CN100591336C - 菱角提取物及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供菱角提取物及其用于抑制、干扰和/或控制细胞组织的病理性血管新生或新血管形成的方法。通过把有效量的菱角提取物送入到细胞或组织中，本发明还提供了一种抑制组织中新血管形成的方法。还提供一种通过向受试者投入有效量的菱角提取物而治疗内皮细胞高增生和/或新血管形成相关的一种疾病之方法。

Description

菱角提取物及其使用方法

发明领域

本发明涉及菱角(Trapa natans)提取物及其应用，菱角(Trapa natans)提取物具有抗血管新生之性能，可用于防止和/或治疗癌细胞转移及与病理性血管新生和新血管形成相关的健康类疾病。因此本发明涉及到新血管及癌细胞转移病理形成的新奇干预治疗法。

发明背景

菱角是一种水生植物，属菱科(Trapaceae)，即水坚果族。菱角的果实是菱肉子，常称之为水蒺藜、欧洲水栗子、水栗子、公牛坚果和耶酥坚果。菱角有两个品种：双角菱即二角菱或野菱，和四角菱，即四角格菱。

血管新生是一个新血管生成的过程，即原先已有血管的派生物。在这一过程中，当蛋白水解酶进行降解作用时，内皮细胞逐渐与基底膜产生分离。然后，这些内皮细胞游离于母体血管之外，分裂并形成一种新的变异血管组织(Risau，(1997)《自然》386：671-674；Wilting等，(1995)《细胞分子生物学》，参考41(4)：219-232)。目前发现，多种不同的生物因子都对控制血管的形成产生作用(Bussolino等，(1997)“生物化学的发展趋势”，《科学》，22(7)：251-256；Folkman和D’Amore，(1996)细胞87：1153-1155)，这些生物因子包括具有不同功能的蛋白质，如生长因子、细胞表面受体、蛋白酶、蛋白酶抑制物和细胞外母体蛋白质(Achen和Stacker，(1998)Int.J.Exp.Pathol.79：255-265；Devalaraja和Richmond，(1999)药理学发展趋势；《科学》，20(4)：151-156；Hanahan，(1997)《科学》277：48-50；Maisonpierre等，(1997)《科学》277：55-60；Suri等，(1996)细胞87：1171-1180；Sato等，(1995)《自然》376：70-74；Mignatfi和Rifkin，(1996)酶蛋白49：117-137；Pintucci等，(1996)Semin Thromb Hemost 22(6)517-524；Vernon和Sage，(1995)《美国药理学期刊》147(4)：873-883；Brooks等，(1994)《科学》264：569-571；Koch等，(1995)《自然》376：517-519)。

血管新生参与了许多基本的生理活动，如发育、繁殖及伤口愈合等。在正常的条件下，血管新生都是在严格控制及高度调节的方式发生的，一般是在胚胎发育期间、成长期间以及一些特殊的情形下，如伤口愈合及女性生殖周期中(Wilting和Christ，(1996)《自然科学》83：153-164；Goodger和Rogers，(1995)《微循环》2：329-343；Augustin等，(1995)《美国药理学期刊》147(2)：339-351)。

然而，许多疾病或健康失调，如癌细胞转移、糖尿病视网膜病变、风湿性关节炎和其它诸如牛皮癣之类的感染疾病等，都是由长期没有规律的血管新生引起的(Folkman，(1995)《自然医学》1(1)：27-31；Polverini，(1995)《风湿病学》38(2)：103-112；Healy等，(1998)《人类生殖新知》4(5)：736-396)。例如，在风湿性关节炎中，新的毛细血管侵袭关节并破坏了软骨组织。在糖尿病视网膜病变中，视网膜中的新毛细血管入侵玻璃状体，造成出血并引起失明。因此，对病理性血管新生进行有效的治疗干预、控制和/或抑制可以减轻许多重要的疾病。

这一血管新生的过程为控制体内血管形成的干预性治疗提供了节点。在实验模式中，我们发现了控制血管形成的血管新生蛋白质抑制剂如血管阻断素(O’Reilly等，(1994)《细胞》79(2)：315-328)内皮抑素(O’Reilly等，(1997)《细胞》88(2))，不过，这类蛋白质疗法生产起来非常昂贵，且发现它们很难配制，很难注射到患者体内。目前，蛋白质血管新生抑制剂并没有发展成为治疗患者疾病的药物。因此，我们仍然需要一种可以安全地投入到患者体内并可以有效地抑制、干预、修改和/或控制血管内皮细胞病理性生长的治疗物质。我们本发明提供了适用于这一目的的组合物及方法。

