CN113215010B - 贝莱斯芽孢杆菌zf128及其在防治马铃薯枯萎病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种贝莱斯芽孢杆菌ZF128及其在防治马铃薯枯萎病中的应用。本发明提供了贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ZF128，其保藏编号为CGMCC No.17633。实验结果表明，该菌株对5种病原真菌和5种病原细菌都具有显著拮抗效果，接种了该菌株的马铃薯发病明显减轻，防效为82.46％。此外，该菌株能在马铃薯根际和根部进行有效定殖，而且其对马铃薯株高、根长、地上部和地下部鲜重、及叶绿素含量均具有明显的促生作用。贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ZF128生防性状优良，是一株具有潜在应用价值的芽胞杆菌。

Description

贝莱斯芽孢杆菌ZF128及其在防治马铃薯枯萎病中的应用

技术领域

本发明涉及贝莱斯芽孢杆菌ZF128及其在防治马铃薯枯萎病中的应用。

背景技术

随着我国马铃薯主粮化战略的提出，马铃薯种植面积逐年增加，已成为我国第四大粮食作物，但近年来，由于连作障碍的不断加剧，导致土传病害发生加剧。马铃薯枯萎病是由镰孢菌(Fusarium spp.)引起的一类土传真菌病害，其发生范围广泛，易于流行且难以防治，严重时直接导致植株死亡，造成大量减产，严重制约着马铃薯产业的健康发展。

目前，马铃薯枯萎病的防治措施以化学防治为主，但化学药剂的长期单一使用会导致病原菌产生抗药性，并且严重威胁环境及食品安全。生物防治具有绿色、无污染，不产生抗药性，对人畜无害等优点，是目前最有应用前景的防治方法。芽胞杆菌是一类常见的生防细菌，种类繁多，广泛存在于土壤、植物内部等自然环境中。由于其具有抗逆性强、繁殖快、广谱抗菌活性和良好的稳定性，易于形成制剂且成本低等特点，被广泛应用于植物病害生物防治。多年来，芽胞杆菌用于防治枯萎病的研究已有较多报道，如利用解淀粉芽胞杆菌Lh-1和特基拉芽胞杆菌wm031防治西瓜枯萎病，枯草芽孢杆菌防治黄瓜枯萎病、甜瓜枯萎病、番茄枯萎病和香蕉枯萎病等。但针对枯萎病筛选出的生防芽胞杆菌种类单一，以枯草芽胞杆菌居多，并且以马铃薯枯萎病为靶标的拮抗芽胞杆菌筛选研究相对较少。因此，筛选高效防治马铃薯枯萎病的生防菌株对于马铃薯土传病害的生防研究具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供贝莱斯芽孢杆菌ZF128及其在防治马铃薯枯萎病中的应用。

第一方面，本发明首先保护贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ZF128，已于2019年04月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101)，保藏编号为CGMCC No.17633。

第二方面，本发明保护菌剂，含有贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ZF128。

所述菌剂中具体可含有1×10⁷～1×10⁹cfu·mL^-1的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)ZF128，更具体可含有1×10⁸cfu·mL^-1的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)ZF128。所述菌剂可作为生防制剂。所述生防制剂可由贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ZF128和助剂配制而成。

第三方面，本发明保护贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ZF128的发酵产物。

进一步地，所述发酵产物是将贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ZF128接种于下述(a)-(g)任一所述的培养基进行发酵培养得到的：

(a)LB液体培养基；

(b)甘露醇培养基；

(c)玉米粉+鱼粉培养基；

(d)黄豆粉培养基；

(e)豆粕粉培养基；

(f)棉籽饼粉培养基；

(g)玉米粉培养基。

所述甘露醇培养基的配方具体可为：甘露醇20g，棉籽饼粉5g，CaCl₂1g，K₂HPO₄1g，蒸馏水1000ml，pH 6.0。

所述玉米粉+鱼粉培养基的配方具体可为：玉米粉25g，鱼骨粉5g，蔗糖1g，蛋白胨1.5g，MgSO₄0.25 g，K₂HPO₄1 g，蒸馏水1000ml。

所述黄豆粉培养基的配方具体可为：黄豆饼粉30g，蛋白胨2g，KH₂PO₄0.2 g，CaCO₃1g，葡萄糖5g，酵母粉3g，蒸馏水1000ml。

所述豆粕粉培养基的配方具体可为：豆粕粉80g，麦芽糖15g，KH₂PO₄6 g，蒸馏水1000ml。

所述棉籽饼粉培养基的配方具体可为：棉籽饼粉32.5g，玉米粉14g，麸皮12g，KH₂PO₄1.1 g，FeSO₄0.049g，蒸馏水1000ml。

所述玉米粉培养基的配方具体可为：玉米粉500g，蒸馏水1000ml。

所述发酵产物可为悬液或菌悬液离心得到的上清液。

所述菌悬液中具体可含有1×10⁷～1×10⁹cfu·mL^-1的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)ZF128，更具体可含有1×10⁸cfu·mL^-1的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)ZF128。

