KR101659785B1 - Ｉｌ-6 활성 억제 작용을 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 ｉｌ-6로 매개되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 IL-6 활성 억제 작용을 갖는 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 IL-6로 매개되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 조성물을 포함하는 피부 외용제에 관한 것이며, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 IL-6로 매개되는 질환의 예방 또는 개선용 식품용 조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 IL-6 활성을 억제하는 조성물을 제공하며, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 사용하여 시험관내(in vitro)에서 IL-6 활성을 억제하는 방법에 관한 것이다.

[화학식 1]

Description

ＩＬ-6 활성 억제 작용을 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 ＩＬ-6로 매개되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물{A composition for preventing or treating diseases mediated by IL-6 comprising a compound for inhibiting IL-6 activity or pharmaceutically acceptable salts thereof as an active ingredient}

본 발명은 IL-6 활성 억제 작용을 갖는 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 IL-6로 매개되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 조성물을 포함하는 피부 외용제에 관한 것이며, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 IL-6로 매개되는 질환의 예방 또는 개선용 식품용 조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 IL-6 활성을 억제하는 조성물을 제공하며, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 사용하여 시험관내(in vitro)에서 IL-6 활성을 억제하는 방법에 관한 것이다.

[화학식 1]

IL-6(Interleukin-6)는 B 세포 자극인자 또는 인터페론-β2로 알려진 사이토카인으로 185개의 아미노산으로 이루어진 비-글리코실화 펩타이드 사슬이다. IL-6는 B 임파구계 세포의 활성화에 관여하는 분화인자로서 발견되었으며(Hirano, T. et al., Complementary DNA for a novel human interleukin (BSF-2) that induces B lymphocytes to produce immunoglobulin. Nature 1986, 324 (6092), 73-6), 이후 T 세포의 분화 및 증식, 신경세포의 분화, 파골세포 형성, 간세포에서 급성기 단백질의 생산 등에 영향을 미치는 다기능성 사이토카인으로 밝혀졌다(Akira, S. et al., Interleukin-6 in biology and medicine. Adv Immunol 1993, 54, 1-78). 그리고 IL-6는 T 세포와 포식세포 등 다양한 세포로부터 분비되며 면역반응을 유도하거나 TNF-α, IL-1 등을 저해하여 면역 억제작용을 하여 생체의 항상성을 유지하는 역할을 하며, 급성기 면역 반응시간에서의 특정 유전자 발현을 조절하고 정상적인 형질아세포의 생존을 제어하는 것으로 밝혀졌다(Ishihara, K. et al., IL-6 in autoimmune disease and chronic inflammatory proliferative disease. Cytokine Growth Factor Rev 2002, 13 (4-5), 357-68).

한편 IL-6는 인슐린 감수성을 감소시키는 것으로 보고되어 인슐린 저항성 당뇨병의 유발에도 관여하며, 세포접착인자의 분비, 간 조직에서 피브리노겐의 분비를 촉진하여 혈액응고 현상을 유도하며 콜레스테롤의 합성을 증가시키거나, 콜레스테롤의 분비를 감소시키며, 레시틴 콜레스테롤 아실트란스퍼라제(LCAT; Lecithin cholesterol acyltransferase)와 아폴리포프로테인(apo A-1; apolipoprotein A-1) 유전자를 상향조절함으로써 동맹경화증을 유도한다(Omoigui, S., Cholesterol synthesis is the trigger and isoprenoid dependent interleukin-6 mediated inflammation is the common causative factor and therapeutic target for atherosclerotic vascular disease and age-related disorders including osteoporosis and type 2 diabetes. Med Hypotheses 2005, 65 (3), 559-69; Yudkin, J. S. et al., Inflammation, obesity, stress and coronary heart disease: is interleukin-6 the link Atherosclerosis 2000, 148 (2), 209-14).

또한 염증 발생에 관여하는 IL-6의 농도가 증가할 경우 심장병 발병 위험과 상기 질병으로 인한 사망률이 증가한다는 사실을 확인한 연구 결과도 발표되었다. IL-6의 생성이 증가되면서 발생하는 질병으로 알츠하이머병, 류마티스 관절염, 염증, 심근경색증, 파제트병(Paget's disease), 골다공증, 고형암(RCC), 방광암, 전립선암, 카스틀맨병(Castleman disease) 등이 보고되었다(Ishihara, K. et al., IL-6 in autoimmune disease and chronic inflammatory proliferative disease. Cytokine Growth Factor Rev 2002, 13 (4-5), 357-68; Lindmark, E. et al., Relationship between interleukin 6 and mortality in patients with unstable coronary artery disease: effects of an early invasive or noninvasive strategy. JAMA 2001, 286 (17), 2107-13). 류마티스 관절염, 카스틀맨병, 크론병(Cronh's disease), 골다공증, 암 악액질(Cancer cachexia), 동맥경화, 당뇨 등과 같은 IL-6 활성 이상에 의해 유발된 염증관련 질환은 최근 그 환자 수가 급속히 증가하고 있는 추세이다. 따라서 류마티스 관절염, 골다공증, 동맥경화, 당뇨로 대표되는 대사성 질환의 치료약 개발에 대한 연구가 전 세계적으로 많이 이루어지고 있으며, 최근에는 이러한 대사성 질환의 발병 및 진전이 염증 반응과 관련이 있으며 여기에 중요한 원인 인자로 IL-6가 주목받고 있다.

한편 IL-6 수용체(IL-6R)는 CD126 (Cluster of Differentiation 126)이라는 타입 Ｉ 사이토카인 수용체로 알려져 있으며 세포 상에서 2 종류의 단백질을 매개로 하여 그 생물학적 활성을 전달하고 있다. 각 단백질은 α-서브유닛과 β-서브유닛의 폴리펩타이드 사슬로 이루어져 있는 것으로 알려졌다. 먼저 α-서브유닛은 리간드 결합 사슬로 약 80 kDa의 분자량을 가지며 gp80 혹은 CD126이라 명명되었으며 세포막을 관통하여 세포막 상에서 발현하는 막 결합형 이외에 주로 그의 세포외 영역으로 이루어진 가용성 IL-6 R로서도 존재한다. 그리고 β-서브유닛은 gp130 혹은 CD130으로 불리며 130 kDa의 분자량을 갖는 것으로 알려져 있다. 이것은 막 결합 단백질로 신호전달에 관여한다고 보고되었다(Taga, T. et al., Receptors for B cell stimulatory factor 2. Quantitation, specificity, distribution, and regulation of their expression. J Exp Med 1987, 166 (4), 967-81). 그리고 온코스타틴 M(Oncostatin M; OSM), 백혈병 억제인자(leukemia inhibitory factor; LIF), IL-11, 카르디오트로핀-1(cardiotrophin-1; CT-1), 섬모 향신경성 인자(ciliary neurotrophic factor; CNTF)와 같은 사이토카인 패밀리가 공유하는 도메인으로 심장, 신장, 비장, 간, 폐, 태반, 뇌 등 대부분의 생체기관에서 발견되고 있다(Kang, B. S. et al., Inhibitory effects of anti-inflammatory drugs on interleukin-6 bioactivity. Biol Pharm Bull 2001, 24 (6), 701-3; Jones, S. A. et al., The soluble interleukin 6 receptor: mechanisms of production and implications in disease. FASEB J 2001, 15 (1), 43-58). 그리고 활성을 나타내기 위하여 필수적으로 IL-6와 IL-6 수용체는 IL-6/IL-6R 복합체를 형성하고 난 후에 β-서브유닛인 gp130과 결합되어야만, IL-6의 생물학적 활성이 세포 내로 전달된다.

