CN108676758B - 一种巨大芽孢杆菌bm22及其液体制剂的制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种巨大芽孢杆菌BM22及其液体制剂的制备和应用，该菌株已经于2017年12月15日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.15070。以巨大芽孢杆菌BM22为菌种，经种子培养、发酵培养可制备得到液体制剂。本发明提供的巨大芽孢杆菌BM22对厚朴根腐病和立枯病有特效，且具有抗逆性，贮藏性好，抗高温、低温、耐干燥，适宜于商品化生产，不仅能避免化学药物所造成的污染环境的严重后果，而且具有可持续、成本低的特点。

Description

一种巨大芽孢杆菌BM22及其液体制剂的制备和应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一种巨大芽孢杆菌，具体涉及一种巨大芽孢杆菌BM22菌株及其液体制剂和在厚朴根腐病和立枯病防治上的应用。

背景技术

厚朴为木兰科木兰属植物，主产湖北和四川，又称为紫油厚朴、川朴，在浙江、安徽、福建、甘肃、贵州、云南等省也有分布，多栽种于海拔800-1700m左右的山区。厚朴是我国特有的传统中药，常以树皮、根皮、枝皮入药，4～6月剥取根皮及枝皮直接阴干，干皮置沸水中微煮后堆置阴湿处，“发汗”至内表面皮紫褐色或棕褐色时，蒸软取出，卷成筒状，干燥。切丝，姜制用。对食积气滞、腹胀便秘、湿阻中焦等疾病有治疗作用。还能加入癌症药物中。厚朴是国家Ⅱ级重点保护野生植物，属于渐危种。

厚朴苗期易发生根腐病和立枯病，根腐病危害树根及茎干和树枝，发病初期由树根、支根变褐、腐烂逐渐向主根蔓延，最后导致全根腐烂，根茎生暗黑斑纹，地上茎叶自下向上枯萎，最终全株死亡。拔出病株可见主根上部和根茎地下部呈黑色，病部凹陷，维管束呈褐色。立枯病多发生在育苗的中后期，主要危害幼苗茎基部或地下根部，初为椭圆形或不规则暗褐色病斑，病苗萎蔫，病部凹陷溢缩，有的渐变为黑褐色，当病斑扩大绕茎一周时即干枯死亡，但不倒伏。目前生产中主要通过营林措施清除病源来进行防治，一般以化学农药、化学肥料为主，但由于长时期施用化学农药(肥料)易污染环境，破坏生态，病害综合防治措施的探讨还有待开展。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术在防治厚朴根腐病和立枯病中的缺陷，提供了巨大芽孢杆菌BM22及其液体制剂在防治厚朴根腐病和立枯病中的应用。

本发明具体通过以下技术方案实现：

本发明的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)BM22菌株于2017年6月15日采用平板稀释涂布法分离于四川大邑仰天窝药场健康杜仲叶片，已经于2017年12月15日保藏于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.15070。

本发明巨大芽孢杆菌BM22在NA平板培养基上培养了2d的单菌落呈乳白色，圆形，表面粗糙，边缘波纹状，不透明，无粘性。

本发明巨大芽孢杆菌BM22的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明以巨大芽孢杆菌BM22为活性成分的液体制剂，由巨大芽孢杆菌BM22为菌种，经种子培养、发酵培养得到液体制剂。

本发明所述的以巨大芽孢杆菌BM22为菌种的液体制剂中含活芽孢数不低于1×10⁹cfu/g。

本发明所述的以巨大芽孢杆菌BM22为菌种的液体制剂通过以下方法制备：

1)一级斜面种子：制作牛肉膏蛋白胨斜面培养基，接种巨大芽孢杆菌BM22后，培养制成一级种子；

2)二级液体种子：营养肉质培养液经高压灭菌后，在通氧控制下盛于三角瓶，在无菌状态接种巨大芽孢杆菌BM22斜面种子，振荡培养，制成巨大芽孢杆菌BM22液体种子；

3)液体发酵：营养肉质培养液经高压灭菌后，在通氧控制下盛于三角瓶，在无菌状态接种巨大芽孢杆菌液体种子，接种量为液体总体积的15％，振荡培养，制成巨大芽孢杆菌BM22液体制剂，然后保存。

所述的牛肉膏蛋白胨斜面培养基的成分为：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 3.5g，琼脂18g，水1000mL。

