CN113151059A - 一株多功能暹罗芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis），保藏号为CGMCC No.19505。本发明所述暹罗芽孢杆菌对茄腐皮镰刀菌引起的根腐病具有很强的抑制作用，用该菌菌液防治油用牡丹根腐病具有较好的防治效果，且还能够促进油用牡丹植株的生长，从而可减少化肥和农药投入、减轻环境污染，实现农业可持续发展。

Description

一株多功能暹罗芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及植物病害生物防治微生物领域，尤其涉及一株多功能暹罗芽孢杆菌及其应用。

背景技术

油用牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)是一种新型木本油料作物，其产籽能力强、种籽出油率高，牡丹籽油中富含丰富的不饱和脂肪酸，其中α-亚麻酸高于40％，是橄榄油的40倍，2011年中华人民共和国卫生部发布第9号公告批准牡丹籽油为新资源食品。目前，油用牡丹已在我国山东、河南、山西、甘肃等地大面积种植。随着种植面积的扩大以及种植年限的增加，油用牡丹受土传病害的影响日益严重，其中主要的土传病害—根腐病的蔓延影响了油用牡丹的产量与品质。

根腐病是一种毁灭性病害，严重危害果树、作物和蔬菜等多种植物，如苹果树、大豆、辣椒等。引起根腐病的病原菌包括多个种属，其中主要是由镰刀菌属(Fusariumspp.)引起，如F.verticillioides引起花生根腐病菌、F.oxysporum和F.graminearum引起大豆根腐病菌、F.solani引起黄瓜、辣椒根腐病菌等。牡丹根腐病发病初期，根皮上出现不规则的黑斑，不断发展，导致根部全部变黑腐烂，造成地上部分长势衰弱，叶片发黄；严重时叶片、枝条枯死，如果不及时防治，就会造成整株死亡。通过对典型病株中分离病原菌进行鉴定发现，病原菌主要为F.solani(茄腐皮镰刀菌)，同时存在少数F.oxysporum (尖孢镰刀菌)。关于牡丹根腐病的防治主要是以化学药剂为主，农药的大量施用不仅引起食品安全问题，而且也会造成环境污染。生防微生物制剂的使用具有环境友好的优势日益得到人们的认可，这些微生物主要包括真菌类(如木霉、青霉等)、放线菌类(如链霉菌)、细菌类(如芽孢杆菌、假单胞杆菌等)。

研究表明，生防菌可以分泌抗菌物质来抑制菌病原菌的生长，也可产生某些物质来促进植株的生长，从而提高植株的免疫力，减轻病害的发生。而细菌中芽孢杆菌(Bacillus spp.)因能产生芽孢抵抗恶劣的条件，且繁殖速度快，易在植物根际定殖等优点被广泛应用。目前筛选到的具有抑制植物病原微生物的芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)、暹罗芽孢杆菌(B.siamensis)等。其中，暹罗芽孢杆菌是2010 年首次报道分离于泰国腌制螃蟹中的芽孢杆菌的一个新种，近年来的研究表明该菌在植物病害生物防治方面表现出较好的效果。中国专利(公开号：CN105505834A)公开了一株防治梨轮纹病和软腐病的暹罗芽孢杆菌及其应用，该发明菌株从莱阳梨果皮中分离获得且对多种植物病原菌具有广谱抗性；中国专利(公开号：CN108034618A)公开了一株从健康仔猪的新鲜粪样中分离获得的暹罗芽胞杆菌，其具有对多种植物病原菌(包括烟草赤星病菌、辣椒胶孢炭疽菌、黄瓜疫病菌、水稻白叶枯病菌以及黄瓜角斑病菌)的拮抗效果，由此说明暹罗芽孢杆菌在多种病害防治方面具有较好的应用潜力。同时上述专利结果也表明，同暹罗芽孢杆菌不同菌株对不同病原菌的拮抗效果存在较大差别，因此在应用暹罗芽孢杆菌作为生防制剂的过程中，需要继续筛选更多能够防治其他病害的菌株，为该菌的应用提供更丰富的菌种资源。

