CN110090236B - 药物组合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种组合物，其包含下述组分：人参皂苷Rk1、人参皂苷Rg5、人参皂苷CK、人参总皂苷提取物，其中所述组合物为白介素(IL)‑6调节剂。本发明还涉及所述组合物在制备药物中的用途。

Description

药物组合物及其用途

技术领域

本发明涉及一种组合物，包含下述组分：人参皂苷Rk1、人参皂苷Rg5、人参皂苷CK、人参总皂苷提取物，其中所述组合物为白介素(IL)-6调节剂。本发明还涉及所述组合物在制备药物中的用途。

背景技术

白细胞介素-6(IL-6)是由184个氨基酸组成的细胞因子，分子量21-26kDa。白细胞介素-6在多种刺激物质的刺激下由淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞以及肿瘤细胞等多种细胞产生。其生物学特性包括诱导B细胞产生抗体、激活T细胞以及加速其他急性炎症蛋白质的合成。另一方面，白细胞介素-6的过度表达可导致多种炎症相关疾病的发生，包括在血小板增多症、骨髓瘤、Castleman病、类风湿性关节炎、脓毒症和流感病毒感染等。

目前，靶向白细胞介素-6的治疗/预防药物主要包含三大类：1、拮抗白细胞介素-6的抗体和生物活性分子；2、拮抗白细胞介素-6受体的抗体和生物活性分子；3、白细胞介素-6合成抑制剂。其中，较为常见的药物主要为拮抗白细胞介素-6及其受体的抗体和多肽类抑制剂，也要少数多肽类(蛋白质)产生抑制剂，如乳蛋白来源的乳化过氧化物酶。然而多肽类(蛋白质)药物常具有性质不稳定、获取困难的缺点。

发明内容

人参皂苷(Ginsenoside)是一种固醇类化合物，主要存在于人参属药材中。其能够参与多条代谢通路，所以其效能也是复杂的。本发明的发明人意外发现，本发明的组合物在体外和体内都能够强效抑制IL-6，进而作为IL-6调节剂。并且，相比单独的各组分，本发明的组合物对IL-6产生了意想不到的协同抑制作用，进而为治疗与IL-6水平异常相关的疾病提供了新的策略。此外，相比抗体类药物，本发明的组合物更加稳定且便于保存，具有显著的应用前景和经济价值。

一方面，本发明提供一种组合物，其包含下述组分：人参皂苷Rk1、人参皂苷Rg5、人参皂苷CK、人参总皂苷提取物，其中所述组合物为白介素(IL)-6调节剂。

在一个实施方案中，本发明的组合物包含：占所述组合物质量19-21％的人参皂苷Rk1、占所述组合物质量16-31％的人参皂苷Rg5、占所述组合物质量15％-23％的人参皂苷CK，占所述组合物质量25-50％的人参总皂苷提取物。优选地，所述人参皂苷Rk1、人参皂苷Rg5和人参皂苷CK的质量之和在所述组合物中占大于等于50％。

附图说明

图1表示HEK-293细胞和HUVEC细胞中白细胞介素6mRNA的含量，说明本发明的组合物对白细胞介素-6的mRNA有明显的下调效果，且该下调效果显著高于其他各组分单独处理组。

图2表示HEK-293细胞和HUVEC细胞中分泌白细胞介素6的含量，本发明的组合物对白细胞介素-6的分泌有明显的抑制作用，且该抑制效果显著高于其他各组分单独处理组。

具体实施方式

在一个实施方案中，本发明的人参总皂苷提取物指从白参、鲜参或红参中提取的总皂苷，其主要包含下述组分：Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc和Rb2。具体地，所述人参总皂苷提取物包含：占该人参总皂苷提取物质量19-39％的Rg1、占该人参总皂苷提取物质量6-12％的Re、占该人参总皂苷提取物质量3.9-8％的Rf、占该人参总皂苷提取物质量9-18.8％的Rb1、占该人参总皂苷提取物质量4-7.9％的Rc和占该人参总皂苷提取物质量3.8-6.8％的Rb2。

本发明中所述的人参皂苷Rk1化学名为3β,6α,12β-trihydroxydammar-20(21),24-diene-6-O-β-D-glucopyranoside，分子式C₄₂H₇₀O₁₂，分子量767.0无臭，白色粉末状。可溶于甲醇、乙醇，微溶与乙酸乙酯，水溶性较差，不溶于三氯甲烷、乙醚，CAS号：494753-69-4，结构式为：

