CN102406666B - 五倍子缓释凝胶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种五倍子缓释凝胶的制备方法，它包括：1、称取五倍子原药，粉碎、过140目筛，用去离子水振摇、过滤、离心，取上清，置入冷冻箱冷冻后放入冻干机内制成冻干粉，60Co照射，4℃冷藏备用；2、取二氯甲烷和三乙酸甘油酯配制成混合溶剂，再加入聚乳酸-羟基乙酸共聚物，溶解后，加入制好的冻干粉；三者之间比例为：61:35:4，充分搅拌均匀，漩涡震荡，制成淡黄色五倍子凝胶，避光4℃保存24h即得成品。本发明的优点在于凝胶遇水凝结，利于牙周膜细胞增殖并优先占据根面，形成新附着；五倍子鞣质可对常见的牙周可疑致病菌具有广谱的抗菌作用，作为防治牙周病的药物具有深入研究开发的医药价值和经济价值。
Description
技术领域
本发明涉及治疗牙周病的缓释剂，尤其是涉及一种五倍子缓释凝胶的制备方法。
背景技术
牙周病是口腔常见病和多发病，是导致成人失牙的主要原因之一。牙周病的治疗一般分为手术治疗和非手术治疗。非手术治疗是通过机械性刮治，消除菌斑及其他局部刺激因素，并辅以药物治疗控制和提高治疗效果，减少复发。但这些治疗手段目前尚未得到满意的临床疗效，其中基础治疗配合药物辅佐治疗对于减少牙周袋深度差别幅度不大（大多在1mm以内）。牙周病发展到较严重阶段后，则需手术治疗，其目的主要是促使牙周附着结构的再生，即形成新的牙周附着。主要有植骨术或骨替代品植入术以及引导组织再生术等。前者是采用骨或骨的替代品等移植材料来修复因牙周炎造成的牙槽骨缺损。后者是利用膜材料作为屏障以阻挡牙龈上皮在愈合过程中沿根面生长，阻挡牙龈结缔组织与根面的接触，并提供一定的空间，引导具有形成新附着能力的牙周膜细胞优先占领根面。但目前疗效的把握性及预期性仍较小，适应证范围仍较局限，且需要经历创伤性手术治疗，给患者带来痛苦。
既能杀灭牙周致病菌，又能拮抗各种细胞因子，且能起屏障作用的局部缓释剂由于具有持续稳定的有效药物浓度，发挥较长时间的治疗作用，减少用药频率，毒副作用小，患者的依从性好等优点，已成为牙周病治疗的主要用药方式。1979年，Goodson首次报告了用含四环素的空管纤维置于牙周袋中治疗慢性牙周炎，其用药量只相当于全身用药的1/1000，由此开创了牙周局部缓释治疗的新途径。研究发现运用四环素纤维与全身用药的4-8μg/mL相比，其龈沟液中的平均药物浓度可达1590μg /mL并保持10d，而且在抑制龈下微生物的同时也不会出现毒副作用，目前国外上市的四环素纤维有Actisite等。但缺点在于不可吸收，治疗结束后必须将其取出，而且发现四环素纤维膜用于治疗青少年牙周炎时，它对伴放线放线杆菌没有抑制作用。我国自行研制的牙康已在治疗牙周病临床上应用多年，其缺点是在牙周袋内有效药物浓度维持时间较短，约2-3d。欧阳翔英等在比较其临床疗效时，实验组需每天放置药物2次，操作比较频繁，使用不便。国内其他学者也研制了甲硝唑药膜，同样取得了一定疗效，但亦存在性能单一，效用范围有限的问题，而且有研究报道在机械刮治的基础上局部应用甲硝唑对抑制伴放线放线杆菌感染无效。
凝胶类的缓释剂产品如日本产的派丽奥，它是包含2%盐酸二甲胺四环素的可生物吸收的持续缓释剂，该制剂每周使用一次，但研究发现，该凝胶制剂只能减少牙龈卟啉单胞菌，而对中间普氏菌，具核梭杆菌，直肠弯曲菌，伴放线放线杆菌及微小消化链球菌均无影响，即使是联合治疗也不会改善牙周袋探诊深度及牙周附着水平，即不能显著增加刮治和跟面平整的疗效，用作牙周炎辅助治疗的长期疗效还有待商榷；美国产品盐酸多西环素凝胶可生物降解，含10%强力霉素、33%聚合物（DL 丙交酯）和57%NMP（N-甲基-2-吡咯烷酮），分装在两个注射器中，用前混合注入牙周袋内，其中的NMP被水置换使聚合物变成半固体，贴附在牙周袋内缓慢分解释放药物，在龈沟中的药物浓度可维持420μg/mL以上达7d，能有效减轻牙周炎的症状。但是对于这种用药方式联合根面平整能否增进牙周健康尚无定论。
近年来，对天然药物五倍子在口腔疾病防治中的研究较多，天然药物五倍子又名文蛤、百虫仓、木附子，为漆树科植物盐肤木（Rhus chinensis Mill.）、青麸杨（Rhus potaninii Maxim）或红麸杨（Rhus pun-jabensis Stew.var.sinica (Diels) Rehd. et Wils.）叶上的虫瘿，主要由五倍子蚜Melaphis chinensis (Bell) Baker寄生而形成，是我国特有的地产资源，产量极其丰富。
