CN112760397A - 一种沃特曼篮状菌Talaromyces wortmannii在作物抗旱、促生中的应用 - Google Patents
一种沃特曼篮状菌Talaromyces wortmannii在作物抗旱、促生中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种沃特曼篮状菌Talaromyces wortmannii在作物抗旱、促生中的应用，其技术方案是：包括以下具体步骤：S1制备、S2浸种、S3播种、S4断水、S5统计、S6菌株耐旱机制研究、S7多基因序列分析，本发明的有益效果是：在实验室借助人工调控手段，将待鉴定种子置于控制温度条件下经浸种、通过发芽后生长至特定苗高，再利用控温、控湿光照温室进行控温、控湿处理，使盆栽上生长幼苗失水，可以对幼苗进行耐旱处理并进行修复处理，观察其幼苗的根、叶片等的生长情况，从而判定作物的耐旱性，本发明在提高作物生长速度、抗旱能力等方面作用效果显著，且能够人工培养，繁殖速度快，便于进行规模化生产，具有良好的开发应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及植物抗旱技术领域，具体涉及一种沃特曼篮状菌Talaromyceswortmannii在作物抗旱、促生中的应用。
背景技术
水资源短缺是目前制约农业生产的一个全球性问题，随着工业化的快速发展，自然灾害的频繁，降水量的减少，全球约有43％的耕地为干早、半干早地区，对种植业提出了巨大挑战，根际微生物是分布于作物根际土壤中的微生物的总称，活跃在根际土壤中的微生物和作物的生长状态密切相关，本发明报道一株分离自根际土壤的沃特曼篮状菌Talaromyces wortmannii，菌株号为MN122989，现已保藏于广东省微生物菌种保藏中心。
现有技术存在以下不足：干早逆境会严重影响植物的生长发育，造成作物减产减收，目前农业领域主要使用海藻肥类、氨基酸水溶肥类、植物生长调节剂类协助作物抗旱，但是效果并不是非常显著，特别是容易受到干旱胁迫影响的农作物，如玉米、水稻等，因此通过基因工程手段，提高种子的抗旱性，对于干旱造成的减产具有非常重要的意义。
因此，发明一种沃特曼篮状菌Talaromyces wortmannii在作物抗旱、促生中的应用很有必要。
发明内容
为此，本发明提供一种沃特曼篮状菌Talaromyces wortmannii在作物抗旱、促生中的应用，可以借助人工调控手段，在温室模拟干旱条件，判定作物的耐旱性，在提高生长速度、抗旱能力等方面作用效果显著，以解决干早逆境严重影响植物的生长发育，造成作物减产减收的问题。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种沃特曼篮状菌 Talaromyceswortmannii在作物抗旱、促生中的应用，包括以下具体步骤：
S1制备：向无菌离心管内加入30mL PDB培养液，然后将18块菌体打孔并装在无菌离心管内，放在恒温振荡培养箱内培养3-5天制成菌液，用血球计数板计数孢子数，使其发酵。
S2浸种：选取颗粒饱满的健康种子进行表面消毒，然后在室温条件下，将种子浸泡在菌液发酵液内过夜。
S3播种：将营养液与基质土充分混合均匀后，分别填装在多个育苗钵内，再将菌液发酵液浸种后的种子分别播种至多个育苗钵内，作为各项处理组。
S4断水：测定各项处理组的土壤水分含量，然后在播种后的第14天开始对所有处理组做断水处理，每日观察植株的干旱等级，根据各项处理组植株干旱等级情况进行两次复水安排，对种子萌发期的耐旱指数进行统计。
S5统计：在第二次复水后的隔天统计各项处理组植株株高、根部表面积、鲜重、干重，最后通过各项指标进行综合评价，得出植株的抗旱性数据。
S6菌株耐旱机制研究：对菌株进行耐旱机制的研究与测试，依次为在不同的水活度下生长能力测试，菌株产吲哚乙酸测试，EPS产孢外多糖活性测定，植物叶片中脯氨酸含量测定以及植物叶片中抗氧化酶类提取及活性测定。
