JPH02172921A - 抗腫瘍剤の製造法 - Google Patents
抗腫瘍剤の製造法Info
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- JPH02172921A JPH02172921A JP63328147A JP32814788A JPH02172921A JP H02172921 A JPH02172921 A JP H02172921A JP 63328147 A JP63328147 A JP 63328147A JP 32814788 A JP32814788 A JP 32814788A JP H02172921 A JPH02172921 A JP H02172921A
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Landscapes
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
(産業上の利用骨!F)
本発明は、桔梗(■虹匹剋並 ■並鮭■虻肋^、OC,
)根由来のイヌリン物質を有効成分とする抗腫瘍剤の製
造方法に関する。
)根由来のイヌリン物質を有効成分とする抗腫瘍剤の製
造方法に関する。
(従来の技術)
近年、多くの癌化学療法剤が開発され臨床の場で利用さ
れている。これらの化学療法剤は、ある程度の臨床効果
を有するものの1重篤な副作用を引き起こすことが多い
。例えば、マイトマイシンCによる腎不全、アドリアマ
イシンやカルバジルキノンによる骨髄機能抑制作用があ
げられる。強い抗腫瘍作用を有し、安全性が高く、かつ
経口投与の可能な抗腫瘍剤が望まれている。
れている。これらの化学療法剤は、ある程度の臨床効果
を有するものの1重篤な副作用を引き起こすことが多い
。例えば、マイトマイシンCによる腎不全、アドリアマ
イシンやカルバジルキノンによる骨髄機能抑制作用があ
げられる。強い抗腫瘍作用を有し、安全性が高く、かつ
経口投与の可能な抗腫瘍剤が望まれている。
ところで、一般に、漢方薬は作用が穏やかであり、これ
らのなかには抗腫瘍作用を有することが期待される物質
も存在する。特開昭60−89427号公報には1毛状
根由来のイヌリン物質が比較的強い腫瘍作用を示し、し
かもその毒性が極めて弱いことが示されている。桔梗根
は、古くから利用されている漢方薬のひとつであり、止
血、排膿、去痰および鎮咳作用を有することが知られて
おり、特に化膿性疾患の治療に用いられるυ1膿敗や排
膿湯の主薬として用いられている。上記公報においては
、イヌリン物質は桔梗根の温水抽出液をアセトン処理す
ることにより得られている。しかし、天然の桔梗根が含
有する有効成分の量は極めて少量であり、かつ、該植物
体の栽培される地方の気候。
らのなかには抗腫瘍作用を有することが期待される物質
も存在する。特開昭60−89427号公報には1毛状
根由来のイヌリン物質が比較的強い腫瘍作用を示し、し
かもその毒性が極めて弱いことが示されている。桔梗根
は、古くから利用されている漢方薬のひとつであり、止
血、排膿、去痰および鎮咳作用を有することが知られて
おり、特に化膿性疾患の治療に用いられるυ1膿敗や排
膿湯の主薬として用いられている。上記公報においては
、イヌリン物質は桔梗根の温水抽出液をアセトン処理す
ることにより得られている。しかし、天然の桔梗根が含
有する有効成分の量は極めて少量であり、かつ、該植物
体の栽培される地方の気候。
土壌、栽培条件などにより含有成分量が変動しやすい。
従って、天然の桔梗根からイヌリン物質を抽出して医薬
品として供するのは必ずしも効果的な方法とはいえない
。イヌリン物質を効果的に生産することができれば、安
全で抗腫瘍作用の高い製剤が安価で提供されると考えら
れる。
品として供するのは必ずしも効果的な方法とはいえない
。イヌリン物質を効果的に生産することができれば、安
全で抗腫瘍作用の高い製剤が安価で提供されると考えら
れる。
(発明が解決しようとする課題)
本発明は、上記従来の問題点を解決するものであり、そ
の目的とするところは、高い抗腫瘍作用を有し安全な抗
腫瘍剤を製造する方法を提供することにある。本発明の
他の目的は、桔梗根由来で高い抗腫瘍効果を示すイヌリ
ン物質を効果的に得る方法を提供することにある。
の目的とするところは、高い抗腫瘍作用を有し安全な抗
腫瘍剤を製造する方法を提供することにある。本発明の
他の目的は、桔梗根由来で高い抗腫瘍効果を示すイヌリ
ン物質を効果的に得る方法を提供することにある。
(課題を解決するための手段)
本発明の抗腫瘍剤の製造方法は、桔梗(旦m閃匹紅並牡
旦匹憇^、 DC,)由来の植物培養細胞または形質転
換細胞を培養し、該培養物からイヌリン物質を主成分と
する抗腫瘍剤を得ることを包含し。
旦匹憇^、 DC,)由来の植物培養細胞または形質転
換細胞を培養し、該培養物からイヌリン物質を主成分と
する抗腫瘍剤を得ることを包含し。
そのことにより上記目的が達成される。
