KR100314999B1 - 장생도라지추출물을포함하는항균성및염증성질환치료용한방제제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 다양한 생리활성을 갖고 있는 20년근 이상의 다년생 도라지(이하 ‘장생도라지’)의 열수 및 유기용매 추출물 또는 이들 추출물에 허용가능한 다른 생약재 또는 생약재 추출물을 선택적으로 혼합한 각종 약제 및 건강보조식품 제조에 관한 것이다. 본 발명의 장생도라지 추출물은 항균활성, 지질대사개선작용, 혈당강하작용, 암세포접착저해활성, 면역증강작용, 항관절염작용 등에 있어서 기존 약제나 2∼4년근의 일반도라지에 비하여 월등한 효과를 가진다.

Description

장생도라지 추출물을 포함하는 항균성 및 염증성 질환 치료용 한방 제제

발명의 분야

본 발명은 대한민국 특허 제45791호의 ‘다년생도라지 재배법’에 따라 생산된 20년근 이상의 장생도라지(長桔)의 다양한 약리적 효능에 기초하여 각종 약제 및 건강보조식품으로서의 용도에 관한 것이다.

발명의 배경

도라지(길경Platycodon grandiflorumA. DC)는 배농, 거담, 기관지염, 천식, 소염 등의 호흡기계질환에 사용되어온 생약제로서 도라지가 배합되어 있는 한방 처방은 동의보감에 273건, 방약합편에 49건이 수록되어 있을 정도로 다양한 약리작용을 가지고 있는 것으로 알려져 있다.

도라지의 주요 약리성분은 테르펜계 사포닌(프레티코틴 A, C, D, D₆, 폴리갈라신 D, D₂등 18종)으로서 뿌리의 약 2%를 차지하고 있다. 동물실험에서 테르펜계 사포닌은 용혈, 국소자극, 진해, 거담작용, 중추신경억제작용(진정, 진통, 해열효과), 급ㆍ만성 염증에 대한 항염증작용, 항알레르기, 항궤양 및 위액분비억제작용, 혈관을 확장하여 혈압을 낮추는 항콜린작용, 혈당강하작용, 콜레스테롤 대사개선작용 등이 있는 것으로 밝혀졌다 [Igarashi, K.,Sogoigaku,3, 1(1951) 및 이은방,생약학회지,5, 49(1974)]. 또한 알파-스피나스테롤, 스티그마스트-7-엔을, 알파-스피나스테롤글루코시드 등과 같은 스테로이드계 화합물과 이눌린, 플레티코디딘, 베튤린과 같은 다당류도 단리되었다.

이외에 도라지의 열수 및 에탄올 추출물은 곰팡이의 아프라톡신을 억제하며 〔Hitokoto, H., Morozumi, S., Wake, T., Sakai, S, and Ueno, I.,Mycopathologia,66, 161(1979)〕, 이눌린(inulin) 분획은 식균작용을 가지며 〔Nagao, T., Matsuda, H., Nambo, K. and Kubo, M.,Shoyakugaku Zasshi,40, 367(1986)〕, 과당중합체인 이눌린은 고형암과 복수암에 대한 항종양효능이 있다고 알려져 있다〔Naga, T., Matsuda, H., Makata, K., Namba and Kubo, M.,Shoyakugaku Zasshi,40, 375(1986)〕.

이러한 도라지의 약리적 성질을 이용한 발명으로 일본특허공개 제60-89427호는 도라지의 70% 메탄올 추출물중의 이눌린 분획이 ICR 마우스의 복수암과 고형암에 대한 억제효능이 각각 31∼39%, 32∼44%로 나타났고, 화학요법제인 마이토마이신과 병용투여시 고형암을 61%까지 억제할 수 있을 뿐만 아니라 마이토마이신의 부작용인 체중감소와 백혈구수의 저하를 억제시킬 수 있다고 개시되어 있다. 이러한 도라지의 우수한 항종양 활성으로 인하여 일본특허공개 2-172921호는 도라지로부터 이눌린을 분리하는 많은 난점을 개선하고자 도라지의 조직 배양물로부터 얻어진 이눌린을 이용하여 Enrlich 복수암 세포주에 투여하여 50%의 종양억제율과 140∼145%의 생명연명율을 얻은 발명의 효과를 개시하고 있다. 일본특허공개 제3-264534호는 알코올흡수 억제물질로서 40% 길경엑기스를 개시하고 있다.