IL-6의 신호전달 체계는 티로신 키나제인 Jak 패밀리와 전사인자인 STAT 패밀리를 신호 전달의 주 매개체로 하고 있는 것으로 밝혀졌다. 이 신호전달 체계는 IL-6 외 다양한 사이토카인과 IFNs, 성장 인자들이 그 메커니즘을 공유하고 있다. 자극이 시작되면 gp130-관련의 키나제인 Jak1, Jak2, Tyk2가 활성화되고 gp130의 세포질 꼬리가 인산화된다. gp-130의 포스포티로신 잔기는 도킹 부위로서 주로 STAT3와 STAT1의 SH2 도메인과 짝을 이룬다. 이어서 STAT가 인산화되고 이합체를 이룬 뒤 핵으로 이동하여 표적 유전자의 전사를 조절한다(Heinrich, P. C. et al., Interleukin-6-type cytokine signalling through the gp130/Jak/STAT pathway. Biochem J 1998, 334 (Pt 2), 297-314). Ras-Raf 경로는 티로신 포스파타제 SHP2가 인산화 된 gp130에 결합하고 미토겐-활성화 단백질 키나제(mitogen-activated protein kinase; MAPK) 경로와 연결이 가능하게 한다. 최종적으로 전사인자인 NF-IL-6 (C/EBP 패밀리 멤버)와 AP-1(c-Jun, c-Fos)를 활성화시켜 생물학적 반응을 일으키며 Ras 신호전달에 관련한 일련의 MAPK 경로는 IL-6의 세포분화 및 증식에 중대한 역할을 할 것으로 예상된다.

많은 연구자에 의하여 IL-6에 의해 유도되는 일련의 신호 전달계에 관하여 보다 세부적 역할을 규명하는 연구가 진행 중이며 각 단계에 관한 정확한 정보가 조금씩 밝혀지고 있다. 이와 같이 복잡한 염증반응의 일련의 기작들의 복잡성이 속속 밝혀지고 있으며 염증질환에 관한 보다 목표지향적인 의약품개발 표적들이 도출되고 있다. 그러므로 IL-6로 유도되는 신호 전달계를 표적으로 하여 IL-6 억제제를 개발한다면 신호 전달계의 메커니즘을 밝히는데 도움이 될 뿐만 아니라 작용기작이 확실한 목표지향적 의약품 개발이 가능하게 될 것이다.

이제까지 IL-6 활성 억제제에 대한 연구는 IL-6에 대한 항체 (항-IL-6 항체), IL-6R에 대한 항체 (anti-IL-6 receptor antibody) 및 gp130에 대한 항체 (anti-gp130 antibody), IL-6 개변체, IL-6 또는 IL-6R 부분 펩타이드 등이 보고 되었다(Heinrich, P. C. et al., Principles of interleukin (IL)-6-type cytokine signalling and its regulation. Biochem J 2003, 374 (Pt 1), 1-20; Novick, D. et al., Rubinstein, M., Monoclonal antibodies to the soluble human IL-6 receptor: affinity purification, ELISA, and inhibition of ligand binding. Hybridoma 1991, 10 (1), 137-46; Huang, Y. W. et al., A monoclonal anti-human IL-6 receptor antibody inhibits the proliferation of human myeloma cells. Hybridoma 1993, 12 (5), 621-30; Mihara, M, Preventives or remedies for sensitized T cell-related diseases containing IL-6 antagonists as the active ingredient. WO9842377, 1998). 특히, IL-6R의 중화항체 (MRA)인 tocilizumab은 카스틀맨병, 크론병과 류마티스 관절염 환자의 증세를 완화시킨 것으로 보고되었다(Nishimoto, N., Clinical studies in patients with Castleman's disease, Crohn's disease, and rheumatoid arthritis in Japan. Clin Rev Allergy Immunol 2005, 28 (3), 221-30).

이와 같이, 단백질 중화항체에서 활성이 확인되었으나 이를 의약품으로 사용하는 경우 활성물질이 단백질이므로 주사제로 사용해야 하고 경구용으로의 사용이 제한되어 있으므로 이러한 점을 극복하기 위하여 의약품으로 사용제한이 없는 저분자 활성물질을 탐색하기 위하여 많은 연구자들이 IL-6 발현억제 활성물질 탐색연구를 하였고 화학합성품뿐만 아니라 천연자원으로부터 활성물질을 탐색하고 있다.

많은 연구 시도 중에 일본의 Kitasato 연구소에서 최초로 저분자 활성물질의탐색에 성공하였다. 탐색된 IL-6 활성 억제제는 토양에서 유래 방성균인 Streptomyces nitrosporeus K930711의 발효 배양액으로부터 분리된 비세포독성 인돌 알칼로이드계열의 물질로 Madindoline A로 명명된 이 저분자 활성 화합물은 gp130의 세포외 도메인과 경쟁적으로 비공유 결합을 이루는 것으로 보고되었다. Madindoline A는 gp130의 호모이성체화를 억제하여 JAK/STAT 신호전달 과정을 억제하는 것으로 확인하였으며, Madindoline A는 모델동물에서 생물 활성을 평가한 결과 IL-6로 유도된 파골세포 형성을 억제하는 것이 보고되었다. 특히 폐경기 유발 생쥐에서 유도된 골다공증의 증상을 완화시켜, 호르몬 이상으로 발생 되기 쉬운 여성의 골다공증에 IL-6가 중요한 역할을 하는 것을 규명하였다. 따라서 Madindoline A를 대량으로 얻기 위하여 여러 가지 연구가 진행 중에 있으며, Madindoline A를 전 합성하기 위한 연구가 진행 중에 있으나 합성 과정이 복잡하여 대량 확보는 아직 어렵고, 생산 미생물을 발효하여 활성물질을 얻으려는 방법은 아직 생산량이 너무 적은 실정이다(Hayashi, M. et al., Suppression of bone resorption by madindoline A, a novel nonpeptide antagonist to gp130. Proc Natl Acad Sci U S A 2002, 99 (23), 14728-33).

추가로 IL-6 활성 억제 저분자 활성물질 탐색연구를 하는 중에 일본의 Kitasato 연구소에서 IL-6R 억제제도 탐색되었는데, 20S, (ERBF)21-epoxy-resibufogenin-3-formate는 천연물을 스크리닝하여 발견된 물질로 두꺼비껍질에서 bufadienolide를 탐색하였다. 이 활성물질은 Madindoline A와 같이 gp-130에 결합하는 것이 아니고 IL-6 수용체에 결합하는 특성을 가지고 있으며, Colon-26에 의해 유도된 암 악액질을 억제하는 것으로 보고되었다. 그러나 ERBF의 경우에도 아직까지 구조가 복잡하여 활성물질을 유기합성적 방법으로 전 합성하는 방법이 아직 개발되어 있지 않으며 천연자원으로부터 활성물질을 확보하기에는 어려움이 있는 실정이다(Enomoto, A. et al., Suppression of cancer cachexia by 20S,21-epoxy-resibufogenin-3-acetate-a novel nonpeptide IL-6 receptor antagonist. Biochem Biophys Res Commun 2004, 323 (3), 1096-102).

