CN102641263A - 一种抑制癌细胞生长的医药组合物 - Google Patents

Abstract

一种抑制癌细胞生长的医药组合物，用于抑制雄性素依赖性及/或非依赖性的摄护腺癌细胞、肝癌细胞、口腔癌细胞及/或胃癌细胞的生长，其包含一有效量的活性成分，该活性成分选自以下群组：式(I)化合物、式(II)化合物、其医药可接受的盐及酯、及前述的任意组合，其中，R为H、烷氧基、或芳基。一种使用式(I)化合物及/或式(II)化合物及/或其医药可接受的盐及/或酯在制造药剂的应用。

Description

一种抑制癌细胞生长的医药组合物

技术领域

本发明关于一种抑制雄性素(androgen)依赖性及/或非依赖性的摄护腺癌细胞、肝癌细胞、口腔癌细胞及/或胃癌细胞生长的医药组合物及其应用。

背景技术

摄护腺(prostate)又称前列腺，是一实心的腺体且为男性特有的生殖器官，于腺体中有尿道和射精管穿过。摄护腺癌已成为全球男性最普遍的癌症之一，在台湾，随着人们饮食习惯改变，高脂肪性食物的摄取量增加，以及平均年龄增长，使得罹患摄护腺癌的危险因素增加，摄护腺癌的发生率与死亡率因而逐年上升，成为台湾男性十大癌症死因之一。但是，摄护腺癌的发生原因迄今未明，一般认为可能与遗传、荷尔蒙、饮食及环境因素有关。

摄护腺癌细胞起初为雄性素依赖性(androgen-dependent)，需要雄性素的刺激才能生长或分裂繁殖，若缺乏雄性素，则会呈现退化(regression)现象。由于降低摄护腺癌病患体内的雄性素，可使摄护腺癌细胞萎缩而死亡，故临床上最常使用雄性素压抑(androgen suppression或androgen ablation)的荷尔蒙疗法来进行治疗。举例言之，使病患服用黄体素促进激素(Luteinizing Hormone-Releasing Hormone agonist，LHRHagonist)的同类物或抗雄性素(anti-androgens)药剂，例如氟他胺(flutamide)或醋酸环妊酮(cyproterone acetate)等。然此疗法并无法有效根治摄护腺癌，原因是部分癌细胞于一段时间后会转变为雄性素非依赖性(androgen-independent)，其对雄性素压抑的治疗方式已不再有反应，而仍可持续地生长，使摄护腺癌患者的病情更加恶化。是故，目前对于雄性素非依赖性的摄护腺癌尚未有有效的治疗方式。

另一方面，化学疗法对于摄护腺癌的治疗效果亦相当有限，原因是化疗药物通常是针对快速生长的癌细胞进行毒杀作用，而摄护腺癌细胞是一种生长缓慢的癌细胞，故多数化疗药物对摄护腺癌细胞的抑制效果不佳。因此，一般几乎不会使用化学疗法来治疗摄护腺癌。

鉴于摄护腺癌的治疗成效有限，因此，于临床医学上，仍亟须一种可有效抑制摄护腺癌，尤其是雄性素非依赖性的摄护腺癌的方法或药物，以提升摄护腺癌的治愈率。

本发明即是针对上述需求所作的研究，本发明人研究发现，异柴胡内酯(isochaihulactone)化合物可拮抗摄护腺癌，其对于雄性素依赖性或雄性素非依赖性的摄护腺癌皆具有优异的抑制功效，故可经由不同于传统荷尔蒙疗法的化学疗法来治疗摄护腺癌。此外，该化合物亦可用于抗肝癌、口腔癌及胃癌。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种用于抑制雄性素依赖性及/或非依赖性的摄护腺癌细胞、肝癌细胞、口腔癌细胞及/或胃癌细胞生长的医药组合物，其包含一有效量的活性成分，该活性成分选自以下群组：式(I)化合物、式(II)化合物、其医药可接受的盐及酯、及前述的任意组合，

其中，R为H、烷氧基、或芳基。

本发明的另一目的在于提供一种使用式(I)化合物及/或式(II)化合物及/或其医药可接受的盐及/或酯在制造药剂的应用，该药剂用于抑制雄性素依赖性及/或非依赖性的摄护腺癌细胞、肝癌细胞、口腔癌细胞及/或胃癌细胞的生长。