人参皂苷Rg5化学名为beta-D-Glucopyranoside,(3beta,12beta,20E)-12-hydroxydammara-20(22),24-dien-3-yl2-O-beta-D-glucopyranosyl，分子式C₄₂H₇₀O₁₂，分子量：767.0，无臭，白色粉末状。可溶于甲醇、乙醇，微溶于乙酸乙酯，水溶性较差，不溶于三氯甲烷、乙醚，CAS号：74964-14-0，结构式为：

人参皂苷CK的化学名为(3b,12b)-3,12-dihydroxydammar-24-en-20-yl，分子式：C₃₆H₆₂O₈，分子量：622.87，无臭，白色粉末状。可溶于甲醇、乙醇，微溶与乙酸乙酯，水溶性较差，不溶于三氯甲烷、乙醚，CAS号：39262-14-1，结构式为：

在一些实施方案中，本发明组合物中的人参皂苷Rk1、人参皂苷Rg5和/或人参皂苷CK是天然提取的。具体地，在一些实施方案中，所述人参皂苷Rk1、人参皂苷Rg5和/或人参皂苷CK提取自野山参、园参、西洋参、三七参、红参、和/或白参。所述人参皂苷可通过水提取法、有机溶剂提取法、渗透法、蒸馏法、超声浸渍法、萃取法、大孔吸附树脂分离技术或上述方法的组合获得。在另一些实施方案中，本发明组合物中的人参皂苷Rk1、人参皂苷Rg5和/或人参皂苷CK通过其他人参皂苷转化获得。具体地，所述人参皂苷可通过二醇型人参皂苷如Rb1转化获得，且所述转化方法可以为酶降解法。

另一方面，本发明涉及所述组合物用于制备调节IL-6水平的药物的用途。具体地，本发明涉及所述的组合物用于制备治疗或预防与IL-6水平异常相关的疾病，或控制所述疾病发展的药物的用途。在一些实施方案中，所述与IL-6水平异常相关的疾病包括炎性疾病、自身免疫性疾病和肿瘤。具体地，所述炎性疾病包括但不限于：脓毒症、病毒感染和细菌感染，所述自身免疫性疾病包括类风湿性关节炎和哮喘，且所述肿瘤包括癌症、癌症的进展和复发。在一些实施方案中，所述癌症包括肝癌、肺癌如非小细胞肺癌、乳腺癌、骨髓瘤和血液肿瘤如血小板增多症。在一些实施方案中，所述癌症的复发包括非小细胞肺癌的复发。

在本发明的一些实施方案中，所述组合物可与一种或多种其他IL-6调节剂共同使用。具体而言，所述IL-6调节剂包括IL-6抗体、IL-6受体抗体、所述抗体的片段和衍生物，以及IL-6小分子拮抗剂。

在一些实施方案中，本发明的组合物可与药物上可接受的载剂共同制备成适于施用的剂型。所述药物上可接受的载剂包括：溶剂、缓冲剂、包衣、等张剂、润湿剂、乳化剂、防腐剂和抗菌剂。

具体地，本发明的组合物可制备为口服剂型，所述口服剂型包括：片剂、粉剂、悬浊液、乳浊液、胶囊、颗粒剂、糖衣片、药丸、液体、醑剂和糖浆。在另一些实施方案中，本发明的组合物可制备为局部施用的剂型，所述局部施用的剂型包括：软膏、固体、悬浊液、水剂、醑剂、粉剂、糊剂、栓剂、气溶胶、泥敷剂、涂抹剂、洗剂、灌肠剂和乳剂。

实施例1本发明组合物的制备

人参皂苷Rk1、人参皂苷Rg5、人参皂苷CK和分别购自西安百乐生物科技发展有限公司、成都曼斯特生物科技有限公司和提取自红参，其纯度均符合药用标准。按如下比重制备本发明的组合物：

实施例2本发明组合物的安全性评价

本发明组合物的非临床安全性评价的研究如下。在下述实验中，将实施例1中制备得到的本发明组合物的溶液加入到细胞培养液中。

1.小鼠口服急性毒性试验

在最大给药浓度和最大给药容量条件，对小鼠口服灌胃给予实施例1中制备的组合物，连续观察14天，进而获得本发明组合物的最大耐受量。

2.Beagle犬口服急性毒性试验

在最大给药浓度和最大给药容量条件，对Beagle犬口服灌胃给予实施例1中制备的组合物，进而获得本发明的组合物的最大耐受量。

3.大鼠灌胃给药的长期毒性

将实施例1中制备的组合物对SD大鼠连续口服灌胃三个月后停药恢复四周长期毒性试验。结果显示：①一般情况：在给药和恢复期间，摄食饮水正常，体重增加，动物皮毛光滑，行为活动正常；②血液学和血液生化学指标：在给药结束和恢复期后，动物血液学和血液生化学各指标均在正常范围内波动，未见明显异常；③骨髓和尿常规指标：在给药结束和恢复期后，动物骨髓和尿常规各指标未见明显异常；④组织病理学指标：在给药结束和恢复期后，动物各脏器肉眼未见明显异常，脏器重量和脏器系数与对照组相比未见显著差异，各脏器病理未见明显异常改变。结果表明，在SD大鼠中长期给药未见明显毒性反应。

