CN1580043A - 抗恶性肿瘤南柴胡萃取物的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种萃取自南柴胡，用于治疗细胞增生性疾病的柴胡萃取物及其萃取方法，该柴胡萃取物的活性成分至少包括以γ－丁内酯为核心，碳2(5)位置呈Z构型或E构型的杂环化合物，以及包含于该杂环化合物中的新的“柴胡内酯、异柴胡内酯、柴胡内酯类似物及其衍生物”，由药物毒性试验、细胞特性、动物试验以及组织切片等结果可知，南柴胡中分离出来的萃取物对于肝癌、肺癌、卵巢癌、大肠直肠癌或恶性脑胶质细胞瘤等癌细胞具抑制效果，并且能够在不损伤正常细胞的情况下，高度专一性地毒杀化疗后期对于紫杉类药物具抗药性的肿瘤细胞，而作为新一代肿瘤抑制剂的药物筛选来源。

Description

抗恶性肿瘤南柴胡萃取物的制备方法

技术领域

本发明是关于一种应用在癌症治疗领域，从天然物中萃取出治疗细胞增生性疾病(Cell Proliferative Disorder)的植物萃取物及其萃取方法，特别是关于一种分离自南柴胡(Bupleurum scorzonerifolium)，并以具γ-丁内酯(γ-Butyrolactone)核心的杂环化合物作为治疗人类肝癌(Hepatoma)、肺癌(Lung cancer)、卵巢癌(Ovarian cancer)、恶性脑胶质细胞瘤(Human Malignant Glioblastoma)以及大肠直肠癌(ColorectalCancer)等癌细胞的主要活性成份的南柴胡萃取物及其萃取方法。

背景技术

癌症是一种细胞增生性疾病，已经成为十大死亡原因之首。根据Boring等人1993年的统计，美国每年约有五十二万六千人死于癌症，以女性癌症的首乳癌(Breast Cancer)为例，几已成为40至55岁妇女的主要杀手。且随着环境污染日益严重，卵巢癌(Ovarian Carcinoma)、肺癌以及肝癌等实体癌(Solid Tumor)以及皮肤癌等患者也明显增多。根据Fitzpatrick等人1986年的研究，今日的癌症患者人数与1945年相较，足足多出六倍，显见癌症的检查与治疗实在是刻不容缓。

根据目前癌症的研究发现，真核细胞(Eukaryocyte)的细胞老化(Senescence)、复制(Replication)以及分裂(Division)都会遵循细胞周期(Cell Cycle)的模式予以调控。的，当细胞进行复制时，携带基因的染色体(Chromosome)其去氧核醣核酸(Deoxyribonucleic Acid，DNA)含量会由2N倍增成4N，以于有丝分裂(Mitosis)后产生两个2N子细胞(Daughter Cell)。1995年Blackburn等人指出，真核细胞分裂时，染色体末端会重复一段称作“端粒(Telomere)”的固定序列。以人类细胞为例，人类染色体末端的端粒会重复固定5’-TTAGGG序列。从目前研究结果得知，“端粒”与细胞周期的时程(Cell Clock)调控有关，随着有丝分裂次数增加，端粒会逐渐变短，当端粒缩短到一定长度时，染色体末端覆盖的端粒很容易黏结而导致染色体配对异常，甚至造成细胞死亡(Cell death)。

1995年Feng等人在胚细胞(Germ-line Cell)、干细胞(Stem Cell)及肿瘤细胞(Tumor Cell)等旺盛分裂的细胞中发现，这些细胞染色体末端的端粒上附着有一种称为“端粒酶(Telomerase)”的核醣蛋白复合体(Ribonucleoprotein Complex)，端粒酶的作用在于维持端粒长度，避免端粒历经多次有丝分裂而变短，因此，端粒酶的存在可以帮助细胞跳脱细胞周期限制而走向不死化。

若进一步以TRAP(Telomerase Repeat Amplification Protocol)Assay测试染色体端粒酶活性(Telomerase Activity)更发现，在肿瘤细胞或分化不完全的细胞系(如胚细胞、干细胞等)中，端粒酶的活性很高，但在骨髓细胞及生殖细胞以外的正常体细胞则几乎没有端粒酶活性；又，1994及1995年Kim及Broccoli等人亦证实，端粒酶在协助肿瘤细胞闪躲细胞程序化死亡调控的连锁机制(Apoptotic Cascade)中扮演重要角色，因此，以端粒酶活性作为抗癌药物的检查标的，可以有效取代传统化学标的，准确地检查药物对于肿瘤细胞的毒杀情形，而使得检测端粒酶活性几已成为测试抗癌药物治疗功效的高专一性(Specificity)指针。

另一方面，根据中医界多年来临床治疗经验，将临床上认为具有抗癌功效的五、六十种中药材，经TRAP活性筛选后发现，柴胡、黄柏、人参、甘草、当归、龙胆及黄芩等中药材对于恶性肿瘤具有明显的治疗效果。同时，将中药与目前抗癌药物相较，亦发现中药造成患者的副作用(如白血球数量减少、恶病质(Cachexia)等)较为缓和，因此，从中药里萃取出具肿瘤抑制功效的活性成份，极可能作为新型抗癌药物的筛选来源。

此外，以现今广泛用来治疗转移性实体癌的化学治疗剂(Chemotherapeutic Agent)“紫杉醇(Paclitaxel，商品名TAXOL)”为例，紫杉醇最早是从太平洋紫杉木(Pacific Yew Tree)萃取而得，化学式如下式所示：(分子式C₄₇H₅₁NO₁₄，分子量854，以二帖类(Diterpene)结构为核心)

紫杉醇(Paclitaxel)主要应用于治疗卵巢癌(Ovarian Cancer)、转移性乳癌(Metastatic Breast Cancer)、肺癌(Lung Cancer)以及黑色素细胞瘤(Melanoma)等癌症，其毒杀肿瘤细胞的作用机转，系藉由紫杉醇以1∶1比例结合细胞骨架(Cytoskeleton)内的β微小管(β-tubulin)来抑制微小管(Microtubule)的去聚合作用(Depolymerization)，藉此阻断有丝分裂(Mitosis)完成以激活肿瘤细胞凋亡(Blafosklonny et.al，1995)。因此，使用紫杉类(Taxane)药物治疗卵巢癌之初，可以有效杀死肿瘤细胞，而使患者的两年存活率提高约15％。

但是，随着疗程延长，临床上发现肿瘤细胞对于紫杉醇会逐渐产生抗药性。尤其，从最近研究发现，部分具紫杉醇抗药性的肿瘤细胞系在β微小管的表现(Expression)及电泳移动性(ElectrophoreticMobility)上明显不同于传统肿瘤细胞。根据1995年Rao等人的研究可知，这些肿瘤细胞(如人类肺癌细胞系AT-12)会改变组成β微小管的六个次单体构型(Subunit Configuration)，使紫杉醇不仅无法与β微小管结合，反会被细胞当作外来物排除(Ion-pumping)，致使肿瘤细胞对于紫杉醇逐渐产生抗药性而在化疗后期逐渐失效。

并且，以现存其它抗癌药物，如5-氟嘧啶二酮(5-Fluorouracil)、埃波霉素(Epothilone)、顺双胺双氯铂(Cisdiammine Dichloroplatinum，俗称Cisplatin)、甲基苄胼(Procarbazine)以及环磷胺(Cyclophosphamide)等单独使用或并用紫杉醇来治疗对于紫杉类药物具抗药性的患者，临床治疗效果不佳，且从细胞实验来看亦发现目前的抗癌药物难以抑制紫杉醇抗药性肿瘤细胞系(Taxol-resistance TumorCell Line)增生。然如提高药物投予剂量，例如将紫杉醇剂量调高到每公斤300毫克注射大白鼠时，紫杉醇产生的细胞毒性(Cytotoxicity)很强，往往于用药后造成正常细胞大量坏死(Necrosis)。

