CN105420125A - 一种丛枝菌根真菌菌剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种丛枝菌根真菌菌剂，该菌剂按照以下步骤制备得到：以白车轴草种子和麦冬种子作为宿主植物，以摩西球囊霉、网状球囊霉、幼套球囊霉或根内球囊霉为接种剂，在特定营养条件下进行培养，将生长至收获期的植株的根部以上部位去除，剩余根系及基质部分粉碎混匀，即得丛枝菌根真菌菌剂。本发明所提供的一种AM真菌菌剂，用白车轴草和麦冬按特定比例组合作为真菌扩繁载体并将该扩繁载体在特定的营养条件下进行培养，生产出了侵染率高、孢子密度大的AM真菌菌剂，其中尤以摩西球囊霉作为接种剂菌种时所生产的菌剂质量最好，侵染率最高、孢子密度最大，可广泛应用于科研或生态防治、土壤改良等领域。

Description

一种丛枝菌根真菌菌剂

技术领域

本发明涉及微生物菌剂，具体的说是涉及一种丛枝菌根真菌菌剂。

背景技术

丛枝菌根，是自然界存在最广泛的一种植物根系和真菌的共生体，丛枝菌根真菌是土壤共生真菌中分布最广泛的一类真菌，能和自然界绝大多数陆生植物形成菌根。丛枝菌根不仅能够促进植物对矿质元素及水分的吸收，还会显著提高植物的抗逆性、抗病性，有利于植物的生长发育，对农业生产以及荒漠化治理等具有重要意义。如在大田作物大豆、小麦、棉花等以及果树作物苹果、柑橘等根系上接种AM真菌后，植物的抗逆性及产量都有明显提高。另外，在白菜等蔬菜作物上进行试验，也取得了良好的效果。

然而目前，由于AM真菌的专性活体共生的性质，AM真菌至今不能分离纯培养，因而使得AM真菌的应用受到了极大的限制。现阶段，有很多种AM真菌扩繁的方法，如活体宿主盆钵培养法、玻璃珠分室培养法、组织培养法等等，玻璃珠分室培养法和组织培养法的优点是能够将培养基质与AM真菌分开，获得纯净的AM真菌菌体；但是其技术含量较高，仅供科学研究和小规模接种剂的生产使用；采用活体宿主植物盆钵培养法培养AM真菌的优点是操作方便、简单可靠，目前是AM真菌纯培养的主要方法，但是目前盆钵培养法所制备的AM菌剂的浸染率和孢子密度普遍较低，菌剂质量差，不能满足产业需求。

发明内容

本发明的目的是提供一种菌剂产量高、侵染率高、可较大规模应用的丛枝菌根真菌菌剂，本发明菌剂制备过程新颖独特、成本较低，为AM真菌应用开辟了新的道路。

本发明所采用的技术方案如下：

一种丛枝菌根真菌菌剂，该菌剂按照以下步骤制备得到：

(1)、催芽：将宿主植物种子灭菌处理后，于无菌水润湿的灭菌滤纸上28℃暗培养，得到发芽的种子；

所述宿主植物种子为白车轴草种子和麦冬种子；

(2)、接种：将接种剂、发芽的种子、灭菌基质、未灭菌基质按灭菌基质→接种剂→灭菌基质→未灭菌基质→发芽的种子→未灭菌基质的顺序依次装填至灭菌的培养容器中；

所述接种剂所用菌种为摩西球囊霉、网状球囊霉、幼套球囊霉或根内球囊霉；

(3)、培养：将装填好的培养容器置于恒温光照培养箱中进行培养，培养过程中培养条件为：

①、第一个月：每10天浇一次二分之一浓度的Hoagland's营养液，保持轻微干旱；

②、第二个月：每10天浇一次P元素减半的Hoagland's营养液，保持轻微干旱；

③、第三个月：每10天浇一次Hoagland's全营养液，保持水分正常供应，直至收获期；

(4)、将生长至收获期的植株的根部以上部位去除，剩余根系及基质部分粉碎混匀，即得丛枝菌根真菌菌剂。

本发明所述的丛枝菌根真菌菌剂，所述白车轴草种子与所述麦冬种子用量比为5～6∶1。

本发明所述的丛枝菌根真菌菌剂，将河沙过1mm筛，然后与土壤按质量比3∶1混合，得培养基质；所述培养基质均分为6份，其中进行高温湿热灭菌处理，为所述灭菌基质，另外2份为所述未灭菌基质。

本发明所述的丛枝菌根真菌菌剂，所述宿主植物种子与所述培养基质用量比为1颗种子∶17～35g培养基质。

本发明所提供的一种AM真菌菌剂，用白车轴草和麦冬按特定比例组合作为真菌扩繁载体并将该扩繁载体在特定的营养条件下进行培养，生产出了侵染率高、孢子密度大的AM真菌菌剂，其中尤以摩西球囊霉作为接种剂菌种时所生产的菌剂质量最好，侵染率最高、孢子密度最大，可广泛应用于科研或生态防治、土壤改良等领域。