앞서 기술한 것과 같이 IL-6 활성 이상에 의해 유발될 수 있는 다양한 질환의 기초적인 연구는 수행되고 있으나 아직까지 그 발병기작이 분명하지 않은 것이 많으며 IL-6의 활성 억제에 의해 발생하는 다양한 생명현상에 대한 연구가 미비한 실정이다. 이는 특이적으로 IL-6 활성을 저해하는 저분자 물질의 개발이 부진한 것에 기인한 것이다. 따라서 IL-6와 관련 질환의 상관성을 보다 정확하게 규명하기 위해서는 대량 합성이 가능하고 특이적으로 IL-6의 활성을 저해하는 저분자 화합물의 개발이 절실히 요구되고 있다.

이에 본 발명자들은, 대량으로 합성이 가능하고 특이적으로 IL-6의 활성을 억제하는 저분자 물질의 개발을 위해 노력한 결과, 백리향으로부터 분리한 본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물이 IL-6 매개의 질환에 효과가 있으며, IL-6 활성을 억제하는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 IL-6(인터루킨-6; Interleukin-6)로 매개되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

[화학식 1]

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 조성물을 포함하는 피부 외용제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 화합물을 유효성분으로 포함하는 IL-6로 매개되는 질환의 예방 또는 개선용 식품용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 화합물을 유효성분으로 포함하는 IL-로 매개되는 질환의 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 화합물을 유효성분으로 포함하는 IL-6 활성을 억제하는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 화합물을 사용하여 시험관(in vitro)에서 IL-6 활성을 억제하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 IL-6(인터루킨-6; Interleukin-6)로 매개되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 대한 것이다.

[화학식 1]

본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 티몰로 명명된 화합물이다.

본 발명에서 용어 "티몰(Thymol)"이란 아이소프로필메틸페놀이라고도 불리며 화학식은 C₁₀H₁₄O로, 물에는 조금 녹지만 에탄올·에테르 등의 유기용매에 잘 녹는 화합물을 의미한다. 천연으로는 사향초유에 함유되어 있고, 또 꿀풀과 식물 정유(精油)의 주성분으로 되어 있다. 멘톨의 합성원료, 방부제·살균제로서 치약·비누 등에 사용되거나 구충제 등에 사용되는 것이 알려진 바 있으나, IL-6의 활성과 연관이 되어 있다는 보고는 없다. 이와 같은 IL-6의 활성의 억제는 본 발명에서 최초로 규명하였다. 이와 같은 티몰은 상업적으로 판매되는 것을 구입하여 사용하거나, m-크레솔과 염화아이소프로필을 염화알루미늄의 존재하에서 반응시켜 합성하거나, 이외의 공지의 방법으로 합성할 수 있다. 또는 백리향 등의 식물로부터 추출분리하여 사용할 수 있다.

바람직하게 본 발명의 화합물은 백리향(Thymus quinquecostatus)으로부터 분리된 것이다. 상기 백리향은 한국, 일본, 중국, 인도 등의 아시아 대륙에 널리 분포하며 주로 산정상이나 고지대, 바닷가 바위틈에 자생하고 있다. 또한 크기는 3∼15cm로, 원줄기는 땅위로 퍼져나가고 어린 가지가 비스듬히 서며 향기가 나고, 잎이 마주나는 긴 타원형으로서 길이 5∼12mm, 너비 3∼8mm이며, 양면에 선점이 있으며 가장자리는 밋밋하거나 물결 모양의 톱니와 털이 나 있는 것이 특징이다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 IL-6 발현을 억제하는 활성물질을 천연자원으로부터 탐색하던 중에 백리향을 선별하여, 이로부터 에탄올 추출물을 제조하고, 감압 농축하여 분획물을 수득하였다. 상기 수득물에 고속 액체 크로마토그래피를 수행함으로써 IL-6 신호전달체계 억제 활성을 갖는 활성분획을 수득하였다. 그 후 상기 활성분획의 이화학적 특성을 분석하여, 활성 화합물의 신원을 확인한 결과 상기 화학식 1로 표시되는 화합물인 티몰임을 확인하였다.

본 발명의 상기 화합물은 약학적으로 허용되는 염의 형태로 사용될 수 있으며, 통상의 방법에 의해 제조되는 모든 염, 수화물 및 용매화물이 포함된다.

염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들어 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알콜(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고, 이어서 상기 혼합물을 증발시켜 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.

이때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산(fumaric acid), 만데르산, 프로피온산 (propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 히드로아이오딕산 등을 사용할 수 있으며, 이로 제한되는 것은 아니다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속염은, 예를 들어 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해시키고, 비용해 화합물 염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하나 이들에 제한되는 것은 아니다. 또한, 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.

본 발명에서 용어, "IL-6"는 B 세포 자극 인자 2(BSF2) 또는 인터페론-β2 (INF-β2)로도 불리는 사이토카인이다. IL-6는 B 임파구의 활성화에 관여하는 분화인자로서, 여러 가지 세포의 기능에 영향을 미치는 다기능 사이토카인이다. IL-6는 세포막 위에 두 종류의 단백질을 매개로 그 생물학적 활성을 전달한다. 하나는 IL-6가 결합하는 단백질인 IL-6 수용체인데, 이는 세포막을 관통하여 발현되어있는 분자량 약 80kD의 막결합형 단백질이다. 다른 하나는, 비리간드 결합성의 시그날 전달에 속하는 분자량 약 130kD의 막단백질 gp130 이다. IL-6와 IL-6 수용체는 IL-6/IL-6 수용체 복합체를 형성하고, 이어서 gp130과 결합한다. 리간드와 수용체들의 결합 후, 세포 내에서는 JAK2가 인산전이반응(transphosphorylation)에 의해 활성화된다. 활성화된 JAK2에 의해 수용체 세포질 도메인의 여러 티로신 잔기가 인산화되고 이것은 SH2나 다른 인산-티로신 결합 모티브를 가지고 있는 STAT3(signal transducers and activators of transcription 3)와 같은 세포질내 단백질의 도킹 부위 역할을 하게 된다. 수용체의 세포질 도메인에 결합한 STAT3는 JAK2에 의해 인산화가 된 후 수용체에서 떨어져 나온다. 활성화된 STAT3들은 세포질내에 서로서로 결합하여 호모 또는 헤테로다이머(heterodimer)를 이룬 후 핵내로 들어가 목적 유전자의 인식 서열에 결합하여 전사를 증가시킨다. 즉, IL-6 활성의 억제는 IL-6 자체뿐만 아니라, IL-6에 의해 매개되는 신호전달 체계에 있어서 STAT3나 JAK3, gp130의 인산화를 억제하여 이루어질 수도 있다. 이와 같은 IL-6의 활성 억제는 곧 IL-6에 의해 매개되는 질환의 치료에도 효과가 있음을 시사하는 것이며, 본 발명에서는 IL-6에 의해 매개되는 부종을 억제하는 것을 확인하였다.

