KR101810412B1 - 초음파 처리를 통하여 현미추출물-함유 배지 내에서 금송 부정근을 배양하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명에 따르면, 금송의 발아, 부정근 유도 및 증식 배양 과정 중 현미추출물-함유 식물 조직 배지를 이용하고, 특히 증식 배양 과정 중 초음파 처리를 통하여 금송 부정근의 증식을 현저히 증가시킬 수 있는 금송 부정근의 배양 방법이 제공된다.

Description

초음파 처리를 통하여 현미추출물-함유 배지 내에서 금송 부정근을 배양하는 방법{Method for Culturing Adventitious Roots of Pseudolarix Amabilis in Media Containing Extracts of Brown Rices through Ultrasonic Treatment}

본 발명은 금송 부정근(세근)을 높은 효율로 배양하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 금송의 발아, 부정근 유도 및 증식 배양 과정 중 현미추출물-함유 식물 조직 배지를 이용하고, 특히 증식 배양 과정 중 초음파 처리를 통하여 금송 부정근의 증식을 현저히 증가시킬 수 있는 금송 부정근의 배양 방법에 관한 것이다.

금송(학명: pseudolarix amabilis, 속명: golden larch)은 일본의 고유종이며, 금송과 금송속의 유일한 종으로 근연종이 없는 살아 있는 신생대 식물로서 송의 화석이 시베리아, 미국, 유럽, 아시아 중부 및 일본 등지에서 발견되고 있으며, 세계 3대 관상수로 인정받고 있다. 또한, 최대 수고가 40 m에 이르고, 나무 지름이 1.5 m까지 성장할 뿐만 아니라, 가지는 넓게 펼쳐져 있고, 수관은 넓은 피라미드(탑형)형이다. 금송의 잎은 선형이며 부드럽고 길이가 2 내지 5.5 cm 정도이다. 암수 한그루로 3월에서 4월 경에 개화하는데, 수꽃은 둥글고 암꽃은 타원 모양이며 가지 끝에 달려 있고, 가을에는 금황색(golden color)을 띈다.

이처럼, 금송은 수형이 유려하여 정원, 학교, 공원 등의 기념수 등으로 식재되고 있으며, 또한 금송의 목재는 건축재로, 그리고 수피는 항암·항균 성분으로 적용되는 등, 장래의 경제목으로도 기대되는 수종이다.

금송의 성분 및 약용 효과는 본초강목 제6권 목부기재에서도 언급되었는 바, 껍질로는 피부 및 진선(무좀, 옴병 등)을 치료하고, 진선균 등에 대한 항균 효과가 탁월하다고 기록되어 있다. 특히, 금송 추출물은 비타민 C, K, B, Flavonoid 등이 함유되어 있어 세균의 증식을 억제하며 염증 부위에 대한 치유 효과가 높기 때문에 민간요법으로도 사용된 바 있다. 이외에도, 안토시안 성분은 강력한 항산화 성분으로 피부의 노화를 억제하고, 탄닌 성분을 함유하여 모공을 수축시키는 등, 피부 건강의 유지에 있어서도 탁월한 것으로 알려져 있다.

전술한 금송의 약리적 효과에 착안하여 다양한 응용 분야(특히, 화장료 분야)에 적용하는 기술이 개발되고 있다. 예를 들면, 금송 추출물을 콩 추출물과 함께 사용하여 피부 미백효과, 방선균에 대한 멜라닌 생성 억제작용 등을 갖는 피부화장료(국내특허공개번호 제2004-24053호), 아토피 피부 개선 조성물(국내특허공개번호 제2011-16611호) 등을 제조하는 기술, 그리고 금송으로부터 피부질환 치료성분인 슈도라릭산, 디터펜산과 같은 항균 성분 등을 크로마토그래피법에 의하여 효과적으로 분리 추출하는 기술(국내특허공개번호 제2014-120594호) 등도 알려져 있다.

전술한 바와 같이, 기존 연구의 대부분은 주로 금송으로부터 특정 약리적 효능을 갖는 성분을 효율적으로 추출하거나, 이를 제품화하는 기술에 중점을 두고 있다.

한편, 최근 식물에서 생성되는 유용한 생리활성물질을 대량생산 할 수 있는 기술로서 식물조직 배양이 많이 이용되고 있다. 특히, 부정근 배양의 경우, 빠른 생장률을 보이며 안정적인 2차 대사 산물을 생산할 수 있기 때문에 효율적인 방법으로 알려져 있다. 이와 관련하여, 금송을 피부 질환 치료제, 항균제 등의 의약품 원료로 적용하기 위하여는 금송을 지속적으로 공급하는 것이 필요하나, 공급량을 증가시키기 위하여는 많은 수목 영역이 필요하고, 해당 분야의 원료로 적용할 수 있기까지는 장시간의 관리가 필수적이다.

그러나, 현재까지는 금송의 부정근 및 캘러스의 대량 확보를 위한 배양 기술에 대한 연구는 미비한 실정이다.