植物根际存在着许多有益的微生物，对植物起到病害防治、产生多种促生因子促进植物生长等作用。虽然前期有学者对牡丹根腐病病原菌具有拮抗作用的生防菌进行了筛选 (王雪山等，牡丹根腐病拮抗菌的筛选与鉴定.山东农业科学,2012年第44卷第7期；吴玉柱等，6种生防真菌、细菌防治牡丹根腐病的研究.山东林业科技,2004年第6期)，但研究对象均为观赏性牡丹，关于以结籽为目的的油用牡丹根腐病病原菌生防菌的筛选的研究还鲜见报道。因此，为了确保油用牡丹丰产稳产，降低油用牡丹根腐病的发生，有必要针对该病害进行生防微生物的筛选，充分挖掘和利用其根际有益微生物，将有助于减少化肥和农药投入、减轻环境污染，实现农业可持续发展。

发明内容

本发明目的在于提供一株具有多种功能的暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)LS275 及其应用，该菌对茄腐皮镰刀菌引起的根腐病具有很强的抑制作用，用该菌菌液防治油用牡丹根腐病具有较好的防治效果，且还能够促进油用牡丹植株的生长，从而可减少化肥和农药投入、减轻环境污染，实现农业可持续发展。

本发明的暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)LS275，是从山西长治地区发生了根腐病的油用牡丹植株的根际土壤与非根际土壤分离筛选出来的菌种，对茄腐皮镰刀菌有很强的抑制效果。在LB固体培养基上该菌株生长快速，菌落为灰白色，不透明，培养2 天后出现皱褶，菌体杆状，具有芽孢，革兰氏染色阳性，能够利用淀粉，明胶，产生过氧化化氢酶，产氨，V.P.测定为阳性。将菌株LS275进行16S rRNA基因扩增和测序分析。菌株LS275的16SrRNA基因测序长度为1420bp，与Bacillus siamensis(NR 117274.1)同源性最高达99％以上，与其他芽孢杆菌相距较远。基于以上特征，将LS275菌株命名为暹罗芽孢杆菌(Bacillussiamensis)，该菌于2020年3月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCC No.19505，经检测存活。

本发明进一步提供所述的暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)在防治植物根腐病中的应用。优选地，所述植物是油用牡丹，进一步优选地所述根腐病是由茄腐皮镰刀菌(Fusarium solani)引起的根腐病。

具体应用时，是利用所述暹罗芽孢杆菌的菌液对植物进行灌根。所述暹罗芽孢杆菌的菌液是菌体悬浮液，优选地制备方法如下：将所述暹罗芽孢杆菌进行液体培养，优选是在 LB液体培养基中，于28℃、160rpm摇床中培养48～72h，获得发酵液作为菌体悬浮液，更优选地，用无菌蒸馏水稀释至发酵液至10⁸cfu·mL^-1作为菌体悬浮液。

本发明还提供所述的暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)在促进植物生长中的应用。优选地，所述植物是油用牡丹。

本发明还提供所述的暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)在防治由辣椒疫霉病病原菌(Phytophthora capsici)、杨树立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、大白菜根腐病病原菌 (Fusarium oxysporum)、番茄细菌性斑点病原菌(Pseudomonas syringae)、胡萝卜软腐病原菌(Pectobacterium carotovorum)或/和番茄青枯病原菌(Ralstoniasolanacearum)引起的植物病害中的应用。

本发明通过实施验证表明，所述暹罗芽孢杆菌LS275对于油用牡丹根腐病具有较好的防治效果，且具有良好防效的同时，能够促进油用牡丹植株的生长。此外，本发明暹罗芽孢杆菌LS275除了对茄腐皮镰刀菌引起的根腐病具有很强的抑制作用，对辣椒疫霉病病原菌、番茄细菌性斑点病原菌和番茄青枯病原菌也具有较强的抑制作用，此外对杨树立枯丝核菌、大白菜根腐病病原菌和胡萝卜软腐病原菌也有一定的抑制作用，由此说明暹罗芽孢杆菌LS275具有潜在的对多种病害的预防效果。因此，将可将本发明暹罗芽孢杆菌作为生防制剂用于防治植物根腐病特别是油用牡丹根腐病，从而可减少化肥和农药投入、减轻环境污染，实现农业可持续发展。

