KR100550465B1 - 혈관신생 억제 효과를 갖는 장생도라지 추출물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 혈관신생 억제 효과를 갖는 장생도라지 추출물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 암세포의 성장 및 전이에 관련된 신생혈관 생성을 억제시키는 효과를 갖는 장생도라지 추출물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 장생도라지 추출물은 혈관신생에 관련된 세포 이동, 세포 부착, 세포 침투 및 튜브 형성을 억제하여, 이를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 억제제는 암의 예방 및 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

혈관신생, 장생도라지, 튜브 형성, 세포 침투, 세포 부착, 세포 이동

Description

혈관신생 억제 효과를 갖는 장생도라지 추출물{old platycodon extracts for prevention angiogenesis associated with growth and metastasis of cancer cells }

도 1은 장생도라지 추출물의 처리농도에 따른 인간 내피세포에 부착된 암세포 개수를 그래프로 나타낸 것이다.

도 2는 대조군과 장생도라지 추출물 800㎍/㎖ 처리하였을 때 matrigel에 침투된 상태의 세포를 사진 촬영한 것이다.

도 3은 장생도라지 추출물의 처리농도에 따른 세포막 침투능 억제 효과를 그래프로 나타낸 것이다.

도 4는 팁을 사용하여 암세포주를 제거한 후 그 빈 공간에 이동한 암세포주를 사진 촬영한 것이다.

도 5는 장생도라지 추출물의 처리농도에 따른 인체 암세포주의 이동세포 수를 그래프로 나타낸 것이다.

도 6은 matrigel에 튜브 형성된 혈관내피세포주를 사진 촬영한 것이다.

도 7은 장생도라지 추출물 처리농도에 따른 혈관내피세포주의 튜브형성율을 그래프로 나타낸 것이다.

본 발명은 혈관신생 억제 효과를 갖는 장생도라지 추출물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 암세포의 성장 및 전이에 관련된 신생혈관 생성을 억제시키는 효과를 갖는 장생도라지 추출물에 관한 것이다.

도라지는(길경 Platycodon grandiflorum A. DC) 도라지과(Campanulaceae)의 식물로 주근이 10 ∼ 15cm 내외이고 지름은 1 ∼ 3cm 이며 윗부분에는 불규칙한 줄기 자리가 있고 회갈∼유백색이며 세로 주름이 깊고, 가로로는 파목(皮目)과 주름이 있다. 질은 단단하나 비섬유성이어서 파절이 쉽고 약간의 냄새가 나며 맛은 아리다. (육창수 등, 현대 생약학, 서울, 학창사, 460-461, 1993)

이러한 도라지의 주요 약리성분은 트리테르펜계 사포닌(platycodin A, C, D, D₂, D₃)으로서 뿌리의 약 2%를 차지하며, 이 약리성분은 동물실험을 통하여 진해, 거담작용, 중추신경억제작용(진정, 진통, 해열효과), 급·만성 염증에 대한 항염증작용, 항궤양 및 위액분비억제작용, 혈관을 확장하여 혈압을 낮추는 항콜린작용, 혈당강하작용, 콜레스테롤 대사 개선작용 등이 있는 것으로 밝혀져 있다(Chem. Pharm. Bull., 20, 1952(1972), Chem. Pharm. Bull., 23, 2965(1975), J. Chem. Soc., Perkin trans I, 661(1984), Sogoigaku, 3, 1(1951), J. Pharm. Soc. Kor., 19, 164(1975)). 또한 알파-스피나스테롤, 스티그마스트-7-엔올, 알파-스피나스테롤글루코시드 등과 같은 스테로이드계 화합물과 이눌린, 베튤린과 같은 다당류도 도라지의 약리성분으로 단리되었다.

장생도라지(長桔)는 20년근 이상의 도라지를 말하는 것으로, 그 동안 도라지의 다양한 약리작용에도 불구하고, 장기간 재배가 어려웠으나, 최근 20년 이상의 도라지인 장생도라지를 재배할 수 있는 기술이 개발되어(이성호, "다년생 도라지재배법" 대한민국 특허 제045731호) 다량생산이 가능해졌다. 이러한 장생도라지는 2∼4년근의 일반도라지에 비해 약리작용과 생리활성효능이 우수하다.

