CN116769615B - 一种用于丛枝菌根真菌规模生产的培养基质 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于丛枝菌根真菌规模生产的培养基质，具体涉及丛枝菌根真菌培养技术领域，包括组分一，20‑40目的沸石20%‑30%、40‑60目的沸石30%‑60%、60‑80目的沸石20%‑30%；组分二：0.05%矿源黄腐酸钾、50μmol/L‑100μmol/L吲哚乙酸、0.5μmol/L‑1.0μmol/L独角金内脂GR24；组分三：50μmol/L‑100μmol/L脱落酸ABA、100nM‑200nM银杏提取物黄酮类物质、50μmol/L‑100μmol/L生长素IAA，本发明公开的培养基质能够显著提高丛枝菌根真菌扩繁的产量，配料结构简单且容易获取，成本低等优点，能够实现快速培育和大量培育丛枝菌根真菌的效果，降低规模生产成本、缩短培养时间、减少人工操作，满足农业生产的规模需求利用筛选的基质，生产只需70‑80天就能得到每克丛枝菌根真菌菌剂中有效繁殖体数量为1000个/克，非常适用于大规模繁育。
Description
技术领域
本发明涉及丛枝菌根真菌培养领域，具体为一种用于丛枝菌根真菌规模生产的培养基质。
背景技术
丛枝菌根真菌具有功能多样性，可显著促进植物生长发育，提高宿主植物对矿质元素的吸收，改善植物的根际微生物环境，提高宿主植物的抗旱、抗盐碱、抗极端温度、湿度等能力，并能增强植物对多种病害的抵抗力，从而改善寄主植物的生长状况。此外，丛枝菌根真菌在减少化肥和农药施用，减少环境污染的同时改善土壤，在维持农业生态平衡中起重要作用。因此，将丛枝菌根真菌通过高效的扩繁体系进行标准化、规模化的生产，形成一种新型的微生物肥料具有很高的应用价值。
丛枝菌根真菌是一种共生真菌，它的生长依赖于共生植物。现有的培育丛枝菌根真菌的方法包括两类，一类用于规模繁育，一类用于实验室材料的获得，其中盆栽培养法(Pot culture)、流动营养液培养法(Nutrition flow culture)、汽雾培养法(Aeroponicculture)可用于大规模繁育，存在设施成本高、生长周期长，一般4-5个月，操作繁琐，而且受环境因素影响大，菌剂生产量和孢子繁殖数量等都较低问题。另外静止营养液培养法(Resting hydroponic culture)、玻璃珠分室培养法(Glass beads split-compartmentculture)、培养基培养法(Medium culture)、离体无菌纯培养(In vitro axenicculture)、丛枝菌根真菌双重无菌培养法(Dual axenic culture)、丛枝菌根真菌与Ri T-DNA转型根的双重单胞无菌培养法(Dual monoaxrnic culture of AM fungi with Ri T-DNA transformed root)和丛枝菌根真菌与RiT-DNA转型根双重培养的改良分室单胞培养系统(Improved the split-plate monoaxenic culture system of AM fungi with RiT-DNA transformed root)等培育方法用于实验室扩繁，但是要求高、材料贵、时间长，适用于少量材质的实验室扩繁，不具备满足农业生产的规模需求。