第四方面，本发明保护贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ZF128或所述菌剂或所述发酵产物在如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)中的应用：

(a1)抑制植物病原菌；

(a2)制备用于抑制植物病原菌的产品；

(a3)防治由植物病原菌所致的疾病；

(a4)制备用于防治由植物病原菌所致的疾病的产品。

所述植物病原菌为病原真菌或病原细菌。

所述病原真菌具体可为尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)、茄链格孢菌(Alternaria solani)、多主棒孢菌(Corynespora cassiicola)、辣椒疫霉菌(phytophthora capsici)或炭疽菌(Colletotrichum spp.)。

所述病原细菌具体可为密执安棒杆菌密执安亚种(Clavibater michiganensissubsp.Michiganensis)、丁香假单胞番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato)、野油菜黄单胞野油菜变种(Xanthomonas campestris pv.campestris)、丁香假单胞流泪致病变种(Pseudomonas syringae pv.lachryrnans)或密执安棒形杆菌环腐亚种(Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus)。

第五方面，本发明保护贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ZF128或所述菌剂或所述发酵产物在如下(b1)或(b2)中的应用：

(b1)防治马铃薯枯萎病；

(b2)制备用于防治马铃薯枯萎病的产品。

所述马铃薯枯萎病具体可为由尖孢镰孢菌引起的马铃薯枯萎病。

第六方面，本发明保护贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ZF128或所述菌剂或所述发酵产物在如下(c1)或(c2)中的应用：

(c1)促进植物生长发育；

(c2)制备用于促进植物生长发育的产品。

所述植物具体可为马铃薯。

所述促进植物生长发育具体可为促进株高增加和/或根长增加和/或地上部鲜重增加和/或地下部鲜重增加和/或叶绿素含量增加。

第七方面，本发明保护产品，包括贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ZF128或所述菌剂或所述发酵产物；所述产品的用途为如下(1)-(4)中的至少一种：

(1)抑制植物病原菌；

(2)防治由植物病原菌所致的疾病；

(3)防治马铃薯枯萎病；

(4)促进植物生长发育。

第八方面，本发明保护一种防治马铃薯枯萎病的方法，包括如下步骤：将贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ZF128或所述菌剂或所述发酵产物所述施于马铃薯根部或根际土壤。

所述马铃薯枯萎病具体可为由尖孢镰孢菌引起的马铃薯枯萎病。

所述方法中，具体可将马铃薯移栽于含有有效浓度贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)ZF128的培养基质中。每1kg基质中具体可含有1×10¹⁰cfu贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ZF128。

第九方面，本发明保护一种促进植物生长发育的方法，包括如下步骤：将贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ZF128或所述菌剂或所述发酵产物施于马铃薯根部或根际土壤。所述方法中，具体可为将有效浓度的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ZF128以灌根法对马铃薯进行接种。更具体可为将20mL浓度为1×10⁸cfu·mL^-1的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ZF128菌悬液均匀浇灌于马铃薯植株根围。

第十方面，本发明保护贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ZF128在制备所述菌剂或所述发酵产物中的应用。

以上任一所述马铃薯具体可为费乌瑞它马铃薯。

本发明从马铃薯根际土壤分离筛选得到一株对马铃薯枯萎病菌具有显著抑制效果的生防细菌ZF128。经生理生化测定、Biolog测定和系统发育树分析，鉴定菌株ZF128属于贝莱斯芽孢杆菌。抑菌谱测定结果显示，ZF128对5种病原真菌和5种病原细菌都具有显著拮抗效果。光学显微观察发现，菌株ZF128处理的病原菌菌丝生长受到抑制并出现膨胀变粗现象。发酵试验表明，菌株ZF128在甘露醇培养基中发酵上清液对马铃薯枯萎病菌的抑制效果最好。盆栽试验结果证明，接种菌株ZF128的马铃薯发病明显减轻，防效为82.46％。此外，定殖和促生试验表明，菌株ZF128能在马铃薯根际和根部进行有效定殖，时间达30天以上，而且其对马铃薯株高、根长、地上部和地下部鲜重、及叶绿素含量均具有明显的促生作用，促生效果均大于20％。综上，菌株ZF128生防性状优良，是一株具有潜在应用价值的芽胞杆菌。

