CN114940958B

CN114940958B - 一株暹罗芽孢杆菌、制备的微生物菌剂及其应用

Info

Publication number: CN114940958B
Application number: CN202210562626.6A
Authority: CN
Inventors: 丁海霞; 彭丽娟; 周志成
Original assignee: Guizhou University
Current assignee: Guizhou University
Priority date: 2022-05-23
Filing date: 2022-05-23
Publication date: 2023-06-27
Anticipated expiration: 2042-05-23
Also published as: CN114940958A

Abstract

本发明提供了一株暹罗芽孢杆菌、制备的微生物菌剂及其应用，属于微生物学及其农业应用技术领域。本发明从西南地区海拔最高的乌蒙大草原灌木腐殖质土壤样中分离筛选并获得1株芽孢杆菌菌株，通过形态学、生理生化特征及基因序列分析鉴定了其分类地位，将其确定为暹罗芽孢杆菌，命名为GUWM35，并进行了保藏，保藏号为CGMCC No.24078。通过对其生防机制进行初步检测，发现该GUWM35菌株对包含烟草黑胫病菌在内的15种植物病原真菌均具有较强的拮抗活性，而且对烟草种子具有明显的促生作用，从而为喀斯特高原地区适应性芽孢杆菌资源研究及高原环境适应性生防菌株的开发和应用提供了优质资源。

Description

一株暹罗芽孢杆菌、制备的微生物菌剂及其应用

技术领域

本发明属于微生物学及其农业应用技术领域，尤其涉及一株暹罗芽孢杆菌、制备的微生物菌剂及其应用。

背景技术

烟草黑胫病(Tobacco black shank)是由烟草疫霉(Phytophthora nicotianae)引起的在贵州烤烟生产中最具破坏性的土传病害，主要为害烤烟的根茎部，严重降低烤烟的产量和品质。目前生产上主要采用甲霜灵(如58％甲霜灵·锰锌可湿性粉剂)等化学药剂进行防治，该药剂的田间使用年限较长，病原菌抗药性逐年增加，农药残留及环境污染等负面效应也逐步增长。因此，对环境友好的植物病害生物防治日益受到关注和重视。

乌蒙大草原位于贵州省盘州市，海拔2000-2857m，是西南地区海拔最高、面积最大的喀斯特高原草场之一，具有独特的生境，其微生物资源研究具有广阔的探索和发展前景。芽孢杆菌是目前微生物资源利用中应用较广的一类微生物资源，因其能产生抗逆的芽孢而具有非常强的生存适应能力，广泛应用于农业、畜牧业、工业、医学等领域；芽孢杆菌也是理想的生防菌筛选对象，具有作用机制多样，不易产生抗药性，生产成本低，易储运，对人畜安全以及防治效果稳定等优点，是生物菌肥和生物农药研发和应用的重要原料。但是目前尚未有喀斯特高原地区适应性芽孢杆菌资源研究及高原环境适应性生防菌株开发和应用的相关报道。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一株暹罗芽孢杆菌、制备的微生物菌剂及其应用。本发明从西南地区海拔最高的乌蒙大草原灌木腐殖质土壤样中分离筛选并获得1株芽孢杆菌菌株，通过形态学、生理生化特征及基因序列分析鉴定了其分类地位，将其确定为暹罗芽孢杆菌，命名为GUWM35，并进行了保藏，保藏号为CGMCC No.24078。通过对其生防机制进行初步检测，发现该GUWM35菌株对包含烟草黑胫病菌在内的15种植物病原真菌均具有较强的拮抗活性，而且对烟草种子具有明显的促生作用，从而为喀斯特高原地区适应性芽孢杆菌资源研究及高原环境适应性生防菌株的开发和应用提供了优质资源。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明提供了一株暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)GUWM35，其保藏号为CGMCC No.24078。