是故，为增进化疗后期癌细胞的毒杀效果，从临床上初见抗癌功效的中药材里发展出能有效抑制紫杉醇抗药性肿瘤细胞系的抗癌药物，已成为医药界的当务之急。

发明内容

为克服上述现有技术的缺点，本发明的主要目的在于提供一种萃取自南柴胡(Bupleurum scorzonerifolium Willd.)，用于抑制紫杉醇抗药性肿瘤细胞系(Taxol-resistance Tumor Cell Line)的具γ-丁内酯(γ-Butyrolactone)核心杂环化合物或其药物上可接受的盐、酯、酮及其衍生物，以及萃取此等杂环化合物及其衍生物的萃取方法。

本发明的另一目的在于提供一种由南柴胡生药中分离出具肿瘤细胞抑制效果，以新颖化合物异柴胡内酯(Isochaihulactone)为首的柴胡内酯(Chaihulactone)类似物(Analogues)及其衍生物或其药物上可接受的盐、酯、酮与其衍生物的萃取方法。

本发明的再一目的在于提供一种由南柴胡生药中分离出可抑制人类肝癌、卵巢癌、恶性脑瘤、肺癌及大肠直肠癌的具γ-丁内酯(γ-Butyrolactone)核心的杂环化合物或其药物上可接受的盐、酯、酮，与其衍生物的萃取方法。

本发明的又一目的在于提供一种在不影响正常肝肾功能的情况下，发展出对紫杉醇抗药性肿瘤细胞系具高度专一性毒杀效果的南柴胡萃取物及其萃取方法，的，该南柴胡萃取物进一步包含有以γ-丁内酯(γ-Butyrolactone)为核心的杂环化合物，或其药物上可接受的盐、酯、酮与其衍生物。为了完成本发明的目的，本发明提供一种从南柴胡(Bupleurum scorzonerifolium)中分离出用于对抗细胞细胞增生性疾病的活性成份的南柴胡萃取方法，该萃取方法包括：

抽提南柴胡以取得木脂素混合物，其中该木脂素混合物包含有至少一种可抑制肿瘤增生的活性成份；以及

分离该抑制肿瘤增生的活性成份，以得到单一类型的南柴胡萃取物。

在该方法中，从南柴胡中抽提出该木脂素混合物的步骤包括以极性互异的第一、第二、第三及第四溶液来执行以下步骤：

以第一溶液溶抽粉碎后的南柴胡，分离取得南柴胡第一萃取物及残渣；

以第二溶液溶抽残渣，分离取得南柴胡第二萃取物；

以第三溶液抽提该南柴胡第一萃取物，并且脱除抽提水层中的醇类；以及

以第四溶液抽提该脱除醇类的抽提水层，并予以浓缩。

换言之，本发明的肿瘤抑制物质及其萃取方法，包括含有分离自南柴胡(Bupleurum scorzonerifolium Willd.)，用于治疗肺癌、卵巢癌、肝癌、人类恶性脑胶质细胞瘤或大肠直肠癌的南柴胡萃取物及其萃取方法，以及从南柴胡粗萃取物(Crude Extracts)中进一步分离出来的肿瘤抑制成份，或药物上可接受的盐、酯、酮或其衍生物。

该南柴胡萃取物的肿瘤抑制成份主要包含一种如通式(I)代表，以γ-丁内酯(γ-Butyrolactone)为核心，并在碳-2(5)为Z构型或E构型的杂环化合物或其药物上可接受的盐、酯、酮与其衍生物：

式(I)

其中，X＝N，O，S，Se；

A，B分别选自具有下式的取代基：

其中，R1，R2，R3，R4，R5分别选自氢原子、卤原子、羟基、硫氢基、胺基、烷氧基及硝基。

同时，式(I)中还包括一种如通式(II)及通式(III)所示，首次公开并且分别命名为柴胡内酯(Chaihulactone)、异柴胡内酯(Isochaihulactone)及其类似物的杂环化合物。的，该柴胡内酯、异柴胡内酯以及该柴胡内酯类似物及其衍生物属于存在于南柴胡的木脂素(Lignan)。比较式(I)、式(II)及式(III)可知，柴胡内酯、异柴胡内酯均为一种以γ-丁内酯结构为核心，且碳2-(5)呈Z构型或E构型的杂环化合物。

式(II)

其中，R代表烷氧基。

                           式(III)

其中，R代表氢原子、烷氧基或芳基。

从本发明实施例的实验结果发现，以不同溶剂(如丙酮、甲醇水溶液等)分离南柴胡中含有γ-丁内酯结构等杂环化合物的萃取物，均可以有效抑制肿瘤细胞增生，且以南柴胡丙酮粗抽取物的肿瘤抑制效果最佳。而且，利用层析法(Chromatography)进一步分离该南柴胡丙酮粗抽取物，并分析各浓缩物的分子结构，可以得到新颖杂环化合物“柴胡内酯、异柴胡内酯、柴胡内酯相关类似物及其衍生物”。

根据本发明较佳实施例实验结果，将南柴胡萃取物中分离出来的柴胡内酯(Chaihulactone)、异柴胡内酯(Isochaihulactone)、柴胡内酯类似物及其衍生物加入人类肺癌、肝癌、恶性脑胶质细胞瘤及大肠癌细胞系以后发现，肿瘤细胞系的端粒酶活性(Telomerase Activity)较未加药的控制组明显减少约5倍，尤其是紫杉醇抗药性肿瘤细胞系(Taxol-resistance Tumor Cell Line)的端粒酶活性在南柴胡萃取物添加之后，可以产生明显的毒杀效果，显示本发明所提供的南柴胡萃取物里确实含有肿瘤抑制成份，且该肿瘤抑制成份包括以γ-丁内酯结构为核心，丁内酯核心的碳2(5)处呈Z构型或E构型的杂环化合物，或其药物上可接受的盐、酯、酮与其衍生物，其中又以新发现的柴胡内酯(Chaihulactone)、异柴胡内酯(Isochaihulactone)及其衍生物其肿瘤毒杀效果最为显著，因此，本发明是将以异柴胡内酯为首的杂环化合物作为肿瘤抑制物质(Antineoplastic Agent)的主要活性成份。

以下即揭示从南柴胡中分离出具肿瘤抑制功效的γ-丁内酯杂环化合物及其衍生物的萃取方法。该萃取方法包含两阶段，第一阶段是以极性(Polarity)互异的溶剂将南柴胡生药分离出不同萃取层，而第二阶段则是以层析法(Chromatography)分离特定萃取层以得到单一类型的南柴胡萃取物。以下即逐步说明南柴胡生药萃取出肿瘤抑制成份的方法：

以丙酮(Acetone)浸泡并搅拌南柴胡粉末，反复抽取浓缩得到南柴胡丙酮粗抽取物(Bupleurum scorzonerifolium-Acetone Crude Extract，简称为BS-A层)后，将残渣以甲醇抽取得到南柴胡甲醇粗抽取物(简称为BS-M层)，复以水抽取残渣以得到南柴胡水层抽取物(简称为BS-W层)；

