TWI324996B - - Google Patents

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1324996 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】： 本發明係關於一種1r -丁内酯化合物，尤指一種用於治 療人類肝癌（Hepatoma)、肺癌（Lung cancer)、卵巢癌 (Ovarian cancer)、惡性腦膠質細胞瘤（Human Malignant Glioblastoma)及大腸直腸癌（Colorectal Cancer)等人類 癌症之7 -丁内酯化合物及其醫藥組成物。 【先前技術】： ® 癌症，一種細胞增生疾病，已經成為十大死亡原因之 首。根據Boring等人1993年的統計，美國每年約有五十 二萬六千人死於癌症，以女性癌症之首乳癌（Breast Cancer)為例，幾已成為40至55歲婦女的主要殺手。且 隨著環境污染曰益嚴重，卵巢癌、肺癌以及肝癌等實體癌 (Solid Tumor )以及皮膚癌等患者也明顯增多。根據 Fitzpatrick等人1986年的研究，今日的癌症患者人數與 #1945年相較，足足多出六倍，顯見癌症的偵測與治療實在 是刻不容緩。 惟根據目前癌症的研究發現，真核細胞（Eukaryocyte ) 的細胞老化（Senescence)、複製（Replication)以及分裂 (Division)都會遵循細胞週期（Cell Cycle)的模式予以 調控。其中，當細胞進行複製時，攜帶基因的染色體 (Chromosome)其去氧核 _核酸（Deoxyribonucleic Acid, DNA )含量會由2N倍增成4N，以於有絲分裂（Mitosis ) 後產生兩個 2N 子細胞（Daughter Cell)。1995 年 Blackburn 5 17218D1 1324996 等人指出，真核細胞分裂時，染色體末端會重複一段稱作 “端粒（Telomere ) ”的固定序列。以人類細胞為例，人類 染色體末端的端粒會重複固定5’-TTAGGG序列。從目前 研究結果得知，“端粒”與細胞週期的時程（Cell Clock )調 控有關，隨著有絲分裂次數增加，端粒會逐漸變短，當端 粒縮短到一定長度時，染色體末端覆蓋的端粒很容易黏結 而導致染色體配對異常，甚至造成細胞死亡（Cell death )。 1995年Feng等人在胚細胞（Germ-line Cell )、幹細 籲胞（Stem Cell)及腫瘤細胞（Tumor Cell)等旺盛分裂的 細胞中發現，這些細胞染色體末端的端粒上附著有一種稱 為“端粒晦（Telomerase) ”的核_蛋白複合體 (Ribonucleoprotein Complex )，端粒晦的作用在於維持端 粒長度，避免端粒歷經多次有絲分裂而變短，因此，端粒 腌的存在可以幫助細胞跳脫細胞週期限制而走向不死化。 若進一步以 TRAP ( Telomerase Repeat Amplification 翁Protocol ) Assay測試染色體端粒梅活性（Telomerase

Activity )更發現，在腫瘤細胞或分化不完全的細胞株（如 胚細胞、幹細胞等）中，端粒晦的活性很高，但在骨髓細 胞及生殖細胞以外的正常體細胞則幾乎沒有端粒臃活性； 又，1994及1995年Kim及Broccoli等人亦證實，端粒梅 在協助腫瘤細胞閃躲細胞程式化死亡調控的連鎖機制 (Apoptotic Cascade )中扮演重要角色，因此，以端粒晦 活性作為抗癌藥物的偵測標的，可以有效取代傳統化學標 的，準確地偵測藥物對於腫瘤細胞的毒殺情形，而使得檢 6 17218D1 1324996 測端粒酶活性幾已成為測試抗癌藥物治療功效的高專一性 (Specificity )指標。 另方面，根據中醫界多年來臨床治療經驗，將臨床 上認為具有抗癌功效之五、六十種中藥材，經TRAp活性 =選後發現’_、黃柏、人參、甘草、當歸、龍膽及黃 今等中樂材對於惡性腫瘤具有明顯的、冶療效果。同時，將 中藥與目前抗癌藥物相較，亦發财藥造成患者的副作用 (如白血球數量減少、惡病質（Cachexia )等）較為緩和， 因此、，從中藥裡萃取出具腫瘤抑制功效之活性成份，極可 能作為新型抗癌藥物的篩選來源。 此外，以現今廣泛用來治療轉移性實體癌的化學治療 劑（Chemotherapeutic Agent) “紫杉醇注射劑…仙咖、 商品名TAX0L)，，為例，其主要成分紫杉醇 (TaXanol )最早係從太平洋紫杉木（pacmc )萃 取而得’化學式如下式所示：（分子^C47H5iN〇"，分子 量854，以二忡類（Diterpene)結構為核心

