CN112913844A - 一种防治白粉病的杀菌组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种防治白粉病的杀菌组合物，属于农药杀菌组合物及其应用领域。该杀菌组合物以非农药组分3‑吲哚甲酸和茉莉酸为基料，3‑吲哚甲酸与茉莉酸按照质量比1:9‑9:1配制而成。本发明的杀菌组合物，具有显著的增效作用，可用于小麦白粉病、葡萄白粉病、黄瓜白粉病、草莓白粉病的防治，且该组合物具有高效、低毒、低残留与环境相容等特点，具有广阔的市场前景。
Description
技术领域
本发明属于农药杀菌组合物及其应用领域，具体地说涉及一种防治白粉病 的杀菌组合物。
背景技术
白粉病由活体营养专性寄生菌白粉病菌引起，其种类多，分布广，引发的 病害广泛存在于多种作物上，如麦类，蔬菜、花卉、树木等。该病大多为多循 环病害，病害潜伏期短，一个生长季节可繁殖多代，且繁殖率高，产生的孢子 可以借助空气大范围传播，并多次重复侵染寄主植物，故在合适的天气、环境 条件下，此类病害可快速、大范围发生，寄主被白粉菌侵染后，其呼吸作用增 强、蒸腾强度增加、光合作用降低，严重影响植物的生长发育，造成巨大的经 济损失。
目前，生产中化学杀菌剂防治白粉病仍是行之有效的方法，但长期采用化 学农药防治面临着两个严重的问题：第一，病原菌在长期施药的压力下，通过 进化与自然选择产生了抗药性或耐药性。已有报道白粉病菌对三唑类、甲氧基 丙烯酸酯类、苯并咪唑类、有机磷类、羧基嘧啶类和苯氧基喹啉等均已产生了 抗药性。第二，长期使用杀菌剂威胁到生态环境，影响人畜的健康。因此，迫 切需要开发活性高、对非靶标生物安全、环境相容性好的新农药。不同药剂的 合理复配或混配具有扩大杀菌谱，提高防治效果、减少用药量、降低药害、减 少残留、延缓真菌耐药性和抗药性的产生，是解决以上问题最为有效的方法之 一。
茉莉酸(Jasmonic acid，JA)及其衍生物是一类重要的植物激素，广泛存 在于高等植物体内，是一种天然的植物生长调节因子，并参与调控植物的生长 发育、抵御逆境胁迫等过程。目前，已有研究表明茉莉酸信号途径不仅参与植 物对腐生型病原菌的抗性，也参与植物对活体营养寄生型病原菌的抗性，如白 粉病菌。当植物受到外界刺激时(如病、虫、草害、干旱等逆境胁迫)，植物体 内的某些特殊酶的活性增强，导致体内的茉莉酸甲酯含量迅速增加，并产生出 具有某些特殊生理活性的次生物质，从而应对不利影响。
3-吲哚甲酸(Indole-3-carboxylic acid)是吲哚衍生物，是重要的精细化工 原材料和化工产品，近年来受到越来越多的关注。3-吲哚甲酸更是一种重要的 有机中间体，可被广泛用于农药和医药的合成，如止吐药盐酸托烷司琼的合成。 但未见3-吲哚甲酸用于植物病害防治的报道。
发明人通过对内生真菌Lasiodiplodia pseudotheobromae(LPS-1菌株)发酵 液中代谢产物的组分研究，发现LPS-1的发酵液中含有茉莉酸及3-吲哚甲酸， 通过大量筛选试验发现茉莉酸及3-吲哚甲酸复配可以显著增效，该组合物用于 白粉病的防治为国内首次报道，这加快了防治白粉病新药剂的筛选，该组合物 的应用具有广阔的市场前景。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种高效的防治白粉病 的杀菌组合物，该组合物由茉莉酸、3-吲哚甲酸复配而成，该组合物对白粉病 菌具备较强的毒杀能力，与市场上防治白粉病的药剂作用机理不同，不存在交 互抗性问题，是一种防治白粉病的作用机理特殊的新药剂。
