CN112725241B - 一株绿针假单胞菌及其在番茄匍柄霉叶斑病防治中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株绿针假单胞菌及其在番茄匍柄霉叶斑病防治中的应用。该绿针假单胞菌为绿针假单胞菌YS05，已于2020年07月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20323。本发明还公开了绿针假单胞菌YS05在抑制病原菌中的应用。在抑菌谱测定中，菌株YS05表现出广谱抗性，对9种病原真菌和3种病原细菌均具有拮抗效果。在进行温室盆栽防效测定试验中，菌株YS05对番茄匍柄霉叶斑病的防效达到61.27％。在对番茄匍柄霉离体叶片防效测定试验中，菌株YS05对番茄灰叶斑病的防效为71.52％。说明菌株YS05具有较好的应用前景。

Description

一株绿针假单胞菌及其在番茄匍柄霉叶斑病防治中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株绿针假单胞菌及其在番茄匍柄霉叶斑病防治中的应用。

背景技术

番茄匍柄霉叶斑病致病菌为茄匍柄霉(Stemphylium solani Weber)和番茄匍柄霉(Stemphylium lycopersici(Enjoji)Yamamoto)，主要为害番茄叶片，严重时蔓延至茎蔓、果实。病斑初为褐色小点，逐渐扩大呈圆形或近圆形，发病后期易穿孔破裂，造成严重损失。现阶段番茄病害的防治措施长期依赖化学防治，但大量施用合成农药造成如化学残留、环境污染、抗药性病原菌株等问题日益凸显。近年来，生物防治由于其安全性及高效、经济、环保等优点，成为研究热点。

假单胞菌属(Pseudomonas spp.)广泛分布于植物根际土壤，许多菌株能在有效抑制病原物的同时，促进植物的生长和增产，因而受到各国研究者的关注，是国内外研究最早、报道最多的一类生防菌和根际促生菌。30余年来，对假单胞菌属生物防治的研究主要集中在其根际促生作用上，近年来，一些学者用假单胞菌成功防治了小麦、草莓、小白菜和番茄等多种植物的侵染性病害，极大地扩展了假单胞菌的应用范围。

发明内容

本发明的目的是提供一株绿针假单胞菌及其在番茄匍柄霉叶斑病防治中的应用。

为了实现上述目的，本发明首先提供了绿针假单胞菌桔黄亚种(Pseudomonaschlororaphis subsp.aurantiaca)YS05，其保藏编号为CGMCC No.20323。

本发明提供的绿针假单胞菌桔黄亚种(Pseudomonas chlororaphissubsp.aurantiaca)YS05已于2020年07月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101)，保藏编号为CGMCC No.20323。

为了实现上述目的，本发明又提供了上述绿针假单胞菌桔黄亚种(Pseudomonaschlororaphis subsp.aurantiaca)YS05的菌悬液或培养液或发酵液或发酵产物或挥发性物质或含有其的菌剂。

为了实现上述目的，本发明还提供了上述绿针假单胞菌桔黄亚种(Pseudomonaschlororaphis subsp.aurantiaca)YS05的菌悬液或培养液或发酵液或发酵产物或挥发性物质或含有其的菌剂在抑制致病菌中的应用。

本发明还提供了上述绿针假单胞菌桔黄亚种(Pseudomonas chlororaphissubsp.aurantiaca)YS05的菌悬液或培养液或发酵液或发酵产物或挥发性物质或含有其的菌剂在制备抑制致病菌的产品中的应用。

本发明还提供了上述绿针假单胞菌桔黄亚种(Pseudomonas chlororaphissubsp.aurantiaca)YS05的菌悬液或培养液或发酵液或发酵产物或挥发性物质或含有其的菌剂在防治致病菌引起的植物病害中的应用。

本发明还提供了上述绿针假单胞菌桔黄亚种(Pseudomonas chlororaphissubsp.aurantiaca)YS05的菌悬液或培养液或发酵液或发酵产物或挥发性物质或含有其的菌剂在制备防治致病菌引起的植物病害的产品中的应用。

本发明还提供了上述绿针假单胞菌桔黄亚种(Pseudomonas chlororaphissubsp.aurantiaca)YS05的菌悬液或培养液或发酵液或发酵产物或挥发性物质或含有其的菌剂在防治番茄匍柄霉叶斑病中的应用。

本发明还提供了上述绿针假单胞菌桔黄亚种(Pseudomonas chlororaphissubsp.aurantiaca)YS05的菌悬液或培养液或发酵液或发酵产物或挥发性物质或含有其的菌剂在制备防治番茄匍柄霉叶斑病的产品中的应用。

为了实现上述目的，本发明还提供了一种产品，其活性成分为上述绿针假单胞菌桔黄亚种(Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca)YS05的菌悬液或培养液或发酵液或发酵产物或挥发性物质或含有其的菌剂；

所述产品具有如下a1)-a3)中任一种功能：

a1)抑制致病菌；

a2)防治致病菌引起的植物病害；

a3)防治番茄匍柄霉叶斑病。

为了实现上述目的，本发明最后提供了如下b1)-b3)中任一种方法：

b1)一种抑制致病菌的方法，包括如下步骤：用上述绿针假单胞菌桔黄亚种(Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca)YS05的菌悬液或培养液或发酵液或发酵产物或挥发性物质或含有其的菌剂处理致病菌；

b2)一种防治致病菌引起的植物病害的方法，包括如下步骤：用上述绿针假单胞菌桔黄亚种(Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca)YS05的菌悬液或培养液或发酵液或发酵产物或挥发性物质或含有其的菌剂处理植物；

b3)一种防治番茄匍柄霉叶斑病的方法，包括如下步骤：用上述绿针假单胞菌桔黄亚种(Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca)YS05的菌悬液或培养液或发酵液或发酵产物或挥发性物质或含有其的菌剂处理番茄。

上述任一所述致病菌为植物致病菌。所述植物致病菌可为致病真菌或致病细菌。

所述致病真菌具体可包括炭疽菌(Colletotrichum spp.)、灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)、多主棒孢菌(Corynespora cassiicola)、辣椒疫霉(Phytophthora capsici)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、茄病镰刀菌(Fusarium solani)、番茄匍柄霉菌(Stemphylium lycopersici(Enjoji)Yamamoto)、茄链格孢菌(Alternaria solani)、西瓜壳二孢(Ascochyta citrullina)。

所述致病细菌具体可包括密执安棒杆菌密执安亚种(Clavibactermichiganensis subsp.Michiganensis)、葡萄土壤杆菌(Agrobacterium vitis)、丁香假单胞番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato)。

上述任一所述植物病害具体可为番茄匍柄霉叶斑病。

上述任一所述植物具体可为番茄。

以上任一所述菌悬液或培养液或发酵液或发酵产物或菌剂中的绿针假单胞菌桔黄亚种(Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca)YS05的菌浓度可为1×10⁷cfu/mL-1×10⁹cfu/mL，具体可为1×10⁸cfu/mL。

在一个具体实施例中，所述菌悬液或培养液或发酵液或发酵产物或菌剂的具体制备方法可包括如下步骤：将绿针假单胞菌桔黄亚种(Pseudomonas chlororaphissubsp.aurantiaca)YS05接种于KB液体培养基中，28℃、180r/min振荡培养24h后，用KB液体培养基调整菌悬液浓度为OD₆₀₀＝0.8。

在另一个具体实施例中，所述菌悬液或培养液或发酵液或发酵产物或菌剂的具体制备方法可包括如下步骤：将绿针假单胞菌桔黄亚种(Pseudomonas chlororaphissubsp.aurantiaca)YS05接种于KB液体培养基中，28℃、180r/min振荡培养24h后，用KB液体培养基调整菌悬液浓度为OD₆₀₀＝0.8，然后用蒸馏水稀释至100倍体积。