附图说明

图1：本发明LS275菌株16S rDNA系统发育树。

图2： 4株拮抗菌生长曲线。

图3：暹罗芽孢杆菌LS275对油用牡丹植株的影响。

图4：使用软件MEGAX基于ITS序列构建茄腐皮镰刀菌的系统发育树。

图5：使用软件MEGAX基于mtSSU序列构建茄腐皮镰刀菌的系统发育树。

具体实施方式

下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。

实施例1暹罗芽孢杆菌LS275的分离、鉴定

1、土壤样品来源

土壤取自山西长治地区发生了根腐病的油用牡丹植株的根际土壤与非根际土壤。将植株连根拔起，轻轻抖落，落下的大块土壤即为非根际土壤，仍粘在根上的是根际土壤，每 5棵植株的样品混为一个土样，分别将土壤收入无菌袋，贴上标签编号，带回实验室在4℃冰箱中保存。

2、芽孢杆菌菌株的分离

取土壤样品10g于90mL的蒸馏水中，恒温振荡培养箱均匀30min，85℃水浴锅中水浴30min以杀死绝大部分非芽孢细菌，静置，将上层清液分别稀释至10^-3，10^-4，10^-5浓度。取100μL稀释液涂布于固体LB培养基(NaCl 10g，胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，琼脂粉20g，蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.5)。将平板倒置培养于37℃恒温培养箱24-36h (本实施中为30h)，挑选形态，色泽，大小不同的菌落于固体LB平板上划线。将纯化后的菌株保存于-80℃冰箱，供下一步拮抗菌的筛选。

3、病原菌的采集

病原菌的采集过程具体如下：

1)油用牡丹根腐病的采集：采自山西长治地区油用牡丹主要种植基地，品种为凤丹牡丹，采集具有地上部枯萎、地下部腐烂变黑的典型根腐病症状的油用牡丹植株，标记后带回实验室。2)培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：200g去皮马铃薯切成小块后，放于蒸馏水中煮，待水开后用8层纱布过滤并用蒸馏水补充至1L，加入20g葡萄糖和16g琼脂粉。3)病原菌的分离与纯化：采用常规组织法进行病原菌的分离：先将凤丹病根用自来水洗净，取其病健交界处，依次用75％的酒精处理30s、0.1％升汞处理30～60 s，无菌水冲洗3遍，将冲洗好的牡丹根切成4～5mm的方块放入加入链霉素(1％)的PDA 培养基中，放在28℃培养箱中培养，将经过单孢分离与纯化的菌株保存于4℃冰箱，备用。4)病原菌的致病性测定：分离到的所有菌株进行致病性实验，使用长势一致并且无任何病害的3年生凤丹，用已灭菌的接种针刺伤凤丹根部表皮，接下来将根部放在1×10⁸个·ml^-1的孢子悬浮液中浸泡30min，以无菌水浸泡30min为空白对照。然后将凤丹种植在基质土中，每盆2棵，每个处理10棵凤丹苗，重复3次，然后放置在25℃温室中，接种 48h后每天浇水，保证其发病条件。种植30天后调查凤丹植株的发病程度，计算病情指数。5)病原菌的鉴定：包括形态观察和分子生物学鉴定，在马铃薯蔗糖琼脂培养基(PSA) (配方：200g去皮马铃薯切成小块后，放于蒸馏水中煮，待水开后用8层纱布过滤并用蒸馏水补充至1L，加入20g蔗糖和16g琼脂粉)中接种病原菌，观察并记录菌落的特征。在康乃馨琼脂培养基(CLA)(配方：已烘干灭菌的康乃馨叶片若干，琼脂20g，蒸馏水1 L)中接种病原菌，待长出菌落后用显微镜观察分生孢子的形态特征。利用OMEGA真菌提取试剂盒进行病原菌基因组DNA的提取，采用通用引物ITS：(ITS1: 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)和引物 mt SSU(NMS1a:5’-CAGCAGTGAGGAATATTGGTCAATG-3’，NMS2b: 5’-GCGGATCATCGAATTAAATAACAT-3’)进行PCR扩增。PCR反应体系为25μL，DNA 模板2μL，上下游引物各1μL，ddH₂O 8.5μL，2×Taq PCRSuper Mix 12.5μL。PCR扩增程序：94℃预变性4min；94℃变性30s，退火(ITS：55℃1min；mtSSU：60℃1.5 min)，72℃延伸1min，35个循环；72℃再延伸10min。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检查后，进行测序，将测序结果在NCBI中进行BLAST分析，使用MEGA X软件进行系统发育树构建(系统发育树请见图4和图5)。