S7多基因序列分析：对菌株进行基因提取与PCR扩增，对基因序列同源性进行分析。
优选的，在所述步骤S1中，恒温振荡培养箱内的培养条件为28℃，200rmp，菌液在制备时发酵液孢子数需要调至106CFU/毫升。
优选的，在所述步骤S2中，消毒时首先使用75％乙醇对种子消毒1分钟，然后使用无菌水洗3遍后，再用5％次氯酸钠消毒5分钟，最后再用无菌水洗3 遍。
优选的，在所述步骤S3中，基质土需要在立式蒸汽高压灭菌锅121℃灭菌 60分钟后，再将营养液与灭菌后的基质土按照1:8v/m的比例进行充分混合。
优选的，在所述步骤S4中，在播种后1-13天，所有处理组隔天浇灌10毫升营养液，在第14天做断水处理前需要向所有处理组浇灌20毫升营养液。
优选的，在所述步骤S4中，当处理组植株普遍萎缩至4级时，向所有处理浇灌20毫升营养液作为第一次复水，当处理组植株普遍萎缩至5级时，向所有处理浇灌20毫升营养液作为第二次复水。
优选的，在所述步骤S5中，评价抗旱性的指标分别为相对发芽势、种子萌发耐旱指数、根系表面积、株高、鲜重、干重与干旱等级。
优选的，在所述步骤S6中，植物叶片中抗氧化酶类提取及活性测定包括SOD 活性测定、CAT、活性测定与POD活性测定。
本发明的有益效果是：
本发明公开了一种沃特曼篮状菌Talaromyces wortmannii增强粮食作物耐旱性的实验室快速筛选方法，通过控温、控湿、光照设备等方式来达到干旱环境的目的，在实验室借助人工调控手段，将待鉴定种子置于控制温度条件下经浸种、通过发芽后生长至特定苗高，再利用控温、控湿光照温室进行控温、控湿处理，使盆栽上生长幼苗失水，从而对幼苗进行耐旱处理并进行修复处理，观察其幼苗的根、叶片等的生长情况，从而判定作物的耐旱性，本发明在提高作物生长速度、抗旱能力等方面作用效果显著，且能够人工培养，繁殖速度快，便于进行规模化生产，具有良好的开发应用前景，本发明在实验室内鉴定种子干扰因素少，环境条件易控制，该方法具有方便、快捷及所得结果精确可靠，且不需要昂贵的仪器设备以及培养基等优点，适合对大量的菌株高通量筛选。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：
本发明提供的一种沃特曼篮状菌Talaromyces wortmannii在作物抗旱、促生中的应用，包括以下具体步骤：
S1制备：向无菌离心管内加入30mL PDB培养液，然后将18块菌体打孔并装在无菌离心管内，放在恒温振荡培养箱内培养3天制成菌液，用血球计数板计数孢子数，使其发酵，恒温振荡培养箱内的培养条件为28℃，200rmp，菌液在制备时发酵液孢子数需要调至106CFU/毫升，以确保菌液发酵环境稳定，为种子打下良好的生长基础。
S2浸种：选取颗粒饱满的健康种子进行表面消毒，然后在室温条件下，将种子浸泡在菌液发酵液内过夜，消毒时首先使用75％乙醇对种子消毒1分钟，然后使用无菌水洗3遍后，再用5％次氯酸钠消毒5分钟，最后再用无菌水洗3遍，确保种子外表面不会出现病菌或其他物质，影响实验数据。
S3播种：将营养液与基质土充分混合均匀后，分别填装在多个育苗钵内，再将菌液发酵液浸种后的种子分别播种至多个育苗钵内，作为各项处理组，基质土需要在立式蒸汽高压灭菌锅121℃灭菌60分钟后，再将营养液与灭菌后的基质土按照1:8v/m的比例进行充分混合，避免基质土本身携带其他菌体，造成种子发育不良，影响种子萌芽生长，影响实验数据。
S4断水：测定各项处理组的土壤水分含量，然后在播种后的第14天开始对所有处理组做断水处理，每日观察植株的干旱等级，根据各项处理组植株干旱等级情况进行两次复水安排，对种子萌发期的耐旱指数进行统计，在播种后1-13 天，所有处理组隔天浇灌10毫升营养液，在第14天做断水处理前需要向所有处理组浇灌20毫升营养液，当处理组植株普遍萎缩至4级时，向所有处理浇灌 20毫升营养液作为第一次复水，当处理组植株普遍萎缩至5级时，向所有处理浇灌20毫升营养液作为第二次复水。