发明内容

根据本发明，我们发现，菱角提取物可以抑制癌细胞转移、内皮细胞的生长及增生以及血管生成的过程。本发明提供了一种抑制、修改和/或控制内皮细胞病理性增生的方法，包括将有效量的菱角提取物送到内皮细胞中的方法。在本发明的范围内，我们提供的是一种抑制一个细胞组织内新血管形成的方法，包括将有效量的菱角提取物送到内皮细胞中的方法。

通过投入有效量的菱角提取物到一个患者体内，我们可以实践抑制、修改和/或控制内皮细胞病理性增生的方法及抑制细胞组织内新血管形成的方法。其中每种方法可以进一步地包括一种针对患者的抗血管生成、抗新血管生成或抗肿瘤疗法的应用，其中，菱角提取物可以增强抗血管生成、抗新血管生成或抗肿瘤疗法的治疗效果。抗血管生成、抗新血管生成或抗肿瘤疗法包括a)投入一种菱角提取物以外的抗血管生成剂或抗新血管生成剂(例如，鲨鱼软骨的硫酸胺沉淀物、鲨鱼软骨提取物、Shimeji DEAE alpha、ShimejiMono-Q alpha、3-氨基苯甲酰胺和顺铂-cisplatin)给患者；b)投入一种抗肿瘤化疗剂给患者；或c)为患者采用放射性疗法。

通过给患者投入有效量的菱角提取物，本发明还提供了治疗与内皮细胞病理性增生和/或新血管生成相关的疾病之方法。同时，这一方法还进一步地包括了为患者采用一种抗肿瘤、抗血管生成或抗新血管生成的疗法，这一疗法可以包括化学疗法、放射性疗法或投入一种菱角提取物以外的抗血管生成或抗新血管生成剂等方法。菱角提取物可以提高抗肿瘤、抗血管生成或抗新血管生成疗法的效果。

本发明还提供了一种防止及抑制癌细胞转移的方法，包括为癌症患者投入有效量的菱角提取物。

在本发明的范围内，我们还提供了包括有效量菱角提取物及在治疗中使用这种提取物的说明书的药盒。这些药盒对治疗那些患有与内皮细胞和/或新血管生成过度增生相关的疾病非常有用。

本发明进一步提供的是一种筛选识别新治疗药剂的方法以确认它们与菱角提取物具有相同的、类似的或更好的治疗效果。这种筛选方法包括把这一药剂对内皮细胞增生的效果与菱角提取物的抗增生效果进行比较。

附图说明

图1通过在内皮细胞测定试验中的菱角的水提物或透析菱角水溶性提取物，显示了内皮细胞增生基于浓度的抑制效果。在图1中，每一浓度下的三条条形图标从左到右分别表示菱角的水提物(初提物)、采用截止分子量为1000M.W的透析管进行透析后的菱角水提物(1K管内)和透析管外的液体(1K管外)。

本发明之详细描述

在本专利说明书及权利要求中，除非文中另行说明，否则所有单数形式如”a”、”an”和”the”等均包含复数含义。例如，“某个细胞”虽然为单数形式，但同样包含该细胞的复数含义以及单数和复数混合使用的含义。

本发明还提供了包含本发明菱角提取物的产品，本发明的方法在操作时可以使用这一产品而不是提取物。其中，当过渡词“包含”指的是一种方法、物质或本发明的组合物时，则该方法、该物质或该组合物既包括了详细列举的各个要素，但也并没有将其他未详细列举的要素排除在外。

本发明还提供了基本上由本发明的菱角提取物组成的一种产品，本发明的方法在操作时可以使用这一产品而不是提取物。这里的过渡短语“基本上由……组成”当用来定义本发明的一种组合物、物质或方法时，它表示既包含了详细列举的各个要素，也没有将实质上没有对本发明基本及新颖特性产生影响的那些未详细列举的要素排除在外。因此，一种基本上由菱角提取物或医学上可以接受的载体组成的专利申请组合物不应将来自提取物或本质上不影响该组合物之病理性血管形成抑制性能的物质如磷酸缓冲液、防腐剂和氯化钠的制备步骤中，如分离和提纯方法中产生的微量污染物排除在外。

术语“分离”在指称一种天然物质时，其含义指这一自然物质从组成物、细胞及其他与化合物天然结合的成分中单独分离。

“受试者”或“宿主”为脊椎动物，最好是哺乳动物或人类，人类患者最佳。哺乳动物包括(但不仅限于)鼠类、猿猴类、马、牛、猪、羊、畜类、竞技类动物、宠物及人类，如人类患者。

术语“肿瘤”及“赘生物”可交换使用，既可用作单数也可用作复数形式，它是指细胞的异常生长，通常产生一种细胞组织堆积块，既可能是良性的，也可能是恶性的。

术语“癌症”既可用作单数也可用作复数形式，它是指经历了恶性病变的一个细胞聚合体。在本发明中，一个癌症细胞的定义不仅包括原代癌细胞，而且指源自癌细胞原种的任何细胞。因此，术语“癌细胞”包括转移的癌细胞、体外培养及源自癌细胞的细胞株。

