KR101187714B1

KR101187714B1 - 새로운 ｔｒｐｖ３ 활성 억제제 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101187714B1
Application number: KR1020090087993A
Authority: KR
Inventors: 황선욱; 방상수
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2009-09-17
Filing date: 2009-09-17
Publication date: 2012-10-05
Also published as: KR20110030058A

Abstract

본 발명은 새로운 TRPV3 활성 억제제 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 레졸빈 D1(resolvin D1; 7S,8R,17S-trihydroxy-4Z,9E,11E,13Z,15E,19Z-docosahexaenoic acid)은 열자극 통증을 유발하는 TRPV3(transient receptor potential vanilloid 3)의 활성을 유의적으로 저해시켜 이에 의해 유발되는 열자극 통증을 효과적으로 저해할 수 있으므로, 상기 레졸빈 D1은 TRPV3 활성 억제제 및 TRPV3 매개 열자극 통증의 억제제 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

레졸빈 D1(resolvin D1), TRPV3, TRPV3 활성 억제제, 열자극 통증 억제제.

Description

새로운 ＴＲＰＶ３ 활성 억제제 및 이의 용도{Novel TRPV３ inhibitor and use thereof}

본 발명은 TRPV3 활성 억제제 및 TRPV3 매개 열자극 통증 억제제에 관한 것이다.

인체 생리학 및 유전학 분야의 연구를 통해 2002년에 인체에 존재하는 TRPV3(transient receptor potential vanilloid 3)가 발견되었고, 다양한 조직에서 생존유지에 필수기능을 수행할 것으로 예측되었다. 상기 TRPV3는 외부의 자극을 감지하는 피부세포 및 감각신경세포에 발현되어 있으며, 온도 및 통증유발 유해자극을 감지하는 통각수용체 군인 thermoTRP 군(temperature-sensitive transient receptor potential ion channels)에 속해 있다. 통각수용체 TRPV3의 기능을 명확히 규명함으로써 인체의 통각 기전을 밝히고, 아울러 TRPV3 활성 조절 약물의 개발을 통해 통증 질환 및 피부 질환 경감의 목표를 달성할 수 있으리라 예측되고 있다. 상기 TRPV3 기능 규명과 조절 약물 개발을 위해서는 강력하게 TRPV3의 활성을 조절할 수 있는 특이적인 조절제 개발이 요구되고 있는 실정이다.

상기 TRPV3의 조절제의 개발에 쓰이는 기반 기술을 이해하기 위한 TRPV3 수용체의 특성은 다음과 같다. TRPV3은 이온채널이며, 이의 활성화를 통하여 양이온이 감각 신경세포 또는 피부세포 내부로 이동하고, 칼슘 의존적인 신호 전달 체계가 발생한다. 피부의 경우 이러한 칼슘 신호 전달 체계는 세포의 생장과 분화를 조절하고 궁극적으로는 피부세포의 운명을 결정한다. 상기 TRPV3의 활성화를 측정하는 기술로는 첫 번째, 세포막 전류를 증폭하여 그 변화를 측정할 수 있는 팻취클램프 전기생리학 기술과 두 번째, TRPV3가 칼슘 이온 등의 양이온을 이동시키는 데에서 착안한 세포내 칼슘 농도 변화 측정 기술이 있다. 첫 번째 기술의 경우 측정의 정밀도에 있어 두 번째 기술보다 우위에 있으며, 두 번째 기술의 경우, 첫 번째 기술 보다 고속 측정이 가능하다는 장점이 있어 서로 보완적이다. 또한 상기한 TRPV3 활성화 측정 기술들은, 세포주 배양기술, TRPV3 DNA 관리 및 형질감염 기술이 뒷받침되어야 구현할 수 있다. 즉, 각종 TRPV3 활성의 특이적 조절제 후보물질들을 TRPV3 과발현 세포에 투여하여, TRPV3 활성화를 측정하고 조절제 여부 및 그 강력성을 측정할 수 있다.

또한, 피부세포와 신경세포와의 연관 관계는 염증성 통증이나 만성 통증에 있어서 매우 중요한 메커니즘으로 알려져 있다. 칼슘 유입에 의하여 활성화된 피부세포에서 분비되는 염증 유발 물질은 신경세포를 흥분시켜 급성 통증을 유발한다. 장기적인 신경의 흥분으로 인해서는 신경 자체에서 substance P 또는 CGRP와 같은 신경성 염증 유발 물질이 역방향으로 분비되어 피부세포를 재차 활성화시키는 악순환 고리를 형성한다. 이러한 신경과 피부조직 간의 상호 피드백 작용을 통해 만성적인 통증성 질병을 유발하는 것으로 알려졌다. 그러므로 통증을 완화하는데에 있어서 감각 신경세포와 피부세포의 활성화 억제함으로서 효율적으로 통증을 억제할 수 있다고 보여진다.

