CN1486190A - 包含分离自半枝莲活性级分的组合物及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及自半枝莲分离出的生物活性级分的制备方法；也涉及含该活性级分的组合物及其在治疗有关病理性新血管生成状况中的用途。

Description

包含分离自半枝莲活性级分的组合物及其使用方法

与相关申请的相互参者

本申请要求2000年12月12日提交的美国临时申请60/254,986，35U.S.C.§119(e)下的利益，该文献在此并入本公开的参考。

发明领域

本发明属于医药领域，明确言之，涉及用于预防及疾病治疗的抗-血管生成药物的领域。

技术背景

血管生成作用是自既存的血管往外生长生成新的血管结构的过程。在此过程中，因为支撑内皮细胞的基膜被蛋白水解酶分解，因而内皮细胞会脱离基膜，而后这些细胞会迁移出原来的血管、进行分裂，并形成新分化的血管结构(Risau(1997)Nature 386：671-674；Wilting等人)，(1995)Cell.Mol.Biol.Res.41(4)：219-232)。已发现有数种不同生物因子具有控制血管形成的功能(Bussosino等人，(1997)Trends inBiochem Sci 22(7)：251-256；Folkman及D’Amore，(1996)Cell87：1153-1155)，这些包括具有多种功能的蛋白质；诸如生因子、细胞表面受体、蛋白酶、蛋白酶抑制剂，及胞外基质蛋白质(Achen及Stacker，(1998)Int.J.Exp.Pathol.79：255-265；Devalaraja和Richmond，(1999)Trends in Pharmacol.Sci.20(4)：151-156；Hanahan，(1997)Science277：48-50；Maisonpierre等人，(1997)Science277：55-60；Suri等人，(1996)Cell 87：1171-1180；Sato等人，(1995)Nature376：70-74；Mignatii及Rifkin，(1996)EnzymeProtein49：117-137；Pintucci等人，(1996)Semin Thromb Hemost 22(6)：517-524；Vernon及Sage，(1995)Am.J.Pathol.147(4)：873-883；Brooks等，(1994)Science 264：569-571；Koch等人，(1995)Nature376：517-519)。血管形成作用的复杂性及控制其进程的因子的多样性提供控制体内血管形成作用的治疗方法的可用思维。

正常情况下，血管形成作用以周密受控制的方式发生于胚胎发育、生长，及特别情况下(例如伤口愈合及女性生殖循环)(Wilting及Christ，(1996)Naturwissenschaften83：153-164；Goodger及Rogers，(1995)Microcirculation2：329-343；Augustin等人，(1995)Am.J.Pathol.147(2)：339-351)。血管形成作用过程中某些重要的步骤有：1)生长因子(即血管内皮生长因子，VEGF)信号作用；2)基质金属蛋白酶(MMP)及VEGF受体相互作用；3)内细胞迁移至生长因子信号作用位置；及4)内皮细胞管状物的生成。病理性血管形成作用在一些人类疾病上扮演重要的角色，包括肿瘤生长及移转性癌症、糖尿病性视网膜病、类风湿性关节炎，及其他炎症疾病，诸如牛皮癣(Folkman，(1995)Nature Med.1(1)：27-31；Polverini，(1995)Rheumatology 38(2)：103-112；Healy等人，(1998)Hum.Reprod.Update4(5)：736-396)。在这些例子中，疾病的恶化由持续失控的血管形成作用所驱动，例如，在类风温性关节炎中，新毛细血管侵入关节，并破坏软骨。在糖尿病性视网膜病中，视网膜中的毛细血管侵入玻璃体，出血并导致失明。重要的是，肿瘤生长及移转作用依赖血管形成作用，大部分原发性固体肿瘤经历一段长时间无血管状态，期间的生长局限于直径约为1-2毫米范围。在此大小之内，肿瘤细胞可经由被动扩散作用获取所需的氧及营养，而这些微观肿瘤质体终会启动血管形成作用，并募集周边的血管，开始突生出毛细血管，在肿瘤质体内形成血管，为肿瘤持续扩展及恶性肿瘤向远端位置转移提供可能。虽然在探索病理性血管形成作用发生时的生物事件已有明显的进展，然而目前并无有效的医药化合物可用以控制体内的血管形成作用，因此，能有效控制血管形成作用的治疗法有可能减轻大量人类疾病的状况。

传统上，通过筛选具所需医药特性的合成性化学化合物，而后在体内试验其毒性及有效性，以开发出医药化合物。利用此法所筛选的化合物常于体内具有毒性副作用，且此方法尚未成功发展出可进行疾病治疗的有效的血管形成作用的抑制剂。近来，已应用分子生物技术发展血管形成作用的抑制剂。现已发现，在实验模型中可控制血管形成的血管形成作用的蛋白抑制剂，诸如血管抑制蛋白(angiostatin)(O’Reilly等人，(1994)Cell 79(2)：315-328)及内皮抑制蛋白(endostatin)(O’Reilly等从，(1997)Cell 88(2)：277-285)。但是，生产此种蛋白质相当昂贵，难以制剂，且不易传送给受体。目前，蛋白质血管形成作用的抑制剂尚未开发成疾病患者的医疗药物，因此需要能安全施用于患者，且有效抑制血管内皮细胞的病理性生长的治疗性化合物。本发明提供的组合物及方法即是用于此目的，并可提供相关的优势。

