KR100541248B1 - 암전이 억제효과를 갖는 장생도라지 추출물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 암전이 억제 효과를 갖는 장생도라지 추출물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 암전이, 세포 부착, 세포 침투 및 세포 증식을 억제시키는 효과를 갖는 장생도라지 추출물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 장생도라지 추출물은 암세포의 종양형성 및 암전이를 억제함으로써 이를 유효성분으로 하는 항암제는암의 예방 및 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

장생도라지, 항전이, 항암, 세포부착, 세포 침투, 세포 증식율

Description

암전이 억제효과를 갖는 장생도라지 추출물{old platycodon extracts for prevention of cancer metastasis}

도 1은 장생도라지 추출물 처리농도에 따른 폐에 전이한 콜로니 수를 그래프로 나타낸 것이다.

도 2는 폐에 전이한 melanoma 암세포 B16-F10의 colony를 hematoxylin-Eosin 염색한 후 사진 촬영한 것이다.

도 3은 장생도라지 추출물 처리농도에 따른 세포 부착억제율을 그래프로 나타낸 것이다.

도 4는 장생도라지 추출물 처리농도에 따른 침투한 세포수를 그래프로 나타낸 것이다.

도 5는 장생도라지 추출물 처리농도에 따른 암세포 증식 억제율을 그래프로 나타낸 것이다.

본 발명은 암전이 억제 효과를 갖는 장생도라지 추출물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 암전이, 세포 부착, 세포 침투 및 세포 증식을 억제시키는 효과를 갖는 장생도라지 추출물에 관한 것이다.

도라지는(길경 Platycodon grandiflorum A. DC) 도라지과(Campanulaceae)의 식물로 주근이 10 ∼ 15cm 내외이고 지름은 1 ∼ 3cm 이며 윗부분에는 불규칙한 줄기 자리가 있고 회갈∼유백색이며 세로 주름이 깊고, 가로로는 파목(皮目)과 주름이 있다. 질은 단단하나 비섬유성이어서 파절이 쉽고 약간의 냄새가 나며 맛은 아리다. (육창수 등, 현대 생약학, 서울, 학창사, 460-461, 1993)

이러한 도라지의 주요 약리성분은 트리테르펜계 사포닌(platycodin A, C, D, D₂, D₃)으로서 뿌리의 약 2%를 차지하며, 이 약리성분은 동물실험을 통하여 진해, 거담작용, 중추신경억제작용(진정, 진통, 해열효과), 급·만성 염증에 대한 항염증작용, 항궤양 및 위액분비억제작용, 혈관을 확장하여 혈압을 낮추는 항콜린작용, 혈당강하작용, 콜레스테롤 대사 개선작용 등이 있는 것으로 밝혀져 있다(Chem. Pharm. Bull., 20, 1952(1972), Chem. Pharm. Bull., 23, 2965(1975), J. Chem. Soc., Perkin trans I, 661(1984), Sogoigaku, 3, 1(1951), J. Pharm. Soc. Kor., 19, 164(1975)). 또한 알파-스피나스테롤, 스티그마스트-7-엔올, 알파-스피나스테롤글루코시드 등과 같은 스테로이드계 화합물과 이눌린, 베튤린과 같은 다당류도 도라지의 약리성분으로 단리되었다.

장생도라지(長桔)는 20년근 이상의 도라지를 말하는 것으로, 그 동안 도라지의 다양한 약리작용에도 불구하고, 장기간 재배가 어려웠으나, 최근 20년 이상의 도라지인 장생도라지를 재배할 수 있는 기술이 개발되어(이성호, "다년생 도라지재배법" 대한민국 특허 제045731호) 다량생산이 가능해졌다. 이러한 장생도라지는 2∼4년근의 일반도라지에 비해 약리작용과 생리활성효능이 우수하다.

