KR102124587B1

KR102124587B1 - 고리매 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 근육질 개선용 조성물

Info

Publication number: KR102124587B1
Application number: KR1020180098084A
Authority: KR
Inventors: 한명석; 김정환
Original assignee: 한명석
Priority date: 2017-12-29
Filing date: 2018-08-22
Publication date: 2020-06-18
Also published as: KR20190082054A

Abstract

본 발명은 고리매 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 근육질 개선용 조성물에 관한 것으로, 상기 고리매 열수추출물은 세포독성 없이 농도의존적으로 마이오스타틴과 결합하여 마이오스타틴과 수용체의 결합을 방해함으로써 항 마이오스타틴 효과를 나타내었으며, 고리매 열수추출물이 경구투여된 마우스 동물모델의 근 밀도 및 근력 향상이 확인됨에 따라, 상기 고리매 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 근육질 개선용 조성물 및 마이오스타틴 관련 질환 예방 또는 개선용 조성물로 제공될 수 있다.

Description

고리매 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 근육질 개선용 조성물{Composition for improving muscular quality comprising scytosiphon lomentaria extract or its fraction}

본 발명은 고리매 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 근육질 개선용 조성물에 관한 것이다.

사람의 근육은 40세 이후부터 매년 1% 이상씩 감소하여 80세가 되면 최대 근육량의 50% 수준이 감소되며, 노년의 근육 감소는 전반적인 신체기능을 떨어뜨리는 가장 중요한 요소로 인식되고 있다.

노화가 진행될수록 근육과 지방의 함량, 골격 왜곡 등 체형이 변화되는 것을 인지하게 되는데, 노년기 근 감소에 의한 비만 유병률은 전 세계적으로 30% 이상 수준에서 지속적인 증가 추세를 보이고 있다. 또한, 인슐린 분비 이상인 경우 세포에 에너지를 제대로 공급하지 못해 근육발달장애를 일으킬 수 있어, 일반인보다 당뇨병 환자에게 근감소증이 증가한다. 이러한 근감소증은 골다공증, 인슐린저항성 및 관절염과 같은 노인성 만성질환과도 밀접하게 관계가 있는 것으로 알려져있다.

또한, 근 감소에 의한 또 다른 질병인 근 위축은 근육량의 점진적 감소에 의하여 발생하는 것으로, 비활동, 산화적 스트레스, 만성 염증 등에 의해 단백질 분해가 합성보다 더 일어날 때 발생되며, 근육의 약화 및 퇴행이 나타난다. 이러한 근감소의 치료법으로 미토콘드리아 생성 증가, 근육 단백질 분해억제, 항염제 등이 제시되고 있으나 뚜렷한 치료약이 없는 실정이다.

최근 많은 사람들은 단백질 보충제를 대안으로 선택하고 있지만 단백질 보충제는 단백질 과다 섭취의 원인이 되어 부작용이 나타날 가능성이 높으며, 더욱이 신장질환이 있는 경우 고단백질 식이를 할 수 없으며 노화에 따라 신장 기능 또한 감소되므로, 근감소증 예방 및 개선을 위한 새로운 대안이 필요한 실정이다.

마이오스타틴 (Myostatin)은 형질전화 생장인자-β (TGF-β, Transforming growth factor-β) 슈퍼패밀리 중의 하나로 근육성장 및 분화를 억제하는 기능을 가진 단백질이다. 이러한 마이오스타틴은 TGF 작용기전과 유사하게 세포표면에 존재하는 세린/트레오닌 키나아제 (serin/threonine kinase) 활성도를 가진 특이 수용체와 결합하여 SMAD 신호전달계를 활성화시켜 핵에서 근육의 추가적인 합성을 방해하는 역할을 하기 때문에 마이오스타틴의 과다한 방출은 핵의 세포분열을 방해하여 근육의 생성을 억제하는 효과를 나타낸다.

고리매는 갈조식물 디크티오시폰목 고리매과의 해조류로 식물체는 연한 갈색의 가는 대롱 모양으로 위 아래 쪽으로 조금씩 가늘어지고 곳곳에 잘록한 부분이 있으며 단추모양의 기부에서 모여나는 것이 특징으로 고리매의 근력증가 효과에 대해서는 아직까지 전혀 보고된 바가 없다.