发明公开

本发明提供自半枝莲提取药学活性级分(又称“提取物”，“化合物”或“药物”)的方法。一方面，该方法自半枝莲热(至少约60℃，更优选约100℃)茶中萃取可溶于有机溶剂的级分，其光学吸收值介于约200nm至约400nm。获得此级分的一个方法是将有效量的半枝莲浸泡在有效量的热水中。制成液态萃取物，过滤液态萃取物后获得滤液，而后以有效量有机溶剂萃取，氮气氛下去除溶剂，并将沉淀物重悬于水中。浓缩悬浮液，利用层析法分离药学活性级分。本发明亦提供利用这些方法所获得的药学活性级分，例如ESBa，ESBb及ASB03。

本发明提供通过向细胞传送生长抑制含量的本发明的级分，以抑制内皮细胞生长的方法。通过向组织中传送抗血管形成作用含量的级分，对抑制组织中血管形成作用有用。本发明亦提供治疗各种疾病，包括癌症的方法。

附图简述

图1至图5描述本发明的实例方法。虽未总是申明，然而应了解，所述药剂仅为实例，其亦可为本领域中所熟知的等同物。下列为实例，而其等同物也在本发明领域内。

图1描述可作为食品及健康补充物，名为ESBa及ESBb的活性级分的分离步骤。从植物的初始萃取作用至经第一次冷冻干燥的后的过程中，所得的第一个粗萃取物为ESBa，此萃取物含有抗-血管生成的特性。继续该方法，可获得第二个粗萃取物，ESBb。第一冷冻干燥后，先以95％乙醇清洗，而后以无水甲醇萃取，此方法可进一步分离出ESBa中发现的活性级分。将此乙醇清洗/甲醇萃取作用后的萃取物溶解于水中，而后冷冻干燥，产生更为浓缩且纯化的半枝莲活性萃取物，命名为ESBb，将此更为浓缩且纯化的萃取物溶解于水中，而后吸附至C-18微型柱。用水清洗后，以25％甲醇洗脱自C-18微型柱上解吸出所吸附的活性成分。自HPLC C-18疏水柱，利用0至100％甲醇梯度的洗脱液中获得纯化的ASB03。每一纯化步骤后利用CPAE分析法分析所有的级分、沉淀物，及上清液，确保抗-血管生成级分并未消失，或遗漏。

图2描述半枝莲甲醇萃取物自C-18疏水层析柱的HPLC洗脱。

图3描述另一种自半枝莲中萃取及纯化ASB03的步骤。

图4是描述利用G-25柱分析ASB03抗-血管生成活性的图形结果。

图5(A、B及C图)描述自半枝莲HPLC C-18层析法萃取物所得的ASB03活性级分的UV光谱分析。

本发明的实施方式

此整篇公开内容中各种发表文献、专利及公开的专利说明书明确引用作用参考。这些发表文献、专利及公开的专利说明书在此全部并入本专利说明书参考，以便更完全详述本发明相关的技术状态。

除非特别说明，本发明采用本领域技艺范围内的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、有机化学、生物化学及免疫学常规技术，有文献详细说明此等技术。

定义

本专利说明书中所用的某些名词具有下列的定义。

除非在上下文中有明确指出，否则本专利说明书及权利要求书中所指单数形成“一”也包括其复数含义，例如，“一种细胞”包括细胞的复数，包括其混合物。

本专利说明书中所用“包括”意指该组合物及方法中包含所列举的元素，但不排除包含其他元素。当以“基本由…组成”定义组合物及方法时，意为排除其他任何对该组合具有基本重要性的元素。因此，基本由在此所定义的元素组成的组合物不排除有分离及纯化时带入的少量污染物，及医药学上可接爱的载体，诸如磷酸缓冲盐溶液，防腐剂，及类似物。“由…组成”指对施用本发明组合物排除其他成分的大于痕量的元素，及实质的方法步骤。这些变化名词限定的实施方案属本发明范围内。

所有的数值名称，例如pH、温度、时间、浓度及分子量，包括范围，系以0.1数值增(+)或减(-)。应了解虽无法总是精确列举，但在数值前应加上“约”字。也应了解，虽无法总是精确列举，但本专利说明书所述的试剂只是实例，而其等同物为本域中所熟知。