레졸빈 D1(Resolvin D1; 7S,8R,17S-trihydroxy-4Z,9E,11E,13Z,15E,19Z-docosahexaenoic acid)은 잠재적인 항-염증성 지질 매개물질이다. 레졸빈 D1은 15- 및 5-지방산화효소(lipoxygenase)에 의한 DHA의 산화에 의해 생리적으로 생성되는 오메가3 지방산 대사체이다. 또한 아스피린으로 처리된 시료로부터 레졸빈 D1의 17(R)-에피머(epimer)가 생성될 수도 있다. 상기 레졸빈 D1 및 이의 17(R) 구조는 급성 염증의 초기 반응인 인간 다핵성 백혈구(polymorphonuclear leukocyte; PMNL)가 혈관 내피 세포를 따라 이동하는 것을 30 nM의 EC₅₀ 수치로 감소시킨다. 또한, 레졸빈 D1 및 이의 아스피린에 의해 유도된 형태는 복막염에 걸린 뮤린 모델에서 백혈구 침투를 농도 의존적으로 감소시키며, 10-100 ng을 투여했을 때, 최대 35%까지 억제한다. 이와 같이 레졸빈 D1이 TRPV3의 활성을 조절한다는 것은 알려진바 없다.

이에, 본 발명자들은 TRPV3을 표적으로 하는 통증 억제제를 찾고자 연구하던 중, 레졸빈 D1이 TRPV3를 발현하는 세포주에 대한 처리 반응에서 TRPV3의 활성화를 효과적으로 억제하여 세포내부로의 칼슘 유입을 차단하였으며, 염증이 유발된 동물 개체의 행동 실험 결과에서도 TRPV3 매개 통증인 열자극 통증의 반응역치가 레졸빈 D1 투여에 의하여 정상 수준으로 회복됨을 확인하였다. 따라서, 상기 레졸빈 D1이 TRPV3 활성을 억제하여 개체의 TRPV3 매개 열자극 통증을 억제하므로, TRPV3 활성 억제제 및 TRPV3 매개 열자극 통증 억제제의 유효성분으로 이용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 레졸빈 D1(resolvin D1; 7S,8R,17S-trihydroxy-4Z,9E,11E,13Z,15E,19Z-docosahexaenoic acid)을 이용한 TRPV3(transient receptor potential vanilloid 3) 활성 억제제, TRPV3 활성 억제 방법, 및 TRPV3 활성 억제제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 레졸빈 D1을 이용한 열자극 통증 억제제, 열자극 통증 억제 방법, 및 열자극 통증 억제제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 레졸빈 D1을 이용한 열자극 통증 개선용 건강식품을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 레졸빈 D1(resolvin D1; 7S,8R,17S-trihydroxy-4Z,9E,11E,13Z,15E,19Z-docosahexaenoic acid)을 유효성분으로 함유하는 열자극 통증 억제용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 TRPV3(transient receptor potential vanilloid 3)를 발현하는 감각신경세포 또는 피부세포에 레졸빈 D1을 처리하는 단계를 포함하는 TRPV3의 활성 억제 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 레졸빈 D1을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 열자극 통증 억제 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

1) TRPV3를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드가 숙주세포에 형질도입된 형질전환체를 제조하는 단계;

2) 상기 형질전환체에 실험군으로 TRPV3 특이적 활성제와 TRPV3 활성 억제제 후보물질을 처리하고, 대조군으로 TRPV3 특이적 활성제와 레졸빈 D1을 각각 처리하는 단계;

3) 단계 2)의 실험군과 대조군의 TRPV3 이온 채널 활성을 각각 측정하는 단계; 및,

4) 단계 3)의 각각의 측정치를 비교하여 대조군보다 낮거나 유사한 TRPV3 이온 채널 활성을 나타내는 TRPV3 활성 억제제 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는 TRPV3 활성 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

2) 상기 형질전환체에 실험군으로 TRPV3 특이적 활성제와 피검물질을 처리하고, 대조군으로 TRPV3 특이적 활성제와 레졸빈 D1을 각각 처리하는 단계;

4) 단계 3)의 각각의 측정치를 비교하여 대조군보다 낮거나 유사한 TRPV3 이온 채널 활성을 나타내는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 열자극 통증 억제 제 스크리닝 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 레졸빈 D1을 유효성분으로 함유하는 열자극 통증 개선용 건강식품을 제공한다.