在本文中，“抑制”内皮细胞生长或一个细胞组织的血管形成指的是阻止、推迟或延缓内皮细胞的生长、增殖或细胞分裂、或细胞组织中血管的形成。监测抑制的方法包括(但不限于)内皮细胞增殖化验、通过测定血液含量测量血管床体积、以及定量测定血管结构的密度。当培养物质为细胞混合体时，监测新血管形成的过程需要通过定量测量能够体现内皮细胞特定指标的细胞加以完成，这些指标包括血管新生因子、蛋白水解酶、以及内皮细胞的特定细胞粘附分子等。

本发明还提供了一种“药剂组合物”，目的是为了包括至少还含有其它物质的菱角提取物的组合物质，如一种载体、稳定剂、防腐剂或另一种有效成分，如另一种治疗性药剂，从而使该组合物适合在体内、体外进行诊断性或治疗性用途。“另一种治疗性有效成分”的范例包括类固醇，如强的松、脱氢皮质(甾)醇、甲基强的松龙、氢化可的松、皮质酮和地塞米松，以及非甾族抗炎药物，如硫代苹果酸钠、硫代葡萄金、右旋青霉胺、氯喹、羟化氯喹、硫氮磺吡啶、咪唑硫嘌呤，和抗肿瘤制剂，如α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、2号白介素、阿地白介素、惠而血添(重组人粒细胞集落刺激因子)、沙格司亭(重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)、左咪唑、BCG疫苗、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、氟脱氧尿苷、阿糖胞苷、5-氮杂胞苷、巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、pentastatin、阿氟酸、克拉屈宾、二氟胞嘧啶、二氯甲基二乙胺、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、左旋溶肉瘤素、洛莫司汀、亚硝(基)脲氮芥、司莫司汀、链佐星、氮烯咪胺、白消安、三胺硫磷、六甲蜜胺、异环磷酰胺、顺铂、碳铂、甲基苄肼、放线菌素D、普卡霉素、博来霉素、亚德里亚霉素、道诺霉素、去甲柔红霉素、mitoxanthrone、丝裂霉素、长春新碱、长春碱、长春瑞宾、依托泊甙、替尼泊甙、太平洋紫杉醇、盐酸拓扑替康、天(门)冬酰胺酶、羟基脲、氯苯二氯乙烷、地塞米松、氨格鲁米特、雌二酮、乙烯雌酚、羟孕酮、甲孕酮、甲地孕酮、睾丸激素、氟羚甲基睾丸素、它莫西芬、亮丙瑞林和氟他胺片。

在本文中，术语“药物学上可接受载体”的含义包含磷酸缓冲溶液、水(最好是消毒水)、乳化剂及各种湿润剂等任何标准的药物学载体。药物学载体、稳定剂和防腐剂的实例请参阅马丁·雷明顿1975年《药物学标准》第15版(麦克米伦出版公司，伊斯顿市，1975年)。

“有效量”是指能够对有利或预期效果产生影响的充足数量。例如，治疗量指能够获得预期疗效的量。预防性有效量是指能够防止疾病发作或疾病症状的必要量。

通过把一定量的菱角提取物生长抑制剂送入到细胞之中，本发明提供了一种对内皮细胞的病理性生长进行抑制的方法。本发明还提供了一种通过把一定量抗血管形成的菱角提取物送到细胞组织内而对组织内的血管形成进行抑制的方法。这些方法既可以在体内操作，也可以在体外操作。当在体外操作时，内皮细胞或血管化组织在业内专业人士熟知的条件下进行培养，具体如下所述。这些细胞和/或组织既可以从现存的细胞株中进行培养，也可以从受试者即患者身上得到的活组织切片检查样本中进行培养。然后，这些细胞和/或组织被投入菱角提取物中，例如，可以把菱角提取物加入到细胞和/或组织的培养基中。

