CN108367039A - 包含刺果瓜提取物作为有效成分的肝疾病的治疗或预防用组合物 - Google Patents

包含刺果瓜提取物作为有效成分的肝疾病的治疗或预防用组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于预防、改善或者治疗肝疾病的组合物以及预防或者治疗肝疾病的方法，其中，上述组合物包含刺果瓜(Sicyos angulatus)的提取物或者其分级物作为有效成分，上述方法包括将上述组合物给药到肝疾病疑似个体的步骤。

Description

包含刺果瓜提取物作为有效成分的肝疾病的治疗或预防用组 合物
技术领域
本发明涉及一种用于预防、改善或者治疗肝疾病的组合物以及预防或者治疗肝疾病的方法，其中，上述组合物包含刺果瓜(Sicyos angulatus)的提取物或者其分级物作为有效成分，上述方法包括将上述组合物给药到肝疾病疑似个体的步骤。
背景技术
肝是在营养素代谢中起到核心作用的器官，当肝功能异常时，会导致活体内营养素的代谢问题。轻度肝损伤的情况下，通过休息肝细胞即可得到恢复，但是，在繁忙的现代社会中，由于没有休息的余地，肝疾病可能会加重。肝疾病中包含有脂肪肝、肝炎、肝硬化症、肝癌等，一般而言，在肝发生炎症的肝炎占据肝疾病的大部分，肝炎根据病情分为急性肝炎和慢性肝炎，根据原因分为病毒性肝炎、酒精性肝炎、药物性肝炎等。当前，并行实施运动或者禁酒、饮食疗法等治疗方法和药物治疗来治疗肝疾病，但是，基本上难以完全治愈，因此持续需要开发有效且改善的肝疾病治疗剂或者肝保护剂。
作为肝脏保护剂兼肝疾病治疗剂所使用的药物可稳定肝细胞并在肝细胞内活化酶，以此成为肝的营养物质。典型的有水飞蓟素(silymarin)和联苯二甲酸二苯二甲酯(biphenyldimethyl dicarboxylate，BDD)(韩国授权专利第10-0090902号；韩国授权专利第10-0577514号)。众所周知，从菊科植物洋蓟花的果实中提取的水飞蓟素和从五味子种子中提取的BDD通过强烈的抗氧化效果抑制肝细胞内脂质氧化来保护肝。但是，这类肝疾病治疗剂具有局限性，对肝疾病其只能表现出暂时性效果，而无法基本改善，并且，存在发生急剧作用或者大量或长期给药时发生副作用等的缺陷。
发明内容
发明要解决的课题
本发明人等为发掘无副作用且对肝疾病有效的物质，进行悉心研究的结果，确认到刺果瓜提取物具有特定功能，由此完成了本发明，该特定功能是指，减少通过LPS引起的炎症反应，抑制肝细胞内ROS生成，对由刀豆蛋白A、四氯化碳或者急性乙醇给药引起的肝炎以及肝损伤动物模型均抑制肝炎以及肝损伤，对由高脂饮食或者乙醇给药引起的脂肪肝动物模型抑制脂肪肝的形成。
解决课题所用的方法
本发明的目的在于，提供一种包含刺果瓜(Sicyos angulatus)提取物或者其分级物作为有效成分的用于预防或者治疗肝疾病的药学组合物。
本发明的另一目的在于，提供一种包含刺果瓜(Sicyos angulatus)提取物或者其分级物作为有效成分的用于预防或者改善肝疾病的食品组合物。
本发明的另一目的在于，提供一种包含刺果瓜(Sicyos angulatus)提取物或者其分级物作为有效成分的用于预防或者改善肝疾病的饲料组合物。
本发明的另一目的在于，提供一种包含将上述组合物给药到肝疾病疑似个体的步骤的用于预防或者治疗肝疾病的方法。
本发明的另一目的在于，提供一种刺果瓜(Sicyos angulatus)提取物或者其分级物的用于预防或者治疗肝疾病的用途。
发明效果
本发明确认到刺果瓜提取物抑制由炎症反应导致的各种炎症性细胞因子以及炎症介质的生成、活性氧簇的增加、肝损伤指标GOT(谷氨酸草酰乙酸转氨酶：glutamyloxaloacetic transaminase)以及GPT(谷氨酸丙酮酸转氨酶：glutamyl pyruvatetransaminase)数值的增加，从而对肝疾病的治疗以及预防有效，以此确认到刺果瓜提取物或者其分级物作为用于预防以及治疗肝疾病的组合物具有优异效果。