因此，制备一种效率高、操作简单、成本低、适用于规模繁育且效果优异的培养基质，是进一步提高丛枝菌根真菌产量与质量的关键，是满足丛枝菌根真菌农业生产应用的关键因素。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于丛枝菌根真菌规模生产的培养基质，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种用于丛枝菌根真菌规模生产的培养基质，包括
组分一，20-40目的沸石20％-30％、40-60目的沸石30％-60％、60-80目的沸石20％-30％；
组分二：0.05％矿源黄腐酸钾、50μmo l/L-100μmo l/L吲哚乙酸、0.5μmo l/L-1.0μmo l/L独角金内脂GR24；
组分三：50μmo l/L-100μmo l/L脱落酸ABA、100nM-200nM银杏提取物黄酮类物质、50μmo l/L-100μmo l/L生长素IAA。
菌剂培养基质中的沸石，具有疏松多孔的微结构，提升复合生物基质持水能力，缓和湿度变化剧烈程度，延长基质浇水周期等物理特性。这种微孔径结构有利于菌丝生长、延伸，有利于水气交换，从而为微生物繁殖提供良好的微环境；
菌剂培养基质中的0.05％矿源黄腐酸钾、50μmo l/L-100μmo l/L吲哚乙酸、0.5μmo l/L-1.0μmo l/L独角金内脂GR24，都是促进共生植物根系转化物质。其中，矿源黄腐酸钾能够促进根系的生长，调节根冠比；吲哚乙酸能够促进植物侧根的发育，侧根是丛枝菌根真菌侵染的首要位置；独角金内酯GR24影响毛状根的生长发育和分支；
菌剂培养基质中的50μmo l/L-100μmo l/L脱落酸ABA、100nM-200nM银杏提取物黄酮类物质、50μmo l/L-100μmo l/L生长素IAA，都是促菌丝生长、侵染和提高产孢活性的物质。如脱落酸ABA，通过促进脂质的合成和运输，提高丛枝菌根真菌的侵染和丛枝形成，进而增加丛枝菌根真菌的孢子产量；生长素IAA能增强丛枝菌根真菌菌丝的生长，提高产孢量。银杏提取物黄酮类物质能促进丛枝菌根真菌菌丝的生长和孢子的萌发。
优选的，所述组分一中沸石的比例为：20-40目的沸石、40-60目的沸石、60-80目的沸石按照1:6:2的体积比。
一种用于丛枝菌根真菌规模生产的培养基质的实验方法，包括如下步骤：
步骤一、基质灭菌，将20-40目的沸石、40-60目的沸石、60-80目的沸石按照1:6:2的体积比混合均匀后，平铺在传送带上，厚度为3cm，进行100℃高温蒸汽灭菌，待自然冷却后备用；
步骤二、寄主植物种子的消毒：将玉米种子用10％H2O2消毒10mi n后，清水清洗干净，再用清水浸泡12h待用；
步骤三、扩繁容器的消毒：对进行扩繁的容器用10％的次氯酸钙消毒灭菌处理待用；
步骤四、配减半含磷量的霍格兰氏营养液：硝酸钙945mg/L、硝酸钾607mg/L、磷酸铵115mg/L硫酸镁493mg/L、铁盐溶液2.5ml/L、微量元素5ml/L、PH＝6；
步骤五、添加组分二中的矿源黄腐酸钾：在试验前，将0.05％矿源黄腐酸钾与扩繁基质中的沸石混合均匀作为混合物1待用；
步骤六、丛枝菌根真菌的接种和宿主植物的种植：装准备好的混合物1至扩繁容器的3/5体积处，后将对应的丛枝菌根菌剂均匀覆于基质上层，再覆盖1cm厚度的混合物1，然后播种玉米种子播种完后再覆一层混合物1，玉米种子长出幼苗后根据扩繁容器大小进行间苗；
步骤七、添加组分吲哚乙酸：在玉米种子出苗30d后,采用灌根法浇灌50μmo l/L吲哚乙酸水溶液，用量为基质的2％，3天浇灌一次，共10次处理；
步骤八、添加组分独角金内酯GR24：在玉米长出3-4片幼叶时开始，采用根施法浇灌1.0μmo l/L的独角金内酯GR24水溶液，用量为基质重量的1％，一周使用一次，共4次处理；
