CN111919694B - 一种水培溶液及其高品质黄芪的培育方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于黄芪种植技术领域，具体涉及一种水培溶液及其高品质黄芪的培育方法，水培溶液由以下组分制备而成：5mM KNO₃；1mM H₃PO₄；1mM MgSO₄；0.01mM‑20mM CaCl₂；5mM MES；微量元素：MS微量元素(0.5×)，MS Fe盐(0.5×)，KOH调pH至5.7。培育方法如下：对黄芪幼苗进行了低钙组、CK组和高钙组三个钙浓度处理，测定黄芪根部黄酮类化合物的含量。检测结果显示，低钙组的毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素含量显著高于CK组和高钙组，所述的培育方法提高黄芪药物的品质，同时提高黄芪幼苗的抗干旱能力、抗盐能力、抗紫外能力和抗冻能力。

Description

一种水培溶液及其高品质黄芪的培育方法

技术领域

本发明涉及黄芪的种植技术领域，具体涉及一种高品质黄芪的培育方法。

背景技术

黄芪为临床常用的中药材之一，为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bunge.)Hsiao(A.mongholicus)与膜荚黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bunge(A.membranaceus)的干燥根，具有补气升阳、固表止汗、利水消肿、生津养血等功效^[1]。黄芪中含有多糖类、皂苷类、黄酮类、叶酸、生物碱及微量元素等多种有效成分。其中，黄酮类是药效活性的重要成分，毛蕊异黄酮葡萄糖苷更是是黄芪的品质评价的标志性成分^[2]。同时，黄酮类也是一类提高植物在逆境中的耐受性的植物次级代谢产物。植物在生物或非生物逆境胁迫中，常常会激活一系列保护体系，包括增加抗氧化酶系统活性、渗透调节物质含量和抗氧化物质含量^[3]来抵御生物侵害和自身氧自由基的损伤。黄酮类物质作为重要的植物抗氧化保护物质，在植物应对逆境过程中发挥重要作用。已有研究表明干旱^[4]、高盐度^[5]、强紫外^[6]和低温^[7]都能促使黄酮类化合物在植物体内的积累。适度的干旱胁迫、茉莉酸甲酯和UV-B都能诱导黄芪根部黄酮类化合物积累^[8]。因此，植物体内黄酮类物质含量的增加水平常用作植物耐逆性品质评价。

水培是一种重要的无土栽培方式，具有节水、省肥、高产、高效、清洁卫生无污染、易于管理、不受土地和连作障碍的限制、便于工厂化生产等优点，广泛应用于蔬菜、花卉、药用植物、果树和苗木的栽培生产。目前，黄芪的药材主要来源于人工种植，专利CN201410192529.8公开了一种黄芪栽培方法，该发明成功将黄芪移植到岭南地区，不仅生产周期缩短一半，而且产量也得到了不小的提高，黄芪有效成分含量也不低，从而使之可以在该地区推广以满足医药需求，但是，所述的栽培方法并没有显著的提高黄芪根部的黄酮类营养物质。在种植过程中，黄芪栽培生产常利用移苗种植，黄芪苗的生产一般使用传统的土壤种植法，生产周期长达1年，药苗的连作常常导致根腐病严重。利用水培法生产黄芪苗是一种成熟的具有前途的生产方式，然而黄芪苗所适应的水培环境与较为干旱的移栽种植环境存在巨大水分差距，因此如何生产具有耐旱的高品质水培苗是本领域技术人员长期未解决的技术问题。

钙是植物生长发育所必需的矿质元素，在细胞的结构及各生理生化代谢过程中具有重要作用。同时，钙离子也是植物细胞响应外界环境变化信号转导过程中重要的信号分子。钙营养的缺乏会引起植物细胞壁的稳定性下降，导致桃、苹果、梨、樱桃等果实褐变腐烂，降低果实贮藏品质^{[9][10][11][12]}。但是未见钙对黄酮类成分有明显调控的报道。本发明意外的发现，通过调控水培溶液中的钙离子浓度，可以显著的提高幼苗根部黄酮类成分，具体包括毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素，进而提升黄芪的品质。

