CN102204511A - 一种高效诱导结球甘蓝双单倍体的方法 - Google Patents
一种高效诱导结球甘蓝双单倍体的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了属于生物育种技术领域的一种高效诱导结球甘蓝双单倍体的方法。该方法涉及园艺作物结球甘蓝的小孢子植株再生及其双单倍体的诱导技术改进，包括以下步骤：(1)花蕾的选取和小孢子的分离；(2)诱导加倍成胚培养；(3)分化成苗与继代培养；(4)壮苗生根培养。本发明可大批量规模化生产结球甘蓝双单倍体，为育种提供大量的新基因型纯系。该方法受生长环境和基因型的影响小，出胚成胚率高，加倍效果好，成苗植株生长健壮，继代培养频次减少，生根后苗壮根粗，大田移栽成活率高。
Description
技术领域
本发明涉及植物的双单倍体(DH)诱导方法，特别是涉及园艺作物结球甘蓝小孢子植株再生及其双单倍体的高效诱导方法及其和培养基。
背景技术
结球甘蓝是一种栽培面积大，适应性广、营养价值高，深受人民喜爱的食用蔬菜，但由于原产于地中海沿岸，国内种质资源匮乏，而国外表现优势的品种及亲本资源又难以获得，一直制约着我国甘蓝优良品种选育工作的开展，若通过双单倍体育种则必然为优良种质资源的获得和新品种培育创建了一种新的有效途径，也必然会大大提高育种选择效率，缩小育种群体规模，缩短育种年限。同时，利用双单倍体培养的变异能够创造许多抗病、耐盐、抗旱、抗虫等优良种质资源；该技术又可以和转基因技术、分子标记技术相结合，能有效推进相关研究和分子育种技术，具有广阔的应用前景。
但我国的结球甘蓝小孢子培养技术尚不够成熟，大多处在对近缘种培养技术的消化吸收及其有限改进上，效果欠佳，要么受基因型的限制，常不能出胚，或出胚量很少；要么成胚成苗过程易玻璃化，苗小根弱，移栽成活率低，远远不能满足大规模产胚并高效育种的要求。
发明内容
本发明的目的在于克服上述缺点，提供一种高效诱导结球甘蓝双单倍体的方法。该方法涉及园艺作物结球甘蓝的小孢子植株再生及其双单倍体的诱导技术改进。
一种高效诱导结球甘蓝双单倍体的方法，采用的技术方案和具体操作步骤如下：
(1)花蕾的选取和小孢子的分离
选取处于单核靠边期的花蕾，将其消毒处理后在分离培养基中进行无菌破碎，离心分离后获得小孢子，所述分离培养基为含蔗糖浓度为140-170mg/L的B5液体培养基；
(2)诱导加倍成胚培养
对分离后的小孢子进行诱导加倍培养，首先在启动培养基中同步进行启动培养和加倍诱导，30-35℃的温度下暗培养24-72小时，所述启动培养基为含有0.5-100ppm秋水仙素加倍剂且蔗糖浓度为150-180g/L的NLN液体培养基；将小孢子膨大率达70％的样品离心，弃上清液后添加成胚诱导培养基悬浮，其中，小孢子的悬浮密度为5×104-5×105个/mL，然后进行成胚诱导暗培养，培养温度为22-25℃，所述成胚诱导培养基为含有0.01-1ppm的6-苄氨基嘌呤和/或0.01-0.5ppm的α-萘乙酸且蔗糖浓度为130-150g/L的NLN液体培养基；
(3)分化成苗与继代培养
A、分化成苗阶段：待胚状体至肉眼可见后将其转到温度为20-28℃、转速为60rpm的摇床上旋转培养1-3周，然后将胚状体接种于分化培养基上进行分化成苗，所述的分化培养基为含0.01-1ppm的6-苄氨基嘌呤和/或0.01-0.5ppm的α-萘乙酸，9-15g/L琼脂的B5固体培养基；B、继代培养阶段：待成正常试管苗后，再转接至继代培养基上进行继代壮苗培养，所述的继代培养基为含0.01-0.5ppm多效唑的B5固体培养基；分化成苗和继代培养两阶段的培养条件为：温度22-25℃，光周期12-20h/d，光照强度1500-4000LUX；