术语“分离”系指将化合物从自然状态下正常与其关连的组成物、细胞及其他成分分开。

“受体”或“宿主”指脊椎动物，优选动物或哺乳动物，更优选为人类患者。哺乳动物包括但不局限于鼠、猿类、人类患者、农场动物、比赛动物，及宠物。

相互变化用词，及使用其单数或复数的“癌症”、“恶性肿瘤”及“肿瘤”指已经历恶性转化的细胞，其对宿主有机体造成病理性伤害。利用良好建立的技术，特别是组织学检查，可轻易的区分原发性癌细胞(换言之，获自靠近恶性转化位点的细胞)与非-癌症细胞。本专利说明书所用癌症定义包括的不仅有原发性癌细胞，亦包括衍生自癌症细胞祖先的任何细胞。其包括转移的癌细胞及体外培养细胞，及衍生自癌细胞的细胞株。当称某类癌症正常称为固体肿瘤时，“临床可检测的”肿瘤是根据肿瘤质量可测得的肿瘤；例如，利用诸如CAT扫描步骤、磁性共振影像(MRI)、X-光、超声波或触诊所测。只以生化或免疫学所发现的不足以符合此定义。

本专利说明书所指“抑制”为终止、延滞或减缓内皮细胞的生长、增殖或细胞分裂，或血管在组织中的生成。监控抑制作用的方法包括，但不局限于内皮细胞增殖分析、利用测定血液含量及定量测定血管结构密度以测定血管床的体积。当培养物为细胞混合物时，利用定量测定能表达内皮细胞特异性标记(诸如血管形成因子、蛋白分解酶及内皮细胞特异性细胞吸附分子)的细胞，以监控新血管形成。

“组合物”指活性药剂及其他化合物或组合物、惰性物(例如可检测剂或标记)或活性剂诸如佐剂的组合。

“药学组合物”指包括活性药剂与惰性或活性载体的组合，以使该组合物适于体内，体外或离体诊断或治疗用途。

本专利说明书中所用“药学上可接受的载体”包括任何标准药用载体，诸如磷酸缓冲盐溶液、水及乳化液，诸如油/水或水/油乳化液，及各式类型的润湿剂。组合物亦可包括稳定剂及防腐剂。载体、稳定剂及佐剂的实例，可参考Martin，REMINGTON’S PHARM.SCI.15版(Mack出版公司.，Easton(1975))。

“有效量”指足以产生有益或所需结果的量，此量与预防有效量可相同或不相同，所谓预防有效量指预防疾病或疾病症状发生所必须的量。以一次或多次施用、应用或剂量可施用有效量。

申请者已经确定自半枝莲萃取药学活性级分的步骤。在一方面，该步骤自半枝莲热茶(约100℃)萃取出级分，其可溶于有机溶剂，其中该级分具有光学吸收值介于约200nm至500nm，而更优选介于约200nm至约400nm。获得此级分的一种方法是将有效量的半枝莲浸泡在有效量的热水中，制备液态萃取物，尔后过滤萃取物得滤液，此级分命名为ESBa，并含有抗-血管形成特性(参考图1及2)。将其浓缩，可作为食品或健康补充品(参考图1)。

而后用有效量的有机溶剂萃取。示于图1中，浓缩物先以乙醇(95％)清洗，而后以无水甲醇萃取，浓缩成ESBb，其亦具有抗-血管形成特性。

在另一个实施方案中，以有机溶剂萃取名为ESBa的级分(参考图1)。氮气氛下，去除溶剂，并将沉淀物重悬于水中，浓缩悬浮液，并利用层析分离药学活性级分。

本发明者亦发现萃取物ESBa、ESBb及活性成分ASB03可抑制内皮细胞生长，且具有抗-血管生成特性。根据这些发现，本发明提供通过向细胞中传送生长抑制量的级分以抑制内皮细胞生长的方法。本发明亦提供通过向组织中传送抗-血管生成量的本发明级分，以抑制组织中血管生成作用的方法。

本发明可应用于体外或体内。当应用于体外试验时，将内皮细胞或血管化组织培养于本领域中所熟知的条件下，如后述例示。细胞和/或组织可源自已建立的细胞株或培养自患者活检样品。而后将该级分直接加入培养基中，或以药物组合物中的成分传送。

不是每种治疗均对每个个体有效，因此，利用体外分析评估对各患者效果是有利的。本方法提供这些方法，以测定组合物或治疗法是否可治疗与病理性内皮细胞增生或血管生成作用有关的特异性疾病。例如，自患者分离出组织活检切片，并处以本专利说明书定义的有效量的药用组合物或治疗法，置于对细胞增殖及生长有效的条件下。利用常规步骤，例如本专利说明书中所述的CPAE分析法，测定病理性细胞生长的抑制，其显示本发明组合物和/或治疗法可有效治疗患者。