附图说明

图1为对峙菌丝形态观察。A：与ZF128对峙培养的病原菌菌丝；B：正常生长的病原菌菌丝。

图2为ZF128双基因系统发育分析。

图3为贝莱斯芽孢杆菌ZF128不同培养基发酵液对马铃薯枯萎病菌抑制率比较。

图4为接种后菌株ZF128^rif+在马铃薯根际土壤定殖动态。

图5为接种后菌株ZF128^rif+在马铃薯根内定殖动态。

图6为贝莱斯芽孢杆菌ZF128抑菌谱。A:丁香假单胞番茄致病变种Pseudomonassyringae pv.tomato；B:野油菜黄单胞野油菜变种Xanthomonas campestrispv.campestris；C:密执安棒形杆菌环腐亚种Clavibacter michiganensissubsp.sepedonicus；D:丁香假单胞流泪致病变种Pseudomonas syringae pv.lachrymans；E:密执安棒形杆菌密执安亚种Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis；F:多主棒孢菌Corynespora cassiicola；G:尖孢镰孢菌Fusarium oxysporum；H:炭疽菌Colletotrichum spp.；I:辣椒疫霉菌phytophthora capsica；J:茄链格孢菌Alternariasolani.。

图7为贝莱斯芽孢杆菌ZF128对马铃薯枯萎病的防治效果。A：马铃薯枯萎病；B：多菌灵+枯萎；C：ZF128+枯萎；D：ZF128。

图8为贝莱斯芽孢杆菌ZF128对马铃薯的促生效果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)已在文献“石延霞,张晓慧,徐玉芳,谢学文,柴阿丽,李宝聚.吡唑并嘧啶衍生物BDO-1诱导黄瓜对枯萎病的抗性[J].园艺学报,2019,46(05):877-890.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。

茄链格孢菌(Alternaria solani)已在文献“柴阿丽、石延霞、谢学文、帕提古丽、李宝聚.加工番茄早疫病病原菌鉴定.华北农学报2015，30(增刊)：316-320.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。

多主棒孢菌(Corynespora cassiicola)已在文献“高苇、李宝聚、石延霞、谢学文.多主棒孢菌在黄瓜、番茄和茄子寄主上致病力的分化.园艺学报2011，38(3)：465-470.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。

辣椒疫霉菌(phytophthora capsici)已在文献“程颖超,康华军,石延霞,柴阿丽,张红杰,谢学文,李宝聚.辣椒疫霉菌RT-PCR检测技术的建立及应用[J].园艺学报,2018,45(05):997-1006.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。

炭疽菌(Colletotrichum spp.)已在文献“于洋、石延霞、傅俊范、李宝聚.亲和病原菌诱导黄瓜组织结构抗病性机制.植物保护学报2008，(01)：37-42.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。

密执安棒杆菌密执安亚种(Clavibater michiganensis subsp.michiganensis)已在文献“李焕玲、石延霞、谢学文、李宝聚.番茄溃疡病的发生规律与防治技术.中国蔬菜2011，23:24-27.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。

丁香假单胞番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato)已在文献“柴阿丽,帕提古丽,郭威涛,石延霞,谢学文,席先梅,李宝聚.番茄细菌性斑点病菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用[J].园艺学报,2019,46(01):182-192.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。

野油菜黄单胞野油菜变种(Xanthomonas campestris pv.campestris)已在文献“张扬、李金萍、周慧敏、李宝聚.十字花科蔬菜细菌性黑腐病的发生规律及防治.中国蔬菜2011，17:23-25.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。

丁香假单胞流泪致病变种(Pseudomonas syringae pv.lachryrnans)已在文献“李焕玲,李宝聚.李宝聚博士诊病手记(五十三)黄瓜细菌性角斑病的症状多样性与综合防治[J]中国蔬菜2012(21):23-25”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。

密执安棒形杆菌环腐亚种(Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus)已在文献“马海艳、张家森、王丽、高中强、余宏军、蒋卫杰.蒋卫杰博士:聚焦生产一线(十四)滕州市早春拱棚马铃薯高效栽培技术.中国蔬菜2015，(08):70-73.”中公开，公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。

实施例1、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ZF128的分离筛选及鉴定

一、菌株分离

从河北沽源马铃薯根际土壤中共分离细菌97株。分离方法如下：

称取马铃薯根际土壤10g，溶于90mL无菌水中，28℃恒温摇床振荡处理30min，使其充分混匀。将混匀的土样80℃水浴15min后，按照10^-1至10^-5进行梯度稀释，分别吸取100μL稀释浓度为10^-3、10^-4、10^-5的悬浮液涂布LB固体平板，每浓度涂3个平板，28℃恒温培养24h后，挑取不同的单菌落，用LB培养基摇培后与40％甘油等比例混合后，保存于-80℃冻存管中。

