CN1738634B - 华千金藤的提取及使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了华千金藤提取物用于抑制、干扰和/或控制细胞组织的病理性血管新生或新血管形成的方法。通过把有效量的华千金藤提取物送入到细胞或组织中，本发明还提供了一种抑制组织中新血管形成的方法。这里提供的还有一种通过向接受治疗者投入有效量的华千金藤提取物而治疗内皮细胞和/或新血管形成相关的一种疾病之方法。

Description

华千金藤的提取及使用方法

发明领域

本发明涉及华千金藤(Stephaniae sinica Diels)的提取物，其具有抗血管新生之性能，可用于防止和/或治疗癌细胞转移及与病理性血管新生和新血管形成相关的健康类疾病。由此本发明涉及到新血管及癌细胞转移病理形成的新奇干预治疗法以及肿瘤的治疗方法。

发明背景

华千金藤属防己科类成员，是一种带有不规则块茎根的植物，直径约10厘米，重者达100公斤之多。其表皮为灰褐色，粗糙不平，且呈不规则的条纹状。其根部的横切面表露出一种白色或略带红色的浆状物，味苦。华千金藤或千金藤(Stephaniae)有许多不同的科学命名或俗名，如金不换、白药子(东方千金藤根)、血散薯(散薯根)、地不容(地藤根)、千金藤(日本千金藤根)、防己(防己藤根)和伞形千金藤。

长期以来，千金藤一直是用来减轻疼痛的药物，如胃痛、头痛、牙痛和风湿病。它还被用来排除人体内的有毒物质及治疗诸如喉咙痛、阿弗他溃疡、痈、蛇咬伤、痢疾和腹泻等疾病。另外，在外科手术期间，它还被用做肌肉弛缓剂。

血管新生是一个新血管生成的过程，即原先已有血管的派生物。在这一过程中，当蛋白水解酶进行降解作用时，内皮细胞逐渐与基底膜产生分离。然后，这些内皮细胞游离于母体血管之外，分裂并形成一种新的变异血管组织(Risau，(1997)《自然》386：671-674；Wilting等，(1995)《细胞分子生物学》，参考41(4)：219-232)。目前我们发现，多种不同的生物因子都对控制血管的形成产生作用(Bussolino等，(1997)“生物化学的发展趋势”，科学》，22(7)：251-256；Folkman和D’Amore，(1996)细胞87：1153-1155)。这些生物因子包括具有不同功能的蛋白质，如生长因子、细胞表面受体、蛋白酶、蛋白酶抑制物和细胞外母体蛋白质(Achen和Stacker，(1998)Int.J.Exp.Pathol.79：255-265；Devalaraja和Richmond，(1999)发展趋势；科学》，20(4)：151-156；Hanahan，(1997)《科学》277：48-50；Maisonpierre等，(1997)《科学》277：55-60；Suri等，(1996)细胞87：1171-1180；Sato等，(1995)《自然》376：70-74；Mignatti和Rifkin，(1996)酶蛋白49：117-137；Pintucci等，(1996)Semin Thromb Hemost 22(6)517-524；Vernon和Sage，(1995)《美国药理学期刊》147(4)：873-883；Brooks等，(1994)《科学》264：569-571；Koch等，(1995)《自然》376：517-519)。

血管新生参与了许多基本的生理活动，如发育、繁殖及伤口愈合等。在正常的条件下，血管新生都是在严格控制及高度调节的方式发生的，一般是在胚胎发育期间、成长期间以及一些特殊的情形下，如伤口愈合及女性生殖周期中(Wilting和Christ，(1996)《自然科学》83：153-164；Goodger和Rogers，(1995)《微循环》2：329-343；Augustin等，(1995)《美国药理学期刊》147(2)：339-351)。

然而，许多疾病或健康失调，如癌细胞转移、糖尿病视网膜病变、风湿性关节炎和其它诸如牛皮癣之类的疾病等，都是有长期没有规律的血管新生引起的(Folkman，(1995)《自然医学》1(1)：27-31；Walsh，(1998)《风湿病学》38(2)：103-112；Healy等，(1998)《人类生殖新知》4(5)：736-396)例如，在风湿性关节炎中，新的毛细血管侵袭关节并破坏了软骨组织。在糖尿病视网膜病变中，视网膜中的新毛细血管入侵玻璃状体，造成出血并引起失明。因此，对病理性血管新生进行有效的治疗干预、控制和/或抑制可以减轻许多重要的疾病。