五倍子味酸，涩，性寒。其功效为：敛肺；止汗；涩肠；固精；止血；解毒。
五倍子的化学成分主要包括：①鞣质，分子结构为C76H52O46，是倍酚葡萄糖的混合物，即葡萄糖上的羟基与没食子酸所形成的酪类化合物的混合物，属水解类鞣质。鞣酸含量很高，最高可达 80%。② 没食子酸，是药物中间体，含量约占2%～4%。③五倍子油成分，其化学成分为癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕搁酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸等 8 种。④矿物质微量元素，五倍子中含有多种金属矿物质微量元素，包括铜、锌、铁、镁、铀、钙等的化合物。⑤其他成分，如树脂、脂肪物质、淀粉、蜡质等成分。但将其作为成熟的治疗药物作用于临床，则尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种有效治疗牙周疾病的五倍子缓释凝胶的制备方法。
为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：
本发明所述的五倍子缓释凝胶的制备方法，它包括下述步骤：
第一步，五倍子冻干粉的制备：
称取五倍子原药，敲开、清洗以去净虫垢，晾干； 0℃条件下粉碎、过140目筛，然后加入去离子水，室温下150rpm振摇48小时，过滤、离心，取上清，置入-70℃冷冻箱12小时后取出，将其放入冻干机内，在0.6mbar 条件下，制成淡黄色冻干粉，60Co照射30分钟，4℃冷藏备用；
第二步，凝胶制备：
取二氯甲烷和三乙酸甘油酯，按二氯甲烷:三乙酸甘油酯=7:3之比例配制成混合溶剂，再加入聚乳酸- 羟基乙酸共聚物，静置，待聚乳酸－羟基乙酸共聚物完全溶解后，加入第一步制好的五倍子冻干粉；混合溶剂: 聚乳酸- 羟基乙酸共聚物: 五倍子冻干粉=61:35:4，充分搅拌均匀，漩涡震荡，制成淡黄色五倍子凝胶，避光4℃保存24h即得成品。
成品药物于2-15度阴凉避光保管。
药品规格：0.5g/支，五倍子含量20mg/支。
使用方法：牙周病患者洁治或龈下刮治后，将本发明所制凝胶注满患者牙周袋内，每周一次，连续用四周。
本发明的优点在于利用具有可溶性，无毒、无抗原性的生物可降解材料---聚乳酸-羟基乙酸共聚物作为药物缓释载体，将其与五倍子冻干粉混合后制成凝胶注入牙周袋内，凝胶遇水凝结，发挥屏障结构的功能，以阻止牙结缔组织、上皮与根面的接触，以利于牙周膜细胞增殖并优先占据根面，进而形成新附着；五倍子冻干粉中的主要有效成分五倍子鞣质可对常见的牙周可疑致病菌具有广谱的抗菌作用，还可抑制内毒素诱导细胞炎性因子的释放，并能显著降低胶原酶的活性，二者结合后制得的缓释凝胶对牙周组织有明显的保护作用，非常符合临床标准，作为防治牙周病的药物具有进一步深入研究开发的医药价值和经济价值。其优异效果主要表现为：
1、本发明凝胶制剂质地均匀，细腻，有一定粘稠度，能顺利通过0.45mm注射针头，遇水凝结后质软，粘性大，能贴附在牙齿壁上，并且稳定性好。凝胶中药物释放可持续7d，累计释放率超过80%，最低药物浓度远远高于6.25μg/mL。
2、本发明凝胶制剂培养1-7d的细胞密度和形态均呈长梭形和多角形，细胞突细长，伸展性良好，呈放射状排列，胞体丰满，胞质均匀，核圆形或卵圆形。其细胞毒性均为1级，可达到理想的生物安全性，符合临床治疗的要求。
3、本发明凝胶制剂可有效拮抗LPS对HPDLFs的抑制作用，提高细胞ALP活性，有效抑制LPS介导细胞分泌MMP－3，且抑制作用可持续7d。
4、本发明凝胶制剂对Pg、Fn、Pi均有一定抑制作用，其中对Pg和Fn的抑菌效果明显优于日本产品派丽奥。
5、本发明凝胶制剂在动物实验中治疗效果良好，PD、BOP、GI均有明显好转。其中PD下降幅度较好； X线片显示五倍子CEJ-B距离明显缩短。
附图说明
图1是本发明缓释凝胶释放液对L-929细胞的增殖率和毒性分级。
图2是不同时间点凝胶释放液对LPS抑制HPDLFs增殖的影响。
图3是不同时间点凝胶释放液对LPS抑制HPDLFs中ALP活性的影响。
图4是本发明缓释凝胶、派丽奥软膏、蒸馏水和2%洗必泰对牙龈卟啉单胞菌(Pg)的抑菌环。
图5是本发明缓释凝胶、派丽奥软膏、蒸馏水和2%洗必泰对具核酸杆菌(Fn)的抑菌环。