所述的营养肉质培养液的成分为：牛肉膏7g，蛋白胨10g，NaCl5g，厚朴根皮浸渍液1000mL。

上述制备方法得到的以巨大芽孢杆菌BM22活性成分的液体制剂也在本发明保护的范围之内。

发明所述的巨大芽孢杆菌BM22在防治厚朴根腐病和立枯病中的应用。

本发明所述的巨大芽孢杆菌BM22液体制剂在防治厚朴根腐病和立枯病中的应用，在苗期或植物生长过程中进行喷雾或灌根施用。

所述的液体制剂在治疗厚朴根腐病和立枯病中的应用，其液体制剂稀释液为将液体制剂制成浓度为1×10⁹cfu/mL，然后再稀释施用。

当然，本发明所述的巨大芽孢杆菌BM22的菌悬液或次级代谢产物在作为制备防治厚朴根腐病和立枯病药物中的应用也在本发明的保护范围内。

本发明巨大芽孢杆菌BM22防治厚朴根腐病和立枯病的方法也属于本发明的保护范围，该方法是在厚朴苗期或生长过程中进行喷雾或灌根施用；所述制剂为该巨大芽孢杆菌BM22的菌悬液或发酵液或代谢产物或制剂。

本发明的有益效果为：

本发明提供的巨大芽孢杆菌BM22对厚朴根腐病和立枯病有特效，经试验显示对厚朴根腐菌和立枯菌的抑制率达到98.17％和96.63％，将该巨大芽孢杆菌BM22制成液体制剂，同样表现有良好的防治效果，适宜于商品化生产，不仅能避免化学药物所造成的污染环境的严重后果，且具有抗逆性，贮藏性好，抗高温、低温、耐干燥的特点，同时符合国家可持续发展的战略，相比化学药物还具有成本低的特点，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1是本发明巨大芽孢杆菌BM22rDNA-ITS序列PCR扩增产物电泳图；

图2是基于16S rDNA序列构建的菌株BM22的系统发育树。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明技术方案作进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与改型，均落在本发明的保护范围内。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1巨大芽孢杆菌BM22的分离与鉴定

1.1内生细菌的分离、纯化与保存

在四川大邑仰天窝药场杜仲黑斑病发生区取健康杜仲叶片。采回的样本用无菌水冲洗干净，称取1.0g组织，在70％的酒精中浸泡1-2min，再用1-3％次氯酸钠溶液消毒3-5min，无菌水洗涤若干遍后，吸取最后一次洗涤液100μL涂抹NA平板(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂粉15-20g，蒸馏水1000mL，pH 7.0，混匀分装后121℃高压灭菌30min)，27℃黑暗培养24h，用于表面消毒的对照，检查表面消毒是否彻底。

将已表面消毒的树皮组织剪碎，放入无菌的研钵，加入灭菌的石英砂和10mL无菌水，充分研磨，静置30min，稀释10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5共5个梯度，分别吸取100μL 10^-3，10^-4，10^-5这3个梯度研磨液分别涂布NA平板(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂粉15-20g，蒸馏水1000mL，pH 7.0，混匀分装后121℃高压灭菌30min)，每个处理3次重复，27℃培养48h，挑取菌落形态差异明显的单菌落进入初筛。

依据菌落的大小、颜色、是否突起，边缘特征、表面光滑与否、透明度等方面的差异，挑取单菌落在NA平板上划线纯化，纯化后转接NA斜面于4℃保藏备用。共获36个内生细菌。

1.2内生细菌对厚朴根腐病菌和立枯病菌的平板拮抗作用

平板对峙法：在培养皿中央接种7d的厚朴根腐菌(Fusarium oxysporum)和厚朴立枯病菌(Rhizoctonia solani)菌饼(直径6mm)，离该病菌饼约3cm处，分别用接种环沾取培养2d的内生菌，在病菌对称两侧各划一条细线，28℃培养，以只接种病菌的平板为对照，待对照长满皿时测量病菌的菌落生长直径，每处理重复3次。按下式计算菌落生长抑制率：

菌落生长抑制率＝(对照菌落净生长直径－处理菌落净生长直径)/对照菌落净生长直径×100％。

表1是32株内生细菌中对厚朴根腐菌(Fusarium oxysporum)和厚朴立枯病菌(Rhizoctonia solani)有较好拮抗作用的菌株，其中BM22对两种病原均表现良好拮抗效果，抑制率分别达到98.17％和96.63％。

表1内生细菌对厚朴根腐病菌和立枯病菌的拮抗作用(7d)

