CN115029269A - 一种产脂肽类抗菌素的梨火疫病菌拮抗细菌及其发酵方法和应用 - Google Patents
一种产脂肽类抗菌素的梨火疫病菌拮抗细菌及其发酵方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种产脂肽类抗菌素的梨火疫病菌拮抗细菌及其发酵方法和应用，属于农业微生物技术领域。该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，分类命名为贝莱斯芽孢杆菌，保藏编号为CGMCC No.24843。该菌株产生的脂肽类抗菌素对梨火疫病菌具有显著拮抗作用和优良的防病效果，对高温、酸碱、蛋白酶、紫外线有一定耐受性，且生长繁殖速度快、竞争能力强，可廉价生产，具有良好的开发应用前景。本发明还公开了一种提高该菌株产生脂肽类抗菌素的发酵方法，该方法成本低廉、操作简便，同时能够提高在梨火疫病生物防治中的效果，为该菌株工业化发酵生产和梨火疫病生物农药的研发提供了理论基础和技术参考。
Description
技术领域
本发明涉及农业微生物技术领域，特别是涉及一种产脂肽类抗菌素的梨火疫病菌拮抗细菌及其发酵方法和应用。
背景技术
梨火疫病(Erwinia amylovora)是严重危害梨、苹果、山楂、海棠等蔷薇科仁果类果树生产的毁灭性细菌病害，被我国列为一类农作物病害和农业植物检疫性有害生物。该病害1780年首次发生于美国纽约州，现已扩散传播到60多个国家和地区。目前梨火疫病缺乏特效的药剂和单一的防治措施，防治难度大，至今仍然在多个国家持续发生和流行，安全防控是一个世界性的难题。目前使用化学药剂是梨火疫病最为普遍的防治手段。农用链霉素曾被认为是梨火疫病防治的最佳药剂，但它的频繁、大量和持续使用造成病原菌抗药性不断增强、防效下降；同时农用链霉素存在通过食物链在人体中富集的风险和环境污染等一系列问题，我国已于2016年6月停止了登记，2018年4月已全部退出农药市场，目前还没有更好的替代药剂。筛选和研发出新型的安全、高效的防病药剂，采取有力的措施阻断病害的传播扩散是保障林果产业发展的重大需求。
发掘对病原菌具有抑菌作用的有益微生物，利用其活体及其抑菌物质研制成生物农药是植物病害防治的发展方向。优良的菌剂产品不仅能达到优于或相当于化学农药的良好防效，还具有选择性强、不易产生抗药性，安全高效、环境友好等突出优势。近年来国外在梨火疫病的生物防治的相关研究和应用方面取得了一定的进展。已有不少报道从植物叶片、花、土壤中分离筛选出对梨火疫病菌具有拮抗作用的菌株，在防效测定中表现出较好的防病效果。如Atur Mikicnski(2012)等报道从苹果叶际中分离得到一株具有拮抗火疫病菌的49M细菌菌株，喷施后对花和果实的保护效果显著；Vanderzwet T&Zoller B G(1988)从梨树花和叶分离的内生细菌中筛选出E.h.89菌株，对花期病害的的相对控制率接近70％。美国研发的荧光假单胞Pseudomonas fluorescens A506、草生欧文氏菌Erwiniaherbicola C9-1等商品菌剂已进入实际应用，达到了与农用链霉素相近的防治效果，显示出良好的应用前景，成为该病害综合防治措施的切实可行的重要组成部分。研究发现，梨火疫病生防细菌的主要作用机制是通过代谢产生各种抑菌物质，以及与病原菌的位点和营养竞争等。生防细菌能合成多种具有抑菌活性的次生代谢产物，主要包括：脂肽类、多肽和聚酮化合物及细菌素、细胞壁降解酶和一些未知的抗菌蛋白等，对多种植物病原菌产生抑制作用。利用微生物次生代谢物开发生物农药，可实现规模化生产，耐贮性好，功效稳定的突出优势，能克服以微生物活体为主要成分的生物农药在菌体定殖、贮藏时间和施用效果易受环境条件的影响，产品质量稳定性不佳、防效不理想等方面的弊端。脂肽类抗菌素主要包括表面活性素(surfactin)、伊枯草菌素(iturins)和芬芥素(fengycin)3大家族，其理化性质稳定，具有广谱的抗菌、抗病毒、高效、安全无毒、不易产生耐药性等优点。因此脂肽类生物农药在农业和生物制药领域备受青睐，尤其在植物病害生物防治中具有广泛的研究价值和应用前景。发酵是微生物农药产业化的基础，优化拮抗菌培养条件是其增加产量，提高抑菌能力和防病效果的重要途径。不同的拮抗菌株产生的抑菌物质种类不同，其产量、活性与培养基和发酵条件密切相关。
国内对梨火疫病的生物防治所开展的工作极为有限，尚处在起步研究阶段。徐琳赟等(2021)报道了从香梨树内生细菌筛选出对杜梨苗梨火疫病具有一定防病效果的3个拮抗菌株TN50、HN89和SN37，分别鉴定为克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)，类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp.)和假单胞杆菌属(Pseudomonas sp.)。鲁宴宏等(2021)从土壤细菌中筛选获得11株具有拮抗作用的菌株，采用杜梨苗灌根试验测定了对梨火疫病菌根部侵染杜梨苗的防病效果。目前针对梨火疫病菌的生防菌株种类很少，环境适应性欠佳，防效不理想，至今还没有专用的生物防治产品。针对当前生产中梨火疫病生物防治专用产品匮乏的瓶颈问题，筛选和发掘微生物生防资源，立足于本地微生物资源的发掘和利用，筛选出胞外代谢产物中抑菌物质稳定、抗菌活性高，防病效果好的优良菌株，优化其发酵条件，提高菌株产抑菌物质的产量和抑菌活性及活菌含量，为研发高效生防菌剂，遏制梨火疫病蔓延扩散，保障林果产业的健康生产提供基础和支持。