结果：在山西省长治地区油用牡丹‘凤丹’大田共采标样22株，共分离获得43个纯培养菌株，依据菌落形态特征，其中41个分离物属于茄腐皮镰刀菌(Fusarium solani)，分离频率为95.35％，再根据显微观察，初步鉴定为上述分离物归属为8株茄腐皮镰刀菌。致病性测定结果表明，有4株茄腐皮镰刀菌使所处理的植株发病较严重，且可再分离到所接菌株，其菌株编号分别为FD1、FD8、FD10、FD13，发病率为100％，病情指数分别为86.67％、85.00％，36.67％，71.67％。发病植株主要症状为根部变黑，出现腐烂，与田间结果一致。将致病性实验中已发病的根再接入到PDA平板中进行菌株的分离，在相同营养与培养条件下，所分离的菌株与所接菌株形态相同，根据柯赫法则，证明所接菌株为凤丹根腐病的病原菌。以上实验说明菌株FD1、FD8、FD10、FD13为油用牡丹‘凤丹’的病原菌，但致病力有所不同。对上述4株菌进行分子鉴定，菌测序结果在GenBank中进行比对，其序列与茄腐皮镰刀菌(Fusarium solani)的相似性达到98％～100％，再结合形态学观察，明确引起油用牡丹根腐病的4株病原菌均是茄腐皮镰刀菌(Fusarium solani)。

4、拮抗菌的初筛

将供试菌株分别在LB活化后，采取平板对峙培养法，在改良PDA培养基(PDA培养基与LB培养基1:1比例添加：18.5g PDA，NaCl 5g，胰蛋白胨5g，酵母浸粉2.5g，琼脂粉10g，蒸馏水1000mL)平板中央，接种边长为0.5mm的茄腐皮镰刀菌FD1新鲜菌块，在菌饼两侧对称等距离2.5cm位置处接种单菌落。每个处理三次重复，28℃恒温培养72h，观察是否有抑菌圈产生，逐日观察并记录。选取对病原菌具有抑制作用的菌株进行下一步实验。初筛结果表明，具有抑菌作用的菌株共有27株。

5、拮抗菌的复筛

将初筛得到的有拮抗茄腐皮镰刀菌(Fusarium solani)FD1作用的细菌(菌株编号分别为LS18、LS28、LS211、LS275)接种在液体LB培养基中，于37℃、130rpm恒温振荡培养箱中培养24-36h(在本实施例中为30h)。采用平板对峙法，将边长0.5mm的茄腐皮镰刀菌(选择在当地分离到的致病性强的4个菌株FD1、FD8、FD10、FD13)新鲜菌块分别置于改良PDA平板中央，在菌饼两侧对称等距离2.5cm位置处打孔，每孔加100μL初筛得到的菌株培养液，在28℃恒温培养箱中进行对峙培养5-7d(在本实施例中为6d)，对有拮抗性能的菌株测量抑菌半径，计算抑菌率(公式：抑菌率＝(对照病原菌直径-处理病原菌直径)/对照病原菌直径*100％)，每个处理重复3次。结果表明，不同拮抗菌株对4 株茄腐皮镰刀菌的抑制效果存在差异，抑菌半径大于15mm的分别有10株、9株、8株和9 株，其中有4株菌对测试病原菌均有抑制作用，结果见表1、表2。综合来看，其中抑菌效果最好的是LS275，对4株茄腐皮镰刀菌的抑菌率在69.96％-76.93％之间。

