CN107557304A

CN107557304A - 一种am真菌快速繁殖方法

Info

Publication number: CN107557304A
Application number: CN201710887185.6A
Authority: CN
Inventors: 崔美香; 王聚将; 卢彦琦; 郭佳; 王艳路
Original assignee: Hebei University of Engineering
Current assignee: Hebei University of Engineering
Priority date: 2017-09-21
Filing date: 2017-09-21
Publication date: 2018-01-09

Abstract

本发明公开了一种AM真菌快速繁殖方法，属于AM真菌繁殖方法技术领域。目的是提供一种快速获得纯净的AM真菌菌根的方法。具体的方法包括以下步骤：步骤一材料准备具体包括：AM真菌菌种：幼套球囊菌菌根或摩西球囊菌菌根；无菌萌动的高粱种子或小麦种子；培养基：水琼脂培养基或Hoagland培养基；步骤二AM真菌培养：将步骤一中的水琼脂培养基或Hoagland培养基装入三角瓶中，将幼套球囊菌菌根或摩西球囊菌菌根剪成小段后与高粱种子或小麦种子共同放入培养基内所挖的穴中，无菌条件下进行培养。对于扩大AM真菌的产量，提高AM真菌的适用范围，具有积极的意义。

Description

一种AM真菌快速繁殖方法

技术领域

本发明具体涉及一种AM真菌快速繁殖方法，属于AM真菌繁殖方法技术领域。

背景技术

丛枝菌根(Arbuscular mycorrhizae，AM)，它是土壤共生真菌中分布最广泛的一类真菌，至少可以与200个科的20万个种以上的植物行共生生活。

由于AM真菌生产量受限制，目前主要用于名贵花卉、苗木、药材和经济作物的接种，

目前AM真菌的繁殖方法仍处于探索阶段，传统方法是盆栽法，但培育时间长，获得菌种与基质混合物。因此，研究AM真菌快速繁殖方法，在较短的时间内获得纯净的菌根，具有很大的实用价值。

发明内容

因此，针对现有技术的上述不足，本发明皆在提供一种快速获得纯净的AM真菌菌根的方法。

具体的，所述方法包括以下步骤：

步骤一材料准备

具体包括：

AM真菌菌种：幼套球囊菌菌根或摩西球囊菌菌根；

无菌萌动的高粱种子或小麦种子；

培养基：水琼脂培养基或Hoagland培养基；

步骤二 AM真菌培养

将步骤一中的水琼脂培养基或Hoagland培养基装入三角瓶中，将幼套球囊菌菌根或摩西球囊菌菌根剪成小段后与高粱种子或小麦种子共同放入培养基内所挖的穴中，无菌条件下进行培养。

进一步的，所述步骤一中的幼套球囊菌菌根或摩西球囊菌菌根进行消毒处理，消毒处理过程为将幼套球囊菌菌根或摩西球囊菌菌根放入75％的酒精中浸泡30s消毒，并用无菌水清洗三遍。

进一步的，所述步骤一中的小麦种子或高粱种子进行消毒处理，消毒处理过程为用0.1％升汞浸泡1min进行表面消毒，用无菌水冲洗三次，用无菌水浸泡使种子充分吸水膨胀，放入超净工作台中催芽，选出无菌种子备用。

进一步的，所述步骤一中Hoagland培养基配制方法为，按照1000毫升的Hoagland的营养液加入20克琼脂粉的比例配制而成。

进一步的，所述步骤二中具体包括：将步骤一中的培养基装入三角瓶中，将培养基与所用的工具一起用手提式压力蒸汽灭菌锅121℃灭菌30min，将消毒处理后的幼套球囊菌菌根或摩西球囊菌菌根剪成1cm的小段，用勺子在三角瓶内的培养基中挖10个穴，每穴放入2至3根菌根小段，再放入一粒高粱种子或小麦种子，用无菌生物透气封口膜封口，无菌条件下进行培养。

本发明的有益效果在于：本发明提供一种AM真菌快速繁殖方法，以双重培养为主探索AM真菌的快速繁殖方法，此方法获得菌根纯净，时间短。对于扩大AM真菌的产量，提高AM真菌的适用范围，具有积极的意义。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行说明：