步骤九、外源添加组分脱落酸：在玉米出苗时，采用根施法浇灌50μmo l/L的脱落酸水溶液和100μmo l/L的生长素IAA水溶液，用量均为基质重量的2％，一周使用一次，共12次处理；
步骤十、外源添加组分银杏提取物黄酮类物质：在玉米出苗时，分别在玉米生长的第一周和第三周时，浇灌150nM的类黄酮水溶液，用量为基质的20％，共2次处理。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、显著降低了丛枝菌根真菌培养基质的制备成本，常规丛枝菌根真菌培养基质是土，容易造成基质灭菌不彻底，菌剂易受杂菌污染的缺点。本发明采用的沸石，市场价是170-180元/吨，而且结构简单、成分单一稳定、对菌未知的影响因素少。成本低、易获得、易制备、非常适用于大规模繁育；
2、生产周期短：常规丛枝菌根真菌培养要四个月，本发明只需要生产只需要70-80天，能够实现快速培育和大量培育丛枝菌根真菌等效果；
3、产孢效率高：常规丛枝菌根真菌培养，得到的丛枝菌根真菌菌剂中丛枝菌根真菌的有效孢子数量是100-200个/克，本发明得到的丛枝菌根真菌菌剂中丛枝菌根真菌的有效孢子数量不低于800-1000个/克；
4、寄主利用效率高：根冠比增加根系是原来的150％-200％；
5、减少人工操作：浇水频率降低，正常条件下一个星期交一次水，现在20-30天交一次水，适用于大规模繁育；
具体实施案例一：
一种用于丛枝菌根真菌规模生产的培养基质的实验方法，
培养地点：陕西省渭南市
生产时间：每年的5-9月进行菌剂的生产
生产管理：前6周每周浇灌1次减半含磷量的Hoagland(霍格兰氏)营养液，每公斤基质50-100mL，后续根据培养基质干湿情况进行适量浇水
生产环境控制：生产室内白天温度控制在25-28℃，夜间温度控制在20-25℃，光照时间为14h/d。
质量检测指标：
(1)检测指标：检测玉米出苗率、丛枝菌根真菌的侵染率、产孢量。
(2)检测方法：镜检，采用phillips和Haymann曲利苯蓝染色法测定侵染率；采用湿筛倾析技术并结合糖离心法测定产孢量。出苗率的检测出方法：以3平方为一个单元，随机抽查6个单元，调查玉米的出苗情况。
效果评价标准：控制玉米的出苗率达到95％-98％；控制根冠比，根系是未使用之前的150％-200％。
具体步骤如下：
步骤一基质灭菌，将20-40目的沸石、40-60目的沸石、60-80目的沸石按照1:6:2的体积比混合均匀后，平铺在传送带上，厚度为3cm，进行100℃高温蒸汽灭菌，待自然冷却后备用；
步骤二寄主植物种子的消毒：将玉米种子用10％H2O2消毒10min后，清水清洗干净，再用清水浸泡12h待用；
步骤三扩繁容器的消毒：对进行扩繁的容器用10％的次氯酸钙消毒灭菌处理待用；
步骤四配减半含磷量的Hoagland(霍格兰氏)营养液：硝酸钙945mg/L、硝酸钾607mg/L、磷酸铵115mg/L硫酸镁493mg/L、铁盐溶液2.5ml/L、微量元素5ml/L、PH＝6。
步骤五添加组分二(矿源黄腐酸钾)：在试验前，将0.05％矿源黄腐酸钾与扩繁基质中的沸石混合均匀作为混合物1待用。
步骤六丛枝菌根真菌的接种和宿主植物的种植：装准备好的混合物1至扩繁容器的3/5体积处，然后将对应的丛枝菌根菌剂均匀覆于基质上层，再覆盖1cm厚度的混合物1，然后播种玉米种子播种完后再覆一层混合物1(玉米种子长出幼苗后根据扩繁容器大小进行间苗。
步骤七添加组分吲哚乙酸：在玉米种子出苗30d后,采用灌根法浇灌50μmol/L吲哚乙酸水溶液，用量为基质的2％，3天浇灌一次，共10次处理。