S5统计：在第二次复水后的隔天统计各项处理组植株株高、根部表面积、鲜重、干重，最后通过各项指标进行综合评价，得出植株的抗旱性数据，评价抗旱性的指标分别为相对发芽势、种子萌发耐旱指数、根系表面积、株高、鲜重、干重与干旱等级，利用抗旱隶属函数法可以得出植物抗旱性强弱排序，同时通过Excel 2010及SPSS 19.0对数据进行统计分析。
S6菌株耐旱机制研究：对菌株进行耐旱机制的研究与测试，依次为在不同的水活度下生长能力测试，菌株产吲哚乙酸测试，EPS产孢外多糖活性测定，植物叶片中脯氨酸含量测定以及植物叶片中抗氧化酶类提取及活性测定，经过多方测定，发现菌株作用于植物时，可分泌大量并能够清除活性氧的酶系和抗氧化物质以及脯氨酸，帮助植物对应干旱胁迫，从而增强环境适应能力，同时对修复植物的生长也具有明显的促生作用。
S7多基因序列分析：对菌株进行基因提取与PCR扩增，对基因序列同源性进行分析，基因组提取采取用Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒完成。
实施例2：
本发明提供的一种沃特曼篮状菌Talaromyces wortmannii在作物抗旱、促生中的应用，包括以下具体步骤：
S1制备：向无菌离心管内加入30mL PDB培养液，然后将18块菌体打孔并装在无菌离心管内，放在恒温振荡培养箱内培养4天制成菌液，用血球计数板计数孢子数，使其发酵，恒温振荡培养箱内的培养条件为28℃，200rmp，菌液在制备时发酵液孢子数需要调至106CFU/毫升，以确保菌液发酵环境稳定，为种子打下良好的生长基础。
S2浸种：选取颗粒饱满的健康种子进行表面消毒，然后在室温条件下，将种子浸泡在菌液发酵液内过夜，消毒时首先使用75％乙醇对种子消毒1分钟，然后使用无菌水洗3遍后，再用5％次氯酸钠消毒5分钟，最后再用无菌水洗3遍，确保种子外表面不会出现病菌或其他物质，影响实验数据。
S3播种：将营养液与基质土充分混合均匀后，分别填装在多个育苗钵内，再将菌液发酵液浸种后的种子分别播种至多个育苗钵内，作为各项处理组，基质土需要在立式蒸汽高压灭菌锅121℃灭菌60分钟后，再将营养液与灭菌后的基质土按照1:8v/m的比例进行充分混合，避免基质土本身携带其他菌体，造成种子发育不良，影响种子萌芽生长，影响实验数据。
S4断水：测定各项处理组的土壤水分含量，然后在播种后的第14天开始对所有处理组做断水处理，每日观察植株的干旱等级，根据各项处理组植株干旱等级情况进行两次复水安排，对种子萌发期的耐旱指数进行统计，在播种后1-13 天，所有处理组隔天浇灌10毫升营养液，在第14天做断水处理前需要向所有处理组浇灌20毫升营养液，当处理组植株普遍萎缩至4级时，向所有处理浇灌 20毫升营养液作为第一次复水，当处理组植株普遍萎缩至5级时，向所有处理浇灌20毫升营养液作为第二次复水。
S5统计：在第二次复水后的隔天统计各项处理组植株株高、根部表面积、鲜重、干重，最后通过各项指标进行综合评价，得出植株的抗旱性数据，评价抗旱性的指标分别为相对发芽势、种子萌发耐旱指数、根系表面积、株高、鲜重、干重与干旱等级，利用抗旱隶属函数法可以得出植物抗旱性强弱排序，同时通过Excel 2010及SPSS 19.0对数据进行统计分析。
S6菌株耐旱机制研究：对菌株进行耐旱机制的研究与测试，依次为在不同的水活度下生长能力测试，菌株产吲哚乙酸测试，EPS产孢外多糖活性测定，植物叶片中脯氨酸含量测定以及植物叶片中抗氧化酶类提取及活性测定，经过多方测定，发现菌株作用于植物时，可分泌大量并能够清除活性氧的酶系和抗氧化物质以及脯氨酸，帮助植物对应干旱胁迫，从而增强环境适应能力，同时对修复植物的生长也具有明显的促生作用。