将BS-A层溶解于甲醇水溶液，经过正己烷(n-Hexane)萃取后，分离取得南柴胡正己烷层(简称为BS-H层)以及南柴胡甲醇水层；

脱除南柴胡甲醇水层中的甲醇，并以氯仿(Chloroform，CHCl₃)重复萃取浓缩；

以层析法(Chromatography)分离该南柴胡氯仿萃取物，并分别收集不同浓度的甲醇/二氯甲烷洗提层(Elution)予以浓缩；

将不同浓度的甲醇/二氯甲烷洗提层各以层析法分离纯化，以得到单一类型的化合物。

由于依上述方法得到的南柴胡丙酮粗抽取物(BS-A)、南柴胡甲醇粗抽取物(BS-M)、5％甲醇/二氯甲烷洗提层以及层析收集物等加入肿瘤细胞系培养后均发现明显肿瘤毒杀效果，且以质谱(Mass Spectrum)及核磁共振图谱(Nuclear Magnetic Resonance Spectrum)鉴定南柴胡中具肿瘤抑制活性的化合物结构，亦显示此等化合物均具有γ-丁内酯结构，由此可证本发明的萃取方法抽取南柴胡，确能有效保留药材住中药材中的肿瘤抑制成份。

再者，以TRAP Assay检测肿瘤细胞系加入南柴胡萃取物以后，端粒酶(Telomerase)的活性抑制情形，结果发现南柴胡丙酮粗抽取物可以有效抑制人类肺癌细胞系A549的端粒酶活性及hTERT信息核糖核酸的表现，显示南柴胡丙酮粗抽取物对于癌细胞可能具有高度专一性的毒杀效果。

尤其，将含有以γ-丁内酯为核心的杂环化合物的南柴胡丙酮粗抽取物以及从南柴胡萃取物分离出来的柴胡内酯类似物与其衍生物加入紫杉醇抗药性肿瘤细胞系(Taxol-resistance Tumor Cell Line)，例如A549-T12(对紫杉醇具抗药性的人类肺癌细胞系)，亦发现南柴胡萃取务中的γ-丁内酯核心杂环化合物及其衍生物会诱发紫杉醇抗药性肿瘤细胞系产生细胞凋亡(Apoptosis)；且从流式细胞仪(Flow Cytometer)及西方点墨法(Western Blot)结果进一步探讨南柴胡萃取物的作用机转，亦发现当肿瘤细胞系加入南柴胡萃取物以后，该南柴胡萃取物会诱导细胞大量生产p21及p53等肿瘤抑制蛋白抑制物(TumorSuppressor)，使肿瘤细胞停滞在有丝分裂后期(高G2/M比例)的纺垂丝聚合状态(Spindle Polymerization)。故，由细胞调控(Cell Regulation)的观点来看，南柴胡丙酮粗萃取物及其内所含以γ-丁内酯(γ-Butyrolactone)为核心的杂环化合物可视为一种用于抑制有丝分裂的微小管稳定剂(Microtubule Stabilizing Agent)，其作用机转与紫杉醇(Paclitaxel)类似，均具有促进微小管聚合(Microtubule Polymerization)的功效，使增生的肿瘤细胞停滞在G2/M期，变成无效细胞(Junk Cell)而导致细胞凋亡。

附图说明

图1为显示以本发明萃取方法分离南柴胡所取得的南柴胡丙酮粗抽取物(BS-A)、南柴胡甲醇粗抽取物(BS-M)以及南柴胡水层粗抽取物(BS-W)进行细胞毒性试验(MTT Assay)后，肿瘤细胞存活率与南柴胡投药剂量间的变化示意图；

图2A至图2D为显示以本发明萃取方法分离南柴胡所取得的南柴胡丙酮粗抽取物(BS-A)、南柴胡甲醇粗抽取物(BS-M)以及南柴胡水层粗抽取物(BS-W)加至肺癌细胞系A549且以流式细胞仪检测后，各种南柴胡萃取物对于肿瘤细胞系的细胞周期波峰示意图；

图3A至图3C为显示人类肺癌细胞系A549在未加药、加入异柴胡内酯20μM及柴胡丙酮萃取物60微克/毫升连续培养48小时后，经流式细胞仪测得的Annexin V-FLOUS细胞凋亡象限图(横轴表示与Annexin V-FLOUS抗体接合的肿瘤细胞萤光强度，而纵轴代表与PI抗体接合的肿瘤细胞萤光强度)；

图4为显示人类肺癌细胞系A549在未加药(控制组)、加入南柴胡丙酮粗抽取物(BS-A)、南柴胡萃取物第八成份(BS-8)以及紫杉醇的作用下，经流式细胞仪测得的细胞周期变化分析图；

图5为显示人类肺癌细胞系A549在未加药(C)、加入南柴胡丙酮萃取物(BS-A)、南柴胡甲醇萃取物(BS-M)、南柴胡水层萃取物(BS-W)、南柴胡萃取物第八成份(BS1)、南柴胡萃取物第三成份(BS2)一日或三日后，测试肿瘤抑制蛋白抑制物(Tumor Suppressor)p21以及p53含量的西方点墨法(Western Blot)示意图；

图6为显示人类肺癌细胞系A549在未加药(C)、加入南柴胡丙酮萃取物12小时、24小时及48小时以后，测试肿瘤细胞细胞骨架中，第一型α-微小管以及第五型β-微小管的西方点墨法示意图；

图7为显示人类肺癌细胞系A549在未加药(A549)、加入南柴胡萃取物第八成份、紫杉醇以及Vinca植物碱之后，测试肿瘤细胞β-微小管在溶解型(Soluble form，以S表示)或颗粒型(Particular form，以P表示)的西方点墨法示意图；

图8为显示人类肺癌细胞系A549在加入南柴胡萃取物之后，纺锤丝呈现拉长状态的共轭交显微镜(Confocal Microscope)萤光标定切片图；

图9A至图9D为显示人类肺癌紫杉醇抗药性细胞系A549-T12在未加药、加入南柴胡丙酮粗抽取物(BS-A)、南柴胡萃取物第八成份(BS-8)以及南柴胡萃取物第十五成份(BS-15)24小时之后，经流式细胞仪测得的Annexin V-FLOUS细胞凋亡象限图(横轴表示与Annexin V-FLOUS抗体接合的肿瘤细胞萤光强度，而纵轴代表与PI抗体接合的肿瘤细胞萤光强度)；

图10A至图10C为显示人类肺癌紫杉醇抗药性细胞系AT-12在加入南柴胡丙酮萃取物(BS-A)、南柴胡萃取物第八成份(BS-8)及南柴胡萃取物第十五成份(BS-15)24小时以及48小时期间，肿瘤细胞的细胞毒性试验(MTT Assay)示意图；

图11A为显示裸鼠皮下植A549细胞系(控制组)，放大100倍并经苏木紫与伊红染色法(Haematoxylin and Eosin Stain，H&E Stain)处理后的组织切片示意图；

图11B为显示于裸鼠皮下植入A549细胞系，连续五天投予腹腔内注射500毫克/公斤南柴胡丙酮萃取物，第七天的肿瘤经放大100倍以及苏木紫与伊红染色法(Haematoxylin and Eosin Stain，H&E Stain)处理后，出现大片肿瘤组织出血性坏死的组织切片示意图；

图12A为显示裸鼠皮下植入A549-T12细胞系(控制组)，放大100倍并经苏木紫与伊红染色法(Haematoxylin and Eosin Stain，H&E Stain)处理后的组织切片示意图；

图12B为显示于裸鼠皮下植入A549-T12细胞系，连续五天投予腹腔内注射400毫克/公斤南柴胡丙酮萃取物，第七天的肿瘤经放大100倍以及苏木紫与伊红染色法(Haematoxylin and Eosin Stain，H&E Stain)处理后，出现大片组织纤维化及只剩余若干肿瘤细胞；

