JP5515098B2

JP5515098B2 - レカニシリウム・マスカリウムｖ−５菌株、該菌株を用いた害虫の防除方法、並びに該菌株を含有する微生物農薬

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Publication number: JP5515098B2
Application number: JP2010524733A
Authority: JP
Inventors: 智史荒木; 宗和小川; 崇之加嶋
Original assignee: Ishihara Sangyo Kaisha Ltd
Current assignee: Ishihara Sangyo Kaisha Ltd
Priority date: 2008-08-11
Filing date: 2009-08-11
Publication date: 2014-06-11
Anticipated expiration: 2029-08-11
Also published as: CN102171327A; US20110135609A1; TW201006388A; TWI444141B; WO2010018830A1; BRPI0917471A2; JPWO2010018830A1; KR20110044861A; CN102171327B; EP2322597A1; US8535932B2; EP2322597A4

Description

本発明は、レカニシリウム・マスカリウム（Lecanicillium muscarium）V-5菌株、該菌株を用いた害虫の防除方法、並びに該菌株を含有する微生物農薬に関する。本発明は、特に農園芸分野において、環境にやさしく、かつ速効的で長期間にわたり効果的に害虫を防除するためのものである。

天敵糸状菌は、昆虫やダニ類に対する天敵類であり、例えば、バーティシリウム（Verticillium）属やボーベリア（Beauveria）属に属する天敵糸状菌が殺虫剤として実用化されている。以前はバーティシリウム・レカニ（Verticillium lecanii）として分類された菌群のうちの一部の菌株は、分生子及びフェアライドの形態観察、βチューブリン遺伝子の制限酵素断片多型分析によって、最近、レカニシリウム（Lecanicillium）属へ再分類された。その結果、本発明の菌株や商品名マイコタール（KOPPERT社製）は、レカニシリウム・マスカリウム（Lecanicillium muscarium）に再分類された。特許文献１には、植物体表面定着能力を有するバーティシリウム・レカニの菌株を、害虫寄生菌として含有することを特徴とする植物体表面定着微生物農薬が記載されているが、本発明の菌株については記載されていない。また、レカニシリウム・マスカリウムを含有する殺虫性微生物農薬としては、マイコタールが、バーテシウムレカニ水和剤として市販されているが、本発明の菌株は、マイコタールに含まれる菌株とは菌叢が異なる。

日本国特開２００３−３３５６１２号公報

本発明が解決しようとする課題は、環境にやさしく、速効的でかつ、害虫の卵・幼虫に散布処理した場合の殺虫効果が優れた微生物農薬として有用な、新規な糸状菌の菌株を提供することにある。

本発明者らは、上述の課題を解決すべく、従来知られていたレカニシリウム・マスカリウムに属する糸状菌に比べ、対象害虫の死亡率が高く、より短期間で対象害虫を防除できる本発明の菌株を見出した。即ち、本発明は、レカニシリウム・マスカリウムV-5菌株（受託番号：FERM BP-11135）、該菌株を用いた害虫の防除方法、並びに該菌株を含有する微生物農薬に関する。

（レカニシリウム・マスカリウムV-5菌株の単離と寄託申請）
本発明のレカニシリウム・マスカリウムV-5菌株（以下、本発明の菌株と略す）は、日本国滋賀県草津市西渋川２丁目3番1号の石原産業(株)中央研究所の温室においてシルバーリーフコナジラミから単離された菌株である。本発明の菌株は、その形態学的性質（分生子柄に突き錐状のフィアライドが輪生し、その先端に単胞の分生子が塊状に形成される。フィアライドの長さ11.2〜34.3μm、基部の直径1.1〜2.7μm、分生子は楕円形又は棍棒状、大きさ1.4〜3.4μm×2.1〜7.5μm。培養菌層は白色〜黄白色。2次フィアライドの形成はない。）及びβ-チューブリン遺伝子の制限酵素断片多型の結果（PCRで540bpのDNAが増幅され、Hae III消化では360bp、180bpの断片が生じた。）から、R. Zare and W. Gamsらによる分類（Nova Hedwigia 73:1-50, 2001）により、レカニシリウム・マスカリウムと同定された。本発明の菌株は、レカニシリウム・マスカリウムV-5株（受託番号：FERM BP-11135）として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６)に寄託申請され、２００９年６月１０日に、同センターで受領されている。このものは、殺虫・殺ダニ効果を有する糸状菌であり、このものを含有する微生物農薬は、害虫の防除に有用である。