4.对Beagle犬灌胃给药的长期毒性试验

将实施例1中制备的组合物对Beagle犬连续口服灌胃三个月后停药恢复四周长期毒性试验。结果显示：①一般情况：在给药和恢复期间，摄食、饮水和体温正常，体重增加，动物皮毛光滑，行为活动正常；②血液学和血液生化学指标：在给药结束和恢复期后，动物血液学和血液生化学各指标均在正常范围内波动，未见明显异常；③心电图指标：在给药结束和恢复期后，动物心电图各指标均在正常范围内波动，未见明显异常；④骨髓和眼科检查：在给药结束和恢复期后，动物骨髓细胞和各分类细胞未见异常；眼科检查各组动物眼底血管纹路清晰无出血渗出，视乳头无水肿，动静脉管径比正常；⑤免疫学和尿粪检测指标：在给药结束和恢复期后，动物免疫学和尿粪检测各指标均在正常范围内波动，未见明显异常；⑥组织病理学指标：在给药结束和恢复期后，动物各脏器肉眼未见明显异常，脏器重量和脏器系数与对照组相比未见显著差异，各脏器病理未见明显异常改变。结果表明，Beagle犬长期给药未见明显毒性反应。

5.一般药理学试验

麻醉Beagle犬口服灌胃给药实施例1中制备的组合物的溶液，Beagle犬的血压(舒张压、收缩压)、心率无明显影响，P波、T波、R波和QRS间期、PR间期、Q-T间期、呼吸频率以及呼吸幅度也无明显影响。本发明的组合物对小鼠Irwin’s行为试验评分及爬杆试验评分均无明显影响。表明本发明的组合物不影响动物的中枢神经系统、心血管系统和呼吸系统。

6.致突变试验

哺乳动物培养细胞(CHL)染色体畸变试验、Ames试验和小鼠微核试验显示，本发明的组合物无致突变作用。

实施例3药效学

1.本发明的组合物抑制白细胞介素-6在细胞中的合成

材料：人脐静脉内皮细胞HUVEC，人胚胎肾上皮细胞HEK-293，经配制的本发明的组合物。通过精确称取1.5mg实施例1制备得到的组合物，将其溶于200μL 75％乙醇溶液中，至终浓度为7.5mg/ml，得到本发明的实施例1的组合物的乙醇溶液。

通过精确称取1.5mg人参皂苷Rk1、人参皂苷Rg5、人参皂苷CK和人参总皂苷提取物，将其溶于200μl 75％乙醇溶液中，至终浓度为7.5mg/mL，得到上述各皂苷的乙醇溶液。

对照组使用200μl 75％乙醇溶液。

方法：培养人脐静脉内皮细胞HUVEC和人胚胎肾上皮细胞HEK-293至对数期，以2.0×106个/板传代于100mm细胞培养板，37℃、5％CO2环境中培养24h，按与培养基的体积比为1：1000的比例分别加入上述的实施例1中制备的组合物的乙醇溶液、上述各皂苷的乙醇溶液，以及作为对照组的相同体积的75％乙醇溶液，在37℃、5％CO2环境中继续培养4h，收集细胞，提取全细胞RNA，经反转录，通过实时定量PCR检测白细胞介素-6的mRNA水平。结果显示(图1)，在人脐静脉内皮细胞HUVEC和人胚胎肾上皮细胞HEK-293中，本发明的组合物对白细胞介素-6的mRNA有明显的下调效果，且该下调效果显著高于其他各组分单独处理组。

2.本发明的组合物抑制白细胞介素-6在细胞中的分泌

材料：人脐静脉内皮细胞HUVEC，人胚胎肾上皮细胞HEK-293，实施例1中制备的组合物，白细胞介素-6检测试剂盒(R&D)。

通过精确称取1.5mg实施例1制备得到的组合物，将其溶于500μl 75％乙醇溶液中，至终浓度为3mg/ml，得到本发明的实施例1的组合物的乙醇溶液。

通过精确称取1.5mg人参皂苷Rk1、人参皂苷Rg5、人参皂苷CK和人参总皂苷提取物，将其溶于500μl 75％乙醇溶液中，至终浓度为3mg/ml，得到上述各皂苷的乙醇溶液。

