CN1732761A - 一种培育茯苓的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种培育茯苓的方法,属于微生物培育方法的技术领域,采用菌种繁殖法,选取优良苓种,进行母种保存和培养,在此基础上进行原种和栽培种的制作和扩繁;母种的培养包括母种的分离和在培养基上的接种培养,原种的制作为将母种接种在培养基上进行培养,栽培种的制作为在培养基上进行发菌培养;本发明提供的培育茯苓的方法,可以培育出茯苓菌丝和菌核,在母种、原种、栽培种的培养过程中,其培养基由人工配制而成,不需要天然松木,因而不用采伐树木,可用于大批量生产,种植成本低。

Description

一种培育茯苓的方法
技术领域
本发明属于微生物的培育方法,尤其是涉及一种培育茯苓的方法。
背景技术
茯苓为一种多年生腐生真菌,属于真菌门,具有药用价值,是一味常用大宗中药。野生茯苓通常在海拔500米以上,生长在地下20厘米左右的腐朽的松树根或松树段上。茯苓的生长发育可分为两个阶段,即菌丝生长阶段和菌核形成阶段,菌丝生长阶段主要是菌丝从松木中吸收水分和营养,繁殖大量的营养菌,当菌丝越积越多时就成为菌核,到形成菌核阶段时栽培上称为结苓阶段。目前人工培育茯苓的方法主要有干段木栽培和松树根栽培,段木栽培法以松木为栽培料,选择直径12厘米以上不成材的松树砍倒,在农历12月份砍下松树,去树杈,削去形成层的外皮,露出木质部,削皮留筋,锯成60~80厘米长的木段,堆码后干燥,约40天后,无松脂分泌,木心干燥后即可接种。松木段下窖的时间在春季3-4月份,下窖选择晴天,每窖下松木段15-20公斤。接种方法目前有三种较普遍采用,一是菌丝引种,将栽培菌种内长满菌丝的松木块取出,顺段木形成的“V”缝,一块接一块平铺在上面,再撒上木屑等料种,然后将一根段木削皮处向下压在松木块上,使其呈“品”字形。二是老段木引种,选黄白色、筋皮下有明显菌丝且有小茯苓又有特殊香气的段木作种引。三是鲜茯苓引种,选1-2代种苓,种苓皮色紫红,肉色白,浆气足,质结实,个重2-3公斤的鲜苓作种引。将种苓切成小块或小片放于段木之间,每一窖需500克左右鲜苓。接好种后,立即覆土,厚7-10厘米,使窖顶呈龟背形,以利排水。用松树段木栽培茯苓要消耗大量木材。松树根栽培法为首先挖开根周围的土,露出松根,将侧根刮开皮槽,曝晒数天,晒干后即可接种。于5-8月间在松根开槽处接放菌种,用树叶将其盖好,覆土压实即可。接后每10天检查1次,发现病虫害和白蚁要及时防治。9~12月茯苓膨大生长期要及时培土。第二年4-6月可采收,此方法虽能节约大量材耗但产量低,不能满足需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可取代现有茯苓栽培种植用材,不需采伐树木,易于推广,产量高的培育茯苓的方法。
本发明的技术方案在于,培育茯苓的方法采用菌种繁殖法。首先选取优良苓种,其标准为品质好,无病虫害,个体较大,近球形,质地坚,皮红,肉白,浆汁多,气味浓郁的茯苓菌核;然后进行母种保存和培养;最后在此基础上进行原种和栽培种的制作和扩繁。其中母种的培养包括母种的分离和在培养基上的接种培养,原种的制作是将母种接种在培养基上进行培养,栽培种的制作是在培养基上进行发菌培养,具体工艺如下:
1、母种的分离和培养
母种分离方法为:用无菌水将种苓冲洗数次,再用纱布揩干,最后用75%酒精擦洗种苓外皮,并用0.1%升汞擦洗干净后,进行紫外线灭菌;在无菌条件下,用无菌刀将种苓剖开,用酒精火焰灭菌后的接种铲从种苓较深部位取出黄豆大小的苓肉,接入试管斜面上;
配制母种培养基,其组分为:马铃薯200克,葡萄糖20克,琼脂20克,水1000毫升,另加0.5克酵母粉,0.5克蛋白胨,PH值为5.5-6.5;
母种的培养过程为:在温度28-32℃,培养2-3天,长出菌丝后,认定无杂菌即可继续培养至菌丝长满斜面。
2、原种的制作
原种制作中用的培养基其配方为:松木屑76%,麸皮20%,糖2%,石膏粉1%,过磷酸钙1%,含水量50%-55%,pH5.5-6.5;