본 발명의 상기 IL-6로 매개되는 질환은 알츠하이머병, 류마티스 관절염, 염증, 심근경색증, 파제트병(Paget's disease), 골다공증, 고형암, 방광암, 전립선암, 카스틀맨병(Castelman disease), 크론병(Cronh's disease), 동맥경화증, 또는 당뇨일 수 있으나, 이로 한정되는 것은 아니며, 통상적으로 주지된 IL-6로 매개되는 질환들은 여기에 포함될 수 있다.

바람직하게는 부종, 류마티스성 관절염, 카스틀맨병, 크론병, 파제트병, 심근경색증, 동맥경화증, 또는 알츠하이머병 일 수 있다.

본 발명의 상기 IL-6로 매개되는 질환은 바람직하게는 부종일 수 있으며, 상기 부종은 조직 내에 림프액이나 조직의 삼출물 등의 액체가 고여 과잉 존재하는 상태를 의미하는 것으로, 피부와 연부 조직에 부종이 발생하면 임상적으로 부풀어 오르고, 푸석푸석한 느낌을 갖게 되며, 누르면 피부가 일시적으로 움푹 들어가게 된다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 티몰의 IL-6 활성을 마우스 실험을 한 결과, Zamosan A에 의해 염증이 유발되어 발 두께가 8.5, 7.0, 6.5, 5.5, 5.6mm로 부풀어 올랐던 마우스의 발 두께가 본 발명의 티몰을 처리해 준 경우에는 6.0, 3.0, 2.0, 1.9, 1.8mm로 부은 정도가 줄어든 것을 확인하였다(도 5).

본 발명의 상기 IL-6로 매개되는 질환은 바람직하게는 자가면역 질환일 수 있다. 자가면역 질환은 자기항원에 대한 면역반응이 직간접 원인으로 나타나는 병으로, 자기항원에 대한 항체, 즉 자가항체나 자기조직반응성 면역담당세포(림프구)의 존재가 자가면역질환의 중요한 지표가 된다. 특정 장기에 국한된 장기특이적 자가면역병과 전신성 자가면역병으로 나뉜다. 전자의 경우에는 자가면역성 용혈성 빈혈, 혈소판감소성자반병, 하시모토병(만성 갑상샘염), 중증근무력증, 자가면역성 위염 등이 있으며 각각 적혈구, 혈소판, 티로글로불린, 아세틸콜린수용체, 위벽세포 등에 대한 자가항체에 의해 직접적으로 나타난다. 후자의 경우에는 전신성 홍반성 낭창이나 류머티스성 관절염 등의 교원병이 포함되며 전신의 거의 모든 조직에서 병적 상태 및 다양한 자가항체 출현을 나타내는 것이 특징적이다.

본 발명에서 용어, "예방"이란 조성물의 투여에 의해 IL-6 매개의 질환을 방지하거나 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 본 발명에서 용어, "치료"란 조성물의 투여에 의해 IL-6 매개의 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 IL-6 활성을 억제하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서, 상기 화합물이 IL-6 활성을 억제하는 것에 대해 확인하기 위해, STAT3 인산화 억제 활성 시험에서 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 티몰을 사용해 1, 3, 10, 30, 100 ㎍/㎖ 농도로 시료를 처리하고 IL-6를 10 ng/㎖ 처리하였을 때, IL-6에 의해 유도된 STAT3 인산화 정도가 티몰의 농도에 의존적으로 억제되는 것을 확인하였다(도 3).

본 발명의 상기 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에서 약학적으로 허용되는 담체는 의·약학업계에서 통상적으로 사용되는 것을 의미한다.

본 발명의 화합물을 포함하는 상기 조성물은 허용 가능한 희석제, 결합제, 붕해제, 윤활제, pH 조절제, 산화방지제, 용해보조제 등의 첨가제를 포함할 수 있다.

희석제는 설탕, 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포도당, 만니톨, 알기네이트, 알칼리토금속류염, 클레이, 폴리에틸렌글리콜, 무수인산수소칼슘, 또는 이들의 몇가지 혼합물로 사용할 수 있다. 결합제로는 전분, 미결정셀룰로오스, 고분산성 실리카, 만니톨, 자당, 유당수화물, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐피롤리돈 공중합체, 히프로멜로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 천연검, 합성검, 코포비돈, 젤라틴을 단독 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있다.

붕해제는 전분글리콘산나트륨, 옥수수전분, 감자전분 또는 전호화전분 등의 전분 또는 변성전분, 벤토나이트, 몬모릴로나이트, 비검, 클레이, 미결정셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스 또는 카르복시메틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스류 알긴산나트륨 또는 알긴산 등의 알긴류, 크로스카멜로스(croscarmellose)나트륨 등의 가교 셀룰로오스류; 구아검, 잔탄검 등의 검류, 가교 폴리비닐피롤리돈(crospovidone) 등의 가교 중합체, 중탄산나트륨, 시트르산 등의 비등성 제제를 단독 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있다.

윤활제는 탈크, 스테아린산, 스테아린산 마그네슘, 스테아린산 칼슘, 라우릴설페이트나트륨, 수소화식물성오일, 나트륨벤조에이트, 콜로이드성 이산화규소 나트륨스테아릴푸마레이트, 글리세릴 베헤네이트, 글리세릴 모노레이트, 글리세릴모노스테아레이트, 글리세릴 팔미토스테아레이트를 단독 또는 이들의 혼합물 등을 사용할 수 있다.

pH 조절제로는 초산, 아디프산, 아스코르빈산, 아스코르빈산 나트륨, 에테르산 나트륨, 사과산, 숙신산, 주석산, 푸마르산, 구연산(시트르산)과 같은 산성화제와 침강 탄산 칼슘, 암모니아수, 메글루민, 탄산 나트륨, 산화 마그네슘, 탄산 마그네슘, 구연산 나트륨, 삼염기칼슘인산염과 같은 염기성화제 등을 사용할 수 있다.

산화방지제는 디부틸 히드록시 톨루엔, 부틸레이티드 히드록시아니솔, 초산 토코페롤, 토코페롤, 프로필 갈레이트, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨 등을 사용할 수 있다.본 발명의 선방출성 구획에서, 용해보조제는 라우릴황산나트륨, 폴리소르베이트 등의 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테류, 도큐세이트 나트륨, 폴록사머(poloxamer) 등을 사용할 수 있다.