紫杉醇注射劑主要用於治療卵巢癌、轉移性乳癌 (Metastatic Breast Cancer )、肺癌以及黑色素細胞瘤山 係藉 (Melanoma)等癌症，其毒殺腫瘤細胞之作用機轉， 17218D1 7 1324996 由紫杉醇以1:1比例結合細胞骨架（Cytoskelet〇n)内的冷 微小管（/3-tubulin)來抑制微小管（Micr〇tubule)的去聚 合作用（Depolymedzation)，藉此阻斷有絲分裂（Mit〇sis) 完成以啟動腫瘤細胞凋亡（Blafoskl〇nny et. al，1995)。因 此，使用紫杉醇等紫杉類（Taxane )藥物治療卵巢癌之初， 可以有效殺死腫瘤細胞，而使患者的兩年存活率提高約 -15%。 ' 但疋，Pic著療私延長，臨床上發現腫瘤細胞對於紫杉 醇會逐漸產生k藥性。尤其，從最近研究發現，部分具紫 杉醇抗藥性之腫瘤細胞株在万微小管的表現（邮⑽^、) 及電泳移動性（Electrophoretic Mobility )上明顯不同於傳 統腫瘤細胞。根據1995年Ra〇等人的研究可知，這些腫 瘤細胞（如人類肺癌細胞株ΑΤ·12)會改變，组成万微小管 的六個次單體構型（Subunit c〇nfigurati〇n )，使紫杉醇不 僅無法與微小管結合，反會被細胞當作外來物排除 鲁（Ion-pumpmg)，致使腫瘤細胞對於紫杉醇逐漸產生抗藥 性而在-化療後期逐漸失效。 ’、 並且，以現存其他抗癌藥物，如5-氟嘧啶二酮 (5-Fluorouracil)、埃波黴素（Ep〇thil〇ne)、順雙胺雙氯鉑 ⑺Sdianimine Dichl⑽Platinum，俗稱 Cispiatin)、甲基节 并（rocarbazine)以及環磷胺（CyC】0ph〇Sphamide)等單 獨使用或併用紫杉醇來治療對於紫杉類藥物具抗藥性之患 者，=床治療效果不佳，且從細胞實驗來看亦發現目前的 k癌藥物難以抑制紫杉醇抗藥性腫瘤細胞株 17218D1 8 叫4996 (Taxan〇i_resistanceTum〇rCellLine)增生。然如提高藥 物投予劑量，例如將紫杉醇劑量調高到每公斤300毫克注 射大白鼠時，紫杉醇產生的細胞毒性（Cytotoxicity )很強， 往往於用藥後造成正常細胞大量壞死（Necr〇sis )。 疋故，為增進化療後期癌細胞的毒殺效果，從臨床上 初見抗癌功效的中藥材裡發展出能有效抑制紫杉醇抗藥性 腫瘤細胞株之抗癌藥物，已成為醫界的當務之急。 【發明内容】： •本發明之主要目的在於提供一種用於抑制哺乳動物 細胞增生疾病（如人類肝癌、卵巢癌、惡性腦瘤、肺癌及 大腸直腸癌等）之卜丁内酯（r_Butyr〇lact〇ne)化合物 及其醫藥組成物。 本發明之另一目的在於提供一種對紫杉醇抗藥性腫 瘤細胞株具抑制功效，且命名為柴胡内酯 (Chaihulactone )、異柴胡内酉旨（Is〇chaihulact〇ne )及其他 丨柴胡内酯衍生物之丁内酯化合物及其醫藥組成物。 本發明之再一目的在於提供一種在不影響正常肝腎 力月匕的f月況下’發展出對紫杉醇抗藥性腫瘤細胞株具高度 專一性毒殺效果之7 -丁内酯化合物及其醫藥組成物。 鑑於上述及其他目的，本發明提出一種用於治療肺 癌、卵巢癌、肝癌、人類惡性腦膠質細胞瘤或大腸直腸癌 等疾病之r-丁内酯化合物及其醫藥組成物，其中，該γ-丁内醋化合物及其醫藥組成物中進一步包括一種以上核心 處之碳2⑺位置呈ζ構型或Ε構型之化合物，並且分別 9 17218D1 命名為“柴胡内酯”、“異柴胡内酯，，及其衍生物。 、上述r-丁内醋化合物及其醫藥組成物包含一種如下 式（I)所示，核心處為r-丁内醋結構，且在碳2 (5)位 置呈Z構型或E構型之化合物：

B 式（I)中，X = N，〇, s，Se ; A，B係分別選自具有下式之取代基：

其中R]’ R2’ R3’ R4，R5係分別選自氮原子、鹵原子、 羥基、硫氫基、胺基、烷氧基及硝基。 式（I )所示之7 -丁内酯化合物的實例包括如式（π) _及式（III )所示，首次公開並且分別命名為“柴胡内酯” 及“異柴胡内酯”之化合物，其中，該柴胡内酯、異柴胡 内S旨及其衍生物俱屬於木脂素（Lignan )類。比較式（I )、 式（II)及式（ΙΠ )可知，柴胡内酯、異柴胡内酯均為一 種以7 -丁内S旨結構為核心之雜環化合物，且該r -丁内酯 在碳2 ( 5 )位置呈Z構型或E構型。 10 17218D1 1324996