图13A为显示裸鼠皮下植入A549细胞系形成肿瘤，连续五天投予腹腔内注射400毫克/公斤的BS-A治疗，第七日后与未加药的控制组相较，其皮下肿瘤直径的局部放大照片；

图13B为显示活体状态下，以每公斤体重500毫克的南柴胡丙酮粗抽取物腹腔注射投予实验动物，并比较未加药控制组与加药治疗组在相对肿瘤体积与治疗天数间的变化示意图；

图14为显示以每公斤体重400毫克的南柴胡萃取物投予清醒鼠72小时期间，胰脏、肝脏、心脏、肾脏及造血组织各功能的生化指针酵素变化示意图；

图15为显示以静脉注射每公斤体重400毫克的南柴胡萃取物投予清醒鼠72小时期间，血小板、白血球、淋巴球的变化示意图；

图16为显示以静脉注射每公斤体重400毫克的南柴胡萃取物投予清醒鼠72小时期间，心搏、收缩压、舒张压及平均压的变化示意图；以及

图17为以连续五日腹腔内注射每公斤体重300毫克的南柴胡萃取物投予清醒鼠之后，其肝脏细胞及肾脏细胞的组织切片图。

具体实施方式

以下为藉由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟习此技艺的人士可由本说明书所揭示的内容轻易地了解本发明的其它优点与功效。本发明亦可藉由其它不同的具体实施例加以施行或应用，本说明书中的各项细节亦可基于不同观点与应用，在不悖离本发明的精神下进行各种修饰与变更。

本发明至少包含三部分：

一为从南柴胡(Bupleurum scorzonerifolium Willd)生药中萃取出对于人类肝癌细胞系J5、卵巢癌细胞系OVCAR-3、恶性脑胶质细胞瘤细胞系DBTRG-05MD、肺癌细胞系A549及大肠直肠癌细胞系HT29具抑制功效的天然萃取物的南柴胡萃取方法。

其二是按照该萃取方法，从南柴胡萃取物中分离出以γ-丁内酯为核心，且碳2(5)位置呈Z构型或E构型的杂环化合物，以及形成此等杂环化合物在药物上可接受的盐、酯、酮及其类似衍生物。其中，该杂环化合物中进一步包括有新颖化合物：柴胡内酯(Chaihulactone)、异柴胡内酯(Isochaihulactone)、以及与柴胡内酯相关的类似物及其衍生物。

而第三部份则是将具有γ-丁内酯核心杂环化合物的南柴胡丙酮粗抽取物、柴胡内酯、异柴胡内酯、柴胡内酯类似物及其衍生物，或其药物上可接受的盐、酯、酮等加至肿瘤细胞系来检验体内(in vivo)及体外(in vitro)环境下，各南柴胡萃取物对于肿瘤细胞系的抑制效果，复运用动物模式进一步评估南柴胡萃取物对于生物体正常细胞及肿瘤细胞的影响，以检视活体状态下，南柴胡萃取物对于肝癌、卵巢癌、肺癌、恶性脑瘤或大肠直肠癌的抑癌效果。

根据本发明较佳实施例所采用的南柴胡抽取方法，该方法是将生药南柴胡(Bupleurum scorzonerifolium)粉碎后浸泡于丙酮(Acetone)，经过四次反复搅拌、抽取及浓缩而取得南柴胡丙酮粗抽取物(BS-A层)后，将残渣以甲醇抽取得到南柴胡甲醇粗抽取物(简称为BS-M层)，再以水抽取残渣以得到南柴胡水层抽取物(简称为BS-W层)；之后，将南柴胡丙酮粗抽取物溶解于甲醇水溶液，经过正己烷(n-Hexane)粗抽后，分离取得南柴胡正己烷层(简称为BS-H层)以及南柴胡甲醇水层；而后，脱除南柴胡甲醇水层中的甲醇，并以氯仿(Chloroform，CHCl₃)重复萃取浓缩取得南柴胡氯仿萃取物；而后，利用层析法(Chromato-graphy)分离该南柴胡氯仿萃取物，并且分别收集不同浓度的甲醇/二氯甲烷洗提层(Elution)进行浓缩；最后，以层析法(如硅胶柱层析法(Silica Gel Chromatography)、制备型高效能液相层析法(preparative HPLC)等)将甲醇/二氯甲烷洗提层分离纯化，俾取得单一类型的化合物。

从层析法分离出来的单离化合物，经过质谱(Mass Spectrum)及核磁共振图谱(Nuclear Magnetic Resource Spectrum)鉴定各单类化合物的分子量以及结构，可得到如下表所示的杂环化合物：

将南柴胡各萃取层以及分离自南柴胡丙酮粗抽物中的上述杂环化合物分别施予药物筛选，可得知南柴胡生药中所含有的肿瘤抑制成份主要保留在南柴胡丙酮粗抽取物以及南柴胡甲醇水层，南柴胡正己烷层以及经氯仿处理后分离的南柴胡水层几乎不具肿瘤抑制功效。而且，经层析法(如低压液相层析或高效能液相层析法(High PerformanceLiquid Chromatography，HPLC))进一步纯化，可以分段收集各洗提层，以浓缩后得到上述各类单一化合物。

惟从本发明较佳实施例的药物筛选结果发现，在层析法分离出来的各种上述成份中，第三成份、第八成份对于人类肝癌、卵巢癌、肺癌、恶性脑瘤以及大肠直肠癌细胞系的肿瘤毒杀效果最为显著。而且，进一步分析具肿瘤效果的第三、第八成份的主要代表性分子结构，亦可得知南柴胡萃取物中的抑癌有效成份其分子主要特征系如通式(I)所示，俱具有γ-丁内酯(γ-Butyrolactone)核心，且以具有γ-丁内酯结构，同时碳-2(5)位置呈Z构型或E构型的杂环化合物或其药物上可接受的盐、酯、酮与其衍生物作为抑制肿瘤增生的主要活性成份。

式(I)

其中，X＝N，O，S，Se；

A，B分别选自具有下式之取代基：

其中，R1，R2，R3，R4，R5分别选自氢原子、卤原子、羟基、硫氢基、胺基、烷氧基及硝基。

若进一步分析纯化合物中，第三成份、第八成份、第十四成份以及第十五成份的分子结构，亦可知南柴胡萃取物中包括有一类首次公开并且命名为柴胡内酯(Chaihulactone)、异柴胡内酯(Isochaihulactone)以及与该柴胡内酯相关类似物或衍生物，如柴胡奈酮(Chaihunaphthone)等的新颖杂环化合物。其中，该柴胡内酯以及异柴胡内酯均是以γ-丁内酯为碳骨架核心，并于碳-2(5)位置形成Z构型的杂环化合物，该柴胡内酯类似物及异柴胡内酯类似物的通式分别如式(II)及式(III)所示：

                            式(II)

其中，R代表烷氧基。

                              式(III)

其中，R代表氢原子、烷氧基或芳基。

此新颖杂环化合物柴胡内酯、异柴胡内酯，以及与柴胡内酯相关的类似物及其衍生物属于一种存在于南柴胡干燥物的木脂素(Lignan)。由于药物筛选时发现各类南柴胡萃取物中以南柴胡丙酮粗抽取物以及第八成份的异柴胡内酯(Isochaihulactone)具有最佳的肿瘤抑制效果，因此，以下所述的较佳实施例遂分别以南柴胡丙酮粗抽取层及第八成份来当作含有γ-丁内酯的南柴胡萃取物，以及南柴胡新颖化合物“柴胡内酯类似物及其衍生物”的活性指针成份。以用来抑制人类肝癌、卵巢癌、肺癌、恶性脑胶质细胞瘤以及大肠直肠癌的功效指针成份。