현재 한국, 중국, 일본 등에서 도라지가 함유된 한방제제는 30여종이 시판되고 있는데, 오약순기산, 통기환, 순기원 등은 중풍, 관절염 등의 치료제로서, 안심원과 천왕보심단은 고혈압, 뇌질환 등의 치료제로서, 자모연조 엑기스는 기관지염, 폐결핵, 늑막염 등의 치료제로서, 만옥단은 고혈압, 동맥경화, 당뇨병 등의 치료제로서 각각 이용되고 있다. 이외의 도라지를 함유한 한방제제는 천식, 거담, 배농, 진해 등과 같은 기관지 관련 질병에 사용되고 있다.

그러나 지금까지 상기 한방제제와 실험에 사용되어 왔던 도라지는 4∼5년 이상 재배하면 뿌리가 썩어버리기 때문에 2∼4년생 도라지들이었다. 최근 제45791호로 특허된 ‘다년생 도라지 재배방법’에 의하여 생산된 20년근 이상의 다년생 장생도라지는 특허보호 생약재료서 판매용 한방제제로 전혀 사용되지 않고 있다.

따라서 본 발명자들은 2∼4년근의 일반도라지에 비하여 장생도라지가 약리작용에 있어서 현저히 우수한 점을 이용하여 이를 건강보조식품 및 한방제제 등의 약제로서의 용도를 개발하기에 이르렀다.

본 발명의 목적은 2∼4년근의 일반도라지에 비하여 우수한 약리작용과 생리활성효능을 가지는 장생도라지의 한방제제로서의 용도를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 장생도라지 추출물을 이용한 항균제를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 장생도라지 추출물을 이용한 항염증성 치료제를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 생체내에서 독성이 없으며 다른 부작용이 없는 한방제제를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 상기 목적 및 기타의 목적들은 하기 설명되는 본 발명에 의하여 모두 달성될 수 있다.

도 1a∼1g는 장생도라지 메탄올 추출물 0.031, 0.062, 0.125, 0.25, 0.5 및 1mg/ml의 농도로 B16-F1 생쥐 멜라노마 세포주를 한 시간 동안 처리하였을 경우 암세포의 라미닌에의 결합 형태 및 세포형태를 현미경으로 관찰한 사진이다.

본 발명은 장생도라지를 분말로 제조한 다음, 이를 열수추출하거나 유기용매를 이용하여 추출하여 제조된 추출액을 항균제, 고지혈증 치료제, 당뇨병 치료제, 암 치료제 또는 염증성 치료제로 사용하는 용도에 관한 발명이다. 하기에서는 일반도라지와 장생도라지의 구성물질 및 약리작용의 차이에 대하여 상세히 살펴본다.

일반도라지와 장생도라지는 일반 성분중 수분, 조지방, 무기염 등에 있어서 큰 차이가 없다. 식이섬유의 총량 및 조사포닌 양은 22년근에서 각각 3.1% 및 0.4%로 높게 검출된다. 도라지의 구성 당성분중 이눌린의 총함량은 70∼73 mg/g으로 거의 변화가 없었으나 이눌린의 구성 당성분인 프락토스(fluctose)의 중합도에 큰 차이가 있다. 즉 장생도라지에서는 G-F₂와 G-F₃의 함량이 높고 일반도라지에서는 G-F₅에서 G-F₈의 함량이 상대적으로 높게 나타나 이눌린의 구조에 상당한 차이가 있슴이 밝혀졌다. 상기에서 G는 글루코스이고, F는 프락토스로서 이눌린의 구성성분을 나타낸 것이며 숫자는 프락토스의 개수를 나타낸 것이다. 이와 같이 이눌린의 과당중합도는 도라지의 재배년수가 증가할수록 과당수가 작은 올리고프락토스가 높게 검출된다. 이러한 결과는 일반도라지에 비하여 장생도라지가 고혈압, 기관지, 당뇨병 등에 효능이 우수한 임상실험 결과와 관련이 있는 것으로 추측된다.