其接种培养过程为:在无菌条件下,按常规将母种接入上述配制好的培养基瓶中,置28-32℃温室中培养,经25-30天,菌丝长满瓶即为原种。
3、栽培种的制作
栽培种制作中所需的培养基配方为:松木片(2厘米×10厘米×0.3厘米)65%,松木屑10%,麸皮20%,糖2%,石膏粉1%,过磷酸钙1%,尿素0.2%;
其发菌培养过程为:将上述配料按常规配制后装入15厘米×18厘米×0.005丝米的聚乙烯塑料袋中,经灭菌接种后置28-32℃下培养,经25-30天,当菌丝长满并深入至木片内后即可。
本发明提供的培育茯苓的方法,能培育出茯苓菌丝和茯苓菌核;由于在母种、原种、栽培种的培养过程中,其培养基由人工配制而成,不需要天然松木,因而不用采伐树木,可用于大批量生产,种植成本低。经试验,生产出的茯苓其外形与现有商品茯苓一致,显微构造基本一致,多糖提取率相近,完全可替代商品茯苓入药。这种茯苓种植用材代用品的开发,既能保证中医临床用药,又有效地保护了森林资源,不失为中医药行业生产类似产品的一种行之有效的方法。
具体实施方式
菌种培养的具体工艺如下:
1、选取优良苓种
其标准为品质好,无病虫害,个体较大,近球形,质地坚,皮红,肉白,浆汁多,气味浓郁的茯苓菌核。
2、母种的分离和培养
母种分离方法为:用无菌水将种苓冲洗数次,再用纱布揩干,最后用75%酒精擦洗种苓外皮,并用0.1%升汞擦洗干净后,进行紫外线灭菌;在无菌条件下,用无菌刀将种苓剖开,用酒精火焰灭菌后的接种铲从种苓较深部位取出黄豆大小的苓肉,接入试管斜面上;
母种培养基的配方为:马铃薯200克,葡萄糖20克,琼脂20克,水1000毫升,另加0.5克酵母粉,0.5克蛋白胨,PH值为5.5-6.5;
母种的培养过程为:在温度28-32℃,培养2-3天,长出菌丝后,认定无杂菌即可继续培养至菌丝长满斜面。
3、原种的制作
原种制作中用的培养基的配方为:松木屑76%,麸皮20%,糖2%,石膏粉1%,过磷酸钙1%,含水量50%-55%,pH5.5-6.5;
其接种培养过程为:在无菌条件下,按常规将母种接入上述配制好的培养基瓶中,置28-32℃温室中培养,经25-30天,菌丝长满瓶即为原种。
4、栽培种的制作
栽培种制作中所需的培养基配方为:松木片(2厘米×10厘米×0.3厘米)65%,松木屑10%,麸皮20%,糖2%,石膏粉1%,过磷酸钙1%,尿素0.2%;
其发菌培养过程为:将上述配料按常规配制后装入15厘米×18厘米×0.005丝米的聚乙烯塑料袋中,经灭菌接种后置28-32℃下培养,经25-30天,当菌丝长满并深入至木片内后即可。
茯苓菌种在松枝、木屑瓶内菌丝生长情况及试验数据如下:
2003年5月22日,将直径1厘米左右小松枝截短至15厘米,木屑分别浸泡在营养液中,待浸透后捞出,分别放入瓶中,高压消毒后,5月30日接种茯苓菌种,接种两天后菌丝开始生长,6月20日已形成菌索,8月9日已形成6×3厘米不等的白色块状物,其质地致密,表面呈粉状。菌丝生长情况如下表:
                      表1茯苓菌丝在瓶内生长情况表
  菌丝生长   松枝瓶数   木屑瓶数   松枝瓶数(%)   木屑瓶数(%)
  菌丝呈块状   36   6   22.64   9.09
  菌丝良好   93   51   58.49   77.27
  有菌丝   11   5   6.91   7.58
  无菌丝   19   4   11.95   6.06
  总数   159   66
显微比较研究:
商品茯苓(购于成都市药材公司),由茯苓成熟菌核分离得到茯苓菌丝为母种(琼脂、马铃薯等),由茯苓母种扩繁得到的茯苓菌丝为原种(木屑等),由茯苓原种扩大培养得到茯苓菌丝为茯苓栽培种(即新配方生长的茯苓菌丝、菌核)。
1、商品茯苓的显微特征
商品茯苓的粉末用水装片,在显微镜下可观察到无色不规则的颗粒状团块和分支状团块;用5%的NaOH溶液装片,可见团块溶化,露出菌丝,菌丝细长,稍弯曲,有分支,呈无色或淡棕色。
2、茯苓菌丝母种的显微特征
茯苓菌丝母种的粉末,用水装片和5%的NaOH溶液装片观察到菌丝,菌丝细长,稍弯曲,有分支,呈无色或淡棕色。