(γ-Butyrolactone)核心杂环化合物及柴胡内酯类似物的指针，藉以检测南柴胡萃取物对于细胞系以及生物体内的肿瘤抑制情形。

惟从本发明较佳实施例的组织切片结果，已明白显示出南柴胡丙酮萃取物能够有效缩小肿瘤体积(Tumor Volume)，使肿瘤细胞核发生裂解，淋巴球浸润而造成肿瘤组织大片坏死。而且，经由动物毒性试验结果，亦可知投予南柴胡萃取物至哺乳类动物后，体内各项器官功能性指针，例如脂解酶(Lipase)、淀粉酶(Amylase)、肌胺酸酐激酶(Creatinine Kinase)、乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase)、GOT、BUN等，在投予南柴胡萃取物前后并无显著差异，但是肿瘤部位的端粒酶活性在投予南柴胡萃取物后却明显降低，显示以本发明的南柴胡丙酮粗抽取物以及新颖化合物“柴胡内酯、异柴胡内酯及柴胡内酯相关类似物与其衍生物”投予哺乳类动物，可在不伤害正常肝肾功能的情况下，可能对于人类肝癌、卵巢癌、肺癌、恶性脑瘤以及大肠直肠癌产生高度专一性(High Specificity)的毒杀能力。

另一方面，将具有γ-丁内酯杂环化合物的南柴胡丙酮粗萃取物，以及自南柴胡萃取物中分离出来的第八成份异柴胡内酯(为柴胡内酯、柴胡内酯类似物及其衍生物的指针成份)投予紫杉醇抗药性肿瘤细胞系(例如人类肺癌细胞系AT-12)后观察其肿瘤抑制情形。结果显示经过分离及纯化步骤，柴胡内酯、异柴胡内酯之类似物及其衍生物作用于抑制紫杉醇抗药性肿瘤细胞系的端粒酶活性的有效浓度(约1.2微克/毫升)远小于南柴胡丙酮萃取物的有效浓度(约60微克/毫升)，显示柴胡内酯、异柴胡内酯以及柴胡内酯相关类似物及其衍生物是南柴胡中最主要的肿瘤抑制活性成份，而且，生药型态的南柴胡经过本发明的萃取方法分离后，其南柴胡萃取物的肿瘤抑制效果更为显著。

因此，从南柴胡萃取物(尤指南柴胡丙酮粗抽取物、柴胡内酯、异柴胡内酯以及柴胡内酯相关类似物及其衍生物)的药物作用机转看来，南柴胡萃取物与紫杉醇类似，是一种用于抑制有丝分裂的微小管稳定剂(Microtubule Stabilizing Agent)，然而两者对于β微小管的作用部位可能不相同。

综上，从南柴胡中分离出来的新颖化合物“柴胡内酯、异柴胡内酯、柴胡内酯类似物及其衍生物”，在新药开发上极可能成为新的抗癌药物来源。

以下的实施例进一步详细说明本发明的观点，但并非以任何观点限制本发明的范畴。

现即配合附图详细说明本发明：(1)具肿瘤抑制功效的南柴胡萃取物，(2)该萃取物所含有的活性成份，(3)从南柴胡生药里萃取出南柴胡萃取物，以及(4)南柴胡萃取物中各活性成分的萃取方法，藉以治疗人类肝癌(Hepatoma)、卵巢癌(Ovarian Cancer)、肺癌(LungCancer)、恶性脑胶质细胞瘤(Malignant Glioblastoma)及大肠直肠癌(Colorectal Carcinoma)等癌细胞各较佳实施例，惟下述各实施例仅用于显示本发明的较佳实施态样，并非用以限制本发明的可实施范畴，且以南柴胡萃取物及其活性成份欲制作成药物上可接受的盐、酯、酮及类似物时，其药物组成、剂型及合成方式均得按实际实施情况进行调整。

实施例1：南柴胡肿瘤抑制(Antineoplastic)活性成分的萃取方法

本发明所用的南柴胡为全绿单叶互生，呈复伞花序的狭叶柴胡(Bupleurum scorzonerifolium Willd，我国称为南柴胡)。经过干燥及粉碎处理后，于室温下将6公斤的南柴胡粉末浸泡于20公升丙酮，搅拌四小时浓缩过滤并且反复粗抽四次，即取得南柴胡丙酮粗抽取物(简称为BS-A)，将残渣以甲醇抽取得到南柴胡甲醇萃取物(简称为BS-M层)，再以水抽取残渣以得到南柴胡水层萃取物(简称为BS-W层)。之后，将南柴胡丙酮粗抽取物以95％甲醇水溶液溶解，并以正己烷(n-Hexane)萃取三次后，分离出南柴胡正己烷层(简称为BS-H)以及南柴胡甲醇水层，并且加入蒸馏水500毫升脱除南柴胡甲醇水层中的甲醇。接着，在脱除甲醇的南柴胡甲醇水层中加入氯仿(Chloroform)进行萃取，经过三次氯仿萃取后分离氯仿层及水层并且合并浓缩，俾制得南柴胡氯仿萃取物(简称为BS-C)。

将南柴胡丙酮粗抽取物(BS-A)、南柴胡甲醇粗抽取物(BS-M)、南柴胡正己烷萃取物(BS-H)、南柴胡氯仿萃取物(BS-C)及南柴胡水层萃取物(BS-W)分别以MTT Assay测试不同萃取层所收集的萃取物对于肺癌细胞系A549的药物毒性，结果如图1所示，在各种南柴胡萃取层中，以南柴胡丙酮萃取物的肿瘤抑制效果最佳，且按照粗抽物的萃取流程「丙酮粗萃取物→甲醇水萃取物→氯仿萃取物」均含有肿瘤抑制成份。然为从南柴胡萃取物中分离出具有肿瘤抑制效果的成份，本发明于是进一步以层析法(Chromatography)洗提分离该南柴胡氯仿萃取物。

以硅胶层析法(Silica Gel Chromatography)将约100克南柴胡氯仿萃取物分别以5％甲醇/二氯甲烷、10％甲醇/二氯甲烷、20％甲醇/二氯甲烷以及甲醇洗提(Elution)分离，得到5％甲醇/二氯甲烷层萃取物27.5克、10％甲醇/二氯甲烷层萃取物14.04克、20％甲醇/二氯甲烷层10.96克以及甲醇层萃取物7.25克，其中，肿瘤抑制成份主要保留在5％甲醇/二氯甲烷层萃取物。而后，以例如硅胶柱层析法、或制备型高效能液相层析法(preperative High Performance Liquid Chromatography，HPLC)、或中压液相层析法(Medium Pressure Liquid Chromatography)或Lobar等层析技术分离5％甲醇/二氯甲烷萃取物，并且浓缩收集出具肿瘤抑制效果的第三成份、第八成份、第十四成份及第十五成份。

实施例2：南柴胡肿瘤抑制活性成分的结构

按上述萃取方法从南柴胡丙酮萃取物分离出来的第三成份、第八成份、第十四成份及第十五成份各主要代表物，分别以质谱(MassSpectrum)及核磁共振图谱(Nuclear Magnetic Resonance Spectrum，NMR)定义各化合物的分子量及其结构后，其结果如同下表所示：