本発明の菌株を用いれば、害虫を極めて効率的に防除できる。本発明の菌株は、増殖性に優れるため、高い菌密度を確保でき、かつ優れた殺虫効果を保持している。このことから、効率的な害虫防除が可能となる。また、害虫の卵の時期から殺虫効果を発揮するので、早期に効率的な害虫防除が可能となる。さらには、本発明は、糸状菌を使用するものであることから、環境に対してもきわめて高い安全性を有し、速効性と持続効果が必要とされる害虫を防除する場面においても有用である。

試験例３において、本発明の菌株の菌叢を示す写真。試験例３において、マイコタール分離菌株の菌叢を示す写真。

本発明の菌株は、そのまま又は水で適宜希釈して施用することにより、微生物農薬として用いることができる。施用濃度及び施用量は害虫の種類、害虫の生育段階、気象条件等種々の条件により異なるが、施用量は一般に、１アール当り本発明の菌株の胞子数にして５×10^６〜５×10¹²胞子、好ましくは５×10^７〜５×10¹¹胞子である。

本発明の菌株は、製剤化して微生物農薬として用いることができる。製剤化には、昆虫病原菌を微生物農薬として製剤化するための一般的な方法を用いることができ、必要により固体担体、液体担体等の担体、界面活性剤、その他の製剤用補助剤等を適宜組み合わせて、粉剤、水和剤、懸濁剤、オイルフロアブル剤等の形態に製剤できる。これらの中でも、粉剤化し、使用にあたってこれを水に溶かして散布する水和剤の形態が望ましい。本発明の菌株を水和剤にして、水で希釈して使用する場合、一般に、本発明の菌株の濃度が散布溶液中の胞子数で１ｍｌあたり10^２〜10¹⁰胞子、好ましくは１ｍｌあたり10^３〜10⁸胞子となるように希釈して施用する。

固体担体としては、例えば、珪藻土、消石灰、炭酸カルシウム、タルク、ホワイトカーボン、カオリン、ベントナイト、カオリナイト、セリサイトの混合物、クレー、炭酸ナトリウム、重曹、芒硝、ゼオライト、澱粉等が挙げられる。また、液体担体としては、例えば、水、トルエン、キシレン、ソルベントナフサ、ジオキサン、アセトン、イソホロン、メチルイソブチルケトン、クロロベンゼン、シクロヘキサン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、アルコール等の溶剤；オリーブ油、カポック油、ひまし油、シュロ油、椿油、ヤシ油、ごま油、トウモロコシ油、米ぬか油、落花生油、綿実油、大豆油、菜種油、亜麻仁油、きり油、液状パラフィン等の植物油や鉱物油等が挙げられる。

