KR100508402B1

KR100508402B1 - 간염 억제활성을 갖는 한약재 추출물

Info

Publication number: KR100508402B1
Application number: KR10-2005-0034631A
Authority: KR
Inventors: 김철호; 정태욱; 라명찬; 이광수; 한기정; 오수진
Original assignee: 오수진; 김철호
Priority date: 2005-04-26
Filing date: 2005-04-26
Publication date: 2005-08-18
Also published as: KR20050046694A

Abstract

본 발명은 한약재 추출물에 관한 것으로 보다 상세히는 와송(바위솔; Orostachys japonicus), 지유(오이풀; Sanguisorba officinalis), 금은화(Lonicera japonica), 귀전우(화살나무; Winged spindle), 삼칠근(Notoginserg Radix), 백지(구릿대; Angelica dahurica), 마치현(쇠비름; Portulaca oleracea), 우피두견(만병초; Rhododendron brachycarpum), 지구목(헛개나무; Hovenia dulcis), 유근피(드릅나무; Ulmus Macrocarpa Hance)로 구성된 한약재를 열수추출한 항종양활성, 간염 억제활성, 노화방지 및 면역증강활성을 갖는 한약재 추출물에 관한 것이다.

Description

간염 억제활성을 갖는 한약재 추출물{An Extract having anti-Hepatitis activity}

본 발명은 한약재 추출물에 관한 것으로 보다 상세히는 와송(바위솔; Orostachys japonicus), 지유(오이풀; Sanguisorba officinalis), 금은화(Lonicera japonica), 귀전우(화살나무; Winged spindle), 삼칠근(Notoginserg Radix), 백지(구릿대; Angelica dahurica), 마치현(쇠비름; Portulaca oleracea), 우피두견(만병초; Rhododendron brachycarpum), 지구목(헛개나무; Hovenia dulcis), 유근피(드릅나무; Ulmus Macrocarpa Hance)로 구성된 한약재인 코리원(상표)을 열수추출한 항종양활성, 간염억제활성, 항산화성 및 면역증강활성을 갖는 한약재 추출물에 관한 것이다.

암의 전이(metastasis)는 초기종양에서 암세포가 신체의 다른 부위로 전파되는 과정으로 악성 종양의 가장 큰 특징이라 할 수 있다. 최근 암 연구보고에서 암전이로 인한 사망은 암 관련환자 사망의 약 90%를 차지하며, 바로 암의 전이가 암환자 사망의 중요한 원인임을 확인하였다. 암의 전이는 암세포와 암세포 주위와의 복잡한 상호작용으로 발생한다. 암세포 주위는 암세포가 정상적으로는 통과할 수 없는 지지구조체인 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)과 기저막(basement membrane)으로 되어 있다. 암세포는 이러한 세포외 장벽을 극복하기 위하여 ECM과 기저막을 분해할 수 있는 다양한 종류의 단백질 분해효소(proteinase)를 생산ㆍ분비하는데 그 중에서도 MMP(matrix metalloproteinase)가 중요한 역할을 담당한다. 정상적인 생리환경에서 MMP는 TIMP(tissue inhibitors of metalloproteinases)라는 내생 MMP 저해제에 의하여 엄격하게 조절된다. 그러나 암의 증식, 침윤 및 전이과정 중에는 MMP와 TIMP 간의 평형이 무너지고 과다한 MMP가 분비된다.

지금까지 보고된 바에 의하면 타입 IV 콜라게나제 또는 젤라티나제 (collagenase or gelatinaes)인 MMP-2와 MMP-9가 암의 전이와 밀접한 관련이 있다고 알여졌다. 암 전이에 가장 큰 장벽인 ECM과 기저막의 주된 성분은 타입 IV 콜라겐인데, MMP-2와 MMP-9는 촉매적 도메인(catalytic domain) 내에 젤라틴과 콜라겐에 대해 친화성이 있는 유사 피므로넥틴 도메인(fibronectin-like domain)을 포함하고 있으며, 타입 IV 콜라겐에 대하여 기질 특이성을 갖고 있다. 뿐만 아니라 인간 암세포주 배양과 실험 동물모델에서 MMP-2와 MMP-9가 암의 전이와 연관되었다고 입증되었음으로, 이를 분비하는 세포주를 이용하여 MMP 저해제를 탐색하는 전략이 효과적이다.