本发明亦提供通过对患者施用治疗有效量或生长抑制量的本发明级分，或其药学可接受衍生物，盐或前药，以治疗患者中与病理性新血管生成作用有关的疾病的方法。本文所用“治疗”一词指减缓病理性新血管生成作用相关的病征，及减少新血管生成作用。此种疾病包括但不局限于关节疾病、基于新血管的皮肤疾病、糖尿病性视网膜病、卡波西氏(Karposi’s)肉瘤、衰老相关的斑退化症、再狭窄症、毛细血管扩张、青光眼、瘢痕瘤、角膜移植排斥、伤口肉芽作用(granularization)、血管纤维瘤、欧斯勒-伟柏综合症、心肌血管生成作用、及硬皮症。关节炎疾病实例选自牛皮癣关节炎、类风温性关节炎及骨关节炎。对于治疗癌症及固体肿瘤而言，“治疗”包括抑制血管的生长，使得肿瘤和/或癌细胞生长时所需的营养物质缺乏，肿瘤及生成物减少，并可能消失不见。治疗关节疾病将导致减少软骨特别是关节中血管的形成，使得这些区域移动性及弹性增加。对治疗牛皮癣而言，该用药可减少皮肤性症状，诸如疙瘩、鳞片化及皮肤表面下的可见血管。对糖尿病性视网膜病而言，施用本发明的级分可减少视网膜多余血管的形成，产生非障碍性视觉。治疗卡波西氏肉瘤时，施用本发明级分可抑制血管的生长和/或血管的进一步形成，因此可抑制所产生的损伤和/或肿瘤。

当对受体施用该组分时，诸如对小鼠、大鼠或人类患者，该级分可加至药学可接受的载体中，并以全身性、经口、经皮或局部投药方式施与受体。治疗量可根据经验确定，并可根据欲治疗的疾病、欲治疗的患者，及治疗方法所用活性级分形式的毒性而调整。各种形式的活性级分可以经口、静脉内、经腹膜内或经皮方式传送，当对动物施用时，该方法可用于进一步确认活性级分的有效性。

当以动物模式为实例时，裸鼠(Balb/c NCR nu/nu雌性，Simonsen，Gilroy，CA)各组以皮下方法接种约10⁵至约10⁹本专利说明书所定义的病理细胞，当移植物建立后，施用该级分，例如，在移植物周边以皮下方式注射。利用游标测径器测定移植物在2个维度上尺寸的减少，每周测定两次。

得自Jackson Labs(Maine)MRL/Ipr小鼠(MRL/MPJ-Fas^Ipr)用以测定或监控对关节疾病的效果。有效治疗效果包括减少动物关节处及后腿处的肿胀程度，及减少软骨退化程度(利用X-光监控)。

体内投药在疗程中可以单一剂量、复剂量、持续或间断投药实现。决定最有效方式及投药剂量的方法为本领域所熟知，且可根据治疗所用的组合物、治疗目的、欲治疗的靶细胞及欲治疗的受体而调整。根据治疗师所选定的剂量水平及形式进行单一剂量或复剂量投药。本专利说明书描述施用活性级分的适当剂量剂型及投药方法。

根据惯用步骤投药法，诸如药物组合物中的活性成分，本发明组合物及药物制剂可用于制备治疗人类及其他动物的药物。

该级分或化合物可以经口、鼻内、肠胃外或通过吸入疗法投药，且可为片剂、锭剂、颗粒、胶囊、药丸、安瓶、栓剂或气溶胶形式。其投药形式亦可为活性成分的水或非水稀释液的悬浮液、溶液及乳化液、糖浆、颗粒或粉末。除了本发明活性级分外，药物组合物亦可含有其他医药活性药剂。

通过适当的途径，包括经口、直肠、鼻腔、局部(包括经皮、气溶胶、口腔及舌下)、阴道、肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内及经皮)及肺部，可施用活性级分，以达到治疗目的。需知优选途径根据病征及患者的年纪，及欲治疗的疾病而有所不同。

需知活性级分的适当剂量视疾病类型及严重性及时期而定，且患者与患者之间有所不同。最佳剂量涉及本发明疗法的疗效水平相对任何风险及负面效果的平衡。

理想的是，施用提取物(“药物”)或包含它的组合物时，该活性化合物在疾病处可达到最高浓度。例如，可通过静脉注射药物，可选溶于盐水中，或以口服投药例如施用片剂、胶囊或含有活性成分的糖浆，而达到此目的。利用持续性输液，可维持所需血药浓度，以便为疾病组织提供活性成分的有效量。本发明亦考虑使用有效性组合来提供治疗组合物，其所需的每种成分药剂的总剂量低于单独使用每种治疗化合物或药剂的所需剂量，因此，可以降低副作用。

虽然活性级分或化合物可以单独施用，但优选施用至少含有一种上述所定义的活性成分与一种或多种药学可接受载体的药物制剂，并可选包含其他治疗药剂。所谓每种载体必须“可接受”是指其与制剂中的其他成分相容，且对患者无害。

制剂包括适合经口、直肠、鼻腔、局部(包括经皮、口腔及舌下)、阴道、肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内及皮内)及肺部施用的制剂。制剂可以方便地以单位剂量形式存在，且可以医药领域中所熟知的方法制备。此种方法包括将活性成分与构成一种或多种附属成分的载体结合的步骤。一般而言，制剂以将活性成分与液态载体或微细固态载体或两者均质并密切结合而制备，而后若需要可定型产品。