二、菌株筛选

采用平板对峙法测定步骤一分离的97株菌株对马铃薯枯萎病菌尖孢镰孢菌的抑制率。具体方法如下：在PDA平板中央接种直径5mm尖孢镰孢菌菌饼，28℃培养24h后，采用十字交叉法在距平板中央3cm处相对的4点分别滴加5μL浓度为1×10⁸cfu·mL^-1的待测菌株，以不接拮抗菌株为空白对照，28℃培养5d，每个处理重复3次。待对照菌丝生长至接抗菌接种点时，测量两个相对接种点间靶标菌的菌落直径，并计算抑菌率。抑菌率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100。在对峙平板上挑取靶标菌落边界处的菌丝，置于光学显微镜下观察。

通过上述实验筛选到26株对马铃薯枯萎病菌有显著拮抗作用的菌株，其中抑制率在45％以上的菌株有11株，分别为ZF115、ZF117、ZF119、ZF120、ZF121、ZF123、ZF126、ZF127、ZF128、ZF136、ZF137。菌株ZF128的抑制率最高，可达51.18％(表1)。

表1 11株生防细菌对尖孢镰孢菌拮抗活性测定

注：数据为平均值±标准误，不同小字母表示0.05水平上差异显著。

挑取菌株ZF128平板对峙试验中尖孢镰孢边界处菌丝，制作乳酚油玻片。光学显微镜观察发现，相比于正常生长的病原菌菌丝，与ZF128对峙培养的病原菌菌丝发生畸变，菌丝变粗、颜色变暗，末端呈念珠状球形或椭球型连续膨胀并形成空泡(图1)，推测菌株ZF128产生的代谢物质可能会破坏尖孢镰孢菌的细胞壁，造成菌丝的畸变。

三、菌株ZF128鉴定

1、形态学

菌株ZF128在LB培养基上形成乳白色、边缘带有褶皱的不规则近圆形菌落。

2、生理生化测定

参照《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》的方法，对菌株ZF128进行革兰氏染色、生长温度试验、耐盐性试验、游动性试验、接触酶试验、V-P试验、淀粉水解试验、明胶液化试验、柠檬酸盐利用试验、硝酸盐还原试验等生理生化试验。

检测结果如表2所示。结果表明，菌株ZF128为革兰氏阳性菌，适宜生长温度为28-37℃，在NaCl含量1％-8％均可以生长，有游动性。接触酶、V-P、淀粉水解和明胶液化反应为阳性，柠檬酸盐利用和硝酸盐还原反应为阴性。

表2菌株ZF128生理生化反应

注：+表示该实验结果为阳性；-表示该实验结果为阴性。

3、Biolog测定

挑取菌株ZF128单菌落接种至LB培养基试管斜面上，28℃培养24h。由中国农业微生物菌种保藏中心使用BIOLOG GENIII试剂盒(按照试剂盒说明书操作)对菌株ZF128进行唯一碳源利用的测定。

结果显示，ZF128菌株可以利用D-麦芽糖、D-海藻糖、D-纤维二糖、α-D-葡萄糖、D-甘露糖、D-甘露醇和蔗糖，不能利用醋酸、D-丝氨酸、D-海藻糖、D-天冬氨酸和万古霉素等。

4、16S rDNA和gyrB基因扩增及序列分析

用普通细菌基因组提取试剂盒提取菌株ZF128的基因组DNA后，分别利用细菌16SrDNA的通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′和gyrB基因扩增引物UP1F：5′-TATATTGGCTCCACGAG-3′，UP2R:5′-GATGATCTCGTCACGTTC-3′对菌株ZF128的16S rDNA和gyrB序列进行PCR扩增，PCR反应条件：95℃预变性10min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸10min。所得产物送博迈德生物公司进行序列测定。用MEGA6.0、Sequence Matrix、Seaview4按顺序连接，比对后采用最大似然法进行双基因联合建树，明确ZF128的分类地位，分析其亲缘关系。

16S rDNA测序结果如序列表的序列1所示。16S rDNA测序结果经BLAST比对发现，ZF128与多数贝莱斯芽孢杆菌一致性较高。

gyrB基因测序结果如序列表的序列2所示。

基于菌株16S rDNA和gyrB基因构建双基因系统发育树，分析结果表明菌株ZF128与贝莱斯芽孢杆菌聚类在同一分支，鉴定其为贝莱斯芽孢杆菌，与菌株ZF128距离最近的菌株为贝莱斯芽孢杆菌LS69(图2)。