式（π) 其中’R代表烷氧基。

其中’ R代表氫原子、烧氧基或芳基。 從本發明實施例之實驗結果發現，以不同溶劑（如丙 酮、甲醇水溶液等）分離南柴胡製得如式（1)所示之丁 内酯化合物及其醫藥組成物能夠有效抑制腫瘤細胞增生， 而且，以丙酮為溶劑抽取南柴胡再分析各濃縮物的^子結 構，可以得到命名為柴胡内酯、異柴胡内酯及其衍生物: 新穎化合物。 根據本發明較佳實施例實驗結果，將具有式（㈠所示 之r ·丁内酯結構之柴胡内酯、異柴胡内酯及其衍生物加至 人類肺癌、肝癌、惡性腦膠質細胞瘤及大腸癌細胞株以後 么現’腫瘤細胞株的端粒腾活性較未加藥之控制組明顯減 少約5倍，尤其係紫杉醇抗藥性腫瘤細胞株的端粒酶活性 在添加上述具有式（I )所示之7 -丁内酯結構之柴胡内 11 17218D1 UZ4996 酯、異柴胡内酯、其衍生物及其醫藥組成物後，可以產生 明顯的毒殺效果，顯示南柴胡中禮實含有腫瘤抑制活性成 伤，且该腫瘤抑制活性成份係指以卜丁内g旨結構為核心， • ^其丁内酉旨核心處之碳2(5)位置呈現z構型或E構型之新 .病化合物及其醫藥組成物，其中尤其以新發現之柴胡内 酯、異柴胡内酯及其衍生物的腫瘤毒殺效果最為顯著。 ' 若以TRAP八85叮檢測腫瘤細胞株加入本發明之7 _丁 -内酯化合物及其醫藥組成物以後，腫瘤細胞内之端粒腾的 活性抑制情形。亦發現該r 丁内醋化合物及其醫藥組成物 可以有效抑制人類肺癌細胞株A549的端粒晦活性及 hTERT訊息核糖核酸之表現，顯示本發明之γ _丁内酯化合 物對於癌細胞具有南度專一性的毒殺效果。 尤其，將本發明之“柴胡内酯”加入紫杉醇抗藥性腫 瘤細胞株，例如A 5 4 9 - Τ12 (對紫杉醇具抗藥性之人類肺癌 細胞株），更發現本發明之r _丁内酯化合物及其醫藥組成 參物會誘發紫杉醇抗藥性腫瘤細胞株產生細胞〉周亡 (Apoptosis );而從流式細胞儀（Flow Cyt〇meter )及西方 點墨法（WesternBlot)結果進一步探討含有本發明之 丁内S曰化合物之南柴胡卒取物的作用機轉，亦發現該南华 胡萃取物會誘導細胞大量生產P21及ρ53等腫瘤抑制蛋白 (Tumor Suppressor)，使腫瘤細胞停滞在有絲分裂後期（高 G2/M比例）的紡垂絲聚合狀態（Spindle P〇lymedzatiQn )。 故’由細胞調控（Cell Regulation)的觀點來看，本發明 之r -丁内醋化合物及其醫藥組成物可視作一種能有效抑 17218D1 12 1324996 制有絲分裂之微小管穩定劑（Microtubule Stabilizing Agent)，其作用機轉與紫杉醇注射器類似，皆具有促進微 小管聚合（Microtubule Polymerization)之功效，使增生 的腫瘤細胞停滯在G2/M期，變成無效細胞（Junk Cell ) 而導致細胞凋亡。 【實施方式】： 以下係藉由特定的具體實施例說明本發明之實施方 式，熟習此技藝之人士可由本說明書所揭示之内容輕易地 籲瞭解本發明之其他優點與功效。本發明亦可藉由其他不同 的具體實施例加以施行或應用，本說明書中的各項細節亦 可基於不同觀點與應用，在不悖離本發明之精神下進行各 種修飾與變更。 本發明至少包含三部分： 一為從南柴胡（召叩/⑼〜所)生藥中 製造出對於人類肝癌細胞株J5、卵巢癌細胞株OVCAR-3、 春惡性腦膠質細胞瘤細胞株DBTRG-05MD、肺癌細胞株 A549及大腸直腸癌細胞株HT29具抑制功效之南柴胡萃 取物。 其二係取得紫杉醇抗藥性腫瘤細胞株具毒殺效果之 南柴胡萃取物後，於該南柴胡萃取物中進一步分離出具腫 瘤抑制效果之T - 丁内酯化合物。其中，該7 - 丁内酯化合 物及其醫藥組成物至少包含有一種以上以r -丁内酯為核 心，且碳2(5)位置呈Z構型或E構型之雜環化合物。 而第三部份則是將上述7 -丁内酯化合物及其醫藥組 13 17218D1 1JZ4990 成物加至腫瘤細胞株，進-步檢驗體内（inviv〇)及體外 (in咖。）環境下，該r·丁内酯化合物及其醫藥組成物對 於腫瘤細胞株的抑制效果，復利用動物模式進一步評估本 發明之τ·τ削旨化合物及其醫藥組成物對於生物體内正 常細胞及腫瘤細胞的影響，以檢視在活體狀熊下，哕 丁内醋化合物及其醫藥組成物對於肝癌、Μ癌、肺^、 惡性腦瘤或大腸直腸癌的抑癌效果。 根據本發明較佳實施例所採用之南柴胡萃取物製造 方法，係將生藥南柴胡粉碎後浸泡於丙嗣，經過四次 授拌、抽取及濃縮而取得南柴胡丙，粗抽取物（BS_A声） 後二慮將殘渣以甲醇抽取得到南柴胡甲醇粗抽取物 (間稱f M層），再以水抽取殘渔以得到南柴胡水層抽 取物（簡稱為BS-W層）； 之後，將南柴胡丙酮粗抽取物溶解 過正己烷粗抽後，分離取 合欣、，工 層）以及南柴胡曱醇水層^正Q層（簡稱 萃取2取醇水層中之甲醇，並以氣仿重複 卒取/辰細取仵南柴胡氣仿萃取物； 极利用層析法卩 , ^ θ v ( omatograPhy)分離該南柴胡氣仿 卒取物，亚且分別收集 (―)進行濃縮； -之…一亂甲烷沖提層 取fM層析法（如矽膠柱層析法（SilicaGd Chromat〇graphy )或製 HPLC)等）將甲醇 …月匕液相層析法（ΡΓ啊ative 知/一乳甲烷沖提層分離純化，俾取得單 17218D1 1324996 一類型之化合物。 從層析法分離出來的單離化合物，經過質譜（Mass Spectrum)及核磁共振圖譜（Nuclear Magnetic Resource Spectrum )鑑定各單類化合物的分子量以及結構，可得到 如下表所示之雜環化合物：

15 17218D1 1324996 第四成份 第五成份 _第六成份 第七成份 鲁第八成份

284.27 Oroxylin A 284.27 Wogonin 380.35 316.31 398.41 Isochaihulactone 16 17218D1 1324996

17 17218D1 1324996 將南柴胡各萃取層以及分離自南柴胡丙酮粗抽取物. 中之上述雜環化合物分別施予藥物篩選，得知南柴胡生藥 中之腫瘤抑制成份主要保留在南柴胡丙酮粗抽取物以及南 柴胡甲醇水層經過層析法（如低㈣相層析或高 效能液相層析法（HighPerf〇rmanceLiquid

Cl^mat〇graphy，HPLC ))進一步純化，亦可分段收集各 冲提層，以於漠縮後得到上述各類單一化合物。 惟從本發明較佳實施例之藥物筛選結果發現 來的ί述各成份中，第三成份'“成份對於人 二賭：主卵巢癌、肺癌 '惡性腦瘤以及大腸直腸癌細胞株 的腫瘤I殺效果最為顯著。 表性二若分析具腫瘤效果之第三、第八成份之代 構特如下知南柴胡中具有抑癌效果之化合物其結 且在二2rs/ 10所不，係為一種以r-丁内酯為核心， 且在石反2(5)位置呈z槎】 構^•或£構型之雜環化合物及其醫藥 組成物。 '、 厂 •X - 旮 Li_ /7* -丁内酯 5\ 式（I) 其中，X = N，0, s，Se ; A3係分別選自具有下式之取代基： 17218D1 18 1324996

其中’ R】，R2, R3, R4, R5係分別選自氫原子、鹵原子、 經基、硫氫基、胺基、烷氧基及硝基。 若進一步分析純化合物中’第三成份、第八成份、第 • ；|；四成份以及第十五成份之分子結構，亦可知該南柴胡令 胡内酯以及異柴胡内酯均是以7 _ 丁 -2(5)位置形成z構型之雜環化合物 異柴胡内酯類似物分別如式（π ) λ .復包括有命名為柴胡内酯、異柴胡内酯及其衍生物，如柴 胡奈酮（Chaihunaphthone)等之雜環化合物。其中，該柴 父7 - 丁内酉旨為核心，並於碳 化合物’該柴胡内|旨類似物及 (π )及式（III )所示：