(4)壮苗生根培养
待胚状体分化出茎叶，并成壮苗后，将其移至生根培养基上进行壮苗生根培养，直至苗壮根粗后移栽大田，所述生根培养基为含0.01-0.5ppm多效唑、0.01-0.5ppm α-萘乙酸的MS固体培养基。
步骤(1)中所述花蕾大小为3.5-5.5mm，且小孢子发育时期在单核靠边期的比例达70％以上。
所述成胚诱导培养基中优选含有0.1-0.2ppm的6-苄氨基嘌呤和0.01-0.02ppm的α-萘乙酸。
所述分化培养基中优选含有0.1-0.2ppm的6-苄氨基嘌呤和0.01-0.02ppm的α-萘乙酸。
本方法适用于多种基因型，如Q2、Q4、Q5、Q8、HP63和HW06，效果均较好。
本发明的有益效果：(1)基因型适应性广，受植物生长环境影响小，可以在人工气候箱、玻璃温室、大田等多种生长环境下对各种基因型材料进行诱导培养，出胚率高，可大批量规模化生产双单胚体；(2)小孢子胚诱导和加倍可一次实现，时间短、费用低、加倍效率高，可直接获得双单倍体频率达50％-90％以上，克服了根、芽加倍效率低，处理繁琐，药品消耗多、有毒污染大等诸多弊端；同时在启动培养基中添加加倍剂不仅使加倍诱导一次完成，而且大大提高了小孢子的膨大率，并使出胚率成倍提高；(3)能有效消除分化成苗过程的玻璃化问题；苗子表现绿壮，个体干重增加，抗逆能力增强，成株率高；同时生根后苗壮根粗，大田移栽成活率高；另外还减少了继代培养频次，节约了成本，降低了因频繁继代所产生的不可避免的污染，减少了DH植株的无谓损失。
附图说明
图1是诱导加倍成胚培养后NLN液体培养中的胚状体；
图2是胚状体转至B5固体分化培养基上分化显绿图；
图3是胚状体在B5固体分化培养基上培养30天后形成的叶、茎、芽图；
图4是壮苗生根图。
具体实施方式
实施例1
本实施例中所用各种培养基的配方见表1。
本实施例选用了基因型为Q2、Q4、Q5、Q8、HP63和HW06的几种结球甘蓝作为原材料，按照如下步骤进行结球甘蓝双单倍体的诱导和培养，同时设立对照组，对照组中启动培养基中无秋水仙素加倍剂，继代和生根培养基中无多效唑：
(1)花蕾的选取和小孢子的分离
待生长在人工气候箱、玻璃温室和大田自然环境下的结球甘蓝至初花期，结合镜检观察花蕾大小在3.5-5.5mm范围，确定小孢子发育时期在单核靠边期的比例达70％以上时，选取对应花蕾装入钢篮中，用70％酒精灭菌30秒后，然后用0.1％升汞消毒8-10分钟，无菌水清洗3次，在分离培养基中捣碎，在无菌条件下将游离出的小孢子离心清洗。
(2)诱导加倍成胚培养
首先将小孢子在启动培养基中同步进行启动培养和加倍诱导暗培养，温度：32-33℃，时长：36-48小时；镜检，对小孢子膨大率达到70％以上的样品进行离心，去上清，新添成胚诱导培养基悬浮，其中，小孢子的悬浮密度为10×104个/mL，暗培养两周左右，培养温度为22-25℃；
(3)分化成苗培养
待胚状体至肉眼可见后将其转到温度为25℃、转速为60rpm的摇床上旋转培养1-2周，胚状体见图1，然后将胚状体接种于分化培养基上进行分化成苗，培养温度为22-25℃，光周期为16-20h/d，光照强度为3500-4000LUX，分化现绿见图2。
(4)继代壮苗生根培养