5、菌株ZF128的保藏

本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ZF128，已于2019年04月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101)，保藏编号为CGMCCNo.17633。贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ZF128简称为贝莱斯芽孢杆菌ZF128。

实施例2、贝莱斯芽孢杆菌ZF128抑菌谱测定

一、真菌抑菌谱测定

按照实施例1步骤二中的方法检测贝莱斯芽孢杆菌ZF128对尖孢镰孢菌、茄链格孢菌、多主棒孢菌、辣椒疫霉菌、炭疽菌的抑制率。

二、细菌抑菌谱测定

采用双层培养法测定贝莱斯芽孢杆菌ZF128对病原细菌(密执安棒形杆菌密执安亚种、丁香假单胞番茄致病变种、野油菜黄单胞野油菜变种、丁香假单胞流泪致病变种或密执安棒形杆菌环腐亚种)的拮抗活性。

具体方法如下：

将5μL浓度为1×10⁸cfu·mL^-1的贝莱斯芽孢杆菌ZF128菌悬液接种在PDA平板中央，28℃下培养24h后加入3mL氯仿熏蒸灭活，作为下层产素层。将100μL OD₆₀₀＝0.8病原细菌菌悬液均匀混入5mLWA培养基中，倒入PDA平板，作为上层。28℃培养48h后测量抑菌直径，计算抑菌率，每个处理重复3次。抑菌率(％)＝抑菌直径/对照菌落直径×100。

上述实验结果如图6和表3所示。结果显示，贝莱斯芽孢杆菌ZF128对5种病原真菌都表现出拮抗活性，对尖孢镰孢菌、茄链格孢菌、多主棒孢菌、辣椒疫霉菌、炭疽菌的抑制率均在55％以上，其中对茄链格孢菌抑制效果最好，抑制率达63.45％。贝莱斯芽孢杆菌ZF128对病原细菌也有很好的抑制效果，对丁香假单胞番茄致病变种、密执安棒形杆菌密执安亚种、野油菜黄单胞野油菜变种和密执安棒形杆菌环腐亚种抑菌直径在1.58-2.53cm之间，抑制率在19.45％-32.01％之间，对丁香假单胞流泪致病变种抑制效果最好，抑制率可达53.05％。

表3贝莱斯芽孢杆菌ZF128对病原菌拮抗试验

注：数据为平均值±标准误，不同小字母表示0.05水平上差异显著。

实施例3、贝莱斯芽孢杆菌ZF128不同培养基发酵液对马铃薯枯萎病菌生长的抑制效果

1、将贝莱斯芽孢杆菌ZF128接种于LB液体培养基中，28℃、180rpm恒温振荡培养24h得到种子液。

2、将步骤1制备得到的种子液(浓度为1×10⁸cfu·mL^-1)按照1:20(体积比)的比例转接于100mL培养基中，28℃、180rpm恒温振荡培养168h。

所述培养基为甘露醇、玉米粉+鱼粉、黄豆粉、豆粕粉、棉籽饼粉或玉米粉。

甘露醇培养基：甘露醇20g，棉籽饼粉5g，CaCl₂1g，K₂HPO₄1 g，蒸馏水1000ml，pH6.0。

玉米粉+鱼粉培养基：玉米粉25g，鱼骨粉5g，蔗糖1g，蛋白胨1.5g，MgSO₄0.25g，K₂HPO₄1 g，蒸馏水1000ml。

黄豆粉培养基：黄豆饼粉30g，蛋白胨2g，KH₂PO₄0.2 g，CaCO₃1 g，葡萄糖5g，酵母粉3g，蒸馏水1000ml。

豆粕粉培养基：豆粕粉80g，麦芽糖15g，KH₂PO₄6 g，蒸馏水1000ml。

棉籽饼粉培养基：棉籽饼粉32.5g，玉米粉14g，麸皮12g，KH₂PO₄1.1 g，FeSO₄0.049g，蒸馏水1000ml。

玉米粉培养基：玉米粉500g，蒸馏水1000ml。

棉籽饼粉(发酵专用)：北京索莱宝科技有限公司，货号：FA0250。

玉米粉(发酵专用)：北京索莱宝科技有限公司，货号：FA0320。

鱼骨粉(发酵专用)：北京索莱宝科技有限公司，货号：FA0080。

黄豆饼粉(发酵专用)：北京索莱宝科技有限公司，货号：FA0160。

豆粕粉(发酵专用)：北京索莱宝科技有限公司，货号：FA0040。

麸皮：北京索莱宝科技有限公司，货号：FA0360。

3、完成步骤2后，将发酵体系10000rpm离心15min，取上清液。将上清液通过0.22μm的滤芯过滤。

4、完成步骤3后，将上清液按照不同比例加至20mL PDA培养基中，使上清液的终浓度分别为1％，5％，10％(体积百分比)，并以不加发酵液的PDA平板接菌作为对照，每处理设置3个重复。在平板中央接种尖孢镰孢菌5mm菌饼，28℃培养5d，测量菌落生长直径和菌落形态。

