CN100588705C - 一种培育茯苓的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种培育茯苓的方法，属于微生物培育方法的技术领域，采用菌种繁殖法，选取优良苓种，进行母种保存和培养，在此基础上进行原种和栽培种的制作和扩繁；母种的培养包括母种的分离和在培养基上的接种培养，原种的制作为将母种接种在培养基上进行培养，栽培种的制作为在培养基上进行发菌培养；本发明提供的培育茯苓的方法，可以培育出茯苓菌丝和菌核，在母种、原种、栽培种的培养过程中，其培养基由人工配制而成，不需要天然松木，因而不用采伐树木，可用于大批量生产，种植成本低。
Description
技术领域
本发明属于微生物的培育方法，尤其是涉及一种培育茯苓的方法。
背景技术
茯苓为一种多年生腐生真菌，属于真菌门，具有药用价值，是一味常用大宗中药。野生茯苓通常在海拔500米以上，生长在地下20厘米左右的腐朽的松树根或松树段上。茯苓的生长发育可分为两个阶段，即菌丝生长阶段和菌核形成阶段，菌丝生长阶段主要是菌丝从松木中吸收水分和营养，繁殖大量的营养菌，当菌丝越积越多时就成为菌核，到形成菌核阶段时栽培上称为结苓阶段。目前人工培育茯苓的方法主要有干段木栽培和松树根栽培，段木栽培法以松木为栽培料，选择直径12厘米以上不成材的松树砍倒，在农历12月份砍下松树，去树杈，削去形成层的外皮，露出木质部，削皮留筋，锯成60～80厘米长的木段，堆码后干燥，约40天后，无松脂分泌，木心干燥后即可接种。松木段下窖的时间在春季3-4月份，下窖选择晴天，每窖下松木段15-20公斤。接种方法目前有三种较普遍采用，一是菌丝引种，将栽培菌种内长满菌丝的松木块取出，顺段木形成的“V”缝，一块接一块平铺在上面，再撒上木屑等料种，然后将一根段木削皮处向下压在松木块上，使其呈“品”字形。二是老段木引种，选黄白色、筋皮下有明显菌丝且有小茯苓又有特殊香气的段木作种引。三是鲜茯苓引种，选1-2代种苓，种苓皮色紫红，肉色白，浆气足，质结实，个重2-3公斤的鲜苓作种引。将种苓切成小块或小片放于段木之间，每一窖需500克左右鲜苓。接好种后，立即覆土，厚7-10厘米，使窖顶呈龟背形，以利排水。用松树段木栽培茯苓要消耗大量木材。松树根栽培法为首先挖开根周围的土，露出松根，将侧根刮开皮槽，曝晒数天，晒干后即可接种。于5-8月间在松根开槽处接放菌种，用树叶将其盖好，覆土压实即可。接后每10天检查1次，发现病虫害和白蚁要及时防治。9～12月茯苓膨大生长期要及时培土。第二年4-6月可采收，此方法虽能节约大量材耗但产量低，不能满足需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可取代现有茯苓栽培种植用材，不需采伐树木，易于推广，产量高的培育茯苓的方法。
本发明的技术方案在于，培育茯苓的方法采用菌种繁殖法。首先选取优良苓种，其标准为品质好，无病虫害，个体较大，近球形，质地坚，皮红，肉白，浆汁多，气味浓郁的茯苓菌核；然后进行母种保存和培养；最后在此基础上进行原种和栽培种的制作和扩繁。其中母种的培养包括母种的分离和在培养基上的接种培养，原种的制作是将母种接种在培养基上进行培养，栽培种的制作是在培养基上进行发菌培养，具体工艺如下：
1、母种的分离和培养
母种分离方法为：用无菌水将种苓冲洗数次，再用纱布揩干，最后用75％酒精擦洗种苓外皮，并用0.1％升汞擦洗干净后，进行紫外线灭菌；在无菌条件下，用无菌刀将种苓剖开，用酒精火焰灭菌后的接种铲从种苓较深部位取出黄豆大小的苓肉，接入试管斜面上；
配制母种培养基，其组分为：马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂20克，水1000毫升，另加0.5克酵母粉，0.5克蛋白胨，PH值为5.5-6.5；
母种的培养过程为：在温度28-32℃，培养2-3天，长出菌丝后，认定无杂菌即可继续培养至菌丝长满斜面。