图6是本发明缓释凝胶、派丽奥软膏、蒸馏水和2%洗必泰对中间普氏菌(Pi)的抑菌环。
图7是非药物载体空白对照组的临床观察图片。
图8是派丽奥对照组的临床观察图片。
图9-10是本发明缓释凝胶的临床观察图片。
图11、图12是非药物载体空白对照组的基线、用药4w后的X线片。
图13、图14是是派丽奥对照组的基线、用药4w后的X线片。
图15、图16是本发明缓释凝胶组的基线、用药4w后的X线片。
具体实施方式
本发明所述的五倍子缓释凝胶的制备方法，它包括下述步骤：
第一步，五倍子冻干粉的制备：
称取五倍子原药400g，敲开、清洗以去净虫垢，于阴凉通风处晾干；使用低温超微粉碎机（ZMD-40，中国江苏）在0℃条件下进行超微粉碎，过140目筛，加入1200ml去离子水，室温下150rpm振摇48小时（使用HYD恒温摇床，中国科学院武汉科学仪器厂制），过滤、离心，取上清，置入-70℃冷冻箱12小时后取出，使用冻干机（Christ Alpha1-2，德国）在0.6mbar 条件下，运行288小时，制成150g淡黄色冻干粉，60Co照射30分钟后4℃冷藏备用；
第二步，凝胶制备：
取二氯甲烷（DCM，批号 20081018，国药集团化学试剂有限公司，分析纯）和三乙酸甘油酯( GTA，国药集团化学试剂有限公司，分析纯)，按二氯甲烷:三乙酸甘油酯=7:3之比例配制成混合溶剂，再加入聚乳酸- 羟基乙酸共聚物(PLGA502H)，静置，待聚乳酸－羟基乙酸共聚物完全溶解后，加入第一步制好的五倍子冻干粉，混合溶剂占61%，聚乳酸- 羟基乙酸共聚物占35%，五倍子冻干粉占4%，（均指质量百分比）；用恒温磁力搅拌器（78H-I，杭州仪表电机厂）充分搅拌均匀，漩涡震荡，制成淡黄色五倍子凝胶，避光4℃保存24h即得成品。
一、本发明缓释凝胶的体外细胞毒性实验
本实验采用该制剂，通过MTT法，以商品化的日本产派丽奥软膏作对照，考察其对小鼠成纤维细胞L-929的毒性。
1、材料
1.1主要材料与仪器
L-929小鼠成纤维细胞(华西医科大学口腔生物学教研室) 。超净工作台（YJ-875 型，苏州净化设备厂）；Olympus CH 型显微镜（BH－2日本工业株式会社）。MTT（Sigma，美国)；DMEM 培养基（Gibco公司）；胰蛋白酶(1:250，Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青生物公司）；青、链霉素（哈尔滨制药厂）；数显恒温水浴锅（江苏天由有限公司）；LXJ－Ⅱ型离心机（上海医用分析仪器厂）；78H-I 恒温磁力搅拌器（杭州仪表电机厂）；96 孔培养板（丹麦NUNC 公司）；BIO-RAD680酶标仪（BIO-RAD 公司）；派丽奥软膏(日本新时代制药株式会社,批号X19992084)。
1.2药物缓释液的制备
分别取本发明人缓释凝胶和派丽奥软膏各0.2g注入含有10ml DMEM培养液的棕色瓶中，加盖，置 37℃ 恒温水浴振荡箱中24h，收集全部释放溶液用于实验。
2、方法
2.1细胞传代和培养
将L-929细胞，用含15%胎牛血清的DMEM培养液，在37℃ 50 mL/L CO2饱和湿度条件下培养传代48～72 h，取生长旺盛期，用2.5 g/L 的胰酶消化5~10 min，Hanks液洗3次，混悬于完全培养液，调整细胞密度为4 ×104 /mL。
2.2本发明缓释凝胶对L-929细胞增殖的影响及毒性观察
将L-929细胞悬液接种于12块96孔培养板，每孔100uL，37℃，50 mL/L CO2条件下培养24h后，弃原液及未贴壁细胞，并随机分为6组（每组复6孔），分别加入本发明五倍子缓释凝胶释放液、派丽奥软膏释放液、含苯酚终末浓度为0.2g/ml的DMEM培养液(阳性对照)以及不含任何药物的DMEM培养液（阴性对照）继续培养。分别于培养后1、3、5、7d各时间点先用倒置显微镜观察各组细胞形态，然后每孔加20ul 5mg/mL MTT 溶液继续培养4h，小心弃去培养液，每孔加入二甲基亚枫（DMSO）150ul，涡旋混合器震荡5min，使结晶物充分溶解。在酶联检测仪上测定各孔在490nm 处的吸光度值。根据实验组的吸光值/阴性对照组的吸光值，计算细胞相对增值率（RGR）。依据美国药典中RGR的细胞毒性分级标准，把RGR值转换成5级反应以评定材料的毒性程度。
| 细胞相对增殖率( %) | 细胞毒性分级 |
| ≥100 | 0 |
| ≥80 | 1 |
| ≥50 | 2 |
| ≥30 | 3 |
| ≥0 | 4 |
2.3统计分析
