KR100781300B1

KR100781300B1 - 신규한 바실러스속 미생물균주를 이용한 딸기 시들음병방제용 미생물제제 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR100781300B1
Application number: KR1020060020008A
Authority: KR
Inventors: 유성준; 곽두원; 김정선; 김홍기; 장창순; 김남규; 남명현; 이석수; 장원석
Original assignee: (주)바이오쉴드; 유 성 준
Priority date: 2006-03-02
Filing date: 2006-03-02
Publication date: 2007-11-30

Abstract

본 발명은 딸기 시들음병균인 후사리움 옥시스포름 프라가리에(Fusarium oxysporum f. sp. fragariae)를 효과적으로 방제(억제)할 수 있는 바실러스속 미생물 균주를 딸기근권 토양으로부터 분리하고, 이를 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) (균주기탁번호 KACC 91217P)로 명명하고, 딸기 시들음병을 방제하기에 적합한 미생물제제와 그 제조방법에 관한 것이다.

상세하게는 균주의 세포 및 배양액을 화이트카본에 흡착한 후 다양한 부형제를 혼합하여 만든 제제를 딸기에 침지 및 관주 처리하면 딸기 시들음병인 후사리움 옥시스포름 프라가리에(Fusarium oxysporum f. sp. fragariae)를 효과적으로 방제할 수 있으며, 딸기의 생육촉진 및 수확량 증대효과를 볼 수 있다.

본 발명의 신규한 바실러스속 미생물 균주를 이용한 미생물제제는 기존의 화학농약이 가지고 있는 잔류독성, 생태계 파괴 등의 환경적인 문제가 없을 뿐만 아니라, 화학농약과 비슷한 방제가를 얻을 수 있기 때문에 친환경농업을 하는 농가에 유용하게 사용될 수 있다.

미생물제제, 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis), 딸기 시들음병 방제, 생육촉진, 수확량 증대, 친환경농업

Description

신규한 바실러스속 미생물균주를 이용한 딸기 시들음병 방제용 미생물제제 및 그 제조방법{A medication using new Bacillus sp. microbial fungicide for control against Fusarium wilt of strawberry and its preparation process}

도 1은 신규한 바실러스속 미생물제제(상표출원 : 베리메이트)를 처리했을 때의 시들음병 억제를 나타낸 사진,

도 2는 신규한 바실러스속 미생물제제(상표출원 : 베리메이트)를 처리했을 때의 생육촉진효과를 나타낸 사진.

본 발명은 신규한 바실러스속 미생물을 이용한 미생물제제 및 그 제조방법에 관한 것으로서 특히 토양에서 분리한 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)를 배양한 후 제형화하고, 이를 딸기에 처리함으로서 딸기 시들음병을 효과적으로 방제하는 것이다.

딸기 시들음병에 사용되고 있는 살균제는 화학농약으로서 인축에 독성을 나 타낼 뿐만 아니라 생태계의 파괴, 농산물의 잔류독성, 병해충에 대한 약제 저항성 유발 등의 문제점을 갖고 있다. 최근 웰빙시대에 맞춰 소비자들이 저농약 및 무농약 농산물을 선호하고 있으며, 무농약 농산물을 섭취함으로서 아토피 피부염과 같은 각종 알러지 등의 개선 효과가 있는 것으로 나타남에 따라 미생물살균제를 이용한 친환경농업을 추구하는 농가들이 급속히 늘고 있다.

현재 재배되고 있는 딸기(Fragaria × ananassa Duch.)의 국내 생산액은 연간 7,000억원으로 전체 채소생산액의 9%를 차지하는 중요한 작물이다. 2004년도 국내의 딸기 재배면적은 7,600ha, 생산량은 210,000M/T으로 세계 8위를 차지하고 있다(FAO, 2005).