本发明从作物根际土中分离到一株对番茄匍柄霉具有明显拮抗作用的菌株YS05。经过对菌株的形态特征、Biolog检测、电镜扫描、生理生化指标及多基因系统发育树进行分析，初步鉴定菌株YS05为绿针假单胞菌桔黄亚种(Pseudomonas chlororaphissubsp.aurantiaca)。在抑菌谱测定试验中，菌株YS05表现出广谱抗性，对9种病原真菌和3种病原细菌均具有拮抗效果。在进行温室盆栽防效测定试验中，菌株YS05对番茄匍柄霉叶斑病的防效达到61.27％。在对番茄匍柄霉离体叶片防效测定试验中，菌株YS05对番茄匍柄霉叶斑病的防效为71.52％。说明菌株YS05具有较好的应用前景，为进一步开发利用提供了一定的理论基础和技术支持。

附图说明

图1为23株假单胞菌对番茄匍柄霉拮抗效果测定。

图2为菌株YS05形态特征。A：透射观察观察；B：扫描电镜观察；C：菌株YS05KB培养基正面形态观察；D：菌株YS05 KB培养基反面形态观察。

图3为菌株YS05基于16S rDNA、gyrB、rpoB和rpoD基因序列构建多基因系统发育树。

图4为菌株YS05抑菌谱。A：辣椒炭疽病的致病菌炭疽菌(Colletotrichum spp.)；B：番茄灰霉病的致病菌灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)；C：黄瓜靶斑病的致病菌多主棒孢菌(Corynespora cassiicola)；D：辣椒疫病的致病菌辣椒疫霉(Phytophthora capsici)；E：白菜茎基腐的致病菌立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)；F：甜瓜根腐病的致病菌茄病镰刀菌(Fusarinm solani)；G：番茄匍柄霉叶斑病的致病菌番茄匍柄霉菌(Stemphyliumlycopersici(Enjoji)Yamamoto)；H：马铃薯早疫病的致病菌茄链格孢菌(Alternaria solani)；I：黄瓜蔓枯病的致病菌西瓜壳二孢(Ascochyta citrullina)；J：番茄溃疡病的致病菌密执安棒杆菌密执安亚种(Clavibacter michiganensissubsp.michiganensis)；K：葡萄根癌病的致病菌葡萄土壤杆菌(Agrobacterium vitis)；L：番茄细菌性斑点病的致病菌丁香假单胞番茄致病变种(Pseudomonassyringaepv.tomato)。

图5为菌株YS05生防因子测定。A：蛋白酶；B：HCN；C：抗生素耐受性；

图6为菌株YS05常见抗生素基因PCR产物凝胶呈象。M：DNA maker BM 5000；1：阴性对照；2：荧光假单胞菌2P24；3：YS05。

图7为菌株YS05挥发性物质抑制效果测定。

图8为菌株YS05对番茄匍柄霉盆栽防效测定。A：菌株YS05菌悬液100倍液；B：菌株YS21菌悬液100倍液；C：异菌脲800倍液；D：蒸馏水对照；E：健康对照。

图9为菌株YS05与6种药剂对番茄匍柄霉离体叶片防效测定。A：蜡质芽孢杆菌可湿性粉剂；B：地衣芽孢杆菌水剂；C：46％氢氧化铜水分散粒剂；D：33.5％喹啉铜悬浮剂；E：10％多抗霉素可湿性粉剂；F：50％异菌脲可湿性粉剂；G：菌株YS05菌悬液；H：空白对照(蒸馏水)。

保藏说明

中文名：绿针假单胞菌桔黄亚种

拉丁名：Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca

菌株编号：YS05

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2020年07月08日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.20323

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的培养基，如无特殊说明均为自然pH。如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的供试番茄品种为‘中杂201’，购于中国农业科学院蔬菜花卉研究所。

下述实施例中的培养基如下：

KB固体培养基(用于假单胞菌的分离纯化)：蛋白胨20.0g，甘油10.0mL，MgSO₄·7H₂O 1.5g，K₂HPO₄ 1.5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL。

KB液体培养基(用于假单胞菌的摇培扩繁)：蛋白胨20.0g，甘油10.0mL，MgSO₄·7H₂O 1.5g，K₂HPO₄ 1.5g，蒸馏水1000mL。

WA培养基(用于细菌抑菌谱的测定)：琼脂5g、蒸馏水1000mL，分装于5mL试管。

PDA培养基(用于真菌拮抗作用试验)：马铃薯200.0g，葡萄糖20.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1000mL

CMC培养基(用于纤维素酶的测定)：MgSO₄ 0.1g、(NH₄)₂SO₄ 1.0g、10×PhosphateBuffer 100.0mL、酵母粉5.0g、甘油2.0mL、CMC 1.0g、Bacto Agar 12.0g、蒸馏水1000mL。

脱脂牛奶培养基(用于蛋白酶的测定)：蛋白胨10.0g、牛肉粉3.0g、NaCl 5.0g、水1000mL、脱脂牛奶100mL，pH 7.0。

刚果红溶液：0.2％(W/V)，刚果红粉末2g，蒸馏水1000mL，可加少量酒精帮助溶解均匀。

NaCl溶液：1M NaCl 58.5g，蒸馏水1000mL。

实施例1、菌株YS05的分离、筛选、鉴定和保藏

一、菌株YS05的分离与纯化

取来自哈尔滨市露地作物根际土壤样品，每份土样称取10g，加入到90mL灭菌水中，置于28℃恒温摇床振荡培养30min。按照10^-1-10^-7进行梯度稀释，取稀释梯度10^-5、10^-6、10^-7的土样进行涂板，置于28℃恒温培养箱培养24h。待所涂平板长出单菌落后，用灭菌牙签挑选不同形态的单菌落在KB固体平板上划线，进行纯化，置于28℃恒温培养箱培养至长出形态一致的单菌落，4℃冰箱保存备用。最终从哈尔滨露地作物根际土壤中共分离获得236株细菌。

二、菌株YS05的筛选

采用平板对峙法测定上述步骤一中分离纯化细菌对番茄匍柄霉抑制率。具体步骤如下：在PDA平板正中央接种直径5mm的番茄匍柄霉菌饼，采用十字交叉法在距平板中央3cm处相对的4点分别滴加5μL OD₆₀₀＝0.8的待测菌液，以不接拮抗菌株为对照，28℃培养，待未接拮抗菌株平板生长至平板边缘进行调查。每个处理重复3次。测量靶标菌的对照菌落直径和处理菌落直径，用抑菌率表示。抑制率(％)＝[(对照菌落直径–处理菌落直径)/对照菌落直径]×100。

利用平板对峙法获得23株对番茄匍柄霉具有抑制效果的拮抗细菌，对其编号为YS01-YS23。23株拮抗细菌对番茄匍柄霉的拮抗效果如表1和图1所示，结果表明：23株拮抗细菌对番茄匍柄霉均具有较好的抑制效果，菌丝生长被抑制，其中菌株YS05效果最为显著，抑制率达68.91％。