结果如图3所示。结果显示，与对照平板相比，添加发酵液的平板上尖孢镰孢菌生长受到抑制，添加比例越大，菌丝受到抑制的程度越大。6种类型培养基中，玉米粉+鱼粉培养基发酵滤液以3种不同比例添加后对尖孢镰孢菌的抑制效果不明显，抑制率均在20％以下，而甘露醇培养基发酵滤液以3种不同比例添加后对尖孢镰孢菌具有显著的抑制效果，抑制率均在35％以上。对尖孢镰孢菌抑制率最大的处理为以10％比例添加甘露醇培养基发酵液，抑制率为60.65％。

实施例4、贝莱斯芽孢杆菌ZF128对马铃薯枯萎病防效测定

1、挑取贝莱斯芽孢杆菌ZF128单菌落接种于LB培养基中，28℃下振荡培养至浓度为1×10⁸cfu·mL^-1。

2、将尖孢镰孢菌菌饼接种于PD培养基，28℃、180rpm振荡培养7d，过滤除去菌丝后，通过血球计数板稀释孢子悬浮液浓度为10⁶cfu·mL^-1。

3、选取生长至4-5片复叶的费乌瑞它马铃薯植株，用无菌水清洗根茎部，针刺茎基部后置于步骤2制备的菌悬液中浸根30min，然后移栽于拌有生防菌(贝莱斯芽孢杆菌ZF128)的基质中，贝莱斯芽孢杆菌ZF128菌液浓度为1×10⁸cfu·mL^-1，每1kg基质对应100mL生防菌菌悬液。用50％多菌灵可湿性粉剂(四川润尔科技有限公司，登记证号：PD85150-35)1500倍液为药剂对照，只接种病原菌为阳性对照。待阳性对照表现出明显枯萎病症状时，进行调查，统计植株发病情况，计算病情指数与防治效果。病情指数＝100×∑(各级病株数×相对级数值)/(调查总株数×9)。相对防效(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100。

结果如图7和表4所示。结果显示，贝莱斯芽孢杆菌ZF128对马铃薯枯萎病有良好的防治效果。只接种马铃薯枯萎病菌的马铃薯病情指数为95，接种菌株ZF128的马铃薯植株病情指数为16.67，相比只接种马铃薯枯萎病菌的对照试验组，病情指数下降78.33。从防治效果来看，菌株ZF128对马铃薯枯萎病菌的相对防效达82.46％，显著高于多菌灵对马铃薯枯萎病42.98％的防效。

表4贝莱斯芽孢杆菌ZF128对马铃薯枯萎病的防治效果

注：数据为平均值±标准误，不同小字母表示0.05水平上差异显著。

实施例5、贝莱斯芽孢杆菌ZF128^rif+在马铃薯根部及根际土壤定殖动态研究

一、抗利福平标记菌株的筛选

采用抗生素驯化法对菌株贝莱斯芽孢杆菌进行利福平抗性驯化，连续继代至菌株在含有50ng·μL^-1利福平LB平板上能稳定生长，菌落形态与野生型保持一致，菌株编号记为ZF128^rif+。

二、菌株ZF128^rif+接种

将带芽费乌瑞它马铃薯块茎播种于育苗钵(10×10cm)中，于温室中培养，生长至主茎5片叶备用。将驯化菌株ZF128^rif+接种于含利福平抗性LB培养基(终浓度为50ng·μL^-1)中，28℃、180rpm振荡培养约24h，至菌悬液浓度为1×10⁸cfu·mL^-1备用。采用灌根法对马铃薯进行接种，将培养好的ZF128^rif+菌悬液均匀浇灌于马铃薯植株根围，每株20mL，共浇灌20株。

三、菌株定殖动态测定

参照文献(汪腾,段雅婕,刘兵团,等.两株香蕉枯萎病拮抗菌在香蕉体内的定殖[J].基因组学与应用生物学,2011,30(03):342-350.)中记载的方法，分别对接种后第1、2、3、4、5、6、7、10、15、30天马铃薯根际及根部进行ZF128^rif+菌株的回收。