表1：南柴胡丙酮萃取物中具肿瘤抑制功效的分离化合物

经过分子结构整合归纳发现，对于人类肝癌、卵巢癌、肺癌、恶性脑胶质细胞瘤及大肠直肠癌的肿瘤细胞系具抑制效果的南柴胡萃取物，其化合物碳骨架均为以γ-丁内酯为核心，且在碳2(5)处呈Z构型或E构型的杂环化合物(Heterocyclic Compounds)。而且，由细胞毒性测试结果可知，第三成份及第八成份对于肺癌细胞系的毒杀效果优于其它成份，故将第三及第八成份结晶以后，以氢核磁共振图谱(¹H-NMR)及碳13核磁共振图谱(¹³C-NMR)进一步分析此两洗提成份的分子结构，而得到分别如通式(I)及通式(II)所示，命名为“柴胡内酯(Chaihulactone)”及“异柴胡内酯(Isochaihulactone)”的新颖化合物：

                           式(I)

其中，R代表烷氧基。

                      式(II)

其中，R代表氢原子或烷氧基。

(白色针状结晶，熔点137-138℃，[α]_D ²⁵-29.0°(c0.5，CHCl3)；IR(KBr)v_maxcm^-1：1745，1635，1581，1335，1153；UV(CHCl3)λ_maxnm(logε)：247(4.08)，298(4.17)，327(4.08))

再而，若进一步分析其它具肿瘤抑制功效的化合物结构，例如前述第一成份、第二成份、第十一成份及第十五成份的代表分子以及相关类似物或其衍生物，并与现行药物数据库进行比对。其比对结果发现，南柴胡萃取物中具有肿瘤毒杀效果的医药组成物，均为含有γ-丁内酯(γ-Butyrolactone)核心结构，且碳-2(5)处呈Z构型或E构型的杂环化合物，或其药物上可接受的盐、酯、酮及其衍生物。该杂环化合物的通式为如式(I)所示：

                      式(I)

其中，X＝N，O，S，Se；

A，B分别选自具有下式的取代基：

其中，R1，R2，R3，R4，R5分别选自氢原子、卤原子、羟基、硫氢基、胺基、烷氧基及硝基；且该取代基进一步包含以下的取代基结构：

而且，由细胞毒性测试结果可知，第八成份异柴胡内酯对于肺癌细胞系的毒杀效果明显优于其它柴胡内酯类似物，因此，本发明所包含的下列各实施例，均是以南柴胡丙酮萃取物(BS-A)及第八成份的异柴胡内酯(BS-(8))作为评估南柴胡肿瘤抑制成份“γ-丁内酯核心，碳2(5)呈Z构型的杂环化合物”，以及新颖化合物“柴胡内酯、异柴胡内酯、柴胡内酯类似物及其衍生物”功效的指针物质。

实施例3：南柴胡萃取物对于细胞增生(Cell Proliferation)的影响

将从南柴胡生药中萃得的南柴胡丙酮粗抽取物(BS-A)、南柴胡甲醇粗抽取物(BS-M)、南柴胡水层粗抽取物(BS-W)以及分离自该BS-A萃取物的第八成份(BS-(8))分别加至人类肝癌细胞系、卵巢癌细胞系、肺癌细胞系、恶性脑胶质细胞瘤以及大肠直肠癌细胞系培养基中，观察加药7日间各肿瘤细胞系间的抑制情形。本实施例以肺癌细胞系A549及大肠直肠癌细胞系HT-29为例，当各萃取物投予三日后，加入60毫克南柴胡丙酮粗抽取物的肿瘤细胞数(Tumor Cell Counts)降低程度与600毫克的南柴胡甲醇粗抽取物所降低的肿瘤细胞数相似，显示肿瘤抑制成份在BS-M层的含量远较BS-A层为低，南柴胡中具肿瘤抑制功效的物质仍然主要保留于南柴胡丙酮萃取物中。

再而，若比较添加各南柴胡萃取物前后，人类肺癌细胞系A549的细胞增生变化，其结果可以利用流式细胞仪(Flow Cytometry)来进行检查。如图2A至图2D所示，横轴代表与抗体接合的肿瘤细胞染色体对数，纵轴代表FITC萤光强度，则从各图结果可清楚得知未加药前，肺癌细胞系A549主要分布在G0/G1期，但是，当肿瘤细胞加入南柴胡丙酮萃取物(BS-A)以及南柴胡甲醇萃取物(BS-M)以后，肿瘤细胞会明显地停滞在G2/M期，尤其更以南柴胡丙酮萃取物的功效最为显著。另一方面，从流式细胞仪的PI染色结果，亦发现加入南柴胡萃取物后，G0/G1期的染色体数量减少，但G2/M期的染色体(2N，4N等)数量却大为提高，而且该现象在人类肝癌细胞系、卵巢癌细胞系、肺癌细胞系及大肠直肠癌细胞系中均呈现相似结果，显示南柴胡萃取物的肿瘤抑制机转极可能与G2/M停滞(G2/M Arrest)有关。

实施例4：南柴胡萃取物与细胞凋亡(Apoptosis)

为进一步证实南柴胡萃取物是否具有诱导肿瘤细胞系产生细胞凋零(Apoptosis)的功效，本发明较佳实施例于是以流式细胞仪(FlowCytometry)、反转录聚合酶链反应(Reverse Transcription PolymeraseChain Reaction，RT-PCR)及西方点墨法(Western Blot)一同检视肿瘤细胞系分别加入南柴胡萃取物第八成份以及南柴胡丙酮萃取物以后，肿瘤细胞在细胞周期以及调控蛋白p21及p53上的变化。

以肺癌细胞系A549为例，将未加药的A549细胞系、加入20M异柴胡内酯的A549细胞系以及加入60微克/毫升南柴胡丙酮萃取物的A549细胞系连续培养48小时之后，利用流式细胞仪(Flow Cytometry)来检查Annexin V-FLOUS与PI之间的染色结果。其中，横轴表示与Annexin V-FLOUS抗体接合的肿瘤细胞萤光强度，而纵轴代表与PI抗体接合的肿瘤细胞萤光强度，结果由图3A至3C可知，控制组(指未加药的A549肿瘤细胞系)培养48小时后，与Annexin V结合(显示细胞膜外翻，细胞凋亡的指针)的细胞数量仅占3.8％，然而于A549肺癌细胞系中加入异柴胡内酯或南柴胡丙酮粗萃取物后再培养48小时，则发现肿瘤细胞与Annexin V结合的肿瘤细胞量大幅增加至32.7％，显示肿瘤细胞在南柴胡萃取物的作用下能够诱发细胞凋亡(Apoptosis)产生。

因此，从图4的细胞周期以及图5西方点墨法结果可知，南柴胡丙酮粗抽取物、以及南柴胡萃取物中的异柴胡内酯对于肿瘤细胞的细胞周期作用机转与紫杉醇类似，均在有丝分裂成熟阶段(G2/M期)停滞住，而且，南柴胡丙酮粗抽取物(BS-A)以及柴胡内酯相似物与其衍生物(BS-3或BS-8)会大幅提高肿瘤抑制蛋白(Tumor Suppressor)p21及p53产量来阻碍Cyclin D及Cyclin E，藉此阻挡细胞进入G0/G1期而使肿瘤细胞停滞于G2/M期。

故，由上述结果可知，南柴胡丙酮萃取物以及包含异柴胡内酯的柴胡内酯类似物及其衍生物具有促使肿瘤细胞停滞在G2/M期，俾诱发肿瘤细胞进入细胞凋亡(Apoptosis)的功效，且上述现象在人类肝癌、肺癌、卵巢癌、恶性脑瘤以及大肠直肠癌细胞系中均会发生，显示南柴胡萃取物具有抑制人类肝癌、卵巢癌、肺癌、恶性脑瘤及大肠直肠癌增生的功效，且其作用机转可能与紫杉醇的作用机转类似，为一种G2/M停滞剂。