界面活性剤としては、例えば、脂肪酸塩、安息香酸塩、アルキルスルホコハク酸塩、ジアルキルスルホコハク酸塩、ポリカルボン酸塩、アルキル硫酸エステル塩、アルキル硫酸塩、アルキルアリール硫酸塩、アルキルジグリコールエーテル硫酸塩、アルコール硫酸エステル塩、アルキルスルホン酸塩、アルキルアリールスルホン酸塩、アリールスルホン酸塩、リグニンスルホン酸塩、アルキルジフェニルエーテルジスルホン酸塩、ポリスチレンスルホン酸塩、アルキルリン酸エステル塩、アルキルアリールリン酸塩、スチリルアリールリン酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルアリールエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルアリールエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸塩、ポリオキシエチレンアルキルアリールリン酸エステル塩、ナフタレンスルホン酸ホルマリン縮合物の塩のような陰イオン系の界面活性剤；ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、脂肪酸ポリグリセライド、脂肪酸アルコールポリグリコールエーテル、アセチレングリコール、アセチレンアルコール、オキシアルキレンブロックポリマー、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレンスチリルアリールエーテル、ポリオキシエチレングリコールアルキルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシプロピレン脂肪酸エステルのような非イオン系の界面活性剤；等が挙げられる。これら界面活性剤によって、散布時の菌体の分散性や展着性の改善を図ることができる。

その他の製剤用補助剤としては、例えば、乳化剤、分散剤、安定剤、湿潤剤、懸濁化剤、展着剤、浸透剤、防菌防黴剤等が挙げられ、乳化剤の具体例としては、リグニンスルホン酸塩、アルギン酸塩、分散剤の具体例としては、ポリビニルアルコール、アラビアガム、カルボキシメチルセルロース、安定剤の具体例としては、酸性リン酸イソプロピル、ポリオキシエチレン樹脂酸（エステル）、アビエチン酸塩、湿潤剤の具体例としては、ジナフチルメタンジスルホン酸塩等が挙げられる。

本発明の菌株を用いて、害虫を防除する方法においては、薬剤を施用する際に、必要により動力噴霧器、肩掛け噴霧器、ハンドスプレーヤー等の噴霧器を用い、害虫、害虫の生息場所、害虫から保護すべき植物等に散布する。また、施用に際して、天敵糸状菌に悪影響のない他の殺虫剤、殺ダニ剤や肥料、殺菌剤、植物生長調節剤等と混合して施用することもできる。

本発明の害虫の防除方法において防除される害虫としては、例えば、コナジラミ類（オンシツコナジラミ（Trialeurodes vaporariorum）、タバココナジラミ（Bemisia tabaci）、ミカンコナジラミ（Dialeurodes citri）等）；アブラムシ類（モアカアブラムシ（Myzus persicae）、ワタアブラムシ（Aphis gossypii）、ダイコンアブラムシ（Brevicoryne brassicae）、ジャガイモヒゲナガアブラムシ（Aulacorthum solani）、ニセダイコンアブラムシ（Lipaphis elisimi）、チューリップヒゲナガアブラムシ（Macrosiphum euphorbiae）、ネギアブラムシ（Neotoxoptera formosana）等）；ハダニ類（ミカンハダニ、リンゴハダニ、ナミハダニ、カンザワハダニ等）；アザミウマ類（ヒラズハナアザミウマ（Frankliniella intonsa）、ミカンキイロアザミウマ（Frankliniella occidentalis）、ミナミキイロアザミウマ（Thrips palmi）、チャノキイロアザミウマ（Scirtothrips dorsalis）等）；サビダニ類（ミカンサビダニ、トマトサビダニ等）；ハモグリバエ類（マメハモグリバエ等）；シンクイムシ類；ヨトウ類；カミキリムシ類（ゴマダラカミキリ、キクスイカミキリ等）等が挙げられる。防除される害虫として、より好ましくは、コナジラミ類、アザミウマ類等である。また、これらの害虫から保護すべき植物としては、例えば、ミカン、リンゴ、ナシ、モモ、ブドウ、イチジク、オウトウ等の果樹、茶及びナス、キュウリ、トマト、ホウレンソウ、キャベツ、パセリ等の蔬菜類、イチゴ、メロン、スイカ等の果物類、バラ、キク、カーネーション、サクラ、ツバキ等の花木類、ベゴニア等の観葉植物等が挙げられる。