본 발명자들은 전술한 종래기술의 한계를 극복하기 위하여 지속적으로 연구한 결과, 현미추출물이 포함된 배지에서 금송의 발아(무균 발아) 및 부정근을 유도하고, 이를 조직 내 세포의 분화를 촉진시키는 초음파로 처리함으로써 금송 부정근의 유도 속도 및 증식량을 현저히 증가시킬 수 있음을 발견하였다.

따라서, 본 발명은 다양한 약리활성 성분을 함유하는 금송을 대량 생산 및 공급할 수 있도록 금송의 부정근의 유도 및 이의 증식을 효율적으로 달성할 수 있는 배양 방법을 제공하고자 한다.

본 발명에 따르면,

a) 금송 씨앗을 준비하여 현미추출물이 함유된 배지에서 무균 발아하는 단계;

b) 상기 무균 발아에 의하여 형성된 발아체의 줄기 및 뿌리 중 적어도 일부를 현미추출물이 함유된 고체 배지에 치상하여 금송의 부정근을 유도하는 단계; 및

c) 상기 유도된 금송의 부정근을 현미추출물이 함유된 액체 배지에서 10 내지 500 mW/㎠의 강도를 갖는 초음파로 처리하면서 증식 배양하는 단계;

를 포함하며,

상기 단계 a), b) 및 c) 각각에서 사용된 배지는 현미추출물을 5 내지 20 체적%로 함유하는 금송 부정근을 배양하는 방법이 제공된다.

일 구체예에 따르면, 상기 단계 a)에서의 무균 발아 및 상기 단계 b)에서의 부정근 유도 각각은 기초 배지로서 MS(Murashige-Skoog) 배지, SY(sugar yeast) 배지 또는 B5 배지에 현미추출물이 첨가된 배지를 이용하여 수행될 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 단계 c)에서 상기 초음파 처리는 5 내지 30분/일로 배양 초기부터 1 내지 14일 동안 수행될 수 있다.

본 발명에 따른 금송 부정근의 배양 방법은 현미로부터 다량의 필수 무기성분, 비타민 등을 함유하는 추출물이 포함된 배지를 이용하여 금송 부정근을 신속하게 유도하고, 이에 초음파 처리를 통하여 증식을 촉진시킴으로써 금속 부정근을 수득할 수 있다. 특히, 최근 다양한 분야에서 수요가 증가하고 있는 금속 부정근을 상업적 대량 생산이 가능한 정도로 배양할 수 있기 때문에 향후 광범위한 적용이 기대된다.

도 1은 비교예 2에 따라 무균 발아된 금송 발아체의 금송 부정근의 유도 정도를 보여주는 사진이고; 그리고
도 2는 실시예 2에 따라 무균 발아된 금송 발아체의 금송 부정근의 유도 정도를 보여주는 사진이다.

본 발명은 하기의 설명에 의하여 모두 달성될 수 있다. 하기의 설명은 본 발명의 바람직한 구체예를 기술하는 것으로 이해되어야 하며, 본 발명이 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 첨부된 도면은 이해를 돕기 위한 것으로, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에 있어서, 어떠한 구성 성분 또는 단계를 "포함"한다고 할 때, 이는 별도의 언급이 없는 한, 다른 구성 성분 및/또는 단계를 더 포함할 수 있음을 의미한다.

"부정근"은 세근이라고도 불리며, 식물의 발아 또는 생육 시 정해진 부위에서 규칙적으로 형성되는 뿌리가 아니고, 상황에 따라 나오는 잔뿌리, 즉 줄기에서 2차적으로 발생하는 뿌리를 의미할 수 있다. 일반적으로, 식물의 뿌리는 발달이 처음 시작되는 부위에 따라 종자근(seminal roots) 및 부정근(adventitious root)으로 구분될 수 있는 바, 부정근은 발아 후 유묘가 형성되면서 발달하는 관부 또는 곁가지의 마디에서 형성되는 뿌리를 의미한다.

"조직 배양"은 식물체에서 다세포로 이루어진 식물의 기관, 조직 또는 세포를 적출 분리해서 영양분이 들어 있는 기내에서 배양하여 캘러스 또는 원조직편에서 직접 분화시키는 것을 의미할 수 있다. 실제 배양하는 재료 중에는 조직뿐만이 아니라 뿌리, 잎 등과 같은 기관을 배양할 수 있고, 식물의 배를 배양하는 배배양, 화분에서 반수성의 식물체를 유기시키는 목적이 있는 약배양 또는 원형질체 배양 등을 포함하는 넓은 개념으로 이해될 수 있다. 따라서, 배양은 기관 배양, 조직 배양, 캘러스 배양, 단세포 배양, 생장점 배양, 자방 배양, 배주 배양, 배배양, 약배양, 화분배양, 원형질체 배양 등을 모두 포함할 수 있다.

"추출물"은, 세포를 용매에 용해시며 분리하고, 증류 또는 증발과 같은 분리 수단을 이용하여 농축한 것을 의미할 수 있는 바, 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 제조될 수 있다. 전형적으로 추출 대상 재료를 건조 및 분쇄한 후, 추출 용매를 넣고 가열하여 유효성분을 추출하고 감압 농축하여 추출물을 얻는 방식을 이용할 수 있다. 추출 용매로는 일반적으로 사용될 수 있는 용매를 사용할 수 있으며, 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수 저급 알코올(메탄올, 에탄올 등), 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트 및 1,3-부틸렌 글리콜 등을 포함할 수 있다. 또한, 추출물은 조추출물, 추출 분획물 및 추출 정제물을 모두 포함하는 개념으로 이해될 수 있다.