参考文献

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发明内容

针对上述技术问题，本发明的目的是提供一种水培溶液及高品质黄芪的培育方法，并具体公开了水培溶液的组成成分和高品质黄芪的培育方法。

本发明的第一个目的是提供一种水培溶液，所述的水培溶液由如下成分组成：5mMKNO₃；1mM H₃PO₄；1mM MgSO₄；0.01mM-20mM CaCl₂；5mM MES；微量元素：0.5×MS微量元素，0.5×MS Fe盐，KOH调pH至5.7。

优选的，所述的水培溶液由如下成分组成：5mM KNO₃；1mM H₃PO₄；1mM MgSO₄；0.01mM CaCl₂；5mM MES；微量元素：0.5×MS微量元素，0.5×MS Fe盐，KOH调pH至5.7。

优选地，所述的0.5×MS微量元素具体包括0.0025mM KI、0.05mM H₃BO₄、0.0005mMNa₂MoO₄·2H₂O、0.00005mM CuSO₄·5H₂O、0.00005mM CoCl₂·6H₂O、0.015mM ZnSO₄·7H₂O、0.045mM MnSO₄·4H₂O，所述的0.5×MS Fe盐具体为0.025mM FeSO₄·7H₂O。

本发明的另一目的是提供一种高品质蒙古黄芪幼苗的培育方法，所述的培育方法包括如下步骤：

(1)取蒙古黄芪种子，于98％的浓硫酸中浸泡10min后用水冲洗，蒸馏水pH调至6.5，将蒙古黄芪种子浸泡3h，取出排干并置于培养皿中，在黑暗中培养72h，在发芽期间每24h供应蒸馏水，置于培养室水平光照培养，获得蒙古黄芪幼苗；

(2)将步骤(1)获得的蒙古黄芪幼苗在所述的水培溶液中培育，获得高品质蒙古黄芪幼苗。

本发明的又一目的是提供一种高品质膜荚黄芪幼苗的培育方法，所述的培育方法包括如下步骤：

(1)取膜荚黄芪种子，用开水热激后用常温水浸泡3h，取出排干置于培养皿中，黑暗中培养72h后，置于培养室水平光照培养，获得膜荚黄芪幼苗；

(2)将步骤(1)获得的幼苗在所述的水培溶液中培育，获得高品质膜荚黄芪幼苗。

优选地，步骤(1)中所述的培养皿置有经过高温灭菌的湿润双层定性滤纸。

优选的，所述步骤(1)中光照培养的光周期为12小时/12小时黑暗，光强为75-100μmol·m^-2·s^-1，培养温度为22-25℃。

本发明的有益效果是：本发明提供了一种水培溶液及其水培高品质黄芪幼苗的方法，该方法通过在所述的水培溶液中添加低浓度钙离子，诱导黄芪幼苗根部黄酮类化合物积累，显著增加了黄芪的黄酮类有效成分例如毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素，提高了黄芪的药效品质，也提高黄芪幼苗的抗干旱能力、抗盐能力、抗紫外能力和抗冻能力。

附图说明

图1为不同钙浓度处理后的蒙古黄芪植株形态

图2为不同钙浓度处理后的膜荚黄芪植株形态

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细的阐述，但是本发明的保护范围并不限于以下实施例。

为了排除其他因素对黄芪生长的影响，本方案设置为水培实验，以蒙古黄芪和膜荚黄芪为材料。

实施例1、黄芪幼苗水培溶液的制备

1.黄芪幼苗水培溶液的成分和分组

高钙组(20mM CaCl₂)：5mM KNO₃；1mM H₃PO₄；1mM MgSO₄；20mM CaCl₂；5mM MES；微量元素：0.5×MS微量元素，0.5×MS Fe盐，KOH调pH至5.7。

CK组(1mM CaCl₂)：5mM KNO₃；1mM H₃PO₄；1mM MgSO₄；1mM CaCl₂；5mM MES；微量元素：0.5×MS微量元素，0.5×MS Fe盐，KOH调pH至5.7。