本发明的详细技术及较佳实施方式，将描述于以下内容中，以供本发明所属领域具通常知识者据以明了本发明的特征。

附图说明

图1所示为顺式及反式异柴胡内酯抑制LNCaP摄护腺癌细胞的统计直条图；

图2所示为顺式异柴胡内酯抑制LNCaP摄护腺癌细胞及PC-3摄护腺癌细胞的统计直条图；

图3所示为顺式异柴胡内酯抑制LNCaP摄护腺癌细胞的雄性素受体及摄护腺特异抗原的表达的cDNA电泳图；

图4所示为顺式异柴胡内酯影响LNCaP摄护腺癌细胞的细胞周期的统计直条图；

图5所示为顺式异柴胡内酯促进LNCaP摄护腺癌细胞的硫胱胺酸蛋白酶-3活性的统计直条图；

图6所示为顺式及反式异柴胡内酯抑制小鼠体内LNCaP摄护腺肿瘤生长的曲线图；

图7所示为顺式异柴胡内酯抑制小鼠体内LNCaP摄护腺肿瘤生长的曲线图；以及

图8所示为小鼠体内LNCaP摄护腺肿瘤的组织切片的染色图。

具体实施方式

除非文中有另外说明，于本说明书中(尤其是在后述专利申请范围中)所使用之「一」、「该」及类似用语应理解为包含单数及复数形式。

如上述，摄护癌细胞的生长会由雄性素依赖性转变为雄性素非依赖性，使一般雄性素压抑的荷尔蒙疗法失去效果，而无法有效治疗摄护腺癌。此外，过去化学疗法对于摄护腺癌的抑制效果相当有限，故一般几乎不使用化疗方式治疗摄护腺癌。然而，本发明人发现，异柴胡内酯(isochaihulactone)化合物可有效抑制雄性素依赖性及非依赖性的摄护腺癌细胞生长，故可借此以不同于传统荷尔蒙疗法的化学疗法来治疗摄护腺癌。

因此，本发明提供一种用于抑制雄性素依赖性及/或非依赖性的摄护腺癌细胞生长的医药组合物，其包含一有效量的活性成分，该活性成分选自以下群组：式(I)化合物、式(II)化合物、其医药可接受的盐及酯、及前述的任意组合，

其中，R为H、烷氧基、或芳基。式(I)及式(II)化合物为异柴胡内酯化合物，化学名称为4-苯并[1，3]二氧杂环戊烯-5-基甲基-3-(3，4，5-三甲氧基-苯亚甲基)-二氢-喃-2-酮(4-benzo[1，3]dioxol-5-ylmethyl-3-(3，4，5-trimethoxyl-benzylidene)-dihydro-furan-2-one)；或称为β-(3′，4′-亚甲二氧苯)-α-(3′，4′，5′-三甲氧亚苄基)-γ-丁内酯(β-(3′，4′-Methylenedioxybenzyl)-α-(3′，4′，5′-trimethoxybenzylidene)-γ-butyrolactone)，其可自南柴胡(Bupleurumscorzonerifolium)中，以萃取纯化的方式制得，或以化学合成的方法制得，其制备方式可参见如Chang et al.，Immunosuppressive flavones and lignans from Bupleurum scorzonerifolium，Phytochemistry，Vol.64，Issue 8，2003，P.1375-1379。

式(I)化合物及式(II)化合物简称为K8，分子量为398.41千达尔顿(kDa)，其以γ-丁内酯结构为核心，且于2号及5号碳(碳2-(5))的位置上，分别具有顺式(cis-，Z)及反式(trans-，E)的构型，即，式(I)化合物为顺式异柴胡内酯(简称为Z-K8)，而式(II)化合物为反式异柴胡内酯(简称为E-K8)，属于同分异构物(几何异构物)。

于式(I)化合物及式(II)化合物中，R较佳为H、C₁至C₆烷氧基、或C₆至C₂₀芳基，更佳为甲氧基。由于式(I)及式(II)化合物皆有一手性中心(chiral center，以「*」标示)，故具有镜像异构物，这些镜像异构物亦涵盖在本发明医药组合物的活性成分的范畴内。

