CN115786212B - 一株苍术根腐病生防促生菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
一株苍术根腐病生防促生菌及其应用，涉及微生物领域，尤其涉及一株苍术根腐病生防促生及其应用。是要解决现有防治苍术根腐病的化学方法对环境及人体造成伤害的问题。该菌株为贝莱斯芽孢杆菌CJ8，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期是2022年12月8日，保藏编号为CCTCC M 20221897。该菌株能够对苍术根腐病致病菌尖孢镰刀菌产生拮抗效果。可促进苍术地上部生长、地下部生长，同时能够提高苍术植株内叶绿素含量、IAA含量及全氮磷钾含量。本发明用于防治苍术根腐病，促进苍术生长。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，尤其涉及一株苍术根腐病生防促生菌及其应用。
背景技术
苍术(Atractylodes chinensis)作为东北著名道地药材之一，由于对其野生资源的掠夺和生态环境的破坏，导致苍术野生资源已濒临灭绝。为了解决苍术资源短缺的问题，大量人工栽培出现。但由于苍术的营养规律与特点较为突出，长期连续栽培后常常会导致一系列土壤病害以及品质下降，最终导致产量降低等问题。
目前对苍术根腐病的防治主要以农药为主，对苍术促生以施加化肥为主，但农药化肥会对环境及人体造成伤害。苍术根腐病生物防治中，在微生物菌剂的利用方面稍有欠缺，开发相应的生防促生微生物菌剂能够迎合绿色环保可持续的农业生态理念。
发明内容
本发明是要解决现有防治苍术根腐病的化学方法对环境及人体造成伤害的问题，提供一株苍术根腐病生防促生菌及其应用。
本发明提供一株苍术根腐病生防促生菌，它为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)CJ8，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期是2022年12月8日，保藏编号为CCTCC M 20221897。
本发明贝莱斯芽孢杆菌CJ8为革兰氏阳性菌，菌落颜色为淡黄色，菌落表面有褶皱，可生长于LB培养基中，生长较为迅速。
将本发明贝莱斯芽孢杆菌CJ8的16S rDNA测序结果提交至NCBI数据库，通过Blast分析与基因库中序列进行同源性比对，与贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)的同源性最高达99％，通过结合菌体形态特征、生长条件等鉴定结果确定，本发明的菌株CJ8为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。
本发明提供贝莱斯芽孢杆菌CJ8在防治苍术根腐病中的应用。
进一步的，所述贝莱斯芽孢杆菌CJ8通过抑制尖孢镰刀菌来防治苍术根腐病。
本发明还提供贝莱斯芽孢杆菌CJ8在促进苍术生长中的应用。
进一步的，所述贝莱斯芽孢杆菌CJ8促进苍术产生叶绿素、IAA和全氮磷钾。
进一步的，所述苍术为北苍术。
本发明的有益效果：
本发明贝莱斯芽孢杆菌CJ8在LB培养基中12小时即可长出菌落，并对苍术根腐病致病菌尖孢镰刀菌产生拮抗效果。而且贝莱斯芽孢杆菌CJ8对苍术生长过程、叶绿素、IAA及全氮磷钾含量具有影响，可促进苍术地上部生长、地下部生长，同时能够提高苍术植株内叶绿素含量、IAA含量及全氮磷钾含量。
本发明利用高效微生物对苍术根腐病进行防治；且在抑制根腐致病菌尖孢镰刀菌生长同时能够促进苍术产生叶绿素、IAA及全氮磷钾，促进植被生长。
附图说明
图1为贝莱斯芽孢杆菌CJ8在LB平板上的形态图；
图2为贝莱斯芽孢杆菌CJ8的系统进化树；
图3为贝莱斯芽孢杆菌CJ8与根腐病致病菌的拮抗效果；
图4为接种贝莱斯芽孢杆菌CJ8后苍术生长状况；
图5为接种贝莱斯芽孢杆菌CJ8后苍术的茎长；
图6为接种贝莱斯芽孢杆菌CJ8后苍术的根粗量；
图7为接种贝莱斯芽孢杆菌CJ8后苍术的IAA含量；
图8为接种贝莱斯芽孢杆菌CJ8后苍术的叶绿素含量；
图9为接种贝莱斯芽孢杆菌CJ8后苍术全氮含量；
图10为接种贝莱斯芽孢杆菌CJ8后苍术全磷含量；
图11为接种贝莱斯芽孢杆菌CJ8后苍术全钾含量。
具体实施方式
下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：
本实施例苍术根腐病生防促生菌，它为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CJ8，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期是2022年12月8日，保藏编号为CCTCC M 20221897。
本实施例贝莱斯芽孢杆菌CJ8的获取方法为：