温度在22-25℃、光周期16-20h/d、光强3500-4000LUX的环境条件下，待胚分化出茎叶、植株(见图3)，将植株移至继代培养基进行继代壮苗；再在生根培养基上，进行生根壮苗培养，生根后的植株见图4，苗壮根粗后移栽大田。
按照该实施例高效诱导的各基因型的结球甘蓝双单倍体的出胚数、成苗数、继代次数、移栽成活数和加倍株数见表2。
由表2可见，本方法基因型适应性广，对于本实施例中的6种基因型效果均较好，加倍效率、出胚率、移栽成活数有大幅度提高，继代次数明显减少。
表1实施例1中各培养基的配方
表2 2008-2009年各基因型诱导状况统计表
注：A为对照处理，与本发明的高效诱导技术的区别在于，启动培养基中无秋水仙素加倍剂，继代和生根培养基中无多效唑；B为本发明的高效诱导技术。
实施例2 在分离、启动和成胚诱导培养过程，各培养基中的蔗糖浓度确定实验
在2007年4月中旬花期，于大田取20份结球甘蓝单核靠边期小孢子比例超过70％的花蕾(蕾大小在3.5-5.5mm间)，装入钢篮中消毒灭菌后，在蔗糖浓度为150g/L的B5液体培养基中破碎洗涤分离小孢子，分离好的小孢子分别在蔗糖浓度为130、140、150、160、170和180g/L的NLN液体培养基中进行33℃高温培养，2天后，观察记录小孢子膨大情况，见表3。
表3启动培养过程NLN液体培养基中不同的蔗糖浓度对小孢子的发育膨大影响
| 蔗糖浓度(g/L) | 取试材料数(份) | 每材料培养皿数 | 小孢子可达70％以上膨大的材料数(份) |
| 130 | 13 | 12 | 1 |
| 140 | 15 | 12 | 3 |
| 150 | 18 | 12 | 13 |
| 160 | 18 | 12 | 17 |
| 170 | 18 | 12 | 17 |
| 180 | 15 | 12 | 8 |
从表3可以看出，启动培养阶段NLN液体培养基中不同的蔗糖浓度对应不同的小孢子发育膨大状况，其中在150-180g/L浓度范围大多数材料都能膨大，160-170g/L效果更佳。同时通过对小孢子分离阶段B5液体培养基中130-180g/L的蔗糖浓度范围对分离启动培养效果的比较考察，表明B5液体分离培养基在140-170g/L蔗糖浓度范围皆可获得较为理想的后续培养效果，150g/L效果最优。
然后，将经蔗糖浓度为160g/L的NLN液体培养基启动培养的小孢子膨大率达70％以上的材料进行成胚诱导暗培养两周左右，培养温度为22-25℃，其中，实验中诱导成胚的NLN液体培养基中的蔗糖浓度和出胚效果见表4。
表4诱导成胚过程NLN液体培养基中不同蔗糖浓度对材料成胚的影响
| 培养材料数 | 启动培养基蔗糖浓度g/L | 诱导成胚培养基蔗糖浓度g/L | 成胚材料数 |
| 10 | 160 | 130 | 6 |
| 10 | 160 | 140 | 10 |
| 10 | 160 | 150 | 9 |
| 10 | 160 | 160 | 2 |
| 9 | 160 | 170 | 0 |
| 10 | 160 | 180 | 0 |
由表4可见，诱导成胚阶段NLN培养基中蔗糖浓度比启动阶段稍低，130-150g/L的蔗糖浓度是较适浓度范围，同时实验结果表明不同基因型的最适浓度因材料有一定差异，有高有低，但大多数基因型以140g/L更适。
实施例3在启动培养阶段利用秋水仙素同步加倍诱导的适宜浓度和处理时长实验