本实施例以双重培养法为基础，通过对比试验的方式，验证本发明技术方案的有效性。

试验材料与方法

供试材料

AM菌种：盆栽加富培养的高粱菌根。

小麦品种：中麦155号，中国农科院作物科学研究所2012年审定；

高粱品种：笤帚高粱(鸟不叨)郑州金阳光种子有限公司；两个品种均来自于邯郸市农贸市场。

培养基配制

培养基种类为：PDA培养基、水琼脂培养基、Hoagland培养基三种，PDA与水琼脂培养基制作方法参考植病研究方法。Hoagland培养基配制方法，用1000毫升的Hoagland的营养液加入20克琼脂粉做成。每种培养基制2000ml。分装入三角瓶(小麦为250ml、高粱为300ml)内，每个三角瓶装入100ml培养基，每种培养基18瓶，将培养基与所用的工具一起用手提式压力蒸汽灭菌锅121℃灭菌30min。

种子消毒

挑选饱满、健康的小麦和高粱种子各300粒，分别用0.1％升汞浸泡1min进行表面消毒，用无菌水冲洗三次，用无菌水浸泡使种子充分吸水膨胀，放入超净工作台中催芽，选无菌种子备用。

菌根表面消毒

将加富培养的高粱菌根{NM01B(幼套球囊菌)、XJ01(摩西球囊菌)、对照组}放入75％的酒精中浸泡30s消毒，并用无菌水清洗三遍，备用。

摩西球囊菌BGC XJ01(Glomus mosseae)、幼套球囊霉BGC NM01B(Glomusetunicatum，二者均以沙土基质为载体，来源于北京农林科学院植物营养与资源研究所。经过盆钵加富培养法获得幼套球囊菌菌根或摩西球囊菌菌根；

在花盆中放入已混合均匀的基质500ml，用凉开水浸透，称取菌种10g，均匀的撒在花盆中，把种子均匀摆放到花盆中并轻轻按一下，保证种子与菌种充分接触，最后在其上面覆盖50ml基质，50粒/盆，每处理3次重复。将花盆放到阳光充足的地方，定期浇适量的水，待高粱长到三叶期后要浇Hoagland营养液。扩繁四个月后对其根系进行处理，按改良“KOH透明-酸性品红乳酸甘油染色的方法”测定不同处理对高粱幼苗根系的侵染率。侵染率在60％以上的菌根。

对照组为无菌沙土。

实验设计和方法

本试验于5月7日在植保实验室完成，共设18个处理，每处理3次重复，各处理及编号见表1，将三角瓶进行编号。

将处理后的NM01B菌根剪成1厘米左右，放在培养皿内，选出对应编号的三角瓶，用勺子在三角瓶的培养基中挖穴，10穴/每瓶，放入处理后的菌根段，每穴2-3根(粗细均有)，再放入一粒高粱(或小麦)种子，用无菌生物透气封口膜封口。全过程在无菌条件下操作。XJ01与对照组同NM01B组处理。每种菌根在小麦、高粱处理上的平均用量为0.26克。放入超净工作台内室温下培养。每天观察记录小麦和高粱种子的发芽、生长情况。在5月28日将高粱处理组全部、小麦N组每种培养基一瓶取苗测定侵染率；在6月7日将小麦处理组全部取出，测量鲜重和侵染率。

表1

注：P-PDA培养基；H-Hoagland培养基；S-水琼脂培养基。

试验结果

试验观察结果

表2为5月28日小麦侵染率测定记录，表3为5月28日高粱侵染率测定记录，根据表2，水琼脂培养基中高粱与小麦长势良好，Hoagland培养基次之，土豆培养因营养丰富，杂菌污染严重。在实验五天左右，菌根出现颜色变化，但对照组中也出现颜色变化，不能依次准确判断AM菌是否侵染，在茎部有白色绒毛长出。具体观察情况见表4，表4为5月28日实验观察结果。

表2

表3

注：-表示污染。

表4

注：P处理污染严重而失败，

侵染率测定结果

结合表2、表3结果显示，小麦土豆培养基的侵染率高，水琼脂次之，Hoagland 最差。而在观察中发现，在同等视野中观察，小麦根中AM菌泡囊数量多于高粱，但从整根长度方面，AM菌侵染高粱的范围较侵染小麦大。高粱水琼脂培养基的侵染率显著高于其他两组，且生长状况良好，杂菌污染少，根量大；而Hoagland培养基中侵染率次之，生长状况良好，但有杂菌污染，根量较少；在土豆培养基中，杂菌污染严重。高粱根系在染色过程中，因染色液时间较长，染色效果差，均未观察到染色后的泡囊，可能影响实验结果的准确性；S-N与H-N两组观察中未发现未染色的泡囊，按照0进行处理，而S-X，H-X观察中发现未染色泡囊。