初筛：选取吉林省通化市(125.20°E,41.47°N)苍术根际土壤样本，将土壤样本于2021年10月收集，采用稀释平板涂布法，从土壤样品中称取10g于90ml无菌水中，120rpm离心30min后静置，取上清进行10倍浓度梯度稀释。分别取10-4、10-5、10-6和10-7浓度的稀释液各100μL，每个梯度涂布3个LB培养基(胰蛋白胨10g，NaCl 10g，酵母粉5g,琼脂18g，蒸馏水1L)平板上，倒置于37℃培养箱中培养1天后，观察菌落的生长情况。
LB培养基：NaCl 10g，胰蛋白胨10g，酵母粉5g，琼脂18g，蒸馏水1L，121℃高压蒸汽灭菌30min。每个9cm×9cm平板倒入约20ml培养基。
复筛：在LB培养基上，将40多株生长较快但形态、颜色等不同的菌落分别挑选出来，进行纯培养，直至菌落单一，筛选出菌株。将菌株逐一与根腐病病原菌进行拮抗实验筛选出13株有效接抗菌后，进行盆栽促生实验，施加菌剂，最后获得生长量最高的苍术植株，即分离筛选得到菌株CJ8。
实施例2：菌株CJ8的鉴定
根据《常用细菌系统鉴定手册》对菌株CJ8进行生理生化鉴定。菌株CJ8为革兰氏阳性菌，菌落颜色为淡黄色，菌落表面有褶皱，可生长于LB培养基中，生长较为迅速。菌株CJ8在LB平板上的形态图如图1所示。
菌株CJ8的分子鉴定：
利用基因组提取试剂盒(FastDNASpin Kit for Soil)提取菌株CJ8的基因组，选择16SrRNA基因的V3-V4区域进行检测(引物的序列分别为341F5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’和785R 5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)反应体系25μL，Premix version 2.0 12.5μL，27F(10nM)1μL，1492R(10nM)1μL，DNA模板1μL，无菌水补足至25μL。反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，55℃退火50s，72℃延伸90s，25个循环；72℃终延伸5min。PCR扩增后，产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检验，有明显的特征条带。将PCR扩增产物送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，所得序列上传到NCBI。通过Blast分析与基因库中序列进行同源性比对，并用MEGA5.1软件中Neihbor-Joinhing构建系统发育进化树，如图2所示。菌株CJ8与贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)的同源性最高，达99％，通过结合菌体形态特征、生长条件等鉴定结果确定，菌株CJ8为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CJ8，并将菌株CJ8序列提交到GenBank数据库中，获得基因登录号OP854769。
实施例3：贝莱斯芽孢杆菌CJ8防治苍术根腐病
将根腐病原菌以菌饼形式置于装有PDA培养基的培养皿正中央，四周间隔20mm接种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CJ8，进行对峙实验。另作、只接种根腐病原菌的培养皿为对照，培养7天后观察抑菌效果。所示根腐病原菌为尖孢镰刀菌。
PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1L，琼脂粉18g。
贝莱斯芽孢杆菌CJ8与根腐病致病菌的拮抗效果如图3所示。
实验结果表明：贝莱斯芽孢杆菌CJ8对苍术根腐病致病菌尖孢镰刀菌的抑制率高达80.07％。说明贝莱斯芽孢杆菌CJ8能有效抑制苍术根腐病致病菌尖孢镰刀菌的生长。
实施例4：贝莱斯芽孢杆菌CJ8促进苍术生长
选择同一块区域种植、生长发育相同的苍术幼苗，移植到花盆中，通过灌根方式施加木霉，定植2个月后，施加尖孢镰刀菌。8天后测定植物的生长指标和生理生化指标。
将苍术从花盆中取出，用直尺测量地上部长度。
植物全氮及全磷采用连续流动分析仪进行测定，全钾采用电感耦合等离子体发射光谱进行测定。
叶绿素的测定采用乙醇提取法，每片叶去掉粗大的叶脉并剪成碎片，分别称取0.2g用于95％乙醇研磨法和浸泡法提取叶绿素，以提取试剂95％乙醇为对照，分别测定649nm、665nm处的吸光度并计算叶绿素浓度，然后换算成鲜重的叶绿素含量(mg/g FW)。
Ca＝13.95D665－6.88D649；
Cb＝24.96D649－7.32D665；
CT＝Ca+Cb
Ca：叶绿素a的含量；Cb：叶绿素b的含量；CT：总叶绿素的含量。
植物IAA的测定采用螯合法：