"현미"는 씨방이 발달한 것으로, 벼의 열매에 해당되며, 종피, 배 및 배유로 이루어지며, 얇은 과피가 현미를 둘러싸고 있는 형태이다. 이때, 종피는 산, 알칼리에 강하고 반투과성 격막으로서, 식염, 산, 색소 등은 통과하지 않는다. 배는 발아하여 벼로 생장하는 부위로서 배유와 접하는 곳에 존재하는 배의 흡수층이 당화효소를 함유하고 있어 발아 시 활성화되어 배유부의 전분을 분해하게 된다. 또한, 배유는 전분 저장조직으로 최외층이 종피와 맞닿아 있으며, 단백질 및 지방질 과립을 다량 함유하고 있다.

"배지(culture medium)"는 미생물이 필요로 하는 각종 영양소를 골고루 함유하는 물질을 의미하는 바, 이때 영양소는 탄소원, 질소원, 비타민류, 무기염 등을 포함할 수 있다. 배지는 조성에 따라, 천연 배지, 합성 배지 및 반합성 배지로 구분될 수 있고, 또한 배지의 상태에 따라 액체 배지 및 고체 배지(액체 배지에 한천(agar), 겔라틴(gelatine) 등의 겔화제 또는 고화제를 첨가하여 응고시킨 것으로, 사면 배지, 고층 배지 및 평판 배지를 포함함)로 분류될 수 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명에서는 금송 씨앗을 무균 발아시켜 형성된 발아체의 일부를 현미추출출이 함유된 배지 내에서 배양하여 부정근을 유도하고, 이를 초음파 처리 하에서 증식 배양하는 단계가 수행되는 바, 개별 단계의 세부 사항은 하기에서 기술하기로 한다.

금송 씨앗의 무균 발아 단계

본 발명의 단계 a)에서는 먼저 금송 씨앗(종자)을 입수하여 무균발아(nonsymbiotic germination)를 수행한다. 무균발아를 위하여는 씨앗의 살균 과정이 수반되는 바, 일 예로서 약 50 내지 90%(구체적으로 약 70%)의 에탄올에 약 20 내지 50초(약 30 초) 동안 침지한 후에, 이를 꺼내어 약 3 내지 10%(구체적으로 약 5%)(중량 기준) 하이포아염소산나트륨(Sodium Hypochlorite; NaOCl) 수용액에 약 15 내지 30분(구체적으로 약 20분) 동안 침지하는 방식으로 수행될 수 있다. 또 다른 예로서, 금송 씨앗을 약 0.5 내지 3%(구체적으로 약 1%)의 하이포아염소산나트륨에서 약 2 내지 7분(구체적으로 약 5분), 그리고 약 50 내지 90%(구체적으로 약 70%)의 에탄올에 약 1 내지 4분(구체적으로 약 3분) 동안 침지할 수 있다. 이와 같은 살균 과정에서는 필요에 따라 Tween 20과 같은 계면활성제를 약 1 내지 3 방울/20 mL로 첨가한 하이포아염소산 나트륨 수용액을 사용할 수 있다. 그 다음, 금송 씨앗의 표피에 남아있는 살균 약제가 내피 세포로 침투하는 것을 억제하기 위하여, 멸균된 증류수로 복수 회, 예를 들면 2 내지 4회 세척한다.

전술한 바와 같이 멸균(무균) 처리된 금송 씨앗은 상처를 내어 용이하게 발아되도록 유도된다. 이때, 발아 유도 과정은 전형적으로 무균 상태(aseptic condition)로 암실 조건 하에서 수행될 수 있는 바, 예를 들면 약 14 내지 45 일, 구체적으로 약 25 내지 30 일에 걸쳐 수행될 수 있다. 또한, 금송 씨앗의 무균 발아 과정은, 예를 들면 약 15 내지 30 ℃, 구체적으로 약 18 내지 22 ℃의 온도에서 수행될 수 있다.

본 발명에 있어서, 발아 단계는 상처 난 씨앗을 현미 추출물이 함유된 배지에 접종(파종)하는 방식으로 수행된다. 이때, 배지에 첨가되는 현미추출물은 하기의 방법 (i) 또는 (ii)에 의하여 수득할 수 있다.

(i) 현미 분쇄물에 약 50 내지 90%(구체적으로, 약 80%)의 메탄올 또는 에탄올 70 내지 150 mL를 첨가한 후에 약 50 내지 90 ℃(구체적으로 약 70 내지 85 ℃)에서 약 1 내지 5시간(구체적으로 약 2 내지 3 시간)에 걸쳐 적어도 1회 추출하는 방식으로 수행될 수 있다. 이때 추출은 환류 추출 방식으로 수행될 수 있다. 추출 과정 후, 공지된 분리수단, 구체적으로 여과, 원심분리 등의 분리 조작을 통하여 고형분을 분리하고, 액상 성분(상등액)을 농축하여 현미추출물을 수득한다.