附图说明
图1是，对由LSP(脂多糖：lipopolysaccharide)引起炎症反应的巨噬细胞系(Raw264.7细胞)处理刺果瓜提取物后表现炎症关联标志物的基因表达的图表。(*：p<0.05，**：p<0.01，***：p<0.001)
图2a是，根据是否进行刺果瓜提取物处理来以染色图像显现出ROS生成的程度。
图2b是，根据是否进行刺果瓜提取物处理来定量显现出ROS生成的程度的图表。(**：p<0.01，***：p<0.001)
图3a是，根据对由刀豆蛋白A(ConA)引起肝炎的小鼠模型是否给药刺果瓜提取物来显现出小鼠肝组织内的坏死面积。(*：p<0.05)
图3b是，根据对由刀豆蛋白A(ConA)引起肝炎的小鼠模型是否给药刺果瓜提取物来显现出肝损伤标志物GOT以及GPT水平的图表。(*：p<0.05)
图4是，根据对由四氯化碳引起肝损伤的小鼠模型是否给药刺果瓜提取物来显现出肝损伤标志物GOT以及GPT水平的图表。(*：p<0.05)
图5是，根据对通过急性乙醇给药引起肝损伤的小鼠模型是否给药刺果瓜提取物来显现出肝损伤标志物GOT以及GPT水平的图表。(*：p<0.05)
图6是，根据对通过高脂饮食或者乙醇给药引起脂肪肝的小鼠模型是否给药刺果瓜提取物来显现出脂肪肝的形成程度以及肝组织内的中性脂肪浓度的图表。(*：p<0.05)
具体实施方式
作为本发明的一个方式提供包含刺果瓜(Sicyos angulatus)提取物或者其分级物作为有效成分的用于预防或者治疗肝疾病的组合物。
本发明中刺果瓜提取物或者其分级物不仅能够减少活性氧簇(ROS)水平，而且还具有抑制肝炎症并保护细胞免受肝损伤的效果，以此确认到能够以预防或者治疗肝疾病的用途所使用。
本发明中，术语“刺果瓜(Sicyos angulatus)”是属于葫芦科的一两年生藤本植物，已知其有除草活性以及抗菌活性等，但是，从未公开过刺果瓜提取物具有肝疾病预防或者治疗效果，由本发明人等首次确定该事实。
本发明中，术语“提取物”是包含对刺果瓜实施提取处理而获得的提取液、上述提取液的稀释液或浓缩液、干燥上述提取液而获得的干燥物、上述提取液的粗提纯物或提纯物、或者它们的混合物等的提取液自身以及通过使用提取液可形成的所有形式的提取物。
本发明中，刺果瓜提取物是，通过执行洗涤刺果瓜并实施干燥后进行粉碎的步骤以及利用选自于由水、C1～C4醇及它们的混合溶剂所组成的组中的溶剂对上述粉碎的刺果瓜进行提取的步骤来获得的。具体地，上述刺果瓜提取物可以用甲醇、乙醇、丙醇或者丁醇进行提取，更具体地，可以用甲醇提取，但并不限定于此。
对提取方法并不特别限制，可以在有效成分未受到破坏或最小化的条件下，在室温或者通过加热进行提取。更具体地，本发明的用于获得刺果瓜提取物的方法如下。对于干燥刺果瓜，可以使用与该干燥刺果瓜的重量的约2至20倍的重量对应的体积且具体使用与约3至5倍的重量对应的体积的水和如甲醇、乙醇、丙醇以及丁醇等的C1～C4醇的极性溶剂或者具有它们的约1：0.1至1：10混合比的混合溶剂来作为洗脱溶剂，但并不限定于此。提取温度可以是1至100℃，具体地，可以是25℃，提取时间可以是约1小时至10天，具体地，可以是2至50小时，提取方法可以是振荡提取、热水提取、冷浸提取、回流冷却提取、超声波提取或者它们的合并方法，但并不限定于此。本发明的具体实施例中，1天内反复实施10次的用甲醇进行15分钟的超声处理后在常温下静止2小时的过程，提取后进行过滤及浓缩，并对此实施冷冻干燥，以此确保刺果瓜提取物。
上述刺果瓜提取物可以从天然、杂种、变种植物中提取，可以从植物组织培养物中提取。
本发明中的术语“分级物”是指，从包含各种构成成分的混合物中，为了分离特定成分或者特定成分组实施分级处理而获得的产物。