低钙组(0.01mM CaCl₂)：5mM KNO₃；1mM H₃PO₄；1mM MgSO₄；0.01mM CaCl₂；5mM MES；微量元素：0.5×MS微量元素，0.5×MS Fe盐，KOH调pH至5.7。

2.黄芪幼苗水培溶液的制备方法

精确称取各物质，按照浓度要求配制大量元素母液：1M KNO₃、1M H₃PO₄、1M MgSO₄、1M CaCl₂；0.5M MES缓冲液；微量元素母液(包括0.001M KI、0.02M H₃BO₄、0.0002MNa₂MoO₄·2H₂O、0.00002M CuSO₄·5H₂O、0.00002M CoCl₂·6H₂O、0.006M ZnSO₄·7H₂O)、0.009M MnSO₄·H₂O、Fe盐母液(0.01M FeSO4·7H₂O和0.01M Na₂EDTA·2H₂O)；

配制1L MS水培溶液，需加入上述母液，大量元素：5ml KNO₃、1ml H₃PO₄、1mlMgSO₄、10μl CaCl₂(低钙)或1ml CaCl₂(CK)或20ml CaCl₂(高钙)；10ml MES缓冲液；2.5ml微量元素母液(含KI、H₃BO₄、Na₂MoO₄·2H₂O、CuSO₄·5H₂O、CoCl₂·6H₂O、ZnSO₄·7H₂O)，5mlMnSO₄·H₂O，2.5ml Fe盐母液，加蒸馏水至900ml，然后逐滴加入0.1M KOH溶液调节pH到5.7，然后补足蒸馏水至1L；

所述MS水培溶液各物质最终浓度：5mM KNO₃；1mM H₃PO₄；1mM MgSO₄；0.01mM CaCl₂(低钙)或1mM CaCl₂(CK)或20mM CaCl₂(高钙)；5mM MES缓冲液；微量元素(包括0.0025mMKI、0.05mM H₃BO₄、0.0005mM Na₂MoO₄·2H₂O、0.00005mM CuSO₄·5H₂O、0.00005mM CoCl₂·6H₂O、0.015mM ZnSO₄·7H₂O、0.045mM MnSO₄·4H₂O)；0.5×MS Fe盐(0.025mM FeSO₄·7H₂O)；。

实施例二、黄芪幼苗的培育

1.蒙古黄芪幼苗培育

本实验为水培实验，以水培蒙古黄芪作为材料。选择健康和饱满的蒙古黄芪种子，将大约50粒蒙古黄芪种子放入茶袋中，将它浸泡到98％的浓硫酸中10min，然后用蒸馏水彻底冲洗，溶液pH调至6.5。蒙古黄芪种子浸泡3h后将它们排干并置于具有湿润双层定性滤纸的90mm培养皿中，培养皿和定性滤纸都经过高温灭菌，在黑暗中培养，并在发芽期间每24h供应蒸馏水。黑暗培养72h后至培养室水平光照培养，光周期为12小时/12小时黑暗，光强为75-100μmol·m^-2·s^-1，培养温度为22-25℃。根部长到2cm左右时移到水培盒中培养，光照周期与光强同上。

2.膜荚黄芪幼苗培育

本实验为水培实验，以水培膜荚黄芪作为材料。选择健康和饱满的膜荚黄芪种子，膜荚种子放入100mL烧杯中用100℃开水热激90s后加入蒸馏水至常温。膜荚黄芪种子都浸泡3h后将它们排干并置于具有湿润双层定性滤纸的90mm培养皿中，培养皿和定性滤纸都经过高温灭菌，在黑暗中培养，并在发芽期间每24h供应蒸馏水。黑暗培养72h后至培养室水平光照培养，光周期为12小时/12小时黑暗，光强为75-100μmol·m^-2·s^-1，培养温度为22-25℃。根部长到2cm左右时移到水培盒中培养，光周期为12小时/12小时黑暗，光强为75-100μmol·m^-2·s^-1，培养温度为22-25℃。