타입 IV 콜라게나제를 분비하는 세포주 탐색을 위해 HT1080, C32TG, HepG2 T98G, MIA-PaCa2, UAcc62, U937, G361 등 다양한 종양 세포주를 이용하여 무 혈청 배지에 TPA와 TGF- 1등의 첨가에 따른 타입 IV 콜라게나제의 유도정도를 확인한다. 젤라티나제의 효소 활성측량법으로는 방사능 동위원소가 표지된 젤라틴(3H-acetylated gelatin)이나 광합성 펩타이드(fluorogenic MMP-2/MMP-9 sustrate, DNP-Pro-Leu-Gly-Met-Trp-Ser-Arg-OH)를 이용하여 분해산물의 방사능량이나 형광량을 측량하는 방법과, 활성 단백질 전기영동법을 이용한 젤라틴 자이모그라피 (gelatin zymography)가 있다. 이들 중 젤라틴 자이모그라피가 비교적 간편하고, 적은 시료량으로 효소활성을 측량이 가능하다. 또한 대략적인 분자량을 알 수 있기 때문에 분비되는 MMP를 동정할 수 있음으로 편리하다.

따라서, MMP 저해제는 암의 침윤과 전이를 효과적으로 막을 수 있는 새로운 표적으로 기대되어 많은 암 연구자들이 새로운 개념의 항암 치료제로서 MMP 저해제 개발에 연구를 집중하고 있다. 현재 MMP에 대한 저분자의 선택적 저해제 탐색 및 합성 디자인의 연구가 활발히 진행되고 있으며, 화학적으로 합성된 저해제와 천연물로부터 분리된 저해제의 전임상 또는 임상실험의 결과는 MMP 저해제가 암의 치료에 있어서 새롭고 유망한 치료제가 될 수 있음을 보여주고 있다.

그러나, 기존의 펩타이드 구조의 부분적인 변형에 의한 합성 저해제는 제한된 생체이용성(bioavailabilty), 짧은 반감기(half-life), 효소 선택성의 결여 및 수용액에서 낮은 용해도 등의 적지 않은 문제점들이 있다. MMP의 중요한 생리적 활성에 비추어 볼 때 특정 MMP에 대해 선택성이 떨어지는 강력한 저해제의 지속적인 투여는 심각한 부작용을 야기할 것으로 예상할 수 있다. 식물이나 미생물 등의 천연물로부터 몇 종류의 MMP 저해제가 탐색되어 개발과정 중에 있지만 효소 저해활성의 빈약함과, 강한 세포독성 때문에 치료약으로 개발되기까지는 많은 문제점이 있다.

따라서, 기존의 MMP 저해제들의 이러한 문제점들을 극복하기 위한 방법으로 민간에서 임상효능이 입증된 한약재로부터 MMP 저해제를 탐색하여 치료약으로 개발하는 방법을 들수 있다. 한방에서 오랜 경험에 의하여 암 치료에 사용되어온 많은 약재들을 몇몇 암 연구가들이 항암제 개발에 사용하여 상당한 진전을 보였다. 지금까지 개발된 항암제 중에서 가장 우수한 것으로 평가받고 있으며 난소암에 특히 효능이 높은 탁솔(taxol)은 실제로 중국에서 많이 사용하고 있는 항암성 약재인 주목(Taxus류)으로부터 분리되며, DNA 토포이소머라제(topoisomerase)-I 저해제인 캄프토세신(camptothecin)류는 희수(Camptotheca acuminata)로부터 그리고, 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine) 등은 장춘화(Catharanthus roseus)에서 분리되어 사용하고 있다. 그러나, 이들은 암세포의 분화와 증식억제라는 측면에서 탐색, 개발되었기 때문에 강한 임상독성을 갖고 있어 치료 중 상당한 부작용을 낳아 장기적인 암치료를 요하는 경우에는 적용이 불가능하다.

지금까지 한방 생약재에서 암의 침윤, 전이, 암세포의 혈관신생 등을 방지하여 세포증식을 억제하는 세포독성 요법(cytostatic therapy) 개념의 치료제 개발을 위한 연구는 거의 없다. 이러한 맥락에서 앞으로 한약재로부터 생화학적 접근에 의한 MMP 저해제의 개발은 새로운 항암치료제 개발의 본보기가 될 수 있다.

일반적으로 대부분의 한방 생약재들은 건조된 상태로 보관 유통되고 있음으로 저장기간 중에 바이러스, 세균 곰팡이 등에 감염되었는지 유의하여야한다. 또한 다른 재료들이 유입되지 않았는지 유의하여야 하며, 특별히 고려해야할 점은 한약재료의 정확한 감정을 필요로 한다. 건조된 식물재료를 추출할 때는 적당한 크기로 자른 다음, 막자사발, 분쇄기 등을 이용하여 완전히 분말로 하여 유기용매와 열수추출을 한다. 건조된 재료는 먼저 메탄올이나 에탄올로 추출하는 것이 좋다. 알코올은 세포막을 파괴함으로 세포내의 성분을 추출할 수 있으나 에테르 또는 삼염화탄소와 같은 비극성 용매로는 세포내 성분을 용출시킬 수 없다.