对照组使用500μL 75％乙醇溶液。

方法：培养人脐静脉内皮细胞HUVEC和人胚胎肾上皮细胞HEK-293至对数期，以2.0×106个/板传代于100mm细胞培养板，37℃、5％CO2环境中培养24h，按与培养基的体积比为1：1000的比例分别加入上述的实施例1中制备的组合物的乙醇溶液、上述各皂苷的乙醇溶液，以及作为对照组的相同体积的75％乙醇溶液在37℃、5％CO2环境中继续培养24h，收集培养基上清液，使用ELISA试剂盒检测上清液中白细胞介素-6的含量。结果显示(图2)，本发明的组合物对白细胞介素-6的分泌有明显的抑制作用，且该抑制效果显著高于其他各组分单独处理组。

3.本发明的组合物抑制试验动物白细胞介素-6的产生和炎症反应

材料：BALB/C小鼠，流感病毒H1N1菌株，实施例1中制备的组合物，白细胞介素-6检测试剂盒(R&D)。

通过精确称取2mg实施例1制备得到的组合物，将其溶于2ml磷酸盐缓冲液中，至终浓度为1mg/ml，得到本发明的实施例1的组合物的磷酸盐悬浊液。

通过精确称取2mg人参皂苷Rk1、人参皂苷Rg5、人参皂苷CK和人参总皂苷提取物，将其溶于2ml磷酸盐缓冲液中，至终浓度为1mg/ml，得到上述各皂苷的磷酸盐悬浊液。

方法：七周龄雌性BALB/C小鼠麻醉后鼻内接种10微升660PFU流感病毒H1N1菌株，第二天开始按2mg/kg(人参皂苷/小鼠体重)每天口服给药按上述制得的本发明的实施例1的组合物的磷酸盐悬浊液和各皂苷的磷酸盐悬浊液，给药体积100μl，对照组口服给药100μL磷酸盐缓冲液，感染6天后解剖小鼠收集眶静脉血和支气管肺泡灌洗液样品，支气管肺泡洗灌液样品经1000rpm离心分别收集上清液和细胞沉淀样品。

使用白细胞介素-6试剂盒测定静脉血和支气管肺泡灌洗液上清样品中白细胞介素-6浓度，结果显示(表1)，本发明的组合物有效降低了病毒感染区域和血液中的白细胞介素-6含量，且该效果优于其他各组分单独处理组。

使用细胞计数板对支气管肺灌泡洗液细胞沉淀(炎性细胞)样品进行计数，结果显示(表2)，本发明的组合物有效降低了炎症细胞的数量。

对小鼠肺实变严重程度进行评分，严重程度用0(无实变)到10(严重实变)进行评分，计算各试验组别的平均分，结果显示(表3)，本发明的组合物有效降低了病毒感染造成的肺实变。

4.本发明的组合物抑制原发性肝细胞癌诱导试验动物中白细胞介素-6的产生和肝细胞癌的发展

材料：C57BL/6小鼠，二乙基亚硝胺，实施例1中制备的组合物，白细胞介素-6检测试剂盒(R&D)。

通过精确称取2mg实施例1制备得到的组合物，将其溶于2ml磷酸盐缓冲液中，至终浓度为1mg/ml，得到本发明的实施例1的组合物的磷酸盐悬浊液。

方法：二周龄雄性小鼠腹腔注射25mg/kg二乙基亚硝胺，30周后灌胃组每周两次按2mg/kg(人参皂苷/小鼠体重)口服给药实施例1的组合物的磷酸盐悬浊液，给药体积100μl，模型组口服给药100μl磷酸盐缓冲液，对照组不注射二乙基亚硝胺，30周开始口服给药100μl磷酸盐缓冲液，42周处死小鼠。

白细胞介素-6检测试剂盒检测小鼠血液中白细胞介素-6的含量；分离脏，统计肿瘤的数量和体积。结果显示(表4、5)，本发明的组合物有效降低了肝癌模型小鼠血液中白细胞介素-6的含量，并对肿瘤的发展有抑制作用。