1.3内生拮抗菌的种类鉴定

经形态学观察，结合生理生化指标(表2)和分子生物学鉴定该内生菌BM22为巨大芽孢杆菌。

表2菌株BM22生理生化指标

在NA平板培养基上培养了2d的BM22菌株的单菌落乳白色，圆形，表面粗糙，边缘波纹状，不透明，无粘性。

分子生物学鉴定(16S rDNA)：通过提取细菌DNA进行PCR扩增及电泳，回收产物送至生物技术公司测序；将所测序列与GenBank数据库中已经报道的序列进行同源性BLAST分析，并用Clustalx(1.83)软件进行多重序列比较，再用Mega4.0软件中的邻接法构建系统发育树，确定BM22菌株在微生物系统发育学上的地位。分子生物学鉴定得到长度为949bp的DNA片段(图1)，将BM22菌株的16S rDNA序列递交GenBank数据库进行BLAST分析，选取其中与之同源性较高的细菌16S rDNA序列，并用Clustalx软件进行多重匹配排列分析，用Mega分析软件构建系统发育树(图2)。可以看出，BM22菌株与JX286698以99％的16SrRNA基因核苷酸序列相似性和较高的自展值支持聚为1个分支，而与其他芽孢杆菌相距较远，表明BM22与Bacillus megaterium的亲缘关系最近。

基于以上特征，上述BM22菌株其分类命名为巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)BM22，已于2017年12月15日保存在中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15070。

实施例2巨大芽孢杆菌BM22液体制剂的制备

根据实施例1得到的巨大芽孢杆菌BM22，经过种子培养、发酵培养制成液体制剂，具体通过以下方法：

常规方法制作牛肉膏蛋白胨斜面培养基(牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 3.5g，琼脂18g，水1000mL)，接种巨大芽孢杆菌后，培养制成一级种子。

营养肉质培养液(牛肉膏7g，蛋白胨10g，NaCl 5g，厚朴根皮浸渍液1000mL)经高压灭菌后，在通氧控制下，按100mL液体盛于300mL三角瓶比例装瓶，在无菌状态接种巨大芽孢杆菌斜面种子，每瓶接种2支斜面种子，振荡培养，制成巨大芽孢杆菌液体种子。其中将10g厚朴根皮在1000mL水中煮沸10分钟，过滤，得到的滤液为厚朴嫩枝浸渍液。

营养肉质培养液(牛肉膏7.0g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000mL)经高压灭菌后，按100mL液体盛于300mL三角瓶比例(通氧控制)装瓶，在无菌状态接种BM22液体种子，接种量为液体总体积的15％，温度28℃，初始pH值7.0，120r/min振荡培养48h，制成BM22菌剂。

制剂保存：瓶装制剂常温保存1年或低温(4℃)2年不影响预防和治疗效果。

通过上述方法制备得到的以巨大芽孢杆菌BM22为菌种的液体制剂中含活芽孢数不低于1×10⁹cfu/g。

该菌剂在使用时液体制剂稀释液对苗木喷雾或灌根。

实施例3巨大芽孢杆菌BM22液体制剂喷雾法防治试验

在厚朴根腐病和立枯病发生苗圃中，按照病害发生症状分为根腐病发生区和立枯病发生区(I：5-10％；II：11-30％；III：31-60％)。在3-4月，用实施例2制得的菌剂采用喷雾法分浓度：原液、稀释50倍、稀释100倍、稀释200倍、稀释500倍、稀释1000倍、稀释2000倍对厚朴苗木进行处理，沿根茎均匀喷雾，每株50mL，并以无菌水作对照，重复3次，统计厚朴发病情况。每处理厚朴苗10株。

处理后15d，按照表3、表4中病害分级标准进行病害调查统计，并计算防治效果。

表3厚朴根腐病病害分级标准

表4厚朴立枯病病病害分级标准

发病率(％)＝发病株数/总株数×100；

病情指数＝[Σ(病级枝条数×代表级数)/(总枝条数×发病最高代表级数)]×100；

防治效果(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100。

表5是BM22内生细菌在喷雾试验15d后的防治效果，生防菌BM22原液和稀释液对厚朴根腐病和立枯病均表现出良好的防治效果。BM22发酵原液在三种发生区内的防治效果超过80％，厚朴根腐菌和立枯菌的生长、繁殖受到抑制，可基本上控制病害蔓延。BM22原液经稀释后，防治效果随稀释倍数的增加而降低表现出不同的防治效果，稀释1000倍时三个区域防效差异较大，轻度发生在55％以上。总的来看，病害发生在10％以下1000倍液为经济浓度，30％以下500倍液为经济浓度，超过30％200倍液为经济浓度。