发明内容
本发明的目的是提供一种产脂肽类抗菌素的梨火疫病菌拮抗细菌及其发酵方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题。该菌株产生的脂肽类抗菌素抗逆性强，对梨火疫病菌具有显著抑制作用，可用于研发防治梨火疫病的生防菌剂，为保障林果产业的健康生产提供基础和支持。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种产脂肽类抗菌素的梨火疫病菌拮抗细菌FX1，该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，分类命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)，保藏编号为CGMCC No.24843，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2022年05月06日。
本发明还提供一种根据上述的梨火疫病菌拮抗细菌FX1的发酵方法，包括将活化的梨火疫病菌拮抗细菌FX1接种到发酵培养基中发酵培养获得其发酵液的步骤；其中，所述发酵培养基的碳源为玉米淀粉，氮源为酵母膏，无机盐为KH2PO4和MnSO4，所述发酵培养的条件：在pH为7.0-7.5、转速为150r/min和温度为30-31℃条件下发酵48h。
进一步地，所述发酵培养基包括以下组分：玉米淀粉10g、酵母膏25-25.127g、KH2PO40.5g、MnSO40.001g和水1000mL。
进一步地，所述活化的梨火疫病菌拮抗细菌FX1的接种量为3％v/v。
进一步地，还包括将获得的发酵液于4℃，12000r/min离心30min后过滤，获得无菌发酵液的步骤。
进一步地，将所述无菌发酵液调pH至2.0后，静置离心，收集沉淀，之后用甲醇抽提，进行真空干燥，获得脂肽类抗菌素。
进一步地，所述静置条件为4℃下12h；所述离心为4℃下，转速为12000r/min，时间为30min。
本发明还提供一种根据上述的梨火疫病菌拮抗细菌FX1或上述发酵液或上述无菌发酵液或上述脂肽类抗菌素在防治果树梨火疫病中的应用。
进一步地，所述果树为蔷薇科仁果类果树，包括梨树、苹果、山楂和海棠树。
本发明还提供一种防治果树梨火疫病的生物制剂，其包括上述的梨火疫病菌拮抗细菌FX1或上述发酵液或上述无菌发酵液或上述脂肽类抗菌素。
本发明公开了以下技术效果：
本发明从香葱酵素液中分离获得的一株梨火疫病菌拮抗菌株贝莱斯芽孢杆菌FX1菌株，其产生的脂肽类抑菌素对梨火疫病菌具有显著拮抗作用和优良的防病效果。该脂肽类抑菌物质对高温、酸碱度和紫外线及蛋白酶具有较好的耐受性，并且具有生长繁殖速度快、竞争能力强，可廉价生产的特性，具有良好的开发应用前景。本发明还提供了提高该菌株产脂肽类抑菌物质抗菌活性和发酵液活菌浓度的发酵方法，该方法成本低廉、操作简便，同时能提高在梨火疫病生物防治中的效果，为研发高效生防菌剂，遏制梨火疫病蔓延扩散，保障林果产业的健康生产提供理论基础和技术参考。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为FX1菌株脂肽类及蛋白类抑菌物质合成相关基因扩增检测结果；M：DNAMarker 2000；1：fenD基因；2：bmyB基因；3：ituC基因；4：yndJ基因；5：bioA基因；6：srfAA基因；7：srfAB基因；8：yngG基因；9：TasA基因；
图2为FX1菌株产脂肽类抗菌素对温度、pH值、紫外线和蛋白酶的耐受性；A：温度；B：紫外线；C：pH；D：蛋白酶；
图3为不同培养基对FX1菌株活菌数及抑菌活性的影响；
图4为碳源及碳源浓度对FX1菌株活菌数及抑菌活性的影响；1：蔗糖CK；2：麦芽糖；3：玉米淀粉；4：红薯淀粉；5：马铃薯淀粉；6：豌豆淀粉；7：玉米粉；
图5为氮源及最佳氮源浓度对FX1菌株活菌数及抑菌活性的影响；1：CK；2：酵母膏；3：黄豆饼粉；4：葵花饼粉；5：尿素；6：硫酸铵；7：棉籽饼粉；
图6为大量元素无机盐对FX1菌株活菌数及抑菌活性的影响；1：K2HPO4；2：CaCl2；3：KH2PO4；4：MgSO4；
图7为微量元素无机盐对FX1菌株活菌数及抑菌活性的影响；1：MnSO4；2：FeSO4；3：ZnSO4；
图8为不同培养条件对FX菌株活菌数和抑菌活性的影响；a：转速；b：温度；c：培养基的初始pH值；
图9为主效应三因素互作对FX1菌株抑菌活性影响的响应面；a：酵母膏浓度和初始pH互作；b：酵母膏浓度和温度互作；c：初始pH和温度互作。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1梨火疫病菌拮抗细菌的筛选及鉴定
从新疆库尔勒市香梨产区农户采用各种瓜果、蔬菜为原料自制的植物酵素液中分离发酵细菌，以梨火疫病菌(Erwinia amylovora)为靶标病原菌，采用平板对峙法初筛具有抑菌活性的22个菌株。再通过“打孔-抑菌圈法”和“共培养法”复筛出胞外代谢产物具有显著抑菌作用的拮抗菌株。
打孔-抑菌圈法：将E.amylovora菌悬液吸取100μL涂布于NA培养基中，用打孔器在培养基上均匀的打3个孔，分别在孔中加入200μL拮抗菌无菌发酵滤液，以加入无菌水作为对照，每个处理3个重复，28℃培养24h，测量并记录抑菌圈的直径大小。