这一血管新生的过程为控制体内血管形成的干预性治疗提供了节点。在实验模式中，我们发现了控制血管形成的血管新生蛋白质抑制剂如血管阻断素(O’Reilly等，(1994)《细胞》79(2)：315-328)和内皮抑素(O’Reilly等，(1997)《细胞》88(2)：277-285)等。不过，这类蛋白质疗法生产起来非常昂贵，且发现它们很难配制，很难注射到患者体内。目前，蛋白质血管新生抑制剂并没有发展成为治疗患者疾病的药物。因此，我们仍然需要一种可以安全地投入到患者体内并可以有效地抑制、干预、修改和/或控制血管内皮细胞病理性生长的治疗物质。我们本发明提供了适用于这一目的的组合物及方法。

发明内容

根据本发明，我们发现，华千金藤提取物可以抑制癌细胞转移、内皮细胞的生长及增生以及血管生成的过程。我们还发现，它对肿瘤的治疗非常有用，如有效地抑制肿瘤生长。本发明提供了一种抑制、修改和/或控制内皮细胞病理性增生的方法，包括将有效量的华千金藤提取物送到内皮细胞中的方法。在本发明的范围内，我们提供的是一种抑制细胞组织内新血管形成的方法，包括将有效量的华千金藤提取物送到内皮细胞中的方法。我们的发明还提供了一种治疗肿瘤患者的方法，包括将有效量的华千金藤提取物送到患者体内的方法。投入的华千金藤提取物可以有效地抑制肿瘤的生长。

通过投入有效量的华千金藤提取物到一个患者体内，我们可以实践抑制、修改和/或控制内皮细胞病理性增生的方法及抑制细胞组织内新血管形成的方法。其中每种方法及以上描述的治疗肿瘤的方法可以进一步地包括一种针对患者的抗血管生成、抗新血管生成或抗肿瘤疗法的应用，其中，华千金藤提取物可以增强抗血管生成、抗新血管生成或抗肿瘤疗法的治疗效果。抗血管生成、抗新血管生成或抗肿瘤疗法包括a)投入一种华千金藤提取物以外的抗血管生成剂或抗新血管生成剂(例如，鲨鱼软骨的硫酸胺沉淀物、鲨鱼软骨提取物、Shimeji DEAE alpha、Shimeji Mono-Q alpha、3-氨基苯甲酰胺和顺铂)给患者；b)投入一种抗肿瘤化疗剂给患者；或c)为患者采用放射性疗法。

通过给患者投入有效量的华千金藤提取物，本发明还提供了治疗与内皮细胞和/或新血管生成病理性增生相关的疾病之方法。同时，这一方法还进一步地包括了为患者采用一种抗肿瘤、抗血管生成或抗新血管生成的疗法，这一疗法包括化学疗法、放射性疗法或投入一种华千金藤提取物以外的抗血管生成或抗新血管生成剂。华千金藤提取物可以提高抗肿瘤、抗血管生成或抗新血管生成疗法的效果。

本发明还提供了一种防止及抑制癌细胞转移的方法，包括为癌症患者投入有效量的华千金藤提取物。

在本发明的范围内，我们还提供了包括有效量华千金藤提取物和治疗中使用该提取物的说明书的药盒。这些药盒对治疗那些患有与内皮细胞和/或新血管生成过度增生相关的疾病非常有用。

本发明进一步提供的是一种筛选识别新治疗药剂的方法以确认它们与华千金藤提取物具有相同的、类似的或更好的治疗效果。这种筛选方法包括把这一药剂对内皮细胞增生的效果与华千金藤提取物的抗增生效果进行比较。

附图简述

图1显示在内皮细胞测定试验中透析过的华千金藤提取物对内皮细胞增生抑制作用的数据。

本发明之详细描述

在本专利说明书及权利要求中，除非文中另行说明，否则所有单数形式如”a”、”an”和”the”等均包含复数含义。例如，“某个细胞”虽然为单数形式，但同样包含该细胞的复数含义以及单数和复数混合使用的含义。

本发明还提供了包含本发明的华千金藤提取物的产品，其发明的方法在操作时可以使用这一产品而不是提取物。其中，当过渡词“包含”指的是一种方法、物质或本发明的组合物时，则该方法、该物质或该组合物既包括了详细列举的各个要素，也并没有将其他未详细列举的要素排除在外。