发明人研究内生真菌Lasiodiplodia pseudotheobromae(LPS-1菌株)代谢产 物时发现，从LPS-1发酵液中分离获得的活性化合物茉莉酸对白粉病菌具有抑 制活性，但活性远低于发酵液的活性。因此推测，LPS-1发酵液中还存在其它 的活性物质或增效物质。后发明人又从内生真菌Lasiodiplodia pseudotheobromae (LPS-1菌株)的发酵液中分离获得了3-吲哚甲酸，虽3-吲哚甲酸对白粉病菌抑 制活性极低，但发明人发现3-吲哚甲酸与茉莉酸按一定质量比混合后，可以显 著的提高茉莉酸对白粉病菌的抑菌活性。
基于以上的试验发现，发明人对具有防治白粉病菌活性的内生真菌LPS-1 次生代谢产物进行反复筛选，并对混配药剂的原料药质量配比进行反复试验， 对试验结果进行对比，最终找到一种杀菌组合物，该杀菌组合物是以3-吲哚甲 酸与茉莉酸为基料，3-吲哚甲酸与茉莉酸按质量比1:9-9:1配制而成。
优选地，如上所述的一种防治白粉病的杀菌组合物，该杀菌组合物中3-吲 哚甲酸与茉莉酸的质量比为2∶8。
优选地，如上所述的一种防治白粉病的杀菌组合物，所述杀菌组合物可用 于白粉病的防治。
优选地，如上所述的一种防治白粉病的杀菌组合物，所述杀菌组合物可用 于小麦白粉病、葡萄白粉病、黄瓜白粉病、草莓白粉病的防治。
优选地，如上所述的一种防治白粉病的杀菌组合物，所述3-吲哚甲酸、茉 莉酸可来源于天然产物的提取纯化或人工化学合成。
优选地，如上所述的一种防治白粉病的杀菌组合物，所述的天然产物的提 取纯化包含但不限于用植物内生真菌Lasiodiplodia pseudotheobromae(LPS-1 菌株)发酵后提取纯化。
优选地，如上所述的一种防治白粉病的杀菌组合物，所述的内生真菌LPS-1 提取纯化3-吲哚甲酸、茉莉酸的方法为：乙酸乙酯萃取，硅胶柱，凝胶柱，高 效液相制备柱进行分离纯化。
通过大量试验，发明人发现茉莉酸与3-吲哚甲酸复配可以防治白粉病的作 用机理为：该组合物使白粉病菌附着孢、吸器形成的关键基因表达发生改变， 进而引起附着孢畸形、抑制吸器的形成，最终导致白粉病菌丧失致病力，达到 防病的效果。
与现有技术相比，本发明的优点在于：(1)茉莉酸和3-吲哚甲酸均为非杀 菌剂组分，与市场上防治白粉病的药剂作用机理不同，不存在交互抗性问题， 是一种防治白粉病的作用机理特殊的新药剂；(2)茉莉酸和3-吲哚甲酸复配后， 具有明显的增效作用；(3)茉莉酸和3-吲哚甲酸复配组合物，具有与环境相容、 低毒、低残留的优点。
具体实施方式
为能清楚说明本发明方案的技术特点，下面结合具体实施例，对本发明进 行阐述。但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思 的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
本申请所使用的内生真菌Lasiodiplodia pseudotheobromae(LPS-1菌株)已 在专利ZL CN 103918724 B中公开，并于2013年11月27日保藏在中国典型 培养物保藏中心(地址：中国武汉武汉大学)，保藏号CCTCC NO:M 2013605。
实施例1：内生真菌LPS-1的发酵及3-吲哚甲酸和茉莉酸分离纯化