본 발명의 레졸빈 D1(resolvin D1; 7S,8R,17S-trihydroxy-4Z,9E,11E,13Z,15E,19Z-docosahexaenoic acid)은 TRPV3(transient receptor potential vanilloid 3)를 과발현하는 형질전환 세포에서 TRPV3 활성제로 알려진 캠퍼(Camphor)에 의해 증가된 TRPV3 활성을 억제하고, 염증 동물 모델에서 TRPV3 활성 기반의 열자극 통증을 억제하므로, 상기 레졸빈 D1은 TRPV3 활성 억제제 및 열자극 통증 억제제의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명에서 사용하는 용어를 정의한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "통증"은 통각수용기와 신경섬유로 구성된 구심성 신경로를 통하여 대뇌피질과 가장자리 계통영역과 맞닿은 부위를 자극함으로써 일어나는 모든 통각 및 감각 장애를 의미한다. 본 발명에서 사용된 "통증"이라는 용어는 모든 종류의 통증을 말하며, 신경병 통증 등의 만성 통증과, 수술후 통증, 만성 아래쪽 등 통증, 군발성 두통, 포진신경통, 환지통, 중추통, 치통, 신경병 통 증, 오피오이드 내성통, 창자통, 외통, 뼈 외상통, 분만 및 출산 중 통증, 햇빛화상을 비롯한 화상으로 초래되는 통증, 분만후통, 편두통, 협심통, 및 방광염통을 비롯한 요생식로 관련 통증을 포함하는 것이고, 또한 외상수용통 또는 통각을 포함한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 통증의 증상을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는 본 발명의 조성물의 투여로 통증의 증상이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "동물"은 척추동물을 의미하며, 바람직하게는 척추동물은 포유동물을 의미한다. 본 발명에서 사용된 "동물"이라는 용어는 보다 고등 척추동물인 포유류를 포함하며, 이는 사람을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 레졸빈 D1(resolvin D1; 7S,8R,17S-trihydroxy-4Z,9E,11E,13Z,15E,19Z-docosahexaenoic acid)을 유효성분으로 함유하는 열자극 통증 억제용 조성물을 제공한다.

상기 레졸빈 D1은 하기 [화학식 1]로 구성된 화합물인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:

.

상기 열자극 통증은 TRPV3(transient receptor potential vanilloid 3) 활성을 기반으로 하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 한가지 실시 태양에서는 TRPV3 특이적 활성제로 알려진 캠퍼(Camphor)에 의해 증가된 TRPV3 활성을 레졸빈 D1이 현저하게 억제하는 것을 확인하였다(도 1 참조). 또한, 본 발명의 한가지 실시 태양에서는 TRPV3 억제제가 마이크로몰랄 농도의 범위에서 TRPV3 활성에 억제 효과를 나타내는 것을 확인하였다(도 2 참조). 또한, 본 발명의 한가지 실시 태양에서는 레졸빈 D1이 CFA(Complete Freund's Adjuvant)에 의해 염증이 유발된 동물모델에서 열자극에 대한 감수성을 현저히 억제하는 것을 확인하였다(도 3 참조).

따라서 본 발명의 레졸빈 D1은 열자극 통증을 유발하는 TRPV3의 활성을 유의적으로 저해시켜 이에 의해 유발되는 열자극 통증을 효과적으로 저해할 수 있으므로 열자극 통증의 억제, 또는 열자극 통증의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

본 발명의 열자극 통증 억제용 조성물은 레졸빈 D1에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

상기 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

경구투여를 위한 고형제제에는 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 연질캅셀제, 환 등이 포함된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제로는 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 멸균된 수용액, 액제, 비수성용제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 좌제, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사제제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 바람직하게는 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용 약학적 조성물을 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 통상적으로 사용되는 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 활택제, 향미제 및 희석제등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실 리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 상기 붕해제로는 전분글리콜산나트륨, 크로스포비돈, 크로스카멜로스나트륨, 알긴산, 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 카르복시 메틸셀룰로오스 나트륨, 키토산, 구아검, 저치환도히드록시프로필셀룰로오스, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 폴라크릴린 칼륨 등이 있다.

또한, 본 발명에 따른 조성물은 약제학적으로 허용가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨, 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 ~ 90 중량부 포함되는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 일일 투 여량은 레졸빈 D1의 양을 기준으로 0.0001 내지 10 중량%이고, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량%이며, 하루 1 ~ 6 회 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은 통증의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 레졸빈 D1을 TRPV3 발현 세포에 처리하는 단계를 포함하는 TRPV3의 활성 억제 방법을 제공한다.

상기 레졸빈 D1은 10 내지 100 uM의 농도로 처리하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 TRPV3 발현 세포는 말초 감각신경세포 또는 피부세포인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명자들은 레졸빈 D1이 통증 수용체인 TRPV3의 활성을 특이적으로 현저히 억제하는 것을 확인함으로써, 레졸빈 D1을 처리하여 TRPV3의 활성을 효과적으로 억제할 수 있음을 알 수 있다.

본 발명의 한가지 실시 태양에서는 TRPV3 특이적 활성제로 알려진 캠퍼(Camphor)에 의해 증가된 TRPV3 활성을 레졸빈 D1이 현저하게 억제하는 것을 확 인하였다(도 1 참조). 또한, 본 발명의 한가지 실시 태양에서는 TRPV3 억제제가 마이크로몰랄 농도의 범위에서 TRPV3 활성에 억제 효과를 나타내는 것을 확인하였다(도 2 참조). 또한, 본 발명의 한가지 실시 태양에서는 레졸빈 D1이 CFA(Complete Freund's Adjuvant)에 의해 염증이 유발된 동물모델에서 열자극에 대한 감수성을 현저히 억제하는 것을 확인하였다(도 3 참조).