表1 拮抗菌对4株病原菌抑制情况

表2 拮抗菌株对4株病原菌的抑菌率(％)

6、拮抗菌LS275的理化特征及16S rRNA分子鉴定

参照《常见细菌系统鉴定手册》对拮抗茄腐皮镰刀菌效果最好的菌株LS275进行形态学观察和生理生化鉴定。将菌株LS275进行16S rRNA基因扩增和测序分析。培养好的纯菌用试剂盒(北京天根生物科技有限公司)提取菌株的DNA，使用细菌16S rRNA基因通用引物27F和1492R进行PCR扩增，27F序列为5′-AGAGTT TGATCC TGG CTC AG-3′，1492R序列为5′-AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA-3′引物由生工生物工程(上海) 股份有限公司合成，电泳监测合格的扩增产物回收后送由生工生物工程(上海)股份有限公司测序。测序结果在NCBI上进行BLAST比对分析，用MEGA10.0软件构建系统发育树，确定菌株在系统发育学上的分类地位。

在LB固体培养基上该菌株生长快速，菌落为灰白色，不透明，培养2天后出现皱褶，菌体杆状，具有芽孢，革兰氏染色阳性，能够利用淀粉，明胶，产生过氧化化氢酶，产氨，V.P.测定为阳性，结果见表3。菌株LS275的16S rRNA基因测序长度为1420bp，与Bacillussiamensis(NR 117274.1)同源性最高达99％以上，与其他芽孢杆菌相距较远(请参见图1)。基于以上特征，将LS275菌株命名为暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)，该菌于2020年 3月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC (单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码： 100101)，保藏编号为CGMCC No.19505。

表3 LS275菌株形态特征及生理生化测定结果

注：“+”表示结果为阳性，“-”表示结果为阴性。

实施例2暹罗芽孢杆菌LS275促生功能测定

具有植物促生作用的微生物一般是通过产生某些促生因子分泌到环境中，从而促进植物生长。实验室条件下通过测定微生物是否产生吲哚乙酸(Indole-3-acetic acid,IAA)、产生铁载体和ACC脱氨酶来判断其对植物的促生作用。

1、产铁载体能力鉴定

将活化好的拮抗菌接种在CAS培养基中，在28℃培养48h，若生防菌株周围有橙黄色透明圈，说明具有产铁载体能力，否则没有(詹寿发等，2017)。

2、产IAA(吲哚乙酸)功能鉴定

在液体LB、高氏一号培养基中加入L-色氨酸，使其含量达到2.5mmol/L，分别将拮抗菌的单菌落接种在含有L-色氨酸的培养基中，30℃、160r/min培养48h，取1.5mL培养好的菌液中加入1.5mL Salkowski试剂混合均匀，若反应后呈粉红色，为阳性反应，说明该菌株具有产IAA的能力；若反应后呈黄色，为阴性反应，说明该菌株不具有产IAA 的能力，以无菌培养基作为对照。

3、ACC脱氢酶活性鉴定

将活化好的拮抗菌先接种在DF培养基中划线培养，细菌在37℃、放线菌在28℃倒置培养24～36h后，将DF培养基中的菌株转移至以ACC为唯一氮源的ADF培养基中培养，若该菌株可以正常生长，则说明该菌株能够利用ACC，具有ACC脱氢酶活性；反之则无(蒙渊，2011)。

4、固氮能力鉴定

将菌株用干净牙签将待测菌株挑入Ashby无氮固体培养基，传代6代，能良好生长说明有固氮能力，无法长出说明不具固氮能力。

液体LB培养基：NaCl 10g，胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，定容至1L，pH 7.0-7.5；