本発明に使用される桔梗由来の植物培養細胞としては、
桔梗植物体の組繊片または細胞から誘導されたカルスま
たは分化根がある。形質転換細胞としては、桔梗植物体
の組織片または細胞に毛状病菌を感染させて得られる。
桔梗植物体の組繊片または細胞から誘導されたカルスま
たは分化根がある。形質転換細胞としては、桔梗植物体
の組織片または細胞に毛状病菌を感染させて得られる。
もしくは毛状病菌から単離されるRjプラスミド(Rt
プラスミド由来の組み換え体プラスミドを含む)により
形質転換されて得られる毛状根がある。
プラスミド由来の組み換え体プラスミドを含む)により
形質転換されて得られる毛状根がある。
上記カルスを得るには、まず桔梗の芽生え(幼植物)の
根1杯軸、子葉;成熟植物の根、茎2葉。
根1杯軸、子葉;成熟植物の根、茎2葉。
花、花粉、などの細胞群または1組織片を出発材料とし
て採取する。上記細胞群または組織片としていずれの部
分を選択しても、カルスの誘導の難易の差はあるが、い
ずれもカルスが誘導され得る。
て採取する。上記細胞群または組織片としていずれの部
分を選択しても、カルスの誘導の難易の差はあるが、い
ずれもカルスが誘導され得る。
これらの細胞群または組織片を1例えば適当な培地を用
いて無菌的に培養することによりカルスが生じる。使用
される培地としては、植物の培養に使用される培地がい
ずれも使用され得る。これには例えば、 MS (Mu
rashige−Skoog)培地、 LS(Lins
maier−5koog )培地、 Whiteの培地
、 Gamborgの培地。
いて無菌的に培養することによりカルスが生じる。使用
される培地としては、植物の培養に使用される培地がい
ずれも使用され得る。これには例えば、 MS (Mu
rashige−Skoog)培地、 LS(Lins
maier−5koog )培地、 Whiteの培地
、 Gamborgの培地。
He1lerの培地、 N1tch−NiLchの培地
などがある。
などがある。
固体培地、液体培地のいずれもが利用されるが。
通常、寒天を含む固体培地が好適に用いられる。
上記培地中には1通常、カルスの誘導を促進するための
植物ホルモン、特にオーキシンが含有される。オーキシ
ン類としては、2,4−ジクロロフェノキシ酢酸(2,
4−D)、ナフタレン酢酸(NAA)。
植物ホルモン、特にオーキシンが含有される。オーキシ
ン類としては、2,4−ジクロロフェノキシ酢酸(2,
4−D)、ナフタレン酢酸(NAA)。
2.4.5− )リクロロフエノキシ酢酸(2,4,5
−T)。
−T)。
インドール酢酸(IAA)、 インドール酪酸(IBA
)などがある。植物ホルモンとして、サイトカイニン
類が含有されてもよく、それには、ゼアチン。
)などがある。植物ホルモンとして、サイトカイニン
類が含有されてもよく、それには、ゼアチン。
6−ベンジルアデニン、カイネチン、リボシルゼアチン
、イソペンテニルアデニンなどがある。植物ホルモンは
、上記オーキシン類が101M〜10−’Hの割合で、
サイトカイニン類が10− @M〜10−’Hの割合で
培地中に含有される。例えば、オーキシン類とサイトカ
イニン類とを含む寒天培地上で、20〜30°Cの暗所
にて10〜30日間培養を行うとカルスが形成される。
、イソペンテニルアデニンなどがある。植物ホルモンは
、上記オーキシン類が101M〜10−’Hの割合で、
サイトカイニン類が10− @M〜10−’Hの割合で
培地中に含有される。例えば、オーキシン類とサイトカ
イニン類とを含む寒天培地上で、20〜30°Cの暗所
にて10〜30日間培養を行うとカルスが形成される。
このようにして誘導されたカルスは、固体もしくは液体
培地を用いて継代培養がなされる。液体培地を用いた振
盪培養が有利である。例えば、上記組成の液体培地にカ
ルスを加え、20〜30°C1好ましくは27°C前後
で50〜150rpn+、好ましくは110rpm前後
の割合で振盪培養が行われる。光は照射してもしなくて
もよい。通常週1回の割合で新しい培地に植え継ぎ、継
代培養が行われる。後述の方法により抗X1m活性が高
く、かつ増殖の速いセルラインを選択して継代培養を行
う。
培地を用いて継代培養がなされる。液体培地を用いた振
盪培養が有利である。例えば、上記組成の液体培地にカ
ルスを加え、20〜30°C1好ましくは27°C前後
で50〜150rpn+、好ましくは110rpm前後
の割合で振盪培養が行われる。光は照射してもしなくて
もよい。通常週1回の割合で新しい培地に植え継ぎ、継
代培養が行われる。後述の方法により抗X1m活性が高
く、かつ増殖の速いセルラインを選択して継代培養を行
う。
上記桔梗の分化根は1例えば2次のようにして上記カル
スから誘導される。まず、上記植物ホルモンを含む培地
で誘導されたカルスを2〜3代にわたって継代培養する
。次いで、オーキシンの濃度を当初の培地の約5倍に、
そしてサイトカイニンの濃度を約115とした固体培地
に、上記カルスを移す。これを暗所で培養することによ
り分化板が誘導される。得られた分化板は固体もしくは