무기염으로서 칼슘(Ca), 마그네슘(Mg), 구리(Cu)의 함량이 일반도라지에 비하여 장생도라지에서 3∼10배 높게 검출된다.

일반도라지와 장생도라지를 80% 에탄올과 30% 메탄올로 추출하여 HPLC로 분석하여 보면 각각 한 개와 두 개의 피크가 함량의 차이가 나타난다. 장생도라지에만 많이 존재하는 이 피크를 다시 극성도에 따라 용매로 분획하여 생리활성을 조사한 결과 석유에테르와 디에틸에테르 분획물에서 효과가 인정되어 여러 기기분석을 통하여 구조분석하였을 때 스테로이드계 물질임이 판명되었다〔하시봉, 석사학위논문, 경상대학교 (1996)〕.

장생도라지는 일반도라지와 구성성분에 있어서 상당한 차이가 있을 뿐만 아니라 항균활성, 지방대사개선작용, 암세포접착저해활성, 면역증강작용, 형당강하작용, 혈당강하작용 등의 약리적효능에 있어서도 일반도라지에 비하여 월등히 우수하다.

장생도라지의 80% 에탄올과 30% 메탄올추출물은 자유라디칼 소거작용과 항진균작용이 있으며 세포독성이 없다. 장생도라지는 일반도라지에 비하여 광범위하고 우수한 항균스펙트럼을 보인다. 장생도라지의 에탄올 추출물은 세균에 대해서는 5 mg/ml, 진균류에 대해서는 2.5∼10 mg/ml 농도의 최소저해농도(MIC) 값을 나타낸다. 항균활성물질은 50℃, 95% 에탄올 농도에서 가장 용이하게 추출된다. 장생도라지의 95% 에탄올 추출물을 다시 용매로 분획하였을 때 부탄을 분획에서 항균활성이 가장 높은 것으로 나타나는데 이것은 사포닌 성분에 기인되는 것으로 추측되고, 다른 용매분획에서도 활성이 검출되는 것을 보아 항균활성물질이 2개 이상인 것으로 추론된다. 장생도라지의 항균활성물질들 중에 에틸아세테이트 분획물에서 분리되어 여러 기기를 사용하여 구조분석을 한 결과 글리세릴 리놀레이트임이 규명되었다.

또한 고지혈증 유발쥐에 장생도라지 분말 또는 추출물을 식이시킬 경우 혈청과 간장의 혈당 및 지질함량이 현저하게 감소된다. 특히 장생도라지 분말 5% 식이군에서는 혈청과 간장중의 총콜레스테롤과 중성지질의 농도가 현저히 감소되고 이때 동맥경화지수도 장생도라지로 처리하지 않은 대조군에 비하여 낮게 나타난다. 이런 결과는 고콜레스테롤증 또는 고지혈증 예방 및 치료에 장생도라지의 처방가능성을 제시해 주고 있다.

본 발명의 장생도라지 추출물은 혈당, 혈청, 간장 등의 지질개선효과가 일반도라지에 비하여 우수하여 당뇨병 치료에도 유용하다. 장생도라지 추출물은 체내에서 혈청 총콜레스테롤 및 LDL의 농도를 상당한 수준으로 감소시키며 혈청 HDL-콜레스테롤 농도는 증가시키는 작용을 한다. 혈청 유리콜레스테롤, 콜레스테롤 에스테르, 중성지질 및 인지질의 농도 또한 낮은 수준으로 감소시키며 동맥경화지수도 낮아진다.

장생도라지 추출물을 암세포주에 처리하게 되면 암세포접착저해활성이 우수하게 나타난다. 장생도라지 메탄올 추출물을 B16-F1 생쥐 멜라노마 세포에 처리하여 라미닌(laminin)의 결합력을 측정하여 보면 추출물의 농도가 0.125 mg/ml 이상이 되면 암세포주에서 100% 암세포접착저해활성이 나타나게 된다. 이로써 장생도라지 추출물이 암전이를 낮은 농도에서도 저해할 수 있음을 알 수 있다.