实施例三、蒙古黄芪根部黄酮类物质含量的测定

1.实验分组

高钙组(20mM CaCl₂)：黄芪幼苗在CK组水培溶液中生长35天后换含有20mM CaCl₂的水培溶液处理25天，期间7天换一次水培溶液。60天后收集其根部，烘干后，超声法提取黄酮类化合物。

CK组(1mM CaCl₂)：黄芪幼苗在CK组水培溶液中生长60天，期间7天换一次水培溶液。60天后收集其根部，烘干后，超声法提取黄酮类化合物。

低钙组(0.01mM CaCl₂)：黄芪幼苗在CK组水培溶液中生长35天后换含有0.01mMCaCl₂的水培溶液处理25天，期间7天换一次水培溶液。60天收集根部，烘干后，超声法提取黄酮类化合物。

2.黄酮类物质检测方法

使用LC-MS/MS检测毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素含量，设置5次重复。

3.实验结果

对移入水培盒后35天的蒙古黄芪进行不同钙浓度的处理后10天观察到表型如图1所示，蒙古黄芪植株从左到右依次是低钙组、CK组、高钙组处理，可以明显看到低钙组叶边缘处变黄且根部呈现暗褐色的现象。在低钙条件下蒙古黄芪的生长情况并不良好，根系也不健康。在高钙情况下黄芪植株生长健康，植株大小与对照处理无明显差异。

表1 蒙古黄芪幼苗根部黄酮类物质含量

注：不同的字母表示不同处理间的差异显著(P<0.05)

蒙古黄芪幼苗根部黄酮类物质含量如表1所示，蒙古黄芪根部毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素低钙组的含量显著高于高钙组和CK组，组间具有显著性差异。与图1的实验结果相结合，可以得到生长情况不好的低钙组蒙古黄芪的黄酮类物质含量显著上升，说明低钙处理类似于非生物胁迫(干旱、盐碱、低温等)给黄芪生长带来的负面影响，例如生物量下降，植株矮小，叶片枯黄等现象，但是这些胁迫正是黄酮类含量增加的根本原因，这些黄酮类物质是黄芪为了应对逆境胁迫的带来的生理损伤的保护物质。低钙处理可能给植物带来生理损伤，但是刺激了黄酮类次生代谢产物增加，有利于提高蒙古黄芪的品质，也有利于提高黄芪的抗干旱能力、抗盐能力、抗紫外能力和抗冻能力。

实施例四、膜荚黄芪根部黄酮类物质含量的测定

1.实验分组

高钙组(20mM CaCl₂)：黄芪幼苗在CK组水培溶液中生长35天后换含有20mM CaCl₂的水培溶液处理25天，期间7天换一次水培溶液。60天收集根部，烘干后，超声法提取黄酮类化合物，设置5次重复。

CK组(1mM CaCl₂)：黄芪幼苗在CK组水培溶液中生长60天，期间7天换一次水培溶液。60天收集根部，烘干后，超声法提取黄酮类化合物，设置5次重复。

低钙组(0.01mM CaCl₂)：黄芪幼苗在CK组水培溶液中生长35天后换含有0.01mMCaCl₂的MQA水培溶液处理25天，期间7天换一次水培溶液。60天收集根部，烘干后，超声法提取黄酮类化合物，设置5次重复。

2.实验方法

使用LC-MS/MS检测毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素含量。

3.实验结果

对移入水培盒后35天的膜荚黄芪进行不同钙浓度的处理后10天观察到表型如图2所示，从左到右依次是低钙组、CK组、高钙组水培溶液处理下的膜荚黄芪，在低钙条件下初生叶变黄萎小，生长状况不良。而高钙条件下的膜荚黄芪生长情况良好，并且茎叶部分比对照条件下生长情况更加良好。

