TWI483724B

TWI483724B - 用於抑制雄性素依賴性及／或非依賴性之攝護腺癌細胞、口腔癌細胞及／或胃癌細胞之生長之醫藥組合物

Info

Publication number: TWI483724B
Application number: TW099123252A
Authority: TW
Inventors: Horng Jyh Harn; Shinn Zong Lin; Yi Lin Chen; Cheng Tung Lin; Tzyy Wen Chiou
Original assignee: Univ China Medical
Priority date: 2010-07-15
Filing date: 2010-07-15
Publication date: 2015-05-11
Also published as: TW201201797A

Description

用於抑制雄性素依賴性及/或非依賴性之攝護腺癌細胞、口腔癌細胞及/或胃癌細胞之生長之醫藥組合物

本發明係關於異柴胡內酯(isochaihulactone)於抑制雄性素(androgen)依賴性及/或非依賴性之攝護腺癌細胞、口腔癌細胞及/或胃癌細胞之生長之應用。

攝護腺(prostate)又稱前列腺，係一實心的腺體且為男性特有的生殖器官，於腺體中有尿道和射精管穿過。攝護腺癌已成為全球男性最普遍的癌症之一，在台灣，隨著國人飲食習慣改變，高脂肪性食物之攝取量增加，以及平均年齡增長，使得罹患攝護腺癌的危險因子增加，攝護腺癌的發生率與死亡率因而逐年上升，成為台灣男性十大癌症死因之一。惟攝護腺癌之發生原因迄今未明，一般認為可能與遺傳、荷爾蒙、飲食及環境因素有關。

攝護腺癌細胞起初為雄性素依賴性(androgen-dependent)，須要雄性素之刺激始能生長或分裂繁殖，若缺乏雄性素，則會呈現退化(regression)現象。由於降低攝護腺癌病患體內的雄性素，可使攝護腺癌細胞萎縮而死亡，故臨床上最常使用雄性素壓抑(androgen suppression 或androgen ablation)之荷爾蒙療法來進行治療。舉例言之，使病患服用黃體素促進激素(Luteinizing Hormone-Releasing Hormone agonist，LHRH agonist)之同類物或抗雄性素(anti-androgens)藥劑，例如拂它邁(flutamide)或醋酸環妊酮(cyproterone acetate)等。然此療法並無法有效根治攝護腺癌，蓋因部分癌細胞於一段時間後會轉變為雄性素非依賴性(androgen-independent)，其對雄性素壓抑之治療方式已不再有反應，而仍可持續地生長，使攝護腺癌患者之病情益加惡化。是故，目前對於雄性素非依賴性之攝護腺癌尚未有有效的治療方式。

另一方面，化學療法對於攝護腺癌之治療效果亦相當有限，蓋因化療藥物通常係針對快速生長的癌細胞進行毒殺作用，而攝護腺癌細胞係一種生長緩慢的癌細胞，故多數化療藥物對攝護腺癌細胞的抑制效果不佳。因此，一般幾乎不會使用化學療法來治療攝護腺癌。

鑒於攝護腺癌之治療成效有限，因此，於臨床醫學上，仍亟須一種可有效抑制攝護腺癌，尤其是雄性素非依賴性之攝護腺癌之方法或藥物，以提升攝護腺癌之治癒率。

本發明即係針對上述需求所為之研究，本案發明人研究發現，異柴胡內酯(isochaihulactone)化合物可拮抗攝護腺癌，其對於雄性素依賴性或雄性素非依賴性之攝護腺癌皆具有優異之抑制功效，故可經由不同於傳統荷爾蒙療法之化學療法來治療攝護腺癌。此外，該化合物亦可用於抗口腔癌及胃癌。

本發明之一目的在於提供一種用於抑制雄性素依賴性及/或非依賴性之攝護腺癌細胞、口腔癌細胞及/或胃癌細胞之生長之醫藥組合物，其係包含一有效量之活性成分，該活性成分係選自以下群組：式(I)化合物、式(II)化合物、其醫藥可接受鹽及酯、及前述之組合，