딸기에 발생하는 시들음병균은 Fusarium oxysporum Schlechtend.: Fr. f. sp. fragariae Winks and Williams로 호주에서 최초로 보고되었으며(Winks and Williams, 1965), 국내에서도 조와 문(1984)에 의해 처음 보고된 이래 VCG(Hyun 등, 1996)와 random amplified polymorphic DNA(RAPD) 분석(Hyun 과 Park, 1996) 및 rDNA restriction fragment length polymorphims(RFLPs) 분석을 통한 유전적 다양성이 보고되었다(Nagarajan 등, 2004). 딸기의 각종 병해 발생은 재배양식에 따른 품종과 관련이 깊은데 국내에서는 1970-80년대 'Hokowase' 품종에서 시들음병 발생으로 큰 피해가 있었으나(김 등, 1982; 조와 문, 1984) 그 후 시들음병에 강한 'Nyoho', 'Akihime' 품종의 도입으로 한동안 문제가 되지 않았다. 그러나 최근 국내에서 육종된 ‘매향’ 품종과 일본에서 육종된 ‘Dochiodome' 품종은 시들음병에 감수성으로 재배농가에서 30%의 큰 피해를 나타내고 있다(Nam 등, 2005).

Fusarium병의 발생은 토양환경과 밀접한 관련이 있고, 토마토와 박과의 경우 사양토에서 발생이 심하며(양 등, 2000), 사질토양이 식질 토양에 비해 Fusarium oxysporum의 증식이 용이하다고 한다(Stover, 1956). 또한, 양(2000) 등에 의하면 pH는 관계없고 유기물, 인산, 양이온 함량이 높을 때 발생이 많다고 한다.

딸기 시들음병은 전염원인 후막포자가 토양 속에 생존하여 전염하는 토양전염성병해이며, 또한 이병모주로부터 발생하는 런너를 통해 자묘로 침입하여 발병시키는 영양번식전염도 한다(Matuo 등, 1980). 따라서 토양 병 방제를 위해 토양 훈증이나 약제 살포 방법을 사용할 경우 토양 미생물상의 파괴와 환경에 큰 영향으로 사용이 쉽지 않은 실정이다. 또한 무병묘를 확보하기 위해서는 조직배양을 통한 건전묘 육성이 되어야 하는데 이에 따른 많은 시간과 노력이 투여되어야 하는 문제점이 있다. 시들음병에 대한 생물학적 방제 연구는 오랜 역사를 가지고 있지만 실용화된 방제방법은 효과적이지 않거나, 처리하기 쉽지 않은 문제점이 있다(Alabouvette, 1998). 그러나 환경보존을 위한 관점에서 생물학적 방제연구가 큰 관심을 가지고 진행되고 있다. 그 중 길항 미생물 (Schisler 등, 2002; de Boer 등, 2003), 중복기생균(Moon 등, 1995; Reid 등, 2002), 비병원성 Fusarium균(Tezuka 와 Makino, 1991; Horimoto, 1993; Fravel 등, 2003), vesicular-arbuscular mycorrhizal (VAM) 균(Datnoff 등, 1995)을 이용한 생물학적 방제가 시도되고 있다. 또한 Bacillus spp.균을 이용한 제품들로 B. subtilis QST 713을 이용한 Serenadeⓡ, B. amyloliquefaciens GB 99+B. subtilis GB 122으로 만든 BioYieldⓡ 등이 사용되고 있다(Schisler 등, 2004). 생물학적 방제제의 병 억제기작은 철에 대한 siderophore-mediated competition(Bakker 등, 1988), competition for substrate(Couteaudir와 Alabouvette, 1990), induction of systemic resistance(Leeman 등, 1995; Fuchs 등, 1997; Van Loon 등, 1998), 항생물질 생산(Anjaiah 등, 1998), chitinolytic 효소의 생산(Singh, 등, 1999) 등이 보고 되어 있다.

상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 본 발명의 목적은, 신규한 딸기 시들음병균인 후사리움 옥시스포름 프라가리에(Fusarium oxysporum f. sp. fragariae)에 대한 항진균 활성을 가지며, 딸기생육촉진 및 수확량 증대 기능을 갖고 있는 신규한 바실러스속 미생물 균주<바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)(기탁번호KACC 91217P)>를 이용하여 환경 친화적인 딸기 시들음병 방제 및 딸기의 생육촉진, 뿌리활착 증대, 수확량 증대 등의 다기능성 미생물제제를 제공함에 그 목적이 있다.