拮抗菌+梨火疫病菌共培养法：(1)在涂布E.amylovora菌悬液的NA培养基平板上，等距离的3个位点上点接待测拮抗菌，观察拮抗菌菌落生长的速度及菌落大小。(2)分别将梨火疫病菌悬液和待测拮抗菌无菌发酵滤液(体积比1:1)加入三角瓶中共培养，以不加拮抗菌无菌发酵液的梨火疫病菌液为对照，每个处理3个重复，30℃，180r/min培养24h后，测定培养液中病原菌的活菌数(cfu/ml)，计算抑菌率(％)。
活菌浓度(cfu/mL)＝(计数皿的平均菌落数×计数皿的稀释倍数)/接种量
抑菌率(％)＝(对照病原菌活菌数-处理病原菌活菌数)/对照病原菌活菌数×100％
结果如表1所示，22株供试拮抗菌株的无菌发酵液对E.amylovora均有抑菌活性，抑菌圈直径14.10±0.92mm～23.41±0.40mm，拮抗菌无菌发酵液与E.amylovora共培养能显著降低培养液中的菌体浓度(OD600值)和病原菌活菌数(cfu/mL)，无菌发酵液的抑菌率为58.92％～99.99％，抑菌活性最强的是FX1菌株(分离自香葱酵素液)；同时该菌株还具有生长速度快、竞争能力强的优势，在与梨火疫病菌共培养的培养基平板上能在24h迅速覆盖病原菌菌落。该菌株在NA培养基中呈乳白色菌落，不规则形状，表面干燥，菌体杆状、G+，芽孢中央位；对FX1菌株16S rRNA和gyrA基因序列测定，16S rRNA测序结果如下(SEQ ID NO.1)：
AATACATGCAAGTCGAGCGGACAGAATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTCTAGGAGCCAGCCGCCGA；
gyrA基因测序结果如下(SEQ ID NO.2)：
ATGAGCGTTATCGTATCCCGGGCGCTTCCGGATGTGCGTGACGGTCTGAAGCCGGTTCACAGGCGGATTTTGTACGCAATGAATGATTTAGGCATGACCAGTGACAAACCATATAAAAAATCTGCCCGTATCGTCGGTGAAGTTATCGGTAAGTACCACCCGCACGGTGACTCAGCGGTTTACGAATCAATGGTCAGAATGGCGCAGGATTTTAACTACCGCTACATGCTTGTTGACGGACACGGCAACTTCGGTTCGGTTGACGGCGACTCAGCGGCCGCGATGCGTTACACAGAAGCGAGAATGTCAAAAATCGCAATGGAAATCCTCCGGGACATTACGAAAGATACGATTGATTATCAAGATAACTATGACGGCGCAGAAAGAGAACCTGTCGTCATGCCTTCGAGATTTCCGAATCTGCTCGTAAACGGAGCTGCCGGTATTGCGGTCGGAATGGCGACAAATATTCCTCCGCATCAGCTTGGGGAAGTCATTGAAGGCGTGCTTGCCGTAAGTGAGAATCCTGAGATTACAAACCAGGAGCTGATGGAATACATCCCGGGCCCGGATTTTCCGACTGCAGGTCAGATTTTGGGCCGGAGCGGCATCCGCAAGGCATATGAATCCGGACGGGGATCCATTACGATCCGGGCTAAGGCTGAAATCGAAGAGACATCATCGGGAAAAGAAAGAATTATTGTCACAGAACTTCCTTATCAGGTGAACAAAGCGAGATTAATTGAAAAAATCGCAGATCTTGTCCGGGACAAAAAAATCGAAGGAATTACCGATCTGCGTGACGAATCCGACCGTAACGGAATGAGAATCGTCATTGAGATCCGCCGTGACGCCAATGCTCACGTCATTTTGAATAACCTGTACAAACAAACGGCCCTGCAGACGTCTTTCGGAATCAACCTGCTGGCGCTCGTTGACGGACAGCCGAAG。
结合上述形态特征观察、测序结果和系统树发育分析，将其鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。拮抗细菌FX1的分类命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.24843。
表1拮抗菌株除菌发酵滤液对梨火疫病菌的抑菌活性的测定结果
实施例2拮抗细菌FX1抑菌活性物质的提取和相关基因检测
筛选获得的胞外代谢产物对梨火疫病具有强抑菌活性的FX1菌株，采用不同方法提取其无菌发酵液中粗提物，分别测定其对梨火疫病菌的抑菌活性。
FX1无菌发酵滤液的制备：
将FX1菌株在NA培养基上划线活化，用接种环挑取单菌落接种于NB液体培养基中，30℃摇床180r/min振荡培养12-18h作为种子液。以2％的接种量将种子液接种于Landy培养基中，30℃摇床180r/min振荡培养48h至OD6000.8～1.0。将培养液在4℃、12000r/min条件下离心30min去除菌体，上清液用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，得到无菌发酵滤液。
抑菌物质的提取和抑菌活性检测：
分别采用①酸沉淀法提取：将FX1无菌发酵滤液用6mol/LHCl将pH调至2.0，4℃静置沉淀12h后，4℃，12000r/min离心30min，收集沉淀得到脂肽类物质粗提物。②硫酸铵饱和沉淀法：将FX1无菌发酵滤液分别缓慢加入硫酸铵直至饱和，4℃静置12h后，12000r/min，4℃离心30min，收集沉淀得到蛋白类物质粗提物。③正丁醇萃取法：将FX1无菌发酵滤液分别按照1:1的比例加入正丁醇溶剂，静置过夜得到萃取液，旋转蒸发仪浓缩蒸干后，得到正丁醇粗提物。