液体培地で継代培養し、抗腫瘍活性が高く、かつ増殖の
速いセルラインが選択される。
スから誘導される。まず、上記植物ホルモンを含む培地
で誘導されたカルスを2〜3代にわたって継代培養する
。次いで、オーキシンの濃度を当初の培地の約5倍に、
そしてサイトカイニンの濃度を約115とした固体培地
に、上記カルスを移す。これを暗所で培養することによ
り分化板が誘導される。得られた分化板は固体もしくは
液体培地で継代培養し、抗腫瘍活性が高く、かつ増殖の
速いセルラインが選択される。
上記桔梗の毛状根を得るために使用される毛根病菌とし
ては2例えば、アグロバクテリウム(m舅す旦卦狂iu
m )属に属するアグロバクテリウムリゾゲネス(A
robacterium n圏皿叩照)が用いられる
。アグロバクテリウム リゾゲネスA−4株(農林水産
省指令 7−名植第386号(昭和57年3月8日))
などが容易に人手可能である。
ては2例えば、アグロバクテリウム(m舅す旦卦狂iu
m )属に属するアグロバクテリウムリゾゲネス(A
robacterium n圏皿叩照)が用いられる
。アグロバクテリウム リゾゲネスA−4株(農林水産
省指令 7−名植第386号(昭和57年3月8日))
などが容易に人手可能である。
この毛根病菌を上記植物に感染させて毛状根を得るには
1次の方法が採用され得る:(a)植物体に茎部に傷を
つけて毛根病菌を接種する;(b)植物体の根茎部を輪
切りにして得たディスクの断面に毛根病菌を塗布する;
(C)表面を殺菌した種子を無菌的に発芽させた芽生え
に毛根病菌を接種する;または、(d)植物体から上記
のようにカルスを誘導し、該カルスに毛根病菌を接触さ
せる。毛根病菌の感染は、自然状態で生育している植物
に対して行なうことも可能であるが、上記方法のいずれ
においても無菌状態において接種することが望ましい。
1次の方法が採用され得る:(a)植物体に茎部に傷を
つけて毛根病菌を接種する;(b)植物体の根茎部を輪
切りにして得たディスクの断面に毛根病菌を塗布する;
(C)表面を殺菌した種子を無菌的に発芽させた芽生え
に毛根病菌を接種する;または、(d)植物体から上記
のようにカルスを誘導し、該カルスに毛根病菌を接触さ
せる。毛根病菌の感染は、自然状態で生育している植物
に対して行なうことも可能であるが、上記方法のいずれ
においても無菌状態において接種することが望ましい。
上記方法のいずれにおいても、使用される毛根病菌は、
使用に先立って培養を行ない、対数増殖期とし、これを
用いることが望ましい。例えば。
使用に先立って培養を行ない、対数増殖期とし、これを
用いることが望ましい。例えば。
アグロバクテリウム リゾゲネスを肉汁培地(Nu−t
rient broth n+ediu+w)、 YM
B培地(J、Gen、 Microbiol、 、 9
8.477−484 (1977)に記載)などの増殖
培地に植菌し、25〜28°Cにて24〜30時間振盪
培養して対数増殖期の菌を含む培養物(菌体濃度約10
″〜101′個/Idl)を得る。この培養物をそのま
ま用いてもよいが、遠心分離により集菌した菌体を適当
な緩衝液に懸濁して菌体濃度を約10’〜IQ11個/
mlに調整するのが好適である。
rient broth n+ediu+w)、 YM
B培地(J、Gen、 Microbiol、 、 9
8.477−484 (1977)に記載)などの増殖
培地に植菌し、25〜28°Cにて24〜30時間振盪
培養して対数増殖期の菌を含む培養物(菌体濃度約10
″〜101′個/Idl)を得る。この培養物をそのま
ま用いてもよいが、遠心分離により集菌した菌体を適当
な緩衝液に懸濁して菌体濃度を約10’〜IQ11個/
mlに調整するのが好適である。
上記(a)〜(d)の方法により毛状根を誘導する場合
においては、滅菌処理した培地を用いることが好ましい
。その培地組成は、上記カルスの誘導培地とほぼ同様で
あるが、植物ホルモンを全く含有しないことが特徴であ
る。炭素源としてはシヨ糖、ブドウ糖、麦芽糖などを含
有することが好ましく、特にシg糖が好適に用いられる
。その濃度は通常1〜10%、好ましくは3〜5%であ
る。固体培地、液体培地のいずれもが利用されるが1通
常、寒天を含む固体培地が好適に用いられる。培地のp
Hは、ρ■4〜6の弱酸性が好ましい。
においては、滅菌処理した培地を用いることが好ましい
。その培地組成は、上記カルスの誘導培地とほぼ同様で
あるが、植物ホルモンを全く含有しないことが特徴であ
る。炭素源としてはシヨ糖、ブドウ糖、麦芽糖などを含
有することが好ましく、特にシg糖が好適に用いられる
。その濃度は通常1〜10%、好ましくは3〜5%であ
る。固体培地、液体培地のいずれもが利用されるが1通
常、寒天を含む固体培地が好適に用いられる。培地のp
Hは、ρ■4〜6の弱酸性が好ましい。
上記培地上に1例えば、無菌処理した植物体根茎部のデ
ィスクやカルスを置床し、これに毛根病菌を感染させる
。通常20〜30℃、好ましくは25〜27°Cで培養