采用摇瓶静态发酵法：在超净工作台中将在PDA上培养的新鲜内生真菌 LPS-1用直径6mm的灭菌打孔器打成菌饼，接种至100mL三角瓶中装入30 毫升麦精培养基中，培养温度25℃，培养7d天，摇培结束后过滤除去菌丝获 得发酵液120L。其中麦精培养基配方：麦精19.95g/L，蔗糖50g/L，硝酸钠7.5 g/L，七水硫酸镁3.561g/L，去离子水1L。
将获得的120L发酵液用乙酸乙酯进行萃取，萃取液减压浓缩得到浸膏， 在室内生物活性检测的指导下，分别用硅胶柱，凝胶柱，高效液相制备柱进行 化合物的分离纯化，最终获得315毫克3-吲哚甲酸(98％)和834毫克茉莉酸 (97％)。
实施例2：3-吲哚甲酸和茉莉酸对小麦白粉病活性测定
本实验中所用的小麦白粉病菌为强致病菌株E21，小麦为感病小麦品种“chanceller”，3-吲哚甲酸(98％)、茉莉酸(97％)来源内生菌LPS-1提取的活 性化合物。采用离体叶段法室内分别测定3-吲哚甲酸和茉莉酸对小麦白粉病菌 活性，将培养至1叶1心的小麦，第1叶剪成30mm长叶段，置于含50μg/ml 苯骈咪唑的0.5％的水琼脂平板上，每皿(直径60mm)摆放8片叶段。按照 2.5×10-4吐温20与发酵液充分混匀，在喷雾塔中施用，喷雾量为350ml/m2，同 时喷施含2.5×10-4吐温20的PDB溶液处理为阴性对照，喷施清水为空白对照， 自然晾干，24h后接种小麦白粉病菌分生孢子(接种量为103个分生孢子/平方 厘米)。然后放在17±1℃的培养室中培养，先避光12h，然后在24小时40W日 光灯照射下(培养室)培养。待空白对照充分发病后(7天)，调查每个处理的 每片叶的发病严重度。
防治效果＝(CK–T)/CK×100％
(CK为阴性对照平均严重度；T为处理平均严重度)
根据表1结果可以看出，3-吲哚甲酸系列浓度中2500mg/L对小麦白粉病菌 抑制率最高，但仅有4.41％，茉莉酸浓度在500mg/L时，基本可以完全抑制小 麦白粉病菌。
表1 3-吲哚甲酸、茉莉酸对小麦白粉病菌室内活性结果
实施例3：3-吲哚甲酸和茉莉酸混配对小麦白粉病菌的毒力测定
本实验中所用的小麦白粉病菌为强致病菌株E21，小麦为感病小麦品种“chanceller”，采用离体叶段法室内测定3-吲哚甲酸和茉莉酸不同比例的组合物 对靶标的毒力和互作增效系数。其方法为：将3-吲哚甲酸原药(98％)用甲醇 溶解成10000μg/mL母液，97％茉莉酸的原药用甲醇溶解成10000μg/mL母液， 均在4℃保存备用。将3-吲哚甲酸和茉莉酸按有效含量分别配制成1：9、2∶8、 3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8：2、9：1组合物、3-吲哚甲酸单剂、茉莉 酸单剂的系列浓度，采用离体叶段法测定各组合物对小麦白粉病的抑制率，计 算EC50值和增效系数。
平均抑制率(％)＝[(对照白粉病发病严重度-处理白粉病发病严重度)/对 照白粉病发病严重度×100％。采用DPS数据处理系统，计算出回归方程和EC50值。按Wadley法，计算增效系数(SR)。
根据增效系数(SR)评价药剂混用的联合作用类型，即SR＜0.5为拮抗作用， 0.5≤SR≤1.5为相加作用，SR＞1.5为增效作用。
SR＝EC50(Eth)/EC50(ob)，EC50(Eth)＝(a+b)/[(a/EC50A)+(b/EC50B)]。
其中，A、B分别为杀菌剂单剂，a、b为相应单剂在混剂中的比例，EC50(Eth) 为混剂EC50理论值，EC50(Eob)为混剂EC50实测值。