대한민국 공개특허 제10-2018-0048416호 (2018. 05. 10. 공개)

본 발명은 생체에 안전하고 우수한 근육질 개선효과를 나타내는 고리매 추출물을 근육질 개선용 조성물로 제공하고자 한다.

본 발명은 고리매 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 근육 질 개선용 조성물을 제공한다.

본 발명은 고리매 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 근육질 개선용 사료첨가제를 제공한다.

본 발명은 고리매 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 마이오스타틴 관련 질환 예방 또는 개선용 건강식품을 제공한다.

본 발명은 고리매 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 마이오스타틴 관련 질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 고리매 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 마이오스타틴 관련 질환 예방 또는 치료용 수의학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 고리매 열수추출물은 세포독성 없이 농도의존적으로 마이오스타틴과 결합하여 마이오스타틴과 수용체의 결합을 방해함으로써 항 마이오스타틴 효과를 나타내었으며, 고리매 열수추출물이 경구투여된 마우스 동물모델의 근 밀도 및 근력 향상이 확인됨에 따라, 상기 고리매 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 근육질 개선용 조성물 및 마이오스타틴 관련 질환 예방 또는 개선용 조성물로 제공될 수 있다.

도 1은 고리매 열수추출물 제조과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 고리매 열수추출물(SLWE)의 항-마이오스타틴(MSTN), 항-액티빈 A(Activin A), 항-GDF11 활성, 세포독성(cytotoxicity) 및 항-산화활성을 확인한 결과로, 도 2(A)는 재조합 마이오스타틴 억제 활성을 확인한 결과이며, 도 2(B)는 재조합 액티빈 A 억제 활성을 확인한 결과이며, 도 2(C)는 세포독성을 확인한 결과이며, 도 2(D)는 DPPH 라디칼 소거능을 확인한 결과이다.
도 3은 HepG2 세포에서 고리매 열수추출물(SLWE)의 마이오스타틴 신호 차단 효과를 확인한 결과로, MSTN 길항제로서의 SLWE의 효과를 확인한 웨스턴 블롯 분석으로, 라인 1은 미처리군이며, 라인 2는 10 nM MSTN 처리군이며, 라인 3은 10 nM MSTN 및 10 μM SB431542 처리군이며, 라인 4는 10 nM MSTN 및 SLWE(IC100) 처리군이며, 라인 5는 10 nM MSTN 및 SLWE(IC10) 처리군이다.
도 4는 마우스 모델에서 하루 한 번 고리매 열수추출물(SLWE)을 690 μg/200 μl 용량으로 14일간 경구투여하고 고리매 열수추출물의 근력 개선 효과를 확인한 결과로, 도 4(A)는 몸무게 측정 결과이며, 도 4(B)는 악력(grip strength)을 확인한 결과이며, 도 4(C)는 0, 7 및 14일 마다 수영 지구력(swimming endurance)을 확인한 결과로, 각 그래프의 흰색 바는 대조군(n=12)이며, 검은색 바는 SLWE 처리군(n=10)이고, 각 오류 막대는 표준 오류를 나타내었다 (*p < 0.1, ** p < 0.01, *** p < 0.005 and **** p < 0.001 compared with the control).
도 5는 하루 한 번 고리매 열수추출물(SLWE)을 690 μg/200 μl 용량으로 14일간 경구투여한 마우스 모델의 근 발달 수준을 확인한 결과로, 도 5(A)는 앞다리와 뒷다리 근육의 질량을 확인한 결과이며, 도 5(B)는 앞다리와 뒷다리 근육의 부피를 확인한 결과이며, 도 5(C)는 앞다리와 뒷다리 근육의 밀도를 확인한 결과이다.
도 6은 하루 한 번 고리매 열수추출물(SLWE)을 690 μg/200 μl 용량으로 14일간 경구투여한 마우스 모델의 복대정맥으로부터 채혈된 혈액에서 분리된 혈청에서 총 콜레스테롤 (Total cholesterol; TC), 트리글리세리드 (Triglyceride; TG), 글루코스 (Glucose; GLU), 젖산탈수소효소 (Latate dehydrogenase; LDH) 활성, 글루타티온 과산화효소 (Glutathione peroxydase; GPx) 활성, HDL 및 LDL/VLDL, 유리 지방산 (Free fatty acid; FFA)을 분석한 결과이다.
도 7(A)는 고리매 열수추출물(SLWE)의 유기용매 분획물 준비과정을 나타내는 모식도이며, 도 7(B)는 고리매 열수추출물(SLWE)의 유기용매 분획물의 항 마이오스타틴 효과를 확인한 결과이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명은 근육질 개선용 조성물에 관한 것으로, 근 감소를 개선하기 위한 방법으로 단백질 보충제를 대안으로 선택하고 있지만 단백질 보충제는 단백질 과다 섭취의 원인이 되어 부작용이 나타날 가능성이 높으며, 신장질환 환자 또는 노화에 따른 신장 기능 감소의 경우, 고단백질 식이의 어려움이 있다. 이에 따라, 본 발명자들은 근감소증 예방 및 개선을 위한 새로운 대안을 연구하던 중 천연 추출물인 고리매 추출물이 근육의 밀도 및 근력 개선에 우수한 효과를 나타내는 것을 확인함에 따라 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 고리매 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 근육 질 개선용 조성물을 제공할 수 있다.