현재까지 장생도라지에 관한 연구는 항당뇨효과에 관한 실험(J. Korean Soc. Food Sci. Nutr., 25, 986(1996)), 고지혈증에 관한 실험(J. Pharmaceutical Society of Japan 93(1973) 1188-1194) 등이 있으며, 간 예방 및 손상억제에 대한 연구 등이 계속되고 있다. 이외에도 도라지의 열수 및 에탄올 추출물은 곰팡이의 아프라톡신을 억제하며, 이눌린 분획은 식균작용과 고형암 및 복수암에 대한 강력한 항종양효능이 있고, 40% 도라지엑기스는 알코올흡수 억제작용이 있는 것으로 알려져 있다 (Mycopathologia, 66, 16(1979), Shoyakugaku Zasshi, 40, 367(1986), Shoyakugaku Zasshi, 40, 375(1986), JP60-89427(1985)).

암이 치명적으로 인식되는 이유는 고형암의 경우 의학적 진단이 가능한 크기의 원발암 덩어리보다는 숨어있는 미세한 크기의 전이암의 위협 때문이라 할 수 있다. 혈관을 따라 전이된 암은 원발암이 외과적으로 제거되었다 하더라도 조건만 갖춰지면 언제든지 새로운 기관이나 조직 내에 증식하여 새로운 암을 유발할 수 있다. 따라서 실제로 암의 치료확률이 50%만 넘어도 양호한 것으로 여겨지고 있으며, 외과적 수술이나 기타 항암요법이 적용 가능한 암은 그 종류나 치료시기, 또는 환자의 상태에 따라 극히 제한적일 수밖에 없다.

한편, 암조직이 커지기 위해서는 산소 및 영양분의 공급이 요구되며, 이러한 공급통로를 만들기 위해 혈관신생(angiogenesis)이 수반된다. 암조직에서 혈관신생과정을 보면, 먼저 암세포가 혈관신생 유도인자를 분비하며 이러한 유도인자가 내피세포에 존재하는 수용체와 결합을 하면서 새로운 혈관의 형성과정이 시작된다. 자극된 내피세포는 성장하기 시작하면서 단백질가수분해효소를 분비하게 되고 이러한 단백질가수분해효소에 의해 기저막(base membrane)의 분해가 일어나 내피세포가 혈관신생 유도인자가 나오는 곳으로 향하여 움직이게 된다(세포 이동). 이렇게 이동한 내피세포는 혈관 사이에 붙은 후(세포 부착) 침투할 장소로 이동후 기저막을 뚫고 들어가(세포 침투) 서로 연결되어 튜브를 형성하며(튜브형성) 마지막으로 24개의 속이 빈 sprouts의 끝이 결합하면서 루프가 형성되고 이곳으로 혈액이 들어오게 된다. 즉 이러한 일련의 과정 중 어느 하나가 차단되어 지면, 혈관신생을 감소시킬 수 있어 항암효과를 기대할 수 있다.

또한 이 신생혈관을 통해 암세포가 다른 조직으로 전이되므로, 암의 성장과 전이에 필수적인 혈관신생과정을 조절하는 것이 새로운 암 치료방법으로 인식되고 있다.

본 발명의 목적은 안전하고 독성이 없는 천연물인 장생도라지 추출물을 활성성분으로 포함하여 암세포의 성장 및 전이과정에서 발생되는 혈관신생을 억제하는 치료제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 장생도라지의 추출물을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 억제제를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명자들은 안전하고 독성이 없는 천연물로부터 암세포의 성장 및 전이에 관련된 혈관신생을 억제하는 제제를 연구하던 중, 장생도라지의 추출물이 인체 암세포주의 신생혈관생성과 관련된 세포 이동, 세포 부착, 세포 침투 및 튜브 형성을 억제함을 확인하고, 이를 토대로 본 발명을 완성하였다.

본 발명에 따른 장생도라지 추출물은 이 분야에서 통상적으로 사용되는 방법에 따라 제조된다. 장생도라지 추출물은 열수 추출물 또는 유기용매 추출물인 것이 바람직하며, 이러한 추출물은 단독으로 또는 허용 가능한 생약재를 첨가하여 제조될 수 있다. 일반적으로 장생도라지 추출시 장생도라지 분말을 사용하는데, 장생도라지 분말은 수분의 함량이 5％ 이하가 되도록 장생도라지를 건조하여 이를 분쇄한 다음, 입자 크기가 0.6mm이하 인 것을 선별하여 사용하는 것이 바람직하다.