또한, 방출지연성 제제를 만들기 위해 장용성 고분자, 수불용성 중합체, 소수성 화합물, 및 친수성 고분자를 포함할 수 있다. 상기 장용성 고분자는 pH5 미만의 산성 조건하에서 불용성이거나 또는 안정한 것으로, pH5 이상인 특정 pH 조건하에서 용해되거나 또는 분해되는 고분자를 말하며, 예를 들어, 히프로멜로오스프탈레이트 (히드록시프로필메틸셀룰로오스 프탈레이트), 메틸 히드록시에틸 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트 말레이트, 히드록시 메틸에틸 셀룰로오스 프탈레이트, 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트 히프로멜로오스 아세테이트 숙시네이트, 셀룰로오스 아세테이트 숙시네이트, 셀룰로오스 벤조에이트 프탈레이트, 셀룰로오스 프로피오네이트 프탈레이트, 메틸셀룰로오스 프탈레이트, 카르복시 메틸에틸 셀룰로오스 및 에틸히드록시 에틸 셀룰로오스 프탈레이트, 메틸히드록시에틸셀룰로오스과 같은 장용성 셀룰로오스 유도체와 스티렌-아크릴산 공중합체, 아크릴산메틸-아크릴산 공중합체, 아크릴산메틸메타크릴산 공중합체, 아크릴산부틸-스티렌-아크릴산 공중합체, 및 아크릴산메틸-메타크릴산-아크릴산옥틸공중합체과 같은 상기 장용성 아크릴산계 공중합체; 폴리(메타크릴산 메틸 메타크릴레이트) 공중합체(예컨대, 유드라짓 L, 유드라짓 S, 에보닉, 독일), 폴리 (메타크릴산 에틸아크릴레이트) 공중합체 (예컨대, 유드라짓 L100-55)와 같은 장용성 폴리메타크릴레이트 공중합체; 아세트산비닐-말레인산 무수물 공중합체, 스티렌-말레인산 무수물 공중합체, 스티렌-말레인산모노에스테를 공중합체, 비닐메틸에테르-말레인산 무수물 공중합체, 에틸렌-말레인산 무수물 공중합체, 비닐부틸에테르-말레인산 무수물 공중합체, 아크릴로니트릴-크릴산메틸ㆍ말레인산 무수물 공중합체, 및 아크릴산부틸-스티렌-말레인산 무수물 공중합체와 같은 장용성 말레인산계 공중합체; 및 폴리비닐알콜프탈레이트, 폴리비닐아세탈프탈레이트, 폴리비닐부틸레이트 프탈레이트 및 폴리비닐아세트아세탈 프탈레이트와 같은 장용성 폴리비닐 유도체를 사용할 수 있다.

상기 수불용성 중합체는 약물의 방출을 제어하는 약제학적으로 허용가능한 물에 용해되지 않는 고분자를 말한다. 예를 들어, 수불용성 중합체는 폴리비닐아세테이트(예컨대, 콜리코트 SR30D), 수불용성 폴리메타 크릴레이트 공중합체[예컨대, 폴리(에틸아크릴레이트-메틸 메타크릴레이트) 공중합체(예컨대, 유드라짓 NE30D, 폴리(에틸아크릴 레이트-메틸 메타 크릴레이트 - 트리메틸아미노에틸 메타 크릴레이트)공중합체 (예컨대, 유드라짓RSPO) 등], 에틸셀룰로오스, 셀룰로오스 에스테르, 셀룰로오스 에테르, 셀룰로오스 아실레이트, 셀룰로오스 디아실레이트, 셀룰로오스 트리아실레이트, 셀룰로오스 아세테이트, 셀룰로오스 디아세테이트 및 셀룰로오스 트리아세테이트 등이 있다.

상기 소수성 화합물은 약물의 방출을 제어하는 약제학적으로 허용가능한 물에 용해되지 않는 물질을 말한다. 예를 들어, 글리세릴 팔미토스테아레이트, 글리세릴 스테아레이트, 글리세릴 비헤네이트, 세틸 팔미테이트, 글리세릴 모노 올레이트 및 스레아린산과 같은 지방산 및 지방산 에스테르류; 세토스테아릴 알코올, 세틸알코올 및 스테아릴알코올과 같은 지방산 알코올류; 카르나우바왁스, 밀납, 및 미결정왁스와 같은 왁스류; 탈크, 침강탄산칼슘, 인산일수소칼슘, 산화아연, 산화티탄, 카올린, 벤토나이트, 몬모릴로나이트 및 비검과 같은 무기질 물질 등이 있다.

상기 친수성 고분자는 약물의 방출을 제어하는 약제학적으로 허용가능한 물에 용해되는 고분자 물질을 말한다. 예를 들어, 덱스트린, 폴리덱스트린, 덱스트란, 펙틴 및 펙틴 유도체, 알긴산염, 폴리갈락투론산, 자일란, 아라비노자일란, 아라비노갈락탄, 전분, 히드록시프로필스타치, 아밀로오스, 및 아밀로펙틴와 같은 당류; 히프로멜로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스 및 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨과 같은 셀룰로오스 유도체; 구아검, 로커스트 콩 검, 트라가칸타, 카라기난, 아카시아검, 아라비아검, 젤란검, 및 잔탄검과 같은 검류; 젤라틴, 카제인, 및 제인과 같은 단백질; 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 및 폴리비닐아세탈디에틸아미노아세테이트과 같은 폴리비닐유도체; 폴리(부틸 메타크릴레이트-(2-디메틸아미노에틸) 메타크릴레이트-메틸메타크릴레이트) 공중합체(예컨대, 유드라짓E100, 에보닉, 독일), 폴리(에틸 아크릴레이트-메틸 메타크릴레이드-트리에틸아미노에틸- 메타크릴레이트 클로라이드) 공중합체 (예컨대, 유드라짓 RL, RS, 에보닉, 독일)과 같은 친수성 폴리메타크릴레이트 공중합체; 폴리에틸렌 글리콜, 및 폴리에틸렌 옥사이드와 같은 폴리에틸렌 유도체; 카보머 등이 있다.

이외에도 착색제, 향료 중에서 선택된 다양한 첨가제로서 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 선택 사용하여 본 발명의 조성물을 제제화할 수 있다. 이러한 제제화 방법은 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA 등에 개시되어 있는 방법을 이용할 수 있다.

본 발명에서 첨가제의 범위가 상기 첨가제를 사용하는 것으로 한정되는 것은 아니며, 상기한 첨가제를 선택에 의하여 통상 범위의 용량을 함유하여 제제화할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 또는 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물 또는 분획물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트 또는 탈크 같은 활택제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 또는 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 또는 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름 또는 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지 또는 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 IL-6로 매개되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 포함하는 피부 외용제에 대한 것이다.

본 발명의 예방 또는 치료용 조성물을 유효성분으로 포함하는 상기 피부 외용제는 바람직하게 연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제, 산제, 현탁제, 겔제 또는 젤의 형태일 수 있으며, 이로 제한되는 것은 아니다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 IL-6로 매개되는 질환의 예방 또는 개선용 식품용 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 식품용 조성물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

본 발명의 상기 식품용 조성물은 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 비스켓, 떡, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강 식품을 모두 포함한다. 상기 외에 본 발명의 식품용 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품용 조성물은건강식품은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 IL-로 매개되는 질환의 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 상기 예방 및 치료방법은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 티몰을 포유류에 투여하여 IL-6로 매개되는 질환인 부종, 류마티스 관절염, 카스틀맨병, 크론병, 파제트병, 심근경색증, 동맥경화증 또는 알츠하이머병 등의 질환을 예방 및 치료하는 것이다.

본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 예방 및 치료용 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 본 발명의 예방 및 치료용 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사, 등에 의해 투여될 수 있으며, 이로 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 치료 방법은 본 발명의 예방 및 치료용 조성물을 약학적 유효량으로 포함하는 것을 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물은 일일 1회 또는 일정한 시간 간격을 두고 일일 2회 이상 투여될 수 있다.