本発明の菌株を元菌株として自然または誘発突然変異により得られる変異株も、本発明の菌株と同様の特性を有する限り、本発明の菌株に含まれる。これらの変異株を調製する方法としては、公知の方法、例えば元菌株を紫外線照射あるいはニトロソグアニジン（ＮＴＧ）等の変異原物質による人工突然変異処理を施し、殺虫効果の優れた菌株を選別する方法等が挙げられる。

次に本発明の具体的な実施形態を記載するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（１）本発明の菌株を、害虫に処理することを特徴とする害虫の防除方法。
（２）害虫が、コナジラミ類、アブラムシ類、ハダニ類、アザミウマ類、サビダニ類、ハモグリバエ類、シンクイムシ類、ヨトウ類及びカミキリムシ類からなる群から選択される少なくとも１種である（１）に記載の方法。
（３）害虫が、コナジラミ類である（１）に記載の方法。
（４）害虫が、アザミウマ類である（１）に記載の方法。

試験例１（タバココナジラミ卵への散布試験）
試験方法
(1)直径7cmのポットに植えた1葉期のキュウリ（品種：北進）４ポットを、昆虫飼育ケース（260×340×340mm）中に設置し、タバココナジラミＢタイプの成虫を7時間にわたって産卵させた。このようにして産卵させた各ポットを、1日当たり8時間を暗条件とし、25℃に保った昆虫飼育室内に移して静置し、コナジラミを発育させた。産卵5日後（タバココナジラミ：卵期）にキュウリ葉に寄生している卵数を記録した。
(2)スプレーガンを用いて、散布水量が４ポット当たり50 mlとなるように、所定濃度に希釈調整した散布液（分生子懸濁液、調整後2時間以内）を、各ポットのキュウリ茎葉部に1回散布した。散布後、直ちに蓋付きプラスチック容器（底部に水が張ってあり、湿度100％に保たれている）に移動し、25℃暗条件にて15時間静置した。その後、(1)と同じ条件下の昆虫飼育室内にキュウリ葉を静置した。
(3)実体顕微鏡を用いて、薬液散布処理７日後（タバココナジラミ：1,2齢幼虫期）、13日後（タバココナジラミ：2,3齢幼虫期）、19日後（タバココナジラミ：4齢幼虫期）及び26日後（タバココナジラミ：羽化痕期）にタバココナジラミの生死の判別し、死亡率を求めた。なお、比較のため、前記した商品名マイコタール（KOPPERT社）を希釈して、分生子濃度が実用濃度である3.0×10⁶個/mlとなるように調製した散布液についても試験を行った。試験結果を第１表に示した。
試験結果

試験例２（タバココナジラミ幼虫への散布試験）
試験方法
(1)直径7cmのポットに植えた1葉期のキュウリ（品種：北進）５ポットを、昆虫飼育ケース（260×340×340mm）中に設置し、タバココナジラミＢタイプの成虫を7時間にわたって産卵させた。このようにして産卵させた各ポットを、1日当たり8時間を暗条件とし、25℃に保った昆虫飼育室内に移して静置し、コナジラミを発育させた。産卵10日後（タバココナジラミ：1,2齢幼虫期）にキュウリ葉に寄生している幼虫数を記録した。
(2)スプレーガンを用いて、散布水量が５ポット当たり50 mlとなるように、所定濃度に希釈調整した散布液（分生子懸濁液、調整後2時間以内）を、各ポットのキュウリ茎葉部に1回散布した。散布後、直ちに蓋付きプラスチック容器（底部に水が張ってあり、湿度100％に保たれている）に移動し、25℃暗条件にて15時間静置した。その後、(1)と同じ条件下の昆虫飼育室内にキュウリ葉を静置した。
(3)実体顕微鏡を用いて、薬液散布処理８日後（タバココナジラミ：2,3齢幼虫期）、14日後（タバココナジラミ：3,4齢幼虫期）、17日後（タバココナジラミ：4齢幼虫期〜羽化痕）及び21日後（羽化痕）にタバココナジラミの生死の判別し、死亡率を求めた。なお、比較のため、前記した商品名マイコタール（KOPPERT社）を希釈して、分生子濃度が実用濃度である1.0×10⁶個/mlとなるように調製した散布液についても試験を行った。試験結果を第２表に示した。