현재까지 장생도라지에 관한 연구는 항당뇨효과에 관한 실험(J. Korean Soc. Food Sci. Nutr., 25, 986(1996)), 고지혈증에 관한 실험(J. Pharmaceutical Society of Japan 93(1973) 1188-1194) 등이 있으며, 간 예방 및 손상억제에 대한 연구 등이 계속되고 있다. 이외에도 도라지의 열수 및 에탄올 추출물은 곰팡이의 아프라톡신을 억제하며, 이눌린 분획은 식균작용과 고형암 및 복수암에 대한 강력한 항종양효능이 있고, 40% 도라지엑기스는 알코올흡수 억제작용이 있는 것으로 알려져 있다 (Mycopathologia, 66, 16(1979), Shoyakugaku Zasshi, 40, 367(1986), Shoyakugaku Zasshi, 40, 375(1986), JP60-89427(1985)).

인류 건강을 위협하는 악성종양, 즉 암은 세계적으로 사망원인의 1, 2위를 차지하고 있으며 심혈관 질환 다음으로 서구사회에서 가장 일반적인 사망원인이다. 현대사회에서 인구의 노령화, 흡연인구의 증가 및 대기오염으로 인한 폐암이 증가하고 있으며 식생활의 서구화에 따른 고지방식의 섭취, 환경오염물질의 증가, 음주 량의 증가 등으로 대장암, 유방암, 전립선암 등이 지속적으로 증가 추세에 있다. 따라서 암의 조기예방 및 치료를 가능하게 하여 인간건강의 증진, 건강한 삶의 질 향상 및 인류보건 증진에 기여할 수 있는 항암 물질의 창출이 절실히 요구되고 있다.

현재까지 암치료를 위해 개발된 약제들은 전신치료용 주사나 경구투여에 따른 혈류를 따라 전신에 작용하는 비특이성으로 암세포에 대한 특이성이 낮다. 따라서 약제투여에 따른 전신적인 부작용이 많으며 수술이나 방사선 치료에 비해 부작용이 많이 나타나는 단점이 있다. 기존의 항암 약물들을 이용하는 암치료 기간은 1주일에 3~5일씩 3~4주 간격으로 6개월 내지 1년 정도 투여함에 따라 다양한 항암제 부작용을 야기해 치료를 중단하는 사례가 많이 발생한다. 암세포를 직접 공격하여 약효를 발휘하는 기존의 화학적 치료법은 부작용이 매우 강할 뿐만 아니라 비특이성의 단점에도 불구하고 최근 수년간 획기적인 신약이 나오지 않고 있는 실정이다.

본 발명의 목적은 안전하고 독성이 없는 천연물인 장생도라지 추출물을 활성성분으로 포함하여 암전이를 억제하는 치료제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 장생도라지의 추출물을 유효성분으로 함유하는 암전이 억제제를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명자들은 안전하고 독성이 없는 천연물로부터 암세포에 대한 암전이를 억제하는 제제를 연구하던 중, 장생도라지의 추출물이 암세포(흑색종)의 폐전이, 세포부착, 세포침투 및 세포증식을 억제함을 탐색해 내고, 이를 토대로 본 발명을 완성하였다.

본 발명에 따른 장생도라지 추출물은 이 분야에서 통상적으로 사용되는 방법에 따라 제조된다. 장생도라지 추출물은 열수 추출물 또는 유기용매 추출물인 것이 바람직하며, 이러한 추출물은 단독으로 또는 허용 가능한 생약재를 첨가하여 제조될 수 있다. 일반적으로 장생도라지 추출시 장생도라지 분말을 사용하는데, 장생도라지 분말은 수분의 함량이 5％ 이하가 되도록 장생도라지를 건조하여 이를 분쇄한 다음, 입자 크기가 0.6mm이하 인 것을 선별하여 사용하는 것이 바람직하다.

열수추출물은 장생도라지 분말에 약 5∼10배의 물을 첨가하고 90∼100℃의 온도에서 4∼6시간 동안 2회 추출하여 얻은 여과액을 그대로 사용하거나 허용가능한 생약재 또는 생약재 추출물을 선택적으로 첨가하여 사용하는 것이 바람직하다.