최근, 대나무잎에서 추출한 다당류는 사르코마-180 (Sarcoma-180)이 이식된 생쥐의 복강암에 효과적인데 [Ikekawa, T.등 (1968) Gann 59: 155-157], 이러한 종양억제 약리활성은 간접적인 숙주를 매개로 한 면역증강효과에 기인하며, 특히 담자균류 세포벽에 존재하는 다당류의 활성이 중요한 것으로 알려져 있다 [Tanaka, T. 등 (1965) Gann, 56: 529-536; Hamuro, J. 등 (1978) Cancer Res., 38: 3080-3085; Maeda, Y. 및 Chihara, G., (1971) Nature, 229: 634-635; Komatsu, N. 등 (1969) Gann. 60: 137-144; Oh, G. T. 등 (1992) Arch. Pharm. Res., 15: 379-381].

한방약제의 다른 약리활성에는 면역증강, 항응고활성 및 소화기계활성이 알려져 있다 [Wagner, H. (1989) Planta Medica 55: 235-241; Wagner, H. (1990) Pure Appl. Chem. 62: 1217-1222.; Hodges, L.C. 등 (985) Carbohyd. Polym. 5: 141-154; Kiyohara, H. 등 (1996) Planta Medica 62: 14-19]. 또한, Sargassum f㎕vellum의 알긴산, Sargassum kjellmanianum의 황화 갈락토퓨칸 (s㎕fated galactofucan) 등은 숙주를 매개로 한 항종양활성을 가지고 있으며 [Yamada, H. 등 (1987) Agric. Biol. Chem. 51, 785-790; Shimizu, S. 등 (1988) Biochem. Biophys. Res. Comm. 150, 335-341], Porphyra yezoensis의 다당류는 시험관내 및 생체내 탐식세포의 활성화 활성을 가지며 [Shimizu, S. 등 (1989) J. Am. Oil. Chem. Soc., 66, 237-241], Gracilaria verrucosa 다당류는 생쥐의 탐식활성을 증대시킨다 [Shinmen, Y. 등, (1989) Appl. Microbiol. Biotechnol. 31, 11-16].

또한, 약리활성을 나타내는 식물계 황화다당류의 혈관내의 지방 제거활성과 항응고(anticoagulant) 활성은 이미 알려진 바 있으며 [Nakagawa, K. 등 (1972) Carbohyd. Res., 21: 420-426; Hatanaka, K. 등 (1987) J. Med. Chem. 30, 810-814], 다당류 중 덱스트란 설페이트(dextran sulfate), 펜토산 (pentosan), 폴리설페이트(polysulfate) [Erik De Clercq. (1989) J. Antimicrob. Chemother., 23 :35-46.22], 레티난 설페이트 (lentinan ulfate) [Hatanaka, K. 등 (1989) Jpn. J. Cancer Res. 80: 95-98.23], 리보퓨라난 설페이트 (ribofuranan sulfate) [Hatanaka, K. 등 (1991) J. Carbohy. Chem., 10: 681-690.24], 퓨칸 설페이트 (fucan sulfate) [Nishino, T. 등, (1991) Agric. Biol. Chem. 55: 791-796], 및 갈락탄 설페이트 (galactan sulfate) [Nagumo, T. 등 (1988) Kitasato Arch. of Exp. Med., 61: 59-67]는 인체 면역결핍 바이러스 (human immunodeficiency virus)에 의해 유발된 세포독성에 효과를 나타내며, 특히 리보퓨라난 설페이트 (ribofuranan sulfate)의 활성은 황화 (sulfation) 정도에 의존한다.

이러한 약리활성을 가지는 식물은 숙주방어활성(host-defense activity)과 탐식세포(macrophage)활성을 촉진하므로써 면역증강(immuno- potentiating)과 항종양활성(actitumoral activity)을 나타내는 것으로 평가된다. 또한, 면역계 활성화와 항종양에 대하여 임상적으로 효과가 인정되는 약물은 소수에 불과하므로 현재까지 항종양에 유효한 약물탐색이 많은 연구자에 의해 이루어지고 있다.