应用SPSS15.0软进行方差分折，两两比较采用t检验，检验标准α=0.05。
3、结果
如图1和表1所示，培养3d后细胞逐渐增殖生长，胞体丰满，胞质均匀，核圆形或卵圆形，细胞体无明显异常。通过7d的观察和数据的比对，可以得出本发明缓释凝胶细胞毒性均为1级，可达到理想生物安全性，符合临床治疗的要求。
表1 五倍子缓释凝胶释放液对L-929细胞的增殖率和毒性分级
二、本发明缓释凝胶对LPS抑制HPDLFs增殖及ALP活性的影响
牙周膜成纤维细胞（HPDLFs）是牙周组织再生修复的细胞基础，具有多向分化潜能和较高的碱性磷酸酶（ALP）活性，在牙周病病理变化及转归中起着重要的作用。牙周病原菌的内毒素（LPS）是G-菌所独有的一种致病因子，不仅是炎性细胞因子的刺激剂，而且对牙周组织细胞也具有直接的细胞毒效应，可抑制细胞的生长与增殖进而对牙周组织造成不同程度的损伤。因此，阻断LPS对HPDLFs的损伤，对阻止牙周病的进展，促进牙周组织的再生修复具有重要意义。
1、主要仪器和试剂
低糖DMEM 培养基(Gibco，美国)，胎牛血清(FCS，杭州四季青生物工程材料研究所)，E.coli LPS(O55B5，Sigma)，胰蛋白酶(Gibco，美国)，青霉素、链霉素(华北制药股份有限公司)，噻唑盐(MTT，华美生物工程公司)，碱性磷酸酶试剂盒(南京建成生物工程研究所)，Triton X - 100 (华美生物工程公司)， Olympus CH型显微镜（BH－2日本工业株式会社），YJ-875型超净工作台（苏州净化设备厂），二氧化碳孵箱（日本池本理工株式会社）。
2、方法
2.1 人牙周膜成纤维细胞（HPDLFs）的体外培养
取正畸减数拔除的新鲜前磨牙。立即置于4℃保存的DMEM 培养液中。在超净工作台内，无菌条件下刮取根中1/3的牙周膜组织，剪成1 mm ×1 mm ×0.5 mm 左右大小，平铺于培养瓶底，加入含15%胎牛血清的DMEM培养液，37℃，50 mL/ L CO2饱和湿度条件下培养，每3d换液1次。细胞铺满瓶底后，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶3传代培养。取第6代细胞用于实验。
2.2 不同时间点本发明缓释凝胶释放液对LPS抑制HPDLFs增殖的影响
取0.2 g本发明缓释凝胶注入含有 10mL培养液的棕色瓶中，加盖，置 37℃ 恒温水浴振荡箱中，分别于注入后2h、1d、3d、5d、7d收集全部释放溶液（同时补加等量培养液）用于实验。取生长良好的第6代HPDLFs，以胰蛋白酶消化后以2×104个/mL浓度接种于96孔板，培养24 h 后，弃原液及未贴壁细胞，加10%FCS的培养液，随机分为7组：5个实验组分别加不同时间点凝胶释放液（2h、1d、3d、5d、7d），同时加LPS使终末浓度为100μg/mL。空白对照组加培养液，阳性对照组只加含100μg/mL LPS的培养液，每孔总量100μL，每组复6孔。于37℃，50 mL/ L CO2 饱和湿度条件下培养48h后，向每孔内加入20μL MTT，继续培养4 h，倒置显微境下观察MTT结晶状况，然后弃去孔内上清液，每孔内加入150μL的二甲基亚砜，在酶联免疫检测仪490nm波长下测吸光值（A）。
2.3 不同时间点本发明缓释凝胶释放液对LPS抑制ALP活性的影响
不同时间点凝胶释放液的收集同上述2.2节。取生长良好的第6代HPDLFs，以胰蛋白酶消化后以2 ×104 个/ mL 浓度接种于96孔板，培养24h后，弃原液及未贴壁细胞，加10%FCS的培养液。实验分组同2.2节。每孔总量100μL，每组复5孔。各组于37℃，50 mL/ L CO2 饱和湿度条件下培养48h后，弃去孔内上清液，PBS洗3遍，吸干，每孔加入50μL 0.3% TritonX -100置4℃冰箱过夜。观察无完整细胞结构后，吹打，加入ALP检测试剂盒中底物，每孔100μL，37℃恒温箱内放置30min后，每孔加50μL的终止液，在酶联免疫检测仪410nm波长下测吸光值（A）。
2.4 统计分析
用SPSS 11.5统计软件进行单因素方差分析，多组均数间比较采用LSD-t检验，检验标准α=0.05。
2.5 结果