5、本发明的组合物抑制非小细胞肺癌移植瘤动物模型白细胞介素-6的产生和肿瘤的发展

材料：SCID小鼠，非小细胞肺癌细胞系A549、H1650，白细胞介素-6检测试剂盒(R&D)，和实施例1中制备的组合物。

通过精确称取2mg实施例1制备得到的组合物，将其溶于2mL磷酸盐缓冲液中，至终浓度为1mg/ml，得到本发明的实施例1的组合物的磷酸盐悬浊液。

方法：八周龄SCID小鼠皮下接种非小细胞肺癌细胞系A549、H1650，一周后灌胃组每周两次按2mg/kg(人参皂苷/小鼠体重)口服给药上述制备的实施例1的组合物的磷酸盐悬浊液，给药体积100μl，模型组口服给药100μl磷酸盐缓冲液，对照组不接种肺癌细胞，一周后口服给药100μl磷酸盐缓冲液，5周后处死小鼠。

白细胞介素-6检测试剂盒检测小鼠血液中白细胞介素-6的含量；分离肿瘤组织，统计肿瘤的体积；分离肺组织，统计肿瘤的数量和体积。结果显示(表6、7)，本发明的组合物有效降低了非小细胞肺癌移植瘤动物模型小鼠血液中白细胞介素-6的含量，并对肿瘤的发展有抑制作用。

表1白细胞介素-6在血液和感染部位组织液中的含量

表2炎性细胞数量

表3肺实变评分

表4白细胞介素-6在血液中的含量

表5肿瘤的数量及体积

表6白细胞介素-6在血液中的含量

表7肿瘤的数量及体积

Claims (15)

1.一种组合物，其包含下述组分：占所述组合物质量19％的人参皂苷Rk1、占所述组合物质量31％的人参皂苷Rg5、占所述组合物质量15％的人参皂苷CK、占所述组合物质量35％的人参总皂苷提取物，其中所述组合物为白介素(IL)-6调节剂，其中所述人参总皂苷提取物包含：占该人参总皂苷提取物质量13.31％的Rg1、占该人参总皂苷提取物质量4.12％的Re、占该人参总皂苷提取物质量2.75％的Rf、占该人参总皂苷提取物质量6.56％的Rb1、占该人参总皂苷提取物质量2.78％的Rc和占该人参总皂苷提取物质量2.37％的Rb2。

2.权利要求1的组合物，其中所述人参总皂苷提取物提取自白参、鲜参或红参。

3.权利要求1-2任一项的组合物，其中所述人参皂苷Rk1、人参皂苷Rg5和/或人参皂苷CK是天然提取的。

4.权利要求3的组合物，其中所述人参皂苷Rk1、人参皂苷Rg5和/或人参皂苷CK提取自野山参、园参、西洋参、三七参、红参、和/或白参。

5.权利要求3-4任一项的组合物，其中所述人参皂苷Rk1、人参皂苷Rg5和/或人参皂苷CK通过水提取法、有机溶剂提取法、渗透法、蒸馏法、超声浸渍法、萃取法、大孔吸附树脂分离方法或其组合获得。

6.权利要求1-2任一项的组合物，其中所述人参皂苷Rk1、人参皂苷Rg5和/或人参皂苷CK通过其他二醇型人参皂苷转化获得。

7.权利要求1-2任一项的组合物，其中所述组合物制备为下述口服剂型：片剂、粉剂、悬浊液、乳浊液、胶囊、颗粒剂、药丸、醑剂或糖浆。

8.权利要求1-2任一项的组合物，其中所述组合物制备为下述口服剂型：糖衣片或液体制剂。

9.权利要求1-2任一项的组合物，其中所述组合物制备为下述局部施用的剂型：软膏、悬浊液、水剂、醑剂、粉剂、糊剂、栓剂、气溶胶、泥敷剂、洗剂、灌肠剂或乳剂。

10.权利要求1-2任一项的组合物，其中所述组合物制备为下述局部施用的剂型：固体制剂。

11.权利要求1-2任一项的组合物，其中所述组合物制备为下述局部施用的剂型：涂抹剂。

12.权利要求1-8任一项的组合物用于制备治疗或预防疾病或控制所述疾病发展的药物的用途，其中所述疾病为由病毒感染引起的肺炎、肝癌或非小细胞肺癌。

13.权利要求12的用途，其中所述疾病与IL-6水平异常相关。

14.权利要求12-13任一项的用途，其中所述组合物可与一种或多种其他IL-6调节剂共同使用。

15.权利要求14的用途，其中所述IL-6调节剂包括IL-6抗体、IL-6受体抗体、所述抗体的片段和衍生物，以及IL-6小分子拮抗剂。

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