本发明还提供了基本上由本发明的华千金藤提取物组成的一种产品，其发明的方法在操作时可以使用这一产品而不是提取物。这里的过渡短语“基本上由……组成”当用来定义本专利申请中本发明的一种组合物、物质或方法时，它表示既包含了详细列举的各个要素，也没有将实质上没有对本发明基本及新颖特性产生影响的那些未详细列举的要素排除在外。因此，一种基本上由华千金藤提取物或医学上可以接受的载体组成的专利申请组合物不应将来自提取物或本质上不影响该组合物之病理性血管形成抑制性能的物质如磷酸缓冲液、防腐剂和氯化钠的制备步骤中，如分离和提纯方法中，产生的微量污染物排除在外。

术语“分离”在指称一种天然物质时，其含义指这一自然物质从组成物、细胞及其他天然结合的成分中单独获取。

“受试者”为脊椎动物，最好是哺乳动物或人类，人类患者最佳。哺乳动物包括(但不仅限于)鼠类、猿猴类、马、牛、猪、羊、畜类、竞技类动物、宠物及人类，如人类患者。

术语“肿瘤”及“赘生物”既可用作单数也可用作复数形式，它是指细胞的异常生长，通常产生一种细胞组织堆积块，既可能是良性的，也可能是恶性的。

术语“癌症”既可用作单数也可用作复数形式，它是指经历了恶性病变的一个细胞聚合体。在本发明中，一个癌症细胞的定义不仅包括原代癌细胞，而且指源自癌细胞原种的任何细胞。因此，术语“癌细胞”包括转移的癌细胞、体外培养及源自癌细胞的细胞株。

在本文中，“抑制”内皮细胞生长或细胞组织的血管形成指的是阻止、推迟或延缓内皮细胞的生长、增殖或细胞分裂、或细胞组织中血管的形成。监测抑制的方法包括(但不限于)内皮细胞增殖化验、通过测定血液含量及测量血管床体积、以及定量测定血管结构的密度。当培养物质为细胞混合体时，监测新血管形成的过程需要通过定量测量能够体现内皮细胞特定指标的细胞加以完成，这些指标包括血管新生因子、蛋白水解酶、以及内皮细胞的特定细胞粘附分子等。

本发明还提供了一种“药物组合物”，目的是为了包括至少还含有其它物质的华千金藤提取物的组合物质，如一种载体、稳定剂、防腐剂或另一种有效成分，如另一种治疗性药剂，从而使该组合物适合在体内、体外进行诊断性或治疗性用途。“另一种治疗性有效成分”的范例，包括类固醇，如强的松、脱氢皮质(甾)醇、甲基强的松龙、氢化可的松、皮质酮和地塞米松，以及非甾族抗炎药物，如硫代苹果酸钠、硫代葡萄金、右旋青霉胺、氯喹、羟化氯喹、硫氮磺吡啶、咪唑硫嘌呤，和抗肿瘤制剂，如α干扰素、β干扰素、γ干扰素、2号白介素、阿地白介素、惠而血添(重组人粒细胞集落刺激因子)、沙格司亭(重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)、左咪唑、BCG疫苗、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、氟脱氧尿苷、阿糖胞苷、5-氮杂胞苷、巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、pentastatin、阿氟酸、克拉屈宾、二氟胞嘧啶、二氯甲基二乙胺、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、左旋溶肉瘤素、洛莫司汀、亚硝(基)脲氮芥、司莫司汀、链佐星、氮烯咪胺、白消安、三胺硫磷、六甲蜜胺、异环磷酰胺、顺铂、碳铂、甲基苄肼、放线菌素D、普卡霉素、博来霉素、亚德里亚霉素、道诺霉素、去甲柔红霉素、mitoxanthrone、丝裂霉素、长春新碱、长春碱、长春瑞宾、依托泊甙、替尼泊甙、太平洋紫杉醇、盐酸拓扑替康、天(门)冬酰胺酶、羟基脲、氯苯二氯乙烷、地塞米松、氨格鲁米特、雌二酮、乙烯雌酚、羟孕酮、甲孕酮、甲地孕酮、睾丸激素、氟羚甲基睾丸素、它莫西芬、亮丙瑞林和氟他胺。

在本文中，术语“药物学上可接受载体”的含义包含磷酸缓冲溶液、水(最好是消毒水)、乳化剂及各种湿润剂等任何标准的药物学载体。药物学载体、稳定剂和防腐剂的实例请参阅马丁·雷明顿1975年《药物学标准》第15版(麦克米伦出版公司，伊斯顿市)。