经发现，当用于抑制摄护腺癌细胞的生长上时，式(I)化合物的抑制活性高于式(II)化合物。因此，于本发明医药组合物中，该活性成分较佳选自以下群组：式(I)化合物、其医药可接受的盐及酯、及前述的任意组合。

已知雄性素依赖性的摄护腺癌细胞需要雄性素的刺激才能生长与分裂繁殖。特定言之，于雄性素依赖性的摄护腺癌细胞的表面上，具有一种雄性素受体(androgen receptor，AR)，当雄性素与该受体结合时，会引发摄护腺癌细胞的生理反应，促使其生长并进行分裂繁殖。因此，雄性素受体在雄性素依赖性的摄护腺癌细胞的致癌机制中，扮演关键的角色。经发现，本发明医药组合物可抑制摄护腺癌细胞的雄性素受体的表达，减少其于摄护腺癌细胞表面上的量，故可经由降低雄性素与雄性素受体结合的机会，来抑制摄护腺癌细胞的生长。

本发明的医药组合物除可通过抑制雄性素受体表达来抑制摄护腺癌细胞生长外，亦可借助促进摄护腺癌细胞的凋亡(apoptosis)而达成抗摄护腺癌的效果。细胞凋亡时，细胞中硫胱胺酸蛋白酶-3(caspase-3)需经活化以进行凋亡作用，故若提升硫胱胺酸蛋白酶-3的活性，则可促进癌细胞凋亡。如后附实施例所示，本发明医药组合物可活化硫胱胺酸蛋白酶-3，提升其活性，促进摄护腺癌细胞的凋亡。

摄护腺特异抗原(prostate specific antigen，PSA)是摄护腺癌的肿瘤标记，可用于摄护腺癌的诊断与临床分期，亦可用于追踪治疗效果。于本发明医药组合物的一使用实施例中，显示本发明医药组合物可抑制摄护腺特异抗原的表达，证实其具有治疗摄护腺癌的效果。

由于本发明医药组合物对于雄性素依赖性的摄护腺癌细胞的生长具有优异的抑制效果，故可用于治疗雄性素依赖性的摄护腺癌。此外，本发明医药组合物亦可抑制雄性素非依赖性的摄护腺癌细胞生长，故解决了现有荷尔蒙疗法中，无法有效针对雄性素非依赖性的摄护腺癌进行治疗的缺点，提供了更为有利的治疗方法。

另一方面，如后附实施例所示，除摄护腺癌细胞外，本发明医药组合物亦具有抑制肝癌细胞、口腔癌细胞及胃癌细胞生长的功效，故可用于治疗肝癌、口腔癌或胃癌。

本发明亦提供一种使用式(I)化合物及/或式(II)化合物及/或其医药可接受的盐及/或酯在制造药剂的应用，其中，式(I)及式(II)化合物中的R为H、烷氧基、或芳基，且该药剂用于抑制雄性素依赖性及/或非依赖性的摄护腺癌细胞、肝癌细胞、口腔癌细胞及/或胃癌细胞的生长。较佳地，R为H、C₁至C₆烷氧基、或C₆至C₂₀芳基，更佳为甲氧基。此外，于本发明中，较佳使用式(I)化合物及/或其医药可接受的盐及/或酯以制造药剂，供用于抑制雄性素依赖性的摄护腺癌细胞、肝癌细胞、口腔癌细胞及/或胃癌细胞的生长。另外，该药剂可用于抑制雄性素受体的表达、抑制摄护腺特异抗原的表达、促进摄护腺癌细胞的凋亡、及/或活化硫胱胺酸蛋白酶-3。基于该药剂的上述应用，其尤其可用于抗摄护腺癌。

可以任何合宜的方式施用本发明医药组合物，举例言之，但不以此为限，可以口服、皮下或静脉内等投药方式施用之。该医药组合物可使用于兽医与人类医药上，单独或与医药佐剂一起使用。