상기 개체는 척추동물이고 바람직하게는 포유동물이며, 그보다 바람직하게는 쥐, 토끼, 기니아피크, 햄스터, 개, 고양이와 같은 실험동물이고, 가장 바람직하게는 침팬지, 고릴라와 같은 유인원류 동물이다. 또한, 투여방법은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사, 자궁내 경막 주사, 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사 또는 흉부내 주사에 의해 투여될 수 있다.

상기 레졸빈 D1은 열자극 통증 억제를 위하여 상기 개체에 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

상기 약학적으로 유효한 양은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그 러나, 바람직한 효과를 위해서, 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.

본 발명은 레졸빈 D1을 이용한 TRPV3 활성 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.

구체적으로,

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 숙주세포는 HEK 세포주, CHO 세포주, HeLa 세포주 또는 RBL-2H3 세포주를 이용하는 것이 바람직하고, HEK 세포주를 이용하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 이온 채널 활성 연구 및 고효율 억제 제 검색에 이용할 수 있는 세포주라면 모두 이용가능하다.

상기 방법에 있어서, 단계 2)의 TRPV3 특이적 활성제는 캠퍼(Camphor)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 2)의 레졸빈 D1은 10 uM에서 100 uM의 농도로 처리하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 2)의 후보물질은 천연화합물, 합성화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아 또는 진균의 대사산물 및 생활성 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 3)의 이온 채널 활성의 측정은 전세포 전압 클램프 기술 또는 칼슘 이미지화에 의해 수행되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 한가지 실시 태양에서는 TRPV3 특이적 활성제로 알려진 캠퍼(Camphor)에 의해 증가된 TRPV3 활성을 레졸빈 D1이 현저하게 억제하는 것을 확인하였다(도 1 참조). 또한, 본 발명의 한가지 실시 태양에서는 TRPV3 억제제가 마이크로몰라 농도의 범위에서 TRPV3 활성에 억제 효과를 나타내는 것을 확인하였다(도 2 참조). 또한, 본 발명의 한가지 실시 태양에서는 레졸빈 D1이 CFA(Complete Freund's Adjuvant)에 의해 염증이 유발된 동물모델에서 열자극에 대한 감수성을 현저히 억제하는 것을 확인하였다(도 3 참조).

따라서, 본 발명자들은 TRPV3 과발현 형질세포주에서 캠퍼(Camphor)에 의해 증가된 TRPV3 활성에 대한 레졸빈 D1의 억제 효과와 비교하여 이와 유사하거나 보다 높은 억제 효과를 갖는 피검물질을 선별함으로써 TRPV3 활성 억제제를 스크리닝할 수 있음을 알 수 있다.

또한, 본 발명은 레졸빈 D1을 이용한 열자극 통증 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 열자극 통증은 TRPV3 활성을 기반으로 하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명자들은 TRPV3 과발현 형질세포주에서 캠퍼(Camphor)에 의해 증가된 TRPV3 활성에 대한 레졸빈 D1의 억제 효과와 비교하여 이와 유사하거나 보다 높은 억제 효과를 갖는 피검물질을 선별함으로써 TRPV3에 의해 매개되는 열자극 통증을 억제하는 통증 예방 및 치료제를 스크리닝할 수 있음을 알 수 있다.

구체적으로,

4) 단계 3)의 각각의 측정치를 비교하여 대조군보다 낮거나 유사한 TRPV3 이 온 채널 활성을 나타내는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 통증 예방 및 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 숙주세포는 HEK 세포주, CHO 세포주, HeLa 세포주 또는 RBL-2H3 세포주를 이용하는 것이 바람직하고, HEK 세포주를 이용하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 이온 채널 활성 연구 및 고효율 억제제 검색에 이용할 수 있는 세포주라면 모두 이용가능하다.

본 발명자들은 레졸빈 D1이 TRPV3를 발현하는 세포주에 대한 처리 반응에서 TRPV3의 활성화를 효과적으로 억제하여 세포내부로의 칼슘 유입을 차단하였으며, 염증이 유발된 동물 개체의 행동 실험 결과에서도 TRPV3 매개 통증인 열자극 통증의 반응역치가 레졸빈 D1 투여에 의하여 정상 수준으로 회복됨을 확인함으로써, 상기 레졸빈 D1을 열자극 통증 억제 또는 개선용 건강식품의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

본 발명의 레졸빈 D1은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에는 본 발명의 레졸빈 D1을 원료에 대하여 0.2 내지 20 중량%, 바람직하게는 0.24 내지 10 중량%로 첨가한다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

본 발명의 건강식품은 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제 로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강식품 100 중량부당 0.01~0.04 중량부, 바람직하게는 약 0.02~0.03 중량부 범위에서 선택하는 것이 바람직하다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 소세지, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 음료수, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강 식품을 모두 포함한다.

상기 외에 본 발명의 건강식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 건강식품은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강식품 100 중량부당 0.01~0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 실시예 및 제조예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용 이 하기 실시예 및 제조예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> TRPV3 형질전환 세포주 제조

본 발명자들은 HEK293 세포주(ATCC CRL-11268)를 hTRPV3(서열번호 1)의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드 DNA를 이용하여 일시적(transiently) 형질전환을 수행하였다.