其中，R為H、烷氧基、或芳基。

本發明之另一目的在於提供一種使用式(I)化合物及/或式(II)化合物及/或其醫藥可接受鹽及/或酯在製造藥劑之應用，該藥劑係用於抑制雄性素依賴性及/或非依賴性之攝護腺癌細胞、口腔癌細胞及/或胃癌細胞之生長。

本發明之詳細技術及較佳實施態樣，將描述於以下內容中，以供本發明所屬領域具通常知識者據以明瞭本發明之特徵。

除非文中有另外說明，於本說明書中(尤其是在後述專利申請範圍中)所使用之「一」、「該」及類似用語應理解為包含單數及複數形式。

如上述，攝護癌細胞之生長會由雄性素依賴性轉變為雄性素非依賴性，使一般雄性素壓抑之荷爾蒙療法失去效果，而無法有效治療攝護腺癌。此外，過去化學療法對於攝護腺癌之抑制效果相當有限，故一般幾乎不使用化療方式治療攝護腺癌。然而，本案發明人發現，異柴胡內酯(isochaihulactone)化合物可有效抑制雄性素依賴性及非依賴性之攝護腺癌細胞之生長，故可藉此以不同於傳統荷爾蒙療法之化學療法來治療攝護腺癌。

因此，本發明提供一種用於抑制雄性素依賴性及/或非依賴性之攝護腺癌細胞之生長之醫藥組合物，其係包含一有效量之活性成分，該活性成分係選自以下群組：式(I)化合物、式(II)化合物、其醫藥可接受鹽及酯、及前述之組合，

其中，R為H、烷氧基、或芳基。式(I)及式(II)化合物為異柴胡內酯化合物，化學名稱為4-苯并[1,3]二氧雜環戊烯-5-基甲基-3-(3,4,5-三甲氧基-苯亞甲基)-二氫-喃-2-酮(4-benzo[1,3]dioxol-5-ylmethyl-3-(3,4,5-trimethoxyl-benzylidene)-dihydro-furan-2-one)；或稱為β-(3',4'-亞甲二氧苯)-α-(3',4',5'-三甲氧亞苄基)-γ-丁內酯(β-(3',4'-Methylenedioxybenzyl)-α-(3',4',5'-trimethoxybenzylidene)-γ-butyrolactone)，其可自南柴胡(Bupleurum scorzonerifolium )中，以萃取純化之方式製得，或以化學合成之方法製得，其製備方式可參見如Changet al .,Immunosuppressive flavones and lignans fromBupleurum scorzonerifolium ,Phytochemistry ,Vol. 64,Issue 8,2003,P. 1375-1379，該文獻全文併於此處以供參考。

式(I)化合物及式(II)化合物簡稱為K8，分子量為398.41千達爾頓(kDa)，其以γ-丁內酯結構為核心，且於2號及5號碳(碳2-(5))之位置上，分別具有順式(cis -，Z)及反式(trans -，E)之構型，即，式(I)化合物為順式異柴胡內酯(簡稱為Z-K8)，而式(II)化合物為反式異柴胡內酯(簡稱為E-K8)，屬於同分異構物(幾何異構物)。

於式(I)化合物及式(II)化合物中，R較佳為H、C₁ 至C₆ 烷氧基、或C₆ 至C₂₀ 芳基，更佳為甲氧基。由於式(I)及式(II)化合物皆有一手性中心(chiral center，以「*」標示)，故具有鏡像異構物，彼等鏡像異構物亦涵蓋於本發明醫藥組合物之活性成分之範疇內。

經發現，當用於抑制攝護腺癌細胞之生長上時，式(I)化合物之抑制活性係高於式(II)化合物。因此，於本發明醫藥組合物中，該活性成分較佳係選自以下群組：式(I)化合物、其醫藥可接受鹽及酯、及前述之組合。