表2 膜荚黄芪幼苗根部黄酮类物质含量

注：不同的字母表示不同处理间的差异显著(P<0.05)。

膜荚黄芪幼苗根部黄酮类物质含量如表2所示，膜荚黄芪根部毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素的低钙组的含量显著高于高钙组和CK组，其中膜荚黄芪根部毛蕊异黄酮葡萄糖苷高钙组的含量也显著高于CK组。与图2的实验结果相结合，可以得到生长情况不好的低钙组膜荚黄芪的黄酮类物质含量显著上升，说明低钙处理出现类似于非生物胁迫(干旱、盐碱、低温等)给黄芪带来的负面影响，例如生物量下降，植株矮小，叶片枯黄等现象，但是这些胁迫正是黄酮类含量增加的根本原因，这些黄酮类物质是黄芪为了应对逆境胁迫的带来的生理损伤的保护物质。低钙处理可能给植物带来生理损伤，刺激了黄酮类次生代谢产物增加，有利于提高膜荚黄芪的品质，也有利于提高黄芪的抗干旱能力、抗盐能力、抗紫外能力和抗冻能力。

综上所述，本发明公开了一种水培溶液，将蒙古黄芪和膜荚黄芪幼苗在所述的水培溶液中培养，低钙组的黄芪幼苗根部芒柄花素、毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量显著高于高钙组和CK组，而在低钙条件下初生叶变黄萎小，生长状况不良。而高钙条件下的膜荚黄芪生长情况良好，并且茎叶部分比对照条件下生长情况更加良好。但是低钙处理组的黄芪幼苗根部的黄酮类成分例如毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素含量高，可提高黄芪幼苗的抗干旱能力、抗盐能力、抗紫外能力和抗冻能力。

Claims (4)

1.一种高品质蒙古黄芪幼苗的培育方法，其特征在于，所述的培育方法包括如下步骤：

(1)取蒙古黄芪种子，于98％的浓硫酸中浸泡10min后用水冲洗，蒸馏水pH调至6.5，将蒙古黄芪种子浸泡3h，取出排干并置于培养皿中，在黑暗中培养72h，在发芽期间每24h供应蒸馏水，置于培养室水平光照培养，获得蒙古黄芪幼苗；

(2)将步骤(1)获得的蒙古黄芪幼苗在水培溶液中培育，获得高品质蒙古黄芪幼苗；

所述的水培溶液由如下成分组成：5mM KNO₃；1mM H₃PO₄；1mM MgSO₄；0.01mM CaCl₂；5mMMES缓冲液；微量元素：0.5×MS微量元素，0.5×MS Fe盐，KOH调pH至5.7；所述的0.5×MS微量元素具体包括0.0025mM KI、0.05mM H₃BO₄、0.0005mM Na₂MoO₄·2H₂O、0.00005mM CuSO₄·5H₂O、0.00005mM CoCl₂·6H₂O、0.015mM ZnSO₄·7H₂O、0.045mM MnSO₄·4H₂O，所述的0.5×MS Fe盐具体为0.025mM FeSO₄·7H₂O。

2.一种高品质膜荚黄芪幼苗的培育方法，其特征在于，所述的培育方法包括如下步骤：

(1)取膜荚黄芪种子，用开水热激后用常温水浸泡3h，取出排干置于培养皿中，黑暗中培养72h后，置于培养室水平光照培养，获得膜荚黄芪幼苗；

(2)将步骤(1)获得的幼苗在水培溶液中培育，获得高品质膜荚黄芪幼苗；

所述的水培溶液由如下成分组成：5mM KNO₃；1mM H₃PO₄；1mM MgSO₄；0.01mM CaCl₂；5mMMES缓冲液；微量元素：0.5×MS微量元素，0.5×MS Fe盐，KOH调pH至5.7；所述的0.5×MS微量元素具体包括0.0025mM KI、0.05mM H₃BO₄、0.0005mM Na₂MoO₄·2H₂O、0.00005mM CuSO₄·5H₂O、0.00005mM CoCl₂·6H₂O、0.015mM ZnSO₄·7H₂O、0.045mM MnSO₄·4H₂O，所述的0.5×MS Fe盐具体为0.025mM FeSO₄·7H₂O。

3.如权利要求1或2所述的培育方法，其特征在于，步骤(1)中所述的培养皿置有经过高温灭菌的湿润双层定性滤纸。

4.如权利要求1或2所述的培育方法，其特征在于，所述步骤(1)中光照培养的光周期为12小时/12小时黑暗，光强为75-100μmol·m^-2·s^-1，培养温度为22-25℃。

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