“有效量”是指能够对有利或预期效果产生影响的充足数量。例如，治疗量指能够获得预期疗效所用的量。预防性有效量是指能够防止疾病发作或疾病症状的必要量。

通过把一定量的华千金藤提取物生长抑制剂送入到细胞之中，本发明提供了一种对内皮细胞的病理性生长进行抑制的方法。本发明还提供了一种通过把一定量抗血管形成的华千金藤提取物送到细胞组织内而对组织内的血管形成进行抑制的方法。这些方法既可以在体内操作，也可以在体外操作。当在体外操作时，内皮细胞或血管化组织在业内专业人士熟知的条件下进行培养，具体如下所述。这些细胞和/或组织既可以从现存的细胞株中进行培养，也可以从受试者即患者身上得到的活组织切片检查中进行培养。然后，这些细胞和/或组织被投入一定量的华千金藤提取物，例如，可以把华千金藤提取物加入到细胞和/或组织的培养基中。

根据本发明，华千金藤提取物的制备方法如下：将华千金藤或其中部分如叶、茎干、分枝、嫩枝、块茎根、根肉或块茎根内部或块茎根表皮(最好是过筛的、压碎的或碾碎的)投入到一种有机溶剂中或最好是含水介质(可以在0°到200℃之间选择，优选4℃到100℃，如4℃和10℃，或室温如20℃到25℃、40℃、60℃、80℃或100℃)，从而把所得的液体与至少一些、或全部、最好是全部华千金藤的固体部分分离开来，以获得一种液体形式的提取物，这一液体提取物还可以通过溶剂蒸发或冻干法在除去有机溶剂或水之后将之还原成固体形态，从而获得固体形态的提取物。有机溶剂最好是极性有机溶剂，如某种醇类，如甲醇、乙醇、N-丙醇、异丙醇、N-丁醇、异丁醇和叔丁醇，最好是甲醇和乙醇。另外，在制备本发明华千金藤提取物时，优选用华千金藤的块茎根或部分块茎根做原料，如此，块茎根(鲜活的或干燥的或两种的混合)或部分块茎根(鲜活或干燥)被放进含水介质或有机溶剂之中，然后采用离心过滤或过滤的方法从固体物中得到液体产物。进一步优选通过将华千金藤或其中的任何部分，如块茎根的根肉，即块茎根内部与表皮分开，(最好是经过筛选、粉碎或磨碎)投入到有机溶剂或含水介质之中进行制备，从而把所得液体与华千金藤的固体部分分离开来，形成一种液体物质，并把含有某些分子量的化合物通过透析法、超滤法或层析法从这一液体物质中除去，以获得液体形式的提取物，所述要除去的化合物分子的分子量为约150到3500、优选约150到2000、更优选约150到1000，进一步优选约200到600、再优选约200到400或约300到500，最优选300到400。这一液体提取物还可以在除去有机溶剂或水之后将之还原成固体，从而获得固体形态的提取物。

肿瘤的生长，特别是固态肿瘤或固态癌症依赖于病理性的血管新生或新血管形成。本发明还提供了一种抑制某种肿瘤生长的方法，一般是固态肿瘤、癌症或固态癌症，这一方法包括向肿瘤投放一定有效量的华千金藤提取物。

并不是每一个疗法对对每一个体都有效，因此，采用试管化验的方法检测出每一个受试者(即患者)的施药功效是有益的。本发明提供了测定华千金藤提取物疗法是否能治疗某一受试者(即患者)与内皮细胞病理性增生相关的特定疾病的一种方法。例如，从该受试者体中分离出某一细胞活组织切片，然后与有效量的华千金藤提取物或含有该提取物的药物组合物进行接触。使用传统程序(如以下要描述的CPAE化验)测定内皮细胞病理性生长的抑制，表明华千金藤提取物或含有该提取物的药物组合物是否能有效地治疗该受试者(即患者)的疾病。

通过向受试者(即患者)体内投入有效药量的华千金藤提取物或含有该提取物的药物组合物，本发明还提供了一种治疗与患者病理性新血管形成相关的失调症之方法。在本文的上下文中，进行“治疗”意味着减缓与病理性新血管形成相关的症状或减轻新血管形成。这类失调症包括(但不限于)关节炎症状、基于新血管形成的皮肤病症状、糖尿病视网膜病变、再狭症、卡波西氏肉瘤、老年黄斑病变、毛细血管扩张、青光眼、瘢痕瘤、角膜移植排斥、创伤性肉芽、血管纤维瘤、遗传性出血性毛细血管扩张症、心肌血管新生、牛皮癣、硬皮病及一些炎症，如由病理性血管形成或新血管形成相关或造成的痔疮。典型的关节炎症状为风湿性关节炎和骨关节炎。