(1)IAA标准溶液：准确称取IAA10mg，先用少量乙醇溶解，后用蒸馏水定容至100mL(其浓度为100μg/mL)作为贮备液；然后用贮备液配成0(空白)、0.5、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0μg/mL的系列浓度标准溶液，作为工作液(现用现配)。
(2)试剂A：内含0.5mol/LFeCl3溶液15mL，浓H2SO4 300mL，蒸馏水500mL，于使用前混合摇匀，避光保存，1mL试液需加此试剂4mL。
(3)试剂B：内含0.5mol/LFeCl3溶液10mL，35％HClO4 500mL，于使用前混合摇匀，避光保存，1mL试液应加此试剂2mL。试剂A与试剂B可任选一种(试剂B比试剂A灵敏)。
取干净的大试管8支(标注0～7号)，依次加人IAA标准溶液2ml，然后分别加入4mL试剂B(或8mL试剂A)，于40℃温箱中暗保温30min(加速显色反应)；于530nm下比色，以吸光度A值为纵坐标，以IAA浓度(μg/mL)为横坐标，绘出一条标准曲线。
将风干的苍术叶片磨成细粉；称取粉末0.5g装人烧杯，加入0.1mol/L NaOH溶液40mL，于100℃水浴中煮沸15min(上面加盖防止水分蒸于)；取出烧杯后再向其中加人0.1mol/L NaOH溶液25mL，充分摇匀，用甲醇定容至100mL，静置30min，取上层液离心30min，上清液即为IAA提取液。
取干净的大试管2支，依次各加入2mL上述样品IAA提取液和4mL试剂B(或8mL试剂A)，于40℃温箱中显色30min，在530nm下比色(以标准曲线的“0”调零)，记录A值。
样品吲哚乙酸含量(μg/g)＝CVT/W
C：一标准曲线上查得的IAA浓度，μg/mL；
VT：样品提取液总体积，mL；
W：样品重量，g。
接种贝莱斯芽孢杆菌CJ8后，苍术生长状况如图4、图5所示，结果表明：与对照相比，贝莱斯芽孢杆菌CJ8的施用显著提高了苍术地上部分30.73％。说明贝莱斯芽孢杆菌CJ8能够有效促进苍术地上部分生长。
接种贝莱斯芽孢杆菌CJ8后苍术根粗量如图6所示，结果表明：与对照相比，贝莱斯芽孢杆菌CJ8的施用显著提高了苍术根粗46.76％。说明贝莱斯芽孢杆菌CJ8能够有效促进苍术地下部分生长。
接种贝莱斯芽孢杆菌CJ8后苍术IAA含量如图7所示，叶绿素含量如图8所示，结果表明：与对照相比，贝莱斯芽孢杆菌CJ8的施用显著提高了苍术植株内IAA含量19.67％，提高了苍术植株内叶绿素含量54.40％，说明贝莱斯芽孢杆菌CJ8能够有效提高苍术植株内促生长素的积累和光合作用的加强。
接种贝莱斯芽孢杆菌CJ8后苍术全氮磷钾含量如图9-11所示，结果表明：与对照相比，贝莱斯芽孢杆菌CJ8的施用显著提高了苍术植株内总氮、总磷和总钾含量分别为9.82％、18.53％和25.60％，说明贝莱斯芽孢杆菌CJ8能够有效提高苍术植株内总氮、总磷和总钾等植物养分的积累。
Claims (6)
1.一株苍术根腐病生防促生菌，其特征在于该苍术根腐病生防促生菌为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）CJ8，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期是2022年12月8日，保藏编号为CCTCC NO: M 20221897 。
2.如权利要求1中所述的贝莱斯芽孢杆菌CJ8在防治苍术根腐病中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述贝莱斯芽孢杆菌CJ8通过抑制尖孢镰刀菌来防治苍术根腐病。
4.如权利要求1中所述的贝莱斯芽孢杆菌CJ8在促进苍术生长中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述贝莱斯芽孢杆菌CJ8促进苍术产生叶绿素、IAA和全氮磷钾。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于所述苍术为北苍术。
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-
2022
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| Title |
|---|
| Isolation and Identification of Biocontrol Bacteria against Atractylodes Chinensis Root Rot and Their Effects;Shouyang Luo 等;《Microorganisms》;第1-18页 * |
| 北苍术根腐病病原菌分离鉴定及其生防菌筛选;李超楠 等;《农业环境科学学报》;第2824-2830页 * |
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