本发明还提供了一种含有所述暹罗芽孢杆菌GUWM35的微生物菌剂。

优选的，所述微生物菌剂中暹罗芽孢杆菌GUWM35的浓度为0.8～1.2×10⁸CFU/mL。

优选的，所述微生物菌剂中暹罗芽孢杆菌GUWM35的浓度为1.0×10⁸CFU/mL。

本发明还提供了一种含有所述暹罗芽孢杆菌GUWM35脂肽类抗生素粗提物的微生物菌剂。

本发明还提供了一种含有所述暹罗芽孢杆菌GUWM35挥发性物质的微生物菌剂。

优选的，所述的暹罗芽孢杆菌GUWM35挥发性物质为VOCs。

本发明还提供了一种所述暹罗芽孢杆菌GUWM35或所述微生物菌剂在防治植物病原真菌病害中的应用。

优选的，所述植物病原真菌病害的病原菌为烟草黑胫病菌、烟草赤星病菌、烟草赤星病长柄链格孢菌、烟草炭疽菌、立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、辣椒炭疽病菌、小麦赤霉病菌、马铃薯干腐病菌、茶叶枯病菌、茶枝枯病菌、葡萄炭疽病菌、油茶炭疽病菌、黄瓜根腐病菌、番茄灰霉病菌中的一种或任意几种。

本发明还提供了一种所述暹罗芽孢杆菌GUWM35或所述微生物菌剂在提高烟草种子发芽率中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：

(1)GUWM35对15种植物病原真菌中的14种病菌的抑制率均在50％以上，对烟草和茶的病原菌抑制效果优秀，对立枯丝核菌、炭疽病菌和部分镰刀菌抑制效果优秀。

(2)室内盆栽防效表明GUWM35对烟草黑胫病具有良好的防效，防效达71.86％，和生产上主用药剂58％甲霜灵·锰锌可湿性粉剂的防效相当，并具有更优秀的促生效果。

(3)GUWM35产生的脂肽类物质对15种植物病原真菌也有良好的抑制效果，对10种病原菌抑制率在50％以上，对烟草和茶的病原菌抑制效果优秀，对对立枯丝核菌、炭疽病菌抑制效果优秀。

(4)GUWM35产生的挥发性物质对15种植物病原真菌也有良好的抑制效果，对6种病原菌抑制率在50％以上，对烟草和茶的病原菌抑制效果优秀。

(5)GUWM35对烟草幼苗的根长、茎高和根鲜重具有良好的促生效果，比生产上主用药剂58％甲霜灵·锰锌可湿性粉剂的促生效果更好。经GUWM35处理后，15d时烟草幼苗的发芽率达92.6％，远远高于CK处理。烟草幼苗的根长和茎长分别为24.04和2.16mm，显著高于CK处理。

保藏证明说明：

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏编号：CGMCC No.24078；

保藏日期：2021年12月09日；

保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

分类学命名：暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)。

附图说明

图1为本发明实施例1中GUWM35的生长曲线图；

图2为本发明实施例1中GUWM35产生的生防相关表型图；

图3为本发明实施例1中GUWM35基于16S rRNA和gyrA基因的系统发育树；

图4为本发明实施例2中GUWM35对15种植物病原真菌的抑菌效果图，其中：Ⅰ.Rhizoctonia solani；Ⅱ.Colletotrichum micotianae；Ⅲ.Alternaria longipes；Ⅳ.Phlebiopsis crassa；Ⅴ.Fusarium asiaticum；Ⅵ.A.alternata；Ⅶ.Phytophthoranicotianae；Ⅷ.Pestalotiopsis sydowiana；Ⅸ.C.gloeosporioides；Ⅹ.F.redolens；ⅩⅠ.F.oxysporum；ⅩⅡ.C.scovillei；ⅩⅢ.C.fioriniae；ⅩⅣ.F.solani；ⅩⅤ.Botrytiscinerea；

图5为本发明实施例2中GUWM35对烟草黑胫病的防病效果(室内盆栽试验)图；

图6为本发明实施例3中GUWM35脂肽类粗提物对15种植物病原真菌的抑菌效果图，其中：Ⅰ.Rhizoctonia solani；Ⅱ.Colletotrichum micotianae；Ⅲ.A.longipes；Ⅳ.Phlebiopsis crassa；Ⅴ.Fusarium asiaticum；Ⅵ.Alternaria alternata；Ⅶ.Phytophthora nicotianae；Ⅷ.Pestalotiopsis sydowiana；Ⅸ.C.gloeosporioides；Ⅹ.F.redolens；ⅩⅠ.F.oxysporum；ⅩⅡ.C.scovillei；ⅩⅢ.C.fioriniae；ⅩⅣ.F.solani；ⅩⅤ.Botrytis cinerea；