또한 장생도라지 추출물을 용매의 극성에 따라 분획하여 면역증강기능을 조사하여 보면 수용액층에서 가장 우수한 효과가 나타난다. 이 수용액층을 HPLC 분석한 결과 이눌린의 프락토스 중합도가 20개 이하의 이눌린 분획에서 가장 우수한 면역증강활성이 검출된다. 장생도라지가 일반도라지에 비하여 면역증강활성이 5배 이상 높은 결과는 이눌린의 프락토스 중합도와 밀접한 상관성이 있는 것으로 추측된다.

장생도라지 추출물은 부종의 저해성능이 있으므로 류마티스 관절염과 같은 염증성 질환의 치료에도 사용될 수 있다. 기존의 부종 저해약제인 프레디졸론(predisolone)에 비등한 부종저해활성을 나타낸다. 장생도라지의 효능을 상승시킬 수 있는 허용가능한 생약재 또는 생약재 추출물을 혼합시키면 상승작용으로 인하여 부종의 억제활성이 더 높아진다.

본 발명에서는 이러한 우수한 장생도라지의 약리활성을 이용한 건강식품 및 약제를 제공한다. 본 발명의 장생도라지를 이용한 건강식품이나 약제로 제공될 수있는 추출물은 이 분야에서 통상적으로 사용되는 방법에 따라 처리된다. 장생도라지 추출물은 통상 열수추출물 또는 유기용매추출물을 들 수 있으며 이러한 추출물들은 단독으로 사용될 수도 있으며 생약재를 첨가하여 제조될 수도 있다.

일반적으로 장생도라지 분말은 수분의 함량이 5%이하가 되도록 장생도라지를 건조하고 이를 분쇄한 다음, 입자크기가 0.6mm이하인 것을 선별하여 제조된다. 열수추출물은 장생도라지 분말에 약 5∼10배의 물을 첨가하고 90∼100℃의 온도에서 4∼6시간동안 2회 추출하여 얻은 여과액 에 허용가능한 생약재 또는 생약재 추출물을 선택적으로 첨가하여 제조된다. 유기용매 추출물의 경우에는 장생도라지 분말에 약 3배의 유기용매를 첨가하고 실온에서 2회 추출하여 얻어진 여과액을 감압농축하여 추출물에 허용가능한 생약재 또는 생약재 추출물을 선택적으로 첨가하여 제조된다.

상기 유기용매로는 알코올이 사용될 수 있으며 메탄올, 에탄올 등이 바람직하게 사용될 수 있다. 허용가능한 생약재로는 창출, 산사자, 원지, 하수오, 백복령, 사상자를 등이 있다.

본 발명의 장생도라지 추출물들은 식품위생법상 또는 약재학적으로 허용가능한 보형제를 이용하는 공지의 방법으로 건강보조식품화 또는 제제화되어 단위 용량형태 또는 다용량 용기에 내압시킬 수 있다. 건강보조식품 또는 제제형태는 수성액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑기스제, 분말제, 과립제, 정제, 캅셀제 형태일수 있으며, 통상의 분산제, 현탁제 또는 안정화제를 함유할 수 있다.

상기 방법으로 제조된 장생도라지 추출물 또는 허용가능한 다른 생약재를 혼합하여 제조된 장생도라지 추출물의 항균활성, 지방대사개선작용, 혈당강하작용, 암세포접착저해활성, 면역증강작용, 항관절염작용 등과 같은 약리적효능에 대한 실험을 하기 실시예에 나타내었다.

본 발명은 하기의 실시예에 의하여 구체화될 것이며, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예

실시예 1 : 장생도라지 추출물 한방제제 제조

장생도라지를 수분함량 5% 이하로 건조시켜 분쇄한 다음 입자의 크기가 0.6mm이하 되게 선별하여 분말로 제조한다. 장생도라지 분말에 대하여 10배의 물을 넣어 90-100℃에서 4-6시간동안 2회 추출하고 여과액을 포장하여 액상제품을 제조하였다. 또한 여과액을 더 농축하여 엑기스제, 분말제, 과립제, 캅슐제 및 환형 한방제제를 제조하였다.