2.5.1 如表2和图2所示，培养液中加入100μg/mL LPS后，明显抑制HPDLFs的增殖，与空白对照组相比，有显著性差异（P<0.05）；而加入本发明凝胶释放液后，对LPS抑制细胞增殖有明显的拮抗作用。各时间点凝胶释放液组与LPS组相比均有显著差异（P<0.05），其中第3d释放液组对LPS拮抗作用最强，明显高于其他各时间点组（P<0.05），此后各时间点组对LPS的拮抗作用略有降低。另外，2h释放液组的作用效果与第5d、第7d释放液组的作用效果相比无明显差异（P>0.05）。
表2 不同时间点凝胶释放液对LPS抑制HPDLFs增殖的影响(
)
| 实验分组 | A值 |
| 空白对照组 | 0.741±0.032 A |
| LPS组 | 0.485±0.030 B |
| LPS+2h释放液 | 0.630±0.018 C |
| LPS+1d释放液 | 0.641±0.021 D |
| LPS+3d释放液 | 0.666±0.029 E |
| LPS+5d释放液 | 0.596±0.013 C |
| LPS+7d释放液 | 0.619±0.011 C |
注：相同字母组间无显著差异（P>0.05），不同字母组间相差显著（P < 0. 05）
2.5.2 如表3和图3所示，100μg/mL LPS可显著抑制ALP活性，与空白对照组相比有显著性差异（P<0.05）。加入五倍子凝胶释放液后，细胞中ALP活性均有所提高，各组与LPS组相比均相差显著（P < 0. 05），其中2h释放液组的作用最弱，低于其他各时间点组（P<0.05），第3d释放液组的效果最强，高于其他各时间点组（P<0.05），此后各时间点组作用逐渐下降。
表3 不同时间点凝胶释放液对LPS抑制HPDLFs中ALP活性的影响(
)
| 实验分组 | A值 |
| 空白对照组 | 0.491±0.011 A |
| LPS组 | 0.267±0.012 B |
| LPS+2h释放液 | 0.328±0.010 C |
| LPS+1d释放液 | 0.399±0.013 D |
| LPS+3d释放液 | 0.441±0.015 E |
| LPS+5d释放液 | 0.389±0.019 D |
| LPS+7d释放液 | 0.357±0.049 D |
注：相同字母组间无显著差异（P>0.05），不同字母组间相差显著（P < 0. 05）
实验结果显示，在培养液中加入100μg/mL LPS后，可明显抑制HPDLFs的增殖及ALP活性。当加入不同时间点本发明的凝胶释放液后，各实验组对LPS均有明显的拮抗作用，与LPS组相比均有显著差异（P<0.05）。提示本发明凝胶可在牙周病变修复过程中，通过阻断LPS而促进细胞增殖，提高细胞中ALP活性，使细胞向成骨细胞转化，进而利于病变的愈合。另外，结果还显示，各时间点释放液组中，2h释放液对细胞的保护作用低于其他各时间点释放液组，而第3d释放液对LPS的拮抗作用最强，细胞的增殖活性及ALP活性均明显高于其它各实验组，随后作用逐渐下降。
三、本发明缓释凝胶对LPS介导HPDLFs分泌MMP-3的影响
1、主要试剂盒仪器
人基质金属蛋白酶-3定量酶联检测试剂盒(MMP-3，上海森雄科技实业有限公)，其余同以上实验。
2、方法
2.1 人牙周膜成纤维细胞（HPDLFs）的体外培养
同以上实验。
2.2 LPS对HPDLFs分泌MMP-3的影响
取生长良好的第6代HPDLFs，胰蛋白酶消化后以2.5 ×104 个/ mL 浓度接种于24孔板。培养24h后，弃原液及未贴壁细胞，PBS洗涤3次加含10%FCS的培养液，随机分为5组，实验组加LPS，使其终末浓度分别为1、25、50，100μg/m L，空白对照组加同等体积的含10% FCS 的培养液。每孔总量1mL，每组复4孔。于37 ℃，50 mL/ L CO2 饱和湿度条件下培养48h后，收集上清，严格按照人基质金属蛋白酶-3定量酶联检测试剂盒说明书操作，在酶联免疫检测仪上测细胞培养上清在490 nm 波长处的吸光值，绘制标准曲线，计算结果。
2.3 本发明缓释凝胶对LPS介导HPDLFs分泌MMP-3的影响
取0.2 g凝胶注入含有 10mL培养液的棕色瓶中，加盖，置 37℃ 恒温水浴振荡箱中，分别于注入后2h、1d、3d、5d、7d收集全部释放溶液（同时补加等量培养液）用于实验。取生长良好的第6代HPDLFs，胰蛋白酶消化后以2.5 ×104 个/ mL 浓度接种于24孔板。培养24 h 后，弃原液及未贴壁细胞，PBS洗涤3 次后加含10%FCS的培养液，随机分为7组，5个实验组分别加不同时间点凝胶释放液（2h、1d、3d、5d、7d），同时加LPS使终末浓度为100μg/mL。空白对照组加培养液，阳性对照组只加含100μg/mL LPS的培养液，每孔总量1mL，每组复4孔。于37 ℃，50 mL/ L CO2 饱和湿度条件下培养48h，收集培养上清。严格按照人基质金属蛋白酶-3定量酶联检测试剂盒说明书操作，在酶联免疫检测仪上测细胞培养上清在490 nm 波长处的吸光值，绘制标准曲线，计算结果。