상기 고리매 추출물은 물, C1 내지 C4의 알콜 또는 이들의 혼합용매로 추출된 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 열수추출물일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 상기추출물은 추가의 분획공정을 수행할 수 있다. 보다 바람직하게는 고리매 열수추출물을 에틸아세테이트 및 물 혼합용액을 이용하여 분획하고 추출하여 얻은 물 분획물에 부탄올 및 물 혼합용액을 이용하여 분획하고 추출하여 수득한 부탄올 분획물일 수 있다.

상기 고리매 추출물 또는 이의 분획물은 항 마이오스타틴 활성을 나타낼 수 있다.

본 발명의 실시예에 따르면, 고리매 열수추출물이 마이오스타틴 신호전달 경로에 미치는 영향을 확인하기 위해, Smad2 전사인자의 인산화 정도를 웨스턴 블롯 분석으로 확인한 결과, 도 2와 같이 마이오스타틴만 처리된 실험군에서는 마이오스타틴의 신호가 전달되어 인산화된 Samd2의 발현이 증가된 반면, 마이오스타틴과 SLWE(IC100)이 동시에 처리된 실험군에서는 SB431542이 처리된 양성대조군과 동일하게 SLWE이 마이오스타틴 신호를 억제하여 Samd2의 인산화가 억제된 것이 확인되었으며, 낮은 농도의 SLWE가 처리된 실험군에서는 마이오스타틴 신호를 완전히 억제하지 못하여 Samd2의 인산화가 확인되었다.

상기 결과로부터 SLWE는 농도의존적으로 마이오스타틴과 결합하여 마이오스타틴이 수용체 결합을 방해함으로써 Samd2 신호 전달을 억제하는 것이 확인되었다.

또한, 상기 고리매 추출물 또는 이의 분획물은 근 밀도를 증가시켜 근력을 향상시키는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에 따르면, 4주령 수컷 ICR 마우스에 14일 동안 1일 1회 경구투여하고 0, 7 및 14일 마다 체중과 근력테스트를 진행한 결과, 도 3(A)와 같이 마우스의 체중은 대조군과 비교하여 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 또한, 도 3(B)를 참고하면 고리매 열수추출물 경구 투여 7일 후 대조군에 비해 근력이 15.7% 유의적으로 증가하였으며, 14일 후에는 대조군에 비해 약 8.8% 유의적으로 증가하였다. 또한, 수영 지구력을 확인한 결과, 도 3(C)와 같이 대조군의 증감에 비해 고리매 열수추출물이 처리된 실험군에서는 유의적인 차이가 나타나지 않았는 것이 확인됨에 따라, 고리매 열수추출물은 체중변화 없이 근력을 유의적으로 증가시키는 것이 확인되었다.

본 발명은 고리매 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 근육질 개선용 사료첨가제를 제공할 수 있다.

