CN103371989A

CN103371989A - 黄腐酚在制备抑制破骨细胞分化和蚀骨功能的预防和/或治疗药物中的应用

Info

Publication number: CN103371989A
Application number: CN2012101210578A
Authority: CN
Inventors: 罗剑; 谢娟; 刘明耀
Original assignee: East China Normal University
Current assignee: East China Normal University
Priority date: 2012-04-24
Filing date: 2012-04-24
Publication date: 2013-10-30

Abstract

本发明公开了黄腐酚在制备抑制破骨细胞分化和蚀骨功能的预防和/或治疗药物中的应用。本发明还提出了抑制破骨细胞分化和蚀骨功能药物可抑制破骨细胞分化，以及抑制破骨细胞分化药物可抑制生理病变组织中破骨细胞活化和功能。本发明药物用于预防和/或治疗骨质疏松症、类风湿性关节炎、牙周炎、多发性骨髓瘤、癌症骨转移造成的骨破坏。

Description

黄腐酚在制备抑制破骨细胞分化和蚀骨功能的预防和/或治疗药物中的应用

技术领域

本发明属于药物应用技术领域，涉及啤酒花提取物黄腐酚在制备抑制破骨细胞分化和蚀骨功能的预防和/或治疗药物中的应用，黄腐酚作为破骨细胞分化及骨吸收过程的抑制剂，可用于制备预防和治疗骨质疏松、类风湿性关节炎、牙周炎、多发性骨髓瘤、癌症骨转移等疾病的药物。

背景技术

破骨细胞首先是由 kolliker 于 1873 年发现，破骨细胞主要位于骨膜的下表面和骨内膜的表面，是起源于造血干细胞的多核细胞。破骨细胞目前被认为是体内执行骨吸收的唯一细胞，其主要功能就是吸附在矿化的骨基质中，行使骨吸收。

已有大量研究表明，破骨细胞功能的紊乱会导致骨重塑的不平衡，从而引发各种骨疾病。例如，当破骨细胞的吸收作用过盛时，会导致骨质疏松、类风湿关节炎、牙周病、多发性骨髓瘤及转移癌症等许多骨骼相关疾病。骨质疏松症是最常见的代谢性骨病,破骨细胞骨吸收能力过于旺盛时，会导致其骨量减少和骨结构塌陷，使得骨脆性增加，从而引发骨折的风险（Nat Rev Rheumatol 7:631-8）；类风湿性关节炎是一种慢性、炎症性、自身免疫性疾病，破骨细胞在炎性细胞因子的刺激下，大量活化从而导致关节剧烈受损（Nat Rev Immunol. 7:429-42）；在原发性和转移的骨肿瘤中，肿瘤细胞分泌细胞因子，强烈刺激破骨细胞活性，导致骨质丢失，另一方面，骨质溶解后释放的细胞因子又可以进一步促进肿瘤细胞的生长，肿瘤细胞又能刺激破骨细胞活化，从而导致了恶性循环（N Engl J Med 350:1655-64）；在牙周病中，同样表现为慢性炎症导致破骨细胞活化，从而导致牙组织破坏（Periodontol 53:55-69）。所以，充分利用破骨细胞的生物学特性，开发抑制破骨细胞形成、分化及功能的药物，已被证明为防治骨相关疾病的较好策略（J Bone Miner Res 26:644-56）。

本发明中使用的化合物黄腐酚（Xanthohumol，简称XN）主要是啤酒花中的提取物。啤酒花属于桑科葎草属多年生草本植物，是酿造啤酒的主要原料之一，也是一种使用历史悠久的药食同源植物，酒花中含有树脂，酒花油，多酚，黄酮等多种药理成分，具有抗菌，镇静，治疗结核，神经衰弱，麻风等药理功能。黄腐酚由酒花蛇麻腺分泌产生，目前发现仅存在于酒花中，为酒花异戊二烯基黄酮，是酒花中主要的黄酮类物质之一，占酒花干重的0.1%-1%。基于黄腐酚为酒花所特有，是酒花黄酮的主要成分，并且已有的研究表明，黄腐酚具有抗肿瘤，抗炎症等活性。因此，本发明主要阐述黄腐酚抑制破骨细胞分化从而抑制骨吸收功能的机制研究。

发明内容

本发明人利用细胞生物学和破骨细胞相关文献查阅等方法，通过初步细胞模型筛选，发现啤酒花提取物黄腐酚能够显著抑制破骨细胞的分化及功能。本发明经过多种细胞模型验证，通过多种分子生物学手段，获得黄腐酚对于破骨细胞分化抑制效果的实验证据，首次提出黄腐酚在制备抑制破骨细胞分化以及破骨细胞活性增加导致的相关疾病的药物中的用途。