高氏一号培养基：可溶性淀粉20g，KNO₃ 1g，K₂HPO₄ 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g， NaCl0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，琼脂20g，定容至1L，pH＝7.4-7.6；

DF培养基：KH₂PO₄ 4g，Na₂HPO₄ 6g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，FeSO₄·7H₂O 0.2g，葡萄糖2g，葡萄糖酸2mL，柠檬酸2g，(NH₄)₂SO₄ 2g，定容至1L，pH 7.2。

ADF培养基：以3mmol/LACC代替DF培养基中的(NH₄)₂SO₄为唯一氮源。

CAS检测培养基：

溶液a：将0.012g CAS(铬天青S)溶于10mL蒸馏水中，再加入含有10mmol/L HCl 的2mL1mmol/L FeCl₃溶液；

溶液b：取0.015g HDTMA(十六烷基三甲基溴化铵)溶于8mL蒸馏水中；

染料溶液c：将溶液a缓慢加入溶液b中，轻轻晃动，使得两溶液互相混合均匀，得到染液c；

将10×MM9盐溶液：(Na2HPO4，30g；KH2HPO4，1.5g；NaCl，2.5g；NH4Cl，5 g；双蒸水，500mL)20mL和哌嗪二乙醇磺酸6.04g加入有150mL的双蒸水的洁净三角瓶中，混匀后用50％的NaOH调节pH到6.8，并加入琼脂粉3.2g，并得到培养基d。

将染料溶液c，培养基d和1mmol/L CaCl2，1mmol/L MgSO4·7H2O(张璐，2014)，20％的葡萄糖分别灭菌(115℃，20min)，10％的酸水解酪蛋白过滤除菌后，都置于50℃水浴锅保温待用。

分别量取上述0.2mL 1mmol/L CaCl2，4mL 1mmol/L MgSO4·7H2O，6mL 10％的酪蛋白氨基酸及2mL 20％的葡萄糖，加入培养基d中再沿瓶壁加入染液c，充分混匀(但勿产生气泡)，即得蓝色定性检测培养基，然后按每皿30mL倾注于培养皿中，置于无菌操作台待用。

Ashby无氮固体培养基

甘露醇10g；NaCl 0.2g；CaCO₃ 5g；KH₂PO₄ 0.2g；MgSO₄ 0.2g；CaSO₄ 0.1g；琼脂粉18g；水1000mL。

通过上述实验，结果表明，暹罗芽孢杆菌LS275能够产生生IAA、铁载体、ACC脱氨酶，具有固氮能力。

实施例3暹罗芽孢杆菌LS275的生长及定殖能力

1、生长特性测定：取暹罗芽孢杆菌LS275种子液以1％接种量接种在20mL液体LB培养基中，重复3次，在37℃，120r/min的摇床中培养，分别在2、4、6、8、10、12、 18、24、30、36、42、48、54、60、66、72h取菌液，使用酶标仪在590nm下测定吸光值(OD₅₉₀)，以同时筛选获得的其他2株具有拮抗能力的暹罗芽孢杆菌LS28、LS211和1 株枯草芽孢杆菌LS18为对照，进行生长特性的测定，4株拮抗菌生长曲线请见图2。从图上可以看出，4株生防菌均在6～8h进入对数期，24h开始进入稳定期，54h开始进入衰亡期。LS18达到稳定期时的OD值最低，其他3株相关不大，但LS275在培养72h后， OD值仍然在1左右，说明该菌生物量和稳定性相对其他菌株更优。