表1、23株假单胞菌对番茄匍柄霉拮抗效果测定

原始编号	编号	初步鉴定结果	抑制率％
				大葱-1	YS01	绿针假单胞菌	44.83±2.64hij
大葱-31	YS02	荧光假单胞菌	0.00±0.00l
				马铃薯-14	YS03	荧光假单胞菌	43.32±1.93ij
向日葵-3	YS04	绿针假单胞菌	58.34±3.77bcd
				YS05	YS05	绿针假单胞菌	68.91±7.29a
向日葵-4	YS06	绿针假单胞菌	46.17±1.94ghij
				向日葵-9	YS07	绿针假单胞菌	48.36±3.18ghi
向日葵-16	YS08	荧光假单胞菌	41.62±2.22j
				向日葵-18	YS09	荧光假单胞菌	45.37±0.68hij
向日葵-20	YS10	韩国假单胞菌	35.04±1.45k
				向日葵-22	YS11	绿针假单胞菌	50.36±1.59fgh
向日葵-32	YS12	荧光假单胞菌	41.74±1.19j
				XRK01	YS13	绿针假单胞菌	52.05±2.00efg
XRK03	YS14	绿针假单胞菌	56.34±2.62cde
				亚麻-7	YS15	韩国假单胞菌	34.36±4.36k
亚麻-13	YS16	荧光假单胞菌	54.65±7.32def
				亚麻-16	YS17	绿针假单胞菌	49.90±1.30fgh
玉米-5	YS18	绿针假单胞菌	63.06±1.27b
				玉米-6	YS19	韩国假单胞菌	33.77±6.70k
玉米-9	YS20	绿针假单胞菌	48.15±1.42ghi
				玉米-22	YS21	绿针假单胞菌	60.93±1.01bc
玉米-24	YS22	荧光假单胞菌	44.32±0.82hij
				YM28	YS23	绿针假单胞菌	54.33±1.13def

三、菌株YS05的鉴定

1、形态鉴定

对菌株YS05进行形态学特征观察。

结果如图2所示，结果表明：绿针假单胞菌桔黄亚种YS05在KB平板中正面呈现乳白色，背面为桔黄色，电镜下观察菌株形态为杆状，鞭毛单个极生，大小为(0.8-1.1)×(1.2-2.7)μm。

2、生理生化鉴定

参考《常见细菌系统鉴定书册》(东秀珠，蔡妙英.2001.常见细菌系统鉴定手册.北京：科学出版社.)和《伯杰氏细菌鉴定手册》(布坎南R E.1984.伯杰氏细菌鉴定手册.北京：科学出版社.)中的方法，对菌株YS05进行如下生理生化试验：革兰氏试验、生长温度试验、耐盐性试验、游动性试验、接触酶试验、V-P试验、淀粉水解试验、葡糖糖氧化发酵试验、明胶液化试验、硝酸盐还原试验等。

结果如表2所示，结果表明：菌株YS05的耐盐性、接触酶、V-P反应、淀粉水解、硝酸盐还原等试验结果与绿针假单胞菌HL5-4和绿针假单胞菌Pa40的反应特征一致，初步确定其为绿针假单胞菌属。

表2、生理生化特征鉴定结果

注：+表示为阳性；-表示为阴性。

3、Biolog检测

挑取YS05单菌落接种至KB培养基试管斜面上，28℃恒温培养24h，由中国农业微生物菌种保藏中心使用BIOLOG GENⅢ试剂盒(按照试剂盒说明书操作)对其进行唯一碳源利用的测定。

菌株YS05对BIOLOG GENIII试剂条上的唯一碳源利用情况如表3所示。

表3、利用BIOLOG GENIII试剂条测定菌株YS05的唯一碳源利用

注：+，阳性；-，阴性；w，弱阳性。

4、分子鉴定

利用TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒小量提取菌株YS05基因组DNA后，选择16SrDNA、gyrB、rpoB和rpoD基因进行扩增与测序。16S rDNA基因扩增引物—27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492R：5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'。gyrB基因扩增引物—gyrB1F：5'-GACAAGCTGGTGTCTTCCGA-3'；gyrB1R：5'-CATCTCGCCCAGACCTTTGT-3'。rpoB基因扩增引物—rpoB1F：5'-GTCCGACTTCACTGTGAGCA-3'；rpoB1R：5'-GTGAAAAAGCCAGCGACGTT-3'。rpoD基因扩增引物—rpoD1F：5'-CACGGTTGAGCACATCCTCT-3'；rpoD1R：5'-GGAGAGTACTTCGCGAGTCG-3'。

PCR扩增体系为25μL，包括上游引物和下游引物各0.5μL，模板DNA 1μL；T-Taq Mix12.5μL；ddH₂O 10.5μL。

PCR反应程序：95℃预变性3min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共34个循环；72℃延伸10min。

所得PCR产物由博迈德生物公司进行测序。测序结果表明：菌株YS05的16S rDNA、gyrB、rpoB、rpoD基因序列分别如序列表中的序列1-4所示。NCBI网站下载其余序列，用MEGA7.0、Sequence Matrix、Seaview4按顺序连接、比对不同菌株的16S rDNA、gyrB、rpoB、rpoD基因序列，采用最大似然法构建系统进化树，分析其分类地位。

基于菌株YS05 16S rDNA、gyrB、rpoB和rpoD基因序列，构建YS05多基因系统进化树，结果如图3所示，结果表明：菌株YS05与绿针假单胞菌桔黄亚种模式菌株P.chlororaphis subsp.aurantiaca LMG 21630聚在一个分支。

结合形态、生理生化特征、Biolog检测和分子鉴定结果，确定菌株YS05属于绿针假单胞菌桔黄亚种(Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca)。

四、菌株YS05的保藏

绿针假单胞菌桔黄亚种(Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca)YS05已于2020年07月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101)，保藏编号为CGMCC No.20323。

实施例2、菌株YS05抑菌谱测定

选择常见的9种蔬菜病原真菌和3种病原细菌测定菌株YS05抑菌谱。

9种蔬菜病原真菌和3种病原细菌具体见表4，具体出处分别如下：

炭疽菌(Colletotrichum spp.)已在文献“于洋、石延霞、傅俊范、李宝聚.亲和病原菌诱导黄瓜组织结构抗病性机制.植物保护学报2008，(01)：37-42.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)已在文献“石延霞、唐明、晋知文、谢学文、柴阿丽、李宝聚.蔬菜作物灰葡萄孢菌对不同类型杀菌剂抗性评价.中国蔬菜2016，(03)：60-65.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

多主棒孢菌(Corynespora cassiicola)已在文献“高苇、李宝聚、石延霞、谢学文.多主棒孢菌在黄瓜、番茄和茄子寄主上致病力的分化.园艺学报2011，38(3)：465-470.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

辣椒疫霉(Phytophthora capsici)已在文献“朱辉、王满意、李宝聚、石延霞.辣椒根腐型疫病病原鉴定及防治药剂筛选.植物保护学报2007，(4)：373-378.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)已在文献“高苇、李宝聚、孙军德、石延霞、金丹.绿色木霉对黄瓜立枯丝核菌和尖孢镰刀菌的拮抗作用.中国蔬菜2008，(6)：9-12.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

茄病镰刀菌(Fusarium solani)已在文献“贲海燕、石延霞、谢学文、柴阿丽、李宝聚.氰氨化钙土壤消毒对黄瓜根腐病及土壤病原菌的控制效果.园艺学报2016，43(11)：2173-2181.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

番茄匍柄霉菌(Stemphylium lycopersici(Enjoji)Yamamoto)已在文献“李宝聚、周艳芳、李金萍、谢学文.番茄匍柄霉叶斑病(灰叶斑病)的诊断与防治.中国蔬菜2010，(23)：24-26.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

茄链格孢菌(Alternaria solani)已在文献“柴阿丽、石延霞、谢学文、帕提古丽、李宝聚.加工番茄早疫病病原菌鉴定.华北农学报2015，30(增刊)：316-320.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