本发明的目的是，黄腐酚在制备抑制破骨细胞分化及破骨细胞活性异常相关疾病的治疗和/或预防药物中的应用。尤其是在制备骨质疏松症、类风湿性关节炎、牙周炎、多发性骨髓瘤以及癌症骨转移造成的骨破坏等破骨细胞活性异常中的应用。

本发明提出了如结构式(1)所示的黄腐酚在制备抑制破骨细胞分化和蚀骨功能的预防和/或治疗药物中的应用。

本发明中，所述抑制破骨细胞分化和蚀骨功能药物可抑制破骨细胞分化。

本发明中，所述抑制破骨细胞分化药物可抑制生理病变组织中破骨细胞活化和功能。

本发明中，所述药物用于预防和/或治疗骨质疏松症、类风湿性关节炎、牙周炎、多发性骨髓瘤、癌症骨转移造成的骨破坏。

本发明中，黄腐酚既可作为抗骨质疏松、类风湿性关节炎、牙周炎、多发性骨髓瘤、癌症骨转移药物单独使用，也可以和其他药物联合使用。

本发明的实验表明，啤酒花提取物黄腐酚能够抑制小鼠破骨前体细胞向成熟破骨细胞分化，也能够显著地抑制小鼠细胞系RAW264.7细胞向破骨细胞的分化。同时研究发现，黄腐酚能够抑制成熟破骨细胞肌动蛋白环（actin-ring）的形成，及抑制破骨细胞对骨片的蚀骨能力。并且，本发明发现黄腐酚主要是通过抑制RANKL诱导的破骨细胞分化相关基因的表达。本发明将黄腐酚与用载体、稀释剂、赋形剂或辅剂等药学可接受成份配伍制备得到的组合物，对破骨细胞分化和蚀骨功能均具有类似的抑制作用。

附图说明

以下各组图中，均以p<0.05显示有显著性差异，其中，*表示p<0.05；**表示0.001<p<0.01；***表示p<0.001。

图1：黄腐酚（XN）在不同浓度时分别抑制小鼠BMM 细胞和RAW264.7细胞系向破骨细胞分化的效果。其中，图1A所示为BMM 细胞，图1B所示为RAW264.7细胞。

图2：XN对小鼠BMM 细胞和RAW264.7细胞系增殖的影响。

图3：XN抑制破骨细胞骨吸收功能。

图4：XN抑制RANKL诱导的破骨细胞中肌动蛋白环的形成。

图5：XN抑制破骨细胞分化不同时期的效果。

图6：XN能够抑制破骨细胞分化调控的标志性基因的表达。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例1：黄腐酚（XN）对破骨细胞分化的抑制效果

原理：骨髓干细胞在细胞因子M-CSF的刺激下，会向破骨前体细胞分化，同时，单核的破骨前体细胞在细胞因子M-CSF和RANKL的继续刺激下，细胞间相互接触融合形成多核细胞，紧接着会继续分化、形成具有密封圈结构的成熟破骨细胞。小鼠细胞系RAW264.7也可以在RANKL细胞因子的作用下分化为多核的破骨细胞。成熟破骨细胞能够吸附在骨基质上，通过分泌蛋白酶降解骨质，从而导致骨质疏松。因此，可以通过检测破骨细胞的形成能力来检测药物对于骨质疏松的潜在治疗效果。

方法：从四周龄C57/BL6小鼠胫骨和股骨中分离BMM细胞：

取小鼠胫骨和股骨，将骨上皮肤和肌肉去除后，将骨置于PBS中清洗两遍，用剪刀剪断骨头两端，并用装有培养基的10mL针头将骨髓中细胞冲出；将骨髓细胞收集于50mL离心管中，1000rpm离心5分钟后将收集的细胞用5mL 培养基重悬；加入20mL 红细胞裂解液上下振荡几次后加入25mL培养基，1200rpm离心5分钟收集细胞；含10%FBS的培养基重悬细胞并加入M-CSF（5ng/mL）培养。24小时后收集悬浮细胞加入M-CSF（20ng/mL）培养至细胞贴壁长满即可得到破骨细胞前体细胞。