根据本发明，菱角提取物的制备方法如下：将菱角或其中部分如果实、叶子、茎干、分枝、躯干、皮或根(最好是筛选过的、压碎的或碾碎的)投入到一种有机溶剂中或最好是含水介质中，从而把得到的液体与至少一些、或全部、最好是全部菱角的固体部分分离开来，以获得一种液体形式的提取物，这一液体提取物还可以通过溶剂蒸发或冻干法在除去有机溶剂或水之后将之还原成一种固体形态，从而获得固体形态的提取物。有机溶剂最好是一种极性有机溶剂，如某种醇，如甲醇、乙醇、N-丙醇、异丙醇、N-丁醇、异丁醇和叔丁醇，最好是甲醇和乙醇。更理想的是在制备本发明菱角提取物时，菱角的果实或部分果实被用作原料，如此，果实(鲜活的或干燥的二角果实、四角果实或两种的混合)或果实的部分被放进含水介质或有机溶剂之中，然后采用离心过滤或过滤的方法将得到的液体物质与菱角果实的固体部分分离开来，以获得提取物。更理想的是，将菱角果实的皮壳与其果肉分离开，然后，在投放到水介质或有机溶剂之前，把皮壳或其中的任何部分进行筛选、粉碎或磨碎。同时，本发明的菱角提取物还可以通过将菱角或其中的任何部分如果实皮壳(最好是经过筛选、粉碎或磨碎)投入到有机溶剂或优选含水介质之中进行制备，从而把得到的液体与菱角的固体部分分离开来，形成一种液体物质，并把其中的某些分子量的化合物通过透析法、超滤法或层析法从液体物质中除去，以获得液体形式的提取物，所要除去的化合物分子量为约150到3500、优选约150到2000、更优选约150到1000、进一步优选约170到600、约170到400、约170到300、最优选约170到200。这一液体提取物还可以在除去有机溶剂或水之后将之还原成固体形态，从而获得固体形态的提取物。在本发明的范围内，我们的菱角提取物实施方案，不包含任何五倍子酸成份。

本发明还提供了一种抑制肿瘤细胞(最好是癌细胞)生长的方法，包括向肿瘤细胞投放一定有效量的菱角提取物，但在提取物中不包含a)一定分子量的化合物，所述分子量为约150到3500、优选约150到2000、更优选约150到1000、进一步优选约170到600、约170到400、约170到300、最优选约170到200；或b)不包含任何五倍子酸成份和/或五倍子酸衍生物，如烷基或羟基五倍子酸。

并不是每一种疗法对每一个体都有效，因此，采用试管化验的方法检测出每一个受试者(即患者)的施药功效是有益的。本发明提供了测定菱角提取物是否能治疗某一受试者(即患者)与内皮细胞病理性增生相关的特定疾病的一种方法。例如，从受试者体内分离出某一细胞活组织切片，然后与有效量的菱角提取物或含有该提取物的药物组合物进行接触。使用传统程序(如以下要描述的CPAE化验)测定内皮细胞病理性生长的抑制表明菱角提取物或含有该提取物的药物组合物是否能有效地治疗该受试者(即患者)的疾病。

通过向受试者(即患者)体内投入有效药量的菱角提取物或含有该提取物的药物组合物，本发明还提供了一种治疗与患者病理性新血管形成相关的失调症之方法。在本文的上下文中，进行“治疗”意味着减缓与病理性新血管形成相关的症状或减轻新血管形成。这类失调症包括(但不限于)关节炎症状、基于新血管形成的皮肤病症状、糖尿病视网膜病变、再狭症、卡波西氏肉瘤、老年黄斑病变、毛细血管扩张、青光眼、瘢痕瘤、角膜移植排斥、创伤性肉芽、血管纤维瘤、遗传性出血性毛细血管扩张症、心肌血管新生、牛皮癣、硬皮病及一些与病理性血管形成或新血管形成相关或造成的炎症，如痔疮等。典型的关节炎症状为风湿性关节炎和骨关节炎。

本发明还提供了一种预防或抑制(如阻止、减少、减缓或推迟)癌细胞转移的方法，包括将菱角提取物投入到某个癌症患者体内的方法；其中，该患者确实非常需要加以预防或抑制癌细胞。投入菱角提取物以治疗关节炎症状会减轻软骨(特别是关节)中的血管形成，从而增强这些区域的机动性和适应性。就治疗牛皮癣而言，投入菱角提取物会减少一些皮肤病的症状，如结疤、片状剥落和皮肤表体下的可见血管。就治疗糖尿病视网膜病变而言，投入菱角提取物会减少视网膜中新异血管的形成，从而使视觉不受阻碍。就治疗卡波西氏肉瘤而言，投入菱角提取物会抑制血管的生长或更进一步的形成，从而抑制住伤害的形成。

菱角提取物投送的方式可以是口入式、口腔式、鼻入式、直肠式、静脉注射式、腹膜腔引流式、肌肉注射式、或局部性方法，如经过皮肤或眼部、阴道或吸入式。当菱角提取物被投入到受试者(如人类，人类患者，或其它哺乳动物，如老鼠、家鼠、马、猪、羊和牛等)体内时，这些提取物可以与医学上可以接受的载体混合在一起，然后投入到患者体内。菱角提取物的药剂量可以根据熟悉这一技艺的人士之经验加以确定，并随接受治疗的症状、关联的病理、瞄准的细胞类型以及接受治疗的患者而加以变化。菱角提取物的药剂量可以在每天0.1毫克及每天1克之间变化，优选为每天1到500毫克、更优选10到100毫克。在整个治疗过程中，体内投入可以采取一个剂量、持续性或间歇性方式的进行。