式（II) 其中’R代表烷氧基。

其中，R代表氫原子 此柴胡内酯、 式（III) 氫原子、烷氧基或芳基。 異柴胡内酯及其衍生物等雜 環化合物係 1721 则 19 1324996 屬，-種存在於南柴胡生藥中之木脂素（Lignan)類。由 於藥物筛選時發現南柴胡丙酮粗抽取物以及第人成份之異 柴胡内酯具有最佳之腫瘤抑制效果，因此，以下各較佳實 -施例遂分別以南柴胡丙酮粗抽取層及第八成份來當作指 標，藉以檢視上述萃取物在人類肝癌、卵巢癌、肺癌、惡 性腦膠質細胞瘤以及大腸直腸癌方面，於細胞株以及生物 • 體内的腫瘤抑制情形。 .鲁 惟從本發明較佳實施例之組織切片結果，已明白顯示 出南柴胡丙酮粗抽取物能夠有效縮小腫瘤體積，使腫瘤細 胞核發生裂解，淋巴球浸潤而造成腫瘤組織大片壞死。而 且，經由動物毒性試驗結果，亦可知投予含有本發明之7 _ 丁内酯化合物及其醫藥組成物之南柴胡粗抽取物至哺乳類 動物前後’體内各項器官功能性指標， 例如脂解酶（Lipase)、澱粉腾（Amylase)、肌胺酸酐 激晦（Creatinine Kinase, CK)、乳酸脫氫晦（Lactate _Dehydr〇genase，LDH )、葡萄糖氧化晦（G〇T)、血清尿素氮 (Blood Urea Nitrogen，BUN)等並無顯著差異，但是腫瘤部 位的端粒晦活性在投予南柴胡粗抽取物後卻明顯降低，顯 示以本發明之^ _丁内酯化合物及其醫藥組成物投予哺乳 •類動物’可在不傷害正常肝腎功能的情況下，對人類肝癌、 •卵巢癌、肺癌、惡性腦瘤以及大腸直腸癌產生高度專一性 (High Specificity)的毒殺能力。 另一方面’將本發明之r -丁内酯化合物及其醫藥組成 物之代表成分“異柴胡内酯”加入紫杉醇抗藥性腫瘤細胞 17218D1 20 1324996 株（例如人類肺癌細胞株A 亦發現經過分離及純化步驟 =;胞株之端粒酶活性的有效漠度（約I:微 克/¾升）运小於南柴胡丙綱萃 ' 克/亳弁介而曰土此4 j卒取物的有效濃度（約60微 >ιέ- 4 y'、、、_ ""上述衣造方法精製以後， /、腫瘤抑制效果會更為顯著。 ^而，從藥物作用機轉看來，本發明旨 物及其醫藥組成物與紫杉醇類 »^|J ^ - ^ 扯、係扣一種用於抑制有絲 可能不相同。 士於石微小官的作用部位 综，，二南柴胡中分離出來，分別命名為“柴胡内 酉曰、異柴胡内酯”及其衍生物夕〜 醫藥組成物在新藥開發上極可能成為新其 以下之實施㈣進-步詳細說明本發明之觀點，但並 非以任何觀點限制本發明之範疇。 丨（較佳實施例） 現即配合所附圖式詳細說明本發明：⑴&柴胡萃取 物’⑺從該南柴胡萃取物中分離出具㈣抑制功效之^ 丁内醋化合物及其醫藥組成物’以及（3)以該卜丁内醋 化合物及其醫藥組成物治療人類肝癌1巢癌、肺癌、$、 性腦膠㈣胞瘤及大腸直耗等癌細胞之較佳實施例。惟 下述各實施例僅用於顯示本發明之較佳實施態樣，並非用 以限制本發明之可實施料，且以南柴胡及其所含活性成 份製作藥物上可接受之醋、酮及類似物時，其藥物劑型及 17218D1 21 合成方式均得按實際實施情況進行調整 柴胡萃取物之, 本發明所用之南柴胡為全綠單葉 狹荦毕钿； 干朱反玍王稷繳化序之 此=胡（〜W謂咖⑽奶/〇//謂·d，我國稱為南 木胡）。經過錢及料處理後，於室溫下將6公斤的南华 月粉末浸泡於20公升丙嗣，授掉四小^農縮過遽並且反覆 抽四次，即取得南柴胡丙酮粗抽取物（簡稱為bs_A)， :殘渣以甲醇抽取得到南柴胡甲醇萃取物（簡稱為队m 曰），再以水抽取殘渣以得到南柴胡水層萃取物（簡稱為 、S W層）。之後，將南柴胡丙酮粗抽取物以曱醇水溶 、:解1以正己心萃取二次後，分離出南柴胡正己烧層 (簡稱為BS-H)以及南柴胡甲醇水層，並且加入蒸鶴水 ⑽亳升脫除南柴胡甲醇水層中之甲_。接著，在脫除甲 ，之南柴胡曱醇水層中加人氯仿進行萃取，經過三次氣仿 萃取後分離氣仿層及水層並且合併濃縮，俾製得南柴胡氣 仿萃取物（簡稱為BS-C)。 將南柴胡丙酮粗抽取物（BS_A)、南柴胡曱醇萃取物 (BS-M)、南柴胡正己烷萃取物（BS_H)、南柴胡氣仿萃 取物（BS-C)及南柴胡水層萃取物（Bs_w)分別以MTT Assay測試不同萃取層所收集之萃取物對於肺癌細胞株 A549的藥物毒性，結果如第i圖所示，在各種南柴胡萃取 層中，係以南柴胡丙嗣粗抽取物的腫瘤抑制效果最佳，立 按照粗抽取物之萃取流程「丙酮粗抽取物—曱醇水萃取物 22 17218D1 氣仿萃取物」均含有腫瘤抑制成份。然為從南柴胡萃取 中分離出具有腫瘤抑制效果的成份，本發明於是進一步 以層析法沖提分離該南柴胡氯仿萃取物。 以矽膠層析法將約100克南柴胡氣仿萃取物分別以 5 /〇甲醇/一氣甲烷、10%甲醇/二氯曱烷、20〇/〇曱醇/二氯甲 烧以及甲醇沖提分離，得到5%曱醇/二氯甲烧層萃取物 .5克丨〇/〇甲醇/二氯甲燒層萃取物14.〇4克、2〇%甲醇/ .二氣曱烷層10.96克以及甲醇層萃取物7 25克，其中，腫 瘤抑制成份主要保留在5%曱醇/二氣曱烷層萃取物。而 後，以例如石夕膠柱層析法、或製備型高效能液相層析法、 或中壓液相層析法（Medium Pressure Liquid Chromatography)或Lobar等層析技術分離5%甲醇/二氯 曱烷萃取物，並且濃縮收集出具腫瘤抑制效果之第三 份、第八成份、第十四成份及第十五成份。 鲁實:南柴胡魏活性成合$娃所 按上述萃取方法從南柴胡丙酮萃取物分離出來 三成份、第八成份、第十四成份及第十五成份各主 物，分別以質譜及核磁共振圖譜定義各化合物之分^表 其結構後，其結果如同下表所示： 刀 量及 23 1324996