表5为6月7目小麦培养基生长发育情况表，可以得出，Hoagland营养液培养基的小麦株高明显高于其他两种培养基；土豆培养基杂菌污染情况严重，小麦根量少，生长不良，不适合培养；而其他两种培养基中杂菌污染情况较轻，高粱根系发达。

表5

注：*表示5月28日已经取样；-表示污染作废。

表6为6月7日小麦侵染率测定情况表，根据表6可以得出，小麦水琼脂培养基中的侵染率31.7％、36.3％，Hoagland营养液培养为64.8％、36.35％，由此可见，Hoagland营养液培养基中的小麦侵染率高于水琼脂培养基。小麦水琼脂培养基初期侵染率高，后期营养不足，植株矮小，根系弱，后期侵染率低，不适宜作为扩繁的培养基；而Hoagland营养液培养基中的小麦生长旺盛，根系繁密，侵染率保持增长趋势。虽然小麦培养基中的AM侵染率均不高，但是缩短了AM菌侵染小麦的时间。土豆培养基因后期杂菌污染严重，不适宜作为扩繁的培养基。

表6

注：因根量较少，所以观察的总跟段数没达到200段。

结论

在研究AM真菌快速繁殖的试验中，传统的沙土盆栽扩繁法，时间为四个月，获得菌根和沙土混合物，易管理，菌根的侵染率高，适宜在生产上推广应用。双重培养基的高粱水琼脂培养基，时间为20天，虽侵染率较高但易污染，操作技术要求高，室内研究采用此方法较好。而小麦Hoagland培养基中侵染率高于同时期的的沙土盆栽培养法中的小麦侵染率，缩短菌种的扩繁时间。在高粱和小麦的对比试验中，我们可以明显观察到被侵染的根的颜色有明显变化，高粱为黑紫色，正常根为深紫色，小麦为黄色正常根为白色。根据以上实验，可以得出AM真菌对高粱的侵染率高于小麦。

在培养基的选择中，高粱土豆培养基因营养丰富，容易感染杂菌，不适合作为扩繁的培养基。而高粱水琼脂培养基中培养的菌根段侵染率高于Hoagland营养液培养基，故在选用高粱作为寄主植物时，可采取水琼脂培养基。高粱为直根系作物，根系较为发达，在测定侵染率过程中，主根侵染率低于侧根侵染率。小麦土豆培养基初期侵染率较高，但后期杂菌污染严重，抑制AM真菌生长，故不适合。

在培养基中的杂菌污染是导致AM真菌侵染率不高的主要原因，在试验过程中，菌根和种子的消毒是试验的关键。在培养过程中，前期因菌根和种子表面带杂菌污染的培养基而造成实验失败。而在后期中，被杂菌污染较少。主要杂菌种类有：青霉和根腐蠕孢霉。

Claims

1.一种AM真菌快速繁殖方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤一材料准备

具体包括：

AM真菌菌种：幼套球囊菌菌根或摩西球囊菌菌根；

无菌萌动的高粱种子或小麦种子；

培养基：水琼脂培养基或Hoagland培养基；

步骤二AM真菌培养

2.如权利要求1所述的AM真菌快速繁殖方法，其特征在于，所述步骤一中的幼套球囊菌菌根或摩西球囊菌菌根进行消毒处理，消毒处理过程为将幼套球囊菌菌根或摩西球囊菌菌根放入75％的酒精中浸泡30s消毒，并用无菌水清洗三遍。

3.如权利要求2所述的AM真菌快速繁殖方法，其特征在于，所述步骤一中的小麦种子或高粱种子进行消毒处理，消毒处理过程为用0.1％升汞浸泡1min进行表面消毒，用无菌水冲洗三次，用无菌水浸泡使种子充分吸水膨胀，放入超净工作台中催芽，选出无菌种子备用。

4.如权利要求3所述的AM真菌快速繁殖方法，其特征在于，所述步骤一中Hoagland培养基配制方法为，按照1000毫升的Hoagland的营养液加入20克琼脂粉的比例配制而成。

5.如权利要求4所述的AM真菌快速繁殖方法，其特征在于，所述步骤二中具体包括：将步骤一中的培养基装入三角瓶中，将培养基与所用的工具一起用手提式压力蒸汽灭菌锅121℃灭菌30min，将消毒处理后的幼套球囊菌菌根或摩西球囊菌菌根剪成1cm的小段，用勺子在三角瓶内的培养基中挖10个穴，每穴放入2至3根菌根小段，再放入一粒高粱种子或小麦种子，用无菌生物透气封口膜封口，无菌条件下进行培养。