열수추출물은 장생도라지 분말에 약 5∼10배의 물을 첨가하고 90∼100℃의 온도에서 4∼6시간 동안 2회 추출하여 얻은 여과액을 그대로 사용하거나 허용 가능한 생약재 또는 생약재 추출물을 선택적으로 첨가하여 사용하는 것이 바람직하다.

유기용매 추출물은 장생도라지 분말에 약 3배의 유기용매를 첨가하고 실온에서 2회 추출하여 얻어진 여과액을 감압 농축하여 추출물에 허용 가능한 생약재 또는 생약재 추출물을 선택적으로 첨가하여 제조된다. 유기용매로는 알코올이 사용될 수 있으며 메탄올, 에탄올이 바람직하게 사용될 수 있다.

본 발명의 장생도라지 추출물은 식품위생법상 또는 약제학적으로 허용가능한 보형제를 이용하는 공지의 방법으로 제제화되어 통상적인 방법에 따라 약학 제형을 제조할 수 있다. 제형의 제조에 있어, 활성 성분이 장생도라지 추출물을 담체와 함께 혼합 또는 희석하거나, 용기 형태의 담체 내에 봉입시키는 것이 바람직하다. 담체가 희석제로 사용되는 경우에는 활성 성분에 대한 비히클(Vehicle), 부형제 또는 메디움(Medium)으로 작용하는 고형, 반고형 또는 액상의 물질일 수 있다. 따라서 제형은 정제. 환제, 분제, 엘릭시르, 현탁제, 유제, 용액제, 시럽제, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀제, 멸균 주사제, 멸균 분제 등의 형태일 수 있다. 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토즈(lactose), 덱스트로즈(dextrose), 수크로즈(sucrose), 소르비톨(sorbitol), 만니톨(mannitol), 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈 (polyvinylpyrrolidone), 물, 메틸하이드록시벤조에이트(methylhydroxybenzoate), 프로필하이드록시벤조에이트(propylhydroxybenzoate), 탈크(talc), 마그네슘 스타아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제형은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 장생도라지 추출물을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 억제제는 포유동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.

본 발명에 따른 장생도라지 추출물을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 억제제는 목적하는 바에 따라 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 사람의 경우 통상적인 1일 투여량은 10 내지 1,000 mg/kg체중, 바람직하게는 10 내지 100 mg/kg체중의 범위일 수 있고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 실제 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 건강상태 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 한다.

이하 실시예 및 실험예로서 본 발명을 상세히 설명한다.

그러나 하기한 실시예는 본 발명의 바람직한 일 실시예일 뿐 본 발명이 하기 한 실시예에 한정되는 것은 아니다.

(실시예 1)

(장생도라지 열수 추출물의 제조)

장생도라지 분말 0.2㎏에 증류수 2ℓ를 가하고 90∼95℃에서 5시간 동안 2회 추출한 후 여과하고 이를 동결 건조하여 장생도라지 추출물 100 g 얻었다.

이하, 본 발명의 혈관신생 억제제의 인체 암세포의 신생혈관 생성관련 튜브 형성(tube formation)억제효과, 세포 침투능(invasion) 억제효과, 세포 부착율(adhesion) 억제효과, 및 세포 이동율(migration) 억제 효과를 알아보기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.

(실험예 1)

(인간의 내피세포(HMEC-1)에 대한 임파구 암세포(HL-60)세포의 부착억제효과)

1. 시약

시약은 다음의 것을 구입하여 사용하였다.

인체 암세포주인 HT-1080, HMEC-1 및 HL-60 세포주는 한국세포주은행에서 구입하였고, Matrigel, RPMI-1640 배양액, Calcein-AM, Trypsin, Fetal bovine serum 은 시그마사 (Sigma chemical co)에서 구입하였다.