에탄올 추출물은 장생도라지 1kg을 분쇄하여 실온에서 에탄을 4L로 2일간 2회 추출하고 여과액을 모아 감압농축하여 125g의 추출물을 얻었다. 이 추출물을 이용하여 엑기스제, 분말제, 과립제, 캅슐제 및 환형 한방제제를 제조하였다.

상기 장생도라지 추출물은 효능을 상승시키고자 창출, 산사자, 원지, 하수오, 백복령, 사상자 등과 같은 허용가능한 생약재 또는 상기와 같은 방법으로 추출, 농축한 생약재 추출물을 첨가하여 제조될 수 있다.

실시예 2 : 장생도라지의 항균활성 시험

장생도라지의 에탄올 추출물을 14종의 식품부패(식중독) 미생물과 병원성 미생물을 대상으로 최소저해농도(MIC)를 측정함으로써 항균활성 실험을 행하였다. 96-웰 플레이트를 사용하여 각 균주의 흡광도가 660nm에서 0.5가 되도록 조절한 다음, 배지에 도라지 추출물을 농도별로 첨가한 다음 37℃에서 24시간 배양하였을 때 생육정도를 확인하는 방법으로 측정하였고 그 결과는 표 1에 기재하였다. 세균의 경우에는 Muller Hinton 배지를 사용하였고 다른 곰팡이류의 경우에는 맥아 추출배지를 사용하였다.

[표 1]

실시예 3 :

장생도라지 급이가 고지혈증 유발 흰쥐의 혈청 및 간장의 지질대사에 미치는 영향

체중이 70±5g이고 4주일된 Sprague Dawley계 흰쥐를 20% 카제인을 함유한기본 식이(basal diet)에 지질 20%와 소듐 콜레이트 0.25%가 함유된 식이를 2주일간 급이시켜 고지혈증을 유발시킨 다음, 6마리씩 A, B, 및 C의 3개 군으로 나누어 3주간 실험사육하였다. A군에는 일반사료만을 급이하고(대조군), B군은 일반도라지 분말 5%를 혼합시킨 사료를 급이하고, C군은 장생도라지 분말 5%를 혼합시킨 사료를 급이하였다. 효과를 비교하기 위하여 체중이 70±5g이고 4주일된 정상적인 흰쥐 6마리(D군)에 일반사료를 급이하였다. 실험에 사용된 장생도라지와 일반도라지는 동결건조하여 0.59mm이하로 분말화한 다음 통상적인 일반사료와 혼합하여 급이시켰다. 3주간 급이한 결과 체중의 증가량(food intake)은 표 2에 나타내였다. 실험사육 3주간의 최종일에는 7시간 질식시킨 후 에테르 마취하에 심장 채혈법으로 채혈하였고 간장은 0.9% 생리식염수로 문맥을 통하여 관류 탈혈한후 여과지로써 물기를 제거하였으며, 혈액은 약 1시간 정도 빙수중에 방치한 후 3,000rpm에서 15분간 원심분리하여 혈청을 얻었다. 상기 혈청과 간장에서의 혈당, 콜레스테롤, 중성지질(트리글리세라이드), 인지질, GOT((glutamic oxaloacetic transaminase), GPT(glutamic pyruvic transaninase) 및 LDH(lactate dehydrogenase)를 측정하여, 그 결과는 표 2에 기재하였다. 이들 혈당, 콜레스테롤, 지질, 및 효소활성은 이 분야의 통상으로 사용되는 측정용 kit 시약을 이용하여 측정하였다.

[표 2]

A군 : 고지혈증을 유발시키고 일반사료 급이군

B군 : 일반도라지 분말 5%를 혼합시킨 사료 급이군

C군 : 장생도라지 분말 5%를 혼합시킨 사료 급이군

D군 : 고지혈증 유발시키지 않은 군

고지혈증을 유발시키고 장생도라지 분말을 식이시킨 군(C군) 경우가 대조군(A군)이나 일반도라지 분말을 식이시킨 군(B군)보다 혈청과 간장중의 총콜레스테롤과 중성지방의 농도가 현저히 작았으며 정상군에 가까운 수치를 나타내었다.동맥경화지수는 고지혈증을 유발시키지 않은 흰쥐보다 더 낮았다. 따라서 장생도라지 분말이 고지혈증 예방 및 치료에 효과가 있다는 사실을 알 수 있다.