を行うと9毛状根が誘導される。誘導された毛状根は1
例えば、上記のような固体培地で継代培養を数回繰り返
した後2液体培地に替えて培養を行う。培養条件は固体
培地の場合と同様でよいが1毛状根を傷っけな、いよう
な条件が好ましい。この培養に用いられる培養装置とし
ては。
ィスクやカルスを置床し、これに毛根病菌を感染させる
。通常20〜30℃、好ましくは25〜27°Cで培養
を行うと9毛状根が誘導される。誘導された毛状根は1
例えば、上記のような固体培地で継代培養を数回繰り返
した後2液体培地に替えて培養を行う。培養条件は固体
培地の場合と同様でよいが1毛状根を傷っけな、いよう
な条件が好ましい。この培養に用いられる培養装置とし
ては。
エアリフト型、旋回型、気相培養装置などが挙げられる
。このように継代培養された毛状根がら抗腫瘍活性が高
(、かつ増殖の速いセルラインが選択される。
。このように継代培養された毛状根がら抗腫瘍活性が高
(、かつ増殖の速いセルラインが選択される。
上記毛状根は1毛根病菌の菌体内に存在するR4(Ro
ot−inducing)プラスミドが植物体細胞(カ
ルスを含む)内に導入され、該RiプラスミドロN^の
一部であるT−DNA領域が該植物体細胞の染色体DN
Aに組み込まれ、その結果、植物体細胞が形質転換され
ることにより誘導される。従って1毛根病菌から遺伝子
工学の一般的手法によりRiプラスミドを単離し、これ
を上記植物体細胞内に導入することによっても毛状根が
誘導される。さらに、単離されたRiプラスミドを改変
して得られるRiプラスミド由来のプラスミド(T−D
NAjJi域を有する)を用いることも有効である。
ot−inducing)プラスミドが植物体細胞(カ
ルスを含む)内に導入され、該RiプラスミドロN^の
一部であるT−DNA領域が該植物体細胞の染色体DN
Aに組み込まれ、その結果、植物体細胞が形質転換され
ることにより誘導される。従って1毛根病菌から遺伝子
工学の一般的手法によりRiプラスミドを単離し、これ
を上記植物体細胞内に導入することによっても毛状根が
誘導される。さらに、単離されたRiプラスミドを改変
して得られるRiプラスミド由来のプラスミド(T−D
NAjJi域を有する)を用いることも有効である。
上記方法により得られた植物培養細胞(カルスまたは分
化板)や形質転換細胞(毛状根)から適当な溶媒による
抽出によりイヌリン物質が得られる。例えばまず、必要
に応じて上記細胞を乾燥し。
化板)や形質転換細胞(毛状根)から適当な溶媒による
抽出によりイヌリン物質が得られる。例えばまず、必要
に応じて上記細胞を乾燥し。
水もしくは水系溶媒で抽出する。抽出液に水と混和し得
る有機溶媒(例えば、アセトン、アルコール、アセトニ
トリル)を加えて放置すると、イヌリン物質が沈澱物と
して析出する。この沈澱物を再び水に溶解させ、上記有
機溶媒を加えて放置することにより沈澱物が析出し、精
製されたイヌリン物質が得られる。これは、 IR,T
LCなどによりイヌリン物質(イヌリンを主成分とする
vN類)であることが確認される。このイヌリン物質は
経口または非経口投与法で投与される。
る有機溶媒(例えば、アセトン、アルコール、アセトニ
トリル)を加えて放置すると、イヌリン物質が沈澱物と
して析出する。この沈澱物を再び水に溶解させ、上記有
機溶媒を加えて放置することにより沈澱物が析出し、精
製されたイヌリン物質が得られる。これは、 IR,T
LCなどによりイヌリン物質(イヌリンを主成分とする
vN類)であることが確認される。このイヌリン物質は
経口または非経口投与法で投与される。
(実施例)
以下に本発明を実施例につき説明する。
側1桝上
(A)カルスの培養およびイヌリン物質の調製:桔梗の
芽生えを採取し、常法に従ってエタノールおよびアンチ
ホルミンで滅菌した後、5unu角の細片に裁断した。
芽生えを採取し、常法に従ってエタノールおよびアンチ
ホルミンで滅菌した後、5unu角の細片に裁断した。
2.4−Dを2.OxlO−bM、 ソLテカイ不チン
を5.OXl0−7Mの割合で含有するMS培地(寒天
を含む固体培地)に上記細片を置床し25°Cにて20
日間培養してカルスを誘導した。このカルスを同様の培
地で3代にわたり継代培養した。
を5.OXl0−7Mの割合で含有するMS培地(寒天
を含む固体培地)に上記細片を置床し25°Cにて20
日間培養してカルスを誘導した。このカルスを同様の培
地で3代にわたり継代培養した。
さらに各継代ごとに、後述の方法により抗1t!i瘍活
性(Il′i水固型1liiの抑制率および腹水型11
!¥!瘍における延命率)を測定し、1週間間隔で20
代にねたり継代培養を行ない抗腫瘍活性の高いセルライ
ンを選択した。
性(Il′i水固型1liiの抑制率および腹水型11
!¥!瘍における延命率)を測定し、1週間間隔で20
代にねたり継代培養を行ない抗腫瘍活性の高いセルライ
ンを選択した。
オーキシンとしてNAAを2.OXl0−bの割合でそ
してサイトカイニンとして6−ベンジルアデニンを1.