不同方法提取物的抑菌效果测定：
结果如表2所示。FX1菌株的酸沉淀法获得的粗提液抑菌活性最高，抑菌圈直径为23.20±0.67mm；硫酸铵饱和沉淀法提取的粗提液也具有抑菌活性，平均抑菌圈直径最高为21.33±0.81mm，低于酸沉淀法粗提液的抑菌活性；而正丁醇萃取粗提液未显示出抑菌活性。
表2拮抗菌FX1抑菌物质的不同粗提方法对病原菌的抑菌活性测定结果
拮抗细菌FX1菌株抑菌物质合成相关功能基因的PCR检测
以提取拮抗菌拮抗菌FX1菌株的总DNA为模板，采用8对脂肽类化合物合成相关基因(bmyB、fenD、ituC、srfAA、srfAB、bioA、yngG、yndJ)，及1对抑菌蛋白合成基因(TasA)的特异性引物，进行PCR扩增检测，引物序列及扩增反应条件如表3所示。
表3 9对引物序列及反应条件
检测结果表明(图1)，参与脂肽类物质合成的8个相关基因srfAA、srfAB(表面活性素)、fenD(芬芥素)、ituC(伊枯草菌素)、bmyB(细菌素)、bioA(生物素操纵子)和yngG、yndJ(假定蛋白)，以及1个抑菌蛋白合成相关基因TasA(DNA解旋酶)均能在FX1菌株的基因组中扩增到，表明该菌株具有产生脂肽类抑菌物质和抗菌蛋白的性能。FX1菌株脂肽类及蛋白类抑菌物质测序结果提交GenBank，获得登录号分别为fenD(OM681340)、ItuC(OM719603)、bioA(OM719604)、srfAA(OM719605)、srfAB(OM719606)、yngG(OM719607)、bmyB(OM719608)、yndJ(OM747548)、TasA(OM747549)。
实施例3拮抗细菌FX1菌株所产脂肽类抗菌物质的稳定性检测
脂肽类抗菌物质粗提液的制备：将FX1发酵液于4℃，12000r/min离心30min后，上清液经细菌过滤器(Φ＝0.22μm)过滤得到无菌发酵滤液。用6mol/L HCl将过滤液pH调至2.0，4℃静置沉淀12h后，4℃，12000r/min离心30min，收集沉淀得到脂肽类物质粗提物，再将粗提物溶解于少量甲醇中，调至浓度为5mg/mL的粗提液。
脂肽类抗菌物质的热稳定性、酸碱稳定性、紫外线耐受性和蛋白酶稳定性检测：①热稳定性：将酸沉淀法提取的脂肽类粗提液在30、50、70、90、100℃的金属浴上保温30min，121℃高温灭菌锅中处理30min；②酸碱稳定性：将脂肽类抗菌物质粗提液用1mol/L的HCl溶液和1mol/L的NaOH溶液分别调至pH 3.0～12.0，4℃保存过夜后用相同浓度的NaOH溶液和HCl溶液分别将各粗提液pH调回至7.0；③紫外线耐受性：将脂肽类物质粗提液放置在30W紫外灯下30cm处照射10、20、30、40、50和60min；④蛋白酶稳定性：将脂肽类物质粗提液加入质量浓度1.0mg/ml的蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶，37℃温育3h。将以上处理后的脂肽抑菌物质吸取200μL，采用“打孔-抑菌圈法”测定脂肽类物质粗提液对E.amylovora的抑菌活性，每个处理重复3次，以未处理的脂肽抑菌物质提取物为对照，24h后观察试验结果，记录抑菌圈直径，计算剩余抑菌活性(％)。
剩余抑菌活性(％)＝(处理后的脂肽抗菌素提取液产生的抑菌圈半径/脂肽类抗菌素提取原液的抑菌圈半径)×100。
由图2A可见，FX1菌株所产脂肽类抗菌物质经90℃处理后对梨火疫病菌的剩余抑菌率为57.47％，100℃处理后剩余抑菌率维持在46.83％，说明该抑菌物质能耐受90℃的高温，具较好的热稳定性。图2B可见，FX1菌株所产脂肽类抗菌物质在紫外线照射60min后的剩余抑菌活性能保持65.70％。图2C可见，在pH为3.0～12.0的酸碱条件下，该脂肽类抗菌物质剩余抑菌活性能维持定在70％以上。图2D可见，FX1菌株所产脂肽类抗菌物质经过蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶处理，剩余抑菌活性均能维持在50％以上。结果表明，FX1菌株所产脂肽类抗菌物质对高温、酸碱、紫外线都具有较好的耐受性，对蛋白酶K、胰蛋白酶和胃蛋白酶具有较好的稳定性。
实施例4拮抗细菌FX1菌株产脂肽类抗菌物质的发酵工艺优化
以FX1发酵滤液中脂肽类抑菌物质提取液对梨火疫病的抑菌活性和发酵液活菌浓度为测定指标进行发酵工艺优化筛选。
发酵液活菌浓度测定：采用稀释平板计数法测定不同处理条件下的FX1菌株发酵液中的活菌浓度。将发酵液10倍比稀释，选取合适浓度的稀释液100μL均匀涂布在NA培养基上，30℃培养48h后统计菌落数，计算活菌浓度(cfu/mL)。
抑菌活性测定：(1)将梨火疫病菌在NA培养基平板上活化，挑取单菌落接入NB培养液中，28℃、180r/min振荡培养24h至菌液OD6000.8～1.0，用无菌水稀释至浓度为108cfu/mL的菌悬液，吸取100μL菌悬液均匀涂布在NA培养基平板上。用灭菌打孔器(Φ＝6mm)在制备的梨火疫病菌涂布平板上均匀打三个孔。(2)将不同处理的FX1发酵液按照实施例3中脂肽类抗菌物质粗提液的制备方法提取无菌滤液中的脂肽类抗菌素提取液。在(1)制备的病原菌涂布平板的每孔中加入200μL脂肽类抗菌物质粗提液，以等量的无菌培养液为对照，28℃培养24h后采用十字交叉法测定抑菌圈直径大小。