經過分子結構整合歸納發現，對於人類肝癌、卵巢 癌、肺癌、惡性腦膠質細胞瘤及大腸直腸癌的腫瘤細胞株 具抑制效果之南柴胡分離物質皆為以τ -丁内酯為核心，且 在碳2(5)處呈Z構型或E構型之雜環化合物。而且，由細 24 17218D1 1324996 胞毒性測試結果可知，第三成份及第八成份對於肺癌細胞 株的毒殺效果優於其他成份，故將第三及第八成份結晶以 後’以氫核磁共振圖譜（W-NMR)及碳13核磁共振圖譜 (C-NMR )進一步分析此兩沖提成份之分子結構，而得 到分別如式（ΙΓ )及式（Ilf )所示，命名為“柴胡内酉旨” 及“異柴胡内酯”之新穎化合物：

OMe 式（ΙΠ，） (白色針狀結晶，熔點 137-13 8。(：，[a ]D25 -29.0。 (c0.5，CHC13); IR (KBr) u max cm·1: 1745, 1635, 1581，1335, 1153; UV (CHC13) λ max nm (log ε ): 247(4.08), 298(4.17), 327(4.08)) 再而，若進一步分析其他具腫瘤抑制功效之化合物結 構’例如前述第一成份、第二成份、第十一成份及第十五 成份之代表分子以及相關類似物或其衍生物，並與現行藥 物資料庫進行比對。從比對結果發現，南柴胡中具有腫瘤 毒殺效果之醫藥組成物，均為含有τ -丁内酯核心結構，且 25 17218D1 1324996 碳2(5)處呈Z構型或E構型之雜環化合物。該雜環化合物 之通式係如式（I )所示：