한편, 예정된 세포사(apoptosis)는 간염의 주요 원인으로 Fas-FasL결합에 의한 간세포(hepatocyte)파괴로 급성간염과 만성간염을 야기한다[Feldmann, G. (1997) J. Hepatol. 36: 1-11]. 즉, 예정된 세포사멸은 종양괴사인자 수용체계 단백질인 Fas(또는 CD95, APO-1)가 그의 리간드(ligand)인 FasL과 결합함으로써 전개되며[Nagata,S. 및 Golstein, P. (1995) Science 267: 1449-1456], 이로 인해 간염 또는 당뇨병이 생성된다[Chervonsky, A. V. 등 Cell 89: 17-24; Griffith, T. S. 등 (1995)Science 270: 1189-1192; Bellgrau, D. (1995) Nature 377: 630-632]. 따라서, Fas-FasL 매개에 의한 세포사 억제활성을 나타내는 물질은 간염치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 와송, 지유, 금은화, 귀전우, 삼칠근, 백지, 마치현, 우피두견, 지구목, 유근피로 구성된 한약재로부터 추출한 항종양, 간염억제, 항산화성 및 면역증강활성을 갖는 추출물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 한약재 추출물을 유효성분으로 하는 건강보조식품을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 천연생약인 코리원(상표) 한약재 추출물의 활성을 연구하여 오던 중, 추출물에 대한 B-임파구(lymphocyte) 자극활성과 탐식세포 자극활성과 같은 면역증강활성 및 항종양활성을 확인하였으며, 본 발명의 추출다당류가 간세포 세포사 (apoptosis)에 있어서 간세포 염증의 원인인 Fas-FasL의 결합을 저해하고 FasL의 발현을 억제하는 효과를 가지고 있음을 알아내어 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 와송, 지유, 금은화, 귀전우, 삼칠근, 백지, 마치현, 우피두견, 지구목, 유근피로 구성되는 한약재로부터 추출되는 항종양활성, 간염억제활성, 항산화성 및 면역증강활성을 갖는 한약재 추출물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 한약재를 각각 동량으로 사용하여 제조하는 한약재 추출물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 각각의 한약재를 세절하여 물, 수용액 또는 완충용액에서 분쇄한 뒤 원심분리 후의 침전물을 열수추출하여 제조되는 항종양활성, 간질환억제활성, 항산화성 및 면역증강활성을 갖는 한약재 추출물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 한약재 추출물을 유효성분으로 함유하는 항종양제, 간염 치료제, 항산화제(노화방지제) 및 면역증강제용 약학적 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 Fas-FasL 상호작용을 매개로 하는 간세포사에 의한 염증, 간기능 장해, 알콜성 간염, 환경성 간염, 바이러스성 간염, 스트레스성 간염, 지방간 질환의 간기능관련질환에 대해 항종양제, 간기능관련질환 치료제, 항산화제(노화방지제) 및 면역증강제용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

약학적 조성물은 임상투여시에 경구 또는 비경구 투여가 가능하며 일반적인 의약품제제의 형태로 사용될 수 있다.

즉, 본 발명의 추출물은 실제 임상투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 생약추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스 (Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜 (Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

추출물의 유효용량은 200∼600mg/kg이고, 바람직하기로는 200∼500mg/kg 이며, 하루 1~3회 투여될 수 있다. 용량이 200mg/kg 미만이면 효과가 미미하며, 600mg/kg을 초과하면 투여량에 대한 기대효과의 증가치가 적어 경제적이지 못하다.

뿐만 아니라, 본 발명은 상기 한약재 추출물을 유효성분으로 하는 건강보조식품을 제공할 수 있다.

본 명세서에는 "조추출물", "열수추출물", "코리원(상표) 한약재 추출물", "추출물" 및 "한약재 추출물"을 혼용하였다.

이하 실시예에 의하여 본 발명을 상세하게 설명한다.

하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1: 생약추출>

*건조 한약재 500g을 세절하여, 50mM PBS(pH 7.2)용액에서 분쇄한 뒤, 4℃, 15,000 X g에서 20분간 원심분리하였다. 그 후 샘플 5g을 취하여 10배량의 메탄올을 가하여 70℃에서 3시간동안 가온 침출하여 여과(동양여지 No. 1)하고 여액을 모아 감압농축하여 추출물을 수득하였다.

<실시예 2: 생약추출물의 MMP-9 저해활성>

MMP-9를 생산하는 Hep3B 세포주를 이용하여 실시예1의 추출물에 대한 MMP-9 저해활성을 실험하고 그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에서 보는 바와 같이 본 발명의 한약재 대부분 성분들이 MMP-9 저해활성을 갖는 것을 확인하였다.

<실시예 3: 생약추출물의 사람간암세포(Hep 3B)에 대한 세포독성>

사람의 간암세포(Hep3B, 5×10³)를 각각 96웰 마이크로플레이트에 웰당 198㎕씩 분주한 후 MTT 어세이를 실시하여 세포독성을 검사한 결과, 간암세포에 선택적인 독성을 나타냈다. 도 2에 세포독성의 결과를 나타냈으며, 도2의 B)에 나타난 화살표는 세포사(apoptosis)유발 세포독성을 나타낸 것이다.