破骨细胞前体细胞在含有M-CSF（20ng/ml）和RANKL（30ng/ml）的培养基中贴壁后，分别加入0、0.1、0.5、1、2.5、5μM的XN继续培养6天；或者RAW264.7细胞系在含有RANKL（30ng/ml）的培养基贴壁后，分别加入0、0.1、0.5、1、2.5、5μM的XN继续培养3天，期间隔天换液。破骨细胞形成后，将细胞固定，对细胞进行TRAP活性分析。TRAP阳性的多核细胞被统计为破骨细胞。

结果与评价：根据图1实验结果显示，RANKL能够诱导破骨细胞前体细胞和RAW264.7细胞分化成多核巨大的TRAP阳性的破骨细胞，XN在浓度范围5μM下对破骨细胞前体细胞和RAW264.7细胞向破骨前体细胞的分化具有抑制作用，并且这种抑制作用呈现XN浓度依赖性。XN在5μM能够显著抑制RANKL诱导的破骨细胞分化。

实施例2：XN对破骨细胞前体细胞毒性试验

原理：磺酰罗丹明B染色是一种旨在通过使用蛋白结合性红色染料，即比色法定量测定细胞内总蛋白质合成率，以评价活体细胞繁殖的经典的技术方法。磺酰罗丹明B（Sulforhodamine B）是一种蛋白质结合染料，可与生物大分子中的碱性氨基酸结合，其颜色的变化和活细胞的蛋白成正比，在540nm波长下产生吸收峰，以评价细胞增殖的经典的技术方法。

方法：96孔板中接RAW264.7(1000个/孔)或BMM细胞(5000个/孔)，细胞贴壁过夜后，分别用0、1、5、7.5、10μM的XN处理细胞4天，隔天换液，实验结束后XN对细胞毒性通过SRB方法分析。具体操作如下：96孔板中细胞100uL培养基中加入冷的TCA(50%,W/V)25uL后混匀；4°C孵育60m分钟后去除孔内溶液；流水冲洗5遍后风干；每孔加入50uL SRB，室温孵育10分钟；用1%醋酸洗5遍以除去未结合的染料，将培养板风干；加入100uL Tris（10mM）溶解板中染料，酶标仪515nM测定OD值。

结果与评价：结果见图2示。加入不同剂量的XN后对前体破骨细胞增殖的影响在10μM以上。但是XN剂量在5μM以内对前体破骨细胞增殖没有太大影响。本发明所使用的抑制破骨细胞分化的有效浓度在5μM以内，因此可以排除由于细胞毒性或者影响细胞增殖导致的影响。

实施例3：XN对破骨细胞肌动蛋白环的形成的抑制效果

原理：破骨细胞在行使吸收骨质功能之时，会在其与骨基质接触的表面局部区域形成密闭的酸性环境，该环境的形成是依赖于一种特殊的环形结构，此结构的主要成分是肌动蛋白，因此这种结构被称为肌动蛋白环（actin ring）。肌动蛋白环的形成是破骨细胞吸收骨质的先决条件。因此通过检测肌动蛋白环的结构可以评估药物对骨吸收的影响。

方法：在RANKL(30ng/ml)刺激下使RAW264.7细胞分化为成熟的破骨细胞。此后用4%多聚甲醛固定10分钟后用PBS洗三遍。固定后细胞用FITC-鬼笔环肽孵育1小时。在荧光显微镜下拍照观察肌动蛋白环的形成。

结果与评价：结果见图3示。RANKL可以诱导破骨前体细胞分化并且形成肌动蛋白丝环。经5μM XN处理，肌动蛋白环结构的大小和数量显著减少，表明XN 能够显著抑制破骨细胞密封圈的形成，并由此抑制破骨细胞骨吸收的蚀骨功能。

实施例4：XN抑制破骨细胞吸收骨质

原理：破骨细胞成熟后形成密闭结构溶解吸收骨质，在骨表面留下吸收骨质后剩下的骨陷窝。骨陷窝的数量多少反映了骨表面的损坏程度，其间接反映了破骨细胞吸收骨质的能力。本实验基于这一特征，将破骨细胞前体在12孔培养板中进行分化，待多核的巨大的破骨细胞形成后将细胞接于骨片表面，两天后检测骨陷窝的数量并分析这些分化的细胞溶解骨片的能力。

方法：将破骨前体细胞接种到12孔板中，加入10ng/ml M-CSF和50ng/ml的RANKL诱导细胞分化。6天后，将分化成熟的破骨细胞收集，平均接于置入96孔板的骨片上，并且同时加入10μM的XN，设置未加XN为对照组。2天后，吸出骨片上的培养基且用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗培养孔两次，然后加入4%的戊二醛（0.2M的甲胂酸钠溶液配成）固定液固定,1%的甲苯胺蓝（0.5%四硼酸盐溶液配成）染色。骨质片层在甲苯胺蓝溶液中染色3-5分钟。PBS清洗去除表面多余的染料，然后用PBS再漂洗几次并风干。已染色的骨质片层可以在室温下长期保存。显微镜拍照观察结果。