已知雄性素依賴性之攝護腺癌細胞須要雄性素之刺激始能生長與分裂繁殖。特定言之，於雄性素依賴性之攝護腺癌細胞的表面上，具有一種雄性素受體(androgen receptor，AR)，當雄性素與該受體結合時，會引發攝護腺癌細胞之生理反應，促使其生長並進行分裂繁殖。因此，雄性素受體在雄性素依賴性之攝護腺癌細胞的致癌機制中，扮演關鍵的角色。經發現，本發明醫藥組合物可抑制攝護腺癌細胞之雄性素受體的表現，減少其於攝護腺癌細胞表面上的量，故可經由降低雄性素與雄性素受體結合的機會，來抑制攝護腺癌細胞之生長。

本發明之醫藥組合物除可經由抑制雄性素受體表現來抑制攝護腺癌細胞生長外，亦可藉由促進攝護腺癌細胞之凋亡(apoptosis)而達成抗攝護腺癌之效果。細胞凋亡時，細胞中硫胱胺酸蛋白酶-3(caspase-3)須經活化以進行凋亡作用，故若提升硫胱胺酸蛋白酶-3之活性，則可促進癌細胞凋亡。如後附實施例所示，本發明醫藥組合物可活化硫胱胺酸蛋白酶-3，提升其活性，促進攝護腺癌細胞之凋亡。

攝護腺特異抗原(prostate specific antigen，PSA)係攝護腺癌之腫瘤標記，可用於攝護腺癌的診斷與臨床分期，亦可用於追蹤治療效果。於本發明醫藥組合物之一使用實施例中，顯示本發明醫藥組合物可抑制攝護腺特異抗原之表現，證實其具有治療攝護腺癌之效果。

由於本發明醫藥組合物對於雄性素依賴性之攝護腺癌細胞之生長具有優異之抑制效果，故可用於治療雄性素依賴性之攝護腺癌。此外，本發明醫藥組合物亦可抑制雄性素非依賴性之攝護腺癌細胞生長，故解決了習知荷爾蒙療法中，無法有效針對雄性素非依賴性之攝護腺癌進行治療的缺點，提供了更為有利之治療方法。

另一方面，如後附實施例所示，除攝護腺癌細胞外，本發明醫藥組合物亦具有抑制口腔癌細胞及胃癌細胞生長之功效，故可用於治療口腔癌或胃癌。

本發明亦提供一種使用式(I)化合物及/或式(II)化合物及/或其醫藥可接受鹽及/或酯在製造藥劑之應用，其中，式(I)及式(II)化合物中之R為H、烷氧基、或芳基，且該藥劑係用於抑制雄性素依賴性及/或非依賴性之攝護腺癌細胞、口腔癌細胞及/或胃癌細胞之生長。較佳地，R為H、C₁ 至C₆ 烷氧基、或C₆ 至C₂₀ 芳基，更佳為甲氧基。此外，於本發明中，較佳係使用式(I)化合物及/或其醫藥可接受鹽及/或酯以製造藥劑，供用於抑制雄性素依賴性之攝護腺癌細胞、口腔癌細胞及/或胃癌細胞之生長。另外，該藥劑可用於抑制雄性素受體之表現、抑制攝護腺特異抗原之表現、促進攝護腺癌細胞之凋亡、及/或活化硫胱胺酸蛋白酶-3。基於該藥劑之上述應用，其尤其可用於抗攝護腺癌。

可以任何合宜之方式施用本發明醫藥組合物，舉例言之，但不以此為限，可以口服、皮下或靜脈內等投藥方式施用之。該醫藥組合物可使用於獸醫與人類醫藥上，單獨或與醫藥佐劑一起使用。

以製備適於口服投藥之藥劑形式為例，可於本發明醫藥組合物中含有不會不利影響式(I)及/或式(II)化合物活性之佐劑，例如：溶劑、油性溶劑、稀釋劑、安定劑、吸收延遲劑、崩散劑、乳化劑、黏合劑、潤滑劑、吸濕劑等。舉例言之，溶劑可選自水及蔗糖溶液，稀釋劑可選自乳糖、澱粉及微晶纖維素，吸收延遲劑可選自幾丁聚醣及葡萄胺基聚醣，潤滑劑可選自碳酸鎂，油性溶劑可選自植物或動物油類，如橄欖油、葵花油及魚肝油等。可利用習知方法，將該組合物製成合宜的口服投藥形式，例如：錠劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、流浸膏劑、溶液劑、糖漿劑、懸液劑、乳劑、及酊劑等等。