이하에서는 본 발명에 따른 바실러스속 미생물균주를 이용한 딸기 시들음병 방제용 미생물제제 및 그 제조방법의 바람직한 실시예를 첨부된 도면을 참고하여 상세히 설명하기로 한다.

도 1은 신규한 바실러스속 미생물제제(상표출원 : 베리메이트)를 처리했을 때의 시들음병 억제를 나타낸 사진이며, 도 2는 신규한 바실러스속 미생물제제(상표출원 : 베리메이트)를 처리했을 때의 생육촉진효과를 나타낸 사진이다.

실시예 1 : 본 발명 미생물 BS87 의 분리 및 동정

각 지역의 딸기 포장에서 분리한 15종의 미생물을 분리하여 딸기 시들음병균에 대한 길항력 검사 및 딸기 생육촉진 실험을 실시한 결과 1종(BS87)의 미생물이 딸기 시들음병균에 대한 길항력 및 딸기 생육촉진 기능이 우수한 것으로 밝혀졌다. 선발된 BS87 균주에 대한 생리 화학적 특성과 형태학적 특성을 조사한 결과 그람 양성균으로 확인되었다. 생리화학적 분석과 gyra gene sequence 분석을 통하여 최종적으로 선발된 BS87은 Bacillus velezensis와 99% 이상의 상동성을 나타내어 동종으로 분류하였다.

실험예 1 : 유용미생물의 분리

딸기 시들음병균에 대한 길항효과와 딸기 생육촉진효과의 특성을 나타내는 유용미생물을 분리하기 위해 딸기 재배포장의 근권토양으로부터 시료를 수집하였다. 시료채취는 지표면으로부터 15cm 이하까지의 근권에서 했으며, 포장별 수집된 토양은 5mm×5mm채로 걸러 10℃에 보관하면서 실험에 이용하였다.

유용길항미생물을 분리하기 위해 채집한 토양을 멸균수 100mL이 들어있는 삼각플라스크에 20g을 넣은 후 30분간 진탕배양한 후 희석평판법에 의거하여 10^-7까지 희석시킨다. 희석된 액을 딸기 시들음병균을 이용하여 만든 assay plates에 10^-3∼10^-7까지 도말한 후 27℃ incubator에 보관하면서 저지원(inhibition zone)을 형성하는 콜로니(colony)를 우선 선발하였다. 선발된 균들의 콜로니는 순수분리하여 KB broth배지에 진탕배양한 후 -81℃의 deep freezer에 냉동보관하였다.

Table 1. 유용미생물의 딸기 시들음병균에 대한 길항력 검정

균주번호	길항력
균주번호	후사리움 옥시스포름 프라가리에 (Fusarium oxysporum f. sp. fragariae)
BS80	++
BS81	+
BS82	+++
BS83	+
BS84	+
BS85	+++
BS86	+
BS87	+++
BS88	+
BS89	++
BS90	+++
BS91	+
BS92	++
BS93	+++
BS94	+
BS95	+++

※ 길항력( + : 약간, ++ : 우수, +++ : 매우 우수)

실험예 2 : 분리된 유용미생물을 이용한 딸기 생육촉진효과 검정

딸기 시들음병균에 대한 저지원이 매우 우수한 6종의 균을 선발하여 딸기 생육촉진효과를 검정하였다.

선발된 6종의 균을 KB broth 배지에 3일간 진탕배양한 후 균의 농도를 10⁸으로 맞추었다. 농도가 균등해진 6종의 균 배양액을 1,000배 희석한 후 딸기 유묘에 10분간 침지한 후 정식하였다. 정식 후 10일 간격으로 2회, 1,000배 희석한 균 배양액을 딸기 유묘 1주당 100mL씩 각각 관주하였다. 최종 30일 후에 딸기묘의 초장, 생체중, 뿌리길이, 뿌리무게를 측정하였다.

6종의 균 중에서 딸기의 초장, 생체중, 뿌리길이, 뿌리무게에 모두 뛰어난 증가효과를 나타내는 BS87균주를 최종적으로 선발하였다.