<실시예 4: Fas-FasL 매개에 의한 간세포의 세포사에 대한 추출물의 억제효과>

코라원 한약재 추출물의 Fas-FasL 매개에 의한 세포사 억제 및 간염의 치료효과를 확인하기 위하여, 생쥐의 초대 간세포(primary hepatocyte)를 분리 후 배양하였다(cm⁵당 2x10⁵). 또한 FasL을 발현하거나 발현하지 않는 NIH3T3 섬유아세포 (cm⁵당 5x10⁵)를 합하여 공배양하였다. 이때, 대조군으로는 Fas-FasL 결합에 의한 세포사의 핵심효소이자 카스파제(caspase) 저해제인 zVAD.fmk를, 카스파제^-/-와 카스파제^-3-는 대조생쥐군으로 사용하였다 [Hughes, D. P 및 Crispe, I. N. (1995) J. Exp. Med. 182: 1395-1401]. 간세포의 생존성은 3uM의 프로피디움 아이오다이드(PI)로 10분간 염색하여 현미경으로 관찰하였으며, 이때 정상적인 간세포의 형태는 PI-음성 생존세포로 구분하였다.

상기의 방법대로 간세포를 FasL을 발현하는 섬유아세포와 공배양하였을 때 생쥐의 간세포가 24시간 내에 사멸하였으나 대조군의 섬유아세포와 같이 배양된 간세포는 대부분이 생존하였다. 더욱이 간세포를 FasL 발현하는 섬유아세포와 동시에 배양하였을 때 일시적인 블렙(bleb) 형성이 시작되었으며 DNA절단이 확인되었으나, 카스파제 저해제인 zVAD.fmk를 첨가하였을 때는 간세포의 사멸이 일어나지 않았다(표 1). 이로부터 FasL이 간세포의 세포사의 원인이며, zVAD.fmk에 의해서 저해되는 카스파제가 세포사에 관여하고 있음을 알 수 있다.

한편, 열수조추출물을 50mg/15ml 농도로 첨가시, FasL발현-NIH3T3에 의한 세포사를 약 40%이상 감소시켜 간세포 생존능력을 향상시켰다. 이러한 결과는 섬유아세포가 생성하는 FasL에 의한 간세포의 Fas 수용체결합을 추출물이 방해 내지 저해함으로서 Fas 수용체에 세포사의 신호가 전달되는 것이 차단되기 때문으로 보인다(표 1). 또한 추출물의 보호효과는 야생형 간세포보다는 카스파제^-3-이 결손된 생쥐에서 분리된 간세포에서 보다 효과적임이 확인되어 Fas-FasL에 의한 세포사는 주로 카스파제^-3-를 매개하고 있음을 확인하였다(표 2).

한편, 추출물의 각종 분획들이 섬유아세포와 24시간 공배양시 간세포의 세포사에 대한 억제효과(PI-음성 세포)를 검정한 결과, 조추출물에서 강한 억제효과를 보였다(표 3).

<실시예 5: 추출물의 화학적 조성>

한약재 추출물의 화학적 특성을 조사하기 위하여 다음과 같이 실시하였다. 총당(total sugar)의 정량은 페놀-황산법[Dubois, M. 등 (1956) Anal. Chem. 28: 350-354]을 사용하였으며, 환원당은 넬슨-쏘모지(Nelson-Somogyi)방법[Nelson, N. J. 및 Somogyi, M. (1952) J. Biol. CHem. 195: 19-23]을, 표준물질로는 포도당을 사용하였다. 단백질 정량은 소혈청알부민(BSA)을 표준으로 하여 로우리(Lowry)법 [Lowry, H.O.,등 (1951) J. Biol. Chem., 193: 265-275]으로 하였으며, 다당류의 가수분해는 2M 황산으로 100℃에서 6시간동안 스크루캡 바이알에서 수행하였다. 가수분해 후 탄산바륨(BaCO₃)으로 중화시키고 엠버라이트(Amberite) IR-120(H⁺ form)컬럼에서 분리하였다. 갈락토퓨라노실(galactofuranosyl) 잔기를 제거하기 위한 다당류의 부분가수분해는 25mM 황산(10ml)으로 100℃에서 4시간동안 수행하였으며, 이때 0.5M 수산회나트륨으로 중화하고 증류수로 투석하였다.

표 4a로부터 조추출물의 구성성분 중 대부분이 당류(96.1%)이며, 미량의 단백질과 황이 포함되어 있음을 확인했다. 따라서, 본 발명의 추출물에 존재하는 황에 의한 항바이러스제로서의 기능도 예상된다. 또한 조추출물의 중성다당성분을 분석한 결과를 도4b에 나타내었다.