本发明中，对于获得上述分级物的分级方法并不特别限制，可以根据本领域通用的方法来实施。作为上述分级方法的非限定性的例子，对提取刺果瓜而获得的提取物实施规定溶剂的处理，由此能够从上述提取物中获得分级物。
本发明中，对于获得上述分级物所使用的级溶剂的种类并不特别限制，可以使用本领域公知的任意溶剂。作为上述分级溶剂的非限定性的例子，可举出水、醇等的极性溶剂；己烷(hexane)、乙酸乙酯(ethylacetate)、丙酮(acetone)、三氯甲烷(chloroform)等的非极性溶剂等。这些溶剂既可以单独使用，也可以混合两种以上使用。
本发明中，术语“预防”是指，通过本发明的刺果瓜提取物、其分级物或者上述组合物的给药抑制或者延迟肝疾病发作的所有措施。本发明中，术语“治疗”是指，通过本发明的刺果瓜提取物、其分级物或者上述组合物的给药上述疾患病情变得好转或病情往有利方向发展的所有措施。
本发明中，术语“肝疾病”是指，由肝执行的各种功能中的一种以上的功能出现问题而无法正常代谢。肝疾病中最常见的是肝炎，肝炎分为急性肝炎和慢性肝炎，一般而言，急性肝炎容易治疗而属于良性。急性肝炎根据原因的不同有病毒性肝炎、酒精性肝炎、中毒性肝炎等。本发明中，对于肝疾病并不限制，只要是利用刺果瓜提取物或者其分级物能够治疗即可，作为其例，可以是肝炎、肝中毒、胆汁淤积、脂肪肝、肝硬化、肝缺血、酒精性肝病、肝脓肿、肝性脑病、肝萎缩以及肝癌。本发明中通过使用刺果瓜提取物来确认了肝疾病的抑制以及治疗效果。
作为本发明的一个具体实施例，对源于小鼠的巨噬细胞系Raw264.7细胞处理刺果瓜提取物，并用LPS(脂多糖：lipopolysaccharide)引发炎症反应的结果，观察到炎症性细胞因子(TNFα、IL-6以及IL-1β)以及炎症介质(iNOS、COX2)的基因表达受到抑制(图1)。另外，对肝癌细胞系HepG2细胞处理刺果瓜提取物并处理t-BHP(tert-butylhydroperoxide：叔丁基过氧化氢)而引发氧化应激的结果，确认到活性氧簇的生成因刺果瓜提取物的处理而减少(图2)。进一步，对由刀豆蛋白A(ConA)、四氯化碳或者乙醇引起急性肝损伤以及肝炎的所有小鼠模型口服给药刺果瓜提取物的情况下，确认到肝损伤标志物GOT(谷氨酸草酰乙酸转氨酶：glutamyl oxaloacetic transaminase)以及GPT(glutamyl pyruvatetransaminase)的数值的增加受到抑制，且实际肝组织中的肝细胞坏死受到抑制(图3至图5)。
根据上述结果确认到本发明的包含刺果瓜提取物或者其分级物的组合物作为预防或者治疗肝疾病的用途具有优异效果。
本发明中，上述肝疾病可以是脂肪肝，具体地，上述脂肪肝可以是酒精性脂肪肝或者非酒精性脂肪肝。本发明中，术语“酒精性脂肪肝”是指，因过度的酒精引发的肝疾病，过多摄取酒精时在肝中促进脂肪合成而无法实施正常的能量代谢，以此引发疾病。本发明中，术语“非酒精性脂肪肝”是指，并非酒精的其他引发原因导致的在肝中蓄积脂肪的代谢症候群，具体地，可以是因过度的卡路里摄取导致的脂肪肝。本发明的刺果瓜提取物或者其分级物对于酒精性脂肪肝以及非酒精性脂肪肝具有预防以及治疗效果，因此，可以作为酒精性脂肪肝以及非酒精性脂肪肝的预防以及治疗用药学组合物使用。
作为本发明的一个具体实施例，对由高脂饮食或者乙醇引起的脂肪肝引发动物模型口服给药刺果瓜提取物之后，获取肝组织来观察脂肪肝的形成程度并分析中性脂肪的浓度的结果确认到：与对照组相比，给药刺果瓜提取物的实验组中脂肪肝的形成以及中性脂肪含量减少(图6)。
本发明的肝疾病预防或者治疗用组合物的药学上给药形式可以是它们的药学上可接受的盐的形式，另外，既可以单独使用，也可以与其他药学活性化合物联合使用或者以适当的组合来使用。
本发明的肝疾病预防或者治疗用组合物还可以包含药物学上可接受的载体。