S7多基因序列分析：对菌株进行基因提取与PCR扩增，对基因序列同源性进行分析，基因组提取采取用Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒完成。
实施例3：
本发明提供的一种沃特曼篮状菌Talaromyces wortmannii在作物抗旱、促生中的应用，包括以下具体步骤：
S1制备：向无菌离心管内加入30mL PDB培养液，然后将18块菌体打孔并装在无菌离心管内，放在恒温振荡培养箱内培养5天制成菌液，用血球计数板计数孢子数，使其发酵，恒温振荡培养箱内的培养条件为28℃，200rmp，菌液在制备时发酵液孢子数需要调至106CFU/毫升，以确保菌液发酵环境稳定，为种子打下良好的生长基础。
S2浸种：选取颗粒饱满的健康种子进行表面消毒，然后在室温条件下，将种子浸泡在菌液发酵液内过夜，消毒时首先使用75％乙醇对种子消毒1分钟，然后使用无菌水洗3遍后，再用5％次氯酸钠消毒5分钟，最后再用无菌水洗3遍，确保种子外表面不会出现病菌或其他物质，影响实验数据。
S3播种：将营养液与基质土充分混合均匀后，分别填装在多个育苗钵内，再将菌液发酵液浸种后的种子分别播种至多个育苗钵内，作为各项处理组，基质土需要在立式蒸汽高压灭菌锅121℃灭菌60分钟后，再将营养液与灭菌后的基质土按照1:8v/m的比例进行充分混合，避免基质土本身携带其他菌体，造成种子发育不良，影响种子萌芽生长，影响实验数据。
S4断水：测定各项处理组的土壤水分含量，然后在播种后的第14天开始对所有处理组做断水处理，每日观察植株的干旱等级，根据各项处理组植株干旱等级情况进行两次复水安排，对种子萌发期的耐旱指数进行统计，在播种后1-13 天，所有处理组隔天浇灌10毫升营养液，在第14天做断水处理前需要向所有处理组浇灌20毫升营养液，当处理组植株普遍萎缩至4级时，向所有处理浇灌 20毫升营养液作为第一次复水，当处理组植株普遍萎缩至5级时，向所有处理浇灌20毫升营养液作为第二次复水。
S5统计：在第二次复水后的隔天统计各项处理组植株株高、根部表面积、鲜重、干重，最后通过各项指标进行综合评价，得出植株的抗旱性数据，评价抗旱性的指标分别为相对发芽势、种子萌发耐旱指数、根系表面积、株高、鲜重、干重与干旱等级，利用抗旱隶属函数法可以得出植物抗旱性强弱排序，同时通过Excel 2010及SPSS 19.0对数据进行统计分析。
S6菌株耐旱机制研究：对菌株进行耐旱机制的研究与测试，依次为在不同的水活度下生长能力测试，菌株产吲哚乙酸测试，EPS产孢外多糖活性测定，植物叶片中脯氨酸含量测定以及植物叶片中抗氧化酶类提取及活性测定，经过多方测定，发现菌株作用于植物时，可分泌大量并能够清除活性氧的酶系和抗氧化物质以及脯氨酸，帮助植物对应干旱胁迫，从而增强环境适应能力，同时对修复植物的生长也具有明显的促生作用。
S7多基因序列分析：对菌株进行基因提取与PCR扩增，对基因序列同源性进行分析，基因组提取采取用Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒完成。
实施例4：
分别取上述实施例1-3的方法，选取90个菌株，每组分为30个，分别对种子进行浸种与播种试验，在第二次复水后的隔天统计各项处理组植株株高、根部表面积、鲜重、干重等，最后通过各项指标进行综合评价，得到以下数据：
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | |
| 相对发芽势 | 0.12 | 1.00 | 0.56 |
| 萌发耐旱指数 | 0.92 | 1.24 | 0.99 |
| 鲜重/g | 2.75±0.94ab | 2.84±0.74ab | 2.78±0.82ab |
| 干重/g | 0.27 | 0.26 | 0.26 |
| 根部表面积/cm2 | 36.07±15.89bcd | 46.8±14.34bc | 40.3±15.36bcd |