<실시예 5: 추출물의 B-임파구 자극활성>

본 발명의 한약재 조추출물에 대한 B-임파구 자극활성을 검토하기 위해 실험동물은 암컷의 생쥐(C57BL/6XC3H) F1(B6C3F1)을 생명공학연구소로부터 구입하여 17~22g 중량이 될 때 비장적출실험에 이용하였다. 양의 적혈구(sRBC)는 한국배지주식회사(서울)에서 구입하였고 기니아피그 보체와 RPMI 1640배지는 Gibco BRL(Grand Island, NY, USA)사 제품을, 리포폴리사카라이드(Lipopolysaccharide, LPS)는 시그마사 제품을 사용하였다.

임파구의 시험관 내 활성화 및 항체생성세포수(AFC) 검정은 다음과 같다. 비장세포를 RPMI 1640배지(10% 소태아혈청함유)에서 배양하여 세포수를 5x10⁶ cells/ml로 조정한 후, 웰당 0.5 ml씩(처리군당 4개씩) 48-웰 플레이트(Costar사 제품)에 옮긴 후, 시료 또는 LPS (25 ㎍/ml, 시그마)를 첨가한다. 시험관 내 자극을 위하여 플레이트를 37℃의 Bellco(Bellco Biotech., Vineland, NJ, USA) 스테인레스스틸 조직배양기에서 흔들어 가면서 배양한다.

항체생성은 배양 2일 뒤에 측정하며 TNP(trinitrophenyl)-합텐 처리된 sRBC에 대한 AFC를 Jerne 플라크검정법으로 측정하고 세포수는 헤마시토미터 (hemacytometer)를 사용하였다. 이때 항체생성 세포수를 활성치로 나타내고 비활성은 다음과 같이 나타냈다. 즉, 일반적으로 항체생성능이 강한 대조군으로 사용되는 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide; LPS) 25㎍/㎖를 대조군으로 처리하였을 때를 기준했다. LPS의 활성이 거의 25 ㎍/㎖농도에서 포화되므로 이 양을 대조군으로 사용하였다.

조추출물 2mg를 B-임파구 자극활성을 C57BL/6XC3H 생쥐에서 다클론 항체생성으로 검정한 결과를 표 5에 나타냈다.

<실시예 6: 추출물의 항종양활성의 검정>

추출물에 있는 다당류의 항암작용을 다음 방법으로 검정하였다. 생후 4주된 ICR계 생쥐에 사르코마(Sarcoma) 180세포를(0.1 ml, 7 x 10⁶ 세포) 쥐의 우측서혜부 피하에 이식하였다. 실험표본 물질은 PBS에 적당한 농도로 용해시켜 고압멸균한 뒤 내부복막 가까이에 종양이식한 후, 24시간 이후부터 10일동안 매일 주사(2 mg/100 g)하였다. 모든 쥐들을 5주간 관찰한 후 종양의 성장에 미치는 영향을 알아보기 위해, 쥐를 죽이고 종양을 절제하여 무게를 측정하므로써 다음의 식으로부터 종양의 성장억제비율을 구하였다.

억제율 (%) = {(A-B)/A} ×100

A는 대조군의 종양무게 평균값이며 B는 실험군의 종양무게 평균값이다. 완전한 퇴행은 실험쥐 숫자에 대한 완전한 퇴행을 보이는 쥐 숫자의 비율이다.

그 결과 조추출물은 사르코마 180 고형종양을 이식한 쥐에서 항종양활성이 2 mg/100g 투여로 44.7%로 매우 높은 억제활성을 나타냈다(표 6).

<실시예 7: 추출물의 B-임파구 자극 활성 검정>

조추출물을 각각의 시료 0.1mg/ml에서 1.0 mg/ml에 대한 면역자극 검정을 한 결과, 대조군인 LPS군의 89% 활성을 나타내었다(표 7).

<실시예 8: 추출물의 탐식세포 자극활성 (macrophage-stimulating activity)>

열수추출물은 복강 및 구강식이를 위해 PBS에 녹인 뒤 투여하였다. 구강식이를 위해서 강제로 섭취하게 하였으며, PEC 분리와 비장의 탐식세포 활성을 위해 적출하였다.

비장의 탐식세포(Splenic macrophage)분리는 조직을 부드럽게 부순 뒤 Tris완충액-염화암모늄용액으로 조직을 단일 세포화시키고, 세포 추출기 (Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ, USA)를 통과시켜 수행하였다. 잔존세포는 HBSS(Hank의 균형용액)를 완벽하게 세척하고, RPMI배지(10% 가열불활성화 소태아혈청, 100U/ml 페니실린, 100g/ml 스트렙토마이신 함유, RPMI-FCS)로 재희석하였다. 희석된 세포는 플라스틱 용기에, 배양된 탐식세포는 RPMI-FCS-HEPES에 부착시키도록 만들었다.