상기 사료첨가제는 가축의 육질을 개선하기 위한 가축용으로 사용될 수 있으며, 적합한 동물로서는 산란계 닭, 오리, 칠면조 및 거위등의 가금류, 소, 말, 염소 및 양 등의 반추동물, 돼지류, 토끼 등의 설치류 및 어류를 포함하여 매우 광범위하게 사용될 수 있다.

본 발명의 사료첨가제에 포함되는 물질은 고리매 추출물 외에 통상의 가축용 사료첨가제에 사용되는 물질이라면 특별히 한정되지 않는다.

또한, 본 발명은 고리매 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 마이오스타틴 관련 질환 예방 또는 개선용 건강식품을 제공할 수 있다.

상기 마이오스타틴 관련 질환은 근육 감소(muscle wasting) 질환, 대사 질환, 퇴행성 골 질환, 성기능 항진증(hypogonadism) 및 악액질(cachexia)로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

상기 근육 감소 질환은 근이영양증(muscular dystrophy), 경직성 척추 증후군(rigid spine syndrome), 근육-눈-뇌병(muscle-eye-brain disease), 근위축성 측삭경화증(루게릭병, amyotrophic lateral sclerosis), 샤르코-마리-투스병(Charcot-Marie-Tooth disease), 만성 염증성 신경증(chronic inflammatory neuropathy) 및 말단근병증(distal myopathy)으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

상기 대사질환은 제2형 당뇨병(type 2 diabetes), 비인슐린의존성 당뇨(noninsulin-dependent diabetes mellitus), 과혈당증(hyperglycemia), 비만 및 당뇨합병증으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

상기 퇴행성 골 질환은 골다공증일 수 있다.

상기 건강식품은 상기 고리매 추출물 또는 이의 분획물 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를 들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

상기 건강식품에 함유된 화합물의 유효용량은 상기 치료제의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.

상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제등을 들 수 있다.

또한, 본 발명은 고리매 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 마이오스타틴 관련 질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공할 수 있다.

본 발명은 고리매 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 마이오스타틴 관련 질환 예방 또는 치료용 수의학적 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 고리매 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 마이오스타틴 관련 질환 예방 또는 치료용 약학조성물은 통상적인 방법에 따라 주사제, 과립제, 산제, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제, 겔, 현탁제, 유제, 점적제 또는 액제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형을 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 고리매 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 마이오스타틴 관련 질환 예방 또는 치료용 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.

구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면 상기 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.

상기 고리매 추출물 또는 이의 분획물의 바람직한 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 이에 제한되는 것은 아니지만 1일 투여량이 0.01 내지 200 mg/kg, 구체적으로는 0.1 내지 200 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 '대상체'는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 고리매 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하며, 상기 고리매 추출물 또는 이의 분획물은 생체 외 (in vitro)에서 세포의 마이오스타틴 활성을 억제시키는 것을 특징으로 하는, 마이오스타틴 활성 억제용 시약조성물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 생체 외 (in vitro)에서 고리매 추출물 또는 이의 분획물을 세포에 처리하는 단계를 포함하는 마이오스타틴 활성 억제 방법을 제공할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 1> 고리매 추출물 준비

고리매 추출물을 도 1과 같은 과정으로 준비하였다.

증류수 1ml에 건조된 고리매 20mg을 첨가하여 90℃에서 20분간 열수 추출하였으며, 상기 과정을 3회 반복하였다.

회전 감압 농축기를 이용하여 추출된 시료에서 용매를 제거하고 4000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다.

pore size 0.2 μM 필터를 이용하여 상등액 내 입자를 완전히 제거한 후 원심회전 농축기를 이용하여 시료의 농도를 측정하였다.

그 결과, 고리매 열수 추출물은 약 16% 수율로 얻어진 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 2> 고리매 추출물의 항 마이오스타틴 및 항 액티빈 A 활성 억제 효과 확인

루시퍼레이즈 분석을 수행하여 세포수준에서 항 마이오스타틴 활성을 확인하였다.

HEK293 세포를 96 웰 플레이트에 웰 당 2.0×10⁴ 세포로 분주하고 10% 태아소혈청(FBS), 1% 페니실린/스트렙토마이신, 1% 겐타마이신(geneticine)이 포함된 DMEM 배지를 이용하여 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다.