(ii) 현미 분쇄물에 염기 수용액(구체적으로 약 0.5 내지 2 M, 특히 1 M의 수산화나트륨 수용액)을 첨가하고, 약 20 내지 40 ℃(구체적으로 상온)에서 약 10 내지 24 시간(구체적으로 약 15 내지 18 시간)에 걸쳐 처리한다. 추출 과정 이후, 공지된 분리수단, 구체적으로 여과, 원심분리 등의 분리 조작을 통하여 고형분을 분리한다. 이때, 얻어진 액상 성분에 대하여 산 성분(예를 들면, 3 내지 8 M의 염산)을 첨가하여 중화시킨 후에 농축 과정을 거쳐 현미추출물을 수득할 수 있다.

현미추출물 내 이종 성분이 혼입되는 것을 최대한 억제하기 위하여는 전술한 방법 중 방법 (i)이 바람직하다. 또한, 후술하는 배지에 첨가하는데 적합한 현미추출액(농축액) 내 고형분 함량은, 예를 들면 약 1 내지 8 중량%, 구체적으로 약 2 내지 7 중량%, 보다 구체적으로 약 3 내지 6 중량% 범위일 수 있다. 경우에 따라서는 물과 혼합하여 희석 사용할 수도 있다.

한편, 본 발명의 일 구체예에서는 무균 발아를 촉진하기 위하여 상기 현미추출물이 첨가된 배지를 사용할 수 있다. 이때, 배지는 기초 배지로서 MS(Murashige-Skoog) 배지, SY(sugar yeast) 배지 또는 B5 배지와 같이 식물의 배양에 일반적으로 사용되는 배지에 현미추출물을 첨가한 것이다. 이때, 기초 배지에 대한 현미추출물의 첨가량은, 예를 들면 약 5 내지 20 체적%(구체적으로, 약 7 내지 15 체적%, 보다 구체적으로 약 9 내지 11 체적%, 특히 약 10 체적%) 범위일 수 있다.

상기 기초 배지의 예로서 MS 배지 및 B5 배지의 조성은 하기 표 1과 같다.

상기 MS 배지 및 B5 배지는 각각 Murashige 및 Skoog(F., Physiol. Plant, 15, 473 (1962)), 그리고 Gamborg(Gamborg O.L., Miller R.A., Ojima K., Nutrient requirement of suspensions cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res., 50, 151 (1968))에 의하여 고안된 배지로서, 보다 전형적으로는 MS 배지가 사용될 수 있다. 다만, 이는 예시적인 것으로, 무균 발아를 비롯하여 후술하는 부정근 배양 모두에 적절히 사용할 수 있는 한, 당업계에서 공지된 다른 배지(예를 들면, N6 배지, KM 배지, LM 배지, SH 배지 등) 역시 기초 배지로 사용할 수 있다.

예시적 구체예에 따르면, 무균 발아 단계에서 사용되는 현미추출물-함유 배지는, 전술한 기초 배지에 추가적으로 탄소원으로서 수크로오스 약 20 내지 40 g/L(구체적으로 약 25 내지 35 g/L, 특히 구체적으로 약 30 g/L) 및 겔화제(예를 들면, 겔라이트(Gelite) 또는 겔란 검(gellan gum), 한천(Agar), 아가로오스 등) 약 3 내지 7 g/L(구체적으로 약 4 내지 6 g/L, 특히 구체적으로 약 5 g/L) 등을 포함할 수 있다. 이때, 겔화제로서 겔라이트를 사용하는 것이 유리할 수 있다.

또한, 현미추출물-함유 배지의 pH가 지나치게 낮거나 지나치게 높은 경우에는 금송의 발아에 바람직하지 않은 영향을 미치는 바, 이점을 고려하여 예를 들면 약 5 내지 6, 구체적으로 약 5.5 내지 5.9, 보다 구체적으로 약 5.7 내지 5.8의 범위로 조절될 수 있다. 이를 위하여, 산 또는 염기(예를 들면, 수산화나트륨)를 이용하여 pH 범위를 조절할 수 있다.

이와 같이, 현미추출물을 함유하는 배지를 이용하여 금송 씨앗을 무균 발아시킬 경우, 효과적인 발아 촉진 효과를 제공할 수 있는 바, 발아율(파종 수에 대한 발아한 종자 수의 비율)은 적어도 약 50%, 구체적으로 약 55 내지 80%, 보다 구체적으로 약 60 내지 70% 범위일 수 있다.

금송 부정근의 유도 단계

본 발명의 단계 b)에서는 무균 발아에 의하여 형성된 금송 씨앗의 발아체의 줄기 및 뿌리 중 일부를 배지에 치상 또는 배양하여 금송의 부정근을 유도한다.

본 발명에 따르면. 부정근의 유도를 촉진하기 위하여, 현미추출물이 함유된 고체 배지를 사용한다. 이때. 부정근의 유도 단계는, 예를 들면 약 30 내지 90 일, 구체적으로 약 55 내지 65일 에 걸쳐 수행될 수 있다. 또한, 금송 씨앗의 무균 발아 과정은, 예를 들면 약 15 내지 30 ℃, 구체적으로 약 18 내지 22 ℃의 온도에서 수행될 수 있다.