본 발명의 예방 및 치료용 조성물의 투여량은 바람직하게는 하루에 0.1 내지 100 mg/kg이다. 이는 환자의 중증, 나이, 성별, 등에 따라 변화될 수 있으며, 따라서 상기 투여량은 어떤 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 IL-6 활성을 억제하는 조성물을 제공하는 것이다. 이와 같은 IL-6 활성 억제는 IL-6에 의해 유도되는 신호전달을 억제하여 이루어질 수 있다. 본 발명의 목적상 IL-6의 수용체인 gp130, 세포내의 JAK2 또는 STAT3의 인산화를 억제하여 이루어질 수 있다. 이와 같은 IL-6 활성을 억제하는 조성물인 티몰은 IL-6에 의하여 유도되는 신호전달 억제를 필요로 하는 기초 기전 연구에서 생화학적 반응 시약으로 이용할 수 있으며, IL-6 활성 억제의 표준물질로 이용될 수 있다.

본 발명자들은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 조성물이 IL-6 활성을 억제하는지 여부를 조사하기 위해서 구체적인 실시예를 통해 시험한 결과, 상기 조성물이 IL-6에 유도 STAT3 인산화 억제 활성을 나타내는 것을 확인하였다(도 3).

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 사용하여 시험관(in vitro)에서 IL-6 활성을 억제하는 방법을 제공하는 것이다.

시험관에서 IL-6 활성을 억제하는 방법은 시료에 적당량의 티몰을 처리하여 시료에서의 IL-6 활성을 억제할 수 있다. 본 발명에서 용어 "시료"는 IL-6 활성을 저해하여 시험하고자 하는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

상기의 시험관에서 IL-6 활성을 억제하는 방법은 IL-6에 의해 유도되는 신호전달을 억제하여 이루어질 수 있으며, 본 발명의 목적상 IL-6의 수용체인 gp130, 세포내의 JAK2 또는 STAT3의 인산화를 억제하여 이루어질 수 있다. 또한 이는 본 발명의 구체적인 실시예를 통해 확인한 바와 같이 IL-6 유도 STAT3 인산화 억제에 의해 달성될 수 있다.

상기의 시험관에서 IL-6 활성을 억제하는 방법을 이용할 경우, IL-6에 의하여 유도되는 신호전달 억제를 필요로 하는 기초 기전 연구에서 본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 티몰을 생화학적 반응시약으로 사용하여 IL-6 활성을 억제할 수 있다.

또한 상기의 시험관에서 IL-6 활성을 억제하는 방법을 이용할 경우, 미지의 물질이 본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 티몰과 유사한 IL-6 활성 억제 활성을 가질 경우, 상기의 미지의 물질을 IL-6 활성 저해제로 선택할 수 있으며, 본 발명의 티몰은 표준물질로 이용하여 IL-6 활성을 억제할 수 있다.

기존의 IL-6로 매개되는 질환의 예방 또는 치료를 위해 의약품으로 사용되는 활성물질은 단백질이어서 주사제로 사용해야하고 경구용으로 사용이 제한되었다. 한편 본 발명의 화합물은 비단백질 저분자 화합물이므로, 본 발명의 조성물을 이용할 경우, IL-6의 활성 억제를 통해 IL-6로 매개되는 질환의 예방 또는 치료를 위해 경구용으로 사용이 가능할 뿐 아니라 대량합성이 가능하여 의약품으로서 사용이 용이할 것이라 예상된다. 또한 본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 IL-6 활성 저해제를 선택할 수 있는 지표 물질로 사용가능성이 있을 것으로 예상된다.

도 1은 본 발명의 활성을 나타내는 화학식 1로 표시되는 화합물의 구조를 나타낸 도이다
도 2는 도 1로 표시되는 화합물인 티몰에 IL-6 반응 STAT3 리포터 유전자의 활성 억제 정도를 나타낸 도이다.
도 3은 도 1로 표시되는 화합물인 티몰에 IL-6 유도 STAT3 인산화 억제 활성에 대한 웨스턴 블랏 시험 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 도 1로 표시되는 화합물인 티몰 처리에 의한 실험동물의 몸무게의 변화를 보여주는 그래프이다.
도 5는 도 1로 표시되는 화합물인 티몰 처리에 의한 염증 경감 정도를 보여주는 그래프이다.
도 6은 도 1로 표시되는 화합물인 티몰 처리에 의한 염증 경감 정도 사진이다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해서 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1 : 백리향에서 활성물질분리 및 구조 결정

백리향 잎을 대전 약령시장에서 구입하여 한국생명공학연구원 해외생물자원 허브센터의 이중구 박사에게 식물분류를 검정 받았다. 백리향 잎 1㎏을 물로 세척하고 상온에서 바람을 쐬어 건조시킨 후 약 0.5∼1㎝의 크기로 잘게 잘라서 분쇄기로 50∼300 메쉬의 입자 크기로 분쇄된 가루에 에탄올을 1:1의 중량비로 혼합하여 4∼5시간 동안 교반한 후 여지로 여과하여 저온 감압하에 에틸에테르를 첨가하면서 조심스럽게 농축하여 조추출액을 2.9gdmf 얻었다.

IL-6 발현억제 활성이 있는 활성물질의 순수 분리정제는 고속 액체 크로마토그래피로 행하였는데 HPLC 컬럼은 YMC Jsphere ODS H-80 (250 x 20 mm)를 사용하였으며 용출 용매는 물:메탄올:아세토나이트릴 (34:64;2)로 하여 용매유량을 5 ㎖/min로 흘려주었으며 활성물질의 검출은 UV 276nm에서 행하였다. IL-6 억제활성 물질은 22분에 용출되는 피크를 감압건조하여 화학식 1로 표시되는 화합물 878㎎을 얻었다.

[화학식 1]

상기 방법으로 분리된 IL-6 활성 억제 작용을 갖는 활성물질의 이화학적 특성을 분석하였다. 분자량을 측정하기 위하여 전자분사 이온화 질량분석법(electrospray ionization mass spectrometry, Fisons VG Quattro 400 mass spectrometer, USA)을 이용하였다. 활성물질의 구조를 알아보기 위하여 핵자기공명 방법을 이용하였다. NMR실험은 각 시료를 CDCl₃ 녹여 5 ㎜ NMR 튜브에서 수소 및 탄소 핵자기 공명 스펙트럼을 측정하였으며, 각 용매의 피크를 Ttetramethylsilane의 피크를 기준으로 측정하였다. 활성화합물에 대하여 물질의 성상은 실온에서 고상이며 녹는 온도는 51 ℃ 였다. 분자량, 분자식 및 질량을 분석한 결과 화합물의 질량은 150.22로 추정되었으며 고분해능 질량분석 결과 분자식은 C₁₀H₁₄O로 추정되었다. 이화학적 특성을 참고하면서 활성물질을 CDCl₃에 녹여 분석한 수소 핵자기공명 스펙트럼에서 14개분의 수소가 protons (1.20ppm , 1.20ppm , 2.34ppm , each 3H, s), (3.05ppm , 1H, m), (6.71ppm , 7.12ppm (F), each 1H, d), (6.89ppm , 1H, s), (5.35ppm , 1H, s)에서 측정되었다. 탄소 핵자기공명 스펙트럼에서 10개의 탄소가 21.6ppm(C-10), 23.6ppm (C-8), 23.6ppm(C-9), 27ppm (C-7), 116.3ppm (C-5), 121.3ppm (C-1), 126.1ppm(C-2), 131.1ppm(C-3), 137.0ppm(C-6), 153.1ppm(C-4) 측정되었다.