2.4 统计分析
用SPSS 11.5统计软件进行单因素方差分析，多组均数间比较采用LSD-t检验，检验标准α=0.05。
3、结果
3.1 LPS对HPDLFs分泌MMP-3的促进作用（见表4）
空白对照组结果显示在正常情况下HPDLFs的MMP－3呈弱阳性表达。当培养液中存在50μg/m L的LPS时HPDLFs分泌MMP-3的水平明显增加，与对照组和1μg/m L，25μg/m L LPS组相比均有显著性差异（P<0.05）；当LPS达到100μg/mL时，促MMP-3分泌作用更加明显，与50μg/m L LPS相比亦有显著差异（P＜0.05）。表明LPS能促进HPDLFs分泌MMP-3，并且在1～100μg/mL范围内呈浓度依赖性。
表4 不同浓度LPS对HPDLFs的MMP-3表达的影响(
)
| 分组 | MMP-3的浓度（ng/mL） |
| 空白对照组 | 26.411±0.517 A |
| 1 μｇ/ ml LPS | 26.568±0.776 A |
| 25μｇ/ ml LPS | 26.929±0.599 A |
| 50μｇ/ml LPS | 31.815±0.582 B |
| 100μｇ/ml LPS | 45.455±0.750 C |
注：相同英文字母组间无显著差异(P>0.05)，不同字母组间相差显著（P<0.05）
3.2 本发明缓释凝胶对LPS介导HPDLFs分泌MMP-3的影响（见表5）
从表5可看出，各时间点凝胶释放液组MMP－3的量均明显低于LPS组，差异
有统计学意义（P<0.05），而且，各时间点凝胶释放液组之间亦有显著差异（P<0.05）。其中2h释放液组的MMP－3最低，相对于LPS组，对MMP－3的抑制率为75.77%，随着释放时间的延长，抑制作用逐渐减弱，但第7d释放液组对MMP－3的抑制率仍可达32.26%，另外，各时间点释放液组（除第7d）MMP－3分泌量还明显低于空白对照组。该结果提示本发明缓释凝胶不仅有效抑制LPS介导HPDLFs分泌MMP－3，还具有抑制MMP－3活性的作用。
表5 不同时间点释放液对LPS介导HPDLFs分泌MMP-3的影响()
| 实验分组 | MMP-3的浓度（ng/mL） | 抑制率（%） |
| 空白对照组（无LPS） | 26.411±0.517 A | - |
| 阳性对照组（LPS） | 45.470±0.713 B | 0 |
| LPS+2h释放液 | 11.255±0.472 C | 75.25 |
| LPS+1d释放液 | 14.546±0.917 D | 68.01 |
| LPS+3d 释放液 | 18.346±0.542 E | 59.65 |
| LPS+5d释放液 | 24.379±0.747 F | 46.38 |
| LPS+7d 释放液 | 31.398±0.902 G | 30.95 |
注：不同字母组间均相差显著（P < 0. 05）
LPS是G- 菌所独有的一种毒力因子，可造成牙周组织的破坏，其致病作用的强弱在一定意义上体现于其刺激机体产生炎性因子的能力。另外，LPS还可刺激牙周组织中的成纤维细胞及单核细胞合成分泌大量的MMP-3。
MMPs是一族锌离子依赖性内肽酶，主要由牙周炎组织中的中性粒细胞，成纤维细胞，上皮细胞及被激活的巨噬细胞合成分泌，是降解细胞外基质的重要酶类，直接参与牙周组织的破坏降解，在牙周炎的发生发展中起重要作用。牙周炎组织中MM Ps（MMP-1、MMP-3、MMP-8，MMP-9）的高表达及强活性是导致牙周组织破坏的原因。大量研究证实在牙周炎患者的牙龈组织及龈沟液中MMPs的水平明显偏高，且活性增强。MMP-3属MMPs家族中基质溶解素类的一种，又称基质溶解素-1 (stromelysin-1)，主要利用各种细胞外基质蛋白作为底物，同时可激活MMP-1、MMP-8 及MMP-9，阻断纤溶酶原激活物抑制剂的活性，参与牙周组织的破坏。MMP-3的高水平表达是导致牙周附着丧失的先兆性因素，与破骨细胞性骨吸收密切相关，在通过牙周治疗后其表达迅速下降，充分表明MMP-3与牙周组织的炎症反应和牙槽骨吸收关系密切。因此抑制MMP-3的表达有助降低牙周组织破坏的程度，对阻断牙周病变的发生发展具有十分重要的意义。