适合经口投药的本发明制剂可为个别单位形式，诸如胶囊、药丸或片剂，其各含有事先确定含量的活性成分；可为粉末或颗粒；可为水或非水液体的溶液或悬浮液；或为水包油液态乳化液或油包水液态乳化液。活性成分亦可为大药丸、糖膏剂或贴片形式。

可利用压缩作用或定模作用，可选一种或多种附属成分制成片剂。在适当的压缩机器中，压缩自由流动形式的活性成分(诸如粉末或颗粒)，可选混有粘合剂(例如聚烯吡酮、明胶、羟基丙基甲基纤维素)、湿润剂、惰性稀释剂、防腐剂、分散剂(例如淀粉乙醇酸钠、交联聚烯吡酮、交联的羧基甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂混合，制成压缩片剂。在适当的机器中，定模混有惰性液态稀释剂的粉末化合物后，可制成定模片剂，片剂可选被包衣或蚀刻及配制成能在使用时缓慢释放或控制释放活性成分，例如，各种比例的羟基丙基甲基纤维素可提供所需释放速度。片剂可选涂覆肠衣，以便在肠道而非胃部释放。

适合口腔局部投药的制剂包括在经调味的基材(通常为蔗糖及阿拉伯胶或西黄蓍胶)中含有活性成分的糖锭；在惰性基材，诸如明胶及甘油，或蔗糖及阿拉伯胶中含有活性成分的软锭片；及在适当液态载体中含有活性成分的漱口水。

根据本发明适合局部投药的药物组合物可调配成软膏、乳膏、悬浮液、乳液、粉末、溶液、贴片、凝胶、喷剂、气溶胶或油状物。或者，制剂可包括小布条或绷带类药品，诸如浸渍活性成分及可选一种或多种赋型剂或稀释剂的绷带或吸附性贴片。

对眼睛或其他外部组织(例如口腔及皮肤)的疾病而言，制剂优选以含有活性成分的局部用软膏或乳膏施用。当调配成软膏时，药物可与石蜡物质或易与水混合的软膏基材调配。或者，药物成分可用水包油乳膏基材调配于乳膏中。

若有需要，乳膏基材的水相可包括，例如，至少约3％重量/重量的多羟基醇，即，具有两个或多个羟基的醇类，诸如，丙二醇、1，3-丁二醇、甘露醇、山梨糖醇、甘油及聚乙二醇及其混合物。局部制剂可包括能增强活性级分经由皮肤或其他作用部位吸收或穿透的化合物，此种透皮促进剂实例包括二甲基砜及相关的类似物。

本发明乳化液的油相包括任何已知方式的已知成分。虽然此相可只包括乳化剂(或称为乳化药剂)，其可包括至少一种具有脂或油或同时这两者的乳化剂。优选，亲水性乳化剂与作为稳定剂的亲脂性乳化剂一起，优选同时包括油及脂。同时，含或不含稳定剂的乳化剂组合成所谓的乳化蜡，而该蜡与油和/或脂组合成所谓的乳化软膏基材，其形成乳膏制剂的油状分散相。

适合用于本发明制剂的乳化剂及乳化液稳定剂包括Tween60、Span80、十六醇十八醇混合物、十四醇、单硬脂酸甘油酯及月桂硫酸钠。

选择适合用于制剂的油或脂根据能够达成的所需化妆品的特性而定，因为活性化合物在大部分可能用于药物乳化制剂的油脂中溶解度相当低，因此，乳液优选为非-油腻性，非-染剂且可清洗掉的具适当稠度的产物，以避免自管状容器或其他容器中渗漏出来。可使用直链或支链，单元或二元烷基酯，诸如二-异己二酸酯，硬脂酸异十六酯，椰子脂肪酸的丙二醇二酯，十四酸异丙酯，油酸癸酯，棕榈酸异丙酯，硬脂酸丁酯，棕榈酸乙基己酯，或已知为Crodamol CAP的支链酯的混合物，后三者是优选酯类。这些可根据所需特性单独使用或组合使用。或者，可以使用高熔点脂，诸如白软蜡和/或液态蜡或其他矿物油。

适合眼睛局部用药的制剂包括滴眼水，其中活性成分溶解或悬浮于适当的载体中，特别是活性成分的水溶液溶剂。用于直肠用药的制剂可为含有适当基质的栓剂，例如包括可可油或水杨酸。

适合阴道用药的制剂可为子宫套、棉塞、乳液、凝胶、贴片、泡沫或喷雾制剂，除活性成分外，尚可包括本领域中所熟知的适当载体。

载体为固体的适合鼻腔用药的制剂，包括具有颗粒大小范围例如约20至约500微米的粗颗粒，其以鼻吸入的方式投药，即将含有粉末的容器靠近鼻子后，快速的吸入鼻腔通道。载体为液态的适合的鼻腔用药的制剂，例如，鼻腔喷雾，滴鼻药水，或以喷鼻器施用的气溶胶，包括活性成分的水溶液或油脂溶液。