以制备适于口服投药的药剂形式为例，可于本发明医药组合物中含有不会对式(I)及/或式(II)化合物活性产生不利影响的佐剂，例如：溶剂、油性溶剂、稀释剂、安定剂、吸收延迟剂、崩散剂、乳化剂、黏合剂、润滑剂、吸湿剂等。举例言之，溶剂可选自水及蔗糖溶液，稀释剂可选自乳糖、淀粉及微晶纤维素，吸收延迟剂可选自几丁聚醣及葡萄胺基聚醣，润滑剂可选自碳酸镁，油性溶剂可选自植物或动物油类，如橄榄油、葵花油及鱼肝油等。可利用现有方法，将该组合物制成合宜的口服投药形式，例如：锭剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、流浸膏剂、溶液剂、糖浆剂、悬液剂、乳剂、及酊剂等等。

至于具适于皮下或静脉内投药的药剂形式，则可于本发明医药组合物中含有一或多种例如增溶剂、乳化剂、以及其他佐剂等成分，以制成如静脉输注液、乳剂静脉输注液、注射剂、干粉注射剂、悬液注射剂、或干粉悬液注射剂等。可能采用的溶剂例如：水、生理食盐溶液、醇类(例如：乙醇、丙醇、或甘油等)、糖溶液(例如：葡萄糖或甘露糖溶液)、或前述的组合。

本发明医药组合物可视需要另含有调味剂、调色剂、着色剂等添加剂，以提高所得药剂服用时的口适感及视觉感受；另可添加合理用量的保存剂、防腐剂、抗菌剂、抗真菌剂等，以改善所得药剂的储存性。

再者，可视需要于本发明医药组合物中并含一或多种其他活性成分，进一步加强本发明医药组合物的功效或增加制剂配方的运用灵活性与调配度。举例言之，可于本发明医药组合物含有一或多种如下活性成分：黄体素促进激素的同类物、抗雄性素药剂如氟他胺或醋酸环妊酮，以及其他活性成分等，只要该其他活性成分对式(I)及/或式(II)化合物的效益没有不利的影响即可。

可以一日一次、一日多次、或数日一次等不同投药频率施用本发明医药组合物，端视投予标的的需求而异。举例言之，当使用于人体以抗摄护腺癌时，药剂的用量，以式(I)及/或式(II)化合物计，为每天约10毫克/公斤体重至约40毫克/公斤体重，其中，该单位“毫克/公斤体重”是指每公斤体重所需的投药量。较佳地，该药剂的用量，以式(I)及/或式(II)化合物计，为每天约15毫克/公斤体重至约35毫克/公斤体重。但是，对于病情严重的病患(如摄护腺癌末期病患)而言，其用量可视实际需要而酌增至数倍或数十倍。

以下列具体实施方式以进一步例示说明本发明。其中该些实施方式仅提供作为说明，而非用以限制本发明的范畴。

[实施例1]摄护腺癌细胞抑制试验

利用MTT(3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl tetrazolium bromide)细胞存活分析法(参见Pavwels et al.，J.Virol.，Methods，1988，20，309-321)来测试顺式及反式异柴胡内酯的抗癌活性。

首先，于一96孔(well)的微量孔盘内(共3组)，每孔培养3×10³个LNCaP摄护腺癌细胞(雄性素依赖性，表面具雄性素受体)或PC-3摄护腺癌细胞(雄性素非依赖性)(购自美国典型微生物菌种保藏中心(ATCC，The American Type Culture Collection))，培养至隔天后，分别添加不同浓度(0、0.625、1.25、2.5、5、10或20微摩尔浓度，每个浓度8个孔)的顺式或反式异柴胡内酯至细胞培养液中，并再培养2天。

接着，吸取移除细胞培养液，并添加200微升的含500微克/毫升的MTT的细胞培养液继续培养2小时后，吸取移除细胞培养液，再添加100微升二甲基亚砜(DMSO)，然后以微量孔盘分光光度计测量细胞于570纳米的波长下的吸光值。利用吸光值的平均值计算顺式及反式异柴胡内酯抑制摄护腺癌细胞的活性，结果如图1、图2、表1及表2所示。