发酵工艺优化的具体步骤：
FX1菌株发酵液的制备及摇瓶发酵培养：将FX1接种在NA培养基中，28℃培养24h活化，挑取单菌落接种至NB培养基中，28℃，180r/min振荡培养24h至OD600≈0.8～1.0的培养液作为种子液。将种子液以3％的接种量接种于发酵培养基中，28℃、180r/min震荡培养48h。
初始发酵培养基的筛选：将FX1菌株种子液分别接种至候选初始发酵培养基ME-1～ME-4中摇瓶培养，测定、比较不同培养基中的发酵液的活菌浓度和脂肽类物质的抑菌活性，确定初始发酵培养基。各培养基配方组成如表4所示。
表4初始发酵培养基配方
图3结果显示：在候选的4个初始发酵培养基中FX1菌株的生长和抑菌活性有显著差异。在ME-4培养基中生长最好，活菌浓度达4.9×108cfu/mL，抑菌圈直径也达到20mm以上，因此选择ME-4培养基作为初始基础发酵培养基。
单因素筛选发酵培养基碳源、氮源及浓度：以筛选出的ME-4培养基为初始基础培养基，添加等量的不同碳源(麦芽糖、玉米淀粉、红薯淀粉、马铃薯淀粉、豌豆淀粉、玉米粉，培养基中的终含量均为10g/L)和不同氮源(葵花饼粉、棉籽饼粉、黄豆饼粉、酵母膏、尿素和硫酸铵，培养基中的终含量均为10g/L)，分别取代初始培养基中的碳源和氮源，其他成分固定不变，每个处理3次重复。测定FX1活菌浓度，比较脂肽类物质的抑菌活性大小，筛选出最佳碳、氮源。再分别设置1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％的添加量，确定最佳碳源和氮源浓度。
图4结果显示，供试的6种碳源培养基中，选择能提高脂肽类物质抑菌活性最高，且活菌浓度109cfu/mL以上的3号玉米淀粉为最佳碳源(图4左图中1：蔗糖CK；2：麦芽糖；3：玉米淀粉；4：红薯淀粉；5：马铃薯淀粉；6：豌豆淀粉；7：玉米粉)。对玉米淀粉的添加浓度进行优化，当玉米淀粉浓度为1.0％时，抑菌活性最高(抑菌圈直径22.05mm)，超过1.0％玉米淀粉浓度则抑菌活性降低。故选取1.0％玉米淀粉作为FX1菌株产抑菌物质的最佳碳源浓度。
图5结果显示，供试的6种氮源培养基中(1：CK；2：酵母膏；3：黄豆饼粉；4：葵花饼粉；5：尿素；6：硫酸铵；7：棉籽饼粉)，葵花饼粉为氮源的发酵液的活菌浓度最高，但抑菌圈直径显著低于酵母膏氮源培养基，并且葵花饼粉在发酵过程中不溶于培养液；酵母膏虽然活菌浓度略低于葵花饼粉，但抑菌圈直径最大，表明产抑菌物质能力最强，故选择酵母膏为最佳氮源。当酵母膏浓度为2.5％时活菌量(1.4×109cfu/mL)和抑菌圈直径(26.02mm)均最大，故2.5％酵母膏是FX1菌株生长和产抑菌物质的最佳氮源浓度。
单因素筛选发酵培养基无机盐及浓度：在初始培养基中分别加入大量元素无机盐MgSO4、KH2PO4、K2HPO4和CaCl2，设置0.05％、0.10％、0.15％(质量分数)3个浓度梯度。分别加入微量元素无机盐MnSO4、ZnSO4和FeSO4，设置0.0001％，0.0005％和0.0010％(质量分数)3个浓度梯度，其他成分保持不变，每个处理3次重复。摇瓶培养48h后取样，测定FX1活菌浓度和抑菌活性，确定无机盐及浓度。
依据测定结果，选择发酵滤液中脂肽类抗菌物质提取物抑菌活性最高，活菌浓度109cfu/mL以上的0.05％KH2PO4为最佳大量元素无机盐(图6，1：K2HPO4；2：CaCl2；3：KH2PO4；4：MgSO4)；选择无菌发酵滤液中脂肽类抗菌物质提取物抑菌活性最高，且活菌浓度为3.8×108cfu/mL的0.0001％MnSO4为最佳微量无机盐(图7，1：MnSO4；2：FeSO4；3：ZnSO4。)。
单因素优化发酵培养条件：利用筛选出的最佳碳源、氮源、无机盐配制培养基，对菌株FX1的发酵温度、初始pH以及转速进行优化。培养温度设定为：25、28、30、32、34和36℃；转速设置为：120、150、180、210和240r/min；培养基起始pH设置为：6.0、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0。以装液量(100mL/500mL三角瓶)，接种量3.0％(体积分数)、28℃、180r/min震荡培养48h为摇瓶发酵基础条件，每个处理重复3次，优化一个因素时其他条件保持不变。测定活菌浓度和抑菌活性，优化培养条件。
由图8结果所示，筛选出FX1摇瓶发酵活菌浓度最高、脂肽类物质的抑菌活性均最强的培养转速、培养温度和培养基初始pH值为别为150r/min，30℃和pH 7.5。
Plackett-Burman试验设计
对单因素试验结果，每个因素分别选取高水平和低水平(低水平为初始培养条件，高水平为低水平的1.5倍)，利用Design-expert 12.0软件设计次数为N＝12的Plackrtt-Burman试验，对各因素进行主效应分析，确定影响脂肽类物质抑菌活性的主要因素。
选取单因素试验中主要影响FX1菌株抑菌活性的7个因素作为主要效应试验因子，以FX1菌株脂肽类物质的抑菌活性为响应值进行Plackett-Burman试验设计，对主效应因素进行分析(表5)，对FX1产抑菌物质的影响显著值性依次为：温度＞pH＞酵母膏＞玉米淀粉＞转速＞KH2PO4＞MnSO4。确定酵母膏浓度、温度、初始pH作为影响FX1菌株脂肽类物质抑菌活性的高显著因素进行响应面法优化。
表5培养基各因素Plackett-Burman试验结果显著性分析