상기 현미추출물이 함유된 고체 배지는 기초 배지에 전술한 현미추출물을 첨가하고, 또한 고상화에 필요한 겔화제, 구체적으로 겔라이트, 한천, 아가로오스 등을 첨가하여 제조될 수 있다. 이때, 현미추출물은 무균 발아 단계에서와 같이 기초 배지에 대한 현미추출물의 첨가량은, 예를 들면 약 5 내지 20 체적%(구체적으로, 약 7 내지 15 체적%, 보다 구체적으로 약 9 내지 11 체적%, 특히 약 10 체적%) 범위일 수 있다.

또한, 부정근 유도용 배지의 조성은, 기초 배지(구체적으로 MS 배지)에 탄소원으로서 수크로오스 약 20 내지 40 g/L(구체적으로 약 25 내지 35 g/L, 특히 구체적으로 약 30 g/L) 및 겔화제(예를 들면, 겔라이트(Gelite) 또는 겔란 검(gellan gum), 한천(Agar), 아가로오스 등; 구체적으로 겔라이트) 약 3 내지 7 g/L(구체적으로 약 4 내지 6 g/L, 특히 구체적으로 약 5 g/L)를 포함할 수 있다. 추가적으로, 부정근 형성을 촉진하기 위하여, 식물 성장 조절 물질인 사이토키닌류, 구체적으로 키네틴(Kinetin) 약 0.1 내지 1 ㎎/L, 구체적으로 약 0.3 내지 0.6 ㎎/L, 특히 구체적으로 약 0.5 ㎎/L를 포함한다. 특히, 캘러스(callus) 형성, 부정근 배아형성(embryogenesis)을 촉진하기 위하여 옥신류로서 IBA(indole butyric acid) 약 2 내지 7 ㎎/L, 구체적으로 약 3 내지 6 ㎎/L, 보다 구체적으로 약 5 ㎎/L를 더 첨가한다.

이외에도, 전술한 바와 같이, 배지의 pH는 약 5 내지 6, 구체적으로 약 5.5 내지 5.9, 보다 구체적으로 약 5.7 내지 5.8의 범위 내에서 조절될 수 있다. 배지의 pH는 부정근 유도에 영향을 미칠 수 있는 바, 지나치게 낮거나 높은 경우에는 부정근 유도능을 저해할 수 있는 만큼, 전술한 pH 범위 내에서 조절하는 것이 바람직할 수 있다.

이처럼, 현미추출물이 함유된 고체 배지에 발아체의 일부를 치상할 경우, 금송 부정근의 유도 속도를 증가시킬 수 있다.

유도된 부정근의 증식 배양 단계

본 발명에 따르면, 전술한 바와 같이 유도된 금송의 부정근을 액체 배지에서 증식 배양하는 단계가 수행된다. 예시적으로, 배양 온도는, 예를 들면 약 15 내지 30 ℃, 구체적으로 약 18 내지 22 ℃의 범위일 수 있다. 또한, 증식 배양은 회전 조건(예를 들면, 약 70 내지 120 rpm, 구체적으로 약 80 내지 100 rpm) 하에서 수행되는 것이 유리할 수 있다.

본 발명에 있어서, 유도된 금송의 부정근을 현미추출물이 함유된 액체 배지에서 증식 배양하되, 초음파를 약 10 내지 500 mW/㎠, 구체적으로 약 100 내지 400 mW/㎠, 보다 구체적으로 약 150 내지 250 mW/㎠, 특히 구체적으로 약 200 mW/㎠의 강도로 처리할 수 있다. 초음파의 강도가 일정 수준 미만에서는 원하는 수준의 증식 효과 증가를 얻을 수 없고, 또한 일정 수준을 초과할 경우에는 오히려 증식 효과가 최대치에서 서서히 감소하게 된다.

따라서, 전술한 범위의 강도의 초음파를 이용하는 것이 바람직할 것이다. 또한, 초음파의 주파수는, 예를 들면 약 50 내지 200 kHz, 구체적으로 약 70 내지 150 kHz, 특히 구체적으로 약 100 kHz일 수 있는 바, 지나치게 높은 주파수에서는 오히려 금속 부정근의 증식에 바람직하지 않은 영향을 줄 수 있으므로 전술한 범위 내에서 적절히 조절할 수 있을 것이다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 초음파는 약 5 내지 30분/일(구체적으로 약 10 내지 25분/일, 보다 구체적으로 약 15 내지 20분/일)로 배양 초기부터 1 내지 21일(구체적으로 1 내지 14일)에 걸쳐 처리하는 것이 유리할 수 있다. 만약, 하루에 일정 범위에 미달하는 시간에 걸쳐 초음파 처리하지 않을 경우, 현미추출물-함유 배지와 초음파 처리에 따른 결합 또는 상승 효과를 얻는데 불충분하거나, 또는 지나치게 긴 시간에 걸쳐 초음파 처리할 경우에는 오히려 초음파에 의하여 금송(금송의 부정근)의 조직 생장에 방해가 될 수도 있다. 따라서, 하루 중 전술한 시간 범위에 걸쳐 초음파를 가하는 것이 유리할 수 있다. 상술한 초음파 처리는 단속적(pulsed type) 또는 연속적(continuous type)으로 수행될 수 있다.