西瓜壳二孢(Ascochyta citrullina)已在文献“SHI Yanxia,MENG Shanshan,XIEXuewen,CHAI Ali,LI Baoju.Dry Heat Treatment Reduces the Occurrence ofCladosporium cucumerinum,Ascochyta citrullina,and Colletotrichum orbiculareon the Surface and Interior of Cucumber Seeds.Horticultural Plant Journal2016,2(01):35-40.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

密执安棒杆菌密执安亚种(Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis)已在文献“李焕玲、石延霞、谢学文、李宝聚.番茄溃疡病的发生规律与防治技术.中国蔬菜2011，23:24-27.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

葡萄土壤杆菌(Agrobacterium vitis)已在文献“赵昱榕、李磊、谢学文、石延霞、柴阿丽、孙广玉、李宝聚.贝莱斯芽胞杆菌ZF2对多主棒孢病菌防治效果.中国生物防治学报，2019，35(02)：217-225.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

丁香假单胞番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato)已在文献“柴阿丽、帕提古丽、郭威涛、石延霞、谢学文、席先梅、李宝聚.番茄细菌性斑点病菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用.园艺学报，2019，46(01)：182-192.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

分别采用平板对峙法(真菌)和双层培养法(细菌)测定菌株YS05对病原菌的抑制效果。测定方法参考文献“Stonier T.1960.Agrobacterium tumefaciensConn.II.production of an antibiotic substance.Journal of Bacteriology，79(6)：889.”中的方法，具体步骤如下：从-80℃冰箱中取菌株YS05甘油管，吸取1mL加入到装液量为100mL KB培养基的250mL锥形瓶中，28℃、180rmp/min振荡摇培24h后，测定OD₆₀₀值并使用空白KB液体培养基调整OD₆₀₀＝0.8备用，取5μL上述菌悬液接种在KB平板中心，28℃培养24h后用氯仿熏蒸灭活，作为下层产素层。使用5mL含有病原细菌的WA培养基作为上层。28℃培养48h后测量抑菌圈直径，计算抑菌率，每个处理重复3次。抑制率(％)＝[(对照菌落直径–处理菌落直径)/对照菌落直径]×100。

结果如表4和图4所示，结果表明：菌株YS05可以有效抑制灰葡萄孢菌、多主棒孢菌、辣椒疫霉、立枯丝核菌、炭疽菌、茄链格孢菌和番茄匍柄霉菌7种真菌，抑制率均大于50％，对茄病镰刀菌和西瓜壳二孢的抑制效果相对较弱，分别为21.4％和7.73％。菌株YS05对病原细菌也有较好的抑制效果，对丁香假单胞细菌流泪致病变种的抑菌直径为4.37cm，对葡萄根癌菌的抑菌直径为4.85cm。

表4、菌株YS05对病原菌的抑菌效果

注：数据为平均值±标准误，不同小字母表示0.05水平上差异显著。“+”抑菌圈大于0.5cm，“++”抑菌圈大于1cm，“+++”抑菌圈大于2cm，“-”无抑制效果。

实施例3、菌株YS05生防因子测定

1、纤维素酶的检测

在CMC培养基中心位置接种5μL OD₆₀₀＝0.8的菌株YS05菌悬液，28℃培养24h后，加入3mL刚果红染料染色30min，倒掉染料，再加入5mL 1mol/L NaCl溶液脱色15min，观察消解圈。每个处理重复3次。

2、蛋白酶的检测

在脱脂牛奶培养基中心位置接种5μL OD₆₀₀＝0.8的菌株YS05菌悬液，28℃培养24h后观察消解圈。每个处理重复3次。

3、氢氰酸HCN的检测

Whatman滤纸剪成5mm×25mm的纸条；分别称取25mg copper(Ⅱ)ethylacetoacetate和25mg 4-4’-methylenebis-(N,N-dimethylaniline)，溶于10mL氯仿中，镊子灭菌后将Whatman滤纸条在上述溶液中完全浸湿，晾干，于9cm玻璃培养皿中保存备用。

结果如图5所示，结果表明：菌株YS05在脱脂牛奶培养基中透明圈产生；接种菌株YS05试管中试纸条变蓝。说明菌株YS05代谢产物中含有蛋白酶和氢氰酸HCN，具有一定的生防潜力。

4、抗生素耐受性测定

1)测定菌株YS05对10种抗生素(表5)的耐受性。具体步骤如下：在15mL无菌管中加入3mL含抗生素KB液体培养基，接种1％OD₆₀₀＝0.8的YS05菌悬液于无菌管中，摇培24h，观察菌株对抗生素的耐受性，每个处理重复3次。

表5、抗生素配制

抗生素种类	使用浓度	溶剂
			氨苄青霉素([Amp]Ampicillin)	100mg/mL	水
羧苄青霉素([Car]Carbenicillin)	50mg/mL	水
			卡那霉素([Kan]Kanamycin)	50mg/mL	水
氯霉素([Cm]Chloramphenicol)	25mg/mL	无水乙醇
			链霉素([Str]Streptomycin)	50mg/mL	水
四环素([Tet]Tetracyyline)	10mg/mL	无水乙醇
			庆大霉素([Gm]Gentamicin)	50mg/mL	水
利福平([Rif]Rifampicin)	50mg/mL	二甲亚砜
			万古霉素([Van]Vancomycin)	50mg/mL	水
奇霉素or壮观霉素([Spec]Spectinomycin)	50mg/mL	水

结果表明：菌株YS05对氨苄青霉素、氯霉素、万古霉素、羧苄青霉素、链霉素、奇霉素等抗生素耐受，对卡那霉素、利福平、四环素、庆大霉素等四种抗生素不耐受。

2)菌株YS05常见抗生素基因扩增

提取菌株YS05的基因组DNA后，分别利用表6中的各个引物对对基因组DNA进行PCR扩增。

表6、抗生素及对应基因名称

PCR反应体系：上游引物1μL，下游引物1μL，DNA模板1μL，T-Taq Mix 25μL，ddH₂O22μL。

PCR反应程序：94℃预变性3min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，共34个循环；72℃延伸10min；12℃保存。设置温度梯度。PCR反应以荧光假单胞菌2P24为对照，取5μL PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳验证后，将其产物送去测序，确定所筛生防菌产生抗生素的生物合成基因序列的相似性。

菌株YS05常见抗生素基因PCR产物凝胶呈象结果如图6所示，PCR扩增结果表明：菌株YS05含有编码合成吩嗪Phenazine，硝吡咯菌素Pyrrolnitrin基因，未扩增出2,4-DAPG、藤黄绿脓菌素和2-羟基吩嗪基因。

实施例4、菌株YS05挥发性物质抑菌活性测定

使用二分皿分别培养生防菌菌株YS05和病原菌(病原菌见表7)，测定菌株YS05挥发性物质对病原真菌抑制效果。具体步骤如下：从-80℃冰箱中取出菌株YS05，使用装液量为3mL KB液体培养基的15mL摇菌管进行活化，28℃，180rpm/min摇培24h，获得种子液。将种子液转接到装液量为200mL KB液体培养基的250mL三角瓶中，摇培24h，测定其OD₆₀₀为0.8。在二分皿中加入PDA培养基，采用划线法接种菌株YS05，对应一侧加入5mm病原真菌菌饼，置于28℃培养箱中倒置培养，未加生防菌作为对照，观察到空白对照病原真菌生长至平板边缘处进行调查，每个处理重复3次。