其中，X = N, 0, S, Se ; Α,Β係分別選自具有下式之取代基：

其中’ Ri，R2，R3，R4，R5係分別選自氫原子、鹵原子、 羥基、硫氫基、胺基、烷氧基及硝基；且該取代基之實例 係包含：

OMe —^ ^—OMe

MeO’ 26 17218D1 1324996 而且，由細胞毒性測試結果可知，第八成份異柴胡内 酯對於肺癌細胞株的毒殺效果明顯優於其他柴胡内酯類似 物丄故，本發明所包含之下列各實施例，均是以南柴胡丙 酮萃取物（BS-Α)及第八成份之異柴胡内酯（Bs_(8))為 代表物質，來驗證r -丁内酯化合物及其醫藥組成物之功 效。 ^_鱼]3 · 了 ·丁内酯化合醫藥組成物對於細胞增生 __( Cell Proliferation )之影響 將該南柴胡丙酮粗抽取物（BS_A)、南柴胡甲醇萃取 物（BS-M)及第八成份（Bs•⑻）分別加至人類肝癌細胞 株、卵巢癌細胞株、肺癌細胞株、惡性腦膠質細胞瘤以及 大腸直腸癌細胞株培養基中，觀察加藥7日間各腫瘤細胞 株間之抑制情形。本實施例以肺癌細胞株A549及大腸直 腸癌細胞株HT-29為例，當各萃取物投予三日後，加入6〇 鲁毫克南柴胡丙酮粗抽取物的腫瘤細胞數（Tum〇rCell Counts )降低程度與600毫克的南柴胡曱醇萃取物所降低 的腫瘤細胞數相似’顯示腫瘤抑制成份在bs_m層的含量 遠較BS-A層為低，南柴胡中具腫瘤抑制功效之物質仍然 主要保留於南柴胡丙酮粗抽取物中。 再而’若比較添加各南柴胡萃取物前後，人類肺癌細 胞株A549的細胞增生變化，其結果可以利用流式細胞儀 (Flow Cytometry )來進行偵測。如第2A圖至第2D圖所 不，杈軸代表與抗體接合之腫瘤細胞染色體對數，縱轴係 27 17218D1 1324996 代表FITC螢光強度，則從各圖結果可清楚得知未加藥前， 肺癌細胞株A549主要分佈在G0/G1期，但是，當腫瘤細 胞加入南柴胡丙酮粗抽取物（BS-A )以及南柴胡曱醇萃取 物（BS-M )以後，腫瘤細胞會明顯地停滯在G2/M期，尤 其更以南柴胡丙酮粗抽取物的功效最為顯著。另一方面， 從流式細胞儀的PI染色結果，亦發現加入南柴胡萃取物 後，G0/G1期的染色體數量減少，但G2/M期的染色體（2N， 4N等）數量卻大為提高，而且該現象在人類肝癌細胞株、 ®卵巢癌細胞株、肺癌細胞株及大腸直腸癌細胞株中均呈現 相似結果，顯示本發明之T - 丁内酯化合物及其醫藥組成物 的腫瘤抑制機轉極可能與G2/M停滯（G2/M Arrest )有關。 實例4 : r - 丁内酯化合物及其醫藥組成物與細I包凋亡 為證實本發明之r -丁内酯化合物及其醫藥組成物是 否具有誘導腫瘤細胞株產生細胞凋零之功效，本發明較佳 |實施例於是以流式細胞儀、反轉錄聚合晦鏈反應（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)及西方 點墨法（Western Blot ) —同檢視腫瘤細胞株分別加入南柴 胡丙酮粗抽取物及第八成分以後，腫瘤細胞在細胞週期以 及調控蛋白p21及p53上之變化。 以肺癌細胞株A549為例，將未加藥之A549細胞株、 加入20 /z Μ異柴胡内酯之A549細胞株以及加入60微克 /毫升南柴胡丙酮粗抽取物之Α549細胞株連續培養48小時 之後，利用流式細胞儀來偵測Annexin V-FL0US與ΡΙ之 28 17218D1 1324996 間的染色結果。其中，橫轴表示與Annexin v_fl〇us抗體 接合之腫瘤細胞螢光強度，而縱軸代表與ρι抗體接合之腫 瘤細胞螢光強度，結果由第3A至3C圖可知’控制纟且（指 未加藥的A549腫瘤細胞株）培養48小時後，與Annexin v 結合（顯示細胞膜外翻，細胞凋亡之指標）之細胞數量僅 佔3.8%，然而於A549肺癌細胞株中加入異柴胡内酯或南 柴胡丙酮粗抽取物後再培養4M、B寺，則發現腫瘤細胞與 Annexin v結合的腫瘤細胞量大幅增加至”,7%，顯示腫瘤 細胞在本發明之7_丁内酯化合物及其醫藥組成物的作用 下能夠誘發細胞凋亡產生。 繼而，從第4圖之細胞週期以及第5圖西方點墨法結 果可知，南柴胡丙酮粗抽取物及異柴胡内酯對於腫瘤細胞 的、、田胞週期作用機轉與紫杉醇類似，會在有絲分裂成熟階 奴（G2/M期）停滯住，而且，南柴胡丙酮粗抽取物（Bs_A ) 以及柴胡内酯相似物（如Bs_3或BS_8)會大幅提高腫瘤 春抑制蛋白P21及P53產量來阻礙cyclin D及Cyclin E，藉 此阻擋細胞進入G0/G1期而使腫瘤細胞停滯於G2/M期。 故，由上述結果可知，本發明之γ · 丁内酯化合物及其 醫藥組成物具有促使腫瘤細胞停滯在G2/M期，而且具有 誘务腫瘤細胞進入細胞凋亡之功效。同時，上述現象在人 類肝癌、肺癌、卵巢癌、惡性腦瘤以及大腸直腸癌細胞株 中均會發生，顯示本發明之τ _丁内酯化合物及其醫藥組成 物具有抑制人類肝癌、卵巢癌、肺癌、惡性腦瘤及大腸直 腸癌增生之功效，且其作用機轉可能與紫杉醇的作用機轉 29 17218D1 1324996 類似，為一種G2/M停滯劑。 若再以西方點墨法來檢測腫瘤細胞株加入本發明之 τ 丁内ga化合物及其醫藥組成物以後，在細胞骨架 (Cytoskeleton)上之變化。由第6圖所示，肺癌細胞株 A549加入南柴胡丙酮粗抽取物12小時、24小時及料小 =期間，細胞骨架中之第一型α_微小管無明顯變化，但在 第五型石-微小管卻逐漸減少，而且，比較加入南柴胡前 籲後，冷·微小管是否出現聚集狀態，由第7圖結果亦可得 知，加入南柴胡第八成份以後，溶解型（s〇luble f〇rm，指 未聚合狀態之；5 -微小管，圖中以s表示）的蛋白帶消失， 而顆粒型（particular f〇rm，指聚合以後之万·微小管，圖中 、表示）的蛋白▼增加，顯示該本發明之γ · 丁内g旨化人 物及其醫藥組成物與紫杉醇相❿，均具有致使万; 集的功能。.象 右藉由共軛交顯微鏡（C〇nfocai Microscope)進一牛 鲁檢視螢光標定微小管抗體接合到微小管上以後，細胞骨^ 内纺錘絲的移動情形。其結果第8圖所示，當腫瘤細胞: 入南柴胡以後，微小管產生聚集現象’導致紡錘絲持續 拉長，進而阻擋2倍數或多倍數染色體向細胞兩極移動、貝 使腫瘤細胞無法一分為二。如此，腫瘤細胞不僅無法有改 地執行有絲分裂，甚至隨著2N, 4N染色體不斷累積而導^ 無效細胞（Junk Cell)細胞凋亡。 172I8D1 30 1324996 杉醉抗藥性腫瘤細胞枝之敷響 由於現行藥物對於化療後期具紫杉醇抗藥性的腫瘤 細胞亚無令人滿意的毒殺效果，而且從上述流式細胞儀結 .果亦發現，南柴胡丙鲷粗抽取物和以異柴胡内醋為代表之 .柴胡内醋及其衍生物對於人類肝癌、印巢癌、惡性腦癌、 肺癌及大腸直腸癌的腫瘤抑制機轉與紫杉醇近似，因此， .本發明藉由南柴胡萃取物當作新藥筛選來源，進一步檢視 鲁南柴胡萃取物對於紫杉醇抗藥性細胞株的毒殺效果。 以下，本發明貫施例將以人類肺癌細胞株繼代 坧養所產生之紫杉醇抗藥性肺癌細胞株12為例， 來試驗南柴胡丙酮粗抽取物（BS_A)、南柴胡萃取物第八 成份及第十五成份（BS-8, BS_〗5 )(各代表異柴胡内酯及 柴胡内酯）對於A549-T12細胞株之影響，並透過流式細 胞儀、藥物毒性試驗以及組織切片來評估本發明之7 _丁内 酯化合物及其醫藥組成物對於紫杉醇抗藥性腫瘤細胞株之 毒殺效果。 如第9 Α至9D圖所示，比較控制組（未加藥之 A549-T12)以及加入100 nM紫杉醇、3〇微克/毫升bs_a、 8微克/宅升BS-8及8微克/毫升BS-15之A549-T12在流 式細胞儀下，Annexin V-FLOUS與PI之間的變化。其中， 橫軸表示與Annexin V-FLOUS抗體接合之腫瘤細胞螢光 強度而縱轴代表與PI抗體接合之腫瘤細胞營光強度，結 果顯不控制組（指未加藥的紫杉醇抗藥性腫瘤細胞株 A549-T12)培養48小時後，與Annexin V結合之細胞數 31 17218D1 1324996 量僅佔6.8%，然於A549-T12細胞株中分別加入異柴胡内 酷、柴胡内酯衍生物或南柴胡丙酮粗抽取物後再培養48 小時後，則發現腫瘤細胞與Annexin V結合的腫瘤細胞量 大幅增加30.6%、23,1%及24%，顯示異柴胡内酯促使腫瘤 細胞调亡的能力較其他r ·丁内醋化合物及其醫藥組成物 更佳’且南柴胡經過純化以後’促進腫瘤細胞產生細胞凋 亡的效果亦較粗抽取物更為顯著，顯示本發明之r _丁内酯 化合物及其醫藥組成物為毒殺腫瘤細胞之活性成分。 ❿再者’從細胞毒性測試結果可知，當添加南柴胡丙酮 粗抽取物（BS-A)、異柴胡内酯（BS_8)及柴胡内酯衍生 物（BS-15)至紫杉醇抗藥性肺癌細胞株48小時以後，如 第10A至1 〇c圖所示，腫瘤細胞存活率均明顯降低，且經 過純化取彳于的柴胡内g旨類似物毒殺腫瘤細胞的效果，.從細 胞或動物的有效半數致死量（或Ed5Q )上來看，皆..遠 小於丙酮粗抽取物。顯示柴胡内酯、異柴胡内酯及其衍生 修物等γ - 丁内酯化合物及其醫藥組成物，確係南柴胡裡抑制 腫瘤成份的主要活性物質，而且，該等r _丁内酯化合物只 而要極低的劑量（1.5微克/毫升）便能引起腫瘤細胞凋亡。 本發丁鬥_座一化合醫藥組成物在夺物 體内抑癌效果評仕

如以組織切片進一步檢視本發明之τ _ 丁内酯化合物 及其醫藥組成物對於生物體内Α549細胞株及紫杉醇抗藥 性腫瘤細胞（Α549-Τ12)之抑制情形。如第11Α圖 '第UB 17218D1 32 1324996 圖以及第12A圖和第12B圖所示，從放大1 〇〇倍的蘇木紫 與伊紅染色法（Haematoxylin and Eosin Stain，H&E Stain) 組織切片結果比較使用BS-A治療前後腫瘤組織的壞死情