表1

表2

图1及表1显示，顺式及反式异柴胡内酯均具有抑制LNCaP摄护腺癌细胞生长的活性，其中又以顺式异柴胡内酯的抑制活性为佳【顺式异柴胡内酯：IC₅₀(抑制一半癌细胞生长的浓度)＝1微摩尔浓度；反式异柴胡内酯：IC₅₀＞10微摩尔浓度】。此外图2及表2显示，顺式异柴胡内酯可抑制雄性素依赖性的LNCaP摄护腺癌细胞生长，亦可抑制雄性素非依赖性的PC-3摄护腺癌细胞生长，说明顺式异柴胡内酯可同时抑制雄性素依赖性及非依赖性的摄护腺癌细胞的生长。此外，顺式异柴胡内酯对雄性素依赖性的LNCaP摄护腺癌细胞的抑制活性高于非雄性素依赖性的PC-3摄护腺癌细胞(LNCaP摄护腺癌细胞：IC₅₀＝1.25微摩尔浓度；PC-3摄护腺癌细胞：IC₅₀＝100微摩尔浓度)。

[实施例2]癌细胞抑制试验

重复实施例1的步骤，其中测试顺式及反式异柴胡内酯对胃癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞及口腔癌细胞的抑制活性，结果如表3所示。

表3

-：未测试

表3显示，除摄护腺癌细胞外，顺式及反式异柴胡内酯亦具有抑制胃癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞及口腔癌细胞的活性，且以顺式异柴胡内酯的抑制活性为佳，故该两种化合物可用于治疗胃癌、肝癌、肺癌及口腔癌。

[实施例3]雄性素受体及摄护腺特异抗原抑制试验

于本试验中，检验摄护腺癌细胞中之雄性素受体及摄护腺特异抗原的表达，以观察顺式及反式异柴胡内酯的抑制机制。以摄护腺癌细胞中的总RNA作为模板，并利用Oligo-dT进行逆转录反应。于此，利用Oligo-dT会与大多数真核细胞mRNA的3’端的poly A tail结合的特性，将mRNA逆转录成cDNA，并结合聚合酶链锁反应(PCR)反复地合成cDNA，其过程包括两股DNA的变性(denaturation)、引子的黏合(annealing of primer)、以及引子的延伸作用(primer extension)，借此以指数方式增加cDNA的数量，从而可达成微量RNA的分析。详细的实验步骤如下。

首先，以1×10⁶个/盘的密度，将LNCaP摄护腺癌细胞种植于一直径为10厘米的培养皿中，静置培养24小时，待细胞贴附后，分别添加不同浓度(0、0.5、1或2微摩尔浓度)的顺式异柴胡内酯，再培养24小时；或者，将1微摩尔浓度的顺式异柴胡内酯投至LNCaP摄护腺癌细胞，并以不同时间(0、6、12、24、或48小时)进行处理。本实验以木犀草素(luteolin)作为正对照组。

接着，收集细胞，并置于一微量离心管中离心(1500转/分钟，5分钟)，再以磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞表面后，再次离心(3000转/分钟，5分钟)。离心后，移除上清液，收集细胞并萃取总RNA。利用omniscriptreverse transcription kit(购自QIAGEN)，将2微克的RNA反转录为cDNA。最后，利用基因增幅反应(即，PCR)增幅雄性素受体及摄护腺特异抗原的cDNA。各组引子序列及基因增幅条件如下所示：

雄性素受体

引子序列

(F)：5’-ATG GTG AGC AGA GTG CCC TA-3’SEQ ID NO：1

(R)：5’-GTG GTG CTG GAA GCC TCT CCT-3’SEQ ID NO：2

条件

(1)94℃，5分钟(2)94℃，0.5分钟；58℃，0.5分钟；72℃，0.5分钟为1个循环，行24循环(3)72℃，5分钟。

摄护腺特异抗原

引子序列

(F)5’-GGT GAC CAA GTT CAT GCT GTG-3’SEQ ID NO：3

(R)5’-GTG TCC TTG ATC CAC TTC CG-3’SEQ ID NO：4

条件

(1)94℃，5分钟(2)94℃，0.5分钟；57.5℃，0.5分钟；72℃，0.5分钟为1循环，行24循环(3)72℃，5分钟。

使用1.2％琼脂糖胶进行PCR产物的电泳分析，并以溴化乙锭染色胶片，以及利用BioDoc-ItTM system(购自UVP公司)观察雄性素受体及摄护腺特异抗原的mRNA的表达。结果如图3所示。