0X10−’Mの割合で含有する液体培地500dを調
製し、これを1000d容のマイヤーフラスコに入れた
。これに上記継代培養したカルスを入れて25’C,1
10rpmにて、1週間振盪培養を行なった。
してサイトカイニンとして6−ベンジルアデニンを1.
0X10−’Mの割合で含有する液体培地500dを調
製し、これを1000d容のマイヤーフラスコに入れた
。これに上記継代培養したカルスを入れて25’C,1
10rpmにて、1週間振盪培養を行なった。
カルスを濾取し、60’Cにて8時間乾燥し、乾燥カル
ス5gを得た。
ス5gを得た。
この乾燥カルスを60°Cの温水30m1で1時間ずつ
2回にわたって抽出し、抽出液を合併して減圧濾過した
。濾液に活性炭0.1 gを加え、60°Cにて20分
間加熱し、温時、減圧濾過した。濾液を、アセトン70
dの入った容器に撹拌しながら加え、1夜放置した。次
いで、析出物を濾取し、これを温水15dに溶かして活
性炭0.1 gを加えて20分間撹拌し、濾過した。撹
拌しなから濾液にアセトン60mflを加え、1夜放置
し、析出物を濾取した。これを60“C以下で3時間乾
燥し、白色粉末1gを得た。
2回にわたって抽出し、抽出液を合併して減圧濾過した
。濾液に活性炭0.1 gを加え、60°Cにて20分
間加熱し、温時、減圧濾過した。濾液を、アセトン70
dの入った容器に撹拌しながら加え、1夜放置した。次
いで、析出物を濾取し、これを温水15dに溶かして活
性炭0.1 gを加えて20分間撹拌し、濾過した。撹
拌しなから濾液にアセトン60mflを加え、1夜放置
し、析出物を濾取した。これを60“C以下で3時間乾
燥し、白色粉末1gを得た。
これは、高速液体クロマトグラフィー()IPLC)に
より、イヌリンを主成分とすることがわかった。
より、イヌリンを主成分とすることがわかった。
(B)イヌリン物質の評価=(A)項で得られたイヌリ
ン物質の抗腫瘍活性を次の方法により評価した。
ン物質の抗腫瘍活性を次の方法により評価した。
ICR−5LC系雄性マウス(5週令2体重22〜24
g)を10匹ずつ10群準備した。第1〜3群および第
7〜8群のマウスには経口によりイヌリン物質を7日間
にわたり隔日に投与した。イヌリン物質の投与量は表1
および表2に示す。第4〜6群および第9〜10群のマ
ウスには、腹腔内にイヌリン物質を7日間にわた隔日に
投与した。イヌリン物質の投与量は表1および表2に示
す。別に25週令のlcI’1−3LC系雄性マウスの
腹腔内にエールリッヒ腹水癌細胞を接種し51週間飼育
し、得られた癌細胞を採取した。この癌細胞2.5 X
103個を含有する生理食塩水0.2 dを上記第1〜
6群のマウスの右大腿部皮下に接種した。接種後、毎日
上記経口もしくは腹腔内投与法でそれぞれイヌリン物質
を投与し、30日間にわたり飼育を行なった。30日後
にマウスを屠殺して腫fIk(腹水固型腫瘍)を摘出し
、その重量を測定した。別にイヌリン物質を投与しない
マウスを用いて同様の操作を行ない1 これを対照とし
た。次式により腫瘍抑制率を算出しその結果を表1に示
す。
g)を10匹ずつ10群準備した。第1〜3群および第
7〜8群のマウスには経口によりイヌリン物質を7日間
にわたり隔日に投与した。イヌリン物質の投与量は表1
および表2に示す。第4〜6群および第9〜10群のマ
ウスには、腹腔内にイヌリン物質を7日間にわた隔日に
投与した。イヌリン物質の投与量は表1および表2に示
す。別に25週令のlcI’1−3LC系雄性マウスの
腹腔内にエールリッヒ腹水癌細胞を接種し51週間飼育
し、得られた癌細胞を採取した。この癌細胞2.5 X
103個を含有する生理食塩水0.2 dを上記第1〜
6群のマウスの右大腿部皮下に接種した。接種後、毎日
上記経口もしくは腹腔内投与法でそれぞれイヌリン物質
を投与し、30日間にわたり飼育を行なった。30日後
にマウスを屠殺して腫fIk(腹水固型腫瘍)を摘出し
、その重量を測定した。別にイヌリン物質を投与しない
マウスを用いて同様の操作を行ない1 これを対照とし
た。次式により腫瘍抑制率を算出しその結果を表1に示
す。
上記第7〜10群のマウスについては、上記癌細胞2.