药剂组合物可以采取片剂、锭剂、颗粒、胶囊、丸剂、针剂、栓剂或气雾剂的形式。它们还可以形成活性成分在含水或非水稀释剂中的悬浮液、溶液或乳液、形成糖浆、颗粒或粉末。

虽然菱角提取物可以采取单独投入的方式，但它还可以以药物制剂的形式出现，制剂的内容包含菱角提取物连同一种或多种医学上可以接受的载体及可选的其它治疗剂。每一载体必须是“可接受的”并与制剂中其它成分相容，且对受试者如人类患者无害。

药物制剂可方便地以单位剂量形式出现，也可以采用加入菱角提取物液态载体或细分的固态载体或两者的方法进行制备，然后，如果必要，将之制备成型。

本发明适宜口服的制剂可以采用散剂的方式，如胶囊、扁胶剂或片剂，每一种都含有预定量的菱角提取物；还可呈粉状或颗粒状；或呈一种水状或非水状液态中的溶液或悬浮液状；或水包油液体乳剂或油包水液体乳剂。菱角提取物也可以为大丸药、干药糖剂或酱状物。

片剂可以通过菱角提取物的压缩和成型进行制作，可根据需要添加一种或多种附属成分。压缩的片剂可以通过适当的机器压缩松散形式中的有机成分(如粉末或颗粒)而制备，如果需要，还可以与粘合剂(如聚乙烯吡咯酮、凝胶、羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(如羟基乙酸淀粉钠、交联聚乙烯吡咯酮、交联羧甲基纤维素钠)和表面活性剂或分散剂。模制片剂可以采用适当的机器将粉末状的化合物混合物用惰性液体稀释剂湿化后经模制加工而成。如果需要，片剂还可以包衣或刻痕，可以配制成使那些有效成分缓慢而加以控制地释放的形式，例如采用不同比例的羟丙基甲基纤维素，就可以达到所期望的释放形式。根据需要，片剂还可以提供肠溶包衣，使其在部分肠内释放而不是在胃部释放。

适用于口腔局部投药的制剂包括将有效成分风味化的锭剂，风味剂通常为蔗糖和阿拉伯树胶或黄蓍胶；包括惰性基质的菱角提取物的芳香熏剂，所述惰性基质如凝胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯树胶；包括菱角提取物在适当的液态载体中的漱剂。

根据本发明，适用于局部投药的药剂组合物可以配制成一种药膏、乳霜、悬浮液、洗剂、粉末、溶液、软膏、凝胶、喷剂、气雾剂或油状物。此外，一种制剂可能包含一种贴片剂或敷料，如浸含菱角提取物的绷带或粘合膏药，同时根据需要还可以含有一种或多种赋形剂或稀释剂。

有些药物制剂实施方案可以体现为一种局部性含有菱角提取物的药膏或乳霜。当配制成一种药膏时，提取物既可以与石蜡也可以与水混溶式药膏基质一起使用。此外，药物成分可与水包油乳霜基质配制成一种乳霜。

如果需要，乳霜基质的水相可包括，例如，至少约30％w/w的多元醇，即具有两个或多个羟基的醇，如丙二醇、丁烷-1、3-二醇、甘露醇、山梨糖醇、丙三醇和聚乙二醇及以上之混合物。局部制剂可根据需要包括可促进菱角提取物经由皮肤或其它感染区域吸收或穿透之化合物。这类真皮穿透增强剂的实际范例包括二甲亚砜和及相关的类似物。

本发明乳状液之油相可用现有技术的成分以任何现有技术的方式构成。虽然此油相可能仅仅包含一种乳化剂(即为熟知的利泄剂)，但它还可以根据需要包括至少一种乳化剂与脂肪或油或脂肪与油之混合物。较理想的是，亲水的乳化剂还与用作稳定剂的亲脂乳化剂一起包括在内。既把油又把脂肪包括在内也非常理想。总之，含有或不含有稳定剂的乳化剂组成了所谓的乳化蜡，蜡与油一起和/或脂肪组成了所谓的乳化药膏，从而形成了乳霜制剂的油性分散内相。