試験例３（本発明の菌株と既存菌株の菌叢比較）
(1)ジャガイモ蔗糖寒天培地（以下、PSA培地と略す）の作製
皮を剥いだジャガイモ200gをイオン交換水にて煮込み、4重にしたガーゼにて煮汁をろ過した。ろ過したジャガイモ煮汁にシュークロース20gと寒天15gを加え、さらに煮込んでシュークロースと寒天を溶解し、1リットルに調整後、オートクレーブにて121℃で20分間滅菌処理を行い、PSAを作製した。その後、クリーンベンチ内にて滅菌シャーレ（直径86 mm）にPSAを20ml分注し、PSA培地を作製した。
(2)菌株の培養
PSA培地中央に菌株を少量接種し、1日当たり8時間を暗条件とした25℃の恒温室内で、静置培養した。菌叢の発育状況を経時的に観察し、培養開始28日後に写真を撮影した。菌株としては、本発明の菌株と、マイコタールから分離した菌株を用いた。
(3）結果
本発明の菌株の菌叢は図１に示した通り、中央部分と外側部分で大きな違いは認められず、全体的に均一に拡がっていた。一方、マイコタール分離菌は図２に示した通り、菌叢中央部分が立体的に盛り上がり、菌叢外側部分は平らになっていた。このように、両者は、明らかに異なった菌叢を示した。

試験例４（本発明の菌株と既存菌株の比較試験）
(1)試験例３と同様の方法でクリーンベンチ内にて滅菌シャーレ(直径86 mm)にPSAを20 ml分注し、PSA培地を作製した。そこへ、希釈調整した胞子懸濁液0.5 ml（5個程度の分生子を含有）を全体に均一に分布するように滴下処理し、1日当たり8時間を暗条件とした25℃の恒温室内で、静置培養し、コロニーを形成させた。分生子懸濁液としては、本発明の菌株とマイコタールから分離した菌株の分生子懸濁液を用いた。
(2)培養から、２週間後、一つの分生子から形成されたコロニーの直径を測定後、メスにてコロニーを寒天とともに切り出した。切り出したコロニーの1/4をイオン交換水が3 ml入れてある小型シャーレ（直径4 cm）に移し、分生子を洗い流した。さらに切り出した寒天に付着している分生子をイオン交換水2 mlを用いて再度洗い流した。このようにして、分生子洗浄液5 mlを得た。得られた分生子洗浄液0.5 mlを試験管に分注し、イオン交換水4.5 mlで希釈し、ボルテックスにて十分に混和し、分生子数測定用試験液を調製した。
(3)分生子数測定用試験液を、メッシュつきプレパラート上に滴下し、顕微鏡下で分生子数をカウントし、培地表面上の全分生子数を計算し、結果を第３表に示した。なお、分生子数測定用試験液は、必要に応じて分生子数をカウント可能な濃度に希釈して、プレパラート上に滴下した。また、試験は5連制で行い、結果はその平均値で示した。

試験の結果、以下のことが明らかになった。本発明の菌株のコロニー半径は、マイコタール菌株のコロニー半径の1.4倍（面積換算で1.9倍）であり、両菌の間に有意差が認められた(t-test, p<0.05)。また、１つのコロニー中の総分生子数は、本発明の菌株がマイコタール分離菌株の約9倍であり、両菌の間に有意差が認められた(t-test, p<0.05)。さらに、コロニー中の分生子密度は、本発明の菌株がマイコタール分離菌株の4.8倍多くなり、有意差が認められた(t-test, p<0.05)。この試験から、本発明の菌株は、菌の増殖率及び分生子の密度に関し、既存株に対する優位性を有することが判った。