24시간 배양 후 FBS가 포함되지 않은 DMEM 배지로 교체하고, 1nM 재조합 마이오스타틴(R&D system, USA)과 고리매 열수추출물(SLWE)을 1, 10 및 100 μg/ml로 처리한 후 5% CO₂ 배양기에서 24시간 배양하였다.

배양 후 배지를 제거하고 DMEM 배지 6 μl와 시약(Bright-Glo luciferase assay system, USA) 6 μl을 처리하여 마이크로플레이트 발광측정기(microplate luminometer)에서 발광을 측정하였다.

측정된 수치는 양성 대조군과 음성 대조군의 수치 및 하기 계산식 1을 이용하여 항 마이오스타틴 활성(%)으로 나타내었다.

[계산식 1]

항 마이오스타틴 활성(%) = [(Firefly RLU of 1nM Myostatin (positive control) - Firefly RLU of the group treated with the extracts) × 100) / (Firefly RLU of 1nM Myostatin (positive control) - Firefly RLU of no treatment group (negative group)]

또한, 마이오스타틴과 같은 슈퍼패밀리에 속해있는 액티빈 A에 대한 고리매 추출물의 저해 활성을 확인하기 위해, 상기 루시퍼레이즈 분석방법으로 액티빈 A 저해 활성을 확인하였다.

액티빈 A의 농도는 앞선 실험의 마이오스타틴과 동일하게 1 nM 농도를 세포에 처리하여 저해활성을 확인하였으며, 하기 계산식 2를 이용하여 항 액티빈 A 활성(%)으로 나타내었다.

[계산식 2]

항 액티빈 활성(%) = [(Firefly RLU of 1 nM ActivinA (positive group) - Firefly RLU of the group treated with the extracts × 100) / (Firefly RLU of 1 nM ActivinA (positive group) - Firefly RLU of no treatment(negative group)]

그 결과, 도 1(A)와 같이 1nM 마이오스타틴에 대한 고리매 열수추출물 (SLWE)의 IC₅₀값은 11.9 μg/ml로 확인되었으며, 1, 10 및 100 μg/ml 농도의 SLWE이 처리된 실험군 어디에서도 마이오스타틴와 같은 슈퍼패밀리에 속하는 액티빈 A(1 nM)에 대한 저해 활성이 나타나지 않았다.

상기 결과로부터 SLWE 10 μg/ml 농도 이하에서는 액티빈 A에 대한 저해활성 없이 특이적인 마이오스타틴 억제 활성이 나타나는 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 3> 고리매 추출물의 세포독성 및 항산화 활성 확인

고리매 열수추출물 (SLWE)의 세포독성을 확인하기 위해, HSK293 세포를 96 웰 플레이트에 웰 당 1×10⁴ 세포로 분주하여 5% CO₂ 배양기에서 24시간 배양하였으며, 10% 태아소혈청(FBS)와 1% 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 DMEM 배지를 사용하였다.

24시간 배양 후 고리매 열수추출물을 0.1, 1, 10 및 100 μg/ml 농도로 처리하여 5% CO₂ 배양기에서 12시간 추가 배양한 후, WST 시약 (DaeilLab, Korea) 10 μl를 1시간 동안 처리하여 반응시키고 415 nm에서 흡광도를 측정한 후, 하기 계산식 3을 이용하여 세포독성 값을 나타내었다.

양성 대조군은 어떠한 처리도 하지 않은 세포군을 이용하였으며, H₂O₂ 처리군은 음성 대조군으로 세포사멸을 유도하였다.

그 결과, 도 1(C)와 같이 고리매 열수추출물의 모든 농도에서 세포독성이 나타나지 않았다.

[계산식 3]

세포 생존율(Cell viability; %) = [(absorbance value of positive control-absorbance value of the group treated with extracts) × 100 / (absorbance value of positive control - absorbance value of negative control)].

한편, 고리매 열수추출물 (SLWE)의 항산화 활성을 확인하기 위해, DPPH 분석을 수행하였다.