2007、2008年4月花期大田取蕾，用150g/L蔗糖浓度的B5液体培养基分离清洗，160g/L蔗糖浓度NLN液体培养基启动诱导，140g/L蔗糖浓度的NLN液体培养基成胚诱导培养，加倍诱导是在启动培养阶段的NLN液体培养基中加入不同浓度的秋水仙素，处理一定时间(48小时)后，调查统计膨大率和最终的成胚加倍情况，结果见表5。
表5不同浓度秋水仙素处理48小时的成胚加倍情况
| 秋水仙素浓度(ppm) | 培养材料数(份) | 每材料培养皿数 | 膨大率达70％材料数 | 成胚材料数(份) | 成苗后加倍率(％) |
| 0 | 10 | 12 | 8 | 5 | 1 |
| 1 | 11 | 12 | 9 | 7 | 14 |
| 10 | 10 | 12 | 9 | 9 | 37 |
| 20 | 10 | 12 | 10 | 10 | 83 |
| 30 | 10 | 12 | 10 | 10 | 85 |
| 50 | 11 | 12 | 11 | 9 | 90 |
| 80 | 10 | 12 | 10 | 5 | 91 |
| 100 | 10 | 12 | 10 | 3 | 94 |
实验表明，秋水仙素在较宽的浓度范围，皆可不同程度实现成胚加倍，最佳浓度大小与基因型相关，一些材料需要加倍浓度大，一些较小；处理时长以24-72小时为宜，浓度大，时间可稍短，反之稍长，但时间不宜太长，否则会较大程度影响后续成胚。
实施例4在诱导成胚和分化成苗阶段激素添加实验
按照实施例1的方法，在诱导成胚和分化成苗使用的培养基中加入不用浓度的激素NAA和6-BA，每组的具体浓度见表6，实验结果见表6。结果表明合适的激素条件可不同程度增加出胚数、提高正常子叶胚比率以及一次成苗数，对壮苗生根等也具有不可替代的作用。两种激素既可单独使用，其使用浓度范围NAA：0.01-0.5ppm，6-BA：0.01-1.0ppm；也可配合使用，配合使用效果更理想，配合使用时各自的浓度范围为NAA 0.01-0.02ppm、6-BA 0.1-0.2ppm，效果见表6、7。
表6不同配比激素在诱导成胚阶段对成胚的影响
| NAA浓度(ppm) | 6-BA浓度(ppm) | 取试材料数(份) | 出胚材料数(份) | 子叶胚所占比率(％) |
| 0 | 0 | 20 | 17 | 30 |
| 0.01 | 0.1 | 20 | 18 | 82 |
| 0.02 | 0.2 | 20 | 18 | 61 |
| 0.05 | 0.5 | 20 | 5 | 11 |
表7在固体分化培养基中使用激素配比对一次成苗的影响
| NAA浓度(ppm) | 6-BA浓度(ppm) | 转接子叶胚数 | 一次成苗数 |
| 0 | 0 | 330 | 128 |
| 0.01 | 0.1 | 265 | 162 |
| 0.02 | 0.2 | 809 | 704 |
| 0.05 | 0.5 | 111 | 11 |
实施例5在继代、壮苗生根培养基中多效唑有效浓度的确定实验
按照实施例1的方法和步骤，在继代和壮苗生根培养基中，添加不同浓度的多效唑，见表8、9。
表8继代固体培养基中添加多效唑对株高控制和继代次数的影响
| 多效唑浓度(ppm) | 处理苗数 | 平均株高(cm) | 试管苗生长天数(天) | 继代处理次数 |
| 0 | 190 | 12 | 90 | 4 |
| 0.05 | 171 | 10.2 | 90 | 3 |
| 0.1 | 183 | 8.3 | 90 | 2 |