2、原种的制作
原种制作中用的培养基其配方为：松木屑76％，麸皮20％，糖2％，石膏粉1％，过磷酸钙1％，含水量50％-55％，pH5.5-6.5；
其接种培养过程为：在无菌条件下，按常规将母种接入上述配制好的培养基瓶中，置28-32℃温室中培养，经25-30天，菌丝长满瓶即为原种。
3、栽培种的制作
栽培种制作中所需的培养基配方为：松木片(2厘米×10厘米×0.3厘米)65％，松木屑10％，麸皮20％，糖2％，石膏粉1％，过磷酸钙1％，尿素0.2％；
其发菌培养过程为：将上述配料按常规配制后装入15厘米×18厘米×0.005丝米的聚乙烯塑料袋中，经灭菌接种后置28-32℃下培养，经25-30天，当菌丝长满并深入至木片内后即可。
本发明提供的培育茯苓的方法，能培育出茯苓菌丝和茯苓菌核；由于在母种、原种、栽培种的培养过程中，其培养基由人工配制而成，不需要天然松木，因而不用采伐树木，可用于大批量生产，种植成本低。经试验，生产出的茯苓其外形与现有商品茯苓一致，显微构造基本一致，多糖提取率相近，完全可替代商品茯苓入药。这种茯苓种植用材代用品的开发，既能保证中医临床用药，又有效地保护了森林资源，不失为中医药行业生产类似产品的一种行之有效的方法。
具体实施方式
菌种培养的具体工艺如下：
1、选取优良苓种
其标准为品质好，无病虫害，个体较大，近球形，质地坚，皮红，肉白，浆汁多，气味浓郁的茯苓菌核。
2、母种的分离和培养
母种分离方法为：用无菌水将种苓冲洗数次，再用纱布揩干，最后用75％酒精擦洗种苓外皮，并用0.1％升汞擦洗干净后，进行紫外线灭菌；在无菌条件下，用无菌刀将种苓剖开，用酒精火焰灭菌后的接种铲从种苓较深部位取出黄豆大小的苓肉，接入试管斜面上；
母种培养基的配方为：马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂20克，水1000毫升，另加0.5克酵母粉，0.5克蛋白胨，PH值为5.5-6.5；
母种的培养过程为：在温度28-32℃，培养2-3天，长出菌丝后，认定无杂菌即可继续培养至菌丝长满斜面。
3、原种的制作
原种制作中用的培养基的配方为：松木屑76％，麸皮20％，糖2％，石膏粉1％，过磷酸钙1％，含水量50％-55％，pH5.5-6.5；
其接种培养过程为：在无菌条件下，按常规将母种接入上述配制好的培养基瓶中，置28-32℃温室中培养，经25-30天，菌丝长满瓶即为原种。
4、栽培种的制作
栽培种制作中所需的培养基配方为：松木片(2厘米×10厘米×0.3厘米)65％，松木屑10％，麸皮20％，糖2％，石膏粉1％，过磷酸钙1％，尿素0.2％；
其发菌培养过程为：将上述配料按常规配制后装入15厘米×18厘米×0.005丝米的聚乙烯塑料袋中，经灭菌接种后置28-32℃下培养，经25-30天，当菌丝长满并深入至木片内后即可。
茯苓菌种在松枝、木屑瓶内菌丝生长情况及试验数据如下：
2003年5月22日，将直径1厘米左右小松枝截短至15厘米，木屑分别浸泡在营养液中，待浸透后捞出，分别放入瓶中，高压消毒后，5月30日接种茯苓菌种，接种两天后菌丝开始生长，6月20日已形成菌索，8月9日已形成6×3厘米不等的白色块状物，其质地致密，表面呈粉状。菌丝生长情况如下表：
表1茯苓菌丝在瓶内生长情况表
| 菌丝生长 | 松枝瓶数 | 木屑瓶数 | 松枝瓶数(％) | 木屑瓶数(％) |
| 菌丝呈块状 | 36 | 6 | 22.64 | 9.09 |
| 菌丝良好 | 93 | 51 | 58.49 | 77.27 |
| 有菌丝 | 11 | 5 | 6.91 | 7.58 |
| 无菌丝 | 19 | 4 | 11.95 | 6.06 |
| 总数 | 159 | 66 |
显微比较研究：
商品茯苓(购于成都市药材公司)，由茯苓成熟菌核分离得到茯苓菌丝为母种(琼脂、马铃薯等)，由茯苓母种扩繁得到的茯苓菌丝为原种(木屑等)，由茯苓原种扩大培养得到茯苓菌丝为茯苓栽培种(即新配方生长的茯苓菌丝、菌核)。