실시예 4 :

장생도라지추출물이 당뇨성 흰쥐의 혈당 및 지질성분에 미치는 영향

체중이 70±5g이고 4주일된 Sprague Dawley계 흰쥐에 알록산 모노히드레이트(15mg/kg B.W/day)를 복강내 주사(I.P. injection)하여 당뇨성 흰쥐가 되도록 하였다. 실험동물은 난괴법에 따라 6마리씩 A, B, 및 C의 3개 군으로 나누어 3주간 각 설험군의 식이에 따라 자유로이 섭취시켰다. A군에는 일반사료만을 급이하고(대조군), B군은 6년근 도라지 추출물을 혼합시킨 사료를 급이하고, C군은 장생도라지(22년근) 추출물을 혼합시킨 사료를 급이하였다. 효과를 비교하기 위하여 체중이 70±5g이고 4주일된 정상적인 흰쥐 6마리(D군)에 일반사료를 급이하였다. 실험에 사용된 도라지 추출물은 동결건조된 도라지 200g에 물을 첨가하여 1L로 한 후 700ml로 농축시키고, 그 잔사에 다시 물 800ml을 넣고 300ml가 될 때까지 열수추출하여 제조하였다. 실험사육 3주간의 최종일에는 7시간 질식시킨 후 에테르 마취하에 심장채혈법으로 채혈하였고 간장은 0.9% 생리식염수로 문맥을 통하여 관류 탈혈한 후 여과지로써 물기를 제거하였으며, 혈액은 약 1시간 정도 빙수중에 방치한 후 3,000rpm에서 15분간 원심분리하여 혈청을 얻었다. 상기 혈청과 간장에서의 혈당, 콜레스테롤, 중성지질(트리글리세라이드), 인지질, AST(aspartate aminotransferase), ALT(alanine aminotransferase) 및 LDH(lactate dehydrogenase)를 측정하여, 그 결과는 표 3에 기재하였다. 이들 혈당, 콜레스테롤, 지질, 및 효소활성은 이 분야의 통상으로 사용되는 측정용 kit 시약을 이용하여 측정하였다.

[표 3]

1) 콜레스테롤 에스테르=전체 콜레스테롤 - 유리콜레스테롤

2) 콜레스테롤 에스테르 비율=콜레스테롤 에스테르/전체 콜레스테롤×100

A군 : 알록산으로 유발된 당뇨성 군으로 도라지 미처리군

B군 : 6년근 도라지 열수 추출물로 처리된 군

C군 : 22년근 장생도라지를 급이한 군

D군 : 알록산을 처리하지 않은 군

상기 표 3에 기재된 바와 같이 혈당농도는 알록산 투여군(A, B 및 C군)이 알록산을 투여하지 아니한 D군에 비하여 유의적으로 높았으나 대조군인 A군에 비해서 도라지 추출물로 처리된 B군과 C군이 낮았으며 특히 장생도라지 추출물로 처리된 C군이 가장 낮았다.

혈청 총콜레스테롤 및 LDL 농도는 A군에 비해 B군과 C군이 낮았으며, 이중 C군이 더욱 낮아 알록산을 투여하지 않은 D군에 가장 가까운 수치를 나타내었다. 혈청 HDL-콜레스테롤 농도는 A군에 비해 도라지 추출액 급여군(B 및 C군)에서 높게 나타났으며 이중 C군이 더 높은 수치를 가져 알록산을 투여하지 않은 D군에 가장 가까운 것으로 나타났다. 동맥경화지수는 A군에 비해 B군과 C군이 낮았다. 혈청 유리콜레스테롤, 콜레스테롤 에스테르, 중성지질 및 인지질의 농도는 A군에 비해 전 실험군에서 유의적으로 낮았다. 간장중 전체 콜레스테롤, 중성지질 및 인지질의 함량은 A군에 비해 전 실험군에서 유의적으로 낮았다. 혈청 AST, ALT 및 LDH 효소활성은 A군이 가장 높았으며 다른 실험군들은 비교적 낮았다. 이상의 결과에서 도라지 추출액이 혈당, 혈청 및 간장의 지질개선에 효과가 있는 것으로 나타났으며, 특히 장생 도라지 추출액이 더욱 효과적인 것으로 나타났다.