| 0.2 | 167 | 7.1 | 90 | 1 |
| 0.5 | 177 | 4.1 | 90 | 1 |
表9壮苗生根固体培养基中添加多效唑对株高控制和成活率的影响
| 多效唑浓度(ppm) | 总苗数 | 平均株高(cm) | 成活总株数 | 成活率(％) |
| 0 | 175 | 12 | 104 | 59.43 |
| 0.05 | 108 | 9.5 | 73 | 67.59 |
| 0.1 | 113 | 8.2 | 92 | 81.42 |
| 0.2 | 147 | 6.5 | 144 | 97.96 |
| 0.5 | 107 | 3.6 | 101 | 94.39 |
在继代、生根固体培养中添加适当浓度的多效唑，可有效控制试管苗的株高，减少继代次数，并且可使试管苗根粗、叶厚色深，在锻炼移栽过程水分散失少，抗逆能力显著增强，移栽成活率高。
Claims (4)
1.一种高效诱导结球甘蓝双单倍体的方法，其特征在于，按照以下步骤进行：
(1)花蕾的选取和小孢子的分离
选取处于单核靠边期的花蕾，将其消毒处理后在分离培养基中进行无菌破碎，离心分离后获得小孢子，所述分离培养基为含蔗糖浓度为140-170mg/L的B5液体培养基；
(2)诱导加倍成胚培养
对分离后的小孢子进行诱导加倍培养，首先在启动培养基中同步进行启动培养和加倍诱导，30-35℃的温度下暗培养24-72小时，所述启动培养基为含有0.5-100ppm秋水仙素加倍剂且蔗糖浓度为150-180g/L的NLN液体培养基；将小孢子膨大率达70％的样品离心，弃上清液后添加成胚诱导培养基悬浮，其中，小孢子的悬浮密度为5×104-5×105个/mL，然后进行成胚诱导暗培养，培养温度为22-25℃，所述成胚诱导培养基为含有0.01-1ppm的6-苄氨基嘌呤和/或0.01-0.5ppm的α-萘乙酸且蔗糖浓度为130-150g/L的NLN液体培养基；
(3)分化成苗与继代培养
A、分化成苗阶段：待胚状体至肉眼可见后将其转到温度为20-28℃、转速为60rpm的摇床上旋转培养1-3周，然后将胚状体接种于分化培养基上进行分化成苗，所述的分化培养基为含0.01-1ppm的6-苄氨基嘌呤和/或0.01-0.5ppm的α-萘乙酸，9-15g/L琼脂的B5固体培养基；B、继代培养阶段：待成正常试管苗后，再转接至继代培养基上进行继代壮苗培养，所述的继代培养基为含0.01-0.5ppm多效唑的B5固体培养基；分化成苗和继代培养两阶段的培养条件为：温度22-25℃，光周期12-20h/d，光照强度1500-4000LUX；
(4)壮苗生根培养
待胚状体分化出茎叶，并成壮苗后，将其移至生根培养基上进行壮苗生根培养，直至苗壮根粗后移栽大田，所述生根培养基为含0.01-0.5ppm多效唑、0.01-0.5ppmα-萘乙酸的MS固体培养基。
2.根据权利要求1所述的高效诱导结球甘蓝双单倍体的方法，其特征在于，步骤(1)中所述花蕾大小为3.5-5.5mm。
3.根据权利要求1所述的高效诱导结球甘蓝双单倍体的方法，其特征在于，所述成胚诱导培养基中含有0.1-0.2ppm的6-苄氨基嘌呤和0.01-0.02ppm的α-萘乙酸。
4.根据权利要求1所述的高效诱导结球甘蓝双单倍体的方法，其特征在于，所述分化培养基中含有0.1-0.2ppm的6-苄氨基嘌呤和0.01-0.02ppm的α-萘乙酸。
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