结果如表7和图7所示，结果表明：菌株YS05挥发性物质对生菜根腐立枯丝核菌和黄瓜蔓枯壳二孢的抑制率均在40％以上，对甜瓜枯萎茄病镰刀菌的抑制率为10％左右。

表7、菌株YS05挥发性物质抑制效果测定

实施例5、菌株YS05防治番茄匍柄霉叶斑病效果测定

采用喷雾接种法进行番茄匍柄霉叶斑病防效测定。

具体方法如下：待盆栽番茄长至5片真叶时，分别进行如下处理：

处理组1：使用无菌水将OD₆₀₀＝0.8的菌株YS05菌悬液稀释100倍，分别喷于植株，以叶片上布满药液且不滴水为度，同时每株50mL处理液(OD₆₀₀＝0.8的菌株YS05菌悬液稀释100倍)灌根。

处理组2：使用无菌水将OD₆₀₀＝0.8的菌株YS21菌悬液稀释100倍，分别喷于植株，以叶片上布满药液且不滴水为度，同时每株50mL处理液(OD₆₀₀＝0.8的菌株YS21菌悬液稀释100倍)灌根。

处理组3：50％异菌脲可湿性粉剂(江苏省苏州富美实植物保护剂有限公司，登记号：PD20151441)按照生产公司的使用说明剂量使用。

对照组：蒸馏水。

处理后24h喷雾接种浓度为1×10⁸cfu/mL的番茄匍柄霉菌悬浮液于各处理植株，于26-28℃下保湿，处理后10d调查发病情况，每个处理8棵，3次重复。按照《农药田间药效试验准则》(农业部农药检定所生测室，1993)进行病害分级，并计算病情指数和防治效果。

病情指数＝∑(各级病叶数×病级数)/(调查总叶数×最高病级数)×100。病级分类标准：0级：无病斑；1级：病斑面积占整个叶面积的5％以下；2级：病斑面积占整个叶面积的6％～25％；3级：病斑面积占整个叶面积的26％～50％；4级：病斑面积占整个叶面积的51％～75％；5级：病斑面积占整个叶面积的75％以上。

防治效果(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100。

结果如表8和图8所示，结果表明：菌株YS05对番茄匍柄霉叶斑病的防治效果达到61.27％，显著高于药剂和菌株对照处理。

表8、菌株YS05对番茄匍柄霉盆栽防效测定

实施例6、菌株YS05与6种药剂对番茄匍柄霉离体叶片防效测定

采用贴菌片法测定菌株YS05和其他6种药剂对番茄匍柄霉离体叶片防效，测定步骤可参照文献“Li B,Yuan H,Fang J,et al.Recent progress of highly efficient invivo biological screening for novel agrochemicals in China.Pest ManagementScience,2010,66.”中的方法。具体步骤如下：

使用5mm无菌打孔器在培养好的番茄匍柄霉平板上打菌饼，并置于番茄叶片正面，28℃、光暗交替条件下培养3d。挑取菌株YS05单菌落接种于KB液体培养基中，28℃、180rpm/min振荡培养24h后，用KB液体培养基调整菌悬液浓度为OD₆₀₀＝0.8，稀释100倍液后喷雾接种于含番茄匍柄霉菌饼的番茄叶片上，以叶片上布满药液且不滴水为度。以蒸馏水作为空白对照(CK)。

将YS05菌悬液分别替换为如下对照药剂进行处理：8亿个/克蜡质芽孢杆菌可湿性粉剂(山东泰诺药业有限公司，登记证号：PD20094534)100倍液，80亿个活芽孢/毫升地衣芽孢杆菌水剂(广西金燕子农药有限公司，登记证号：PD20140122)90倍液，46％氢氧化铜水分散粒剂(美国杜邦公司，登记证号：PD20110053)1800倍液，33.5％喹啉铜悬浮剂(山东奥胜生物科技有限公司，登记证号：PD20200743)1500倍液，10％多抗霉素可湿性粉剂(山东省德州祥龙生化有限公司，登记证号：PD20100857)1000倍液，50％异菌脲可湿性粉剂(江苏省苏州富美实植物保护剂有限公司，登记号：PD20151441)800倍液。

处理后7d调查发病情况，每个处理6个叶片，3次重复。计算病情指数和防治效果。

病情指数＝100×∑(各级病叶数×相对级数的代表值)/(总叶数×最高级数的代表值)。病级分类标准：0级：无病斑；1级：病斑面积占整个叶面积的5％以下；2级：病斑面积占整个叶面积的6％～25％；3级：病斑面积占整个叶面积的26％～50％；4级：病斑面积占整个叶面积的51％～75％；5级：病斑面积占整个叶面积的75％以上。

防治效果(％)＝100×(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数。

结果如表9和图9所示，结果表明：菌株YS05菌悬液对番茄灰叶斑病的防效为71.52％，显著高于其他药剂。

表9、菌株YS05与6种药剂对番茄匍柄霉离体叶片防效测定

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所

<120> 一株绿针假单胞菌及其在番茄匍柄霉叶斑病防治中的应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1538

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

ttaaggaggt gatccagccg caggttcccc tacggctacc ttgttacgac ttcaccccag 60

tcatgaatca caccgtggta accgtcctcc cgaaggttag actagctact tctggtgcaa 120

cccactccca tggtgtgacg ggcggtgtgt acaaggcccg ggaacgtatt caccgcgaca 180

ttctgattcg cgattactag cgattccgac ttcacgcagt cgagttgcag actgcgatcc 240

ggactacgat cggttttatg ggattagctc cacctcgcgg cttggcaacc ctctgtaccg 300

accattgtag cacgtgtgta gcccaggccg taagggccat gatgacttga cgtcatcccc 360

accttcctcc ggtttgtcac cggcagtctc cttagagtgc ccaccataac gtgctggtaa 420

ctaaggacaa gggttgcgct cgttacggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga 480