2. 실험방법

장생도라지 추출물의 인간의 내피세포 HMEC-1에 대한 임파구 암세포 HL-60세포의 부착억제효과를 조사하기 위하여, 48 well-plate에 HMEC-1 세포를 seeding한 후 장생도라지 추출물들을 24시간 전처리하였다. 그 다음 HL-60세포를 형광물질 (Calcein-AM)로 표식 시킨 후 6시간 동안 HMEC-1세포와 형광물질 (Calcein-AM)로 표식된 HL-60을 공동 배양하였다. 배양액을 제거하고, PBS로 2번 세척 후 형광 현미경으로 관찰하여 부착된 HL-60 세포수를 계수하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1은 장생도라지 추출물의 처리농도에 따른 인간 내피세포에 부착된 암세포 개수를 그래프로 나타낸 것이다. 도 1을 참조하면, 대조군(control)과 혈관신생촉인인자(V-EGF)처리한 군에 비해, 장생도라지 추출물을 처리한 군이 인간의 내피세포인 HMEC-1에 대한 HL-60세포의 부착율이 억제됨을 확인할 수 있었으며, 장생도라지 처리농도(CK100:100㎍/㎖, CK200:200㎍/㎖, CK500:500㎍/㎖)에 의존하여 부착율이 억제됨을 확인하였다.

(실험예 2)

(장생도라지 추출물들의 인체 암세포주 (HT-1080)의 세포 및 세포막 침투능 억제효과)

1. 실험방법

장생도라지 추출물의 세포막 침투능 억제 효과를 조사하기 위하여 암세포주 HT-1080을 matrigel 코팅이 되어있는 48 well plate에 계대 배양 후, 각 농도별 시료를 넣고 18시간 후에 세포침투 상태를 현미경 관찰을 통해 침투한 HT-1080 세포를 계수하였다. 그 결과를 도 2 및 도 3에 나타내었다.

도 2는 대조군과 장생도라지 추출물 800㎍/㎖ 처리하였을 때 matrigel에 침투된 상태의 세포를 사진 촬영한 것이다. 도 3은 장생도라지 추출물의 처리농도에 따른 세포막 침투능 억제 효과를 그래프로 나타낸 것이다. 도 3을 참조하면, 장생도라지를 처리하지 아니한 대조군과 비교하여, 장생도라지의 농도를 100㎍/㎖, 200㎍/㎖, 400㎍/㎖, 800㎍/㎖ 처리함에 따라 세포 및 세포막 침투능 억제효과가 장생도라지 처리농도에 의존하여 억제효과가 나타남을 확인하였다.

(실험예 3)

(장생도라지 추출물들의 인체 암세포주인 HT-1080의 세포이동 억제효과)

1. 실험방법

시료의 인체 암세포주인 HT-1080에 대한 세포이동 억제효과를 조사하기 위하 여 HT-1080을 48well plate에 계대배양 후 Blue tip 끝을 사용하여 상처를 입힌 다음, 6시간 후에 HT-1080의 이동세포를 현미경관찰을 통하여 계수하였다. 그 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다.

도 4는 팁을 사용하여 암세포주를 제거한 후 그 빈 공간에 이동한 암세포주를 사진 촬영한 것이다. 도 5는 장생도라지 추출물의 처리농도에 따른 인체 암세포주의 이동세포 수를 그래프로 나타낸 것이다. 도 5를 참조하면, 인체 암세포주인 HT-1080의 세포 이동율이 장생도라지 추출물의 처리농도에 의존하여 유의성 있게 억제됨을 확인할 수 있었다.

(실험예 4)

(장생도라지 추출물의 혈관신생 억제 효과)

1. 실험방법.

시료에 인체 혈관내피세포주인 HMEC-1에 대한 혈관신생 억제효과를 조사하기 위하여 HMEC-1을 matrigel이 코팅되어 있는 48 well plate에 계대 배양한 후, 각 농도별 시료를 넣고 18시간 후에 혈관신생(튜브형성)을 현미경 관찰하였다. 양성 대조군으로 혈관신생 촉진제인 VEGF를 처리하였다. 그 결과를 도 6및 도 7에 나타내었다.