| 株高/cm | 34.81±8.92ab | 38.87±3.96a | 36.62±5.96a |
| 收获时干旱等级 | 6.2±0.77d | 7.93±1.03ab | 6.96±0.73ab |
由上表可知，实施例2中方法适宜(注：同列数字后英文字母相同者表示在0.05水平上差异不显著(DMRT法))，同时根据目标菌株在多种作物种子上的应用及试验，如玉米、水稻和小麦等，最终发现一种沃特曼篮状菌Talaromyces wortmannii在提高作物生长速度、抗旱能力等方面作用效果显著，且能够人工培养，繁殖速度快，便于进行规模化生产，具有良好的开发应用前景，同时需要说明：为了更好了解土壤的干旱等级，本次试验属于超级重度干旱等级(轻度55-65％、中度40-55％、重度30-40％)，正常浇灌75-85％，而植株干旱等级评价标准采用1-9级评价体系，9级最好，1级最差，具体为：
9级，植株完好；
8级，叶子开始变软，但还没有卷曲，叶子个别区域出现颜色变浅；
7级，叶子继续变软，叶色继续变浅，至少有1片叶子开始卷曲；
6级，叶子继续变软，颜色变浅，大部分的叶子开始卷曲；
5级，所有叶子都开始变软卷曲，甚至叶子下垂；
4级，最下面叶子开始干枯，植株整体变坏，中间的叶子也卷曲严重；
3级，最下面的两片叶子枯萎，其他叶子也开始干枯；
2级，中间叶子开始干枯；
1级，任何比2级更严重的都归为1级。
本发明提供的一种沃特曼篮状菌Talaromyces wortmannii，该生物材料样品的分类学名称为Talaromyces wortmannii(拉丁文名称)，保藏该生物材料样品的单位全称是广东省微生物菌种保藏中心，该单位地址位于广东省广州市先烈中路 100号大院广东省微生物研究所59栋5楼，该生物材料样品的保藏日期为2020 年12月10日，该生物材料样品的鉴别特征为Talaromvces wortmannii MN122989，该生物材料样品在广东省微生物菌种保藏中心的登记入册编号为GDMCC No: 61365。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，任何熟悉本领域的技术人员均可能利用上述阐述的技术方案对本发明加以修改或将其修改为等同的技术方案。因此，依据本发明的技术方案所进行的任何简单修改或等同置换，尽属于本发明要求保护的范围。
Claims (8)
1.一种沃特曼篮状菌Talaromyces wortmannii在作物抗旱、促生中的应用，其特征在于：包括以下具体步骤：
S1制备：向无菌离心管内加入30mL PDB培养液，然后将18块菌体打孔并装在无菌离心管内，放在恒温振荡培养箱内培养3-5天制成菌液，用血球计数板计数孢子数，使其发酵。
S2浸种：选取颗粒饱满的健康种子进行表面消毒，然后在室温条件下，将种子浸泡在菌液发酵液内过夜。
S3播种：将营养液与基质土充分混合均匀后，分别填装在多个育苗钵内，再将菌液发酵液浸种后的种子分别播种至多个育苗钵内，作为各项处理组。
S4断水：测定各项处理组的土壤水分含量，然后在播种后的第14天开始对所有处理组做断水处理，每日观察植株的干旱等级，根据各项处理组植株干旱等级情况进行两次复水安排，对种子萌发期的耐旱指数进行统计。
S5统计：在第二次复水后的隔天统计各项处理组植株株高、根部表面积、鲜重、干重，最后通过各项指标进行综合评价，得出植株的抗旱性数据。
S6菌株耐旱机制研究：对菌株进行耐旱机制的研究与测试，依次为在不同的水活度下生长能力测试，菌株产吲哚乙酸测试，EPS产孢外多糖活性测定，植物叶片中脯氨酸含量测定以及植物叶片中抗氧化酶类提取及活性测定。
S7多基因序列分析：对菌株进行基因提取与PCR扩增，对基因序列同源性进行分析。