实验结果显示HPDLFs在正常情况下MMP-3呈弱阳性表达，与Bodet 所得结果一致。当培养液中加入50μg/mL LPS时，能明显促进HPDLFs分泌MMP-3，加入100μg/mL LPS后，促进作用更明显。表明LPS对HPDLFs合成分泌MMP-3表现出很强的介导能力，并在一定范围内呈浓度依赖性。
四、本发明缓释凝胶的体外抑菌实验
由于牙菌斑中绝大多数细菌为口腔正常菌丛，仅少数细菌（约30种）与牙周病的发生、发展密切相关，其中牙龈卟啉单胞菌（Pg）、具核酸杆菌（Fn）、中间普氏菌（Pi）是牙周病的证据充分的致病菌。本实验将通过体外纸片法抑菌方法观察本发明缓释凝胶对Pg、Fn、Pi 3种常见可疑致病菌的抑菌效果。
1、主要材料与仪器
牙龈卟啉单胞菌( Porphyromonas gingivalis) ATCC 33277、具核梭杆菌( Fusobacterianucleatum) ATCC 23276、中间普氏菌( Prevotalla intermedius ) ATCC 25361（华西口腔生物医学实验室微生物室提供）；牛心脑浸液肉汤（Brain Heart Infusion Broth，BHI，Sigma公司）；派丽奥软膏(日本新时代制药株式会社,批号X19992084)。聚乳酸-羟基乙酸共聚物502H (PLGA502H，济南健宝开元生物材料有限公司)；二氯甲烷(DCM，国药集团化学试剂有限公司，化学纯)；三乙酸甘油酯( GTA，国药集团化学试剂有限公司，分析纯)；2%洗必泰（西京医院药剂科配制）。
2、方法
按本发明方法制备五倍子缓释凝胶备用。
取Pg、Fn和Pi菌株分别接种于新鲜配制的牛心脑浸液肉汤培养基中，置厌氧箱内（37℃、80%N2，10%H2，10%CO2）培养48h后，用生理盐水以麦氏比浊法调细菌密度为1.5×108CFU/ml，接种于厌氧的培养皿上，均匀涂布，在厌氧箱内继续培养48h。将培养皿4等分，分别为五倍子缓释凝胶、派丽奥软膏、蒸馏水（阴性对照组）、2%洗必泰（阳性对照组）。用消毒后的打孔器（直径为5mm）将滤纸片制成相同大小的圆纸片，分别在圆纸片上滴加各实验药物0.5g后分别放于每个菌种培养皿中的相应分组位置，培养皿平稳放于厌氧罐，37℃，培养4d，测量抑菌环直径。上述实验重复做3次，取均值。
3、统计分析
应用SPSS15.0软件包进行统计分折，多组均数间比较采用LSD-t检验，检验标准α=0.05。
4、结果
各组药物对Pg、Fn、Pi均有一定的抑菌作用，其中2%洗必泰（阳性对照组）抑菌效果最好，对各菌种的抑菌环直径均明显大于其他各组，差异有统计学意义（P<0.05）。本发明缓释凝胶对Pi的抑菌环直径明显小于派丽奥软膏(P<0.05)，但对Pg和Fn的抑菌效果则明显优于派丽奥软膏(P<0.05)。阴性对照组（蒸馏水）对各菌种均无抑菌作用。（见图3、图4、图5，表6）。
表6 各药物对三种细菌的抑菌环直径比较(mm，
)
注： 不同英文字母组间（P < 0. 05）
五、本发明缓释凝胶对Beagle犬实验性牙周炎疗效的观察
1、实验材料
1.1 2岁，全身健康Beagle犬（陕西省迪乐普比格犬实验动物养殖基地）；派丽奥软膏（日本新时代制药株式会社，批号19992084）；牙龈卟啉单胞菌( Porphyromonas gingivalis) ATCC 33277、具核梭杆菌( Fusobacterianucleatum) ATCC 23276（华西口腔生物医学实验室微生物室提供）；其他同以上实验。
1.2 按照本发明方法制备五倍子缓释凝胶备用
1.3 空白药物载体的制备
取DCM（二氯甲烷）和GTA（三乙酸甘油酯）按7：3的配比配成混合溶剂，加入35%浓度的PLGA502H（聚乳酸－聚乙酸醇共聚物），静置，待完全溶解后，漩涡震荡，避光保存，静置24h后备用。
2、方法
用健康Beagle犬建立实验性牙周炎动物模型，建模7d后全部实验牙GI均出现不同程度的炎症表现，当建模30d后，实验牙牙周袋深度均达到4mm以上，X线片显示牙槽骨明显吸收，牙槽嵴顶模糊呈虫蚀状，嵴顶由宽平变凹陷，牙槽骨高度降低。吸收长度均为根长的1/2，约在根分叉下3-4mm，组织学显示牙龈上皮出现糜烂、溃疡，结合上皮西根向增殖、延伸，牙槽嵴顶明显吸收降低，建模组JE-CEJ距离比正常组明显增大，部分牙在临床检查中出现不同程度的松动，实验牙均达到牙周炎标准。