至於具適於皮下或靜脈內投藥之藥劑形式，則可於本發明醫藥組合物中含有一或多種例如增溶劑、乳化劑、以及其他佐劑等成分，以製成如靜脈輸注液、乳劑靜脈輸注液、注射劑、乾粉注射劑、懸液注射劑、或乾粉懸液注射劑等。可能採用之溶劑例如：水、生理食鹽溶液、醇類(例如：乙醇、丙醇、或甘油等)、糖溶液(例如：葡萄糖或甘露糖溶液)、或前述之組合。

本發明醫藥組合物可視需要另含有調味劑、調色劑、著色劑等添加劑，以提高所得藥劑服用時的口適感及視覺感受；另可添加合理用量之保存劑、防腐劑、抗菌劑、抗真菌劑等，以改善所得藥劑的儲存性。

再者，可視需要於本發明醫藥組合物中併含一或多種其他活性成分，進一步加強本發明醫藥組合物之功效或增加製劑配方的運用靈活性與調配度。舉例言之，可於本發明醫藥組合物含有一或多種如下活性成分：黃體素促進激素之同類物、抗雄性素藥劑如拂它邁或醋酸環妊酮，以及其他活性成分等，只要該其他活性成分對式(I)及/或式(II)化合物之效益沒有不利的影響即可。

可以一日一次、一日多次、或數日一次等不同投藥頻率施用本發明醫藥組合物，端視投予標的之需求而異。舉例言之，當使用於人體以抗攝護腺癌時，藥劑之用量，以式(I)及/或式(II)化合物計，為每天約10毫克/公斤體重至約40毫克/公斤體重，其中，該單位『毫克/公斤體重』係指每公斤體重所須之投藥量。較佳地，該藥劑之用量，以式(I)及/或式(II)化合物計，為每天約15毫克/公斤體重至約35毫克/公斤體重。惟，對於病情嚴重之病患(如攝護腺癌末期病患)而言，其用量可視實際需要而的增至數倍或數十倍。

茲以下列具體實施態樣以進一步例示說明本發明。其中該些實施態樣僅提供作為說明，而非用以限制本發明之範疇。

[實施例1]　攝護腺癌細胞抑制試驗

利用MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)細胞存活分析法(參見Pavwelset al .,J .Virol .,Methods,1988,20,509-321，該文獻全文併於此處以供參考)來測試順式及反式異柴胡內酯之抗癌活性。

首先，於一96孔(well)之微量孔盤內(共3組)，每孔培養3×10³ 個LNCaP攝護腺癌細胞(雄性素依賴性，表面具雄性素受體)或PC-3攝護腺癌細胞(雄性素非依賴性)(購自美國典型微生物菌種保藏中心(ATCC，The American Type Culture Collection))，培養至隔天後，分別添加不同濃度(0、0.625、1.25、2.5、5、10或20微莫耳濃度，每個濃度8個孔)的順式或反式異柴胡內酯(Z-K8或E-K8，其中R為甲氧基，下同)至細胞培養液中，並再培養2天。

接著，吸取移除細胞培養液，並添加200微升之含500微克/毫升之MTT的細胞培養液繼續培養2小時後，吸取移除細胞培養液，再添加100微升二甲基亞碸(DMSO)，然後以微量孔盤分光光度計測量細胞於570奈米之波長下的吸光值。利用吸光值之平均值計算順式及反式異柴胡內酯抑制攝護腺癌細胞之活性，結果係如第1圖、第2圖、表1及表2所示。