5 XIO’個を含有する生理食塩水0.27を腹腔部
皮下に接種した。接種後、上記経口もしくは腹腔内投与
法でそれぞれイヌリン物質を投与し。
5 XIO’個を含有する生理食塩水0.27を腹腔部
皮下に接種した。接種後、上記経口もしくは腹腔内投与
法でそれぞれイヌリン物質を投与し。
15日間にわたり飼育を行なった。15日後の生存数を
確認し1次式により腹水型Il!I瘍における延命率を
算出した。その結果を表2に示す。
確認し1次式により腹水型Il!I瘍における延命率を
算出した。その結果を表2に示す。
経口
経口
経口
腹腔内
腹腔内
腹腔内
経口
経口
腹腔内
腹腔内
表1
12.5
6.25
12.5
6.25
表2
12.5
12.5
16.0
28.0
49.5
36.0
42.6
21.0
140.2
142.5
135.2
128.6
上記抗腫瘍活性は、上記20代にわたり継代培養を始め
たときの約20倍であった。
たときの約20倍であった。
次に、 ddY−5系雄性マウスを準備し、 Behr
enKaerber法により、7日後の生存率からLD
s。を算出した。イヌリン物質を経口投与した場合のL
D、。
enKaerber法により、7日後の生存率からLD
s。を算出した。イヌリン物質を経口投与した場合のL
D、。
は14g/kgを越え、そしてイヌリン物質を腹腔的投
与した場合のLD、。は4g/kgを越えた。
与した場合のLD、。は4g/kgを越えた。
災施拠叉
実施例1 (A)項と同様にしてカルスを誘導し。
3代にねたり継代培養を行なった。別に、オーキシンと
してNAAを2.OXl0−”M、 そしてサイトカイ
ニンとしてカイネチンを1.OXl0−” Mの割合で
含有するMS液体培地を調製し、これに上記カルスを移
植した。これを25°Cにて30日間培養し、カルスか
ら分化根を誘導した。誘導された分化根を集め、上記と
上記の液体培地で5代にねたり継代培養を行なった。さ
らに、継代ごとに実施例1の方法により抗腫瘍活性を測
定し、活性の高いセルラインを選択しながら10代にわ
たって継代培養を行なった。次に、上記!’ls液体培
地500 dを1000 d容のマイヤーフラスコに入
れ、これに上記10代の継代により得られた高活性の分
化根を移植して。
してNAAを2.OXl0−”M、 そしてサイトカイ
ニンとしてカイネチンを1.OXl0−” Mの割合で
含有するMS液体培地を調製し、これに上記カルスを移
植した。これを25°Cにて30日間培養し、カルスか
ら分化根を誘導した。誘導された分化根を集め、上記と
上記の液体培地で5代にねたり継代培養を行なった。さ
らに、継代ごとに実施例1の方法により抗腫瘍活性を測
定し、活性の高いセルラインを選択しながら10代にわ
たって継代培養を行なった。次に、上記!’ls液体培
地500 dを1000 d容のマイヤーフラスコに入
れ、これに上記10代の継代により得られた高活性の分
化根を移植して。
110rpmにて1週間にわたり振盪培養した。得られ
た分化根を60°Cにて8時間乾燥し、乾燥分化根4g
を得た。
た分化根を60°Cにて8時間乾燥し、乾燥分化根4g
を得た。
この乾燥分化根から実施例1と同様の操作によりイヌリ
ン物質1.2 gを得た。その抗腫瘍活性およびLD、
。を実施例1と同様の方法により測定した。
ン物質1.2 gを得た。その抗腫瘍活性およびLD、
。を実施例1と同様の方法により測定した。
その結果を表3および表4に示す。イヌリン物質のLD
、2は経口投与による場合には14g/kgを越え。
、2は経口投与による場合には14g/kgを越え。
腹腔的投与による場合は4g/kgを越えた。
(以下余白)
経口
経口
経口
腹腔内
腹腔内
腹腔内
表3
12.5
6.25
12.5
6.25
表4
16.0
29.6
50.2
37.0
42.0
20.0
経口
経口
腹腔内
腹腔内
12.5
12.5
142.2
144.3
136.2
140.1
!JfL桝ユ
(八)毛状根の培養およびイヌリン物質の調製;桔梗の
根茎部を採取し、常法に従って1%アンチホルミンで滅
菌した後、滅菌水で洗浄した。この根茎部から内部組織
を無菌的に採取し、植物ホルモンを含有しないMS寒天
培地に置床し、アグロバクテリウム リゾゲネスA−4
株(農林水産省指令7−名植第386号(昭和57年3
月8日))を接種した。
根茎部を採取し、常法に従って1%アンチホルミンで滅
菌した後、滅菌水で洗浄した。この根茎部から内部組織
を無菌的に採取し、植物ホルモンを含有しないMS寒天
培地に置床し、アグロバクテリウム リゾゲネスA−4
株(農林水産省指令7−名植第386号(昭和57年3
月8日))を接種した。
これを暗所にて25°Cで2〜4週間培養することによ
り2毛状根を誘導した。形成された毛状根を2〜3週間
毎に増殖の良好な部分を選択し、同一組成の新たな培地
を用いて10回継代培養を行った。
り2毛状根を誘導した。形成された毛状根を2〜3週間
毎に増殖の良好な部分を選択し、同一組成の新たな培地
を用いて10回継代培養を行った。
次に1毛状根を植物ホルモンを含有しないWh i t
e寒天培地に移植し、その増殖速度および抗腫瘍活性の
両者について考慮しながら選択を繰り返し。
e寒天培地に移植し、その増殖速度および抗腫瘍活性の
両者について考慮しながら選択を繰り返し。
30代にねたり継代培養を行った。この毛状根30gを
2植物ホルモンを含有しないMS培地500 dを入れ
たLOOM容マイヤーフラスコに移植し、 llOrp
mにて1週間振盪培養を行なった。得られた毛状根を6
0°Cにて8時間乾燥し、乾燥毛状根5gを得た。
2植物ホルモンを含有しないMS培地500 dを入れ
たLOOM容マイヤーフラスコに移植し、 llOrp
mにて1週間振盪培養を行なった。得られた毛状根を6
0°Cにて8時間乾燥し、乾燥毛状根5gを得た。
この乾燥毛状根を60°Cの温水30m1で1時間ずつ
2回にわたって抽出し、抽出液を合併して減圧濾過した