유기용매 추출물은 장생도라지 분말에 약 3배의 유기용매를 첨가하고 실온에서 2회 추출하여 얻어진 여과액을 감압 농축하여 추출물에 허용가능한 생약재 또는 생약재 추출물을 선택적으로 첨가하여 제조된다. 유기용매로는 알코올이 사용될 수 있으며 메탄올, 에탄올이 바람직하게 사용될 수 있다.

본 발명의 장생도라지 추출물은 식품위생법상 또는 약제학적으로 허용가능한 보형제를 이용하는 공지의 방법으로 제제화되어 통상적인 방법에 따라 약학 제형을 제조할 수 있다. 제형의 제조에 있어, 활성 성분이 장생도라지 추출물을 담체와 함께 혼합 또는 희석하거나, 용기 형태의 담체내에 봉입시키는 것이 바람직하다. 담체가 희석제로 사용되는 경우에는 활성 성분에 대한 비히클(Vehicle), 부형제 또는 메디움(Medium)으로 작용하는 고형, 반고형 또는 액상의 물질일 수 있다. 따라서 제형은 정제. 환제, 분제, 엘릭시르, 현탁제, 유제, 용액제, 시럽제, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀제, 멸균 주사제, 멸균 분제 등의 형태일 수 있다. 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토즈(lactose), 덱스트로즈(dextrose), 수크로즈(sucrose), 소르비톨(sorbitol), 만니톨(mannitol), 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈 (polyvinylpyrrolidone), 물, 메틸하이드록시벤조에이트(methylhydroxybenzoate), 프로필하이드록시벤조에이트(propylhydroxybenzoate), 탈크(talc), 마그네슘 스타아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제형은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 장생도라지 추출물을 유효성분으로 포함하는 종양형성 및 암전이 억제제는 포유동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.

본 발명에 따른 장생도라지 추출물을 유효성분으로 포함하는 치료제는 목적하는 바에 따라 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 사람의 경우 통상적인 1일 투여량은 10 내지 1,000 mg/kg체중, 바람직하게는 10 내지 100 mg/kg체중의 범위일 수 있고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 실제 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 건강상태 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 한다.

이하 실시예 및 실험예로서 본 발명을 상세히 설명한다.

그러나 하기한 실시예는 본 발명의 바람직한 일 실시예일 뿐 본 발명이 하기한 실시예에 한정되는 것은 아니다.

(실시예 1)

(장생도라지 열수 추출물의 제조)

장생도라지 분말 0.2㎏에 증류수 2ℓ를 가하고 90∼95℃에서 5시간 동안 2회 추출한 후 여과하고 이를 동결건조하여 장생도라지 추출물 100 g 얻었다.

이하, 본 발명의 종양형성 및 암전이 억제제의 흑색종 암세포의 폐전이 억제효과, 세포 부착율(adhesion) 억제효과, 세포 침투능(invasion) 억제효과, 및 암세포 증식율(proliferation) 억제 효과를 알아보기 위해 하기와 같은 실험을 수행하 였다.

(실험 동물 및 처리)

1. 시약

시약은 다음의 것을 구입하여 사용하였다.

B16F10 세포주는 한국세포주은행에서 구입하였고, Matrigel, Hematoxylin, Eosin, Gelatin, EMEM 배양액, Trypsin, Fetal bovine serum은 시그마사 (Sigma chemical co)에서 구입하였다.

2. 동물

실험동물은 생후 8주된 25∼30g의 마우스 (C57BL/6 mouse)를 사용하였고, 사료 (purina korea)와 물은 자유롭게 섭취하도록 하였으며, 사육장의 온도는 21∼24℃, 상대습도는 40∼80%로 유지하였다. 또한 12시간마다 낮과 밤이 반복되도록 사육장내 빛을 조절하였다.