附图说明

图1是本发明实施例1所培养的感染AM真菌的麦冬根段染色结果。

图2是本发明实施例1所培养的感染AM真菌的白车轴草根段染色结果。

具体实施方式

实施例1

(1)、催芽：

宿主植物选用白车轴草(学名：TrifoliumrepensL)和麦冬(学名：Ophiopogonjaponicus(Linn.f.)Ker‐Gawl.)，将宿主植物种子(白车轴草种子和麦冬种子)在5％次氯酸钠溶液中浸泡15min，取出后吸水纸吸干，然后用无菌水冲洗十次后放置于无菌培养皿中用无菌水润湿的无菌滤纸上，28℃暗培养直至种子出芽。

(2)、基质及培养容器的准备：

将建筑河砂过1mm筛后，与土壤(普通农田土)按质量比3∶1充分混合，作为宿主植物的生长以及AM真菌扩繁的培养基质；

将培养容器(纸杯或小型花盆)75％酒精里外擦拭三遍后放置于紫外灯下照射10min，完成灭菌处理。

(3)、接种剂准备：

摩西球囊霉(Glomusmosseae)接种剂(市购或自制)为含有摩西球囊霉孢子、根外菌丝及被侵染根断的沙土混合物，每10g接种剂中含60±3个摩西球囊霉孢子。

(4)、扩繁培养：

将2份灭菌基质装填到培养容器中，然后均匀铺撒一层准备好的接种剂，然后加入剩余2份灭菌基质，再加入1份未灭菌基质，然后均匀播撒已萌发的宿主种子(白车轴草种子10粒+麦冬草种子2粒)，最后加入1份未灭菌基质；

本步骤中：培养基质(共360g)均分为6等份，其中4份进行灭菌处理(103.4KPa、121℃条件下维持15‐20min进行高温湿热灭菌)后，为灭菌基质，另外2份不做任何处理，为未灭菌基质；

本步骤中：培养基质、宿主种子、接种剂用量比为360g∶12颗∶10g；

将装填好的培养容器置于恒温光照培养箱内培养(恒温光照条件是：温度25℃、光照时间为12h)，培养过程中培养条件为：

①、第一个月：每10天浇一次二分之一浓度的Hoagland's营养液，保持轻微干旱；

②、第二个月：每10天浇一次P元素减半的Hoagland's营养液，保持轻微干旱；

③、第三～四个月：每10天浇一次Hoagland's全营养液，保持水分正常供应。

(5)、第四个月末，将白车轴草和麦冬植株的根部以上部位去除，剩余根系及基质部分常规粉碎混匀，即得摩西球囊霉真菌菌剂。

实施例2‐4

按照与实施例1相同的实验步骤和条件，分别准备网状球囊霉、幼套球囊霉和根内球囊霉接种剂，制备网状球囊霉、幼套球囊霉和根内球囊霉真菌菌剂。

对比例1～4

将实施例1～4中的麦冬草种子替换为白车轴草种子，其他条件不变。

对比例5～8

将实施例1～4中的白车轴草种子替换为麦冬草种子，其他条件不变。

对比例9

步骤(1)～步骤(3)与实施例1相同。

(4)、扩繁培养：

将2份灭菌基质装填到培养容器中，然后均匀铺撒一层准备好的接种剂，然后加入剩余2份灭菌基质，再加入1份未灭菌基质，然后均匀播撒已萌发的宿主种子(白车轴草种子10粒+麦冬草种子2粒)，最后加入1份未灭菌基质；

本步骤中：培养基质(共360g)均分为6等份，其中4份进行灭菌处理(103.4KPa、121℃条件下维持15‐20min进行高温湿热灭菌)后，为灭菌基质，另外2份不做任何处理，为未灭菌基质；

本步骤中：培养基质、宿主种子、接种剂用量比为360g∶12颗∶10g；

将装填好的培养容器置于恒温光照培养箱内培养(恒温光照条件是：温度25℃、光照时间为12h)，培养过程中培养条件为：

①、第一个月：每周浇一次二分之一浓度的Hoagland's营养液，保持轻微干旱；

②、第二～三个月：每周浇一次Hoagland's全营养液，保持轻微干旱；

③、第四个月：不再浇营养液，保持水分正常供应。

(5)、第四个月末，将白车轴草和麦冬植株的根部以上部位去除，剩余根系及基质部分常规粉碎混匀，即得摩西球囊霉真菌菌剂。

试验例1：侵染率检测

将实施例1步骤(5)中所收获白车轴草根段和麦冬根段，按照Kormaniketal.方法进行染色，然后镜检并计算侵染率，具体操作如下：

将根段剪成1cm长，放入碱液(质量百分含量8％的KOH水溶液)中，90℃水浴加热30min，然后去掉碱液，再用自来水冲洗3次；之后放入酸液(体积百分含量2％的HCl水溶液)中浸泡5min，然后去掉酸液，再用自来水冲洗3次；之后放入酸性品红染色液(乳酸875mL、蒸馏水63mL、甘油6mL、酸性品红Acidfuschin0.1g)中60‐90℃水浴加热30min，然后加入乳酸分色，镜检(染色结果分别见图1、图2)，计算摩西球囊霉的侵染率(统计结果见表1)。