适用于本发明制剂的利泄剂和乳化稳定剂包括Tween 60、Span 80、十六醇和十八醇混合物、肉豆寇醇、单硬脂酸甘油酯和十二烷基硫酸钠。

由于活性化合物在大多数用于医药学乳剂制剂的油中其溶解度都非常低，所以可根据所需求的化妆品特性选择适当的油类或脂肪进行配制。因此，乳霜最好应是非油脂的、非染色的以及可清洗的产物，具有适当的坚硬度以避免从试管或其它容器中漏出。可以使用直链的或支链、单或二烷基的烷基酯类，如二异己二酸酯、硬脂酸异十六烷基酯、椰子脂肪酸丙二醇二酯、异丙基肉豆蔻酸酯、油酸癸酯、异丙基棕榈酸酯、硬脂酸丁酯、2-乙基己基棕榈酸酯或名为Crodamol CAP的支链酯类掺合物，后三者为较理想的酯类。这些可以单独使用，也可以根据所要求的特性结合使用。此外，可使用高熔点的脂质，如白色软石蜡和/或液体石蜡或其它矿物油。

适用于眼睛局部投药的制剂还包括眼药水，其中之有效成分可溶解于或悬浮于适当的载体内，特别是一种这种有效成分的含水溶剂。直肠投药的制剂表现为具有适当基质的栓剂，包括，例如可可油和水杨酸盐。

适用于阴道投药的制剂可以是阴道栓剂、止血塞、乳霜、凝胶、软膏、泡沫胶或喷雾剂等，这些制剂都含有菱角提取物及一种或多种适宜的载体。

适用于鼻腔投药的制剂(其载体为一种固态物质)包括颗粒大小的粗粉末，其大小从20微米到500微米左右，投药的方式为鼻吸入式，即通过鼻腔从靠近鼻孔的容器内快速吸入粉末。而适用于投药的液体载体制剂表现为鼻喷液、鼻腔滴液或采用喷雾器进行气雾剂投药，这些制剂包括菱角提取物之含水溶液或油溶液。

适用于肠胃外投药的制剂包括含水或非水的等渗消毒注射溶液，它们可含有抗氧化剂、缓冲溶液、细菌抑制剂和使制剂与预期受体的血液等张的溶质；它还包括含水或非水的消毒悬浮液，可含悬浮剂、增稠剂和脂质体或其它用来使菱角提取物导向血成分或者一个或多个器官的微颗粒系统。这些制剂可存在于单位剂量或多剂量密封容器之中，如安瓿和玻璃瓶，并可以存放于冷冻干燥(冻干的)条件下，在使用之前仅需加入消毒的液体载体，如注射用水。即用的注射溶液和悬浮液可以从先前描述的消毒粉末、颗粒和片剂中进行制备。

除了以上特别提到的成分外，本发明的制剂可包括其它业内常规的、与讨论中制剂类型相关的试剂，例如，那些适用于口腔投药的制剂可能进一步包括诸如甜味剂、增稠剂和风味剂等之类的试剂。

菱角提取物及包含一种或多种该提取物的组合物也可能作为兽医制剂的形式使用，可以采用业内常规的方法进行制备。

本发明进一步提供了一种医疗药剂的筛选方法，以抑制新血管形成或内皮细胞的增长。其筛选要求如下：

(a)将一种试验药剂与适当的细胞或组织样本接触；

(b)将适当细胞或组织样本的分离样本与有效治疗量的菱角提取物接触，然后，

(c)比较步骤a)样本中的内皮细胞增长和步骤b)样本中的内皮细胞增长，其中，步骤a)中用以抑制内皮细胞增长的任何试验药剂与步骤b)中的几乎一样，都可以用做抑制新血管形成或内皮细胞病理性增长的药剂。

实施例1

采用菱角提取物抑制内皮细胞增生

菱角提取物的制备

将二角和四角菱角果实的皮壳与其果肉分离开来。分离出来的皮壳在使用液体氮冷冻后，使用研钵和乳钵槌将之捣碎，它们被磨碎成大小为约2毫米的片。将一份20克捣碎的皮壳投入到二次蒸馏水中，蒸馏水的体积为皮壳的5倍到10倍，然后让其在80°或100℃的温度下驻留2到4个小时(根据需要，也可以低于80℃，如4℃或20°到25℃，但驻留的时间为4到12个小时)，加以搅拌，获得一种混合物。然后，采用Miracloth之双层膜对这种混合物进行过滤，除去固态的残留物质。其混浊的滤出液通过离心法在室温下以每分钟约1，500的转数加以澄清。上清液从沉淀物中轻轻倒出，获得一种清澈的棕色溶液，可被用做本发明中的菱角提取物。而在本实验中，这种清澈的棕色溶液被冻干，成为一种为储藏冻干的粗提取物，它也可以用做本发明试验的菱角提取物。然后，将这种冻干的粗提取物在10毫升的二次蒸馏水中进行溶解，并采用截止分子量为1000MW的透析管进行透析过夜，以每次250毫升二次蒸馏水换水三次。保留在透析管内的液体为菱角提取物的一种形式，然后按照以下描述的方法进行生物学化验。