(실험예 1)

(장생도라지 추출물들의 C57BL/6 생쥐에서 흑색종 암세포주인 B16F10의 폐전이 억제효과)

1.실험방법.

장생도라지 추출물의 암세포 전이 억제 효과를 조사하기 위하여 전이성 melanoma 암세포 B16-F10을 C57BL/6 실험동물의 꼬리정맥을 통하여 주입한 다음 장생도라지 추출물들을 구강 투여한 후 폐에 전이한 melanoma 암세포 B16-F10의 colony를 Hematoxylin-Eosin 염색을 통하여 그 수를 계측하였다. 그 결과를 다음 표 1에 나타내었다.

장생도라지 추출물	처리 마리수	종양수	저해율(%)
0mg/kg	10	110±20	0
50mg/kg	10	56±15	49
100mg/kg	10	15±12	86

도 1은 장생도라지 추출물 처리농도에 따른 폐에 전이한 콜로니 수를 그래프로 나타낸 것이다. 도 2의 상단은 폐에 전이한 melanoma 암세포 B16-F10의 colony를 Hematoxylin-Eosin 염색한 후 사진 촬영한 것이고, 도 2의 하단은 그 조직을 파라핀으로 포매한 후 Hematoxylin-Eosin 염색한 것이다. 상기 표 1 및 도 1에서 알 수 있는 바와 같이, C57BL/6 생쥐에 흑색종 B16F10을 투여한 뒤 장생도라지 추출물들 14일간 농도별로 투여하고 폐 전이율을 알아보기 위해 폐에 전이한 흑색종 B16F10 암의 Colony 수를 계측하여 살펴본 결과, 장생도라지 추출물 농도에 의존적으로 폐에 전이한 콜로니 수가 감소하였다.

(실험예 2)

(장생도라지 추출물들의 흑색종 암세포 B16F10의 세포부착 억제효과)

1. 실험방법

장생도라지 추출물의 세포부착 억제효과를 조사하기 위하여 전이성 melanoma 암세포 B16F10을 gelatin 코팅이 되어있는 48 well plate에 계대배양 후 각 농도별 시료를 넣고 18시간 후에 세포부착 상태를 현미경 관찰을 통해 부착세포를 계수하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3은 장생도라지 추출물 처리농도에 따른 세포 부착억제율을 그래프로 나타낸 것이다. 도 3을 참조하면, 장생도라지 처리농도에 의존적으로 세포 부착억제율이 증가함을 확인할 수 있었다.

(실험예 3)

(장생도라지 추출물들의 흑색종 암세포 B16F10의 세포침투능 억제효과)

1. 실험방법

장생도라지 추출물의 암세포의 세포침투능 억제 효과를 조사하기 위하여 전이성 melanoma 암세포 B16F10을 matrigel 코팅이 되어있는 48 well plate에 계대배양 후 각 농도별 시료를 넣고 18시간 후에 세포침투 상태를 현미경 관찰을 통해 침 투세포를 계수하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4는 장생도라지 추출물 처리농도에 따른 침투한 세포수를 그래프로 나타낸 것이다. 도 4를 참조하면, 장생도라지 처리농도에 의존하여 침투한 세포수가 감소하여 흑색종 암세포주인 B16F10의 침투능에 대한 억제효과가 나타남을 확인할 수 있었다.

(실험예 4)

(장생도라지 추출물들의 흑색종 암세포 B16F10의 증식능 억제효과)

1. 실험방법.