구체적으로, HEK293T 세포주를 각각 24 웰 프레이트(well plate) 당 0.8 ㎍의 hTRPV3의 폴리뉴클레오티드(서열번호 1)를 포함하는 pcDNA5/FRT 벡터 및 0.2 ㎍/웰의 pCDNA3(Invitrogen Corp., USA; 녹색 형광 단백질 cDNA 포함)로 Fugene HD(Roche Diagnostics, 미국)를 이용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 형질전환하였다. 상기 형질전환된 세포를 24시간 동안 CO₂ 인큐베이터에서 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 DMEM 배지에서 배양하고, 폴리-L-오르트린 코팅된 유리 커버 슬립에 도말한 후, 10 내지 24시간 동안 추가 배양하였다.

<실시예 2> TRPV3 억제제에 의한 TRPV3의 활성화 변화 조사

<2-1> 화합물질 처리

본 발명자들은 상기 <실시예 1>의 방법으로 제조한 hTRPV3 형질전환 세포주에 4 mM 캄파(camphor; MP Biomedicals, USA)를 처리한 후, 상기 약물 처리기간 중 일부 기간 동안, 3 uM 또는 100 uM 레졸빈 D1(Resolvin D1: Cayman biochem, USA) 을 함께 처리하였다. 상기 화학물질들의 저장 용액은 물 또는 DMSO을 이용하여 제조하였고, 사용하기 직전에 검사용액으로 희석하여 사용하였다.

<2-2> 전기 생리학적인 방법으로 세포내 채널의 활성 측정

상기 실시예 <2-1>의 방법으로 처리된 형질전환 세포에 전기 생리학적인 측정을 수행하였다.

구체적으로, 배스 용액(bath solution)(140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂, 10 mM HEPES를 포함하고, NaOH를 이용하여 pH 7.4로 적정), 유리 피펫에는 피펫 용액(pipet solution, 140mM CsCl 10mM EGTA,10mM HEPES를 포함하고 pH 7.4로 적정), 및 상기 실시예 <2-1>의 방법으로 화학물질이 처리된 형질전환 세포를 사용하였다. 패치 클램프 세트(patch clamp set)를 이용하여 전체 세포 패치 클램프(whole cell patch clamp)를 실시하였고, 이중 전압 전류 상관 곡선을 이용하여 이온 채널 특이적인 반응임을 확인하였으며, 이와 동시에 레졸빈 D1에 의해 효과적으로 억제함을 확인하였다. 상기 패치 클램츠 세트(patch clamp set)는 multiclamp 700B(molecular device, 미국)을 이용하여 미세한 신호를 증폭하고, digidata1332a(Molecular device, 미국)를 이용하여 아날로그 신호를 디지털화하였다. pClamp 10(Molecular device, 미국)을 이용하여 데이터를 수집 및 기계를 조작하였으며, clemp X-10(Molecular device, 미국)을 이용하여 데이터를 편집했다.

실험 결과는 양측 꼬리(two-tailed), 쌍을 이루지 않는(unpaired) 스튜던트 검정(Student's t-test)을 이용하여 통계적으로 분석하였고, 평균 ± 표준편차의 형태로 나타내었다. 또한, **P < 0.01 및 *P < 0.05이었다.

그 결과, 도 1에서 나타난 바와 같이 레졸빈 D1은 TRPV3 채널을 억제함을 확인하였다(도 1).

<2-3> 칼슘 이미지화를 이용한 세포내 칼슘수준변화 측정

상기 실시예 <2-1>의 방법으로 화학물질이 처리된 형질전환 세포에 칼슘 이미지화를 수행하였다.

구체적으로, 0.02% 풀루로닉산(pluronic acid; Invitrogen, USA)을 포함하는 배스 용액(bath solution)(140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂, 10 mM HEPES를 포함하고, NaOH를 이용하여 pH 7.4로 적정함)에서 상기 실시예 <2-1>의 방법으로 화학물질이 처리된 형질전환 세포에 Fura2-AM(5 uM; invitorgen, USA)을 37℃에서 1시간 동안 주입하였다. 이후, 퓨라 2 칼슘 이미지 시스템 올림푸스(fura2 calcium image system olympus) 형광 현미경(Olympus, 일본)을 이용하여 칼슘 이미지화(Calcium imaging)를 수행하였고, 메타 플로우(Meta flow)(Morecular device, 미국)를 이용하여 촬영이미지(time-lapse image; 340 nm /380 nm)를 매 3초마다 측정하여 그 비율로 나타내었다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 레졸빈 D1은 TRPV3의 활성화를 억제하는 것을 확인하였다(도 2).