Table 2. 유용미생물의 딸기 생육촉진효과 검정

처리	초장(cm)	생체중(g)	뿌리길이(cm)	뿌리무게(g)
BS82	23.57b	19.53c	16.10bc	7.00bc
BS85	23.37b	18.37c	15.00cd	6.80bc
BS87	26.93a	27.13a	19.33a	8.57a
BS90	21.43c	19.87c	17.67ab	7.30ab
BS93	20.67c	15.30d	14.07d	5.60c
BS95	23.43b	24.50b	14.57cd	6.63bc
무처리구	21.97c	18.70c	15.50cd	6.70bc

In a colum, means followed by a common letter are not significantly different at the 5% level by DMRT

실험예 3 : 본 발명에 따른 미생물 BS87의 동정

Bergey의 시스테믹 박테리올로지 메뉴얼을 이용해 생리화학적 분석과 광학현미경을 이용한 형태적 관찰로 동정하였고, 또한 정확한 동정을 위해 gyra gene sequence 분석을 실시하였다. 그 결과 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) 표준균주와 99.36%로 가장 높은 nucleotide sequence similarity를 보였기 때문에, 선발된 본 발명 미생물(BS87)은 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)로 동정하였다.

Table 3. 본 발명에 따른 미생물 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)의 생리·생화학적 특성과 형태학적 특성

특성	유용미생물 BS87
그람반응(Gram reaction)	+
액체배지에서 운동성	+
NA, YDC or NBY, KBA에서 노란 균총 형성	-
형광색소	-
젤라틴 분해	+
혐기배양	-
가지(rod) 형성	-
60℃ 또는 고열에서 생장	+
배양초기 Rod 형태	+
내생포자 형성	+

Table 4. 본 발명에 따른 미생물 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)의 결정된 16S r RNA gene 염기서열

① 결정된 염기서열의 개수 : 596bp.

② 결정된 염기서열:

Fig. 2 16S r RNA gene 염기서열 분석을 통한 본 발명에 따른 미생물 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis)의 계통도

실시예 2 : 본 발명 미생물 BS87 의 제제화

미생물제제의 가장 큰 특징은 살아있는 미생물을 이용하는 것이다. 따라서 제형화시 미생물에 영향이 없어야 하며, 장기간 보관 시 다른 균에 의한 오염이 없으면서, 미생물의 농도 및 활성을 그대로 유지할 수 있도록 하여야 하며, 소비자가 사용하기 편리하도록 만들어져야 한다. 이러한 제반요인을 만족시키기 위해 여러 가지 부형제들을 포함하여 다음과 같은 타입의 제형을 개발하였다.

성분 : 화이트카본, 유안, 분당, 마그네슘, 칼슘, 망간, 몰리브덴, 붕소, 아연, 미생물균체 및 그 배양액

위에 나열한 각각의 성분들을 일정비율로 혼합하였으며, 유용미생물 농도를 10⁷cfu/g 이상의 제형으로 완성하였다.

Fig. 3 제형화 2년경과 후의 미생물 활성 검증

실시예 3 : 본 발명에 따른 미생물( BS87 )을 이용한 미생물제제의 딸기 시들음병 방제효과

실험예 1 : 본 발명 미생물(BS87)을 이용한 미생물제제의 포장실험 1 (딸기품종 : 매향)

본 발명은 딸기 시들음병을 방제할 수 있는 선발된 길항미생물 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) BS87균주를 이용하여 제제화하고, 이 제제화된 시작품을 딸기 재배 시 처리함으로서 화학농약에 비슷하거나 높은 방제효과를 얻어 친환경 딸기를 생산하는 데 있다.

완성된 제제를 이용하여, 육묘포장에서 매향품종을 시험품종으로 시들음병 방제효과를 조사하였다. 1,000배 희석한 제제를 10일 간격으로 3회 관주(100ml/딸기 1주) 후 한 달 후에 이병주율을 조사하였으며 대조약제로 쿠퍼수화제<copper hydroxide(77%)>를 공시하였다.