第1圖及表1顯示，順式及反式異柴胡內酯均具有抑制LNCaP攝護腺癌細胞生長之活性，其中又以順式異柴胡內酯之抑制活性為佳(順式異柴胡內酯：IC₅₀ (抑制一半癌細胞生長的濃度)=1微莫耳濃度；反式異柴胡內酯：IC₅₀ >10微莫耳濃度)。此外第2圖及表2顯示，順式異柴胡內酯可抑制雄性素依賴性之LNCaP攝護腺癌細胞生長，亦可抑制雄性素非依賴性之PC-3攝護腺癌細胞生長，說明順式異柴胡內酯可同時抑制雄性素依賴性及非依賴性之攝護腺癌細胞之生長。此外，順式異柴胡內酯對雄性素依賴性之LNCaP攝護腺癌細胞之抑制活性高於非雄性素依賴性之PC-3攝護腺癌細胞(LNCaP攝護腺癌細胞：IC₅₀ =1.25微莫耳濃度；PC-3攝護腺癌細胞：IC₅₀ =100微莫耳濃度)。

[實施例2]　癌細胞抑制試驗

重複實施例1之步驟，其中測試順式及反式異柴胡內酯對胃癌細胞、肝癌細胞、肺癌細胞及口腔癌細胞之抑制活性，結果係如表3所示。

-：未測試

表3顯示，除攝護腺癌細胞外，順式及反式異柴胡內酯亦具有抑制胃癌細胞、肝癌細胞、肺癌細胞及口腔癌細胞之活性，且以順式異柴胡內酯之抑制活性為佳，故該兩種化合物可用於治療胃癌、肝癌、肺癌及口腔癌。

[實施例3]　雄性素受體及攝護腺特異抗原抑制試驗

於本試驗中，檢驗攝護腺癌細胞中之雄性素受體及攝護腺特異抗原的表現，以觀察順式及反式異柴胡內酯之抑制機制。以攝護腺癌細胞中的總RNA作為模板，並利用Oligo-dT進行逆轉錄反應。於此，利用Oligo-dT會與大多數真核細胞mRNA之3’端的poly A tail結合之特性，將mRNA逆轉錄成cDNA，並結合聚合酶鏈鎖反應(PCR)反覆地合成cDNA，其過程包括兩股DNA的變性(denaturation)、引子的黏合(annealing of primer)、以及引子的延伸作用(primer extension)，藉此以指數方式增加cDNA的數量，從而可達成微量RNA之分析。詳細之試驗步驟如下。

首先，以1×10⁶ 個/盤之密度，將LNCaP攝護腺癌細胞種植於一直徑為10公分的培養皿中，靜置培養24小時，待細胞貼附後，分別添加不同濃度(0、0.5、1或2微莫耳濃度)之順式異柴胡內酯，再培養24小時；或者，將1微莫耳濃度之順式異柴胡內酯投予LNCaP攝護腺癌細胞，並以不同時間(0、6、12、24、或48小時)進行處理。本試驗以木犀草素(luteolin)作為正對照組。

接著，收集細胞，並置於一微量離心管中離心(1500轉/分鐘，5分鐘)，再以磷酸鹽緩衝液(PBS)清洗細胞表面後，再次離心(3000轉/分鐘，5分鐘)。離心後，移除上清液，收集細胞並萃取總RNA。利用omniscript reverse transcription kit(購自QIAGEN)，將2微克的RNA反轉錄為cDNA。最後，利用基因增幅反應(即，PCR)增幅雄性素受體及攝護腺特異抗原之cDNA。各組引子序列及基因增幅條件如下所示：

雄性素受體引子序列

(F)：5’-ATG GTG AGC AGA GTG CCC TA-3’ SEQ ID NO: 1

(R)：5’-GTG GTG CTG GAA GCC TCT CCT-3’ SEQ ID NO:2

條件

(1)94℃，5分鐘(2)94℃，0.5分鐘；58℃，0.5分鐘；72℃，0.5分鐘為1循環，行24循環(3)72℃，5分鐘。

攝護腺特異抗原引子序列

(F)5’-GGT GAC CAA GTT CAT GCT GTG-3’ SEQ ID NO: 3

(R)5’-GTG TCC TTG ATC CAC TTC CG-3’ SEQ ID NO: 4

條件

(1)94℃，5分鐘(2)94℃，0.5分鐘；57.5℃，0.5分鐘；72℃，0.5分鐘為1循環，行24循環(3)72℃，5分鐘。

使用1.2%瓊脂糖膠進行PCR產物之電泳分析，並以溴化乙錠染色膠片，以及利用BioDoc-ItTM system(購自UVP公司)觀察雄性素受體及攝護腺特異抗原之mRNA的表現。結果係如第3圖所示。