도 6은 matrigel에 튜브 형성된 혈관내피세포주를 사진 촬영한 것이다. 대조군과 혈관신생촉진인자를 처리한 군과 비교하여 장생도라지 추출물을 처리한 군이 튜브 형성이 억제되며, 장생도라지 처리농도에 의존하여 튜브 형성이 억제됨을 알 수 있었다. 도 7은 장생도라지 추출물 처리농도에 따른 혈관내피세포주의 튜브형성율을 그래프로 나타낸 것이다. 도 7을 참조하면, 혈관내피세포주인 HMEC-1의 신생혈관 생성시 튜브형성(tube formation)이 장생도라지 처리농도에 의존하여 유의성 있게 억제됨을 확인하였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 인체 혈관내피세포주인 HMEC-1을 이용하여 튜브 형성에 대한 장생도라지 추출물들의 효과를 조사한 결과 장생도라지 추출물 처리농도에 의존적으로 인체 혈관내피세포주인 HMEC-1의 튜브 형성율이 감소하였으며, 인체 암세포주인 HT-1080을 이용하여 세포 침투능에 대한 장생도라지 추출물들의 효과를 조사한 결과 장생도라지 추출물들 처리농도에 의존적으로 인체 암세포주인 B16F10의 세포 침투능이 현저히 감소하였다. 또한 암세포주인 HT-1080의 이동율을 측정한 결과 암세포주인 HT-1080의 이동율이 장생도라지 추출물 처리농도 의존적으로 감소함을 확인하였다. 한편 인간의 내피세포인 HMEC-1세포에 HL-60세포가 부착하는 정도를 측정한 결과 장생도라지 추출물들이 HMEC-1세포에 HL-60 세포 부착율이 처리농도 의존적으로 감소하였다.

즉, 본 발명에 따른 장생도라지 추출물은 내피세포가 혈관신생 유도인자가 나오는 곳을 향하여 움직이는 세포 이동, 이동한 내피세포가 혈관 사이에 붙는 세포 부착, 내피세포가 혈관사이에 붙은 후 침투할 장소로 이동 후 기저막을 뚫고 들어가는 세포 침투, 내피세포가 서로 연결되어 튜브를 형성하는 튜브 형성과정을 모두 억제함으로써 암세포의 혈관신생을 억제하여 항암효과를 나타낼 수 있다.

(실험예 5)

(급성독성실험)

1. 경구투여

ICR계 마우스(25g)를 10마리씩 5군으로 나누어 본 발명에 따른 장생도라지 추출물을 각각 1, 5, 25, 125, 625mg/kg의 용량으로 경구 투여한 후 2주간 독성여부를 관찰한 결과, 5군 모두에서 사망예가 한 마리도 없었다.

2. 복강투여

ICR계 마우스(25g)를 10마리씩 4군으로 나누어 본 발명에 따른 장생도라지 추출물을 각각 0.2, 2, 20, 200mg/kg의 용량으로 복강 투여한 후 24시간 동안 독성여부를 관찰한 결과 4군 모두에서 사망예가 한 마리도 없었다.

이상의 결과에서 본 발명의 장생도라지 추출물은 급성독성이 거의 없음을 확인하였다.

다음에 제제실시예로서 본 발명에 따른 장생도라지 추출물을 유효성분으로 포함하는 항암제의 제제화를 예시한다. 본 발명에 따른 항암제가 다음의 제제예에 의해 한정되는 것은 아니다.

(제제실시예 1)

(정제의 제조)

장생도라지 추출물 50mg

유당 20mg

전분 20mg

스테아르산마그네슘 적량

장생도라지 추출물을 유효성분으로 하여 상기의 성분을 통상의 정제방법에 따라 타정하여 정제를 제조하였다.

(제제실시예 2)

(캅셀제의 제조)

장생도라지 추출물 50mg

유당 20mg

전분 20mg

탈크 1mg

스테아르산마그네슘 적량

장생도라지 추출물을 유효성분으로 하여 상기의 성분을 통상의 정제방법에 따라 젤라틴 캅셀에 충진하여 캅셀제를 제조하였다.

이와 같이 본 발명은 안전하고 독성이 없는 천연물인 장생도라지 추출물을 활성성분으로 포함하는 혈관신생 억제제는 외부 물질이나 바이러스 감염에 의해 발생되는 암세포의 성장 및 전이과정에 관련된 혈관신생 억제제로써 암의 치료 및 예방에 임상적으로 유용하게 사용할 수 있을 것이다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 장생도라지 추출물은 암세포의 성장 및 전이에 관련된 세포 이동, 세포 부착 및 세포 침투를 억제하고 혈관내피세포의 튜브 형성을 억제하여 혈관신생을 억제함으로써, 이를 유효성분으로 포함하는 항암제는 암의 예방 및 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (2)

1. 장생도라지의 추출물을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 억제제.
2. 제1항에서, 상기 장생도라지의 추출물은,

   열수추출물인 것을 특징으로 하는 혈관신생 억제제.

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