本发明的肝疾病预防或者治疗用组合物是，可以使用本领域熟知的方法来制备药物剂型，以用于向哺乳动物给药之后迅速、持续或者延迟地放出活性成分。剂型制备中，优选地，将活性成分与载体一同混合或者稀释，或者，封入于容器形式的载体内。
另外，本发明的肝疾病预防或者治疗用组合物是，可以根据常用的方法以散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、悬浊剂、乳剂、糖浆、气溶胶等的口服型剂型、外用剂、栓剂以及灭菌注射溶液形式制剂化而使用，组合物的制备中还可以包含常用且适宜的载体、辅料以及稀释剂。
例如，本发明的组合物中可包含的载体有，乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、海藻酸钠、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟苯甲酯、羟苯丙酯、滑石、硬脂酸镁以及矿物油等，但并不限定于此。制剂化时，通过使用常用的填充剂、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂等的稀释剂或者辅料来配制。
用于口服给药的固体制剂包含片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等，这些固体制剂是，通过在上述化合物中混合至少一个以上的淀粉、碳酸钙(calcium carbonate)、蔗糖(sucrose)或者乳糖(lactose)、明胶等的辅料来配制。另外，除单纯的辅料以外还可以使用硬脂酸镁、滑石等的润滑剂。
作为用于口服的液体制剂有悬浮剂、内容液剂、乳剂、糖浆剂等，除惯用的单纯稀释剂水、液体石蜡以外，还可以包含各种辅料，例如，润湿剂、甜味剂、增香剂、保存剂等。
用于非口服给药的制剂包含灭菌的水溶液、非水溶剂、悬浮剂、乳剂、冷冻干燥制剂及栓剂。作为非水溶剂及悬浮剂，可以使用丙二醇(propylene glycol)、聚乙二醇、橄榄油等植物油、油酸乙酯等注射用酯等。作为栓剂的基质，可以使用witepsol、聚乙二醇、吐温(tween)61、可可脂、laurinum、甘油明胶等。
本发明的药学组合物可以以单独治疗剂进行给药或与其他治疗剂组合给药，可以与以往的治疗剂依次或者同时给药。并且，可以单次或者多次给药。重要的是，考虑上述所有要素的情况下，可以以不引发副作用的同时以最小量获得最大效果的量给药，其对于本领域技术人员而言容易实施。
本发明中所使用的术语“给药”是指，以任意适宜方法向患者引入本发明的药学组合物，关于本发明的组合物的给药途径，只要能够到达目标组织即可，可以通过口服或者非口服的各种途径进行给药。
对于本发明的药学组合物的给药方式并不特别限制，可以根据本领域的常用方式来给药。作为上述给药方式的非限定性的例子，可以将组合物以口服给药或者非口服给药方式给药。本发明的药学组合物可以根据目标给药方式制作成各种剂型。
对于本发明的组合物的给药频率并不特别限制，可以以1天1次的方式给药或者可以分剂量来多次给药。
根据本发明的包含刺果瓜提取物或者其分级物作为有效成分的组合物的常规的1天给药量是，可以以刺果瓜提取物或者其分级物给药量达到10至1，000mg/kg的方式给药，具体地，可以以给药达到量10至600mg/kg的方式给药，可以1次给药或者分多次给药。
作为本发明的另一方式提供包含将上述组合物给药到肝疾病疑似个体的步骤的用于预防或者治疗肝疾病的方法。作为一例，包含将上述组合物给药到除人以外的肝疾病疑似个体的步骤的用于预防或者治疗肝疾病的方法。
刺果瓜提取物以及肝疾病如上所述。
本发明中所使用的术语“个体”是指，肝疾病已发作或有可能发作的包含人的所有动物。上述动物既可以是人，还可以是需要治疗类似症状的牛、马、羊、猪、山羊、骆驼、羚羊、狗、猫等的哺乳动物，但并不限定于此。