若再以西方点墨法来检测肿瘤细胞系投予南柴胡丙酮萃取物及南柴胡萃取物第八成份以后，细胞骨架(Cytoskeleton)的变化。由图6所示，肺癌细胞系A549加入南柴胡丙酮萃取物12小时、24小时及48小时期间，细胞骨架中的第一型α-微小管无明显变化，但在第五型β-微小管却逐渐减少，而且，比较加入南柴胡萃取物前后，β-微小管是否出现聚集状态，由图7结果亦可得知，南柴胡萃取物第八成份加入以后，溶解型(Soluble form，指未聚合状态的β-微小管，图中以S表示)的蛋白带消失，而颗粒型(Particular form，指聚合以后的β-微小管，图中以P表示)的蛋白带增加，显示南柴胡萃取物与紫杉醇相似，均具有致使β-微小管聚集的功能。

并且，藉由共轭交显微镜(Confocal Microscope)进一步检视萤光标定微小管抗体接合到微小管上以后，细胞骨架内纺锤丝的移动情形。其结果图8所示，当肿瘤细胞加入南柴胡萃取物以后，β-微小管产生聚集现象，导致纺锤丝持续拉长，进而阻挡2倍数或多倍数染色体向细胞两极移动，使肿瘤细胞无法一分为二。如此，肿瘤细胞不仅无法有效地执行有丝分裂，甚至随着2N，4N染色体不断累积而导致无效细胞(Junk Cell)细胞凋亡。

实施例5：南柴胡萃取物对于紫杉醇抗药性肿瘤细胞系(Taxol Resistanee Tumor Cell Line)的影响

由于现行药物对于化疗后期具紫杉醇抗药性的肿瘤细胞并无令人满意的毒杀效果，而且从上述流式细胞仪(Flow Cytometry)结果亦发现，南柴胡丙酮粗抽取物以及异柴胡内酯类似物及其衍生物对于人类肝癌、卵巢癌、恶性脑癌、肺癌及大肠直肠癌的肿瘤抑制机转与紫杉醇近似，因此，本发明冀以南柴胡萃取物作为新药筛选来源，进一步检视南柴胡萃取物对于紫杉醇抗药性细胞系的毒杀效果。

以下，本发明实施例将以人类肺癌细胞系A549继带培养所产生的紫杉醇抗药性肺癌细胞系A549-T12为例，来试验南柴胡丙酮萃取物(BS-A)、南柴胡萃取物第八成份及第十五成份(BS-8，BS-15)，各代表柴胡内酯及与柴胡内酯相关的类似衍生物)对于A549-T12细胞系的影响，并运用流式细胞仪、药物毒性试验以及组织切片来评估南柴胡萃取物对于紫杉醇抗药性肿瘤细胞系的毒杀效果。

如图9A至9D所示，比较控制组(未加药的A549-T12)以及加入100nM紫杉醇、30微克/毫升BS-A、8微克/毫升BS-8及8微克/毫升BS-15的A549-T12在流式细胞仪下，Annexin V-FLOUS与PI之间的变化。的，横轴表示与Annexin V-FLOUS抗体接合的肿瘤细胞萤光强度，而纵轴代表与PI抗体接合的肿瘤细胞萤光强度，结果显示控制组(指未加药的紫杉醇抗药性肿瘤细胞系A549-T12)培养48小时后，与Annexin V结合的细胞数量仅占6.8％，然于A549-T12细胞系中分别加入异柴胡内酯、柴胡内酯衍生物或南柴胡丙酮粗抽取物后再培养48小时后，则发现肿瘤细胞与Annexin V结合的肿瘤细胞量大幅增加30.6％、23.1％及24％，显示异柴胡内酯对于诱发紫杉醇抗药性细胞系产生细胞凋亡的能力较其它柴胡内酯衍生物更佳，而且，南柴胡丙酮萃取物经过纯化后，促进肿瘤细胞产生细胞凋零的效果较粗萃取物状态更为显著。

再者，从细胞毒性测试结果可知，当添加南柴胡丙酮粗抽取物(BS-A)、柴胡内酯类似物(BS-8)以及柴胡内酯衍生物(BS-15)至紫杉醇抗药性肺癌细胞系48小时以后，如图10A至10C所示，肿瘤细胞存活率均明显降低，且经过纯化取得的柴胡内酯类似物毒杀肿瘤细胞的效果，从细胞或动物的有效半数致死量(IC₅₀或ED₅₀)上来看，皆远小于丙酮萃取物。显示包含柴胡内酯、异柴胡内酯在内的柴胡内酯类似物及其衍生物，为南柴胡丙酮粗抽取物里抑制肿瘤成份的主要活性物质，而且，经过分离以后的南柴胡萃取物只需要极低的剂量(1.5微克/毫升)便能引起肿瘤细胞凋亡。

实施例6：南柴胡萃取物在生物体内(in vivo)抑癌效果评估

如以组织切片进一步检视南柴胡萃取物对于生物体内(in vivo)A549细胞系及紫杉醇抗药性肿瘤细胞(A549-T12)的抑制情形。如图11A、图11B以及图12A和图12B所示，从放大100倍的苏木紫与伊红染色法(Haematoxylin and Eosin Stain，H&E Stain)组织切片结果比较使用BS-A治疗前后肿瘤组织的坏死情形，其结果发现，投予动物每公斤300毫克以上的BS-A以后，肿瘤细胞于细胞核部分发生裂解，淋巴球浸润且产生大片肿瘤细胞出血性坏死；从图12B更显示经过BS-A治疗以后，原本密集分布的肿瘤细胞只剩下数颗肿瘤细胞。同时，从图13A皮下肿瘤组织(A549细胞系)比较图亦显示，经过每公斤500毫克剂量的南柴胡萃取物投予，动物皮下的肿瘤体积明显缩小77％(肿瘤直径由13微米缩小为3微米)，且从相对肿瘤体积来看，如图13B所示，以南柴胡萃取物治疗肿瘤后，肿瘤增大的速度亦会明显趋缓。因此，从组织切片及皮下肿瘤组织可以得知，南柴胡萃取物对于生物体内的肿瘤组织具有显著的毒杀效果，并能控制肿瘤体积的扩张速度。

实施例7：南柴胡萃取物在细胞毒性及动物毒性方面的影响

从本发明实验结果侦知，南柴胡丙酮粗抽取物(60微克/毫升)对于人类肝癌、卵巢癌、肺癌、恶性脑瘤以及大肠直肠癌细胞系具显著抑制功效，且在组织切片及皮下肿瘤试验中，亦证实南柴胡萃取物可以毒杀生物体(in vivo)内的肿瘤组织。故为进一步测量南柴胡萃取物在执行肿瘤毒杀效果的同时，对于其它正常细胞或器官是否具有伤害性，以评估南柴胡萃取物作为新药来源的可能，本发明以清醒鼠为例来显示投予每公斤400微克的南柴胡萃取物以后，鼠体各器官生化指针酵素的变化。