步骤八添加组分独角金内酯GR24：在玉米长出3-4片幼叶时开始，采用根施法浇灌1.0μmol/L的独角金内酯GR24水溶液，用量为基质重量的1％，一周使用一次，共4次处理。
步骤九外源添加组分脱落酸：在玉米出苗时，采用根施法浇灌50μmol/L的脱落酸水溶液和100μmol/L的生长素IAA水溶液，用量均为基质重量的2％，一周使用一次，共12次处理。
步骤十外源添加组分银杏提取物黄酮类物质：在玉米出苗时，分别在玉米生长的第一周和第三周时，浇灌150nM的类黄酮水溶液，用量为基质的20％，共2次处理。
检测结果如表一:
| 第2周 | 第8周 | 第12周 | |
| 丛枝菌根菌根侵染率(％) | 50.73±1.1 | 92.7±0.8 | 98.8±0.1 |
| 菌剂中菌剂含量(个/g) | / | 877±9 | 997±4 |
玉米出苗达到98％以上，培养70-80天后即可获得丛枝菌根真菌菌剂，通过多次取样数据统计分析，玉米在生长到第2周时，丛枝菌根侵染率达50％以上，在第8周时，侵染率达92％，到12周时，每克培养物中孢子密度不低于800-1000个/克，对寄主植株的侵染率不低于98％。
具体实施案例二：本实施方式与具体实施方式一的不同点在于：步骤六中的与丛枝菌根真菌共生的宿主植物为高粱。其它步骤及参数与实施方式一中相同。
检测结果如表二：
高粱出苗率达到96％以上，培养70-80天后即可获得丛枝菌根真菌菌剂，通过多次取样数据统计分析，高粱在生长到第2周时，丛枝菌根侵染率达50％以上，在第8周时，侵染率达94％，到12周后，每克培养物中孢子密度不低于800-1000个/克，对寄主植株的侵染率不低于98％。
实施案例3为本发明中用于丛枝菌根真菌规模生产的最佳培养基质。
对比例1：相对于不同目数沸石混合使用与单一目数沸石使用的对比试验。
对比例1-1：与具体实施案例1不同之处在于：培养基质20-40目的沸石、40-60目的沸石、60-80目的沸石的体积比为1:3:5，其他均相同。
对比例1-2：与具体实施案例1不同之处在于：培养基质20-40目的沸石、40-60目的沸石、60-80目的沸石的体积比为3:4:2，其他均相同。
对比例1-3：与具体实施案例1不同之处在于：培养基质使用20-40单一目数沸石，其他均相同。
对比例1-4：与具体实施案例1不同之处在于：培养基质使用40-60单一目数沸石，其他均相同。
对比例1-5：与具体实施案例1不同之处在于：培养基质使用60-80单一目数沸石，其他均相同。
检测结果如表三：
对比例2：在同样实验条件下，缺少某一组分的培养基质的对比实验
实施案例1为本发明中用于丛枝菌根真菌规模生产的最佳培养基质。
对比例2-1：与具体实施案例1不同之处在于：缺少步骤八中独角金内脂GR24溶液的添加，其他均相同。
对比例2-2：与具体实施案例1不同之处在于：缺少步骤九中脱落酸水溶液的添加，其他均相同。
对比例2-3：与具体实施案例1不同之处在于：缺少步骤十中类黄酮水溶液的添加，其他均相同。
其他步骤与具体实施方式一相同。
检测结果如表四：
对比例3：在相同实验条件下，培养基质中各组分不同含量的对比实验。
实施案例1为本发明中用于丛枝菌根真菌规模生产的最佳培养基质。
对比例3-1：与具体实施案例1不同之处在于：步骤七中50μmo l/L吲哚乙酸水溶液浓度改为20μmo l/L，其他均相同
对比例3-2：与具体实施案例1不同之处在于：步骤九中50μmo l/L的脱落酸水溶液浓度改为100μmo l/L，其他均相同。
对比例3-3：与具体实施案例1不同之处在于：步骤十中150nM的类黄酮水溶液浓度改为50nM，其他均相同。