장생도라지 추출물의 암세포에 대한 증식억제효과를 조사하기 위하여 전이성 melanoma 암세포 B16F10을 48 well plate에 계대배양 후 각 농도별 시료를 넣고 24시간 후에 세포증식 상태를 세포의 수에 비례하여 세포의 미토콘드리아 효소가 MTT를 환원시켜 formazan을 형성시킬 수 있음을 근거로 formazan의 농도를 측정하는 MTT 방법을 통해 증식된 세포를 계수하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5는 장생도라지 추출물 처리농도에 따른 암세포 증식 억제율을 그래프로 나타낸 것이다. 도 5를 참조하면, 흑색종 암세포주인 B16F10의 세포 증식율이 장생도라지 처리 농도에 의존하여 억제됨을 확인할 수 있었다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 장생도라지 추출물은 in vivo 동물실험에서 C57BL/6 생쥐에 흑색종 암세포주인 B16F10를 꼬리정맥으로 투여하여 폐전이를 유발 후 폐전이 억제효과를 확인한 결과 장생도라지 추출물 처리농도에 의존적으로 폐전이율이 감소하였으며, in vitro 실험에서 흑색종 암세포주인 B16F10을 이용하여 세포부착율(adhesion)에 대한 장생도라지 추출물들의 효과를 조사한 결과 장생도라지 추출물 처리농도에 의존적으로 흑색종 암세포주인 B16F10의 세포부착율이 감소하였다. 또한, 흑색종 암세포주인 B16F10을 이용하여 세포 침투능 (invasion)에 대한 장생도라지 추출물들의 효과를 조사한 결과 또한 장생도라지 추출물들의 처리농도에 의존적으로 흑색종 암세포주인 B16F10의 세포침투능이 감소하였으며, 이러한 장생도라지 추출물들이 흑색종 암세포주인 B16F10의 세포 부착율 및 침투 억제능에 대한 작용기작을 조사하기 위해 장생도라지 추출물에 대한 흑색종 암세포주인 B16F10의 증식율 (proliferation)을 조사한 결과, 암세포의 증식율도 장생도라지 추출물의 처리농도에 의존적으로 감소하였다.

(실험예 5)

(급성독성실험)

1. 경구투여

ICR계 마우스(25g)를 10마리씩 5군으로 나누어 본 발명에 따른 장생도라지 추출물을 각각 1, 5, 25, 125, 625mg/kg의 용량으로 경구투여한 후 2주간 독성여부 를 관찰한 결과, 5군 모두에서 사망예가 한 마리도 없었다.

2. 복강투여

ICR계 마우스(25g)를 10마리씩 4군으로 나누어 본 발명에 따른 장생도라지 추출물을 각각 0.2, 2, 20, 200mg/kg의 용량으로 복강투여한 후 24시간 동안 독성여부를 관찰한 결과 4군 모두에서 사망예가 한 마리도 없었다.

이상의 결과에서 본 발명의 장생도라지 추출물은 급성독성이 거의 없음을 확인하였다.

다음에 제제실시예로서 본 발명에 따른 장생도라지 추출물을 유효성분으로 포함하는 항암제의 제제화를 예시한다. 본 발명에 따른 항암제가 다음의 제제예에 의해 한정되는 것은 아니다.

(제제실시예 1)

(정제의 제조)

장생도라지 추출물 50mg

유당 20mg

전분 20mg

스테아르산마그네슘 적량

장생도라지 추출물을 유효성분으로 하여 상기의 성분을 통상의 정제방법에 따라 타정하여 정제를 제조하였다.

(제제실시예 2)

(캅셀제의 제조)

장생도라지 추출물 50mg

유당 20mg

전분 20mg

탈크 1mg

스테아르산마그네슘 적량

장생도라지 추출물을 유효성분으로 하여 상기의 성분을 통상의 정제방법에 따라 젤라틴 캅셀에 충진하여 캅셀제를 제조하였다.

이와 같이 본 발명은 안전하고 독성이 없는 천연물인 장생도라지 추출물을 활성성분으로 포함하는 치료제는 외부 물질이나 바이러스 감염에 의해 발생되는 암세포에 대한 암전이를 억제함으로써 암예방 및 치료제로 임상적으로 유용하게 사용할 수 있을 것이다.

상술한 바와 같이 장생도라지 추출물을 포함하는 암세포에 대한 전이를 억제시키는 조성물을 이용한 기능성 식품 / 의약품으로서 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (2)

1. 장생도라지 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 암전이 억제제.
2. 삭제

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