한편, 본 발명에 있어서, 금송 부정근의 증식 배양 시 주목할 점은 전술한 초음파 처리뿐만 아니라, 현미추출물이 함유된 배지(액체 배지)를 사용하는 것이다. 액체 배지 내 현미추출물의 함량은 전술한 범위 내에서 선정될 수 있다.

이와 관련하여 주목할 점은 부정근을 초음파로 처리하면서 현미추출물-함유 배지에서 증식 배양함으로써 금송의 증식 속도를 현저히 증가시킬 수 있다는 것이다. 본 발명이 특정 이론에 구속되는 것은 아니지만, 금송의 부정근이 고유 특성 상 현미추출물-함유 배지에서 배양되면서 초음파에 의한 처리 또는 자극에 훨씬 민감하게 반응하여 증식을 촉진하는 것으로 판단된다.

금송 부정근의 증식 배양에 사용되는 액체 배지는 전술한 부정근 유도 단계에서와 유사하게 기초 배지에 다양한 식물 성장 조절 물질 등을 더 포함할 수 있는 바, 추가 가능한 성분은 앞서 언급된 종류일 수 있고, pH 범위 등도 전술한 바와 같다. 다만, 본 발명에서는 액체 배지를 사용하는 만큼, 겔화제와 같이 고체 배지 형성용 성분은 제외될 것이다.

일 예로서, 배지를 구성하는 기초 배지는 전술한 종류의 배지를 사용할 수 있는 바, 구체적으로는 MS 배지일 수 있다. 또한, 현미추출물은 앞선 무균 발아 및 금송의 부정근 유도 단계에서와 유사하게, 예를 들면 약 5 내지 20 체적%(구체적으로, 약 7 내지 15 체적%, 보다 구체적으로 약 9 내지 11 체적%, 특히 약 10 체적%) 범위로 첨가될 수 있다.

또한, 현미추출물과 함께 기초 배지에 첨가되는 식물 성장 조절 물질의 종류 및 첨가량은 금송의 부정근 내에 축적되는 생리 활성 성분에 영향을 미치는 만큼, 이러한 첨가 성분의 량을 조절하여 증식 효과를 극대화할 수 있다. 상기의 점을 고려하여, 배지에 첨가되는 식물 성장 조절 성분으로서, 수크로오스 약 20 내지 40 g/L(구체적으로 약 25 내지 35 g/L, 특히 구체적으로 약 30 g/L), 그리고 옥신류로서 IBA 약 1 내지 4 ㎎/L, 구체적으로 약 2 내지 3 ㎎/L을 더 첨가할 수 있다.

본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 명확히 이해될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적에 불과하며 발명의 영역을 제한하고자 하는 것은 아니다.

비교예 1

종래의 조성 배지를 이용한 금송 씨앗의 무균 발아

금송의 씨앗을 70% 에탄올에 30초 동안 침지한 후 멸균수로 세척하고, 다시 살균액(5% 하이포아염소산나트륨 및 Tween 20 함유)으로 20분 동안 살균한 후, 멸균수로 3회에 걸쳐 수세하였다. 이후, 멸균된 금송 씨앗을 나이프를 이용하여 상처를 내었다.

한편. 무균 발아용 배지는 MS 기본 배지(Duchefa사, Cat No. M0221))에 수크로오스 30g/L 및 겔라이트(Gelite) 5g/L를 첨가하고 1N 수산화나트륨(NaOH)을 이용하여 pH를 5.8로 조정하였다. 상기 배지를 이용하여 상처 난 금송 씨앗을 20℃±2℃로 유지되는 배양실 내에서 발아 유도하였다.

실시예 1

현미추출물 함유 배지로부터 금송 씨앗의 무균 발아

현미추출물의 제조

현미(Oryza satica L.)를 60 메쉬 사이즈로 분쇄한 시료 30 g에 80% 에탄올 500 mL을 첨가한 후에 균질화기를 이용하여 2분 동안 균질화시켰으며, 상온에서 2시간 동안 환류 조건 하에서 추출하였으며, 재차 동일량의 에탄올을 가하여 반복 추출하였다. 추출 후, Kimble-filtering 플라스크에 펀넬을 장착하고 여과지(Whatman No. 2)를 사용하여 추출액을 여과하였다. 추출 여액을 45 ℃의 수욕 상에서 약 100 mL로 감압 농축하여 현미추출물을 수득하였다(현미추출물 내 고형분 함량: 약 3 중량%).

금송 씨앗을 70% 에탄올에 30초 동안 침지한 후 멸균수로 세척하고, 다시 살균액(5% 하이포아염소산나트륨 및 Tween 20 함유)으로 20분 동안 살균한 후, 멸균수로 3회에 걸쳐 수세하였다. 이후, 멸균된 금송 씨앗을 날카로운 나이프를 이용하여 상처내었다.