Table 5. BS87 균을 이용한 미생물제제(상표출원 : 베리메이트)의 딸기 시들음병 방제 효과

(논산 딸기시험장 시험자료 인용)

처 리	이병과율(%)	방제가(%)
베리메이트(BS87)♣	3.2	72.6
쿠퍼수화제♧	3.7	68.4
무처리구	11.7

♣ 베리메이트-정식 후 10일 간격으로 3회 관주(100mL/주) 처리

♧ 쿠퍼수화제-정식 후 10일 간격으로 3회 관주(100mL/주) 처리

BS87 균을 이용한 미생물제제의 경우, 대조약제인 쿠퍼수화제보다 좋은 72.6%의 방제가를 나타내었으며, 이는 딸기 시들음병에 공시된 화학농약을 대체할 수 있는 결과라 할 수 있다.

실험예 2 : 본 발명에 따른 미생물(BS87)을 이용한 미생물제제의 포장실험 2 (딸기품종 : 도치오도메)

딸기하우수 포장에서 도치오도메 품종을 시험품종으로 시들음병 방제효과를 조사하였다. 1,000배 희석한 제제를 정식전 유묘 30분 침지 후 7일 간격으로 관주 2회 처리한 처리구(침지+관주2회)와 7일 간격으로 관주(100ml/1주) 3회를 처리한 처리구(관주3회)로 나누어 실험하였으며, 최종 약제처리 66일 후에 이병주율을 조사하였으며, 대조약제로 쿠퍼수화제<copper hydroxide(77%)>를 공시하였다.

Table 6. BS87 균을 이용한 미생물제제(상표출원 : 베리메이트)의 딸기 시들음병 방제 효과

(충남대 농업과학연구소 시험자료 인용)

시 험 약 제	이병과율(%)	방제가(%)
베리메이트(BS87) 침지+관주(2회)	5.8	69.8
베리메이트(BS87) 관주(3회)	7.5	60.1
쿠퍼수화제(BS87) 관주(3회)	5.0	73.9
무처리구	19.2

베리메이트 침지+관주(2회)= 유묘 침지처리 후 정식, 7일 간격으로 2회 관주 (100mL/주) 처리

베리메이트 관주(3회)= 정식 후 7일 간격으로 3회 관주(100mL/주) 처리

쿠퍼수화제= 정식 후 7일 간격으로 3회 관주(100mL/주) 처리

BS87 균을 이용한 미생물제제의 경우, 침지+관주(2회) 처리구가 대조약제인 쿠퍼수화제와 비슷한 69.8%의 방제가를 나타내었으며, 관주(3회) 처리구는 미생물제제로서는 다소 높은 60.1%의 방제가를 나타내었다. 생물학적 방제제로서 69.8%의 병 방제가는 화학농약과 별 차이가 없는 수준이다. 일반적인 생물학적 방제제의 방제가는 40∼60%정도이면 우수한 방제효과가 있다고 말하고 있는 현실적인 시점에서, BS87 균을 이용한 미생물제제의 경우 딸기 시들음병 방제에 실용가능성이 매우 큰 것이며, 특히 제조단가 대비 방제가가 우수하므로 저렴한 비용으로 방제가가 매우 우수한 제품을 만들 수 있게 된다.

실험예 2 : 본 발명에 따른 미생물(BS87)을 이용한 미생물제제의 약해시험 (딸기품종 : 도치오도메)

딸기하우수 포장에서 도치오도메 품종을 시험품종으로 BS87균을 이용한 미생물제제의 약해시험을 실시하였다. 본 발명에 따른 미생물을 이용한 미생물제제를 침지 및 관주처리 방식으로 기준량과 배량으로 처리한 후 최종 약제처리 7일, 30일, 80일 후에 딸기의 외관상 나타나는 약해 유무를 달관 조사하였다.