作为本发明的用于预防或者治疗肝疾病的上述方法，具体地，可以包含向发作肝疾病或有发作危险的个体以药学上有效的量给药上述组合物的步骤。
作为本发明的又另一方式提供包含刺果瓜提取物或者其分级物作为有效成分的用于预防或者改善肝疾病的食品组合物。
本发明的食品组合物可以日常摄取，因此，可以期待高肝疾病的预防或者改善效果，从而非常有用。
本发明的术语“改善”是指，因本发明的组合物的给药肝疾病变得好转或者往有利方向发展的所有措施。
本发明的用于预防或者改善肝疾病的食品组合物包含丸剂、粉末、颗粒、浸剂、片剂、胶囊或者液体制剂等的形式，作为能够添加本发明的组合物的食品有饮料、口香糖、茶、维生素复合剂、保健食品类等各种食品类。
作为本发明的用于预防或者改善肝疾病的食品组合物中可包含的必要成分，除含有包括上述刺果瓜提取物的具有肝疾病预防以及治疗活性的组合物、该组合物的有效成分或者该组合物的生理学上可接受的盐以外，对于其他成分并不特别限制，作为附加成分可以含有常用的食品等的各种草药提取物、食品辅助添加剂或者天然碳水化合物等。
本发明的术语“生理学上可接受的盐”是指，生理学上可接受的常用物质，并且在向生物体给药时一般不会引起胃肠障碍、头晕等的过敏反应或者类似的反应，而且给药的化合物能够发挥目标效果。
另外，如上所述，还可以添加食品辅助添加剂，食品辅助添加剂包含香味剂、调味剂、着色剂、填充剂、稳定剂等的本领域惯用的食品辅助添加剂。
作为上述天然碳水化合物的例子有：如葡萄糖、果糖等的单糖；如麦芽糖、蔗糖等的二糖；如糊精、环糊精等的多糖等常规糖；以及木糖醇、山梨醇、赤藓糖醇等糖醇。除上之外，作为香味剂，可以有利使用天然香味剂(如甜叶菊甙A、甘草甜素等)以及合成香味剂(糖精、阿斯巴甜等)。
除上之外，本发明的用于预防或者改善肝疾病的食品组合物可以含有各种营养剂、维生素、矿物(电解质)、合成调味剂以及天然调味剂等的调味剂、着色剂以及增强剂(奶酪、巧克力等)、果胶酸及其盐、褐藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、乙醇、碳酸饮料中所使用的碳酸化剂等。此外，可以含有用于制备天然果汁、果汁饮料以及蔬菜饮料的果肉。这些成分可以单独使用或者组合使用。
本发明中，上述健康辅助食品包含健康功能食品以及健康食品等。
与特定保健用食品(food for special health use，FoSHU)相同术语的上述健康功能(性)食品(functional food)是指，以除供给营养外还可有效显现出活体调整功能的方式加工的医学或医疗效果高的食品。其中，“功能(性)”的含义是指，对于人体结构以及功能调整营养素或者可得到生理学作用等的对保健用途有利的效果。本发明的食品是，可以通过本领域惯用的方法来制备，制备时可以通过添加本领域常规添加的原料以及成分来制备。另外，对于上述食品的剂型，可以不受限制地制备，只要被公认为食品即可。本发明的食品用组合物可以制备成各种形式的剂型，与普通医药品不同地，将食品作为原料，因此具有不会产生长期服用医药品时可发生的副作用等的优点，并且，便携性突出，因此本发明的食品可以作为辅助剂来摄取，以提高预防或者改善肝疾病的效果。
作为本发明的又另一方式提供包含刺果瓜提取物或者其分级物作为有效成分的用于预防或者改善肝疾病的饲料组合物。
刺果瓜提取物以及肝疾病如上所述。
上述饲料用组合物可以包含饲料添加剂。本发明的饲料添加剂相当于饲料管理法中的辅助饲料。
本发明中，术语“饲料”可以指，用于动物饮食、摄取以及消化或者适于动物饮食、摄取以及消化的任意天然或者人工规定食、一顿食等，或者上述一顿食的成分。
对于上述饲料的种类并不特别限制，可以使用本领域常用的饲料。作为上述饲料的非限定性的例子，可举出：谷物类、根茎类、食品加工副产物类、藻类、纤维质类、医药副产物类、油脂类、淀粉类、葫芦类或者谷物副产物类等的植物性饲料；以及蛋白质类、无机物类、乳脂类、矿物性类、油脂类、单细胞蛋白质类、动物性浮游生物类或者食物等的动物性饲料。这些既可以单独使用，也可以混合两种以上使用。