실시예 5 : 장생도라지의 암세포접착저해활성

B16-F1 생쥐 멜라노마 세포주를 장생도라지 메탄올 추출물로 처리하여 세포외 메트릭스의 일종인 라미닌에 접착을 저해하는지의 여부를 정량적으로 측정함으로써 장생도라지의 암세포접착저해활성을 조사하였다. 상기 멜라노마 세포주의 유지는 소 태아 혈청〔FCS(fetal calf serum), 10%〕을 함유한 최소 필수 배지〔MEM(minimum essential medium), Hank's salt 함유〕에서 유지시켰다. 라미닌-코팅된 플레이트는 라미닌 1 mg을 PBS〔phosphate buffer saline, NaCl 8g, KCl 0.2g, NaHPO₄1.44g, KH₂PO₄0.24g/L〕 2ml에 용해하여 냉장고에 보관하면서 필요시에 라미닌의 농도(20㎍/ml)를 결정하여 찬 PBS 용액으로 희석하고 이 용액을 96-웰 마이크로플레이트의 각 월에 50l씩 분주하여 하룻밤 동안 건조시켜 사용하였다.

세포 현탁액의 제조는 T-25 배양(culture) 플라스크에 80% confluence를 성장한 B16-F1 세포를 3ml의 2mM EDTA용액으로 떼어낸 다음 무혈청(serum-free) MEM 5ml를 가하여 800 rpm에서 5분 동안 원심분리 시켜 얻은 세포를 1% BSA를 함유한 무혈청 MEM의 적당한 양에 현탁하여 세포수가 2×10⁶cells/ml이 되도록 조절하여 이 현탁액 50l를 사용하였다.

활성의 측정은 라미닌-코팅된 웰을 100l의 PBS로 3회 세척한 후 다시 1% BSA용액 (PBS에 용해) 100l를 첨가하였고, BSA를 감압하에 제거시켰다. 이 판에 0.1% BSA를 함유한 무혈청 MEM 50l, 시료 및 세포를 첨가하여 5% CO₂존재하에서 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후 PBS(37℃)로 두 번 세척한 후 0.5% BSA(PBS에 용해) 100l와 PBS 100l로 각각 세척한 다음 부착되어 있는 세포를 2.5% 글루타르알데히드(glutaraldehyde) 40l로 실온에서 30분 동안 고정화시켰다.

장생도라지 메탄올 추출물 0.031, 0.062, 0.125, 0.25, 0.5 및 1 mg/ml의 농도로 한 시간 동안 처리하였을 경우 암세포의 라미닌에의 결합 형태 및 세포형태를 현미경으로 관찰한 결과를 도 1a∼1g에 나타내었다. 도 1에서 나타난 바와 같이 대조구의 경우 vehicle로 사용한 DMSO를 첨가하였을 때에는 암세포가 라미닌에 부착되어 있었고, 메탄올 추출물의 농도가 0.031 및 0.062 mg/ml의 경우에는 각각 30% 및 70% 정도의 세포가 부착하지 못하는 것으로 나타났으며, 메탄올 추출물의 농도가 0.125 mg/ml 이상이 되면 100%의 세포가 라미닌에 부착하지 못하고 구형의 세포형태를 유지하였다. 0.5 mg/ml의 농도에서는 20∼30%의 세포가 세포막 손상을 받았으나 나머지 70%-80%의 세포는 라미닌에 부착하지 못하고 구형의 세포형태를 유지하였으며, 1mg/ml의 농도에서는 암세포의 세포막의 파손이 관찰되었다.