DPPH 시약 100 μl와 고리매 열수추출물 100 μl를 1, 10 및 100 μg/ml 농도별로 처리하여 상온에서 30분간 반응시킨 후 562 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 아무것도 처리되지 않은 대조군과 양성대조군으로 대표적인 항산화 물질이 비타민 C를 10 μg/ml 처리하여 DPPH 분석을 수행하였다.

그 결과, 도 1(D)와 같이 고리매 열수추출물 (SLWE) 100 μg/ml의 농도에서 약 70% 항산화 효과가 나타나는 것이 확인되었다.

상기 결과로부터 고리매 열수추출물은 세포독성이 나타나지 않는 안전한 물질이며, 항 마이오스타틴 활성과 함께 항산화 효과가 나타나는 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 4> 고리매 열수추출물 ( SLWE )에 의한 마이오스타틴 신호전달 억제 확인

고리매 열수추출물이 마이오스타틴 신호전달 경로에 미치는 영향을 확인하기 위해, Smad2 전사인자의 인산화 정도를 웨스턴 블롯 분석으로 확인하였다.

먼저, HepG2 세포를 6 웰 플레이트에 웰당 2.0 × 10⁵ 세포로 분주하고 10% 태아소혈청(FBS)와 1% 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 DMEM 배지를 이용하여 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다.

24시간 배양 후 FBS가 포함되지 않은 DMEM로 교체하고, 4시간 후 10 nM 재조합 마이오스타틴과 고리매 열수추출물 (SLWE) IC100 및 IC10 농도로 각각 30분간 처리하였다. (SLWE의 IC100 값은 1500 μg/ml, IC10 값은 15 μg/ml 임)

30분 처리 후 세포를 PBS로 2회 세척하고 RIPA 버퍼 [20 mM Tris-HCl, pH7.5, 150 mM NaCl, 1 mM Na₂EDTA, 1 mM EGTA, 1% NP-40, 1% sodium deoxychloate, 2.5 mM sodium pyrophosphate, 1 mM β-glycerophosphate, 1 mM NA₃VO₄, 1 μg/ml leupeptin (cell signaling, USA)]를 처리하여 수집하였다.

수집한 세포는 초음파 분해기(sonicator)를 이용하여 파쇄하고 4℃에서 12,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 상등액은 BCA 분석을 통하여 단백질 정량한 후 10% 폴리아크릴아마이드 겔에서 전기영동하였다.

p-Smad2 발현을 확인하기 위해, p-Smad2 1차 항체 (monoclonal antibody, Cell signaling, USA)를 상온에서 3시간 동안 반응시켰으며, Smad2 및 β-액틴 발현을 위해 Smad2 (monoclonal antibody, Cell signaling, USA), β-액틴 (monoclonal antibody, Cell signaling, USA) 1차 항체를 4℃에서 12시간 동안 반응시켰다.

이후 TBS-T 버퍼를 이용하여 실온에서 10분간 3회 세척하고, 2차 항체 항-래빗 IgG (Samd2, p-Smad2), 항-마우스 IgG (b-actin) (Cell signaling, USA)를 상온에서 3시간 동안 반응시켰다.

반응 후 TBS-T 버퍼를 이용하여 막을 상온에서 10분간 3회 세척하고 SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Scientific, USA)를 이용하여 X-선 필름에 감광하였다.

그 결과, 도 2와 같이 마이오스타틴만 처리된 라인 2에서는 마이오스타틴의 신호가 전달되어 인산화된 Samd2의 발현이 증가된 것을 확인할 수 있었다. 또한, 라인 3은 마이오스타틴과 마이오스타틴이 결합하는 수용체의 인산화를 억제하는 작은 분자 SB431542를 동시에 처리한 양성대조군으로 인산화된 Samd2의 발현량 증가가 나타나지 않았다.

라인 4는 마이오스타틴과 SLWE(IC100)을 동시에 처리한 실험군으로 상기 SB431542이 처리된 양성대조군과 동일하게 SLWE이 마이오스타틴 신호를 억제하여 Samd2의 인산화가 억제된 것을 확인할 수 있었으며, 라인 5는 마이오스타틴과 낮은 농도의 SLWE(IC10)을 처리한 실험군으로 낮은 농도의 SLWE은 마이오스타틴 신호를 완전히 억제하지 못하여 Samd2의 인산화가 나타나는 것이 확인되었다.