。濾液に活性炭0.1 gを加え、60°Cにて20分
間加熱し ?gJ、時、減圧濾過した。濾液を、アセト
ン7Mの入った容器に撹拌しながら加え21夜放置した
。次いで2析出物を濾取し、これを温水15m1に溶か
して活性炭0.1 gを加えて20分間撹拌し、濾過し
た。撹拌しなから濾液にアセトン60m1を加え、1夜
放置し、析出物を濾取した。これを60°C以下で3時
間乾燥し、白色粉末1.5gを得た。
2回にわたって抽出し、抽出液を合併して減圧濾過した
。濾液に活性炭0.1 gを加え、60°Cにて20分
間加熱し ?gJ、時、減圧濾過した。濾液を、アセト
ン7Mの入った容器に撹拌しながら加え21夜放置した
。次いで2析出物を濾取し、これを温水15m1に溶か
して活性炭0.1 gを加えて20分間撹拌し、濾過し
た。撹拌しなから濾液にアセトン60m1を加え、1夜
放置し、析出物を濾取した。これを60°C以下で3時
間乾燥し、白色粉末1.5gを得た。
これはHPLCからイヌリンを主成分とすることがわか
った。
った。
(B)イヌリン物質の評価二本実施例(八)項で得られ
たイヌリン物質を用い、実施例1(B)項と同様に評価
を行なった。その結果を表5および表6に示す。
たイヌリン物質を用い、実施例1(B)項と同様に評価
を行なった。その結果を表5および表6に示す。
(以下余白)
表5
経口
経口
経口
腹腔内
腹腔内
腹腔内
12.5
6.25
12.5
6.25
17.0
29.0
51.5
37.0
45.6
25.2
表6
経口
経口
腹腔内
腹腔内
12.5
12.5
146.2
148.5
139.2
143.6
上記抗腫瘍活性は、上記30代にわたり継代培養を始め
たときの約20倍であった。
たときの約20倍であった。
次に、実施例1と同様にLD、。を測定した。イヌリン
物質を経口投与した場合のLD、。は14g/kgを越
え、そしてイヌリン物質を腹腔内投与した場合のLD、
。は4g/kgを越えた。
物質を経口投与した場合のLD、。は14g/kgを越
え、そしてイヌリン物質を腹腔内投与した場合のLD、
。は4g/kgを越えた。
止較貫
乾燥カルス、乾燥分化根または乾燥毛状根の代わりに乾
燥桔梗根5gを使用し、実施例1と同様の抽出操作によ
り0.8gのイヌリン物質を得た。
燥桔梗根5gを使用し、実施例1と同様の抽出操作によ
り0.8gのイヌリン物質を得た。
このイヌリン物質の抗腫瘍活性およびLD、。を実施例
1と同様の方法により測定した。その結果を表7および
表8に示す。イヌリン物質のLD、。は経口投与による
場合には14g/kgを越え、腹腔内投与による場合は
4g/kgを越えた。
1と同様の方法により測定した。その結果を表7および
表8に示す。イヌリン物質のLD、。は経口投与による
場合には14g/kgを越え、腹腔内投与による場合は
4g/kgを越えた。
(以下余白)
経口
経口
経口
腹腔内
腹腔内
腹腔内
表7
12.5
6.25
12.5
6.25
■4,0
24.5
44.4
31.5
39.2
21.5
以上の実施例および比較例から1本発明方法により、天
然の桔梗根から得られるイヌリン物質と同等のもしくは
それ以上の抗腫瘍活性を有するイヌリン物質を高収率で
得られることがわかる。
然の桔梗根から得られるイヌリン物質と同等のもしくは
それ以上の抗腫瘍活性を有するイヌリン物質を高収率で
得られることがわかる。
(発明の効果)
本発明により、桔梗由来の植物培養細胞または形質転換
細胞から高い抗腫瘍活性を有するイヌリン物質が効果的
に得られる。このイヌリン物質を含む抗腫瘍剤は副作用
が極めて低いため、安全に経口もしくは非経口的に投与
され得る。
細胞から高い抗腫瘍活性を有するイヌリン物質が効果的
に得られる。このイヌリン物質を含む抗腫瘍剤は副作用
が極めて低いため、安全に経口もしくは非経口的に投与
され得る。
以上
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、桔梗(¥Platycodon¥¥grandif
lorum¥A.DC.)由来の植物培養細胞または形
質転換細胞を培養し、該培養物からイヌリン物質を主成
分とする抗腫瘍剤を得ることを包含する、抗腫瘍剤の製
造法。 2、前記培養細胞がカルスまたは分化根である特許請求
の範囲第1項に記載の製造法。 3、前記形質転換細胞が、前記桔梗の細胞を毛状根病菌
の感染により形質転換した毛状根である、特許請求の範
囲第1項に記載の製造法。 4、前記毛状根病菌がアグロバクテリウムリゾゲネス(
¥Agrobacterium¥¥rhizogene
s¥)である特許請求の範囲第3項に記載の製造法。 5、前記形質転換細胞が、毛状病菌から単離されるRi
プラスミドまたはRiプラスミド由来の組み換え体プラ
スミドを桔梗細胞に直接導入することにより得られる、
特許請求の範囲第1項に記載の製造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63328147A JPH02172921A (ja) | 1988-12-26 | 1988-12-26 | 抗腫瘍剤の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63328147A JPH02172921A (ja) | 1988-12-26 | 1988-12-26 | 抗腫瘍剤の製造法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH02172921A true JPH02172921A (ja) | 1990-07-04 |
Family
ID=18207016