其他步骤与具体实施方式一相同。
检测结果如表五：
综上所述，本发明实施案例1中提供的培养基质为大规模生产丛枝菌根真菌最佳培养基质。
与现在技术比较，本发明具有以下优点：
传统的以砂或土为基质较易扩繁丛枝菌根真菌，但存在基质成分复杂，需要灭菌处理和接种剂重量大，不便于运输等缺点，将沸石作为丛枝菌根真菌的扩繁材料，具有侵染率高、质轻、好获取、便于运输等特点，不同目数的沸石可避免在补水过程中基质水分的过快流失、减少对菌的活性的冲击作用，从而更加有利于生产侵染率高、低成本、质轻的丛枝菌根真菌菌剂；
在丛枝菌根真菌扩繁的过程中，利用外源添施激素的方式增加丛枝菌根真菌的产孢量，在培育丛枝菌根真菌方面能够实现快速培育和大量培育丛枝菌根真菌的效果，降低规模生产成本、缩短培养时间、减少人工操作，满足农业生产的规模需求，具有可控性，使丛枝菌根真菌的产业化推广更加成熟化。
Claims (2)
1.一种用于丛枝菌根真菌规模生产的培养基质的实验方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤一、基质灭菌，将20-40目的沸石、40-60目的沸石、60-80目的沸石按照1:6:2的体积比混合均匀后，平铺在传送带上，厚度为3 cm，进行100℃高温蒸汽灭菌，待自然冷却后备用；
步骤二、寄主植物种子的消毒：将玉米种子用10%H2O2消毒10 min后，清水清洗干净，再用清水浸泡12h待用；
步骤三、扩繁容器的消毒：对进行扩繁的容器用10%的次氯酸钙消毒灭菌处理待用；
步骤四、配减半含磷量的霍格兰氏营养液：硝酸钙945mg/L、硝酸钾607mg/L、磷酸铵115mg/L、硫酸镁 493 mg/L、铁盐溶液2.5 ml/L、微量元素5ml/L、PH=6；
步骤五、添加矿源黄腐酸钾：在试验前，将0.05%矿源黄腐酸钾与扩繁基质中的沸石混合均匀作为混合物1待用；
步骤六、丛枝菌根真菌的接种和宿主植物的种植：装准备好的混合物1至扩繁容器的3/5 体积处，然后将对应的丛枝菌根菌剂均匀覆于基质上层，再覆盖1cm厚度的混合物1，然后播种玉米种子播种完后再覆一层混合物1，玉米种子长出幼苗后根据扩繁容器大小进行间苗；
步骤七、添加组分吲哚乙酸：在玉米种子出苗30d后,采用灌根法浇灌50μmol/L吲哚乙酸水溶液，用量为基质的2%，3天浇灌一次，共10次处理；
步骤八、添加组分独角金内酯GR24：在玉米长出3-4片幼叶时开始，采用根施法浇灌1.0μmol/L的独角金内酯GR24水溶液，用量为基质重量的1%，一周使用一次，共4次处理；
步骤九、外源添加组分脱落酸：在玉米出苗时，采用根施法浇灌50μmol/L的脱落酸水溶液和100μmol/L的生长素IAA水溶液，用量均为基质重量的2%，一周使用一次，共12次处理；
步骤十、外源添加组分银杏提取物黄酮类物质：在玉米出苗时，分别在玉米生长的第一周和第三周时，浇灌150nM的银杏提取物黄酮类物质水溶液，用量为基质的20%，共2次处理。
2.根据权利要求1所述方法的培养基质组成，其特征在于：包括
20-40目的沸石、40-60目的沸石、60-80目的沸石按照1:6:2的体积比；
试剂包括：0.05%矿源黄腐酸钾、50μmol/L-100μmol/L吲哚乙酸、0.5μmol/L-1.0μmol/L独角金内脂GR24；50μmol/L-100μmol/L脱落酸ABA、100nM-200nM银杏提取物黄酮类物质、50μmol/L-100μmol/L生长素IAA。
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