图7为本发明实施例4中GUWM35挥发性物质VOCs对15种植物病原真菌的抑菌效果图，其中：Ⅰ.Rhizoctonia solani；Ⅱ.Colletotrichum micotianae；Ⅲ.A.longipes；Ⅳ.Phlebiopsis crassa；Ⅴ.Fusarium asiaticum；Ⅵ.Alternaria alternata；Ⅶ.Phytophthora nicotianae；Ⅷ.Pestalotiopsis sydowiana；Ⅸ.C.gloeosporioides；Ⅹ.F.redolens；ⅩⅠ.F.oxysporum；ⅩⅡ.C.scovillei；ⅩⅢ.C.fioriniae；ⅩⅣ.F.solani；ⅩⅤ.Botrytis cinerea；

图8为本发明实施例5中CK、58％甲霜灵·锰锌以及GUWM35处理对烟草种子发芽率促生效果的对比图；

图9为本发明实施例5中CK、58％甲霜灵·锰锌以及GUWM35处理中烟草种子的发芽率检测图；

图10为本发明实施例5中CK、58％甲霜灵·锰锌以及GUWM35处理中烟草种子的苗长和根长检测图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。以下实施例中使用的试剂、试剂盒和仪器均可由市售获得，实施例中使用的方法如无特别说明，与常规使用的方法一致。

下面结合实施例，对本发明的技术方案进行进一步详细阐述。

实施例1GUWM35菌株的分离与鉴定

1.GUWM35菌株的分离

2018年3月从贵州省盘州市乌蒙大草原采集5-10cm深度灌木丛腐殖质土样，采用五点采样法。使用无菌自封袋封装土样，采土工具使用75％酒精进行消毒，避免不同采样点之间土壤微生物混杂。

2.菌株生理生化试验鉴定

(1)生长曲线测定：采用比浊法测定芽孢杆菌的生长速率，挑取单菌落接种于LB液体培养基的试管中，于37℃、200r·min^-1过夜摇培母液，按1：100的接种量接入含有50mL LB液体培养基的500mL三角瓶中，37℃、200rpm恒温摇床培养，在分光光度计600nm波长下每1h测定一次菌液OD值，至OD值稳定时停止测量。实验重复3次，计算平均值并绘制生长曲线，结果如图1所示。

图1显示：该菌株生长速度较快，且符合暹罗芽孢杆菌的生长规律。

(2)菌落形态观察：37℃、200rpm过夜摇培菌株，收集芽孢杆菌菌液，在LB平板上滴加2μL菌液，37℃过夜培养后利用体视镜观察菌落形态，结果如图2所示。

由图2可知：GUWM35菌株可在LB液体培养基表面形成复杂的生物膜结构(biofilm)；GUWM35菌落近白色，有复杂的褶皱形态(colony)，可以产生蛋白酶、纤维素酶、铁载体和磷酸酯酶。

(3)生理生化特征测定：根据《伯杰细菌鉴定手册(第八版)》和《常见细菌系统鉴定手册》，对菌株的生理生化特性进行测定，结果如表1所示。

表1GUWM35的生理生化特征

由表1可知：筛选的菌株革兰氏染色反应、VP试验、甲基红测定、柠檬酸盐、过氧化氢、淀粉水解、明胶液化等呈阳性；亚硝酸盐还原试验为阴性，符合暹罗芽孢杆菌的生理生化特点。

3、菌株的分子生物学鉴定

芽孢杆菌DNA提取具体步骤参照EZ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)操作说明书。以基因组DNA为模板，利用16SrRNA基因通用引物和gyrA基因引物对菌株的基因组进行PCR扩增，其中通用引物为27F和1492R，具体序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.2所示，gyrA基因引物为gyrA-F和gyrA-R，具体序列如SEQ IDNo.3～SEQ ID No.34所示。利用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物长度，将扩增产物及时送往北京诺赛基因组研究中心有限公司测定基因序列。测序结果用Bioedit软件进行序列拼接，将拼接结果在BLAST网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)利用blastn suite软件进行同源性比较，之后在GenBank数据库中查找模式菌株序列并下载。以Bioedit进行多序列比对后，用系统发育分析软件MEGA*(Molecular EvolutionaryGenetics Analysis)X运行相关文件，执行邻近算法(Neighbor-Joining)构建系统发育树。其16S rRNA与gyrA基因序列已提交GenBank数据库，序列号为MW494627、MW647173，序列如SEQ ID No.5～SEQ ID No.6所示，系统发育树如图3所示。