经4w治疗后，与基线相比，除空白载体组外，本发明缓释凝胶实验组和派丽奥软膏组的GI、BOP、PD均有明显好转。其中PD下降幅度以本发明缓释凝胶组较好，优于派丽奥软膏组，差异有统计学意义（P<0.05）；X线片显示本发明缓释凝胶组的CEJ-B距离明显缩短，而派丽奥软膏组和空白载体组相比无显著性差异（P>0.05）。虽然派丽奥软膏在控制和消除牙周局部的炎症效果显著，但对牙周附着丧失的恢复无明显疗效，由于派丽奥软膏在牙周袋内不能凝固，无法阻挡牙龈上皮根向生长，为牙周再附着提供生长空间。而本发明缓释凝胶的主要成分由高分子材料PLGA和五倍子冻干粉组成，PLGA遇水后形成骨性支架，五倍子中的鞣酸可将龈沟液及唾液中的蛋白凝固变性，为牙周膜的再生提供有利空间。具体实验结果见下表7-表10以及附图7—图16。
表7 治疗后各组GI的比较(平均值)
| 治疗时间 | 本发明缓释凝胶组 | 派丽奥软膏组 | 空白载体组 |
| 基线 | 17.50Aa | 17.00Aa | 16.75Aa |
| 用药1w | 17.00Aa | 16.50Aa | 16.5Aa |
| 用药2w | 10.75Ba | 10.00Ba | 16.00Aa |
| 用药3w | 6.50Ca | 7.00Ba | 15.00Ab |
| 用药4w | 5.75Ca | 6.50Ba | 12.5Ab |
注：大写英文字母为组内各治疗时间相比；小写英文字母为组间（横行）相比，不同字母间P<0.05)
表 8治疗后各组BOP的比较(%)
| 时间 | 本发明缓释凝胶组 | 派丽奥软膏组 | 空白载体组 |
| 基线 | 100.0Aa | 100.0Aa | 100.0Aa |
| 用药1w | 100.0Aa | 100.0Aa | 100.0Aa |
| 用药2w | 93.3Aa | 100.0Aa | 100.0Aa |
| 用药3w | 56.7Ba | 60.0Ba | 93.3Ab |
| 用药4w | 13.3Ca | 7.0Ca | 93.3Ab |
注：大写英文字母为组内各治疗时间相比；小写英文字母为组间（横行）相比，不同字母间P<0.05)
表9 治疗后各组PD比较(mm，
)
| 时间 | 本发明缓释凝胶组 | 派丽奥软膏组 | 空白载体组 |
| 基线 | 4.56±0.52Aa | 4.48±0.82Aa | 4.59±0.72Aa |
| 用药1w | 3.47±0.67Ba | 3.63±0.58Ba | 4.10±0.89Ab |
| 用药2w | 2.79±0.42Ca | 2.63±0.39Ca | 3.98±0.87Ab |
| 用药3w | 2.21±0.51Da | 2.56±0.44Ca | 3.87±0.62Ab |
| 用药4w | 1.98±0.47Da | 2.44±0.38Cb | 3.89±0.81Ac |
注：大写英文字母为组内各治疗时间相比；小写英文字母为组间（横行）
相比，不同字母间P<0.05)
表10 各组治疗前后X线测量的CEJ-B间距离比较(mm，
)
| 时间 | 本发明缓释凝胶组 | 派丽奥软膏组 | 空白载体组 |
| 基线 | 4.56±0.52 | 4.78±0.72 | 4.49±0.84 |
| 用药4w | 2.88±0.49* | 4.51±0.42 | 4.45±0.35 |
注：*与基线相比P<0.05。
Claims (1)
1.一种五倍子缓释凝胶的制备方法，其特征在于：它包括下述步骤：
第一步，五倍子冻干粉的制备：
称取五倍子原药，敲开、清洗以去净虫垢，晾干； 0℃条件下粉碎、过140目筛，然后加入去离子水，室温下150rpm振摇48小时，过滤、离心，取上清，置入-70℃冷冻箱12小时后取出，将其放入冻干机内，在0.6mbar 条件下，制成淡黄色冻干粉，60Co照射30分钟，4℃冷藏备用；
第二步，凝胶制备：
取二氯甲烷和三乙酸甘油酯，按二氯甲烷:三乙酸甘油酯=7:3之比例配制成混合溶剂，再加入聚乳酸- 羟基乙酸共聚物，静置，待聚乳酸－羟基乙酸共聚物完全溶解后，加入第一步制好的五倍子冻干粉；三者之间的比例为：混合溶剂: 聚乳酸- 羟基乙酸共聚物: 五倍子冻干粉=61:35:4，将其充分搅拌均匀，漩涡震荡，制成淡黄色五倍子凝胶，避光4℃保存24h即得成品。
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