注：P＜0.01差异极显著，P＜0.05差异显著，P＞0.05差异不显著。
FX1菌株的发酵条件的响应面法优化及模型验证试验：将单因素确定的影响脂肽类物质抑菌活性的主效应因素作为自变量，根据Box-Behnken试验设计，以抑菌圈直径为响应值，利用Design-expert 12.0软件设计3因素3水平的响应面分析试验，进一步对拮抗菌株FX1的发酵条件进行优化。为了明确影响FX1菌株脂肽类物质抑菌活性关键因子的最优浓度范围，以酵母膏浓度、初始pH、温度3个主要效应因素为自变量，选取试验结果中效果最好的试验组，即酵母膏2.5％、pH 7.5、温度30℃进行响应面法优化。以发酵液中脂肽类抗菌素的抑菌活性为响应值(Y1)，采取Design-expert 12.0软件设计3因素3水平的响应面分析试验(表5)。对试验结果进行二次回归方程预测及方差分析(表6)，得到回归方程式：
Y1＝-683.51+8.749A+78.17B+21.68C-0.59AB-0.007AC-0.63BC-0.087A2-3.283B2-0.217C2
表6响应面法试验结果
方差分析该模型的P＜0.05，表明二次回归模型显著；决定系数R2为0.8882表明模型具有较高的相关度，能较好的反应响应值的变化。
根据回归方程得出响应面均为开口向下的三维空间曲面图形(图9，a：酵母膏浓度和初始pH互作；b：酵母膏浓度和温度互作；c：初始pH和温度互作)，表明响应面值存在极高值，最优条件值存在于所设计的因素水平当中，其中酵母膏和温度的交互作用相比其他因素互作作用更为显著。对回归方程求解，得到FX1菌株产脂肽类物质的发酵最佳培养基组成为：酵母膏25.127g/L、初始pH 7.0，温度30.9℃，模型预测FX1抑菌圈直径最大值为27.046mm。
对发酵培养基和培养条件的优化模型进行验证。按照FX1菌株的最佳培养成分及培养条件的3次摇瓶试验，FX1培养活菌数为1.53×109cfu/mL，抑菌圈直径为26.59mm，与预测值的相对误差为1.69％，故拮抗菌FX1模型能够很好的预测实际发酵情况，具有良好的拟合性，证实模型可靠。
优化前后的抑菌活性和活菌浓度比较。在优化后的培养基和培养条件下，FX1菌株摇瓶发酵液活菌浓度达1.53×109cfu/mL，抑菌圈直径为26.59mm。优化前FX1菌株在初始发酵培养基ME-4中的活菌浓度为4.9×108cfu/mL，抑菌圈直径为20.15mm。相比优化前发酵液活菌浓度提高了30.6倍，抑菌圈直径增加了1.32倍。
实施例5拮抗细菌FX1菌株对梨火疫病的防效测定
对香梨梨火疫病的防效
在健康香梨果园采集香梨(Pyrus sinkiangensi)花蕾枝条带回实验室，插入含3％蔗糖溶液的组培瓶中水培。待花苞全部绽放时用手持压力式喷雾器将FX1菌液、除菌发酵滤液、脂肽类抑菌物质粗提液分别喷雾接种香梨花序至全部湿润，每个处理接种50朵花，重复3次，以喷施农用链霉素(华北制药厂生产，有效成分72％)为药剂对照，以喷施无菌培养基为空白对照。将接种后的花序在温度25℃、相对湿度75％的人工气候箱中培养24h后，再喷雾接种梨火疫病菌菌液至香梨花序全部湿润。接种后花序置于温度25℃、相对湿度75％的人工气候箱中培养，3-5d定时观察记录发病情况，统计花腐率，计算防效。
花腐率(％)＝(病花数/总花数)×100％
花腐防效(％)＝(对照花腐率－处理花腐率)/对照花腐率×100％
对香梨花期梨火疫病的防效结果显示(表7)，FX1菌株的发酵液、无菌发酵液和胞外代谢产物中的脂肽类抗菌素对香梨花期的梨火疫病均有较好的保护性防效，其防效依次为：脂肽类抗菌素提取物>无菌发酵滤液>菌体发酵液，其中脂肽类抗菌素的防效与农用链霉素相当，发酵工艺优化后其防效有明显提高。
表7 FX1菌株对香梨梨火疫病花腐的防效
对杜梨苗梨火疫病的防效
⑴保护性防效：以2年生杜梨盆栽苗为接种材料，用手持压力式喷雾器将拮抗菌FX1菌悬液(OD600值为0.8～1.0)、除菌发酵滤液、脂肽类抑菌物质粗提液及其稀释液喷雾接种杜梨苗幼嫩枝条至全部湿润，每个处理喷施10个枝条，重复3次。以喷施农用链霉素(华北制药厂生产，有效成分72％)4000倍液为药剂对照，以喷施无菌水为空白对照。接种后的杜梨苗放入覆盖有塑料薄膜的保湿棚中(温度25-30℃、相对湿度75％以上)，72h后再喷雾接种梨火疫病菌菌液(浓度108CFU·mL-1，接种量100μL·枝条-1)，继续在保湿棚中培养。待发病后掀开塑料膜，每天观察发病情况，记录发病枝条数，计算病情指数，统计防效。
⑵治疗性防效：治疗性试验与保护性试验⑴接种顺序相反，即先在杜梨苗上喷施接种病原菌液72h后,再喷施拮抗菌菌体发酵液、除菌发酵滤液、抑菌物质粗提液及稀释液，培养条件及防效调查方法等均与保护性试验一致。
发病率(％)＝(发病枝条数/接种总枝条数)×100％
病情指数＝∑(各级发病枝条数×病级代表值)/(接种总枝条数×最高级值)×100
枝枯防效(％)＝(对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数×100％
保护性防效试验结果见表8。未接种拮抗菌的对照处理在病原菌接种后第5d开始杜梨苗幼嫩枝条顶端叶片开始发黑，枝条上出现坏死斑并由顶稍向下扩展，而预先喷施FX1菌体发酵液、除菌发酵滤液、脂肽类物质粗提液的处理，能延缓显症时间，明显降低病情指数(P＜0.05)。对杜梨苗7d的保护性防效，FX1菌株发酵液(80.27％)、除菌发酵滤液(81.05％)和脂肽类抗菌素提取液(80.85％)均达到80％以上，与农用链霉素防效接近；7d～15d的平均防效，FX1菌株脂肽类抗菌素提取液(73.64％)、除菌发酵滤液(72.85％)、菌体发酵液原液(71.54％)的防效均在70％以上，脂肽类抗菌素提取液和除菌发酵滤液5倍～100倍的稀释液防效均在50％以上，脂肽类抗菌素提取液的防效更优。