SEQ ID No.1：27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)；

SEQ ID No.2：1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)；

SEQ ID No.3：gyrA-F(5′-CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT-3′)；

SEQ ID No.4：gyrA-R(5′-CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT-3′)；

SEQ ID No.5：16S rRNA序列

ATAGATGCAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGC

GGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGAT

AACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCGTGG

TTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGGTACCACTTACAGATGGACCCGCGG

CGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGGTCACCAAGGGGACGATGCGTA

GCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCGACACTGGGACTGAGACACGGCCCA

GACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAG

TCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAG

CTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTG

ACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCG

GTAATACGTAGGTGGCAAGCGTGTCCGGAAATTATGGGCGTAAAGGGCT

CGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCCGGG

GAGGGTCATGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGA

ATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTG

GCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGT

GGGGAGCGAACAGGATTAGATACYCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATG

AGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCA

TTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCARGACTGAAACTCAAAGG

AATTGACGGGGGCCCGGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAA

GCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGA

GATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTC

GTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAAC

CCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCG

GTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTT

ATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCG

AAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCG

CAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGAT

CAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTC

ACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAA；

SEQ ID No.6：gyrA基因序列

TCCCGGGCGCTTCCGGATGTGCGTGACGGTCTGAAGCCGGTTCACAGACGGATTTTGTACGCAATGAATGATTTAGGCATGACCAGTGACAAACCATATAAAAAATCTGCCCGTATCGTCGGTGAAGTTATCGGTAAGTACCACCCGCACGGTGACTCAGCGGTTTACGAATCAATGGTCAGAATGGCGCAGGATTTTAACTACCGCTACATGCTTGTTGACGGACACGGCAACTTCGGTTCGGTTGACGGCGACTCAGCGGCCGCGATGCGTTACACAGAAGCGAGAATGTCAAAAATCGCAATGGAAATTCTGCGTGACATTACGAAAGACACGATTGACTATCAAGATAACTATGACGGTTCAGAAAGAGAGCCTGCCGTCATGCCTTCGAGATTTCCGAATCTGCTCGTAAACGGGGCTGCCGGTATTGCGGTCGGAATGGCGACAAACATTCCCCCGCATCAGCTTGGGGAAGTCATTGAAGGCGTGCTTGCCGTAAGTGAGAATCCTGAGATTACAAACCAGGAGCTGATGGAGTACATCCCGGGCCCGGATTTTCCGACTGCAGGTCAGATTTTGGGCCGGAGCGGCATCCGCAAGGCATATGAATCCGGACGGGGATCAATCACAATCCGGGCTAAGGCTGAAATCGAAGAGACTTCATCGGGAAAAGAAAGAATTATTGTCACGGAACTTCCTTATCAGGTGAACAAAGCGAGATTAATTGAAAAAATCGCGGATCTTGTCCGGGACAAAAAAATCGAAGGAATTACCGATCTGCGAGACGAATCCGACCGTAACGGAATGAGAATCGTCATTGAGATCCGCCGTGACGCCAATGCTCACGTCATTTTGAATAACCTGTACAAACAAACGGCCCTGCAGACGTCTTTCGGGATCAACCTGCTGGCGCTCGT。

根据比对结果可推断GUWM35为暹罗芽孢杆菌。

实施例2GUWM35菌株对15种植物病原真菌病害的生长抑制试验

烟草黑胫病菌(Phytophthora nicotianae)、烟草赤星病菌(Alternariaalternata)、烟草赤星病长柄链格孢菌(A.longipes)、烟草炭疽菌(Colletotrichummicotianae)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、辣椒炭疽病菌(C.scovillei)、小麦赤霉病菌(G.asiaticum)、马铃薯干腐病菌(F.asiaticum)、茶叶枯病菌(Phlebiopsis crassa)、茶枝枯病菌(Pestalotiopsissydowiana)、葡萄炭疽病菌(C.gloeosporioides)、油茶炭疽病菌(C.fioriniae)、黄瓜根腐病菌(F.solani)、番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)等15种植物病原真菌和暹罗芽孢杆菌GUWM35由贵州大学农学院植物病理学教研室保存并提供。