1、商品茯苓的显微特征
商品茯苓的粉末用水装片，在显微镜下可观察到无色不规则的颗粒状团块和分支状团块；用5％的NaOH溶液装片，可见团块溶化，露出菌丝，菌丝细长，稍弯曲，有分支，呈无色或淡棕色。
2、茯苓菌丝母种的显微特征
茯苓菌丝母种的粉末，用水装片和5％的NaOH溶液装片观察到菌丝，菌丝细长，稍弯曲，有分支，呈无色或淡棕色。
3、茯苓原种菌丝的显微特征
茯苓菌丝原种的粉末，用水装片时，可见到分支状团块，也可见到少量的菌丝；用5％的NaOH溶液装片时，只能见到菌丝，菌丝细长，稍弯曲，有分支，呈无色或淡棕色。
4、新配方生长的茯苓菌丝、菌核的显微特征
同上方法装片只能见到菌丝，菌丝细长，稍弯曲，有分支，呈无色或淡棕色。与商品茯苓的显微特征基本一致。
提取工艺的确定：
茯苓水溶性多糖提取工艺的确定：选用复合方法提取茯苓水溶性多糖。即将茯苓粉末(过40目筛)适量，用乙酸乙酯、丙酮于索氏提取器分别提取4小时，药渣加入催化酶酶解，于60-70℃浸泡40分钟，再依次用5倍量、3倍量、2倍量的沸水提取1小时。合并水提液，滤过，滤液浓缩至1/10，用Severge法除蛋白。上清液加入三倍量的乙醇沉淀多糖，冷藏12小时，离心，收集沉淀，低温干燥，即得。
茯苓碱溶性多糖提取工艺的确定：茯苓碱溶性多糖含量较高，提取方法相对简单，所得提取率较稳定。即将水提后的药渣用稀NaOH溶液提取，碱提液离心，所得上清液以10％的醋酸中和，3倍量乙醇沉淀，再提纯即得。综合考虑了生产可行性及经济性，经反复试验后确定稀NaOH溶液用量为5倍量，提取2次，每次4小时。
茯苓多糖的提取定量实验：
取低温烘干后的商品茯苓、母种、原种，新配方生长的茯苓菌丝、菌核适量精密称定，按上述方法提取多糖，结果如下表：
表2茯苓多糖提取率
茯苓多糖含量测定：
采用苯酚-硫酸法，对商品茯苓、本发明新配方生长的茯苓菌丝和菌核、茯苓菌丝母种、茯苓菌丝原种进行茯苓多糖含量测定。测定结果如下：
表3茯苓多糖含量测定结果
由上可见，该发明新配方生长的茯苓菌丝、菌核与商品茯苓比较，多糖提取率相近，可代替商品茯苓入药，并且该发明新配方生长的茯苓菌丝、菌核的培育成本低，可以大批量生产。
Claims (1)
1、一种培育茯苓的方法，其特征在于该方法包括选取优良苓种、母种保存和培养、在此基础上进行原种和栽培种的制作和扩繁，具体工艺如下：
(1)母种的培养
母种分离方法为：用无菌水将种苓冲洗数次，再用纱布揩干，最后用75％酒精擦洗种苓外皮，并用0.1％升汞擦洗干净后，进行紫外线灭菌；在无菌条件下，用无菌刀将种苓剖开，用酒精火焰灭菌后的接种铲从种苓较深部位取出黄豆大小的苓肉，接入试管斜面上；
母种培养基的配制为：马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂20克，水1000毫升，0.5克酵母粉，0.5克蛋白胨，pH5.5-6.5；
母种培养过程为：在温度28-32℃，培养2-3天，长出菌丝后，认定无杂菌即可继续培养至菌丝长满斜面；
(2)原种的制作
原种培养基的配制为：松木屑76％，麸皮20％，糖2％，石膏粉1％，过磷酸钙1％，含水量50％-55％，pH5.5-6.5；
原种接种培养过程为：在无菌条件下，按常规将母种接入上述配制好的培养基瓶中，置28-32℃温室中培养，经25-30天，菌丝长满瓶即为原种；
(3)栽培种的制作
栽培种培养基的配方为：形状为2厘米×10厘米×0.3厘米的松木片65％，松木屑10％，麸皮20％，糖2％，石膏粉1％，过磷酸钙1％，尿素0.2％；
栽培种发菌培养过程为：将上述配料按常规配制后装入15厘米×18厘米×0.005丝米的聚乙烯塑料袋中，经灭菌接种后置28-32℃下培养，经25-30天，当菌丝长满并深入至木片内后即可。
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