适合肠胃外投药的制剂包括等张无菌注射用的水或非水溶液，其可包含有抗-氧化剂，缓冲液，抑菌剂及使制剂与欲治疗受体的血液等张的溶质；及包括设计为将化合物向血液成分或一或多种器官靶向的悬浮剂及增稠剂，与脂质体或其他微颗粒系统的水性或非水性无菌悬浮液。制剂可置于单位剂量或多剂量密封容器，例如，安瓶及小瓶，可以冷冻干燥(粉末冷冻干燥)条件保存，在使用的前，只需加入无菌液态载体，例如注射用水即可。即时注射用溶液及悬浮液可从先前所述无菌粉末，颗粒及片剂种类制得。

优选的单位剂量制剂包括药剂成分的每日剂量或单位，每日次剂量(subdose)(如本专利说明书前述)，或其适当的级分。其亦可包括额外的活性药剂，例如，抗-肿瘤，抗-癌，抗-血管生成药剂或免疫促进剂。

需知除了前所特别说明的成分外，本发明制剂可包括有关剂型领域常规的其他药剂，例如，适合口服的制剂包括甜味剂，粘稠剂及调味剂。

相同的提取物(“药剂”)或组合物亦可用于兽用型制剂中，其可如本领域中常规方法制备。

本发明另外提供筛选用以抑制新血管生成或内皮细胞生长的治疗药剂的方法，筛选方法包括：

(a)将药剂与适当的细胞或组织样品接触；

(b)将另一适当的细胞或组织与含有效量的本发明提取物或含该提取物的药学可接受的组合物接触；及

(c)比较步骤(a)样品与步骤(b)样品的生长，当其中步骤(a)的生长抑制情况与步骤(b)样品相同或相似程度时，表示(a)的药剂为抑制新血管生成或内皮细胞生长的治疗药剂。

如本专利说明书所使用，适当样品意指任何含有内皮细胞的样品。方法如本专利说明书所述，可体外或体内实施。

本发明亦提供治疗受体病理性新血管生成作用相关疾病的试剂盒。该试剂盒包括治疗量的提取物及使用说明书。该试剂盒用以治疗选自关节炎疾病、基于新血管的皮肤病、糖尿病性视网膜病、卡波西氏肉瘤、衰老相关的斑退化症、再狭窄症、毛细血管扩张、青光眼、瘢痕瘤、角膜移植排斥、伤口肉芽作用、血管纤维瘤、欧斯勒-伟板综合症、心肌血管生成作用、硬皮症、牛皮癣关节炎、类风湿性关节炎及风关节炎。

下列的实施例用以说明本发明，并非限制本发明。

实施例

实施例1

分离及纯化活性级分

本发明提供数个自含有半枝莲的组合物中制备生成活性级分的实施方案。一方面(如图1所示)，该方法包括萃取溶于有机溶剂的级分，获得具有光吸收值介于约200nm至约500nm的活性级分，优选介于约200nm及约400nm。在另一方面，该级分的光吸收值介于260nm及330nm。

在一个实施方案中，该方法需自10克干燥半枝莲及约300毫升热双蒸水(至少约60℃，更优选至少约100℃)的组合中萃取。其浸泡约5分钟至30分钟，而后以具有适当孔径约22至25微米的滤膜过滤，适合的滤膜可高温灭菌，可无菌化，且对多数化学溶剂具有抗性。一种适当的滤膜为市售的iracloth。此萃取物(ESBa，参考图1)具有抗-血管生成特性，其可为食品或健康补充物，或进一步加工成食品或健康补充物。

而后以有机溶剂，诸如乙醇或甲醇，或其他相似的有机溶剂至少萃取该“茶”三次，而后以甲醇萃取2至5次，优选约4次。该萃取物(ESBb，参考图1)亦具有抗-血管生成活性，其可为食品或健康补充物，或进一部加工成食品或健康补充物。

ESBb可进一步浓缩，例如，溶解于水中，并冷冻干燥。利用柱层析法自冷冻干燥物中获得具有光学吸收值约200至约500nm，或优选介于约200至约400nm，及更优选介于约300nm至约400nm的活性级分ASB03(见图1)。

在另一个实施方案中，获得活性级分的步骤有：

a)将有效量的半枝莲浸泡于热的双蒸水中至少5分钟。

b)而后将液体离心(2000rpm)约10分钟，以Watman滤纸过滤，丢弃沉淀物。

c)粗萃取液进行冷冻干燥过夜，获得ESBa。

d)用95％乙醇清洗，并离心，用有效量有机溶剂萃取沉淀物，获得较纯化的萃取物。

e)以氮气蒸发有机溶剂(例如甲醇)。

f)干燥物用至少约12至约18毫升水混合，并隔夜冷冻干燥，获得ESBb。

g)其可重悬于药学可接受载体，诸如双蒸水中。

h)溶液过柱层析分离，此柱之一为AC-18，25％甲醇溶液用以洗脱所吸附的活性级分。

i)以氮气气流蒸发甲醇。

j)萃取物重悬于水中，并冷冻干燥。

k)利用柱层析法，诸如0至100％梯度的HPLC分级，以获得ADB03。

实施例2

图3所示为另一种分离名为ASB03活性级分的步骤。在此实施方案中，以上述实施例1步骤制备的粗萃取物，再用G-25-300(25×40公分)柱分离。图4所示为自G-25管柱分离的不同级分的抗-血管生成活性。柱分离以流速为2毫升/分钟过柱得各级分，以CPAE分析法(后述)测定级分22至30的生物活性。