한편, 무균 발아용 배지는 MS 기본 배지에 현미추출물 100 ml/L, 수크로오스 30 g/L, 겔라이트(Gelite) 5.0 g/L를 첨가하고 1N 수산화나트륨(NaOH)을 이용하여 pH 5.8로 조정하였다. 상기 배지를 이용하여 상처 난 금송 씨앗을 20℃±2℃의 배양실에서 발아 유도하였다.

비교예 1 및 실시예 1에 따른 금송 씨앗의 발아율을 하기 표 2에 나타내었다.

	발아율
비교예 1	15%
실시예 1	60%

상기 표에 나타난 바와 같이, 현미추출물을 함유한 배지에서 금송 씨앗의 발아 유도율이 높음을 확인할 수 있다.

비교예 2

통상의 조성을 갖는 배지로부터 금송의 부정근 유도

실시예 1에서 무균 발아된 금송 발아체 일부를 나이프를 이용하여 상처를 내어 MS 기초 배지(Duchefa사, Cat No. M0221))에 수크로오스 30 g/L, 겔라이트 5 g/L, IBA 5 mg/L, 및 키네틴 0.5 mg/L을 첨가하였고, 1N 수산화나트륨(NaOH)을 이용하여 pH를 5.8로 조정하였다.

이와 같이 제조된 부정근 유도용 배지를 이용하여 20℃±2℃로 유지되는 배양실에서 60일에 걸쳐 부정근을 유도하였으며, 시간 경과에 따른 부정근 유도 정도를 확인하여 도 1에 나타내었다.

상기 도면으로부터 확인할 수 있듯이, 상당 시간에 걸쳐 금송 부정근이 유도되었으나, 유도 정도가 미미하였다. 특히, 종래의 기초 배지에 충분한 량의 탄소원(수크로오스), 식물 성장 조절 성분 및 부정근 형성 촉진 성분을 첨가하였음에도 불구하고 다른 식물종에서와 달리 부정근 유도가 충분하지 않았는 바, 이는 금송의 고유 특성 상 통상의 영양 배지의 사용만으로 금송 부정근을 배양하기가 용이하지 않음을 뒷받침한다.

실시예 2

현미추출물-함유 배지로부터 금송의 부정근 유도

실시예 1에서 무균 발아된 금송 발아체 일부에 대하여 나이프를 이용하여 상처를 내어 MS 기본 배지(Duchefa사, Cat No. M0221)에 현미추출물 100 ml/L, 수크로오스 30 g/L, 겔라이트 5 g/L, IBA 5 mg/L 및 키네틴 0.5 mg/L을 첨가하였고, 1N 수산화나트륨(NaOH)을 이용하여 pH를 5.8로 조정하였다. 이와 같이 제조된 부정근 유도용 배지를 이용하여 20℃±2℃로 유지되는 배양실에서 60일에 걸쳐 부정근을 유도하였으며, 시간 경과에 따른 부정근 유도 정도를 확인하여 도 2에 나타내었다.

상기 도면에 따르면, 현미추출물을 함유한 배지에서 유도된 금송 부정근(실시예 2)은 현미추출물을 함유하지 않은 배지에서 유도된 금송 부정근(비교예 2)와 비교하면, 월등히 높은 금송의 부정근 유도율을 나타내었다. 이는 금송이 배지 내 다른 영양 성분보다 현미추출물에 특이적으로 반응하고 있음을 시사한다.

비교예 3

통상의 조성을 갖는 배지로부터 금송 부정근의 증식 배양

실시예 2에서 유도된 금송 부정근을 증식 배양하기 위하여, 하기 표 3과 같이 MS 액체 배지(Duchefa사, Cat No. M0221)에 수크로오스 30 g/L 및 IBA 3 mg/L를 첨가한 배양용 배지를 250 mL의 삼각플라스크에 넣고, 90 rpm 속도로 회전시키면서 20℃±2℃의 조건으로 4주 동안 금송의 부정근을 배양하였다.

비교예 4

초음파 처리없이 현미추출물 함유 배지로부터 금송 부정근의 증식 배양

실시예 2에서 유도된 금송 부정근을 증식 배양하기 위하여, 하기 표 3과 같이 MS 액체 배지(Duchefa사, Cat No. M0221)에 현미추출물 100 mL/L(10 체적%), 수크로오스 30 g/L 및 IBA 3 mg/L를 첨가한 배양용 배지를 250 mL의 삼각플라스크에 넣고, 90 rpm 속도로 회전시키면서 20℃±2℃의 조건으로 4주 동안 금송의 부정근을 배양하였다.

비교예 5

초음파 처리를 수반하면서 통상의 조성을 갖는 배지로부터 금송 부정근의 증식 배양

하기 표 3과 같이 200 mW/㎠ 강도의 초음파를 하루에 1회, 15분씩 2주에 걸쳐 처리하고, 나머지 2주간은 초음파 처리 없이 배양한 것을 제외하고는 비교예 3에서와 동일하게 금송의 부정근을 증식 배양하였다.

실시예 3 내지 5

초음파 처리를 수반하면서 현미추출물 함유 배지로부터 금송 부정근의 증식 배양

하기 표 3에 기재된 강도를 갖는 초음파 처리를 수반한 것을 제외하고는 비교예 2에서와 동일하게 금송의 부정근을 증식 배양하였다.