cgacagccat gcagcacctg tctcaatgtt cccgaaggca ccaatccatc tctggaaagt 540

tcattggatg tcaaggcctg gtaaggttct tcgcgttgct tcgaattaaa ccacatgctc 600

caccgcttgt gcgggccccc gtcaattcat ttgagtttta accttgcggc cgtactcccc 660

aggcggtcaa cttaatgcgt tagctgcgcc actaagagct caaggctccc aacggctagt 720

tgacatcgtt tacggcgtgg actaccaggg tatctaatcc tgtttgctcc ccacgctttc 780

gcacctcagt gtcagtatca gtccaggtgg tcgccttcgc cactggtgtt ccttcctata 840

tctacgcatt tcaccgctac acaggaaatt ccaccaccct ctaccatact ctagctcgcc 900

agttttggat gcagttccca ggttgagccc ggggatttca catccaactt aacgaaccac 960

ctacgcgcgc tttacgccca gtaattccga ttaacgcttg caccctctgt attaccgcgg 1020

ctgctggcac agagttagcc ggtgcttatt ctgtcggtaa cgtcaaaata ctcacgtatt 1080

aggtaagtac ccttcctccc aacttaaagt gctttacaat ccgaagacct tcttcacaca 1140

cgcggcatgg ctggatcagg ctttcgccca ttgtccaata ttccccactg ctgcctcccg 1200

taggagtctg gaccgtgtct cagttccagt gtgactgatc atcctctcag accagttacg 1260

gatcgtcgcc ttggtgagcc attacctcac caactagcta atccgaccta ggctcatctg 1320

atagcgcaag gcccgaaggt cccctgcttt ctcccgtagg acgtatgcgg tattagcgtc 1380

cgtttccgga cgttatcccc cactaccagg cagattccta ggcattactc acccgtccgc 1440

cgctctcaag agaagcaagc ttctctctac cgctcgactt gcatgtgtta ggcctgccgc 1500

cagcgttcaa tctgagccat gatcaaactc ttcagttc 1538

<210> 2

<211> 2418

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

tcagaagtcc aggttggata ccgccagggc gttgctttcg atgaagtcgc gacgaggctc 60

gaccgcatcc cccatcaggg tgttgaagat ctggtcggcg ccgatggcgt cttcgatggt 120

gaccttgagc atacggcgca cgcttgggtc catggtggtt tcccacagct gatccgggtt 180

catctcgccc agacctttgt atcgctggat ggtgtggcgc ttggtgcttt cggtcatcag 240

ccagtccagg gcttccttga actcggtcac cgccttcttg cgttcgccgc gctgaatata 300

agcaccttcg tccagcaggg agctcagttg agcgccgagg gtaacgacgg tcttgtagtc 360

attgctgccg aagaagtcgc ggttgaaggt gacgtagttc gacaggccgt gggagatcag 420

ttcgacctct ggcagccaga cattacgttc acggtcttca cgcaggctgg ctttgtaaac 480

caggccggac ttctcgacgg tgcgcaggcg gacttcatat tgggccagcc aatcctgcat 540

cgccgcgtga tcggagagtt gctccaggct cacggccggc aggtagatga agtgctcggt 600

cagctcctga gggtacagcc gcgacagacg cttgagggtt ttcatgacca tgcggaagtc 660

gttcaccagg cgctccagcg cctcgccgga aatacccggt gcgtcttcgt tcaggtgcag 720

gctcgcatct tccagggccg actgcgtcat gtactcttcc atggcatcgt cgtctttgat 780

gtattgctct tgcttgcctt tcttgacctt gtacagcggc ggctgagcga tatagatgta 840

gccacgctcg atcagctccg gcagctgacg gaagaagaag gtcagcagca gggtacggat 900

gtgcgaaccg tcgacgtcgg cgtcggtcat gatgatgatg ttgtgataac gcagcttgtc 960

gatgttgtac tcttcgcggc cgatgccgca accgagtgca gtgatcaagg tgccgacctc 1020

ttgcgaggaa atcatcttgt cgaagcgcgc tttctcgacg ttaaggatct tgcccttgag 1080

tggcagaatc gcctgggtct tacggttgcg tccctgcttg gcggagccgc cagcagagtc 1140

accttccacc aggtagagtt cggaaagggc agggtctttc tcctggcagt ccgccagttt 1200

gcccggcagg ccggcgatat ccagcgcgcc tttacggcgg gtcatctcgc gagccttacg 1260

cgccgcttca cgggcacggg cggcgtcgag catcttgccg accaccagct tggcttcgtt 1320

cgggttttcc agcaggaagt cggagaagta cctgcccatt tcctgttcga ccgcggtctt 1380

cacttcggaa gacaccagct tgtctttggt ctgggagctg aacttcggat ccggcacctt 1440

gaccgaaatg atcgcggtca ggccttcacg ggcatcgtca ccggtggtgg cgaccttgtg 1500

cttcttcgcc agaccttcct gttcgatgta attgttcagg ttacgcgtca gtgccgaacg 1560

gaagcccacc aggtgggtgc cgccgtcgcg ctgcggaatg ttgttggtga agcactgcag 1620

gttttcgttg aagctgtcgt tccactgcag ggcgatttcc acgccgatgc catcttcacg 1680

ttgcacattg aagtggaaca cctggttgac cgcggtcttg ttggtgttca ggtattcaac 1740

gaatgcacgc aggccgcctt cgtacttgaa cagttcttcc ttgccgctgc gttcgtcctt 1800

cagaacgata ccgacaccgg agttgaggaa ggacagttca cgaatccgct tggccaggat 1860

gtcccagctg aaatggatgt tcttgaaggt ctcgctggaa gccttgaagt gaatctgggt 1920

accggtggtt tcgctgtcac cgacgatcgc cataggcgcc tgaggtacac cgtgaacgta 1980

ggtctgctcc cagatcttgc cgctgcggcg aacggtcagg accagttctt cggacaaggc 2040

gttcactacc gacacaccca caccgtgcag accgccggat actttgtagg agttgtcgtc 2100

gaacttaccg ccggcgtgca gcacggtcat gatgacctcg gccgcggaaa cgccttcttc 2160

tttatgcacg tctaccggga tgccgcgacc gttgtcacgc acggtaatgg attcgtccgg 2220

atggatgatg atgctgatgt cgtcgcagtg gccggccaga gcttcgtcga tcgagttatc 2280

gaccacctcg aacaccatat ggtgcagacc gctgccatca tcggtgtcac caatgtacat 2340

accgggacgt ttgcgtacgg catccaaacc tttcagcact ttaatgctgc tcgagtcgta 2400

cgtgttttct tcgctcat 2418

<210> 3

<211> 4074

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

atggcttact catatactga gaaaaaacgt atccgcaagg actttagcaa gttgccggac 60

gtcatggatg tgccgtacct cctggccatc cagctggatt cgtatcgtga attcttgcaa 120

gcgggagcga ctaaagatca gttccgcgac gtgggcctgc atgcggcctt caaatccgtt 180

ttcccgatca tcagctactc cggcaatgct gcgttggagt atgtcggtta tcgcctgggc 240

gaaccggcat ttgatgtcaa agaatgcgtg ctgcgcggtg taacttacgc cgtacctttg 300

cgggtaaaag ttcgtctgat cattttcgac aaagagtcgt cgaacaaagc gatcaaggac 360

atcaaagagc aagaagtcta catgggtgaa atccccctga tgactgagaa cggtaccttc 420

gtaatcaacg gtaccgagcg tgtaatcgtt tcccagctgc accgttcccc tggcgtattc 480

ttcgaccacg accgtggcaa gacgcacagc tccggtaagc tgctgtactc cgcacgtatc 540

attccttacc gcggttcctg gttggacttc gagttcgacc cgaaagactg cgtattcgtg 600

cgtatcgacc gtcgccgcaa gctgcctgca tcggtgctgc tgcgtgcgct gggctacacc 660

actgaagaag tgctggacgc tttctacacc accaacgtat tccacgtgcg cggcgaaagc 720