表8 FX1发酵液、除菌发酵液及脂肽类物质粗提液对杜梨苗梨火疫病的保护性防效
注：同列不同小写字母表示不同处理间差异在P＜0.05水平显著。
治疗性防效试验结果见表9。FX1菌株脂肽类抗菌素提液原液7d、7～15d(平均)防效分别为73.53％和61.59％，优于菌体发酵液(70.57％，56.03％)和除菌发酵滤液(60.78％，52.02％)。脂肽类物质粗提液5、10、50和100倍稀释液7d、7～15d(平均)防效均在54.41％和44.76％以上，高于除菌发酵滤液稀释液的防效。
表9 FX1发酵液、除菌发酵液及脂肽类物质粗提液对杜梨苗梨火疫病的治疗性性防效
注：同列不同小写字母表示不同处理间差异在P＜0.05水平显著。
综上，本发明的拮抗细菌FX1菌株的菌体发酵液、除菌发酵液及脂肽类抗菌素提取液及其稀释液对香梨和杜梨的梨火疫病均有较好的防病效果，脂肽类抗菌素提取液的防效最佳。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 新疆农业大学
<120> 一种产脂肽类抗菌素的梨火疫病菌拮抗细菌及其发酵方法和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1427
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aatacatgca agtcgagcgg acagaatggg agcttgctcc ctgatgttag cggcggacgg 60
gtgagtaaca cgtgggtaac ctgcctgtaa gactgggata actccgggaa accggggcta 120
ataccggatg gttgtttgaa ccgcatggtt cagacataaa aggtggcttc ggctaccact 180
tacagatgga cccgcggcgc attagctagt tggtgaggta acggctcacc aaggcgacga 240
tgcgtagccg acctgagagg gtgatcggcc acactgggac tgagacacgg cccagactcc 300
tacgggaggc agcagtaggg aatcttccgc aatggacgaa agtctgacgg agcaacgccg 360
cgtgagtgat gaaggttttc ggatcgtaaa gctctgttgt tagggaagaa caagtgccgt 420
tcaaataggg cggcaccttg acggtaccta accagaaagc cacggctaac tacgtgccag 480
cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tgtccggaat tattgggcgt aaagggctcg 540
caggcggttt cttaagtctg atgtgaaagc ccccggctca accggggagg gtcattggaa 600
actggggaac ttgagtgcag aagaggagag tggaattcca cgtgtagcgg tgaaatgcgt 660
agagatgtgg aggaacacca gtggcgaagg cgactctctg gtctgtaact gacgctgagg 720
agcgaaagcg tggggagcga acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg 780
agtgctaagt gttagggggt ttccgcccct tagtgctgca gctaacgcat taagcactcc 840
gcctggggag tacggtcgca agactgaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc 900
ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatcct 960
ctgacaatcc tagagatagg acgtcccctt cgggggcaga gtgacaggtg gtgcatggtt 1020
gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttgatc 1080
ttagttgcca gcattcagtt gggcactcta aggtgactgc cggtgacaaa ccggaggaag 1140
gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg 1200
gacagaacaa agggcagcga aaccgcgagg ttaagccaat cccacaaatc tgttctcagt 1260
tcggatcgca gtctgcaact cgactgcgtg aagctggaat cgctagtaat cgcggatcag 1320
catgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac cacgagagtt 1380