根据表2结果可以看出，当3-吲哚甲酸和茉莉酸的配比为1～9∶9～1时， 对小麦白粉病菌的EC50为9.00μg/ml～817.00μg/ml，增效系数为1.8～22.9。
表2 3-吲哚甲酸·茉莉酸室内配方筛选结果(强致病菌株E21)
实施4：3-吲哚甲酸和茉莉酸混配对小麦白粉病菌的作用机理
分别用3-吲哚甲酸:茉莉酸(2:8)、茉莉酸(97％)、3-吲哚甲酸(98％)处 理小麦叶片自然晾干，再接种新鲜的小麦白粉病菌，接种后8h、12h、24h、48h 采用台盼蓝染色法，显微观察每时期随机视野，分别观察100个分生孢子，3 次重复，统计孢子萌发率(萌发孢子数/调查总孢子数)、附着孢形成率(萌发 孢子附着孢形成数/调查萌发孢子总数)、孢畸形率(萌发孢子附着畸形数/调查 萌发孢子附着孢总数)、初生吸器形成率(附着孢形成初生吸器数/调查附着孢 总数)、次生吸器形成率(初生吸器形成次生吸器数/调查初生吸器总数)，计算 各药剂处理对白粉病菌侵染过程的影响，确定药剂对病原菌的作用机理。
根据表3结果可以看出，3-吲哚甲酸对小麦白粉病菌整个生长发育过程影 响不大；茉莉酸、3-吲哚甲酸和茉莉酸复配(2:8)，主要作用在附着孢和吸器形 成过程。其作用机理为施用杀菌剂组合物后，可能影响了白粉病菌附着孢、吸 器形成的关键基因表达发生改变，进而引起附着孢畸形、抑制吸器的形成，最 终导致小麦白粉病菌丧失致病力，达到防病的效果。
表3 3-吲哚甲酸和茉莉酸混配对小麦白粉病菌生长发育影响
实施例5：3-吲哚甲酸和茉莉酸混配防治小麦白粉病田间效果
试验于2019年3月26日和2020年3月25日。试验地点分别为湖北省黄 冈市外岭大道外岭村和黄冈市农科院小麦种植基地，试验对象为小麦白粉病。 设5个处理，喷施清水为对照，每一种处理设4次重复，一次重复为一个小区， 小区面积为25平方米，小区排列按照随机区组设计。小麦白粉病的调查按照 “《农药田间药效试验准则一》(GB/T17980.22-2000杀菌剂防治禾谷类白粉病)” 调查，在试验过程中，详细记录每天的气象资料。
两年田间药效试验结果表明，3-吲哚甲酸单剂对小麦白粉病基本没有防治 效果；茉莉酸单剂对小麦白粉病有一定的防治效果，防效在60％以上，而3-吲 哚甲酸：茉莉酸(2:8)对小麦白粉病有很好的防治效果，防效在80％以上，远 高于3-吲哚甲酸和茉莉酸单剂的防治效果，本发明的杀菌剂组合物将两者复配 后进行喷施，不仅有效的降低了发病率、病情指数，提高了防治效果，而且大 大降低了用药量，节省了大量的经济投入。
表4 3-吲哚甲酸和茉莉酸混配防治小麦白粉病田间药效试验
实施例6：3-吲哚甲酸和茉莉酸混配防治葡萄白粉病田间效果
试验于2019年7月17日和2020年8月4日。试验地点分别为湖北省巴东 县清太坪镇思阳坪和金水农科院葡萄基地，试验对象均为葡萄白粉病。设5种 喷施处理，喷施清水为对照，每一种处理设4次重复，一次重复为一个小区， 小区面积为30平方米，小区排列按照随机区组设计。葡萄白粉病的调查按照 “《农药田间药效试验准则》(NY/T1464.12-2007杀菌剂防治葡萄白粉病)”调查， 在试验过程中，详细记录每天的气象资料。
两年田间药效试验结果表明，3-吲哚甲酸单剂对葡萄白粉病基本没有防治 效果；茉莉酸单剂对葡萄白粉病有一定的防治效果，防效在60％左右，而3-吲 哚甲酸：茉莉酸(2:8)对葡萄白粉病有很好的防治效果，防效在80％左右，远 高于3-吲哚甲酸和茉莉酸单剂的防治效果，本发明的杀菌剂组合物将两者复配 后进行喷施，不仅有效的降低了发病率、病情指数，提高了防治效果，而且大 大降低了用药量，节省了大量的经济投入。