<실시예 3> TRPV3의 농도 의존적 반응 확인

상기 <실시예 1>의 방법으로 제조한 TRPV3 형질전환 세포주에 0.1 내지 1000 μM 레졸빈 D1을 각각 처리한 후, 상기 실시예 <2-2>의 방법으로 칼슘 이미지화를 수행하였다. 이후, 측정값을 Hill-plot을 이용하여 농도-반응 곡선으로 작성하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 레졸빈 D1의 TRPV3에 대한 IC₅₀은 약 11.09 μM이었고, N 값은 약 1.10이었으며, 약 10 내지 100 μM 농도 범위에서 TRPV3 활성을 급격히 억제하는 것으로 나타나 레졸빈 D1이 마이크로몰라 농도의 범위에서 TRPV3에 대한 활성 효과를 가지는 것으로 확인되었다.

<실시예 4> 동물 통증 행동 실험을 통한 레졸빈 D1 통증억제 반응 조사

<4-1> 생쥐의 준비 및 분류

본 발명자들은 성체 ICR계 생쥐(한림실험동물연구소, 한국)들을 각각 5마리씩 무작위로 분류한 후, 아무것도 처리하지 않은 대조군, 3 mM의 레졸빈 D1을 처리한 실험군 1, 생쥐의 뒷발에 CFA(complete Freund`s adjuvant)(Sigma, USA)를 10 ul씩 주입한 후 24시간 방치하여 염증을 유발한 실험군 2, 및 생쥐의 뒷발에 CFA를 10 ul씩 주입한 후 24시간 방치하여 염증을 유발한 다음 3 mM의 레졸빈 D1을 처리한 실험군 3으로 각각 분류하였다.

<4-2> 염증 유발 및 열자극에 의한 행동 분석

상기 실시예 <4-1>에서 분류한 각 실험군의 뒷발에 열자극 기계 장치를 이용하여 주사한 다음, 자극에 대해 회피하는 시간을 측정하였다. 열자극 기계 장치는 Hagrvess test(Ugo bassle, Italy)를 사용하였고 IR 강도는 50을 사용하였다. 무작위적으로 3회 각각 측정한 다음, 통계처리하였다.

그 결과, 도 4에서 나타난 바와 같이 레졸빈 D1은 염증 유발 전에는 감각이상을 보이지 않았으나, 염증을 유발한 후에는 염증에 의해 비정상적으로 짧아진 열자극에 의한 회피 시간을 정상으로 회복시키는 효과를 보였다(도 4).

<제조예 1> 약학적 제제의 제조

<1-1> 산제의 제조

레졸빈 D1 2 g

유당 1 g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

<1-2> 정제의 제조

레졸빈 D1 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

<1-3> 캡슐제의 제조

레졸빈 D1 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

<1-4> 환의 제조

레졸빈 D1 1 g

유당 1.5 g

글리세린 1 g

자일리톨 0.5 g

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1환 당 4 g이 되도록 제조하였다.

<1-5> 과립의 제조

레졸빈 D1 150 ㎎

대두추출물 50 ㎎

포도당 200 ㎎

전분 600 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 30% 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 섭씨 60 ℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.

<제조예 2> 식품의 제조

<2-1> 밀가루 식품의 제조

본 발명의 레졸빈 D1 0.5 ~ 5.0 중량부를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하였다.

<2-2> 유제품(dairy products)의 제조

본 발명의 레졸빈 D1 5 ~ 10 중량부를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

<2-3> 선식의 제조

현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.

검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.

본 발명의 레졸빈 D1을 진공 농축기에서 감압농축하고, 분무, 열풍건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60 메쉬로 분쇄하여 건조분말을 얻었다.

상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 레졸빈 D1을 다음의 비율로 배합하여 제조하였다.

곡물류(현미 30 중량부, 율무 15 중량부, 보리 20 중량부),

종실류(들깨 7 중량부, 검정콩 8 중량부, 검정깨 7 중량부),

레졸빈 D1(3 중량부),

영지(0.5 중량부),

지황(0.5 중량부)

<제조예 3> 음료의 제조

건강음료의 제조

레졸빈 D1 1000 ㎎

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 ℓ용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다. 상기 조성비는 비교적 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

본 발명은 오메가3 지방산 대사체인 레졸빈 D1이 TRPV3의 활성화를 억제하는 현상을 통해 레졸빈 D1을 이용하여 TRPV3 활성 억제제를 개발할 수 있으며, TRPV3 활성에 기인한 열자극 통증의 치료제 개발을 가능하게 한다.

도 1은 세포주에서 발현된 hTRPV3가 레졸빈 D1에 의해 억제됨을 전기 생리학적인 이온 채널의 열림 억제 효과의 측정을 통해 억제효과가 있음을 나타낸 것으로, 30 μM 레졸빈 D1이 4 mM 캄파(camphor)에 의해 활성화된 TRPV3 반응을 전기 생리학적인 방법으로 억제함을 나타낸 그래프이다(RSD: 레졸빈 D1, camp: 캄파).

도 2는 세포주에서 발현된 mTRPV3이 레졸빈 D1에 의해 억제됨을 칼슘의 세포내 유입 억제 효과의 측정을 통해 억제효과가 있음을 나타낸 것으로, 30 μM 레졸빈 D1이 칼슘 이미지화 실험에서 유용하게 억제됨을 나타낸 그래프이다(RSD: 레졸빈 D1, camp: 캄파).