Table 7. BS87 균을 이용한 미생물제제(상표출원 : 베리메이트)의 약해시험 결과

(충남대 농업과학연구소 시험자료 인용)

시 험 약 제	시험작물(품종)	약해정도(0∼5)		비고
시 험 약 제	시험작물(품종)	기준량	배량	비고
베리메이트(BS87) 침지	딸기(도치오도메)	0	0	약해없음
베리메이트(BS87) 관주	딸기(도치오도메)	0	0	약해없음

BS87 균을 이용한 미생물제제의 약해시험 결과, 기준량 및 배량 처리 시 모두 약해 증상이 없었다. 화학농약의 경우 배량을 처리할 경우 약해가 발생하거나, 잔류성분이 많아져 환경오염 및 인체에 유해 할 수 있으나, BS87 균을 이용한 미생물제제의 경우 그러한 문제점이 없기 때문에 안전한 농산물 생산을 가능하게 함으로서 농가의 소득증대 및 수입농산물에 대한 경쟁력을 높일 수 있게 된다.

실시예 4 : 본 발명에 따른 미생물( BS87 )을 이용한 미생물제제의 딸기 생육촉진 및 수량증대효과 검증

"매향" 품종을 공시하여 2004년 10월 27일 정식 후 촉성으로 재배하였다. 본 발명에 따른 미생물(BS87)을 이용한 미생물제제의 처리는 2005년 1월 8일부터 10일 간격으로 3회 관주 처리 후 2월 11일에 초장, 생체 중, 뿌리길이, 뿌리무게를 조사하였고 수량은 2005년 3월 22일부터 5월 15일 까지 3∼5일 간격으로 조사하였다. 시험구 배치는 난괴법 3반복으로 실시하였다.

Table 7. BS87 균을 이용한 미생물제제(상표출원 : 베리메이트) 처리 후 딸기의 생육촉진효과 검증 결과(2004∼2005년)

처리	초장(cm)	생체중(g)	뿌리길이(cm)	뿌리무게(g)
베리메이트(BS87)	28.6	31.1	19.4	11.9
무처리구	24.4	20.1	17.7	7.1

BS87 균을 이용한 미생물제제 처리구가 무처리구보다 딸기의 초장, 생체중, 뿌리길이, 뿌리무게에서 각각 16.0%, 35.4%, 8.7%, 40.3%의 높은 생육촉진효과를 나타낸다.

Table 8. BS87 균을 이용한 미생물제제(상표출원 : 베리메이트) 처리 후 딸기 상품수량에 미치는 영향(2004∼2005년)

처리	생산량(kg/10a)
처리	1화방 수량	2화방 수량	합계(1화방+2화방)
BS87	983.9	362.7	1,346.6
RK1	539.9	236.6	776.5
무처리구	403.7	279.8	683.5

BS87 균을 이용한 미생물제제 처리구가 무처리구에 비해 딸기의 1화방 수량에서는 2배 이상의 높은 생산량 증대효과를 나타냈고, 2화방 수량에서는 1.29배의 생산량 증수효과를 나타낸다.

이상에서 상세히 설명한 바와 같이 본 발명에 따른 신규한 바실러스속 미생물균주<바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) BS87>을 이용한 딸기 시들음병 방제용 미생물제제는 딸기 시들음병균인 후사리움 옥시스포름 프라가리에(Fusarium oxysporum f. sp . fragariae)를 효과적으로 방제할 수 있을 뿐만 아니라 딸기의 생육촉진 및 수확량 증대효과가 있다.

또한, 안전한 농산물을 생산가능하게 함으로서, 농가의 소득증대 및 수입농산물에 대한 경쟁력, 소비자의 욕구충족을 가져올 수 있고, 화학농약의 사용을 절감하거나, 대체할 수 있기 때문에 환경오염 방지 등의 효과가 있다.

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Claims

딸기 시들음병균인 후사리움 옥시스포름 프라가리에(Fusarium oxysporum f. sp . fragariae)를 효과적으로 방제할 수 있는 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) BS87(균주기탁번호 KACC 91217P).
바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) BS87(균주기탁번호 KACC 91217P)인 미생물은, 딸기 시들음병 방제용 미생물제제 또는 생육촉진 미생물제제의 유효성분으로 함유되는 것을 특징으로 하는 딸기 시들음병 방제용 미생물제제.
바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) BS87(균주기탁번호 KACC 91217P)인 미생물을 통상의 부형제에 혼합하여 미생물제제로 제조하는 것을 특징으로 하는 딸기 시들음병 방제용 미생물제제의 제조방법.