本发明还提供了一种预防或抑制(如阻止、减少、减缓或推迟)癌细胞转移的方法，包括将华千金藤提取物投入到某个癌症患者体内的方法；其中，该患者确实非常需要加以预防或抑制。投入华千金藤提取物以治疗关节炎症状会减轻软骨(特别是关节)中的血管形成，从而增强这些区域的机动性和适应性。就治疗牛皮癣而言，投入华千金藤提取物会减少一些皮肤病的症状，如结疤、片状剥落和皮肤表体下的可见血管。就治疗糖尿病视网膜病变而言，投入华千金藤提取物会减少视网膜中新异血管的形成，从而使视觉不受阻碍。就治疗卡波西氏肉瘤而言，投入华千金藤提取物会抑制血管的生长或更进一步的形成，从而抑制住伤害的形成。

华千金藤提取物投送的方式可以是口入式、口腔式、鼻入式、直肠式、静脉注射式、腹膜腔引流式、肌肉注射式、或局部性方法，如经过皮肤或眼部、阴道或吸入式。当华千金藤提取物被投入到接受治疗者(如人类，人类患者，或其它哺乳动物，如老鼠、家鼠、马、猪、羊和牛等)体内时，这些提取物可以与医学上可以接受的载体混合在一起，然后投入到患者体内。华千金藤提取物的药剂量根据熟悉这一技艺的人士之经验加以确定，并随接受治疗的症状、关联的病理、瞄准的细胞类型以及接受治疗的患者而加以变化。华千金藤提取物(固体还是液体？其中活性物的含量？)的药剂量可以在每天0.01毫克及每天1克之间变化，优选每天0.1到500毫克、更优选1到100毫克、进一步优选1到50毫克。在整个治疗过程中，体内投入可以采取一个剂量、持续性或间歇性方式进行。

药剂组合物可以采取片剂、锭剂、颗粒、胶囊、丸剂、针剂、栓剂或气雾剂的形式。它们还可以采用活性成分在含水或非水稀释剂中的悬浮液、溶液和乳液形式、或者糖浆、颗粒或粉末等。

虽然华千金藤提取物可以采取单独投入的方式，但它还可以以药物制剂的形式出现，制剂的内容包含华千金藤提取物连同一种或多种医学上可以接受的载体及可选的其它治疗剂。每一载体必须是“可接受的”并与制剂中其它成分相容，且对受试者如人类患者无害。

药物制剂可方便地以单位剂量形式出现，也可以采用加入华千金藤提取物液态载体或细分的固态载体的方法进行制备，然后，如果必要，将之制备成型。

本发明适宜口服的制剂可以采用散剂的方式，如胶囊、扁胶剂或片剂，每一种都含有预定量的华千金藤提取物；还可呈粉状或颗粒状；或呈一种含水或非水液态中的溶液或悬浮液状；或水包油液体乳剂或油包水液体乳剂。华千金藤提取物也可以为大丸药、干药糖剂或浆状物。

片剂可以通过华千金藤提取物的压缩和成型进行制作，可根据需要添加一种或多种附属成分。压缩的片剂可以通过适当的机器压缩松散形式中的有机成分(如粉末或颗粒)而制备，如果需要，还可以与粘合剂(如聚乙烯吡咯酮、凝胶、羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(如羟基乙酸淀粉钠、交联聚乙烯吡咯酮、交联羧甲基纤维素钠)和表面活性剂或分散剂混合。模制片剂可以采用适当的机器将粉末状的化合物混合物用惰性液体稀释剂湿化后经模制加工而成。如果需要，片剂还可以包衣或刻痕，还可以为使那些有效成分以缓慢而加以控制地释放的方式进行制剂，例如采用不同比例的羟丙基甲基纤维素，就可以达到所期望的释放形式。根据需要，片剂还可以提供肠溶包衣，使其部分在肠内释放而不是在胃部释放。

适用于口腔局部投药的制剂，包括风味化有效成分的锭剂，所述风味剂通常为蔗糖和阿拉伯树胶或黄蓍胶；包括含惰性基质的华千金藤提取物的芳香熏剂，所述惰性基质如凝胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯树胶；包括含适当液态载体的华千金藤提取物的漱剂。

根据本发明，适用于局部投药的药剂组合物可以配制成一种药膏、乳霜、悬浮液、洗剂、粉末、溶液、软膏、凝胶、喷剂、气雾剂或油状物。此外，一种制剂可能包含一种贴片剂或敷料，如浸含华千金藤提取物的绷带或粘合剂膏药，同时根据需要其中还可以含有一种或多种赋形剂或稀释剂。