도 3은 농도에 따른 TRPV3 활성화에 의한 칼슘 유입양을 나타낸 농도-반응 곡선으로서 각각의 활성을 Hill-plot 방법으로 도표화하여 나타낸 그래프이다. 그 결과, 11.09 uM의 IC₅₀ 값을 얻었고 N 값은 1.10이었다(RSD: 레졸빈).

도 4는 염증에 의한 열자극 조사법에 의해 열을 조사한 쥐에서 열자극에 대한 회피 시간을 평균하여 나타낸 그래프이다. 그 결과, CFA로 유발된 염증에 의해 열자극에 대한 회피 시간이 빨라졌으며 이를 레졸빈 D1이 효과적으로 회복시킴을 나타낸다(RSD: 레졸빈 D1, CFA: complete Freund's Adjuvant, ND: 정상상태)..

<110> KOREA UNIVERSITY Industry & Academy Collaboration Foundation <120> Novel TRPV3 inhibitor and use thereof <130> 9P-08-45 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 3420 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ccacaacttc gatcttggca cctgcggcct cccctgcctt ttctccggtg gggatgaggc 60 tgctgtgtgg gtgtgggggt gactcacacg ggccacgtgg gtgggcgggt gctgcagctg 120 tggctggtgg gcgtggcctg cctggcgccg agggcaggtg gctcagccag ttctgcctct 180 gacgcctcat tccagccatc cctctgcctg caatgagagc ttcccgccgc ctcagccaca 240 gtcccacccg ggggccttgg gccccagaca tgcggtgatc tcagggcaag ggttgccacg 300 accacccaga acctcaccag ccatgaaagc ccaccccaag gagatggtgc ctctcatggg 360 caagagagtt gctgccccca gtgggaaccc tgccatcctg ccagagaaga ggccggcgga 420 gatcaccccc acaaagaaga gtgcacactt cttcctggag atagaagggt ttgaacccaa 480 ccccacagtt gccaagacct ctcctcctgt cttctccaag cccatggatt ccaacatccg 540 gcagtgcatc tctggtaact gtgatgacat ggactccccc cagtctcctc aggatgatgt 600 gacagagacc ccatccaatc ccaacagccc cagtgcacag ctggccaagg aagagcagag 660 gaggaaaaag aggcggctga agaagcgcat ctttgcagcc gtgtctgagg gctgcgtgga 720 ggagttggta gagttgctgg tggagctgca ggagctttgc aggcggcgcc atgatgagga 780 tgtgcctgac ttcctcatgc acaagctgac ggcctccgac acggggaaga cctgcctgat 840 gaaggccttg ttaaacatca accccaacac caaggagata gtgcggatcc tgcttgcctt 900 tgctgaagag aacgacatcc tgggcaggtt catcaacgcc gagtacacag aggaggccta 960 tgaagggcag acggcgctga acatcgccat cgagcggcgg cagggggaca tcgcagccct 1020 gctcatcgcc gccggcgccg acgtcaacgc gcacgccaag ggggccttct tcaaccccaa 1080 gtaccaacac gaaggcttct acttcggtga gacgcccctg gccctggcag catgcaccaa 1140 ccagcccgag attgtgcagc tgctgatgga gcacgagcag acggacatca cctcgcggga 1200 ctcacgaggc aacaacatcc ttcacgccct ggtgaccgtg gccgaggact tcaagacgca 1260 gaatgacttt gtgaagcgca tgtacgacat gatcctactg cggagtggca actgggagct 1320 ggagaccact cgcaacaacg atggcctcac gccgctgcag ctggccgcca agatgggcaa 1380 ggcggagatc ctgaagtaca tcctcagtcg tgagatcaag gagaagcggc tccggagcct 1440 gtccaggaag ttcaccgact gggcgtacgg acccgtgtca tcctccctct acgacctcac 1500 caacgtggac accaccacgg acaactcagt gctggaaatc actgtctaca acaccaacat 1560 cgacaaccgg catgagatgc tgaccctgga gccgctgcac acgctgctgc atatgaagtg 1620 gaagaagttt gccaagcaca tgttctttct gtccttctgc ttttatttct tctacaacat 1680 caccctgacc ctcgtctcgt actaccgccc ccgggaggag gaggccatcc cgcacccctt 1740 ggccctgacg cacaagatgg ggtggctgca gctcctaggg aggatgtttg tgctcatctg 1800 ggccatgtgc atctctgtga aagagggcat tgccatcttc ctgctgagac cctcggatct 1860 gcagtccatc ctctcggatg cctggttcca ctttgtcttt tttatccaag ctgtgcttgt 1920 gatactgtct gtcttcttgt acttgtttgc ctacaaagag tacctcgcct gcctcgtgct 1980 ggccatggcc ctgggctggg cgaacatgct ctactatacg cggggtttcc agtccatggg 2040 catgtacagc gtcatgatcc agaaggtcat tttgcatgat gttctgaagt tcttgtttgt 2100 atatatcgtg tttttgcttg gatttggagt agccttggcc tcgctgatcg agaagtgtcc 2160 caaagacaac aaggactgca gctcctacgg cagcttcagc gacgcagtgc tggaactctt 2220 caagctcacc ataggcctgg gtgacctgaa catccagcag aactccaagt atcccattct 2280 ctttctgttc ctgctcatca cctatgtcat cctcaccttt gttctcctcc tcaacatgct 2340 cattgctctg atgggcgaga ctgtggagaa cgtctccaag gagagcgaac gcatctggcg 2400 cctgcagaga gccaggacca tcttggagtt tgagaaaatg ttaccagaat ggctgaggag 2460 cagattccgg atgggagagc tgtgcaaagt ggccgaggat gatttccgac tgtgtttgcg 2520 gatcaatgag gtgaagtgga ctgaatggaa gacgcacgtc tccttcctta acgaagaccc 2580 ggggcctgta agacgaacag atttcaacaa aatccaagat tcttccagga acaacagcaa 2640 aaccactctc aatgcatttg aagaagtcga ggaattcccg gaaacctcgg tgtagaagcg 2700 gaacccagag ctggtgtgcg cgtgcgctgt ctggcgctgc aggcggagtc accgactctg 2760 tgcagagagg ctttgaggga tggtggagtc cggctctgct ggcctagaag cagagtgcac 2820 cctcgtgctc agtgctcagt gggtgtctga actgaggggc agttgtcaat ttgtctgagt 2880 gggaaacatc ctggattttg ttacttggca aacagctggt gtaaacctac agccagcagc 2940 agtctggagc ctgggagcct cctgaagtcc cgggtgaagc ctctggtttt accaattgca 3000 ggtcggcttg gctgggagag atggatggcg ggaaaggggc agcagtcttg aggagcaggg 3060 agaggagtct ttcctcctgc cagcttcccc cgtcagcccc aaccccagcc cacacattgt 3120 accatctctt ctgctgtgac tgggttgcct gaatttgtgg gagacccgtg atcccatccc 3180 agagtgtgcg ggggacggag gtaagctgga tatcctgggg gaggagggga atgcgctctg 3240 gaaacaccct tccggaaccc ttcggggaaa aggagaccat ccttggagtg aacgtcccct 3300 gacaccccaa ggttcaaact gtctcaagct gagagatgtt tttagtagca gaattaacac 3360 agggttttaa cttgcaatac ggaaaagaca tttcagttga gaatgaaaat tactacaatg 3420 3420