图3显示，顺式异柴胡内酯可抑制LNCaP摄护腺癌细胞中雄性素受体及摄护腺特异抗原的表达，且随着时间或剂量的增加，抑制活性愈高，此结果说明，顺式异柴胡内酯可经由抑制雄性素受体的表达，达到抑制摄护腺癌细胞生长的效果。

[实施例4]细胞凋亡试验

碘化丙啶(Propidium iodide，PI)是一种荧光染剂，PI染色的基本原理为，以酒精将细胞膜打洞固定后，进入细胞内的PI可与核苷酸进行键结，当其以嵌合(intercalation)的方式与双股核苷酸链结合时，会产生红色荧光(640纳米)。由于凋亡细胞中内切酶的活化，导致DNA被断裂成小片段，配合柠檬酸-磷酸缓冲液(phosphate-citrate buffer)的浸润，使细胞内DNA渗透出细胞膜外，借此使细胞内DNA含量减少，其会在流式细胞仪DNA直方图的G0/G1peak前出现一个sub-G1波峰。利用上述原理可以反映出细胞内DNA的状态，或进行细胞周期的分析。详细实验步骤如下。

以1×10⁶个/盘的密度将LNCaP摄护腺癌细胞种植于一直径为10厘米的培养皿中，静置培养24小时，待细胞贴附后，添加不同浓度(0、0.25、0.5、1、2或4微摩尔浓度)的顺式异柴胡内酯，再培养24小时。接着，收集细胞，并置于一微量离心管中离心(1500转/分钟，5分钟)，再以磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞表面，并再次离心(3000转/分钟，5分钟)。之后，以1毫升冰冷磷酸盐缓冲液悬浮细胞，细胞浓度为2×10⁵个/毫升，再以快速混合法固定细胞，其将细胞悬浮液加入至一含有10毫升70体积％预冷酒精的离心管(15毫升)中，快速吸抽混合，再静置固定细胞至少2小时，或在低温-20℃下静置过夜。

固定细胞后，进行离心(300×g，5分钟)并移除酒精，再添加柠檬酸-磷酸溶液，并将细胞放入37℃的水浴槽中作用2小时。接着，进行离心(300×g，5分钟)，再将碘化丙啶(PI)溶液加入至细胞中，并与悬浮细胞充分混合。将细胞悬浮液吸取移至一褐色微量离心管中，以低温4℃避光作用30分钟。作用完毕后，于3小时内进行流式细胞仪分析，上机前轻轻混匀细胞悬浮液，并以57微米尼龙筛网过滤细胞，再利用流式细胞仪(Cell lab QuantaTM SC Flow cytometer)进行荧光平均强度测定。结果如图4及表4所示。

表4

图4及表4显示，顺式异柴胡内酯会增加LNCaP摄护腺癌细胞的细胞周期停留在G2/M时期的比例，且其随着剂量提高而增加，且sub-G1的结果亦说明顺式异柴胡内酯会促进LNCaP摄护腺癌细胞的细胞凋亡(apoptosis)。因此，顺式异柴胡内酯可经由促进LNCaP摄护腺癌细胞的细胞凋亡来达成抑制摄护腺癌的效果。

[实施例5]硫胱胺酸蛋白酶-3分析

细胞凋亡时，硫胱胺酸蛋白酶-3(caspase-3)会被活化以进行凋亡作用。本试验利用此原理，将顺式异柴胡内酯投予LNCaP摄护腺癌细胞，使其进行凋亡作用而活化硫胱胺酸蛋白酶-3，再添加硫胱胺酸蛋白酶-3的基质，其经活化的硫胱胺酸蛋白酶-3切割反应后会释出荧光物质，可借此评估硫胱胺酸蛋白酶-3活化情形，进而观察LNCaP摄护腺癌细胞的凋亡情形。详细实验步骤如下。

首先，将1×10⁶颗LNCaP摄护腺癌细胞株种植于一直径为10厘米的细胞培养皿中，静置培养24小时，待细胞贴附后，添加不同浓度的顺式异柴胡内酯(0、0.25、0.5、1、2或4微摩尔浓度)，再培养24小时。收集细胞，并置于一微量离心管中离心(1500转/分钟，5分钟)后，以冰冷磷酸盐缓冲液清洗细胞后，再次离心(3000转/分钟，5分钟)。接着，添加蛋白质萃取缓冲液(protein extraction buffer)，并置于冰上作用30分钟后，以高速离心(12000×g)于4℃下离心10分钟，收取上清液即为蛋白质萃取液。