PEC는 추출물을 복강 및 구강섭취 후에 5ml의 Hank의 균형용액(HBSS)으로 말초동공으로부터 분리하고, 원심분리하여 세포덩어리를 HBSS로 두 번 세척한 후 HBSS(25mM-HEPES(-2-hydroxyethyl-peperazine-N-2-ethane s㎕fonic acid 함유) 1 ml에 녹였다. 이렇게 얻은 PEC는 F-300 세포측정기(Medical Electronics, Kobe, Japan)를 사용하여 그 수를 측정하였다.

PEC의 탐식활성의 측정은 형광 마이크로파티클(microparticle)에서 배양하여 측정한다. 즉, PEC(1 x 10⁵)를 원심분리하고 100㎕의 HBSS-HEPES에 재희석 한 뒤, HBSS-HEPES로 100배 희석시킨 플루오레스브라이트 카복실레이트 마이크로스피어즈 (Fluoresbrite carboxylate microspheres, 2.0m; Polyscience, Warrington, PA, USA)를 20㎕를 첨가하여 37℃에서 1시간 배양하였다. 배양액에 2ml의 냉PBS(3 mM ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt; EDTA-PBS함유)를 첨가하여 반응을 정지시킨 후 세포덩어리를 모아 EPICS-프로파일 II 플로우시토미터 (EPICS-Profile II flow-cytometer, Coulter, Hialeah, FL, USA)를 이용하여 탐식활성을 측정하였다.

화학 루미네센스 활성측정은 F-300 마이크로셀(microcell) 측정기를 사용하여 PEC와 비장의 탐식세포 밀도가 4 x 10⁵/ml이 되도록 트리판 블루(Trypan Blue) 염색으로 세포수를 세고 RPMI-FCS-HEPES로 조정한 뒤, 500㎕의 세포용액을 20㎕의 0.2% 루미놀(luminol, 5-amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazine-dione, Sigma, Co., USA)이 함유된 폴리스티렌 큐벳에 옮긴다. 각각의 큐벳을 부드럽게 섞은 뒤 15분 후에 루미노미터(luminometer, Multi-biolumat LB9505; Berthold, Wildbad, Germany)를 사용하여 측정하였다. 활성은 15분동안의 총활성으로 나타냈다.

비장의 탐식세포 활성에 대한 효과를 측정하기 위하여, 추출물을 10마리의 생쥐 복강 내에 투여하여 이 중 2마리에서 비장의 탐식세포를 투여후 3, 18일째에 분리하여 일시적인 화학 루미네센스를 측정하였다(표8). 추출물 투여 생쥐에서의 화학 루미네센스가 대조군보다 증가하였다.

생쥐당 5mg씩 추출물을 투여한 생쥐의 PEC가 가장 높은 화학 루미네센스를 나타내었다. 이들 생쥐에서 비장의 탐식세포의 생성은 투여량 의존적임이 확인되었다. 추출물의 B세포자극활성을 다클론 항체생성 세포를 C57BL/6XC3H 생쥐에서 측정한 결과 5 mg 투여에서 가장 높았으며(표 9), B-세포자극활성을 나타내었다.

<실시예 9: 열수추출물의 독성 및 혈중누출효소에 대한 영향>

상기에서 추출된 열수추출물을 임상적으로 사용하려면 독성이 없어야 하므로, 독성검사와 간세포계 효소에 미치는 영향을 검토하였다. 무처리군의 정상랫트 (1군 5마리)에 대한 열수추출 다당류의 복강내 투여시의 치사량을 구하고자 하였으나, 5일동안 950mg/kg 이하 투여시에 사망을 일으키지 않았다. 또한 950 mg/kg을 복강내 투여시, 24시간 후의 S-GOT, S-GPT, S-Alp에 어떠한 영향도 미치지 않았다(표 10).

<실시예 12. 열수추출물의 노화방지(항산화성)에 대한 효과>

열수추출물에 대한 항산화성 유무를 확인하기 위해서 실험동물은 일본 에어로지수틱스(Air Logistics)사의 4주령 B6C3F1 숫컷 생쥐로 한국 바이오 제노믹스사를 통하여 구입하여 다섯 군(1군 10마리)으로 나누어 실험하였다. 제1군(이하, 1군)은 정상군으로 물과 사료만으로 사육하였다. 제2군(이하, 2군)은 생쥐당 17.5mg/㎏의 비율로 DEN(N,N-diethylnitrosoamine)을 주 2회씩 8주간 복강 주사하였고[Kolaja, K. L., Xu, Y., Walborg, E. F., Jr., Stevenson, D. E. and Klaunig, J. E. (1998) J. Toxicol. Environ. Health A 53: 479-492] 이후에 12주를 더 사육한 다음에 경추 탈구법으로 도살하여 생화학적 검사를 실시하는데 이용하였다. 제3군(이하, 3군)은 처음부터 열수추출물을 물에 희석하여(500 ppm) 사료와 함께 사육하였고, 제4군(이하, 4군)은 DEN을 8주간 복강 주사한 후에 9주부터 열수추출물을 물에 희석하여 사료와 함께 사육하였다. 제5군(이하, 5군)은 DEN을 복강 주사하면서 열수추출물과 사료로 사육하는 군으로 분류하여 실험하였다.