作为本发明的又另一方式提供刺果瓜(Sicyos angulatus)提取物或者其分级物的用于预防或者治疗肝疾病的用途。
本发明确认到刺果瓜提取物抑制由炎症反应导致的各种炎症性细胞因子以及炎症介质的生成、活性氧簇的增加、肝损伤指标GOT(谷氨酸草酰乙酸转氨酶：glutamyloxaloacetic transaminase)以及GPT(谷氨酸丙酮酸转氨酶：glutamyl pyruvatetransaminase)的数值增加，从而对肝疾病的治疗以及预防有效，以此确认到刺果瓜提取物或者其分级物具有用于预防或者治疗肝疾病的用途。
发明的实施形式
下面，通过实施例等更加详细说明本发明。这些实施例仅用于例示本发明，不可理解为本发明的范围受到这些实施例的限制。
实施例1.刺果瓜提取物的制备
干燥刺果瓜并粉碎后，加入甲醇作为溶剂，并超声处理(sonication)15分钟后，常温下静止2小时，1天内反复10次上述过程，以此获得提取溶液。过滤并浓缩上述提取溶液，超低温冷冻箱(deep freezer)中冰冻试样后利用冷冻干燥仪进行干燥。为了肝细胞系以及巨噬细胞系实验，在DMSO中溶解如上提取的刺果瓜提取物而使用，动物实验中溶解于0.5％CMC(羧甲基纤维素：carboxy methylcellulose)溶液而使用。
实施例2.利用巨噬细胞系的刺果瓜提取物的抗炎效能实验
向巨噬细胞系Raw264.7细胞同时处理1μg/mlLPS(脂多糖：lipopolysaccharide)与100、200或者300μg/ml浓度的刺果瓜提取物，以此引发炎症反应。培养24小时后，从细胞中提取RNA，并分析与炎症反应相关的细胞因子(TNFα、IL-6、IL-1β)以及炎症反应介质(iNOS、COX2)的基因表达(图1)。
结果可观察到：通过刺果瓜提取物的处理，由LPS处理导致的炎症反应浓度依赖性地显著降低。从上述结果确认到，刺果瓜提取物对炎症反应具有抑制效果。
实施例3.刺果瓜提取物的活性氧抑制能力实验
向肝癌细胞系HepG2细胞处理100、200或者300μg/ml浓度的刺果瓜提取物，培养3小时后，处理300μM t-BHP(tert-butylhydroperoxide：叔丁基过氧化氢)来引发氧化应激。一小时后，为了测定细胞内发生的活性氧簇(reactive oxygen species；ROS)，替换成包含20μM DCF-DA(2′7′-二氯荧光素二乙酸盐：2′，7′-Dichlorofluorescein diacetate)的培养基，再培养60分钟，通过荧光显微镜分析生成的ROS。
结果可观察到：由t-BHP导致的肝细胞内ROS生成程度因刺果瓜提取物的处理降低了40％以上(图2a以及2b)。从上述结果确认到，刺果瓜提取物具有对氧化应激具有保护作用。
实施例4：由刀豆蛋白A(Concanavalin A)引起的非脂肪肝炎动物模型中的刺果瓜提取物的给药效果分析
为了在由刀豆蛋白A(ConA)引起的并不伴有脂肪肝的肝炎中确认刺果瓜提取物的给药效果，将8周龄的雄性C57BL/6小鼠作为对象，以300mg/kg浓度单次口服给药悬浮于0.5％CMC溶液的刺果瓜提取物。刺果瓜提取物给药30分钟后，将ConA溶于PBS中，并以15ml/kg浓度尾静脉注射，6小时后采取小鼠的血液以及肝组织。对于采取到的肝组织，为了对比观察ConA导致的急性肝炎相关肝细胞坏死程度，用10％中性福尔马林固定24小时以上并用乙醇脱水，再用石蜡进行包埋并制作块之后，用切片机制作4μm厚度的组织切片，并制作染色用盖玻片来实施苏木精以及曙红染色之后，用光学显微镜进行了观察。
计算肝组织内坏死部位面积的结果，实验对照组中观察到肝组织整体面上的广范围的急性肝炎性坏死，与此相反地，在给药刺果瓜提取物的组中观察到肝细胞坏死的部位显著减少(图3a)。