-形’其結果發現’投予動物每公斤300毫克以上之bs-A - 以後，腫瘤細胞於細胞核部分發生裂解，淋巴球浸潤且產 生大片腫瘤細胞出血性壞死；從第12B圖更顯示經過bs_a '治療以後’原本密集分布的腫瘤細胞只剩下數顆腫瘤細 -胞。同時，從第13A圖皮下腫瘤組織（A549細胞株）比較圖 _亦顯示，經過每公斤500毫克劑量的南柴胡萃取物投予， 動物皮下的腫瘤體積明顯縮小77% (腫瘤直徑由13微米 縮小為3微米），且從相對腫瘤體積來看，如第丨3B圖所 不，以南柴胡萃取物治療腫瘤後，腫瘤增大的速度亦會明 顯趨緩。因此，從組織切片及皮下腫瘤組織可以得知，本 發明之7-丁内酯化合物及其醫藥組成物對於生物體内的 腫瘤組織具有顯著的毒殺效果，並能有效控制腫瘤體積的 0擴張速度。 .g i旨化合物及其醫藥組成物在細胞 鲞性及動_物毒性方兩之影攣 • 從本彳x明貫驗結果偵知，含有本發明之了 ·丁内酯化合 物及其邊藥組成物之南柴胡丙酮粗抽取物（⑼微克/毫升） 對於人通肝癌、卵巢癌、肺癌、惡性腦瘤以及大腸直腸癌 、’田月匕株^^著抑制功效，且在組織切片及皮下腫瘤試驗 中亦€實本發明之γ _丁内酯化合物及其醫藥組成物可有 33 17218D1 1324996 效毒殺生物體内的腫瘤組織。為進一步測量本發明之 丁内酯化合物及其醫藥組成物在執行腫瘤毒殺效果的同 時，對於其他正常細胞或器官是否具有傷害性，以下，本 發明即以清醒鼠為例來顯示投予每公斤4〇〇微克之南柴胡 丙酮粗抽物以後，鼠體各器官生化指標酵素的變化。 如第14圖及第15圖所示，於活體狀態下靜脈投予每 公斤400微克劑量之南柴胡丙酮粗抽取物至清醒鼠體内 小時以後，在胰臟功能指標酵素脂解騰、澱粉晦，肝臟功 ^能指標酵素葡萄糖氧化梅（G0T)、葡萄糖磷酸轉化晦 (GPT)’心臟功能指標酵素乳酸脫氫梅、肌酐酸激梅，腎 臟功能指標肌針酸（Creatinine)、血清尿素氮等各類生化 值’以及心#、舒張壓、收縮壓、灰小板以及白血球方面， 均無異於未㈣之控㈣，顯示南柴胡的投予並不會對生 物體内的消化系統、循環系統、代謝系統、造血機能及生 殖細胞造成毒害。而且’從第15圖的肝、腎組織切片亦能 丨佐證連續五日於大鼠腹腔内投予南柴胡丙酮粗抽出物每公 斤300微克以後，正常肝細胞及腎細胞並不會受到破壞。 另-方面，從前述結果可知本發明之卜丁内醋化合物及並 醫藥組成物對於活體動物的腫瘤細胞端粒酶的活性且明孽 抑制功效’因此，綜合上述結果可知，投料發明^〜 丁内酉旨化合物及其醫藥組成物至生物體並不會影響 胞功能或器官運作，然對包含紫杉醇抗藥性細胞株在内之 腫瘤細胞卻具有高度專—性的毒殺效果，故，以本發明之 r 丁内^化。物及其醫藥组成物作為治療藥物或輔助藥 17218D1 34 物，可以有效解決現行藥物 殺效果不彰的問題，而為化療後抗藥性腫瘤細胞毒 提供一種新的抗腫瘤藥劑_ 4杉醇逐漸失效的患者 結論 碳二二言，本發明係提供—種如下式⑴所示，且在 藥組成物J: z構型或E構型之7 - 丁内酯化合物及其醫 醋，：、‘‘此;、中之包含有首次公開命名為“異柴胡内 :一：月内酯’及其衍生物之新穎化合物及其醫藥組 腊直腸Γ作為人類肝癌、印巢癌、肺癌、惡性腦瘤及大 軔直腸癌之腫瘤抑制活性成份。