第3圖顯示，順式異柴胡內酯可抑制LNCaP攝護腺癌細胞中雄性素受體及攝護腺特異抗原之表現，且隨著時間或劑量之增加，抑制活性愈高，此結果說明，順式異柴胡內酯可經由抑制雄性素受體之表現，達成抑制攝護腺癌細胞生長之效果。

[實施例4]　細胞凋亡試驗

碘化丙啶(Propidium iodide，PI)是一種螢光染劑，PI染色之基本原理為，以酒精將細胞膜打洞固定後，進入細胞內之PI可與核苷酸進行鍵結，當其以嵌合(intercalation)的方式與雙股核苷酸鏈結合時，會產生紅色螢光(640奈米)。由於凋亡細胞中內切酶的活化，導致DNA被斷裂成小片段，配合檸檬酸-磷酸緩衝液(phosphate-citrate buffer)的浸潤，使細胞內DNA滲透出細胞膜外，此使細胞內DNA含量减少，其會在流式細胞儀DNA直方圖的G0/G1 peak前出現一個sub-G1波鋒。利用上述原理可以反映出細胞內DNA之狀態，或進行細胞週期的分析。詳細試驗步驟如下。

以1×10⁶ 個/盤之密度將LNCaP攝護腺癌細胞種植於一直徑為10公分的培養皿中，靜置培養24小時，待細胞貼附後，添加不同濃度(0、0.25、0.5、1、2或4微莫耳濃度)之順式異柴胡內酯，再培養24小時。接著，收集細胞，並置於一微量離心管中離心(1500轉/分鐘，5分鐘)，再以磷酸鹽緩衝液(PBS)清洗細胞表面，並再次離心(3000轉/分鐘，5分鐘)。之後，以1毫升冰冷磷酸鹽緩衝液懸浮細胞，細胞濃度為2×10⁵ 個/毫升，再以快速混合法固定細胞，其係將細胞懸浮液加入至一含有10毫升70體積%預冷酒精的離心管(15毫升)中，快速吸抽混合，再靜置固定細胞至少2小時，或在低溫-20℃下靜置過夜。

固定細胞後，進行離心(300×g，5分鐘)並移除酒精，再添加檸檬酸-磷酸溶液，並將細胞放入37℃之水浴槽中作用2小時。接著，進行離心(300×g，5分鐘)，再將碘化丙啶(PI)溶液加入至細胞中，並與懸浮細胞充分混合。將細胞懸浮液吸取移至一褐色微量離心管中，以低溫4℃避光作用30分鐘。作用完畢後，於3小時內進行流式細胞儀分析，上機前輕輕混勻細胞懸浮液，並以57微米尼龍篩網過濾細胞，再利用流式細胞儀(Cell lab QuantaTM SC Flow cytometer)進行螢光平均強度測定。結果係如第4圖及表4所示。

第4圖及表4顯示，順式異柴胡內酯會增加LNCaP攝護腺癌細胞之細胞周期停留在G2/M時期的比例，且其隨著劑量提高而增加，且sub-G1之結果亦說明順式異柴胡內酯會促進LNCaP攝護腺癌細胞之細胞凋亡(apoptosis)。因此，順式異柴胡內酯可經由促進LNCaP攝護腺癌細胞之細胞凋亡來達成抑制攝護腺癌之效果。

[實施例5]　硫胱胺酸蛋白酶-3分析

細胞凋亡時，硫胱胺酸蛋白酶-3(caspase-3)會被活化以進行凋亡作用。本試驗利用此原理，將順式異柴胡內酯投予LNCaP攝護腺癌細胞，使其進行凋亡作用而活化硫胱胺酸蛋白酶-3，再添加硫胱胺酸蛋白酶-3之基質，其經活化之硫胱胺酸蛋白酶-3切割反應後會釋出螢光物質，可藉此評估硫胱胺酸蛋白酶-3活化情形，進而觀察LNCaP攝護腺癌細胞之凋亡情形。詳細試驗步驟如下。