tgtaacaccc gaagtcggtg aggtaacctc taggagccag ccgccga 1427
<210> 2
<211> 951
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgagcgtta tcgtatcccg ggcgcttccg gatgtgcgtg acggtctgaa gccggttcac 60
aggcggattt tgtacgcaat gaatgattta ggcatgacca gtgacaaacc atataaaaaa 120
tctgcccgta tcgtcggtga agttatcggt aagtaccacc cgcacggtga ctcagcggtt 180
tacgaatcaa tggtcagaat ggcgcaggat tttaactacc gctacatgct tgttgacgga 240
cacggcaact tcggttcggt tgacggcgac tcagcggccg cgatgcgtta cacagaagcg 300
agaatgtcaa aaatcgcaat ggaaatcctc cgggacatta cgaaagatac gattgattat 360
caagataact atgacggcgc agaaagagaa cctgtcgtca tgccttcgag atttccgaat 420
ctgctcgtaa acggagctgc cggtattgcg gtcggaatgg cgacaaatat tcctccgcat 480
cagcttgggg aagtcattga aggcgtgctt gccgtaagtg agaatcctga gattacaaac 540
caggagctga tggaatacat cccgggcccg gattttccga ctgcaggtca gattttgggc 600
cggagcggca tccgcaaggc atatgaatcc ggacggggat ccattacgat ccgggctaag 660
gctgaaatcg aagagacatc atcgggaaaa gaaagaatta ttgtcacaga acttccttat 720
caggtgaaca aagcgagatt aattgaaaaa atcgcagatc ttgtccggga caaaaaaatc 780
gaaggaatta ccgatctgcg tgacgaatcc gaccgtaacg gaatgagaat cgtcattgag 840
atccgccgtg acgccaatgc tcacgtcatt ttgaataacc tgtacaaaca aacggccctg 900
cagacgtctt tcggaatcaa cctgctggcg ctcgttgacg gacagccgaa g 951
Claims (10)
1.一种产脂肽类抗菌素的梨火疫病菌拮抗细菌FX1，其特征在于，该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，分类命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)，保藏编号为CGMCC No.24843，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2022年05月06日。
2.一种根据权利要求1所述的梨火疫病菌拮抗细菌FX1的发酵方法，其特征在于，包括将活化的梨火疫病菌拮抗细菌FX1接种到发酵培养基中发酵培养获得其发酵液的步骤；其中，所述发酵培养基的碳源为玉米淀粉，氮源为酵母膏，无机盐为KH2PO4和MnSO4，所述发酵培养的条件：在pH为7.0-7.5、转速为150r/min和温度为30-31℃条件下发酵48h。
3.根据权利要求2所述的发酵方法，其特征在于，所述发酵培养基包括以下组分：玉米淀粉10g、酵母膏25-25.127g、KH2PO40.5g、MnSO40.001g和水1000mL。
4.根据权利要求2所述的发酵方法，其特征在于，所述活化的梨火疫病菌拮抗细菌FX1的接种量为3％v/v。
5.根据权利要求2所述的发酵方法，其特征在于，还包括将获得的发酵液于4℃，12000r/min离心30min后过滤，获得无菌发酵液的步骤。
6.根据权利要求5所述的发酵方法，其特征在于，将所述无菌发酵液调pH至2.0后，静置离心，收集沉淀，之后用甲醇抽提，进行真空干燥，获得脂肽类抗菌素。
7.根据权利要求6所述的发酵方法，其特征在于，所述静置条件为4℃下12h；所述离心为4℃下，转速为12000r/min，时间为30min。
8.一种根据权利要求1所述的梨火疫病菌拮抗细菌FX1或权利要求2中所述发酵液或权利要求5中所述无菌发酵液或权利要求6中所述脂肽类抗菌素在防治果树梨火疫病中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述果树为蔷薇科仁果类果树，包括梨树、苹果、山楂和海棠树。
10.一种防治果树梨火疫病的生物制剂，其特征在于，其包括权利要求1所述的梨火疫病菌拮抗细菌FX1或权利要求2中所述发酵液或权利要求5中所述无菌发酵液或权利要求6中所述脂肽类抗菌素。
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