有些药物制剂实施方案可以为一种局部涂敷用的含有华千金藤提取物的药膏或乳霜。当配制成一种药膏时，提取物既可以与石蜡，也可以与水混合式药膏基质一起使用。此外，药物成分可与水包油乳霜基质配制成一种乳霜。

如果需要，乳霜基质的水相可包括，例如，至少约30％w/w之多元醇，即具有两个或多个羟基醇，如丙二醇、丁烷-1、3-二醇、甘露醇、山梨糖醇、丙三醇和聚乙二醇及以上之混合物。局部制剂可根据需要包括可促进华千金藤提取物经由皮肤或其它感染区域吸收或穿透之化合物。这类真皮穿透增强剂的实际范例包括二甲亚砜和及相关的类似物。

本发明乳状液之油相可用现有技术的成分以任何现有技术的方式构成。虽然此油相可以仅仅包含一种乳化剂(即为熟知的利泄剂)，但它还可以根据需要包括至少一种乳化剂与脂肪或油或脂肪与油之混合物。较理想的是，亲水的乳化剂还与用作稳定剂的亲脂乳化剂一起包括在内。优选既把油又把脂肪包括在内。总之，含有或不含有稳定剂的乳化剂组成了所谓的乳化蜡，蜡与油一起和/或脂肪组成了所谓的乳化药膏，从而形成了乳霜制剂的油性分散相。

适用于本发明之制剂的利泄剂和乳化稳定剂包括Tween 60、Span 80、十六醇和十八醇混合物、肉豆寇醇、单硬脂酸甘油酯和十二烷基硫酸钠。

由于活性化合物在大多数用于医药学乳液制剂的油中其溶解度都非常低，所以可根据所需求的化妆品特性选择适当的油类或脂肪进行配制。因此，乳霜最好应是具有适当的坚硬度的非油脂的、非染色的以及可清洗的产物，以避免从试管或其它容器中漏出。可以使用直链的或支链、单或二烷基的烷基酯类，如二异己二酸酯、硬脂酸十六烷基酯、椰子脂肪酸丙二醇二酯、异丙基肉豆蔻酸酯、油酸癸酯、异丙基棕榈酸酯、硬脂酸丁酯、2-乙基己基棕榈酸酯或名为Crodamol CAP的支链酯类掺合物，后三者为较理想的酯类。这些可以单独使用，也可以根据所要求的特性结合使用。此外，可使用高熔点的脂质，如白色软石蜡和/或液体石蜡或其它矿物油。

适用于眼睛局部投药的制剂还包括眼药水，其中之有效成分可溶解于或悬浮于适当的载体内，特别是这种有效成分的含水溶剂。直肠投药的制剂表现为具有适当基质的栓剂，包括，例如可可油和水杨酸盐。

适用于阴道投药的制剂可以是阴道栓剂、止血塞、乳霜、凝胶、软膏、泡沫胶或喷雾剂等，这些制剂含有华千金藤提取物及一种或多种适宜的载体。

适用于鼻腔投药的制剂(其载体为一种固态物质)包括颗粒大小的粗粉末，其大小从20微米到500微米左右，投药的方式为鼻吸入式，即通过鼻腔从靠近鼻孔的容器内快速吸入粉末。而适用于投药的液体载体制剂表现为鼻喷液、鼻腔滴液或采用喷雾器进行气雾剂投药，这些制剂包括华千金藤提取物之含水溶液或油溶液。

适用于肠胃外投药的制剂包括含水或非水的等渗消毒注射溶液，它们可含有抗氧化剂、缓冲溶液、细菌抑制剂和使制剂与预期受体的血液等张的溶质；它还包括水溶性或非水溶性的消毒悬浮液，如悬浮剂、增稠剂和脂质体或其它用来使华千金藤提取物指定导向血成分或一个或多个器官的微颗粒系统。这些制剂可存在于单位剂量或多剂量密封容器之中，如安瓿和玻璃瓶，并可以存放在一个冷冻干燥(冻干的)条件下，在使用之前仅需加入消毒的液体载体，如注射用水。即用的注射溶液和悬浮液可以从先前描述的消毒粉末、颗粒和片剂进行配制。

除了以上特别提到的成分外，本发明的制剂可包括其它业内常规的、与讨论中制剂类型相关的试剂，例如，那些适用于口腔投药的制剂可进一步包括诸如甜味剂、增稠剂和风味剂等之类的试剂。