侵染率的计算公式为：

侵染率(％)＝Σ(0％×根段数+10％×根段数+20％×根段数+30％×根段数+40％×根段数+50％×根段数+60％×根段数+70％×根段数+80％×根段数+90％×根段数+100％×根段数)/观察总根段数

上述公式中的百分数(即0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％和100％)的含义是指根段上菌丝体侵染的区域占该根段总长的百分比。

实施例2‐4按照同样的操作方法，检测网状球囊霉、幼套球囊霉和根内球囊霉的侵染率(统计结果见表1)。

对比例9是在不同营养条件对所制备的菌剂的侵染率的影响，其侵染率统计结果见表1。

表1：侵染率(单位：％)

对比例1～4是单独以白车轴草做为宿主植物时，摩西球囊霉、网状球囊霉、幼套球囊霉和根内球囊霉侵染率检测结果，具体见表2。

表2：侵染率(单位：％)

对比例5～8是单独以白车轴草做为宿主植物时，摩西球囊霉、网状球囊霉、幼套球囊霉和根内球囊霉侵染率检测结果，具体见表3。

表3：侵染率(单位：％)

试验例2：孢子密度检测

采用湿筛倾析法测定实施例1所制备的菌剂的孢子密度：将20g菌剂放入水中，搅拌后静置，过400目筛，然后流水冲洗筛子，以免筛网上的筛出物中残留有真菌孢子，过筛后所得滤液转入离心管，3000r/min离心3min，去上清液后，在离心管中加入8mL35％蔗糖(m/V)，搅匀，3000r/min离心3min，然后将所得上清液用滤纸过滤后镜检并统计数据，结果见表4。

实施例2～4、对比例1～9采用同样的方法检测所制备菌剂的孢子密度，结果见表4～6。

表4：孢子密度(单位：个/每10g菌剂)：

表5：孢子密度(单位：个/每10g菌剂)：

表6：孢子密度(单位：个/每10g菌剂)：

由以上实验结果可以看出，本发明所制备的菌剂侵染率相对于单一宿主植物的侵染率和孢子密度均大大提高，表明本发明所采用的扩繁载体及为该特定扩繁载体所选择的特定培养条件的结合，取得了突出的效果，获得了高侵染率和高孢子密度的菌剂。

Claims (4)

1.一种丛枝菌根真菌菌剂，其特征在于，该菌剂按照以下步骤制备得到：

（1）、催芽：将宿主植物种子灭菌处理后，于无菌水润湿的灭菌滤纸上28℃暗培养，得到发芽的种子；

所述宿主植物种子为白车轴草种子和麦冬种子；

（2）、接种：将接种剂、发芽的种子、灭菌基质、未灭菌基质按灭菌基质→接种剂→灭菌基质→未灭菌基质→发芽的种子→未灭菌基质的顺序依次装填至灭菌的培养容器中；

所述接种剂所用菌种为摩西球囊霉、网状球囊霉、幼套球囊霉或根内球囊霉；

（3）、培养：将装填好的培养容器置于恒温光照培养箱中进行培养，培养过程中培养条件为：

①、第一个月：每10天浇一次二分之一浓度的Hoagland's营养液，保持轻微干旱；

②、第二个月：每10天浇一次P元素减半的Hoagland's营养液，保持轻微干旱；

③、第三个月：每10天浇一次Hoagland's全营养液，保持水分正常供应，直至收获期；

（4）、将生长至收获期的植株的根部以上部位去除，剩余根系及基质部分粉碎混匀，即得丛枝菌根真菌菌剂。

2.根据权利要求1所述的丛枝菌根真菌菌剂，其特征在于，所述白车轴草种子与所述麦冬种子用量比为5~6∶1。

3.根据权利要求1所述的丛枝菌根真菌菌剂，其特征在于，将河沙过1mm筛，然后与土壤按质量比3∶1混合，得培养基质；所述培养基质均分为6份，其中进行高温湿热灭菌处理，为所述灭菌基质，另外2份为所述未灭菌基质。

4.根据权利要求3所述的丛枝菌根真菌菌剂，其特征在于，所述宿主植物种子与所述培养基质用量比为1颗种子∶17~35g培养基质。