为了在由刀豆蛋白A引起的肝炎小鼠模型中确认刺果瓜提取物的肝炎抑制效果，对于血液内的肝损伤相关的代表性指标GOT(谷氨酸草酰乙酸转氨酶：glutamyloxaloacetic transaminase)以及GPT(谷氨酸丙酮酸转氨酶：glutamyl pyruvictransaminase)进行了分析。对此，使用经肝素(heparin)处理的毛细管(capillary tube)从各动物的眼眶静脉窦(retro-orbital sinus)采取血液之后，在10，000rpm下离心分离10分钟以获得上层部分的血浆。之后，使用自动血液分析仪(日立7150、日本：Hitachi 7150、Japan)直接分析上述血浆。
分析结果确认到：实验对照组中GOT以及GPT的血液内浓度显示为1930±105IU/L以及2822±172IU/L，与此相反地，刺果瓜提取物给药组中分别显示为1462±134IU/L以及2042±204IU/L，与实验对照组相比，显著抑制了GOT以及GPT浓度的增加(图3b)。
从上述结果确认到，刺果瓜提取物的给药不仅能够有效抑制刀豆蛋白A导致的肝炎，而且还具有肝保护作用。
实施例5：由四氯化碳引起的肝损伤动物模型中的刺果瓜提取物的给药效果分析
将8周龄的雄性C57BL/6小鼠作为对象，以1g/kg浓度单次口服给药悬浮于0.5％CMC的刺果瓜提取物。刺果瓜提取物给药30分钟后，以同等量(1：1v/v)混合四氯化碳和玉米油并以1ml/kg浓度腹腔注射，禁食24小时之后，采取小鼠的血液以及肝组织。实验期间，所有动物可以自由摄取水。动物室的饲养条件是：维持温度22±2℃、湿度55±10％、以及照明以12小时为周期调整明暗的SPF-barrier环境，以此实施实验。
分析结果，实验对照组中GOT以及GPT的血液内浓度显示为13335±1455IU/L以及19890±3174IU/L，与此相反地，刺果瓜提取物给药组中分别显示为9200±1164IU/L以及16168±2710IU/L，GOT和GPT数值均减少，与实验对照组相比，特别是GOT数值显著减少(图4)。从上述结果确认到，刺果瓜提取物的给药不仅能够有效抑制四氯化碳导致的肝细胞损伤，而且还具有肝保护作用。
实施例6：急性酒精性肝损伤引发动物模型中的刺果瓜提取物的给药效果分析
将8周龄的雄性C57BL/6小鼠作为对象，以600mg/kg浓度单次口服给药悬浮于0.5％CMC的刺果瓜提取物。刺果瓜提取物给药30分钟后，乙醇稀释成25.3％，以最终浓度达到6g/kg的方式口服给药，12小时后采取血液以及肝组织。
分析结果，实验对照组中GOT以及GPT的血液内浓度显示为153±10.5IU/L以及172±15.6IU/L，与此相反地，刺果瓜提取物给药组中分别显示为135±4.2IU/L以及123±10.8IU/L，GOT和GPT数值均减少(图5)。从上述结果确认到，刺果瓜提取物的给药不仅能够有效抑制急性乙醇给药导致的肝细胞损伤，而且还具有肝保护作用。
综合上述结果确认到，本发明中刺果瓜提取物减少由LPS引起的炎症反应、抑制肝细胞内ROS生成、对由刀豆蛋白A、四氯化碳或者急性乙醇给药引起的肝炎以及肝损伤动物模型均抑制肝炎以及肝损伤。其启示：本发明的刺果瓜提取物或者其分级物在肝疾病的预防、改善或者治疗中具有非常优异的效果。
实施例7：由高脂饮食或者乙醇引起的脂肪肝引发动物模型中的刺果瓜提取物的给药效果分析
将8周龄的雄性C57B/6小鼠作为对象，为了引起饮食性肥胖、高脂血症以及脂肪肝，提供8周的高脂肪饲料，与此同时，实验组中以300mg/kg浓度一天一次口服给药刺果瓜提取物。8周后终止实验，取得肝组织，实施脂肪染色并分析肝组织内中性脂肪的浓度。
具体地，制作从每个小鼠取得的肝组织的冷冻切片后，实施油红O(Oil red O；ORD)染色并观察脂肪肝的形成程度，使用中性脂肪测定试剂盒分析肝组织内中性脂肪的浓度。