3、茯苓原种菌丝的显微特征
茯苓菌丝原种的粉末,用水装片时,可见到分支状团块,也可见到少量的菌丝;用5%的NaOH溶液装片时,只能见到菌丝,菌丝细长,稍弯曲,有分支,呈无色或淡棕色。
4、新配方生长的茯苓菌丝、菌核的显微特征
同上方法装片只能见到菌丝,菌丝细长,稍弯曲,有分支,呈无色或淡棕色。与商品茯苓的显微特征基本一致。
提取工艺的确定:
茯苓水溶性多糖提取工艺的确定:选用复合方法提取茯苓水溶性多糖。即将茯苓粉末(过40目筛)适量,用乙酸乙酯、丙酮于索氏提取器分别提取4小时,药渣加入催化酶酶解,于60-70℃浸泡40分钟,再依次用5倍量、3倍量、2倍量的沸水提取1小时。合并水提液,滤过,滤液浓缩至1/10,用Severge法除蛋白。上清液加入三倍量的乙醇沉淀多糖,冷藏12小时,离心,收集沉淀,低温干燥,即得。
茯苓碱溶性多糖提取工艺的确定:茯苓碱溶性多糖含量较高,提取方法相对简单,所得提取率较稳定。即将水提后的药渣用稀NaOH溶液提取,碱提液离心,所得上清液以10%的醋酸中和,3倍量乙醇沉淀,再提纯即得。综合考虑了生产可行性及经济性,经反复试验后确定稀NaOH溶液用量为5倍量,提取2次,每次4小时。
茯苓多糖的提取定量实验:
取低温烘干后的商品茯苓、母种、原种,新配方生长的茯苓菌丝、菌核适量精密称定,按上述方法提取多糖,结果如下表:
               表2茯苓多糖提取率
  茯苓样品                 提取率(%)
  水溶性多糖   碱溶性多糖   总多糖
  商品茯苓新配方生长的菌核新配方生长的菌丝菌丝母种菌丝原种   2.002.041.941.151.20   80.1080.7280.3059.6468.16   82.1082.7681.2260.7969.36
茯苓多糖含量测定:
采用苯酚—硫酸法,对商品茯苓、本发明新配方生长的茯苓菌丝和菌核、茯苓菌丝母种、茯苓菌丝原种进行茯苓多糖含量测定。测定结果如下:
                        表3茯苓多糖含量测定结果
  茯苓样品   商品茯苓   新配方生长的菌核   新配方生长的菌丝   菌丝母种   菌丝原种
  多糖含量(%)   87.79   87.23   86.02   87.84   86.98
由上可见,该发明新配方生长的茯苓菌丝、菌核与商品茯苓比较,多糖提取率相近,可代替商品茯苓入药,并且该发明新配方生长的茯苓菌丝、菌核的培育成本低,可以大批量生产。

Claims (1)

1、一种培育茯苓的方法,其特征在于该方法包括选取优良苓种、母种保存和培养、在此基础上进行原种和栽培种的制作和扩繁,具体工艺如下:
(1)母种的培养
母种分离方法为:用无菌水将种苓冲洗数次,再用纱布揩干,最后用75%酒精擦洗种苓外皮,并用0.1%升汞擦洗干净后,进行紫外线灭菌;在无菌条件下,用无菌刀将种苓剖开,用酒精火焰灭菌后的接种铲从种苓较深部位取出黄豆大小的苓肉,接入试管斜面上;
母种培养基的配制为:马铃薯200克,葡萄糖20克,琼脂20克,水1000毫升,0.5克酵母粉,0.5克蛋白胨,pH5.5-6.5;
母种培养过程为:在温度28-32℃,培养2-3天,长出菌丝后,认定无杂菌即可继续培养至菌丝长满斜面;
(2)原种的制作
原种培养基的配制为:松木屑76%,麸皮20%,糖2%,石膏粉1%,过磷酸钙1%,含水量50%-55%,pH5.5-6.5;
原种接种培养过程为:在无菌条件下,按常规将母种接入上述配制好的培养基瓶中,置28-32℃温室中培养,经25-30天,菌丝长满瓶即为原种;
(3)栽培种的制作
栽培种培养基的配方为:形状为2厘米×10厘米×0.3厘米的松木片65%,松木屑10%,麸皮20%,糖2%,石膏粉1%,过磷酸钙1%,尿素0.2%;
栽培种发菌培养过程为:将上述配料按常规配制后装入15厘米×18厘米×0.005丝米的聚乙烯塑料袋中,经灭菌接种后置28-32℃下培养,经25-30天,当菌丝长满并深入至木片内后即可。
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