土壤样品每次称取1g，溶于9mL无菌水中，充分混匀后进行梯度稀释，分别吸取100μL稀释倍数10^-3、10^-4、10^-5的悬浮液涂布于含终浓度50ng·μL^-1利福平的LB平板，28℃培养24h后进行菌落计数，并计算每g土壤中的菌落数(cfu·g^-1)。

根组织样品每次称取1g，75％乙醇消毒30s，用无菌水清洗3次，将样品剪碎置于灭菌研钵中，加入9mL无菌水研磨，研磨充分进行梯度稀释，分别吸取100μL稀释倍数10^-3、10^-4的稀释液涂布于含终浓度50ng·μL^-1利福平LB平板，28℃培养24h后进行菌落计数，并计算每g根组织中的菌落数。

结果显示，驯化菌株ZF128^rif+灌根接种马铃薯后，从根际土壤和根组织均可回收到目标菌株，并且在含50ng·μL^-1利福平LB平板上培养的菌落与接种菌株菌落形态一致。此外，在根组织回收试验中无菌水对照组在50ng·μL^-1利福平LB平板未长出细菌菌落，综上表明驯化菌株ZF128^rif+可以用于定殖测定。

定殖试验结果表明，ZF128^rif+可以在马铃薯根际土壤和根部有效定殖。在根际土壤中的定殖量呈现逐渐降低的趋势，第1d定殖量最大，可达3.3×10⁶cfu·g^-1，7d后趋于稳定，定殖量为1×10⁵cfu·g^-1(图4)。在根部的定殖量呈现“先增后减”的趋势，第5d达到最大值，定殖量为1.67×10⁴cfu·g^-1，随后逐渐下降，第7d趋于稳定，定殖量为5×10³cfu·g^-1(图5)。接种30d后，仍可检测到一定数量的目标菌株，在根际土壤和根组织定殖量分别为8.8×10⁴cfu·g^-1和5×10³cfu·g^-1，说明贝莱斯芽孢杆菌ZF128能在马铃薯根际土壤及根部稳定定殖，定殖时间长达30d以上。

实施例6、贝莱斯芽孢杆菌ZF128对马铃薯的促生作用

将贝莱斯芽孢杆菌ZF128接种于LB培养基中，28℃、180rpm振荡培养约24h，至菌悬液浓度为1×10⁸cfu·mL^-1备用。采用灌根法对马铃薯进行接种，将培养好的ZF128菌悬液均匀浇灌于马铃薯植株根围，每株20mL，共浇灌20株。以20mL 10μg·mL^-1IAA溶液作为阳性对照，以无菌水处理作为阴性对照，每个处理浇灌5棵苗，并设置3次重复。接种15d后分别测定不同处理马铃薯株高、根长、地上部及地下部鲜重、叶绿素含量等指标，并计算增长率。

10μg·ml^-1IAA溶液：称取0.01g IAA纯品溶于1mL无水乙醇中，混匀后吸取100μL加去离子水稀释至1mL，混匀后再吸取100μL加去离子水稀释至1mL，得100μg·ml^-1IAA母液。IAA母液稀释成10μg·mL^-1溶液备用。

结果如图8和表5所示。结果显示，贝莱斯芽孢杆菌ZF128灌根处理后，对马铃薯具有显著的促生作用，并且促生效果优于IAA纯品的促生效果。贝莱斯芽孢杆菌ZF128处理后的马铃薯株高、根长、地上部鲜重、地下部鲜重及叶绿素含量分别为36.40cm、26.58cm、48.84g、16.32g、46.69，相比无菌水对照分别增加21.54％、28.72％、49.72％、23.17％、22.22％，均达到显著水平(表5)。经IAA纯品处理的马铃薯植株地上部鲜重为40.70g，与无菌水对照相比增加14.29％，达到显著水平，而对株高、根长、地下部鲜重和叶绿素含量虽有一定的增幅，但未达到显著水平。

表5菌株ZF128对马铃薯的促生效果

注：数据为平均值±标准误，不同小字母表示0.05水平上差异显著。

序列表

<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所

<120> 贝莱斯芽孢杆菌ZF128及其在防治马铃薯枯萎病中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1429

<212> DNA

<213> 贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)