表5 3-吲哚甲酸和茉莉酸混配防治葡萄白粉病田间药效试验
实施例7：3-吲哚甲酸和茉莉酸混配防治黄瓜白粉病田间效果
试验于2019年9月29日和2020年10月5日。试验地点分别为武汉市蔬 菜科学研究所基地大棚和湖北省农业科学院鄂州基地，试验对象均为黄瓜白粉 病。设5种喷施处理，喷施清水为对照，每一种处理设4次重复，一次重复为 一个小区，小区面积为25平方米，小区排列按照随机区组设计。黄瓜白粉病的 调查按照“《农药田间药效试验准则一》GB/T17980.30-2000杀菌剂防治黄瓜白 粉病)”调查，在试验过程中，详细记录每天的气象资料。
两年田间药效试验结果表明，3-吲哚甲酸单剂对黄瓜白粉病基本没有防治 效果；茉莉酸单剂对黄瓜白粉病有一定的防治效果，防效在60％以上，而3-吲 哚甲酸：茉莉酸(2:8)对黄瓜白粉病有很好的防治效果，防效在80％以上，远 高于3-吲哚甲酸和茉莉酸单剂的防治效果，本发明的杀菌剂组合物将两者复配 后进行喷施，不仅有效的降低了发病率、病情指数，提高了防治效果，而且大 大降低了用药量，节省了大量的经济投入。
表6 3-吲哚甲酸和茉莉酸混配防治黄瓜白粉病田间药效试验
实施例8：3-吲哚甲酸和茉莉酸混配防治草莓白粉病田间效果
试验于2019年9月29日和2020年10月5日。试验地点分别为武汉市黄 陂区武湖农场沙口分场草莓园和湖北省农科院新科源大棚，试验对象均为草莓 白粉病。设5种喷施处理，喷施清水为对照，每一种处理设4次重复，一次重 复为一个小区，小区面积为20平方米，小区排列按照随机区组设计。草莓白粉 病的调查按照“《农药田间药效试验准则二》GB/T17980.30-2004杀菌剂防治草 莓白粉病)”调查，在试验过程中，详细记录每天的气象资料。
两年田间药效试验结果表明，3-吲哚甲酸单剂对草莓白粉病基本没有防治 效果；茉莉酸单剂对草莓白粉病有一定的防治效果，防效在50％以上，而3-吲 哚甲酸：茉莉酸(2:8)对草莓白粉病有很好的防治效果，防效在75％以上，远 高于3-吲哚甲酸和茉莉酸单剂的防治效果，本发明的杀菌剂组合物将两者复配 后进行喷施，不仅有效的降低了发病率、病情指数，提高了防治效果，而且大 大降低了用药量，节省了大量的经济投入。
表7 3-吲哚甲酸和茉莉酸混配防治草莓白粉病田间药效试验
Claims (6)
1.一种防治白粉病的杀菌组合物，其特征在于：该杀菌组合物由3-吲哚甲酸、茉莉酸组成，所述3-吲哚甲酸与茉莉酸的质量比为1:9-9:1。
2.如权利要求1所述的一种防治白粉病的杀菌组合物，其特征在于：该杀菌组合物中3-吲哚甲酸与茉莉酸的质量比为2∶8。
3.如权利要求1所述的一种防治白粉病的杀菌组合物，其特征在于：所述杀菌组合物可用于白粉病的防治。
4.如权利要求3所述的一种防治白粉病的杀菌组合物，其特征在于：所述白粉病为小麦白粉病、葡萄白粉病、黄瓜白粉病、草莓白粉病。
5.如权利要求1所述的一种防治白粉病的杀菌组合物，其特征在于：所述3-吲哚甲酸、茉莉酸可来源于天然产物的提取纯化或人工化学合成。
6.如权利要求5所述的一种防治白粉病的杀菌组合物，其特征在于：所述的天然产物的提取纯化包含但不限于用植物内生真菌Lasiodiplodia pseudotheobromae发酵后提取纯化。
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