表5 BM22喷雾试验15d后的防治效果

实施例4巨大芽孢杆菌BM22液体制剂灌根法防治试验

在厚朴根腐病和立枯病发生苗圃中，按照病害发生症状分为根腐病发生区和立枯病发生区(I：5-10％；II：11-30％；III：31-60％)。在3-4月，用实施例2制得的菌剂采用灌根法分浓度：原液、稀释50倍、稀释100倍、稀释200倍、稀释500倍、稀释1000倍、稀释2000倍对厚朴苗木进行处理，沿根茎灌根施用，每株50mL，并以无菌水作对照，重复3次，统计厚朴发病情况。每处理厚朴苗10株。

处理后15d，按照上述公式统计发病情况、计算防治效果。

表6是BM22内生细菌在灌根试验15d后的防治效果，生防菌BM22原液和稀释液(50-500倍)对厚朴根腐病和立枯病均表现出良好的防治效果。灌根法比喷雾法各处理防效稍好，原液最高防效可达98.1％和97.5％。从浓度看，2000倍液效果在10％以上发生区效果较不理想，200倍液各区域两种病害防效均高于55％。综合成本因素，与喷雾法相似，病害发生在10％以下1000倍液为经济浓度，30％以下500倍液为经济浓度，超过30％200倍液为经济浓度。

表6 BM22灌根试验15d后的防治效果

总的来看，本发明分离得到的巨大芽孢杆菌BM22菌株对厚朴根病有特效，对环境适宜性强、亲和性好，适于商品化生产，符合可持续发展的战略要求，具有广阔的市场前景。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种巨大芽孢杆菌BM22及其液体制剂的制备和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 949

<212> DNA

<213> 巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)

<400> 1

caggctgcgg ggctatacat gcagtcgagc gaactgatta gaagcttgct tctatgacgt 60

tagcggcgga cgggtgagta acacgtgggc aacctgcctg taagactggg ataacttcgg 120

gaaaccgaag ctaataccgg ataggatctt ctccttcatg ggagatgatt gaaagatggt 180

ttcggctatc acttacagat gggcccgcgg tgcattagct agttggtgag gtaacggctc 240

accaaggcaa cgatgcatag ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca 300

cggcccagac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga 360

cggagcaacg ccgcgtgagt gatgaaggct ttcgggtcgt aaaactctgt tgttagggaa 420

gaacaagtac gagagtaact gctcgtacct tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta 480

actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc gttatccgga attattgggc 540

gtaaagcgcg cgcaggcggt ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccacggct caaccgtgga 600

gggtcattgg aaactgggga acttgagtgc agaagagaaa agcggaattc cacgtgtagc 660

ggtgaaatgc gtagagatgt ggaggaacac cagtggcgaa ggcggctttt tggtctgtaa 720

ctgacgctga ggcgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg 780

ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttagagg gtttccgccc tttagtgctg cagctaacgc 840

attaagcact ccgcctgggg agtacggtcg caagactgaa actcaaagga attgacgggg 900

gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca acgcgaaga 949

Claims (4)

1.一种巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）BM22在防治厚朴根腐病和立枯病中的应用，其特征在于，所述的巨大芽孢杆菌BM22已于2017年12月15日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.15070。

2.以保藏编号CGMCC No.15070的巨大芽孢杆菌BM22为活性成分的液体制剂在防治厚朴根腐病和立枯病中的应用，其特征在于，在苗期或植物生长过程中进行喷雾或灌根施用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的以巨大芽孢杆菌BM22为活性成分的液体制剂的制备方法，包括以下步骤：

1）一级斜面种子：制作牛肉膏蛋白胨斜面培养基，接种巨大芽孢杆菌BM22后，培养制成一级斜面种子；

2）二级液体种子：营养肉质培养液经高压灭菌后，在通氧控制下盛于三角瓶，在无菌状态接种一级斜面种子，振荡培养，制成巨大芽孢杆菌BM22液体种子；所述的营养肉质培养液的成分为：牛肉膏7 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，厚朴根皮浸渍液1000 mL；

3）液体发酵：营养肉质培养液经高压灭菌后，在通氧控制下盛于三角瓶，在无菌状态接种巨大芽孢杆菌BM22液体种子，接种量为液体总体积的15%，振荡培养，制成以巨大芽孢杆菌BM22为活性成分的液体制剂，然后保存。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的牛肉膏蛋白胨斜面培养基的成分为：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 3.5 g，琼脂18 g，水1000 mL。

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