华千金藤提取物及包含一种或多种该提取物的组合物也可作为兽医制剂的形式使用，可以采用业内常规的方法进行制备。

本发明进一步提供了一种医疗药剂的筛选方法，以抑制新血管形成或内皮细胞的增长。其筛选要求如下：

(a)将一种试验药剂与适当的细胞或组织样本接触；

(b)将适当细胞或组织样本的分离样本与有效治疗量的华千金藤提取物接触，然后，

(c)比较步骤a)样本中的内皮细胞增长和步骤b)样本中的内皮细胞增长，其中，步骤a)中用以抑制内皮细胞增长的任何试验药剂与步骤b)中的几乎一样，都可以用做抑制新血管形成或内皮细胞病理性增长的药剂。

实施例1

采用华千金藤提取物抑制内皮细胞增生

华千金藤提取物的制备

将华千金藤块茎根的表皮与其根肉分离开来。将一份20到30克的根肉在二次蒸馏水中磨碎，使其成为均匀分布的微粒；蒸馏水的体积为根肉的五倍到10倍，然后让其在4°或100℃的温度下驻留2到4个小时，加以搅拌，获得一种混合物。然后，采用Miracloth双层滤膜对这种混合物进行过滤，除去固态的残留物质。这种混浊的滤出液在室温下以每分钟约1,500的转数加以澄清。上清液从沉淀物中轻轻倒出，获得一种透明溶液，可用做本发明的华千金藤提取物。但在这一实验中，可将这种透明溶液冻干，成为一种冻干的粗提取物，也可以作为本发明的华千金藤提取物而储藏。然后，这种冻干的粗提取物在二次蒸馏水中进行溶解，并三次换用二次蒸馏水、以截止分子量为1000MW或3500MW的透析管进行透析过夜。透析后，保留在透析管内的液体，即保留物，就成为华千金藤提取物之一种形式。将1.0K和3.5K的透析保留物冻干，从而获得该提取物的固态形式，然后按照以下描述的方法进行生物学化验。

内皮细胞化验

以上制备的华千金藤提取物(即在截止点为1000MW或3500MW的管中透析后再进行冻干的)被用于一种内皮细胞化验之中(即CAPE)，可根据Connally等人的《模拟生物化学》(1986年)152：136-140及修改稿中介绍的程序进行(Liang和Wong(2000)，《血管新生：从分子到综合的药理学》，由Maragoudakis、Kluwer Academic/Plenum出版社编辑出版，纽约pp209-223)。为了比较之目的，这种冻干的粗提取物(即在4℃或100℃的温度下提取后未透析的物质)也用于生物测定。

内皮细胞培养化验的结果如表1所示。经发现，华千金藤提取物可以抑制内皮细胞的增长。这一内皮细胞化验的结果表明，把华千金藤提取物加入到内皮细胞化验中，可以有效地抑制内皮细胞的增长。在化验中，4℃条件下的华千金藤提取物在透析前引起内皮细胞生长90.85％之抑制率，然后3.5K的滞留物表现出93.29％的抑制率，1.0K的滞留物则为93.35％之抑制率。此结果强烈地显示，在低温条件下提取的华千金藤提取物是一种非常有效的内皮细胞增长抑制剂。而高温条件下(100℃)制备的华千金藤提取物也表明了较高的抑制性能(透析前为71％，其3.5K的滞留物为60.98％，其1.0K的滞留物为67.54％)。然而，高温条件下的提取物表现出来的效果比低温提取物的效果在产生具有抗血管新生的活性中要差一些。

表1：高低温条件下制备华千金藤提取物之内皮细胞生长抑制率

	低温提取法(4℃)	高温提取法(100℃)
			未透析	90.85％	71％

	低温提取法(4℃)	高温提取法(100℃)
			3.5K透析液	35.28％	27.68％
3.5K滞留液	93.35％	60.98％
			1.0K滞留液	93.29％	67.54％

采用冻干的华千金藤水溶性提取物(提取温度在4℃)之1.0K保留物在抑制内皮细胞增生的效果上与其浓度的依赖关系，如图1所示。

实施例2

作为测定华千金藤提取物药剂量的一个动物模型范例，我们选择了几组裸鼠(Balb/c NCR nu/nu雌性，Simonsen，Gilroy加拿大)，每组都采用皮下注射的方式嫁接约10⁵到10⁹高增生状态的细胞，其定义如本文所述。当嫁接完成后，通过在嫁接的周围采用皮下注射的方式投入提取物。测定嫁接尺寸减少的大小可以采用维内尔测径器每周检查两次。