글루타사이온 퍼옥사이다제(Glutathione peroxidase)는 생체 내에서 생성되는 과산화수소를 물로 바꿔주는 과정에 관여하는 효소이며, 글루타사이온 퍼옥사이다제의 활성도는 이 효소에 의해 생성된 산회글루타사이온(oxidized glutathione; GSSG)이 글루타사이온 환원제에 의해 글루타사이온(glutathione;GSH)으로 되어 일정수준의 GSH를 유지할 때, NADPH가 산화되는 것을 측정하는 방법으로 그 검정방법은 다음과 같다.

0.1mM EDTA를 함유하는 0.1mM 인산염 완충용액(pH 7.0) 0.5ml와 글루타사이온 환원제 0.1 ml(0.24 unit), 10mM GSH 0.1ml 그리고 시료 0.1ml를 혼합하였다. 이 혼합용액에 1.5mM NADPH 용액 0.1ml를 넣고 12mM 쿠메니 하이드로퍼옥사이드 (cumene hydroperoxide) 0.1ml를 가하여 340nm에서 5분간 흡광도의 감소를 측정하였다. 1분동안에 1uM의 NADPH를 산화시키는 효소의 양을 1unit로 하였다.

표 11은 열수추출물의 과산화물분해효소에 대한 영향을 측정한 결과를 나타낸 것이다. 암 유발 물질을 투여하지 않은 군들(1 군과 2 군)간의 비교에서 열수추출물의 투여군에서 과산화물분해효소의 활성이 29 % 이상 증가함을 나타내었다, 또한 암 유발 물질의 투여군들간(2 군, 4군 그리고 5 군)의 비교에서도 열수추출물의 투여군(4 군과 5 군)에서 과산화물분해효소의 활성이 유의적으로 증가하였다.

이상과 같은 본 발명에 의하면, 본 발명의 추출물은 항종양활성, 간염억제활성, 면역증강활성 및 노화방지(항산화성) 특성을 가지며, 이에 따라 항종양제, 간염 치료제, 면역활성화제용 치료제 및 항산화제(노화방지제)로 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 추출물은 독성이 전혀 없으므로 건강보조식품으로도 널리 이용될 수 있다.

도 1은 MMP-9를 Hep3B sup. 세포주를 이용하여 본 발명의 한약재의 열수추출물을 이용하여 MMP 자이모그라피를 한 결과를 나타낸 것이다.

1: 대조군(Hep3B sup., MMP9) 2: 삼칠근

3: 금은화 4: 백지

5: 대조군(Hep3B sup., MMP9, 레인1의 1/5 양을 영동함.)

6: 지구목 7: 유근피

8: 귀전우

도 2는 간암세포주(Hep3B)에 대한 세포독성의 결과이다.

A) 정상간세포주, B) 간암세포주 Hep3B.

Claims

와송(바위솔; Orostachys japonicus), 지유(오이풀; Sanguisorba officinalis), 금은화(Lonicera japonica), 귀전우(화살나무; Winged spindle), 삼칠근(Notoginserg Radix), 백지(구릿대; Angelica dahurica), 마치현(쇠비름; Portulaca oleracea), 우피두견(만병초; Rhododendron brachycarpum), 지구목(헛개나무; Hovenia dulcis), 유근피(드릅나무; Ulmus Macrocarpa Hance)로 구성되는 한약재로부터 추출되는 것을 특징으로 하는, 간염 억제활성을 갖는 한약재 추출물.
제1항에 있어서, 상기 한약재는 각각 동량으로 사용하는 것을 특징으로 하는 간염 억제활성을 갖는 한약재 추출물.
제1항에 있어서, 각각의 한약재를 세절하여 물, 수용액 또는 완충용액에서 분쇄한 뒤 원심분리 후의 침전물을 열수추출하여 제조되는 것을 특징으로 하는 간염 억제활성을 갖는 한약재 추출물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 한약재 추출물을 유효성분으로 함유하는 간염예방·치료용 약학적 조성물.
제4항에 있어서, 간염은 Fas-FasL 상호작용을 매개로 하는 간세포사에 의한 염증, 간기능장해, 알콜성 간염, 환경성 간염, 바이러스성 간염, 스트레스성 간염, 지방간 질환인 것을 특징으로 하는 간염예방·치료용 약학적 조성물.
제4항에 있어서, 추출물의 유효용량은 200∼600mg/kg인 것을 특징으로 하는 간염예방·치료용 약학적 조성물.