如图14及图15所示，于活体状态下静脉投予每公斤400微克剂量的南柴胡丙酮萃取物至清醒鼠体内72小时以后，在胰脏功能指针脂肪酶(Lipase)、淀粉酶(Amylase)，肝脏功能指针酵素葡萄糖氧化酶(GOT)、葡萄糖磷酸转化酶(GPT)，心脏功能指针酵素乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase，LDH)、肌酸酐激酶(Creatinine Kinase，CK)，肾脏功能指针肌酸酐(Creatinine)、血清尿素氮(Blood Urea Nitrogen，BUN)等各类生化值，以及心搏、舒张压、收缩压、血小板以及白血球方面，均无异于未投药的控制组，显示南柴胡萃取物的投予并不会对生物体内的消化系统、循环系统、代谢系统、造血机能及生殖细胞造成毒害。而且，从图15的肝、肾组织切片亦能左证连续五日腹腔内投予南柴胡萃取物每公斤300微克以后，正常肝细胞及肾细胞并不会受到破坏。另一方面，由于南柴胡丙酮萃取物或异柴胡内酯对于活体动物的肿瘤细胞端粒酶(Telomerase)的活性具明显抑制功效，因此，综合上述结果可以清楚得知，南柴胡萃取物投予生物体后并不会影响正常细胞功能或器官运作，但对包含紫杉醇抗药性细胞系在内的肿瘤细胞却具有高度专一性的毒杀效果，故，以南柴胡萃取物或其药物上可接受的盐、酯、酮及其衍生物作为治疗药物，可以有效解决现行药物对于紫杉醇抗药性肿瘤细胞毒杀效果不彰的问题，而为化疗后期紫杉醇逐渐失效的患者提供一种新的抗肿瘤药剂来源。

结论

综上而言，以本发明萃取方法分离取得的南柴胡萃取物，为以包含如通式(I)，具γ-丁内酯结构，碳2(5)呈Z构型或E构型的杂环化合物的南柴胡丙酮萃取物，以及分离自该南柴胡丙酮萃取物，而以异柴胡内酯为代表的柴胡内酯类似物与其衍生物，或其药物上可接受的盐、酯、酮与其衍生物作为治疗人类肝癌、卵巢癌、肺癌、恶性脑瘤及大肠直肠癌的肿瘤抑制活性成份。

                          式(I)

其中，X＝N，O，S，Se；

A，B分别选自具有下式之取代基：

其中，R1，R2，R3，R4，R5分别选自氢原子、卤原子、羟基、硫氢基、胺基、烷氧基及硝基。

惟从本发明的较佳实施例可知，南柴胡萃取物经过分离、纯化得到的异柴胡内酯较丙酮粗抽取物具有更佳的肿瘤抑制效果，而且，投予南柴胡萃取物以后，不论在一般肿瘤细胞或紫杉醇抗药性肿瘤细胞，其抑制肿瘤端粒酶活性、缩小相对肿瘤体积、抑制肿瘤细胞增生以及促进肿瘤细胞凋零方面均具有显著功效，并在不影响生物体正常消化系统、循环系统、代谢系统、造血系统以及生殖泌尿系统的状态下，高度专一性地毒杀肿瘤细胞。

再者，由细胞调控的观点来看，南柴胡丙酮萃取物为一种促使细胞骨架的β-微小管聚集，使拉长的纺锤丝无法向两极牵引而导致细胞凋亡的微小管稳定剂(Microtubule Stabilizing Agent)，且其作用机转与紫杉醇类似，可以促使肿瘤细胞的有丝分裂停滞在G2/M期，而达到控制肿瘤细胞增生的功效。

Claims (27)

1.一种从南柴胡(Bupleurum scorzonerifolium)中分离出用于对抗细胞细胞增生性疾病的活性成份的南柴胡萃取方法，其特征在于，该萃取方法包括：

抽提南柴胡以取得木脂素混合物，其中该木脂素混合物包含有至少一种可抑制肿瘤增生的活性成份；以及

分离该抑制肿瘤增生的活性成份，以得到单一类型的南柴胡萃取物。

2.如权利要求1所述的南柴胡萃取方法，其特征在于，从南柴胡中抽提出该木脂素混合物的步骤包括以极性互异的第一、第二、第三及第四溶液来执行以下步骤：

以第一溶液溶抽粉碎后的南柴胡，分离取得南柴胡第一萃取物及残渣；

以第二溶液溶抽残渣，分离取得南柴胡第二萃取物；

以第三溶液抽提该南柴胡第一萃取物，并且脱除抽提水层中的醇类；以及

以第四溶液抽提该脱除醇类的抽提水层，并予以浓缩。

3.如权利要求2所述的南柴胡萃取方法，其特征在于，该第一溶液为丙酮。

4.如权利要求2所述的南柴胡萃取方法，其特征在于，该第二溶液为甲醇。

5.如权利要求2所述的南柴胡萃取方法，其特征在于，该第三溶液为95％甲醇水溶液。

6.如权利要求2所述的南柴胡萃取方法，其特征在于，该第四溶液为氯仿。

7.如权利要求1所述的南柴胡萃取方法，其特征在于，该方法还包括以层析法分离该肿瘤抑制增生的活性成份。

8.如权利要求7所述的南柴胡萃取方法，其特征在于，该层析法为硅胶层析法。

9.如权利要求7所述的南柴胡萃取方法，其特征在于，该层析法为制备型高效能液相层析法。

10.如权利要求7所述的南柴胡萃取方法，其特征在于，该层析法为中压液相层析法。

11.如权利要求1所述的南柴胡萃取方法，其特征在于，该方法还包括以质谱及核磁共振图谱鉴定各单一类型南柴胡萃取物的分子量及其结构。

12.如权利要求1所述的南柴胡萃取方法，其特征在于，该细胞增生性疾病为人类肝癌。

13.如权利要求1所述的南柴胡萃取方法，其特征在于，该细胞增生性疾病为人类卵巢癌。

14.如权利要求1所述的南柴胡萃取方法，其特征在于，该细胞增生性疾病为人类恶性脑胶质细胞瘤。

15.如权利要求1所述的南柴胡萃取方法，其特征在于，该细胞增生性疾病为人类肺癌。

16.如权利要求1所述的南柴胡萃取方法，其特征在于，该细胞增生性疾病为人类大肠直肠癌。

17.如权利要求1所述的南柴胡萃取方法，其特征在于，该细胞增生性疾病对于紫杉类治疗剂具抗药性。

18.如权利要求17所述的南柴胡萃取方法，其特征在于，该紫杉类治疗剂为紫杉醇。

19.如权利要求1所述的南柴胡萃取方法，其特征在于，该抑制肿瘤增生的活性成份包括至少一种具以下通式的杂环化合物，或包含有如下式的药物上可接受的盐、酯、酮或其衍生物：

其中，X＝N，O，S，Se；

A，B分别选自具有下式的取代基：

其中，R1，R2，R3，R4，R5分别选自氢原子、卤原子、羟基、硫氢基、胺基、烷氧基及硝基。

20.如权利要求19所述的南柴胡萃取方法，其特征在于，该A，B取代基选自以下的取代基结构：

以及

21.如权利要求19所述的南柴胡萃取方法，其特征在于，该杂环化合物为在碳2(5)处呈Z构型。

22.如权利要求19所述的南柴胡萃取方法，其特征在于，该杂环化合物为在碳2(5)处呈E构型。

23.如权利要求19所述的南柴胡萃取方法，其特征在于，该杂环化合物为具有以下通式命名的柴胡内酯：

其中，R代表烷氧基。

24.如权利要求19所述的南柴胡萃取方法，其特征在于，该杂环化合物具有以下通式命名的异柴胡内酯：

其中，R代表氢原子、烷氧基

或芳基。

25.如权利要求1所述的南柴胡萃取方法，其特征在于，该抑制肿瘤增生的活性成份为一种调控细胞周期的G2/M停滞剂。

26.如权利要求1所述的南柴胡萃取方法，其特征在于，该抑制肿瘤增生的活性成份为一种促使细胞骨架的β-微小管聚集的微小管稳定剂。

27.一种经权利要求1所述的方法萃取得到的萃取物。

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