(1)抑菌谱测定

采用平板对峙法，芽孢杆菌菌液收集与生长曲线测定方法中的菌液收集方法相同，检测芽孢杆菌对15种重要植物病原真菌的抑菌效果，每个处理5个平板，实验重复3次，采用十字交叉法测量菌落直径并计算抑制率，结果如图4和表2所示。

抑制率(％)＝[(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/处理组菌落直径]×100％

表2GUWM35对15种植物病原真菌的抑菌效果

结果可知：GUWM35对15种植物病原真菌中的14种病菌的抑制率均在50％以上，对烟草和茶的病原菌抑制效果优秀，对立枯丝核菌、炭疽病菌和部分镰刀菌抑制效果优秀。

(2)室内盆栽试验

将生防菌株GUWM35作为室内盆栽防效实验供试菌剂。以生产上有效的化学药剂58％甲霜灵·锰锌可湿性粉剂作为室内盆栽防效实验供试药剂。在室内以8株苗为一处理，喷施菌剂和药剂，菌剂浓度为1×10⁸CFU/mL，药剂浓度为推荐浓度，菌剂和药剂各设置3个重复，以无药清水处理作为对照，根据烟草移栽稳定生长后进行第1次喷施或灌根生防菌液20mL，之后每隔7d处理菌液1次，共处理3次。施用第一次生防菌液后3天接种烟草黑胫病病原菌。药剂在第2次处理生防菌液时一同施下，共灌根1次。在最后1次处理菌液后的第10d调查并统计各个处理的烟草苗发病情况，记录发病率和病情指数；分别取各处理植株，小心抖去根部土壤，再用清水洗浄根表土壤，并用吸水纸吸干根表水分，分别测量和统计根长、根鲜重和茎高。数据采用Excel表格和DPS 7.05数据处理系统Duncan新复极差法进行方差分析，结果如表3和图5所示。

发病率(％)＝(发病株数/调查总株数)×100；

病情指数(DI)＝∑(各级发病株数×病级数值)/[(调查总株数×病级最高值)×100]；

相对防效(％)＝(CK病情指数-处理病情指数)/CK病情指数×100

表3GUWM35对烟草黑胫病的防病效果(室内盆栽试验)

结果可知：室内盆栽防效表明GUWM35对烟草黑胫病具有良好的防效，防效达71.86％，和生产上主用药剂58％甲霜灵·锰锌可湿性粉剂的防效相当，并具有更优秀的促生效果。

实施例3GUWM35脂肽类抗生素粗提物对病原菌的抑菌效果

(1)GUWM35脂肽类抗生素粗提物的制备

挑取GUMT319新鲜单菌落接种到LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养过夜。接种于不加抗性的LB液体培养基中预培养6h至OD约等于3.0，以1:100比例接种至50mL Landy培养基(10倍溶氧)中，30℃、200rpm培养36h至深咖啡色。50mL离心管收集菌悬液，5000rpm离心10min，取上清。称取6g XAD16吸附树脂装入柱子中，用50mL去离子水洗去树脂表面的盐，将离心取得的上清加入此基质中。再用50mL去离子水洗涤树脂柱，加14mL甲醇洗脱，收集洗脱液。用旋转蒸发仪干燥甲醇样品(干燥至变深黄贴壁)。干燥的样品先在100μL去离子水中溶解，再加1mL二甲基亚砜(DMSO)至样品中(可在-20℃下长期保存)。

(2)抑菌效果验证

采用0.22μm的无菌滤膜过滤GUMT319脂肽类抗生素粗提物，制备无菌粗提物。采用牛津杯法，在无菌条件操作，并将无菌牛津杯置入倒好的PDA培养基中，往牛津杯滴加150μL脂肽类抗生素粗提物，用5mm的无菌打孔器打取活化后的各个病原菌接种于距牛津杯5cm处的PDA平板上，7d后采用十字交叉法测量病原菌直径，计算抑制率，采用SPSS软件进行显著性分析，结果如图6所示。