2、定殖能力测定：首先对暹罗芽孢杆菌LS275菌株进行利福平和氨苄青霉素的双抗标记，在装有20mL液体LB的三角瓶中加入利福平溶液，使其利福平的终浓度为10 μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL、120μg/mL、160μg/mL、200μg/mL、300μg/mL，吸取100μL已活化好的菌液加入含有10μg/mL利福平的培养基中，在28℃培养36～48h，待菌株可以稳定生长后，吸取该瓶中100μL菌液转移至含有20μg/mL利福平的培养基中培养，这样依次培养，筛选出具有利福平抗性的突变菌株。将具有利福平抗性的突变菌株使用相同方法进行氨苄青霉素抗性标记，将菌株逐步在含有10μg/mL、20μg/mL、50 μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL氨苄青霉素的培养基中进行培养，使得菌株获得双抗标记。以茄腐皮镰刀菌FD1为材料，采用平板对峙法对双抗标记菌株的抑制效果进行验证，确保其保持原来抗病能力。然后选取2年生凤丹植株，没盆中装入5kg土壤，种植3棵凤丹植株，用已双抗标记的暹罗芽孢杆菌LS275菌株进行处理，初始菌液浓度达到 10⁸cfu/mL，每盆植株使用50mL菌悬液进行灌根处理，每个处理3个重复。分别在灌根后的7d、28d、70d、77d、84d进行根际土壤取样，每盆中三颗植株的根际土壤混为一个样品。土壤样品采用梯度稀释法，取10^-3、10^-4和10^-5浓度稀释的稀释液在同时含有利福平和氨苄抗性的LB培养基上进行涂布，放在30℃培养箱中培养24～72h，计数并计算土壤中菌株的数量，并比较回收菌株与接种菌株抑菌能力。以同时筛选获得的其他2株具有拮抗能力的暹罗芽孢杆菌LS28、LS211和1株枯草芽孢杆菌LS18为对照，进行上述实验。通过上述方法可以验证暹罗芽孢杆菌LS275在土壤中的定殖能力。

结果表明经双抗标记的拮抗菌仍然保持了抑菌效果，且抑菌能力未发生显著变化，结果见表4，而且拮抗菌灌根处理后105天，土壤中拮抗菌数量能够维持在每克土壤10⁶cuf 的活菌数，其中暹罗芽孢杆菌LS275的活菌数量最高，具体结果见表5。

表4 双抗标记菌株抑菌率变化

表5 双抗标记菌株在土壤中定殖不同时间后的数量变化

实施例4暹罗芽孢杆菌LS275的拮抗菌谱

选择发病率较普遍的植物真菌病害和细菌病害的病原微生物为实验材料，采用平板对峙法对暹罗芽孢杆菌LS275拮抗菌谱进行测定。其中病原真菌为：1.辣椒疫霉病病原菌(Phytophthora capsici)；2.板栗疫病病原菌(Cryphonectria parasitica)；3.杨树立枯丝核菌 (Rhizoctonia solani)；4.大白菜根腐病病原菌(Fusarium oxysporum)。病原细菌为：1.番茄细菌性斑点病原菌(Pseudomonas syringae)；2.胡萝卜软腐病原菌(Pectobacterium carotovorum)；3.番茄青枯病原菌(Ralstonia solanacearum)；4.细菌性杨树溃疡 (Botryosphaeria dothidea)。如表6所示，暹罗芽孢杆菌LS275除了对茄腐皮镰刀菌引起的根腐病具有很强的抑制作用，对辣椒疫霉病病原菌、番茄细菌性斑点病原菌和番茄青枯病原菌也具有较强的抑制作用，此外对杨树立枯丝核菌、大白菜根腐病病原菌和胡萝卜软腐病原菌也有一定的抑制作用，由此说明暹罗芽孢杆菌LS275具有潜在的对多种病害的预防效果。