ctgagcctgg aactggtgcc tcagcgcctg cgtggtgaaa ttgccgtcct cgatattcag 780

gatgacaaag gcaaggttat tgtcgagcag ggtcgtcgta ttaccgctcg ccacatcaac 840

cagctggaaa aagccgggat caaagagctg gaagtgccgc tggactatgt cctgggtcgc 900

actaccgcca aggtcatcgt gcatccggcc accggcgaaa tcctggcaga gtgcaacacc 960

gagctgaaca ccgagatcct ggcgaagatc gccaaggctc aggttgtgcg catcgaaacg 1020

ctgtacacca acgatatcga ttgcggtccg ttcgtttccg acactctgaa gatcgactcc 1080

accaccaacc agctggaagc gttggtcgag atctatcgca tgatgcgtcc tggcgagcct 1140

ccaaccaagg atgcagccga gaccctgttc aacaacctgt tcttcagccc tgagcgctat 1200

gacctgtctg cggtcggccg gatgaagttc aaccgtcgta tcggccgtac cgagatcgaa 1260

ggttcgggcg tgttgtgcaa ggaagacatc gttgcggttc tgaagaccct ggtcgacatc 1320

cgtaacggca aaggcatcgt cgatgacatc gaccacctgg gtaaccgtcg tgttcgctgc 1380

gtaggcgaga tggccgagaa ccagttccgc gttggcctgg tgcgcgtaga gcgtgcggtc 1440

aaagagcgtc tgtcgatggc tgaaagcgaa ggcctgatgc cgcaagacct gatcaacgcc 1500

aagccagtgg ctgcggcggt gaaggagttc ttcggttcca gccagctgtc ccagttcatg 1560

gaccagaaca acccgctgtc cgagatcacc cacaagcgtc gtgtctctgc cctcggccca 1620

ggcggtctga ctcgtgagcg tgcaggcttc gaagtgcgtg acgtacaccc gactcactat 1680

ggtcgtgtat gtccgattga aacgccggaa ggtccgaaca tcggtctgat caactccttg 1740

gctgcctatg ctcgcaccaa tcagtatggc ttcctcgaga gcccgtaccg cgtggtgaaa 1800

gaaggtctgg tgaccgacga gatcgtgttc ctgtccgcta tcgaagaggc cgatcacgtg 1860

atcgcccagg cttcggcgac catgaacgac aaaggtcagc tgatcgacga gctggtagct 1920

gttcgtcacc tgaacgaatt caccgtcaag gcgccagaag acgtcacctt gatggacgtt 1980

tcgccgaagc aggtagtttc ggttgcggcg tcgctgattc cgttcctcga gcacgacgac 2040

gccaaccgtg cgttgatggg ttcgaacatg cagcgtcagg ctgtaccaac cctgcgtgcc 2100

gacaagccgc tggtaggtac cggcatggag cgtaacgttg cccgtgactc cggcgtctgc 2160

gtcgtggctc gtcgtggcgg cgtgatcgac tcggttgatg ccagccgtat cgtggttcgt 2220

gttgcggatg acgaagttga accaggcgaa gccggtgtcg acatctacaa cctgaccaaa 2280

tacacccgct ccaaccagaa cacctgcatc aaccagcgtc cgctggtgag caagggtgat 2340

cgggttcagc gcagcgatat catggccgac ggtccgtcca ccgatatggg tgaactggct 2400

ctgggtcaga acatgcgcat cgcgttcatg gcatggaacg gcttcaactt cgaagactcc 2460

atctgcctgt ccgagcgtgt ggttcaggaa gaccgcttca ccacgatcca catccaggaa 2520

ctgacctgtg tggcccgtga caccaagctt ggcccagagg aaatcactgc ggacatcccg 2580

aacgtgggtg aggctgcact gaacaagctg gacgaagccg gtatcgttta tgtaggtgct 2640

gaagttggtg caggcgacat cctggtcggt aaggtcactc cgaaaggcga gacccagctg 2700

actccggaag aaaaactgct gcgtgcaatc ttcggtgaaa aagccagcga cgttaaagac 2760

acctccctgc gcgtacctac cggtaccaag ggtactgtca tcgacgtaca ggtcttcact 2820

cgtgacggcg tagagcgtga cgctcgtgcc ctgtcgatcg agaagagcca gctcgacgag 2880

atccgcaagg atctgaacga agagttccgt atcgtcgaag gcgccacttt cgaacgtctg 2940

cgttccgctc tggtcggcca caaagccgaa ggcggcgccg gtctgaagaa ggggcaggaa 3000

atcaccgacg aagtactcga cggtcttgag catggtcagt ggttcaaact gcgcatggct 3060

gaagatgctc tgaacgagca gcttgagaag gcccaggcct atatcgttga tcgccgccgt 3120

ctgctggacg acaagttcga agacaagaag cgcaaactgc agcagggcga tgacctggcc 3180

ccaggcgtgc tgaaaatcgt caaggtttac ctggcaatcc gtcgtcgcat ccagccgggc 3240

gacaagatgg ccggtcgtca cggtaacaag ggtgtggtct ccgtgatcat gccggttgaa 3300

gacatgccgc acgatgccaa tggcaccccg gtcgatgtcg tcctcaaccc gttgggcgta 3360

ccttcgcgta tgaacgttgg tcagattctc gaaacccacc tgggcctcgc ggccaagggg 3420

ctgggcgaga agatcaaccg catggtcgaa gagcagcgca aggtcgcgga actgcgtaaa 3480

ttcctggacg agatctacaa ccagatcggt ggtcgtaacg aagatctgga tagcttctcc 3540

gatcaggaaa tcctggatct ggcgaaaaac ctgcgtggcg gcgtgccgat ggccactccg 3600

gtgttcgacg gtgccaagga aagcgaaatc aaggccatgc tgaaactggc ggacctgcca 3660

gaaagcggcc agatgcagct gaccgacggc cgtaccggca acaagttcga gcgcccggtt 3720

actgttggct acatgtacat gctgaagctg aaccacttgg tagacgacaa gatgcacgct 3780

cgttctaccg gttcgtacag cctggttacc cagcagccgc tgggtggtaa ggcgcagttc 3840

ggtggtcagc gtttcgggga gatggaggtc tgggcactgg aagcatacgg tgctgcatac 3900

actctgcaag aaatgctcac agtgaagtcg gacgatgtga acggccggac caagatgtac 3960

aaaaacatcg tggacggcga tcaccgtatg gagccgggca tgcccgagtc cttcaacgtg 4020

ttgatcaagg aaattcgttc cctcggcatc gatatcgatc tggaaaccga ataa 4074

<210> 4

<211> 1848

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

ttactcgtcg aggaaggagc gcaggtgctc gcttcgcgtc ggatggcgca gcttgcgcag 60

cgccttggct tcgatctggc gaatccgctc acgggtaacg tcgaactgct taccgacttc 120

ctcgagggtg tggtcggtat tcatgtcgat gccgaagcgc atgcgcagta ccttggcttc 180

acgggcagtg aggccggaga gtacttcgcg agtcgcttct ttaaggctct cgacggtggc 240

gacatcgatt ggcgactgca tggtcgagtc ttcgatgaag tcacccagat gggagtcttc 300

gtcatcaccg atcggggttt ccatggagat cggctcttta gcgatcttca ataccttgcg 360

gatcttgtcc tcaggcattt ccatgcgttc gcccagctct tccggagtcg gttcgcgacc 420

catttcctgc aacatctgcc gggaaatacg gttgagcttg ttgatcgtct cgatcatgtg 480

caccggaata cgaatggtgc gggcctggtc ggcgatcgag cgagtgatcg cctgacggat 540

ccaccaggtg gcataagtcg agaacttgta gccgcgacgg tattcgaact tgtctaccgc 600

tttcatcaaa ccgatgttgc cttcctggat caggtcgagg aattgcaggc cacggttggt 660

gtacttcttg gcgatggaga tcaccaggcg caggttggct tcgaccatct ctttcttcgc 720

gcgacgggcc ttggcctcgc cgatcgacat gcgacggttg atgtccttga tctcggcgat 780

cgtcaggccg gtctcggtct cgagcgcggt cagcttctgc tggcaacgga tgatgtccgg 840

ctgcaggcgg ccgatggctt cggcgtactt ggccttgcct ttggccagtg cgtcggacca 900