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP63328147A Pending JPH02172921A (ja) | 1988-12-26 | 1988-12-26 | 抗腫瘍剤の製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH02172921A (ja) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0692252A1 (en) * | 1994-06-14 | 1996-01-17 | "Raffinerie Tirlemontoise", société anonyme: | Composition containing inulin or oligofructose for use in cancer treatment |
EP0879600A1 (en) * | 1997-05-20 | 1998-11-25 | Tiense Suikerraffinaderij N.V. (Raffinerie Tirlemontoise S.A.) | Fructan containing composition for the prevention and treatment of colon cancer |
WO2001045723A1 (en) * | 1999-12-22 | 2001-06-28 | Jang Saeng Doraji Co., Ltd. | Medicines manufactured from old platycodon extracts |
WO2005007181A1 (en) * | 2003-07-22 | 2005-01-27 | Jangsaeng Doraji Co., Ltd | Old platycodon extracts for prevention angiogenesis |
WO2005007182A1 (en) * | 2003-07-22 | 2005-01-27 | Jangsaeng Doraji Co., Ltd | Old platycodon extracts for prevention of metastasis and cancer formation |
-
1988
- 1988-12-26 JP JP63328147A patent/JPH02172921A/ja active Pending
Cited By (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0692252A1 (en) * | 1994-06-14 | 1996-01-17 | "Raffinerie Tirlemontoise", société anonyme: | Composition containing inulin or oligofructose for use in cancer treatment |
US5721345A (en) * | 1994-06-14 | 1998-02-24 | Raffinerie Tirlemontoise, S.A. | Prevention of mammary carcinogenesis and breast cancer treatment |
EP0879600A1 (en) * | 1997-05-20 | 1998-11-25 | Tiense Suikerraffinaderij N.V. (Raffinerie Tirlemontoise S.A.) | Fructan containing composition for the prevention and treatment of colon cancer |
WO1998052578A1 (en) * | 1997-05-20 | 1998-11-26 | Tiense Suikerraffinaderij N.V. | Fructan containing composition for the prevention and treatment of colon cancer |
US6500805B2 (en) | 1997-05-20 | 2002-12-31 | Tiense Suikerraffinaderij N.V. | Fructan containing composition for the prevention and treatment of colon cancer and method for the prevention and treatment of same |
JP2009275028A (ja) * | 1997-05-20 | 2009-11-26 | Tiense Suikerraffinaderij Nv | 結腸癌の予防及び治療用のフルクタン含有組成物 |
WO2001045723A1 (en) * | 1999-12-22 | 2001-06-28 | Jang Saeng Doraji Co., Ltd. | Medicines manufactured from old platycodon extracts |
US6902748B1 (en) | 1999-12-22 | 2005-06-07 | Jang Saeng Doraji Co., Ltd | Medicines manufactured from old platycodon extracts |
WO2005007181A1 (en) * | 2003-07-22 | 2005-01-27 | Jangsaeng Doraji Co., Ltd | Old platycodon extracts for prevention angiogenesis |
WO2005007182A1 (en) * | 2003-07-22 | 2005-01-27 | Jangsaeng Doraji Co., Ltd | Old platycodon extracts for prevention of metastasis and cancer formation |
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