試験例５（本発明の菌株のミカンキイロアザミウマに対する効果試験）
直径17cmのポットに植えたナス（品種：千両2号）３ポットに寄生しているミカンキイロアザミウマの幼虫数を調査後、分生子濃度が5.0×10⁷（個/ml）になるように水で希釈調整した本発明の菌株を含む散布液（分生子懸濁液、調整後2時間以内）を自動噴霧機（サカタ製．NZ-2）を用いて全葉に十分量散布した。散布後の３ポットを温室内に設置し、約15時間高湿度条件下に保ち、その後は通常の方法で温室管理を行った。散布から7日後にナス全葉に寄生している幼虫数を調査した。試験結果を第４表に示した。なお、比較のための無処理区として、散布液の代わりに水を散布し、同様の試験を行った。無処理区では幼虫数が約1.4倍に増加したのに対し、処理区では約3分の1に減少し、防除効果が認められた。

試験例６（本発明の菌株のオンシツコナジラミに対する効果試験）
(1)直径7cmのポットに植えた1葉期のインゲン（品種：新江戸川菜豆）2ポットを、昆虫飼育ケース（260×340×340mm）中に設置し、オンシツコナジラミの成虫に7時間にわたって産卵させた。このようにして産卵させた各ポットを、1日当たり8時間を暗条件とし、23℃に保った昆虫飼育室内に移して静置し、オンシツコナジラミを発育させた。産卵10日後（オンシツコナジラミ：1,2齢幼虫期）にインゲン葉に寄生している幼虫数を記録した。
(2)スプレーガンを用いて、散布水量が1ポット当たり10 mlとなるように、所定濃度に希釈調整した散布液（分生子濃度1.0×10⁶/ml及び1.0×10⁷/mlの2濃度）を、各ポットのインゲン茎葉部に1回散布した。分生子懸濁液は調整2時間以内のものを使用した。散布後、直ちに蓋付きプラスチック容器（底部に水が張ってあり、湿度100％に保たれている）に移動し、23℃暗条件にて15時間静置した。その後、(1)と同じ条件下の昆虫飼育室内にインゲン葉を静置した。
(3)実体顕微鏡を用いて、薬液散布処理３日後（オンシツコナジラミ：羽化痕）にオンシツコナジラミの生死の判別し、死亡率を求めた。試験結果を第５表に示した。

次に本発明の製剤例を記載するが、本発明における製剤量、剤型等は記載例のみに限定されるものではない。

製剤例１
本発明菌株の分生胞子約10¹²個を蒸留水10リットルに懸濁し、セライト 100ｇと乳糖10ｇを添加した後、スプレードライにより乾燥した。これに保水性物質としてポリビニルアルコール50ｇを混合し、粉剤とする。

製剤例２
ガラス瓶に、液状パラフィン８５．０重量％及びポリオキシエチレン脂肪酸エステル５．０重量％を入れ、これをよく混和する。当該混合物に製剤例１で得られる本発明菌株の粉剤１０．０重量％を加え、さらに混和することにより、オイルフロアブル剤を得る。

本発明を特定の態様を参照して詳細に説明したが、本発明の精神と範囲を離れることなく様々な変更および修正が可能であることは、当業者にとって明らかである。
なお、本出願は、２００８年８月１１日付けで出願された日本特許出願（特願2008-206866）に基づいており、その全体が引用により援用される。
また、ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。

Claims

レカニシリウム・マスカリウムV-5菌株（受託番号：FERM BP-11135）。
請求項１に記載の菌株を、害虫に処理することを特徴とする害虫の防除方法。
害虫が、コナジラミ類、アブラムシ類及びアザミウマ類からなる群から選択される少なくとも１種である請求項２に記載の方法。
害虫が、コナジラミ類である請求項３に記載の方法。
害虫が、アザミウマ類である請求項３に記載の方法。
請求項１に記載の菌株を含有する微生物農薬。