	현미추출물 함유 배지 사용	초음파 세기 (㎽/㎠)
비교예 3	×	-
비교예 4	○	-
비교예 5	×	200
실시예 3	○	100
실시예 4	○	200
실시예 5	○	500

시험예

금송 부정근의 증식량 평가

비교예 3 내지 5 및 실시예 3 내지 5에 따른 금송 부정근의 증식 배양에 따른 증식량을 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

	초기 중량(g)	4주후 중량(g)	증식율(%)
비교예 3	1.5	15.7	9.46
비교예 4	1.5	18.6	11.40
비교예 5	1.5	17.6	10.73
실시예 3	1.5	22.5	14.00
실시예 4	1.5	26.8	16.87
실시예 5	1.5	24.1	15.07

상기 표에 나타낸 바와 같이, 현미추출물-함유 배지 여부, 그리고 초음파 처리 여부 및 초음파 세기에 따른 금송 부정근의 증식량을 비교한 결과, 현미추출물이 함유된 배지에 200 ㎽/㎠ 강도의 초음파로 처리한 실시예 5의 금송 부정근 증식량이 가장 우수함을 확인하였다.

특히, 주목할 점은 증식 배양 시 현미추출물이 함유된 배지의 사용 및 초음파 처리를 동시에 조합함으로써 현미추출물-함유 배지만의 사용 및 초음파 처리만의 도입 각각으로부터 예측되는 증식 정도에 비하여 현저히 높은 수준의 증식량을 달성할 수 있다는 것이다.

이는 전술한 바와 같이, 금송의 고유 특성 상 현미추출물-함유 배지에서 배양되면서 초음파에 의한 처리 또는 자극에 훨씬 민감하게 반응하여 부정근의 증식이 촉진되는 것임을 시사하는 것으로 판단된다.

본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 모두 본 발명의 영역에 속하는 것으로, 본 발명의 구체적인 보호범위는 첨부된 특허청구범위에 의하여 명확해질 것이다.

Claims (5)

1. a) 금송 씨앗을 준비하여 현미추출물이 함유된 배지에서 무균 발아하는 단계;
   b) 상기 무균 발아에 의하여 형성된 발아체의 줄기 및 뿌리 중 적어도 일부를 현미추출물이 함유된 고체 배지에 치상하여 금송의 부정근을 유도하는 단계; 및
   c) 상기 유도된 금송의 부정근을 현미추출물이 함유된 액체 배지에서 10 내지 500 mW/㎠의 강도를 갖는 초음파로 처리하면서 증식 배양하는 단계;
   를 포함하며,
   상기 단계 a), b) 및 c) 각각에서 사용된 배지는 현미추출물을 5 내지 20 체적%로 함유하는 금송 부정근을 배양하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 현미추출물은, 하기의 방법 (i) 및 (ii) 중 어느 하나에 의하여 제조되는 것을 특징으로 하는 금송 부정근을 배양하는 방법:
   (i) 현미 분쇄물에 50 내지 90%의 메탄올 또는 에탄올 70 내지 150 mL를 첨가한 후에 50 내지 90 ℃에서 1 내지 5시간에 걸쳐 적어도 1회 환류 추출하는 단계; 및 상기 추출 단계 후, 여과 또는 원심분리를 수행하고, 이로부터 얻어진 액상 성분을 농축하는 단계를 포함하거나, 또는
   (ii) 현미 분쇄물에 0.5 내지 2 M의 수산화나트륨 수용액을 첨가하고, 20 내지 40 ℃에서 10 내지 24 시간에 걸쳐 추출하는 단계; 상기 추출 단계 후, 여과 또는 원심분리를 수행하는 단계; 및 상기 여과 또는 원심분리로부터 얻어진 액상 성분에 대하여 3 내지 8 M의 염산을 첨가하여 중화시킨 후에 농축하는 단계를 포함함.
3. 제2항에 있어서, 상기 단계 a)에서 사용된 배지는 MS 배지에 현미추출물 5 내지 20 체적%, 수크로오스 20 내지 40 g/L 및 겔화제 3 내지 7 g/L를 포함하고.
   상기 단계 b)에서 사용된 배지는 MS 배지에 현미추출물 5 내지 20 체적%, 수크로오스 20 내지 40 g/L, 겔화제 3 내지 7 g/L, 키네틴(Kinetin) 0.1 내지 1 ㎎/L, 및 IBA(indole butyric acid) 2 내지 7 ㎎/L를 포함하고,
   상기 단계 c)에서 사용된 배지는 MS 배지에 현미추출물 5 내지 20 체적%, 수크로오스 20 내지 40 g/L, 및 IBA 1 내지 4 ㎎/L를 포함하며, 그리고
   상기 단계 a), 단계 b) 및 단계 c) 각각에 사용된 배지의 pH는 5 내지 6 범위인 것을 특징으로 하는 금송 부정근을 배양하는 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 단계 c)에서 초음파 처리는 5 내지 30분/일로 배양 초기부터 1 내지 21일에 걸쳐 수행되는 것을 특징으로 하는 금송 부정근을 배양하는 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 초음파 처리가 단속적 또는 연속적으로 수행되는 것을 특징으로 하는 금송 부정근을 배양하는 방법.

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