实施例3

其中，我们提供了测定本发明提取物在治疗关节炎症时的药剂效果。受试者为美国缅因州杰克逊实验室的MRL/lpr老鼠(MRL/MpJ-Fas^lpr)，其对试验或监测本发明提取物治疗关节炎症的功效非常有用。老鼠投入了提取物后，在X光线的监控下，动物的关节和后腿的肿胀明显减少，软骨退化也有所下降，这都充分表明了这一提取物对治疗关节炎症的积极效果。

实施例4

其中，我们还提供了采用动物模型测定本发明提取物在治疗关节炎症时的药剂效果的另外一个例子。受试者为几组Lewis老鼠(年龄：8周；重30-150g，来自美国缅因州杰克逊实验室)，采用二类(BII)牛骨胶原进行免疫处理以诱发关节炎症状。BII在400ug/ml的条件下在0.1M的乙酸中溶解。每只老鼠都在尾巴的底部皮内注射了20ug(100ul)的一种乳剂，其中BII和ICFA(不完全Freund之佐剂)的量相等。当确定了关节炎症状时，将本发明中的华千金藤提取物投入到老鼠体内，然后按四级评分制对多种诱导性鼠体疾病进行为期28天的观察，结果显示，这种提取物对治疗关节炎症有效。

Claims (13)

1.一种含有华千金藤提取物的产品，这种提取物是通过如下方法制备的：

将华千金藤块茎根的表皮与其根肉分离开来；将一份20到30克的根肉在二次蒸馏水中磨碎，使其成为均匀分布的微粒；蒸馏水的体积为根肉的五倍到10倍，然后让其在4°或100℃的温度下驻留2到4个小时，加以搅拌，获得一种混合物；然后，采用Miracloth双层滤膜对这种混合物进行过滤，除去固态的残留物质；这种混浊的滤出液在室温下以每分钟约1,500的转数加以澄清；上清液从沉淀物中轻轻倒出，获得一种透明溶液；将这种透明溶液冻干，成为一种冻干的粗提取物；然后，这种冻干的粗提取物在二次蒸馏水中进行溶解，并三次换用二次蒸馏水、以截止分子量为1000MW或3500MW的透析管进行透析过夜；透析后，保留在透析管内的液体，即保留物，就成为华千金藤提取物的一种形式；将1.0K和3.5K的透析保留物冻干，从而获得该提取物的固态形式。

2.权利要求1所述的含有华千金藤提取物的产品在制备具有抑制内皮细胞病理性生长活性的药物中的用途。

3.权利要求2中的用途，其中，在组织和器官内的内皮细胞，可以取得抑制组织或器官中新血管形成的效果。

4.权利要求3中的用途，其中，该产品被投入到体外的内皮细胞之中。

5.权利要求3中的用途，其中，该产品被投入到体内的内皮细胞之中。

6.权利要求5中的用途，其中，通过把有效量的药剂投放给患者，该产品被投入到内皮细胞之中。

7.权利要求6中的用途，其中，患者需要抑制其病理性血管新生。

8.权利要求7中的用途，其中，对患者治疗有效的病症包括关节炎。

9.权利要求6中的用途，其中，患者为哺乳动物。

10.权利要求9中的用途，其中，哺乳动物为宠物、家畜或人类患者。

11.治疗患者病理性新血管形成相关的疾病的药盒，包括药用有效量的权利要求1产品以及治疗用说明书。

12.一种制备权利要求1中产品的方法，包括以下步骤：

将华千金藤块茎根的表皮与其根肉分离开来；将一份20到30克的根肉在二次蒸馏水中磨碎，使其成为均匀分布的微粒；蒸馏水的体积为根肉的五倍到10倍，然后让其在4°或100℃的温度下驻留2到4个小时，加以搅拌，获得一种混合物；然后，采用Miracloth双层滤膜对这种混合物进行过滤，除去固态的残留物质；这种混浊的滤出液在室温下以每分钟约1,500的转数加以澄清；上清液从沉淀物中轻轻倒出，获得一种透明溶液；将这种透明溶液冻干，成为一种冻干的粗提取物；然后，这种冻干的粗提取物在二次蒸馏水中进行溶解，并三次换用二次蒸馏水、以截止分子量为1000MW或3500MW的透析管进行透析过夜；透析后，保留在透析管内的液体，即保留物，就成为华千金藤提取物的一种形式；将1.0K和3.5K的透析保留物冻干，从而获得该提取物的固态形式。

13.一种抑制内皮细胞增生的药用组合物，包括权利要求1中的产品和医学上可以接受的药剂载体。

Images