结果与评价：结果见图4示。与对照组相比，实验组的骨陷窝数目明显减少，说明加入XN后能够有效抑制破骨细胞对骨片表面的蚀损程度。实验结果表明，XN能够对RANKL诱导的破骨细胞导致的骨吸收具有显著的抑制作用。

实施例5：XN对破骨分化不同时期的抑制效果

原理：破骨分化的过程主要包括骨髓干细胞向破骨前体细胞分化，进而单核的破骨前体细胞相接触，融合成为多核的前破骨细胞，最后形成成熟的具有蚀骨能力的破骨细胞。依据此特征，在破骨前体细胞分化的不同天数，分别加入5uM 的XN，观察其对破骨细胞形成的抑制效果。

方法：将小鼠的RAW264.7细胞接于96孔板中（约1000个细胞/孔），在RANKL（30ng/ml）的刺激下进行分化，分别在分化的0、1、2 、3天加入5uM 的XN。第4天将细胞固定进行TRAP染色活性分析。

结果与评价：根据图5的结果，XN能够通过在RAW264.7细胞向破骨前体细胞分化的早期产生显著抑制作用，从而抑制破骨细胞的形成，而在分化的晚期XN抑制破骨细胞的分化效果较弱。本实施例表明，XN主要通过在破骨细胞分化的早期作用从而抑制破骨细胞形成。

实施例6：XN抑制破骨细胞分化标志性基因的表达

原理：RANKL被证实能够诱导许多破骨细胞分化相关基因的表达，包括NFATc1, TRAP, Cathepsin K和CTR。利用RT-PCR技术，可检测分化中这些标志性基因的表达水平。

方法：在M-CSF（20ng/ml）和RANKL（30ng/ml）存在下，将BMM细胞培养于6孔板中，分别加入0.1%DMSO（对照组）和5uM的XN（实验组）。分别在第0、1、2、3天时用1mlTRIZOL裂解细胞。室温静置5分钟后，加入0.2ml的氯仿混匀，4度12000g离心15分钟。将上清吸出转入新的1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇混匀，室温孵育5分钟后，4度12000g离心10分钟。弃上清，用1ml的75%乙醇重悬沉淀，4度7500g离心5分钟。弃上清，室温干燥沉淀。加入30ul的DEPC水溶解沉淀，测RNA浓度。按2ug的RNA量进行反转录，得到cDNA。再按20ul的体系进行PCR。

其中β-actin的循环数为20，NFATc1, TRAP, Cathepsin K和CTR的循环数为30。取5ul的PCR产物，加入1ul 6×的DNA Loading Buffer混匀后，在2%的琼脂糖凝胶上电泳，拍照。

结果与评价：根据图6所示，在RANKL的诱导下，TRAP，NFATc1，CathepsinK和CTR基因均有显著的表达，但是在同时加入了5uM的XN实验组中，TRAP，NFATc1，CathepsinK和CTR基因的表达显著降低，由此说明XN能够通过显著抑制以上基因的表达，有效地抑制RANKL诱导的破骨细胞的分化。

综上所述，啤酒花提取物黄腐酚能够作为破骨细胞分化的抑制剂，在制备预防、延缓或治疗由破骨细胞介导的骨质疏松症、牙周炎、类风湿性关节炎、多发性骨髓瘤以及癌症骨转移造成的骨破坏等破骨细胞活性异常的相关疾病等相关疾病药物中具有重要用途。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。

Claims

1.结构式(1)黄腐酚在制备抑制破骨细胞分化和蚀骨功能的预防和/或治疗药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制破骨细胞分化和蚀骨功能药物可抑制破骨细胞分化。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制破骨细胞分化药物可抑制生理病变组织中破骨细胞活化和功能。

4.根据权利要求 1 所述的应用，其特征在于，所述药物用于预防和/或治疗骨质疏松症、类风湿性关节炎、牙周炎、多发性骨髓瘤、癌症骨转移造成的骨破坏。

5.根据权利要求 1 所述的应用，其特征在于，黄腐酚既可作为抗骨质疏松症、类风湿性关节炎、牙周炎、多发性骨髓瘤、癌症骨转移药物单独使用，也可以和其他药物联合使用。