实施例3

内皮细胞分析法(“CPAE”)

根据Connally等人，(1986)Anal.Biochem.152：136-4经修饰(Liang及Wong(1999)ANGIOGENESIS：FROM THE MOLECULAR TOINTEGRATIVE PHARMACOLOGY Maradoudakis出版，KluwerAcademic/Plenum出版商，纽约)后的步骤进行分析。牛肺动脉内皮细胞(CPAE)接种在24孔培养盘中，密度为10000细胞/槽孔。在37℃下，5％CO₂条件下培养生长约60小时，每个样品孔中加入样品剂量(约50微升至约100微升)，再培养30分钟，培养后，以倒置显微镜观察细胞，检测细胞的存在，及利用ECC分析法。两种分析法用以检测每个孔中是否含内皮细胞，不含样品的对照组细胞生长正常。

实施例4

CAM分析

绒毛膜(CAM)分析(Nguyen，M.，等人，(1994)Microvas.Res.47：31-40)用以测定活性级分、萃取物或化合物在体内模型中的效果。获自King Valley农场(Kingsburg，CA)的受精鸡蛋培养在37℃潮湿室中，每日将鸡蛋转180度一次，第四日时，以下述的方法在蛋壳上切一小窗口；首先，以95％乙醇控试鸡蛋，并在鸡蛋钝端开一小洞，破坏钝端处的气室，利用钢锯(25齿/寸)自蛋壳取下1平方公分大小“窗口”时，绒毛膜会脱离蛋壳。以无菌Howard’s Ringer溶液洗掉任何多余的蛋壳碎片，后以玻璃纸胶带将鸡蛋窗口封住，置回培养箱中。4-7天后，开启窗口，放置无菌盖玻片为参考点。测试时，用无菌针在CAM的血管间开一小孔，将小量样品置入小孔中，再次封住，以乳糖为对照。每日观察有否任何抑制CAM血管发育的作用，观察四日。

实施例5

MMP分析

P.C.Brooks，等人，(1996)在“基质金属蛋白酶MMP-2通过与整合蛋白ανβ3相互作用定位至侵害细胞表面‘Cell85：683-93中揭示基质金属蛋白酶及αν/β整合蛋白相互作用的体外分析法。实验样品对MMP-2/ανβ3整合蛋白复合物的作用确定该样品作用机制是否与血管生成途径的任何破坏有关。这涉及试验该实验样品是否可抑制MMP-2与ανβ3整合蛋白的相互作用。开始时，以抗MMP-2抗体的ELISA进行，并测定这些抗体对样品的结合。另外研究是否会有阳性结果产生。已知为MMP-2天然抑制物的TIMP-2(基质金属蛋白酶组织抑制剂)用为对照组。

实施例6

内皮细胞管状物/中心管形成分析

在冰冷的96孔微量盘的每个孔中置入马萃胶(Matrigel)(10毫克/毫升浓度，60微升；Collaborative Lab#35423)，将微量盘置于室温下15分钟，而后在37℃培养30分钟，让马萃胶进行聚合化，同时，以EGM-2(Clonetic#CC3162)制备HUVEC，浓度为2×10⁵细胞/毫升，以相同的培养基制备2X所需浓度的测试化合物(5个浓度水平)，细胞(500微升)与2X级分或化合物(500微升)混合，将2份此悬浮液的200微升置于聚合的马萃胶上。培养24小时后，以Bioquant Image Analysis系统拍下每个浓度样品情况，每个浓度拍三张。测定所形成小管/管状物长度及交接点数目，与未处理对照组比较后，评估药剂效果(IC₅₀)。以TNP-470(NSC642492)及紫杉醇(paclitaxel)(NSC125973)为参考化合物。

实施例7

内皮细胞迁移分析

利用48-孔Boyden盒子及8微米孔径大小动物胶原蛋白涂覆(10微克/毫升老鼠尾胶原蛋白；Collaborative Laboratories聚碳酸滤膜(Osmonics公司)评估迁移。底层盒子孔只注入27-29微升DMEM培养基(基础线)，或含有化学吸引物(bFGF，VEGF或经Swiss 3T3细胞条件化的培养基)的培养基。上层盒子加入在DMEM+1％BSA中制备且含/不含级分或化合物的45微升HUVEC细胞悬浮液(1×10⁶细胞/毫升)，在37℃下培养5小时后，以PBS润湿滤膜，固定，并在Diff-Quick溶液中染色。将移动细胞面朝下方式将滤膜置于玻璃片上，且以Kimwipe去除上面的细胞，该试验进行4-6个重复，每个孔计算五个视野，从刺激的对照和级分或化合物处理的数值减去阴性未刺激对照组数值，所得数据以平均迁移的细胞±S.D作图，从所得图形数据计算出IC₅₀。TNP-470(NSC642492)及紫杉醇(NSC125973)用为参考化合物。