활성물질의 구조를 추정한 결과, IL-6를 활성 억제의 기능을 갖는 활성 화합물은 이미 알려진 티몰인 것을 확인하였다.

실시예 2 : pSTAT3 - TA - Luc6 구조체의 제조

리포터 유전자 분석에서 활성정도를 더욱 반영될 수 있도록 하기위하여 pSTAT-3-TA-Luc 보다 8개의 STAT3 DNA 결합 서열 카피가 포함되어 STAT3 리포터 유전자 분석에서 유리하도록 pSTAT3-TA-Luc6 구조체를 제작하였다. pSTAT3-TA-Luc 플라스미드(Clontech, Palo Alto, CA)를 주형으로 사용하고, 올리고뉴클레오티드 (AGAGGGTAACGGTACCGTGCTTCCCGAACGTTGCTTCC (Kpn I 부위 함유), 서열번호 1)와 올리고뉴클레이티드 (GTACGCAAGGCTCGAGCTACGTTCGGGAAGCAACGTTC (Xho I 부위 함유), 서열번호 2)를 각각 정방향 프라이머와 역방향 프라이머로 사용하여 STAT3 DNA 결합 서열을 thermocycler로 증폭하였다. 5' 말단과 3' 말단에 각각 Kpn I 과 Xho I 제한자리가 있고, 또한 그 중간에 8 카피의 STAT3 시스 액팅 인핸서 요소(cis acting enhancer element)를 포함하는 DNA 가닥과 상보적인 가닥을 합성하였다. 합성한 두 개의 가닥을 90 ℃에서 5분 동안 가열하고 상온에서 서서히 식혀 어닐링 시킨 다음 Kpn I 과 Xho I으로 처리하였다(37 ℃, 밤새). 두 가닥된 DNA를 SDS-PAGE를 이용하여 분리하고 pGL3 베이직 벡터 (Promega, Madision, WI)에 클로닝하였다. 증폭한 PCR 산물을 클로닝하고, 분리한 다음 pSTAT3-TA-Luc 플라스미드의 Kpn I/Xho I 부위에 삽입하여 사용하였다.

실시예 3 : IL -6 반응 STAT3 리포터 유전자 분석

인간의 간암세포주(HepG2 세포)를 37℃, 5% CO₂, 물-포화 조건에서 MEM (Minimal Essential Medium, WelGENE Inc, Daegu, Korea)배지로 배양했다. 이 배지에 10% (v/v) 소 태아 혈청, 스트렙토마이신(100 U/mL)과 페니실린(100 U/mL)을 첨가하여 배양하였고 6 웰 세포 배양 플레이트의 80%까지 세포가 자라도록 하여 준비하였다. 플레이트에서 배지를 조심스럽게 제거하고 혈청이 함유되지 않은 배지 50 ㎕로 교환하고 0.1 ㎍ pSTAT3-TA-Luc6 구조체와 0.3 ㎕ 리포펙타민 시약의 혼합액을 각 웰에 첨가하여 3시간 반응시켜 pSTAT3-TA-Luc6 구조체를 감염시켰다. 그리고 새 배지로 갈아주고 24시간 배양하여 일시성 감염(transient transfection)시켰다. 감염된 세포를 1% BSA/DMEM으로 혈청 기아시키고 시험할 검체를 여러 농도로 희석하여 각각 1시간 동안 처리한 후 IL-6를 첨가하여 3시간 배양하였다. PBS로 세척하고, 용균 완충액(promega luciferase assay system) 50 ㎕를 넣고 1분간 격렬히 흔들고 여기에 30-100 ㎕의 루시퍼라제 기질(Promega luciferase assay system)을 넣고 발광측정기로 5분 안에 측정하였다.

IL-6 반응 STAT3 리포터 유전자의 활성 저해 정도를 알아보기 위하여 시료를 각각 20 ㎍/㎖ 처리하였을 때의 IL-6 반응 STAT3 리포터 유전자에서 나타나는 저해효과를 보고 그 중에서 저해활성이 가장 좋았던 티몰을 여러 가지 농도에서 억제 정도를 측정하였을 때 농도 의존적으로 활성을 저해하는 것으로 나타났으며 50% 억제하는 농도 즉 IC₅₀값을 구하였을 때 티몰의 분자량을 감안하여 계산한 결과 IC₅₀값은 18.9 μM인 것으로 확인되었다(도 2).

실시예 4 : IL -6에 의하여 유도된 STAT3 리포터 유전자의 억제활성 시험

HepG2 세포를 6 웰 플레이트에 5×104 세포/웰로 분주하여 80% 합류하게 키워 소 태아 혈청이 포함되지 않은 무혈청 배지로 교환하여 6시간 배양 후 시료를 1시간 전처리하였다. 이후 20 ng/㎖ IL-6를 처리하고 10분간 반응시킨 뒤 용균 완충액 (20 mM Tris-HCl, pH 8, 137 mM NaCl, 10 % glycerol, 1 % Triton X-100, 1 mM Na3VO4, 2 mM EDTA, 1 mM PMSF, 20 mM leupeptin, 20 ㎎/㎖ aprotonin)을 사용하여 세포를 용해시킨 후, 원심분리(13,000xg, 15분)하여 그 상등액을 용해질로 얻었다. 이때 IL-6 와 시료를 처리하지 않은 HepG2 세포를 대조군으로 사용하였다. 단백질의 농도는 Bio-Rad DC 단백질 분석 키트를 이용하여 정량하였고, 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔(SDS-PAGE)에서 단백질을 로딩하여 30 mA에서 2시간 동안 전기영동 하였다. 전기영동이 끝난 후 겔의 단백질을 PVDF 막(Weatran® S, pore size 0.2 ㎜)으로 90V에서 90분 동안 전사시키고 전사된 막을 트리스-완충 용액(T-TBS; 50 mM Tri-HCl, pH 7.6, 150 mM NaCl, 0.2 % Tween-20, 5% skim milk)으로 4℃에서 12시간 블로킹하고 T-TBS로 5번 세척하였다. 이 막에 일차항체로 포스포-STAT3 (각각, 1:1000 희석)의 다클론 항체를 2시간 동안 처리하였다. T-TBS로 5번 세척 후 이차항체로 HRP-접합의 항-토끼 항체(1:5000 희석)를 1시간 반응시켰다. T-TBS로 세척한 다음 암실에서 ECL을 이용하여 필름을 현상시켰다.

IL-6 반응 STAT3 리포터 유전자 시험에서 활성 억제 정도가 우수하였던 티몰을 가지고 세포주에서 IL-6에 의해 유도된 STST3 인산화 억제활성 정도를 1, 3, 10, 30, 100 ㎍/㎖ 농도로 티몰을 HepG2 세포에 가한 후 시료 IL-6를 10 ㎍/㎖ 처리하여 시험하였다. 시험 결과 티몰이 IL-6 발현을 농도 의존적으로 억제하는 것을 확인하였다(도 3).