상기 결과로부터 SLWE는 농도의존적으로 마이오스타틴과 결합하여 마이오스타틴과 수용체의 결합을 방해함으로써 Samd2 신호 전달이 억제되는 것이 확인되었다.

< 실시예 5> 마우스모델을 이용한 고리매 열수추출물 ( SLWE )의 효과 확인

1. 체중 및 근력 변화 확인

iv vivo 수준에서 고리매 열수추출물이 근육에 미치는 영향을 확인하기 위해, ICR 마우스에 경구투여하여 체중 및 근력의 변화를 확인하였다.

4주령 수컷 ICR 마우스에 14일 동안 1일 1회 경구투여하고 0, 7 및 14일 마다 체중과 근력테스트를 진행하였다.

그 결과, 도 3(A)와 같이 마우스의 체중은 대조군과 비교하여 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 또한, 도 3(B)를 참고하면 고리매 열수추출물 경구 투여 7일 후 대조군에 비해 근력이 15.7% 유의적으로 증가하였으며, 14일 후에는 대조군에 비해 약 8.8% 유의적으로 증가하였다. 또한, 수영 지구력(swimming endurance)을 확인한 결과, 도 3(C)와 같이 대조군의 증감에 비해 고리매 열수추출물이 처리된 실험군에서는 유의적인 차이가 나타나지 않았다.

상기 결과로부터 고리매 열수추출물은 체중변화 없이 근력을 유의적으로 증가시키는 것이 확인되었다.

2. 근육 무게 및 부피 변화 확인

앞선 실험과정과 동일하게 14일간 고리매 열수추출물 (690 μg/200 μl)이 경구투여된 마우스의 앞다리 및 뒷다리 근육의 무게와 부피를 측정하고 근밀도를 확인하였다.

그 결과, 도 4(A)와 같이 근육의 질량은 대조군과 비교하여 유의적인 차이가 나타나지 않았다.

근육 부피를 확인한 도 4(B)를 참고하면, 앞다리 근육의 부피는 대조군에 비해 10.8% 감소하였으며(p value = 0.025), 뒷다리 근육의 부피는 대조군과 유의적인 차이가 나타나지 않았다.

또한, 근육의 밀도는 도 4(C)와 같이 앞다리 근육의 밀도는 대조군에 비해 14.6% 유의적으로 증가하였으며, 뒷다리 근육의 밀도는 대조군과 유의적인 차이가 나타나지 않았다.

상기 결과로부터 근육의 무게 증감율에 비해 부피의 감소율이 높아짐에 따라 근밀도가 유의적으로 증가되는 것을 확인할 수 있었다.

3. 혈액분석

앞선 실험과정과 동일하게 14일간 고리매 열수추출물 (690 μg/200 μl)이 경구투여된 마우스의 복대정맥으로부터 혈액을 채혈하고 혈청을 분리하여 총 콜레스테롤 (Total cholesterol; TC), 트리글리세리드 (Triglyceride; TG), 글루코스 (Glucose; GLU), 젖산탈수소효소 (Latate dehydrogenase; LDH) 활성, 글루타티온 과산화효소 (Glutathione peroxydase; GPx) 활성, HDL 및 LDL/VLDL, 유리 지방산 (Free fatty acid; FFA) 분석을 수행하였다.

그 결과, 표 1 및 도 5와 같이 고리매 열수추출물 경구투여로 인하여 총 콜레스테롤 (TC), 글루코스 (GLU), 젖산탈수소효소 (LDH) 활성, 글루타티온 과산화효소 (GPx) 활성, HDL 및 LDL/VLDL, 유리 지방산 (FFA)은 대조군에 비해 유의적인 차이를 보이지 않았지만 트리글리세리드 (TG)는 대조군에 비해 39.9% 유의적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다 (p value = 0.034).

상기 결과로부터 고리매 열수추출물은 혈중 중성지방의 함량을 유의적으로 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.