为使本发明更为清楚，虽然前述发明已通过说明及实施例进行了详细描述，但显然可以实施某些变化及修饰。例如，对于本领域技术人员显然本发明方法可与一种或多种已知抗-肿瘤、抗-血管生成性或免疫增进治疗法及组合物联合，例如鲨鱼软骨，酷胺酸神经鞘胺醇或神经鞘胺醇。因此，说明及实施例不应理解为限制所附权利要求限定的本发明范围。

Claims (21)

1.自半枝链的组合物制备为名ASB03的生物活性级分的方法，其包括提取可溶于有机溶剂的级分，其中该级分具有光吸收值介于约200nm至约500nm。

2.权利要求1的方法，其包括步骤：

a)将有效量的半枝链浸泡于有效量的热水中，获得液态提取物；

b)过滤该提取物，获得名为ESBa的滤液；

c)以有效量的有机溶剂萃取该滤液，获得ESBb；

d)浓缩该萃取液；及

e)分离具有光吸收值介于约200nm至约450nm的级分，分离出ASB03。

3.权利要求1的方法，其包括步骤：

a)以乙醇萃取半枝链液态提取物至少两次，获得上清液；

b)以甲醇至少萃取三次，获得浓缩的上清液；

c)以氮气蒸发甲醇；

d)将该萃取物重悬于约12至约18毫升水中，并干燥；

e)重悬于药学可接受载体，获得溶液；

f)将溶液过C-18微型柱；

g)以至少约35毫升水清洗该柱；

h)以至少约15毫升的25％甲醇清洗该柱；

i)以氮气蒸发甲醇；

j)将该萃取物重悬于液态载体中；及

k)利用C-18疏水HPLC层析，获得具有光吸收值约200nm至约500nm的名为ASB03的生物活性级分。

4.由权利要求1至3任一项的方法所获得的生物活性提取物。

5.包括权利要求4的提取物及药学可接受载体的组合物。

6.包括权利要求4的提取物及抗-血管生成或免疫刺激药剂的组合物。

7.抑制内皮细胞生长的方法，其包括向细胞传送生长抑制量的权利要求4的提取物。

8.抑制组织血管化的方法，其包括向组织传送抗-血管化量的权利要求4的提取物。

9.治疗受体的病理性新血管生成相关疾病的方法，其包括对受体施用治疗有效量的权利要求4的提取物。

10.权利要求9的方法，其中疾病选自癌症，关节炎疾病、基于新血管的皮肤病、糖尿病性视网膜病、卡波西氏肉瘤、衰老相关的斑退化症、毛细血管扩张、青光眼、瘢痕瘤、角膜移植排斥、伤口肉芽作用、血管纤维瘤、欧斯勒-伟板综合症、心肌血管生成和硬皮症。

11.权利要求7或8的方法，其中疾病是选自牛皮癣关节炎、类风湿性关节炎及骨关节炎的关节炎病。

12.权利要求7或8的方法，其中传送方式选自经口，静脉内，腹膜内和经皮方式。

13.权利要求8的方法，其中受体是动物。

14.权利要求13的方法，其中动物选自宠物，农场动物或人类患者。

15.筛选抑制新血管生成或内皮细胞生长的治疗药剂的方法，其包括步骤：

a)将药剂与适当的细胞或组织样品接触；

b)将另一份适当的细胞或组织与治疗有效量的权利要求4的提取物接触；及

c)比较步骤(a)样品的生长与步骤(b)样品的生长，其中任何生长抑制情况与步骤(b)样品相同或相似程度的步骤(a)药剂，为抑制新血管生成或内皮细胞生长的治疗药剂。

16.权利要求15的方法，其中接触为体内或体外接触。

17.权利要求7，8或9任一项的方法，其进一步包括施用或传送有效量的抗血管生成药剂或疗法。

18.权利要求7，8或9任一项的方法，其进一步包括施用或传送抗肿瘤药剂或疗法。

19.治疗病理性新血管生成相关疾病的试剂盒，其包括治疗有效量的权利要求4的提取物和使用说明。

20.权利要求19的试剂盒，其中疾病选自癌症，关节炎疾病、基于新血管的皮肤病、糖尿病性视网膜病、卡波西氏肉瘤、衰老相关的斑退化症、再狭窄症、毛细血管扩张、青光眼、瘢痕瘤、角膜移植排斥、伤口肉芽作用、血管纤维瘤、欧斯勒-伟板综合症、心肌血管生成和硬皮症。

21.权利要求20的试剂盒，其中疾病是选自牛皮癣关节炎、类风湿性关节炎及骨关节炎的关节炎病。