gctttcgtcc acttcattgc cagggaactg gcgcaggaag tcggcgcgtg gcatgcgggc 960

atcacgaaca cagagctgca tgatcgcgcg ctcttgctga cgcaggcgat ccagggcgct 1020

acgaacacgt tcaaccaagc cttcgaattg cttcggaacc agtttgatcg gcatgaacag 1080

ttcagccagg gccagcattt cagccagggc ttgcttgtgt tcgcgaccgt gcttcttcag 1140

cgccttgcgg gtgatttcca tctggtcggc aacggcgcca aagcgctggg ctgcgatgac 1200

cggatccgga ccgctttcgg cttcttcttc gtcgtcactg gcttcggcgt catcgtcgtc 1260

ggtgtcgtcg tccgcttttg tggccttggc atcgacaggc ggtggtactt cggcggcagg 1320

cggcgcaatg ccgtcgtccg ggtcgatgta accgctcagg acgtcggaca ggcggccacc 1380

ttcggtggtg acgcgagtgt attcggagag gatgtgctca accgtgccag ggaagtgcgc 1440

gatcgcgccc atcacctcac ggatgccctc ttcgatacgc ttggcgattt cgatttcgcc 1500

ttcacgtgtg agcagctcta ccgtacccat ttcgcgcatg tacatacgca ctgggtcggt 1560

agtgcgacca atgtcggttt ccacagccgc caacgctgcg gcggcttctt cagctgcagc 1620

ttcgtcagta tcggcttcgg ccaacaaaag ggcatccgca tccggagcac tctcgaatac 1680

gttgatcccc atgtcgttga tcatgcggat gatgtcttcc acctgttccg gatctgaaat 1740

atcctccggc aggtggtcgt tgacctccgc gtaagtcagg taaccctgct cacgaccacg 1800

gctgatcaac tctttgaggc gagactgctg ttgcgctttt ccggacat 1848

Claims (9)

1.绿针假单胞菌桔黄亚种（Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca）YS05，其保藏编号为CGMCC No.20323。

2.权利要求1所述绿针假单胞菌桔黄亚种（Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca）YS05的菌悬液或发酵液或含有权利要求1所述绿针假单胞菌桔黄亚种YS05的菌剂。

3.权利要求1所述绿针假单胞菌桔黄亚种（Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca）YS05的菌悬液或发酵液或含有权利要求1所述绿针假单胞菌桔黄亚种YS05的菌剂在抑制植物致病菌中的应用；

所述植物致病菌为致病真菌或致病细菌；

所述致病真菌为炭疽菌（Colletotrichum spp.）、灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）、多主棒孢菌（Corynespora cassiicola）、辣椒疫霉（Phytophthora capsici）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、茄病镰刀菌（Fusarium solani）、番茄匍柄霉菌（Stemphylium lycopersici (Enjoji) Yamamoto）、茄链格孢菌（Alternaria solani）或西瓜壳二孢（Ascochyta citrullina）；

所述致病细菌为密执安棒杆菌密执安亚种（Clavibacter michiganensis subsp.Michiganensis）、葡萄土壤杆菌（Agrobacterium vitis）或丁香假单胞番茄致病变种（Pseudomonas syringae pv. tomato）。

4.权利要求1所述绿针假单胞菌桔黄亚种（Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca）YS05的菌悬液或发酵液或含有权利要求1所述绿针假单胞菌桔黄亚种YS05的菌剂在制备抑制植物致病菌的产品中的应用；

所述植物致病菌为致病真菌或致病细菌；

所述致病真菌为炭疽菌（Colletotrichum spp.）、灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）、多主棒孢菌（Corynespora cassiicola）、辣椒疫霉（Phytophthora capsici）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、茄病镰刀菌（Fusarium solani）、番茄匍柄霉菌（Stemphylium lycopersici (Enjoji) Yamamoto）、茄链格孢菌（Alternaria solani）或西瓜壳二孢（Ascochyta citrullina）；

所述致病细菌为密执安棒杆菌密执安亚种（Clavibacter michiganensis subsp.Michiganensis）、葡萄土壤杆菌（Agrobacterium vitis）或丁香假单胞番茄致病变种（Pseudomonas syringae pv. tomato）。

5.权利要求1所述绿针假单胞菌桔黄亚种（Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca）YS05的菌悬液或发酵液或含有权利要求1所述绿针假单胞菌桔黄亚种YS05的菌剂在防治致病菌引起的植物病害中的应用；

所述致病菌为致病真菌或致病细菌；

所述致病真菌为炭疽菌（Colletotrichum spp.）、灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）、多主棒孢菌（Corynespora cassiicola）、辣椒疫霉（Phytophthora capsici）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、茄病镰刀菌（Fusarium solani）、番茄匍柄霉菌（Stemphylium lycopersici (Enjoji) Yamamoto）、茄链格孢菌（Alternaria solani）或西瓜壳二孢（Ascochyta citrullina）；

所述致病细菌为密执安棒杆菌密执安亚种（Clavibacter michiganensis subsp.Michiganensis）、葡萄土壤杆菌（Agrobacterium vitis）或丁香假单胞番茄致病变种（Pseudomonas syringae pv. tomato）。

6.权利要求1所述绿针假单胞菌桔黄亚种（Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca）YS05的菌悬液或发酵液或含有权利要求1所述绿针假单胞菌桔黄亚种YS05的菌剂在制备防治致病菌引起的植物病害的产品中的应用；

所述致病菌为致病真菌或致病细菌；

所述致病真菌为炭疽菌（Colletotrichum spp.）、灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）、多主棒孢菌（Corynespora cassiicola）、辣椒疫霉（Phytophthora capsici）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、茄病镰刀菌（Fusarium solani）、番茄匍柄霉菌（Stemphylium lycopersici (Enjoji) Yamamoto）、茄链格孢菌（Alternaria solani）或西瓜壳二孢（Ascochyta citrullina）；

所述致病细菌为密执安棒杆菌密执安亚种（Clavibacter michiganensis subsp.Michiganensis）、葡萄土壤杆菌（Agrobacterium vitis）或丁香假单胞番茄致病变种（Pseudomonas syringae pv. tomato）。

7.权利要求1所述绿针假单胞菌桔黄亚种（Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca）YS05的菌悬液或发酵液或含有权利要求1所述绿针假单胞菌桔黄亚种YS05的菌剂在防治番茄匍柄霉叶斑病中的应用。

8.权利要求1所述绿针假单胞菌桔黄亚种（Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca）YS05的菌悬液或发酵液或含有其的菌剂在制备防治番茄匍柄霉叶斑病的产品中的应用。

9.如下b1）-b3）中任一种方法：

b1）一种抑制植物致病菌的方法，包括如下步骤：用权利要求1所述绿针假单胞菌桔黄亚种（Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca）YS05的菌悬液或发酵液或含有权利要求1所述绿针假单胞菌桔黄亚种YS05的菌剂处理植物致病菌；

b2）一种防治致病菌引起的植物病害的方法，包括如下步骤：用权利要求1所述绿针假单胞菌桔黄亚种（Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca）YS05的菌悬液或发酵液或含有权利要求1所述绿针假单胞菌桔黄亚种YS05的菌剂处理植物；

b3）一种防治番茄匍柄霉叶斑病的方法，包括如下步骤：用权利要求1所述绿针假单胞菌桔黄亚种（Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca）YS05的菌悬液或发酵液或含有权利要求1所述绿针假单胞菌桔黄亚种YS05的菌剂处理番茄；

其中，b1)或b2）中所述致病菌为致病真菌或致病细菌；

所述致病真菌为炭疽菌（Colletotrichum spp.）、灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）、多主棒孢菌（Corynespora cassiicola）、辣椒疫霉（Phytophthora capsici）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、茄病镰刀菌（Fusarium solani）、番茄匍柄霉菌（Stemphylium lycopersici (Enjoji) Yamamoto）、茄链格孢菌（Alternaria solani）或西瓜壳二孢（Ascochyta citrullina）；

所述致病细菌为密执安棒杆菌密执安亚种（Clavibacter michiganensis subsp.Michiganensis）、葡萄土壤杆菌（Agrobacterium vitis）或丁香假单胞番茄致病变种（Pseudomonas syringae pv. tomato）。

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