表6 暹罗芽孢杆菌LS275抑菌谱

注：“-”无拮抗；“+”0<拮抗半径<3mm；“++”3<拮抗半径<8mm；“+++”拮抗半径>8mm。

实施例5暹罗芽孢杆菌LS275对油用牡丹根腐病的防治效果

培养至对数期的暹罗芽孢杆菌LS275种子液以1％的接种量接种于LB液体培养基中，于28℃、160rpm摇床中培养48～72h，用无菌蒸馏水稀释至发酵液至10⁸cfu·mL^-1备用。将病原菌茄腐皮镰刀菌FD1、FD8、FD10、FD13用打孔器打成直径为7mm的菌块，接入 PD培养基中，每250ml接7-8块，在28℃、160rpm摇床中培养7d，离心后用纱布过滤得到菌丝体，将其放入搅拌机中加无菌水打碎，用蒸馏水稀释至孢子为10⁶个·mL^-1，备用。选取2年生的凤丹牡丹植株，挑选大小一致，健康的植株进行种植，用清水洗去浮土，用 75％的酒精清洗一遍。在直径为24.5cm、高20.5cm的塑料盆中装土5kg，均匀栽种6棵牡丹苗，定期进行浇水。在缓苗两个月后，采用灌根法进行接菌液种。共设置5个处理组：处理1(CK)：对照，自来水100mL；处理2(S)：接种暹罗芽孢杆菌LS275，生防菌悬液和清水各50mL；处理3(SB)：同时接种生防菌和病原菌，生防菌悬液和病原菌孢子悬浮液各50mL；处理4(B)：接种病原菌，病原菌孢子悬浮液和清水各50mL；处理5(EB)：接种病原菌，同时添加化学农药恶霉灵，病原菌孢子悬浮液和500倍恶霉灵稀释液各50 mL。每个处理3次重复。每隔7d灌根一次，共灌根3次，在最后一次灌根两个月后进行收苗。统计发病率，计算病情指数与防效；测定植株株高、根鲜重、株鲜重等指标。

在第3次生防菌液灌根后，继续种植2个月后收苗，统计植株发病情况，结果如表7所示。在没有添加病原孢子悬浮液的处理CK和处理S中，植株均未发病，在只添加病原孢子悬浮液的处理B中，植株全部发病，出现根部腐烂变黑，病情指数为87.96％。在添加病原孢子悬浮液与生防菌液的处理SB和添加病原孢子悬浮液与药剂的处理EB中，发病率和病情指数显著低于处理B，但处理SB与EB之间没有显著差异，说明暹罗芽孢杆菌 LS275对于油用牡丹根腐病具有较好的防治效果。

表7 暹罗芽孢杆菌LS275对油用牡丹根腐病的防治效果

生防菌液处理对油用牡丹植株的促生作用结果如表8和图3所示，只添加病原菌的处理B各项植株指标显著低于其他处理组，说明病害的发生阻滞了油用牡丹植株的正常生长。处理S的各项指标均大于处理CK，植株鲜重、根干重、根长等指标间存在显著差异(P<0.05)。处理SB与处理EB相比，处理SB的各项指标均大于处理EB组，植株鲜重、根干重、根长等指标间也存在显著差异。以上说明暹罗芽孢杆菌LS275具有良好防效的同时，能够促进油用牡丹植株的生长。

表8 暹罗芽孢杆菌LS275处理对油用牡丹生长的影响

Claims (9)

1.一株暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis），保藏号为CGMCC No. 19505。

2.如权利要求1所述的暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis）在防治植物根腐病中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述植物是油用牡丹。

4.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述根腐病是由茄腐皮镰刀菌（Fusarium solani）引起的根腐病。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：其利用所述暹罗芽孢杆菌的菌液对植物进行灌根。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述暹罗芽孢杆菌的菌液是菌体悬浮液，优选地制备方法如下：将所述暹罗芽孢杆菌进行液体培养，优选是在LB液体培养基中，于28℃、160 rpm摇床中培养48～72 h，获得发酵液作为菌体悬浮液，更优选地，用无菌蒸馏水稀释至发酵液至10⁸ cfu·mL^-1作为菌体悬浮液。

7.如权利要求1所述的暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis）在促进植物生长中的应用。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述植物是油用牡丹。

9.如权利要求1所述的暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis）在防治由辣椒疫霉病病原菌（Phytophthora capsici）、杨树立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、大白菜根腐病病原菌 （Fusarium oxysporum）、番茄细菌性斑点病原菌（Pseudomonas syringae）、胡萝卜软腐病原菌（Pectobacterium carotovorum）或/和番茄青枯病原菌（Ralstonia solanacearum）引起的植物病害中的应用。

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