_ 其中，X = N，〇, Ss Se ; A，B係分別選自具有下式之取代基：

其中，Ri，R2, R3, r4, R5係分別選自氮原子、齒原子、 羧基、硫氫基、胺基、烷氧基及硝基。 而伙本發明之較佳實施例可知，投予式（I )所示之γ_ 丁内酯化合物及其醫藥組成物以後’不論在一般腫瘤細胞 17218D1 35 1324996 或紫杉醇抗藥性腫瘤細胞，其抑制腫瘤端粒晦活性、縮小 相對腫瘤體積、抑制腫瘤細胞增生以及促進腫瘤細胞祠零 句-有顯著功效，又能在不影響生物體正常消化 二能、統、代謝系統、造血系統以及生殖泌尿系統的 '狀心下，尚度專一性地毒殺腫瘤細胞。 其次，從細胞調控的觀點來看，本發明之r •丁内酯化 -^物及其醫藥組成物為一種促使細胞骨架之万-微小管聚 集二使拉長的紡錘絲無法向兩極牽引而導致細胞〉周亡之微 小管穩定劑，且其作用機轉與紫杉醇類似，可以促使腫瘤 2胞之有絲分裂停滞在G2/_，而達到控制腫瘤細 生之功效。 上述實施例僅為例示性說明本發明之原理及其功.. 效、1而非用於限制本發明。任何熟習此技藝之人士均可在 =違背本發明之精神及範訂，對上述實施例進行修飾與 ，交化。因此’本發明之權利保護範圍，應如 籲利範圍所列。 月寻 【圖式簡單說明】： » 1圖係顯示本發明分離南㈣製得南㈣丙嗣粗抽 取物（BS-A)、南柴胡甲醇萃取物（Βδ·Μ)以及南柴胡水 .層萃取物（BS-W)進行細胞毒性試驗（㈣―）後， •腫瘤細胞存活率與投藥劑量間之變化示意圖； 第2A圖至第2D圖係顯示本發明分離南柴胡製得南柴 胡丙酮粗抽取物（BS_A)、南柴胡甲醇萃取物（bs_m)以、 及南柴胡水層萃取物（BS_W)加至肺癌細胞株a549且以 17218D1 36 1324996 流式細胞儀檢測後’各種南柴胡萃取物對於腫瘤細胞株之 乡田胞週期波峰示意圖； 第3A圖至第3C圖係顯示人類肺癌細胞株A549在未 加藥、加入異柴胡内酯20 /ζ Μ及柴胡丙酮6〇微克/毫升連 續培養48小時後，經流式細胞儀測得之Annexin ν -FL〇US細胞凋亡象限圖（橫軸表示與Annexin V-FLOUS 抗體接合之腫瘤細胞螢光強度，而縱軸代表與^抗體接合 之腫瘤細胞螢光強度）； _ 第4圖係顯示人類肺癌細胞株A549在未加藥（控制 組）、加入南柴胡丙酮粗抽取物（BS_A)、南柴胡萃取物第 八成份（BS-8)以及紫杉醇的作用下，經流式細胞儀測得 之細胞週期變化分析圖； 第5圖係顯不人類肺癌細胞株A549在未加藥（匸）、 加入南柴胡丙酮萃取物（BS_A)、南柴胡甲醇萃取物 (BS-M)、南柴胡水層萃取物（bs_w)、南柴胡萃取物第 •成h (BS1)、南柴胡萃取物第三成份（b⑵一曰或三 日f K腫瘤抑制蛋白P21以及P53含量之西方點墨法 第6圖係顯示人類肺癌細胞株A549在未加藥（C)、 加入南柴胡丙酮粗拙跑榀 ^ 柚取物12小時、24小時及48小時以 後，測6式腫瘤細胞細胞晋加士 型^微小管之西太 弟一型心微小管以及第五 吕之西方點墨法示意® ; 第7圖係顯示人類姑 頦肺癌細胞株Α549在未加藥 (A 5 4 9 )、加入南绝士 月卒取物第八成份、紫杉醇以及Vinca 17218D1 37 1324996 植物驗之後，測試腫瘤細胞微小管在溶解型或顆粒型之 西方點墨法不意圖， 第8圖係顯示人類肺癌細胞株Α549在加入南柴胡丙 嗣粗抽取物之後，紡㈣呈現拉長狀態之共似顯微鏡榮 光標定切片圖， 第9 Α圖至第9 D圖係顯示人類肺癌紫杉醇抗藥性細胞 株A549-T12在未加藥、加入南柴胡丙酮粗抽取物 (BS-A)、南柴胡萃取物第八成份（BS_8)以及南柴胡萃 ’取物第十五成份（BS-15) 24小時之後，經流式細胞儀測 得之Annexin V - FL0US細胞洞亡象限圖（橫軸表示盥

Annexin V-FL〇US抗體接合之腫瘤細胞螢光強度，而縱轴 代表與PI抗體接合之腫瘤細胞榮光強度）； 第10A圖至第10C圖係顯示人類肺癌紫杉醇抗藥性細 胞株AT-12在加入南柴胡丙酮粗抽取物（Bs_a)、南柴胡 萃取物第人成份（BS_8)及南柴胡萃取物第十五成份、 ,(BS 15 ) 24小時以及48小時期間，腫瘤細胞之細胞毒性 試驗（MTT Assay)示意圖； 第11A圖係顯示裸鼠皮下植A549細胞株（控制組）， 放大⑽倍並經蘇木紫與伊紅染色法處理後之組織切月示 意圖； 第11B圖係顯示於裸鼠皮下植入A549細胞株，連續 五天二予腹腔内注射500亳克/公斤南柴胡丙酮粗抽取、 物’第七天之腫瘤經放大1〇〇倍以及蘇木紫與伊紅染色法 處理後’出現大片腫瘤組織出血性壞死之組織切片示意圖 17218D1 38 1324996 第12A圖係顯示裸鼠皮下植入A549-T12細胞株（控制 組）’放大100倍並經蘇木紫與伊紅染色法處理後之組織切 片示意圖； 第12B圖係顯示於裸鼠皮下植入A549_t12細胞株， 連續五天投予腹腔内注射400毫克/公斤南柴胡丙酮粗抽 取物，第七天之腫瘤經放大100倍以及蘇木紫與伊紅染色 法處理後，出玉見大片組織纖維化及只剩餘若干腫瘤細胞； 第13A圖係顯示裸鼠皮下植入A549細胞株形成腫 瘤，連續五天投予腹腔内注射4〇〇毫克/公斤之BS_A治 療，第七日後與未加藥之控制組相較，其皮下腫瘤直徑之 局部放大照片； 第13B圖係顯示活體狀態下，以每公斤體重5〇〇亳克 之南柴胡丙酮粗抽取物腹腔注射投予實驗動物，並比較未 加藥控制組與加藥治療組在相對腫瘤體積與治療天數間 變化示意圖； 弟14圖係顯 ^毛兄之向罙胡丙酉同 粗抽取物投予清醒鼠72小時期間，騰臟、肝臟、心臟 臟及造血組織各功能之生化指標酵素變化示音圖. 弟15圖係顯不以靜脈注射每公斤辦去丄 %哥a汀體重400亳克之南 柴胡丙酮粗抽取物投予清醒鼠72小日4地p日，， ▽ J間，血小板、白心 球、淋巴球之變化示意圖； 第16圖係顯示以靜脈注射每公斤體重4⑻毫克之 柴胡丙酮粗抽取物投予清醒鼠72小睥:^ „ 南 可J間，心搏、收縮 壓、舒張壓及平均壓之變化示意圖；以及 ^ 17218D1 39 1324996 第17圖係以連續五日腹腔内注射每公斤體重300毫 克之南柴胡丙酮粗抽取物投予清醒鼠之後，其肝臟細胞及 腎臟細胞之組織切片圖。 (本案無元件符號） 40 17218D1

Claims (1)

1. 十、申請專利範園： h 一種如下列式（I)所示之 |年(9%年$月冗斤 γ _ 丁内酯化合物：

   其中’式（I)中，χ = 〇;且 Α，Β係選自下式之取代基：

   OMe —/ \—OMe ，以及^ OMe 〇 2. 如申請專利範圍第1項之r —丁内酯化合物，其中，該 T -丁内酯化合物之碳2(5)處係呈Z構形之雜環化合物 者。 3. 如申請專利範圍第1項之r _丁内酯化合物，其中，該 r_丁内酯化合物之碳2(5)處係呈E構形之雜環化合°物 者。 4. 如申請專利範圍第1項之r_丁内酯化合物，其中，該 r -丁内酯化合物係如下式（Π)所示 '、 ^

   (II) 式（II)中，R代表烷氧基。 17218D1(修正版) 41 1324996 5.如申請4利範圍第1項之r -丁内酯化合物，其中，該 r-丁内酯化合物係如下式（in)所示

   OMe OMe (III) 式（III)中，R代表氫原子或烷氧基。 籲

   42 17218D1(修正版)