Group	Total cholesterol (mg/dl)	Triglyceride (mg/dl)	Glucose (md/dl)	LDH activity^† (mU/ml)	GPx activity^† (mU/dl)	HDL^† (μg/μl)	LDL/VLDL^† (μg/μl)	FFA (mM)
Control	115.2 ±5.26	127.0 ±17.04	354.3 ±20.07	501.8 ±82.5	6990.7 ±1567.4	0.979 ±0.029	0.577 ±0.052	0.779 ± 0.107
SLWE	123.3 ±6.78	76.3 ±11.67^*	320.0 ±10.95	647.7 ±162.1	5476.6 ±1192.9	1.087 ±0.074	0.571 ±0.040	0.679 ± 0.067
p value	0.364	0.034	0.173	0.453	0.471	0.222	0.931	0.446

Values are means±SE (n = 6, †: n = 4). *P < 0.1, **P < 0.01, ***P < 0.005 and ****P < 0.001 compared with the control. Statistical

< 실시예 6> 고리매 열수추출물 ( SLWE ) 유기용매 분획 및 이의 활성 확인

1. 고리매 열수추출물의 유기용매 분획

유기용매를 이용하여 고리매 열수추출물에서 항 마이오스타틴 물질을 분리하였다.

건조된 고리매 파우더를 20 mg/ml의 농도로 90℃에서 20분간 열수 추출하였다. 회전감압 농축기를 이용하여 열수추출물에서 용매를 제거하고 에틸 아세테이트와 물 혼합액(1:1, v:v)을 첨가하여 분별깔데기에서 분획하였다.

각각 회전감압 농축기를 이용하여 에틸 아세테이트 분획층과 물 분획층에서 용매를 제거하였다.

상기 용매가 제거된 에틸 아세테이트 분획층에 90% 메탄올과 헥산 혼합액(1:1, v:v)을 첨가하여 분별깔데기에서 분획하였으며, 물 분획층은 부탄올과 물 혼합액(1:2, v:v)을 첨가하여 분별깔데기에서 분획하였다.

회전 감압농축기를 이용하여 분획한 90% 메탄올, 헥산, 부탄, 물 분획층에서 용매를 제거하였다.

2. 고리매 열수추출물 분획의 항 마이오스타틴 활성 확인

상기 과정으로 준비된 90% 메탄올, 헥산, 부탄, 물 분획층들을 원심회전 농축기를 이용하여 농도를 측정한 후 각 분획층 100 μg/ml의 농도로 루시퍼레이즈 분석을 이용하여 항 마이오스타틴 활성을 확인하였다.

그 결과, 도 6과 같이 부탄올 분획층에서 약 97% 항 마이오스타틴 활성이 확인됨에 따라, 고리매 추출물의 부탄올 분획층에 항 마이오스타틴 활성을 나타내는 물질이 존재하는 것을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

고리매 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 근육질 개선용 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 고리매 추출물은 물, C1 내지 C4의 알콜 또는 이들의 혼합용매로 추출된 것을 특징으로 하는 근육질 개선용 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 분획물은 부탄올 분획물인 것을 특징으로 하는 근육질 개선용 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 고리매 추출물 또는 이의 분획물은 항 마이오스타틴 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 근육질 개선용 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 고리매 추출물 또는 이의 분획물은 근 밀도를 증가시켜 근력을 향상시키는 것을 특징으로 하는 근육질 개선용 조성물.
고리매 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 근육질 개선용 사료첨가제.
고리매 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 근육 감소(muscle wasting) 질환 예방 또는 개선용 건강식품.
삭제
청구항 7에 있어서, 상기 근육 감소 질환은 근이영양증(muscular dystrophy), 경직성 척추 증후군(rigid spine syndrome), 근육-눈-뇌병(muscle-eye-brain disease), 근위축성 측삭경화증(루게릭병, amyotrophic lateral sclerosis), 샤르코-마리-투스병(Charcot-Marie-Tooth disease), 만성 염증성 신경증(chronic inflammatory neuropathy) 및 말단근병증(distal myopathy)으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 근육 감소 질환 예방 또는 개선용 건강식품.
삭제
삭제
고리매 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 근육 감소 질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
고리매 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 근육 감소 질환 예방 또는 치료용 수의학적 조성물.