内皮细胞化验

以上制备的菱角提取物之固体形式被用于内皮细胞化验之中(即CAPE)，可根据Connally等人的《模拟生物化学》(1986年)152：136-140及修改稿中介绍的程序进行(Liang和Wong(2000)，《血管新生：从分子到综合的药理学》，由Maragoudakis、Kluwer Academic/Plenum出版社编辑出版，纽约pp209-223)。在100ug/ml的浓度下，菱角提取物的固体形式抑制内皮细胞增生的成功率达到了86.75％。

实施例2

采用菱角提取物抑制癌细胞增生

实施例1中制备的菱角提取物固体形式被用于癌细胞增生化验，以检测提取物对三类癌细胞增生的效果(Lncap，前列腺癌细胞；SW 480，直肠癌细胞；和HTB 72，黑素瘤细胞)，其方法是将菱角提取物固体形式以100ug/ml之量在体外与癌细胞接触，然后测量出癌细胞的增生情况。为了比较之目的，将两种抗癌药物即cisplatin和太平洋紫杉醇针对三类癌细胞增生的药效也在体外进行了检测。生物检定的结果如表1中所示，其结果表明将菱角提取物加入到癌细胞培养基中可以有效地抑制癌细胞的增长。

^*每毫升细胞介质加100ug

^**1毫升细胞介质加50ul饱和溶液

实施例3

菱角不同浓度的冻干粗提物、菱角的透析提取物，即实施例1中获得的截止分子量为1000MW的透析管内的液体和透析管外的水被分别用于内皮细胞化验。其结果如图1所示，表明菱角的冻干粗提物、菱角的透析提取物依据浓度大小抑制内皮细胞的增长情况。相比之下，透析管外的水不能显著地抑制内皮细胞增生。这些数据证明，菱角的提取物是内皮细胞增长极端有效的抑制剂。既然菱角提取物的抗血管形成组合物被保留在透析管内，这些组合物就不是一种低分子重量的物质。

实施例4

实施例1中制备的菱角冻干粗提取物在二次蒸馏水中进行溶解，并采用截止分子量为3500MW的透析管进行透析过夜，以每次250毫升二次蒸馏水换水三次。这一液体即透析管内的透析提取物在内皮细胞化验中显示能够抑制内皮细胞之增生。这一实验表明，这些菱角提取物的抗血管形成成分的分子重量至少在约3500。

实施例5

作为测定菱角提取物药剂量的一个动物模型实施例，我们选择了几组裸鼠(Balb/c NCR nu/nu雌性，Simonsen，Gilroy加拿大)，每组都采用皮下注射的方式嫁接约10⁵到10⁹高增生状态的细胞，其定义如本文所述。当嫁接完成后，通过在嫁接的周围采用皮下注射的方式投入提取物。测定嫁接尺寸减少的大小可以采用维内尔测径器每周检查两次。

实施例6

这里，我们提供了测定本发明中提取物在治疗关节炎症时药效之动物模式范例。受试者为美国缅因州杰克逊实验室的MRL/lpr老鼠(MRL/MpJ-Fas^lpr)，对试验或监测采用本发明的菱角提取物治疗关节炎症的功效非常有用。老鼠在投入了提取物后，在X光线的监控下，动物的关节和后腿的肿胀明显减少，软骨退化也有所下降，这都充分表明了这一提取物对治疗关节炎症的积极效果。

实施例7

这里，我们还提供了采用动物模型测定本发明提取物在治疗关节炎症时的药效的另外一个例子。受试者为几组Lewis老鼠(年龄：8周；重30-150g，来自美国缅因州杰克逊实验室)，采用二类(BII)牛骨胶原进行免疫处理诱发关节炎症状。BII在400ug/ml的条件下在0.1M的乙酸中溶解。每只老鼠都在尾巴的底部皮内注射了20ug(100ul)的乳剂，其中BII和ICFA(不完全Freund之佐剂)的量相等。当确定患了关节炎症状时，将本发明的菱角提取物投入到老鼠体内，然后以四级评分法对多种诱导性鼠体疾病进行为期28天的观察，结果显示，这种提取物对治疗关节炎症有效。

Claims (29)

1、一种含有菱角提取物的产品，所述菱角提取物从菱角果实的皮壳制得，其特征在于：不包含分子重量为170到200的任何化合物。

2、权利要求1中的产品，其中，这种提取物是通过将菱角果实的皮壳投入到极性有机溶剂中制备的。

3、权利要求1中的产品，其中，这种提取物是通过将菱角果实的皮壳投入到含水介质之中制备的。

4、权利要求3中的产品，其中，含水介质是二次蒸馏水。

5、权利要求1中的产品，不包含任何五倍子酸。

6、权利要求1-5中任一项产品在制备抑制内皮细胞病理性生长的药物中的应用。

7、权利要求6中的应用，其中，所述内皮细胞在组织和器官内。

8、权利要求1的产品在筛选抑制新血管形成或内皮细胞生长的药剂中的应用，包括以下步骤：

a).将试验药剂与细胞或组织样本接触；

b).将分离的细胞或组织样本与药用有效剂量的权利要求1中产品接触；以及

c).比较步骤a)样本中的内皮细胞增长和步骤b)样本中的内皮细胞增长，其中，步骤a)中用以制备抑制内皮细胞增长的任何试验药剂与步骤b)中的几乎一样，都可以用做制备抑制新血管形成或内皮细胞病理性增长的药剂。