<400> 1

gcctatactg gcaagtcgag cggacagatg ggagcttgct ccctgatgtt agcggcggac 60

gggtgagtaa cacgtgggta acctgcctgt aagactggga taactccggg aaaccggggc 120

taataccgga tggttgtctg aaccgcatgg ttcagacata aaaggtggct tcggctacca 180

cttacagatg gacccgcggc gcattagcta gttggtgagg taacggctca ccaaggcgac 240

gatgcgtagc cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac ggcccagact 300

cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac ggagcaacgc 360

cgcgtgagtg atgaaggttt tcggatcgta aagctctgtt gttagggaag aacaagtgcc 420

gttcaaatag ggcggcacct tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc 480

agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga attattgggc gtaaagggct 540

cgcaggcggt ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccccggct caaccgggga gggtcattgg 600

aaactgggga acttgagtgc agaagaggag agtggaattc cacgtgtagc ggtgaaatgc 660

gtagagatgt ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactctc tggtctgtaa ctgacgctga 720

ggagcgaaag cgtggggagc gaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga 780

tgagtgctaa gtgttagggg gtttccgccc cttagtgctg cagctaacgc attaagcact 840

ccgcctgggg agtacggtcg caagactgaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa 900

gcggtggagc atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc 960

ctctgacaat cctagagata ggacgtcccc ttcgggggca gagtgacagg tggtgcatgg 1020

ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttga 1080

tcttagttgc cagcattcag ttgggcactc taaggtgact gccggtgaca aaccggagga 1140

aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa 1200

tggacagaac aaagggcagc gaaaccgcga ggttaagcca atcccacaaa tctgttctca 1260

gttcggatcg cagtctgcaa ctcgactgcg tgaagctgga atcgctagta atcgcggatc 1320

agcatgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accacgagag 1380

tttgtaacac ccgaagtcgg tgaggtaacc tttaggagcc agccgccga 1429

<210> 2

<211> 1692

<212> DNA

<213> 贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)

<400> 2

cttgggtgtg ggaatcgtcg acaacagtat tgacgaagcc ctggccggtt attgtacaga 60

tattaacatc gagattgaaa aagataacag cattaccgtt aaggacaacg ggcgcggaat 120

tccggtcggt atccaggaga agatgggccg ccctgcggtt gaagtcatca tgaccgttct 180

ccacgccggc ggtaaatttg acggaagcgg atataaagta tccggcggtc ttcacggtgt 240

aggggcgtct gtcgtaaacg ccttgtcgac cactcttgac gttacggttc atcgtgacgg 300

aaaaatccac tatcaggcgt acgagcgcgg tgtacctgtg gccgatcttg aagtgatcgg 360

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cgcgactcag ctttgggaaa cgacaatgga ccctgcgacc agaacgcttc tgcaagtcaa 1680

tcttgaagat gc 1692

Claims (9)

1.贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）ZF128，其保藏编号为CGMCC No.17633。

2.菌剂，含有权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）ZF128。

3.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）ZF128的发酵产物；所述发酵产物为菌悬液或菌悬液离心得到的上清液。

4.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）ZF128或权利要求2所述的菌剂或权利要求3所述的发酵产物在如下（a1）或（a2）或（a3）或（a4）中的应用：

（a1）抑制植物病原菌；

（a2）制备用于抑制植物病原菌的产品；

（a3）防治由植物病原菌所致的疾病；

（a4）制备用于防治由植物病原菌所致的疾病的产品；

所述植物病原菌为病原真菌；

所述病原真菌为尖孢镰孢菌（Fusarium oxysporum）、茄链格孢菌（Alternaria solani）、多主棒孢菌（Corynespora cassiicola）、辣椒疫霉菌（phytophthora capsici）或炭疽菌（Colletotrichum spp.）。

5.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）ZF128或权利要求2所述的菌剂或权利要求3所述的发酵产物在如下（b1）或（b2）中的应用：

（b1）防治马铃薯枯萎病；

（b2）制备用于防治马铃薯枯萎病的产品。

6.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）ZF128或权利要求2所述的菌剂或权利要求3所述的发酵产物在如下（c1）或（c2）中的应用：

（c1）促进植物生长发育；所述促进植物生长发育为促进株高增加和/或根长增加和/或地上部鲜重增加和/或地下部鲜重增加和/或叶绿素含量增加；

（c2）制备用于促进植物生长发育的产品。

7.一种防治马铃薯枯萎病的方法，包括如下步骤：将权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）ZF128或权利要求2所述的菌剂或权利要求3所述的发酵产物施于马铃薯根部或根际土壤。

8.一种促进植物生长发育的方法，包括如下步骤：将权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）ZF128或权利要求2所述的菌剂或权利要求3所述的发酵产物施于植物根部或根际土壤；

所述促进植物生长发育为促进株高增加和/或根长增加和/或地上部鲜重增加和/或地下部鲜重增加和/或叶绿素含量增加。

9.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）ZF128在制备权利要求2所述的菌剂或权利要求3所述的发酵产物中的应用。

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