Claims

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1) 시험관내(In vitro)에서, TRPV3를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드가 분리된(isolated) 숙주세포에 형질도입된 형질전환체를 제조하는 단계;

2) 상기 형질전환체에 실험군으로 TRPV3 특이적 활성제와 TRPV3 활성 억제제 후보물질을 처리하고, 대조군으로 TRPV3 특이적 활성제와 레졸빈 D1을 각각 처리하는 단계;

3) 단계 2)의 실험군과 대조군의 TRPV3 이온 채널 활성을 각각 측정하는 단계; 및,

4) 단계 3)의 각각의 측정치를 비교하여 대조군보다 낮거나 유사한 TRPV3 이온 채널 활성을 나타내는 TRPV3 활성 억제제 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는 TRPV3 활성 억제제 스크리닝 방법.
제 6항에 있어서, 단계 2)의 TRPV3 특이적 활성제는 캠퍼(Camphor)인 것을 특징으로 하는 TRPV3 활성 억제제 스크리닝 방법.
제 6항에 있어서, 단계 3)의 이온 채널 활성의 측정은 전세포 전압 클램프 기술 또는 칼슘 이미지화에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 TRPV3 활성 억제제 스크리닝 방법.
1) 시험관내(In vitro)에서, TRPV3를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드가 분리된(isolated) 숙주세포에 형질도입된 형질전환체를 제조하는 단계;

2) 상기 형질전환체에 실험군으로 TRPV3 특이적 활성제와 피검물질을 처리하고, 대조군으로 TRPV3 특이적 활성제와 레졸빈 D1을 각각 처리하는 단계;

3) 단계 2)의 실험군과 대조군의 TRPV3 이온 채널 활성을 각각 측정하는 단계; 및,

4) 단계 3)의 각각의 측정치를 비교하여 대조군보다 낮거나 유사한 TRPV3 이온 채널 활성을 나타내는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 염증을 동반한 열자극 통증 억제제 스크리닝 방법.
제 9항에 있어서, 단계 2)의 TRPV3 특이적 활성제는 캠퍼(Camphor)인 것을 특징으로 하는 염증을 동반한 열자극 통증 억제제 스크리닝 방법.
제 9항에 있어서, 단계 3)의 이온 채널 활성의 측정은 전세포 전압 클램프 기술 또는 칼슘 이미지화에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 염증을 동반한 열자극 통증 억제제 스크리닝 방법.
제 9항에 있어서, 열자극 통증은 TRPV3 활성을 기반으로 하는 것을 특징으로 하는 염증을 동반한 열자극 통증 억제제 스크리닝 방법.
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