将待测的蛋白质样本进行蛋白质定量，取10微升的蛋白质置入一96孔微量孔盘，做两次重复试验，每孔加入200微升的Bradford染剂(购自Bio-Rad公司)，再利用微量盘分析仪于595纳米的波长下测定蛋白质标准品的吸光值并取得平均值，以获得一趋势线方程式，再将蛋白质样本的吸光值代入趋势线方程式，则可求得蛋白质样本的实际浓度。之后，利用Promega G3540caspACETM assay kit(购自Promega公司)，并依照其说明步骤进行分析。将试剂与待测蛋白质样本配制于一96孔的黑色微量孔盘中，并静置于30℃的培养箱内，避光反应30分钟，接着，添加2微升的硫胱胺酸蛋白酶-3的基质Ac-DEVD-AMC(购自Promega公司)，静置于30℃的培养箱中，避光反应60分钟，最后，利用微量盘分析仪测量荧光值(激发波长：360纳米；发散波长：460纳米)，以测得硫胱胺酸蛋白酶-3的活性。结果如图5及表5所示。

表5

图5及表5显示顺式异柴胡内酯可增加LNCaP摄护腺癌细胞的硫胱胺酸蛋白酶-3的活性，且其效果随着剂量增加而增加，此说明异柴胡内酯可经由增加硫胱胺酸蛋白酶-3的活性而促进摄护腺癌细胞的凋亡，故其可用于抗摄护腺癌。

[实施例6]体内试验-小鼠实验

首先，取经无菌培养的1×10⁷个LNCaP摄护腺癌细胞，并将其注射至Balb/c免疫不全的裸小鼠(购自台湾动物中心)皮下，以进行体内肿瘤移植。于肿瘤生长至50至100立方毫米(长×宽×宽/2)后开始皮下(i.p.)给药治疗，其中，在肿瘤对侧超过1.5公分处给药，连续5天，每天1次。治疗组(实验组)投予15毫克/公斤体重或30毫克/公斤体重的顺式或反式异柴胡内酯，溶剂组(对照组)则投予二甲基亚砜及维他命K1。投药第5天后连续观察33天，每3天测量一次肿瘤大小及小鼠体重，其中，每只裸鼠测得的肿瘤大小减掉第1天的肿瘤大小所得的值为肿瘤成长大小值(tumor growth size)，以肿瘤成长大小值作为肿瘤生长抑制效果的指标，数值愈小，表示抑制效果愈好。结果如图6、图7、表6及表7所示。

表6

表7

图6、图7、表6及表7显示，顺式或反式异柴胡内酯可于小鼠体内有效抑制LNCaP摄护腺肿瘤的生长，且顺式异柴胡内酯的抑制活性高于反式异柴胡内酯，其中，将15毫克/公斤体重的顺式异柴胡内酯投予小鼠时，可达到60％的抑制效果。此结果说明，顺式或反式异柴胡内酯可用于活体内的摄护腺癌治疗。

[实施例7]免疫组织染色分析

于以上实施例6的小鼠实验中，经过33天的观察期后，牺牲小鼠，取出皮下肿瘤并以石蜡包埋以进行组织切片。接着，进行组织切片染色前，先将石蜡去除，以0.3体积％triton X-100/PBS增加细胞膜通透性，再将组织切片放入3重量/体积％过氧化氢溶液中达10分钟，以0.05体积％tritonX-100/PBS(清洗缓冲液)清洗切片三次，于室温下，以5重量/体积％无脂牛奶(non-fat Milk)进行阻断作用(blocking)两小时。之后，添加经适当稀释的一级抗体(anti-caspase-3)于室温下作用1小时，再以清洗缓冲液清洗组织切片3次，然后使用Super Sensitive^TM Polymer-HRP IHCDetection System 29(购自Biogenex)添加二级抗体，再以清洗缓冲液清洗3次，然后，添加三级抗体放大信号，再用清洗缓冲液清洗组织切片3次。最后，添加二胺基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)呈色剂，至呈红色阳性反应即可取出组织切片，并以灭菌水终止反应，若于添加呈色剂后10分钟未有颜色出现则为阴性反应。以苏木精(hematoxylin)进行细胞核染色，再以流动的水浸泡组织切片10分钟，风干后，以DPXMountant  (购自Fluka)封片。免疫组织染色的结果如图8所示。