9、治疗患者病理性新血管形成相关疾病的药盒，包括有效药用剂量的权利要求1中产品以及治疗用途的说明书。

10、一种制备权利要求1中产品的方法，包括以下步骤：

a把菱角或其部分投入到溶剂中，形成液体部分和固态部分，然后：

b把液体部分与至少一些固态部分分离开来，以获得作为产品的液体物质；其中，把步骤b中的液体与固态残留物分离，然后倾析出得到的上清液作为产品；在步骤b倾析后，将分子量170到200的化合物从上清液中除去，得到液体产品。

11、权利要求10的方法，其中，步骤b后，溶剂被除去，从而获得固态产品。

12、权利要求10中的方法，其中，溶剂指极性有机溶剂或含水介质。

13、权利要求12中的方法，其中，溶剂是一种醇。

14、权利要求13中的方法，其中，溶剂是甲醇或乙醇。

15、权利要求12中的方法，其中，溶剂指含水介质。

16、权利要求15中的方法，其中，溶剂是一种含水缓冲液。

17、权利要求15中的方法，其中，溶剂是水。

18、权利要求17中的方法，其中，溶剂是二次蒸馏水。

19、权利要求10中的方法，其中，步骤a)是通过将菱角果实之皮壳投入到溶剂之中完成的，以形成液体部分及固态部分。

20、权利要求19中的方法，其中，皮壳在投入到溶剂之前被压碎、过筛或磨碎。

21、权利要求10中的方法，其中，步骤b是通过把液体部分与几乎所有的固态部分分离开来而完成的，以获得液体产品。

22、权利要求10中的方法，其中，步骤a是通过把菱角果实皮壳与果肉分离，将果实皮壳被压碎、磨碎或筛选成片状，再把这些片状物投入到二次蒸馏水中而完成的，形成一种包括液体和固态残留物的混合物；步骤b是通过把液体与固体残留物分离来完成的，以获得液体产品。

23、权利要求10中的方法，其中，采用透析法或离心法，，将分子量约170到200的化合物从上清液中除去。

24、权利要求23中的方法，其中，将水从倾析后的上清液中除去，得到固体产品。

25、一种抑制内皮细胞病理性生长的药用组合物，包括权利要求1中的产品和医学上可以接受的药物载体。

26、权利要求25中的药用组合物，进一步包括至少一种其它治疗活性剂。

27、权利要求26中的药用组合物，其中，至少一种其它治疗活性剂是至少一种类固醇、非类固醇抗炎药物、硫代苹果酸钠、金硫葡糖、D-青霉胺、氯喹、羟基氯喹、硫氮磺吡啶、咪唑硫嘌呤、或抗肿瘤药剂。

28、权利要求27中的药用化合物，其中，至少一种其它治疗剂选自下列至少一种药剂：α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、2号白介素、阿地白介素、重组人粒细胞集落刺激因子、重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、左咪唑、BCG疫苗、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、氟脱氧尿苷、阿糖胞苷、5-氮杂胞苷、巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、阿氟酸、克拉屈宾、二氟胞嘧啶、二氯甲基二乙胺、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、左旋溶肉瘤素、洛莫司汀、亚硝基脲氮芥、司莫司汀、链佐星、氮烯咪胺、白消安、三胺硫磷、六甲蜜胺、异环磷酰胺、顺铂、碳铂、甲基苄肼、放线菌素D、普卡霉素、博来霉素、亚德里亚霉素、道诺霉素、去甲柔红霉素、丝裂霉素、长春新碱、长春碱、长春瑞宾、依托泊甙、替尼泊甙、太平洋紫杉醇、盐酸拓扑替康、天门冬酰胺酶、羟基脲、氯苯二氯乙烷、地塞米松、氨格鲁米特、雌二酮、乙烯雌酚、羟孕酮、甲孕酮、甲地孕酮、睾丸激素、氟羚甲基睾丸素、它莫西芬、亮丙瑞林或氟他胺片。

29、菱角提取物在制备抑制肿瘤细胞生长的药物中的应用，该菱角提取物不包含a)分子量为170到200的化合物；b)不包含任何五倍子酸和/或烷基或羟基五倍子酸。

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