[표 4]

실시예 6 : 장생도라지의 면역증강작용

복수암 및 고형암이 이식된 생쥐를 A군(대조군), B군(일반도라지 투여군), 및 C군(장생도라지 투여군)으로 나누어 3주간 사육하였다. 각 그룹에 속하는 생쥐의 혈액중 NK-cell, T-cell, B-cell, Tc-cell 등 면역세포의 비율을 FAC Scan을 이용하여 조사하였다. 복수암의 경우에는 표 5에 기재된 바와 같이 직접적인 항암효과를 나타내는 NK-cell이 A군의 경우 1.14%이고, B군의 경우 1.52%에 지나지 않으나, 장생도라지를 투여한 C군의 경우에는 6.23%로 약 5.5배 정도 높게 나타났다. 그리고 B-cell도 A군이나 B군보다 C군에서 높게 나타났으며, T-cell은 C군이 비록 약간 낮았지만 오히려 Tc-cell이 높게 나타난 것으로부터 항암효과 나타낸다고 볼 수 있다.

또한 고형암에서는 표 6에 나타낸 것과 같이 NK-cell은 A군의 경우 3.6%, B군의 경우 3.8%인데 반하여 장생도라지를 투여한 C군의 경우에는 4.55%로 높게 나타났다. 그리고 B-cell은 대조군 보다 낮았으나 T-cell과 Tc-cell은 대조구에 비하여 높게 나타난 것으로부터 충분한 항암효과를 나타낸다고 볼 수 있다.

[표 5]

장생도라지의 복수암에 대한 면역활성

[표 6]

장생도라지의 고형암에 대한 면역활성

실시예 7 :

장생도라지추출액과 도라지 함유 한방제제가 류마티스 관절염 치료효능에 미치는 영향

SD-rat의 오른쪽 발바닥에 0.6mg/kg의 열처리된(heat killed) Mycobacterium hlstolyticm을 주사한 후 약 20일 후 양쪽 발의 부종 크기를 측정하여 염증의 저해 정도를 조사하였다. 대조군으로서 부종을 발생시키지 않은 식이군(A군), 부종억제제로서 프레디졸론(predisolone)을 4 mg/day의 양으로 급이한 군(B군), 일반도리지 추출물을 160mg/day의 양으로 급이시킨 군(C군), 14종의 생약재 추출물을 20 mg/day의 양으로 급이한 군(D군), 장생도라지 추출물을 160 mg/day의 양으로 급이한 군(E군), 및 생약재추출물(40 mg/day)과 장생도라지 추출물(160mg/day)을 급이시킨 군(F군)으로 나누어 각각 조사하였다. 각 군에는 6마리의 SD-rat이 포함되도록 하였다. 결과는 표 7에 나타내었다.

[표 7]

장생도라지 추출물 급여군(E군) 및 생약재와 장생도라지 추출물 혼합급여군(F군)에서 부종의 저해능이 우수한 것으로 관찰되었다. 그러나 장생도라지 추출물의 급여량을 200mg/kg으로 증가시키면 유의성 있는 활성이 없는 것으로 나타나 약 100∼200 mg/kg의 범위로 사용하는 것이가장 활성이 있었다. 급여량에 따른 부종저해활성을 조사한 결과 150 mg/kg 용량에서 가장 강한 활성이 나타내었다.

본 발명의 20년근 이상의 장생도라지 추출물로 제조된 한방제제는 2∼4년근의 일반도라지에 비하여 약리작용과 생리활성효능이 우수하며, 세균이나 진균류에 대한 항균활성도 일반도라지에 비하여 월등히 우수하다. 또한 장생도라지 추출물로 제조된 항염중성 치료제는 부종억제활성이 뛰어나 류마티스 관절염과 같은 염증성질환 치료효과가 우수한 발명의 효과를 가진다. 본 발명의 항균제 또는 항염증성 치료제는 생체내에서 독성이 없으며 다른 부작용이 없는 발명의 효과도 가진다.

본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 실시될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.

Claims (3)

1. 장생도라지(20년근 이상의 다년생 도라지)의 열수 또는 유기 용매 추출물을 포함하는 항균성 한방 제제.
2. 장생도라지(20년근 이상의 다년생 도라지)의 열수 또는 유기 용매 추출물을 포함하는 염증성 질환 치료용 한방 제제.
3. 제2항에 있어서, 상기 염증성질환이 류마티스 관절염인 염증성질환 치료용 한방 제제.