图8显示，顺式异柴胡内酯可增加硫胱胺酸蛋白酶-3的活性，有效抑制摄护腺肿瘤的生长。

由以上实施例可知，不论是雄性素依赖性或非雄性素依赖性的摄护腺癌细胞，异柴胡内酯皆可于体内或体外抑制其生长，且可促使其进行细胞凋亡。因此，异柴胡内酯可用于治疗雄激素依赖性或非雄性素依赖性的摄护腺癌。

上述实施例仅用以例示说明本发明的原理及功效，而非用于限制本发明。任何熟于此项技艺之人士均可在不违背本发明的技术原理及精神的情况下，对上述实施例进行修改及变化。

Claims (16)

1.一种抑制癌细胞生长的医药组合物，用于抑制雄性素(androgen)依赖性的摄护腺癌细胞、雄性素非依赖性的摄护腺癌细胞、肝癌细胞、口腔癌细胞及/或胃癌细胞生长，其包含一有效量的活性成分，该活性成分选自以下群组：式(I)化合物、式(II)化合物、其医药可接受的盐及酯、及前述的任意组合，

其中，R为H、烷氧基、或芳基。

2.如权利要求1所述的医药组合物，其特征在于：R为H、C₁至C₆烷氧基、或C₆至C₂₀芳基。

3.如权利要求2所述的医药组合物，其特征在于：R为甲氧基。

4.如权利要求1至3中任一项所述的医药组合物，其特征在于：该活性成分选自以下群组：式(I)化合物、其医药可接受的盐及酯、及前述任意的组合。

5.如权利要求1至3中任一项所述的医药组合物，其特征在于：所述组合物用于抑制雄性素依赖性的摄护腺癌细胞的生长。

6.如权利要求1至3中任一项所述的医药组合物，其特征在于：所述组合物用于抑制雄性素受体的表达、抑制摄护腺特异抗原(prostatespecific antigen，PSA)的表达、促进摄护腺癌细胞的凋亡、及/或活化硫胱胺酸蛋白酶-3(caspase-3)。

7.如权利要求1至3中任一项所述的医药组合物，其特征在于：所述组合物用于抗摄护腺癌、抗肝癌、抗口腔癌及/或抗胃癌。

8.一种使用下式(I)化合物及/或式(II)化合物及/或其医药可接受的盐及/或酯在制造药剂的应用：

其中，R为H、烷氧基、或芳基，且该药剂用于抑制雄性素依赖性的摄护腺癌细胞、雄性素非依赖性的摄护腺癌细胞、肝癌细胞、口腔癌细胞及/或胃癌细胞的生长。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：R为H、C₁至C₆烷氧基、或C₆至C₂₀芳基。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：R为甲氧基。

11.如权利要求8至10中任一项所述的应用，其特征在于：使用式(I)化合物及/或其医药可接受的盐及/或酯以制造药剂。

12.如权利要求8至10中任一项所述的应用，其特征在于：该药剂用于抑制雄性素依赖性的摄护腺癌细胞的生长。

13.如权利要求8至10中任一项所述的应用，其特征在于：该药剂用于抑制雄性素受体的表达、抑制摄护腺特异抗原的表达、促进摄护腺癌细胞的凋亡、及/或活化硫胱胺酸蛋白酶-3。

14.如权利要求8至10中任一项所述的应用，其特征在于：该药剂用于抗摄护腺癌、抗肝癌、抗口腔癌及/或抗胃癌。

15.如权利要求14所述的应用，其特征在于：该药剂的用量，以式(I)化合物及/或式(II)化合物计，为每天约10毫克/公斤体重至约40毫克/公斤体重。

16.如权利要求15所述的应用，其特征在于：该药剂的用量，以式(I)化合物及/或式(II)化合物计，为每天约15毫克/公斤体重至约35毫克/公斤体重。

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