실시예 5 : 세포독성 분석

1% 페니실린 G/스트렙토마이신이 있는 10% FBS를 포함하는 배지 속에 96 웰 세포 배양 플레이트에 각 세포주를 유지했다. 37 ℃, 5% CO₂ 조건하에서 세포를 배양하였다. 모든 실험은 3번 반복했다. 검체 처리 48시간 후에 PBS에 희석시킨 10% (v/v) 5 mg/mL 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라-졸리움 브로마이드 (MTT; Sigma)를 세포 배양액에 가했다. 배양 3시간 후 이 배지를 흡인하고 PBS로 씻어내었다. DMSO (100 μL)를 가하고 5분간 부드럽게 흔들었다. VERSA 맥스 마이크로 플레이트 리더(Molecular Devices Inc.)를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 3회의 실험에서 얻은 평균 흡광도 (± SEM) 값은 t-test, P < 0.05로 통계적 유의성을 비교하였다.

그 결과, 티몰을 HepG2세포에 최종농도로 50 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖, 12.5 ㎍/㎖을 처리하였을 때 90.90, 93.74, 96.92% 생존율을 나타내었다.

실시예 6 : In vivo 에서의 티몰 효과 분석

In vitro에서 STAT3 결합억제 정도를 측정하여 활성이 좋았던 후보물질들 중에 MTT 시험결과 비교적 독성이 적은 후보물질인 티몰을 선별하여 in vivo에서 염증치료 활성을 평가하였다. C57BL/6 마우스를 중앙실험동물에서 입수하여 1주간 순화시킨 후 실험에 사용하였다. 사용동물의 성은 암컷으로 대조군 3마리, 시험군(용량군) 4마리를 사용하였으며, 대조군에는 Saccharomyces cereviciae으로부터 분리된 Zymosan A (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 3 mg/㎖로 조제하여 50 ㎕를 복강 내에 주사하고 티몰을 30 ㎎/㎏로 오른쪽 발에 매일 오후 4시, 하루에 한 번씩 투여하여 5일간 실험하였다. 1, 3, 4, 5일에 체중을 측정하였고 발 두께는 매일 측정하였다. 투여 6일째 되는 날 부검하여 오른쪽과 왼쪽의 슬관절의 림프노드의 크기를 각각 측정하였다. 동물실험은 온도 23 ± 3 ℃, 상대습도 50 ± 10%, 조명시간 12시간 (오전 6시-오후 6시), 환기횟수 10-20회/시간, 및 조도 150-300 룩스(Lux)로 설정된 장소에서 사육하였다. 동물 활성평가 시험자들은 모두 고압증기멸균(121 ℃, 20분)된 작업복, 두건, 마스크 및 장갑 등을 착용하고 작업을 실시하였다. 순화, 검역기간 동안에는 폴리카보네이트제 구두통형 사육상자 (260W x 410L x 200H ㎜)에 3마리씩 수용하였다. 투여 및 관찰기간 중에는 와이어사육상자 (205W x 350L x 175H ㎜)에 1마리씩 수용하였다. 시험기간 중 사육 상자는 시험번호 및 동물번호를 기재한 라벨을 붙여 식별하였다. 사료는 방사선 멸균된 (25 kGy, Picolab) 실험동물용 고형사료를, 음수는 상수도수를 고압멸균기로 멸균시킨 후 물병을 이용하여 자유섭취시켰다.

대조군과 티몰처리군(30mg/kg)의 체중을 1일 간격으로 비교한 결과에서, 대조군과 비교할 때, 티몰처리군의 체중에 변화가 없었다. 시험이 종료된 6일 후의 실험동물의 외견상 어떠한 독성의 징후도 나타나지 않았다. 대조군에는 Saccharomyces cereviciae으로부터 분리된 Zymosan A (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 3 mg/㎖로 조제하여 50 ㎕를 오른쪽 발에 주사하고 화학식 1의 티몰 30 ㎎/㎏를 복강 내에 매일 오후 4시, 하루에 한 번씩 5일간 투여하였다. 1, 2, 3, 4, 5일에 체중을 측정한 티몰에 의하여 실험동물의 몸무게의 변화는 거의 없는 것을 확인하였다(도 4).

In vitro에서 STAT3 결합 억제 정도를 측정하여 활성이 확인된 티몰의 in vivo에서 염증경감 활성을 평가하였는데, 사용한 동물은 C57BL/6 마우스를 중앙실험동물에서 입수하여 1주간 순화시킨 후 실험에 사용하였다. 사용한 동물의 성은 암컷으로 대조군 4마리, 시험군(용량군) 4마리를 사용하였으며, 대조군에는 Zymosan A (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 3 mg/㎖로 조제하여 50 ㎕를 오른쪽 발에 주사하고 티몰 30 ㎎/㎏를 매일 오후 4시, 하루에 한 번씩 6일간 투여하였다. 매일 발 두께를 측정하였을 때, Zymosan A에 의하여 유도된 염증반응으로 인해 실험동물의 발 두께가 8.5, 7.0, 6.5, 5.5, 5.6 mm였던 것이 티몰을 처리함으로써 6.0, 3.0, 2.0, 1.9, 1.8 mm로 염증반응 및 부은 정도가 경감된 것을 확인하였다(도 5). 6일째의 시험동물의 Zymosan A 처리군, Zymosan A + 화학식 1의 티몰을 처리한 군, 아무것도 처리하지 않은 군의 실제 사진에서도 그 차이를 확인할 수 있었다(도 6).

상기와 같은 결과들은 본 발명의 티몰이 IL-6의 활성을 효과적으로 저해할 뿐만 아니라 IL-6에 의해 매개되는 부종 등에 있어서 치료효과가 우수하다는 것을 입증하는 것이다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> A composition for preventing or treating disease mediated by IL-6 comprising a compound for inhibiting IL-6 activity or pharmaceutically acceptable salts thereof as an active ingredient <130> PA100592KR <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 1 agagggtaac ggtaccgtgc ttcccgaacg ttgcttcc 38 <210> 2 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 2 gtacgcaagg ctcgagctac gttcgggaag caacgttc 38

Claims (11)

1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 IL-6(인터루킨-6)로 매개되는 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물로서,
   상기 IL-6로 매개되는 질환은 부종 또는 류마티스성 관절염인 약학 조성물.
   

   

   
   [화학식 1]
   
2. 제1항에 있어서, 상기 화합물은 백리향(Thymus quinquecostatus)으로부터 분리된 것인, 약학 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 화합물은 IL-6 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 것인, 약학 조성물.
   
4. 삭제
5. 제1항에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 것인, 약학 조성물.
   
6. 제1항의 조성물을 포함하는 피부 외용제.
   
7. 제6항에 있어서, 연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제, 산제, 현탁제, 겔제 또는 젤의 형태인 피부 외용제.
   
8. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 IL-6로 매개되는 질환의 예방 또는 개선용 식품용 조성물로서,
   상기 IL-6로 매개되는 질환은 부종 또는 류마티스성 관절염인 식품용 조성물.
   

   

   
   [화학식 1]
   
9. 삭제
10. 삭제
11. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 사용하여 시험관(in vitro)에서 IL-6 활성을 억제하는 방법.
    

    

    
    [화학식 1]

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