2.根据权利要求1所述的一种沃特曼篮状菌Talaromyces wortmannii在作物抗旱、促生中的应用，其特征在于：在所述步骤S1中，恒温振荡培养箱内的培养条件为28℃，200rmp，菌液在制备时发酵液孢子数需要调至106CFU/毫升。
3.根据权利要求1所述的一种沃特曼篮状菌Talaromyces wortmannii在作物抗旱、促生中的应用，其特征在于：在所述步骤S2中，消毒时首先使用75％乙醇对种子消毒1分钟，然后使用无菌水洗3遍后，再用5％次氯酸钠消毒5分钟，最后再用无菌水洗3遍。
4.根据权利要求1所述的一种沃特曼篮状菌Talaromyces wortmannii在作物抗旱、促生中的应用，其特征在于：在所述步骤S3中，基质土需要在立式蒸汽高压灭菌锅121℃灭菌60分钟后，再将营养液与灭菌后的基质土按照1:8v/m的比例进行充分混合。
5.根据权利要求1所述的一种沃特曼篮状菌Talaromyces wortmannii在作物抗旱、促生中的应用，其特征在于：在所述步骤S4中，在播种后1-13天，所有处理组隔天浇灌10毫升营养液，在第14天做断水处理前需要向所有处理组浇灌20毫升营养液。
6.根据权利要求1所述的一种沃特曼篮状菌Talaromyces wortmannii在作物抗旱、促生中的应用，其特征在于：在所述步骤S4中，当处理组植株普遍萎缩至4级时，向所有处理浇灌20毫升营养液作为第一次复水，当处理组植株普遍萎缩至5级时，向所有处理浇灌20毫升营养液作为第二次复水。
7.根据权利要求1所述的一种沃特曼篮状菌Talaromyces wortmannii在作物抗旱、促生中的应用，其特征在于：在所述步骤S5中，评价抗旱性的指标分别为相对发芽势、种子萌发耐旱指数、根系表面积、株高、鲜重、干重与干旱等级。
8.根据权利要求1所述的一种沃特曼篮状菌Talaromyces wortmannii在作物抗旱、促生中的应用，其特征在于：在所述步骤S6中，植物叶片中抗氧化酶类提取及活性测定包括SOD活性测定、CAT、活性测定与POD活性测定。
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|---|---|---|---|---|
| CN113080205A (zh) * | 2021-04-01 | 2021-07-09 | 慕恩（广州）生物科技有限公司 | 一种沃特曼菌篮状菌、菌剂及在制备生长调节剂中的应用 |
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| JP2001031564A (ja) * | 1999-05-19 | 2001-02-06 | Mitsubishi Chemicals Corp | テロメレース阻害剤 |
| CN101081848A (zh) * | 2006-01-06 | 2007-12-05 | 华北制药集团有限责任公司 | 新的多烯类化合物及其制备方法和用途 |
| JP2015129744A (ja) * | 2013-12-04 | 2015-07-16 | 英樹 村上 | 有機酸と糸状菌・放線菌類バイオフィルムを活用した農地土壌除染方法と植物活性化方法 |
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2020
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Patent Citations (3)
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| CN113080205B (zh) * | 2021-04-01 | 2022-04-15 | 慕恩（广州）生物科技有限公司 | 一种沃特曼菌篮状菌、菌剂及在制备生长调节剂中的应用 |
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