结果可知：GUWM35产生的脂肽类物质对15种植物病原真菌也有良好的抑制效果，对10种病原菌抑制率在50％以上，对烟草和茶的病原菌抑制效果优秀，对对立枯丝核菌、炭疽病菌抑制效果优秀。

实施例4GUWM35挥发性物质对病原菌的抑菌效果

取活化的GUWM35菌落后均匀、密集地于LB平板上划线，使该细菌布满平板；另取植物病原菌菌碟(Φ＝5mm)分别接种于PDA平板的中央，然后与布满GUWM35菌体的LB平板对扣，周围用封口膜密封，28℃、黑暗条件下恒温培养，另以空白LB平板为对照，间隔2-7d分别观察并测量处理和对照平板菌落直径，一直到对照平板菌丝长满。采用十字交叉法测量病原菌直径，计算抑制率，采用SPSS软件进行显著性分析，结果如图7所示。

结果可知：GUWM35产生的挥发性物质对15种植物病原真菌也有良好的抑制效果，对6种病原菌抑制率在50％以上，对烟草和茶的病原菌抑制效果优秀。

实施例5烟草种子发芽率促生实验

将生防菌株GUWM35发酵液(含菌量1×10⁸CFU/mL)浸泡烟草种子2h，晾干后均匀置于铺有1层润湿灭菌滤纸的培养皿内，于25℃下培养。每24h记录发芽数，15d后截止，分别测量处理后的发芽率，芽长和根长，以清水浸种为对照，每处理重复5次，结果如表4和图8所示。

表4GUWM35对烟草幼苗的促生效果

由表4和图8可知：GUWM35对烟草幼苗的根长、茎高和根鲜重具有良好的促生效果，比生产上主用药剂58％甲霜灵·锰锌的促生效果更好。经GUWM35处理后，15d时烟草幼苗的发芽率达92.6％，远远高于CK处理。烟草幼苗的根长和茎长分别为24.04和2.16mm，显著高于CK处理。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 贵州大学

<120> 一株暹罗芽孢杆菌、制备的微生物菌剂及其应用

<130> 2022.05.06

<141> 2022-05-23

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 2

ggttaccttg ttacgactt 19

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 3

cagtcaggaa atgcgtacgt cctt 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 4

caaggtaatg ctccaggcat tgct 24

<210> 5

<211> 1426

<212> DNA

<213> 暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)

<400> 5

atagatgcag tcgagcggac agatgggagc ttgctccctg atgttagcgg cggacgggtg 60

agtaacacgt gggtaacctg cctgtaagac tgggataact ccgggaaacc ggggctaata 120

ccggatggtt gtttgaaccg cgtggttcag acataaaagg tggcttcggg taccacttac 180

agatggaccc gcggcgcatt agctagttgg tgaggtaacg ggtcaccaag gggacgatgc 240

gtagccgacc tgagagggtg atcggcgaca ctgggactga gacacggccc agactcctac 300

gggaggcagc agtagggaat cttccgcaat ggacgaaagt ctgacggagc aacgccgcgt 360

gagtgatgaa ggttttcgga tcgtaaagct ctgttgttag ggaagaacaa gtgccgttca 420

aatagggcgg caccttgacg gtacctaacc agaaagccac ggctaactac gtgccagcag 480

ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgtgtc cggaaattat gggcgtaaag ggctcgcagg 540

cggtttctta agtctgatgt gaaagccccc ggctcaaccc ggggagggtc atggaaactg 600

gggaacttga gtgcagaaga ggagagtgga attccacgtg tagcggtgaa atgcgtagag 660

atgtggagga acaccagtgg cgaaggcgac tctctggtct gtaactgacg ctgaggagcg 720

aaagcgtggg gagcgaacag gattagatac yctggtagtc cacgccgtaa acgatgagtg 780

ctaagtgtta gggggtttcc gccccttagt gctgcagcta acgcattaag cactccgcct 840

ggggagtacg gtcgcargac tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgg cacaagcggt 900

ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta ccaggtcttg acatcctctg 960

acaatcctag agataggacg tccccttcgg gggcagagtg acaggtggtg catggttgtc 1020

gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttgatctta 1080

gttgccagca ttcagttggg cactctaagg tgactgccgg tgacaaaccg gaggaaggtg 1140

gggatgacgt caaatcatca tgccccttat gacctgggct acacacgtgc tacaatggac 1200

agaacaaagg gcagcgaaac cgcgaggtta agccaatccc acaaatctgt tctcagttcg 1260

gatcgcagtc tgcaactcga ctgcgtgaag ctggaatcgc tagtaatcgc ggatcagcat 1320

gccgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccac gagagtttgt 1380

aacacccgaa gtcggtgagg taacctttat ggagccagcc gccgaa 1426

<210> 6

<211> 920

<212> DNA

<213> 暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)

<400> 6

tcccgggcgc ttccggatgt gcgtgacggt ctgaagccgg ttcacagacg gattttgtac 60

gcaatgaatg atttaggcat gaccagtgac aaaccatata aaaaatctgc ccgtatcgtc 120

ggtgaagtta tcggtaagta ccacccgcac ggtgactcag cggtttacga atcaatggtc 180

agaatggcgc aggattttaa ctaccgctac atgcttgttg acggacacgg caacttcggt 240

tcggttgacg gcgactcagc ggccgcgatg cgttacacag aagcgagaat gtcaaaaatc 300

gcaatggaaa ttctgcgtga cattacgaaa gacacgattg actatcaaga taactatgac 360

ggttcagaaa gagagcctgc cgtcatgcct tcgagatttc cgaatctgct cgtaaacggg 420

gctgccggta ttgcggtcgg aatggcgaca aacattcccc cgcatcagct tggggaagtc 480

attgaaggcg tgcttgccgt aagtgagaat cctgagatta caaaccagga gctgatggag 540

tacatcccgg gcccggattt tccgactgca ggtcagattt tgggccggag cggcatccgc 600

aaggcatatg aatccggacg gggatcaatc acaatccggg ctaaggctga aatcgaagag 660

acttcatcgg gaaaagaaag aattattgtc acggaacttc cttatcaggt gaacaaagcg 720

agattaattg aaaaaatcgc ggatcttgtc cgggacaaaa aaatcgaagg aattaccgat 780

ctgcgagacg aatccgaccg taacggaatg agaatcgtca ttgagatccg ccgtgacgcc 840

aatgctcacg tcattttgaa taacctgtac aaacaaacgg ccctgcagac gtctttcggg 900

atcaacctgc tggcgctcgt 920

Claims

1.一株暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis）GUWM35，其特征在于，其保藏号为CGMCCNo. 24078。

2.含有权利要求1所述的暹罗芽孢杆菌GUWM35的微生物菌剂。

3.如权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中暹罗芽孢杆菌GUWM35的浓度为0.8~1.2×10⁸ CFU/mL。

4.如权利要求3所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中暹罗芽孢杆菌GUWM35的浓度为1.0×10⁸ CFU/mL。

5.权利要求1所述的暹罗芽孢杆菌GUWM35或权利要求2~4任一所述的微生物菌剂在防治植物病原真菌病害中的应用，其特征在于，所述植物病原真菌病害的病原菌为烟草黑胫病菌（Phytophthora nicotianae）、烟草赤星病菌（Alternaria alternata）、烟草赤星病长柄链格孢菌（A. longipes）、烟草炭疽菌（Colletotrichum micotianae）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、辣椒炭疽病菌（C. scovillei）、小麦赤霉病菌（G. asiaticum）、马铃薯干腐病菌（F. asiaticum）、茶叶枯病菌（Phlebiopsis crassa）、茶枝枯病菌（Pestalotiopsis sydowiana）、葡萄炭疽病菌（C. gloeosporioides）、油茶炭疽病菌（C. fioriniae）、黄瓜根腐病菌（F. solani）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）中的一种或任意几种。

6.权利要求1所述的暹罗芽孢杆菌GUWM35或权利要求2~4任一所述的微生物菌剂在提高烟草种子发芽率中的应用。