另外，向同样周龄的雄性C57B/6小鼠给药乙醇2周以引起脂肪肝，与高脂饮食模型相同地分析脂肪肝。
分析结果确认到：脂肪肝的情况下，相比于对照组，给药刺果瓜提取物的实验组中染色成红色的脂肪肝显著减少。另外，还确认到：肝组织内中性脂肪含量的情况下，由高脂肪饮食以及乙醇引起的模型中中性脂肪含量均显著降低(图6)。
由此可得到如下启示：本发明的刺果瓜提取物或者分级物，不仅对于由刀豆蛋白A、四氯化碳或者急性乙醇给药引起的肝炎以及肝损伤，具有非常优异的预防、改善或者治疗效果，而且还对于由高脂饮食或者乙醇引起的脂肪肝，具有非常优异的预防、改善或者治疗效果。
实施例8：统计学分析
所有数值均显示成平均值±标准差(S.E.M)。显著水平设定为0.05以显示平均值之间的显著性，并且通过student t检验(Student's t-test)分析所使用的统计学方法以用于分析。
基于上述说明，本发明所属领域的技术人员将能够理解，在不改变本发明的技术思想或本质特征的情况下，本发明可以以其它具体形式实施。在这点上，上述叙述的实施例对于所有方面仅用于例示，而不应解释为限制本发明的范围。本发明的范围应解释为包括后面将要叙述的权利要求的含义和范围以及从其等同概念导出的所有修改及修改形式，而不是以上对本发明的详细描述。
工业实用性
本发明确认到刺果瓜提取物抑制炎症反应导致的各种炎症性细胞因子以及炎症介质的生成、活性氧簇的增加、肝损伤指标GOT(谷氨酸草酰乙酸转氨酶：glutamyloxaloacetic transaminase)以及GPT(谷氨酸丙酮酸转氨酶：glutamyl pyruvatetransaminase)的数值的增加而对肝疾病的治疗以及预防有效，以此确认到刺果瓜提取物或者其分级物作为用于预防以及治疗肝疾病的组合物具有优异效果，因此，本发明为具有工业实用性的发明。

Claims (12)

1.一种用于预防或者治疗肝疾病的药学组合物，其特征在于，
该药学组合物包含刺果瓜的提取物或者其分级物作为有效成分。
2.如权利要求1所述的药学组合物，
上述提取物是利用选自由水、C1～C4醇及它们的混合溶剂所组成的组中的溶剂进行提取的。
3.如权利要求2所述的药学组合物，其特征在于，
上述醇溶剂选自于由甲醇、乙醇、丙醇以及丁醇所组成的组中。
4.如权利要求1所述的药学组合物，其特征在于，
上述分级物是利用选自由水、醇、己烷、乙酸乙酯、丙酮、三氯甲烷及它们的混合溶剂所组成的组中的溶剂对刺果瓜的提取物实施分级而获得的。
5.如权利要求1所述的药学组合物，其特征在于，
上述肝疾病选自于由肝炎、肝中毒、胆汁淤积、脂肪肝、肝硬化、肝缺血、酒精性肝病、肝脓肿、肝性脑病、肝萎缩以及肝癌所组成的组中。
6.如权利要求1所述的药学组合物，其特征在于，
上述组合物抑制谷氨酸草酰乙酸转氨酶(GOT,glutamyl oxaloacetic transaminase)或者谷氨酸丙酮酸转氨酶(GPT,glutamyl pyruvic transaminase)在血中的浓度增加。
7.如权利要求1所述的药学组合物，其特征在于，
上述组合物抑制肝细胞的活性氧簇的增加或者肝细胞的坏死。
8.如权利要求1所述的药学组合物，其特征在于，
上述组合物抑制脂肪肝的形成。
9.如权利要求1所述的药学组合物，其特征在于，
上述组合物进一步包含药物学上可接受的载体。
10.一种肝疾病的预防或者改善用食品组合物，其特征在于，
该食品组合物包含刺果瓜的提取物或者其分级物作为有效成分。
11.一种用于预防或者改善肝疾病的饲料组合物，其特征在于，
该饲料组合物包含刺果瓜的提取物或者其分级物作为有效成分。
12.一种预防或者治疗肝疾病的方法，其特征在于，
包含将该权利要求1～9中任一项所述的组合物给药到肝疾病疑似个体的步骤。
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