首先，將1×10⁶ 顆LNCaP攝護腺癌細胞株種植於一直徑為10公分之細胞培養皿中，靜置培養24小時，待細胞貼附後，添加不同濃度之順式異柴胡內酯(0、0.25、0.5、1、2或4微莫耳濃度)，再培養24小時。收集細胞，並置於一微量離心管中離心(1500轉/分鐘，5分鐘)後，以冰冷磷酸鹽緩衝液清洗細胞後，再次離心(3000轉/分鐘，5分鐘)。接著，添加蛋白質萃取緩衝液(protein extraction buffer)，並置於冰上作用30分鐘後，以高速離心(12000×g)於4℃下離心10分鐘，收取上清液即為蛋白質萃取液。

將待測之蛋白質樣本進行蛋白質定量，取10微升的蛋白質置入一96孔微量孔盤，做兩次重複試驗，每孔加入200微升之Bradford染劑(購自Bio-Rad公司)，再利用微量盤分析儀於595奈米之波長下測定蛋白質標準品之吸光值並取得平均值，以獲得一趨勢線方程式，再將蛋白質樣本之吸光值代入趨勢線方程式，則可求得蛋白質樣本之實際濃度。之後，利用Promega G3540 caspACETM assay kit(購自Promega公司)，並依照其說明步驟進行分析。將試劑與待測蛋白質樣本配製於一96孔之黑色微量孔盤中，並靜置於30℃之培養箱內，避光反應30分鐘，接著，添加2微升之硫胱胺酸蛋白酶-3的基質Ac-DEVD-AMC(購自Promega公司)，靜置於30℃之培養箱中，避光反應60分鐘，最後，利用微量盤分析儀測量螢光值(激發波長：360奈米；發散波長：460奈米)，以測得硫胱胺酸蛋白酶-3的活性。結果係如第5圖及表5所示。

第5圖及表5顯示順式異柴胡內酯可增加LNCaP攝護腺癌細胞之硫胱胺酸蛋白酶-3之活性，且其效果隨著劑量增加而增加，此說明異柴胡內酯可經由增加硫胱胺酸蛋白酶-3之活性而促進攝護腺癌細胞之凋亡，故其可用於抗攝護腺癌。

[實施例6]　體內試驗-小鼠實驗

首先，取經無菌培養之1×10⁷ 個LNCaP攝護腺癌細胞，並將其注射至Balb/c免疫不全之裸小鼠(購自國家動物中心)皮下，以進行體內腫瘤移植。於腫瘤生長至50至100立方毫米(長×寬×寬/2)後開始皮下(i.p.)給藥治療，其中，在腫瘤對側超過1.5公分處給藥，連續5天，每天1次。治療組(實驗組)投予15毫克/公斤體重或30毫克/公斤體重之順式或反式異柴胡內酯，溶劑組(對照組)則投予二甲基亞碸及維他命K1。投藥第5天後連續觀察33天，每3天測量一次腫瘤大小及小鼠體重，其中，每隻裸鼠測得之腫瘤大小減掉第1天之腫瘤大小所得之值為腫瘤成長大小值(tumor growth size)，以腫瘤成長大小值作為腫瘤生長抑制效果的指標，數值愈小，表示抑制效果愈好。結果係如第6圖、第7圖、表6及表7所示。

第6圖、第7圖、表6及表7顯示，順式或反式異柴胡內酯可於小鼠體內有效抑制LNCaP攝護腺腫瘤之生長，且順式異柴胡內酯之抑制活性高於反式異柴胡內酯，其中，將15毫克/公斤體重之順式異柴胡內酯投予小鼠時，可達到60%之抑制效果。此結果說明，順式或反式異柴胡內酯可用於活體內之攝護腺癌治療。

[實施例7]　免疫組織染色分析

於以上實施例6之小鼠實驗中，經過33天的觀察期後，犧牲小鼠，取出皮下腫瘤並以石蠟包埋以進行組織切片。接著，進行組織切片染色前，先將石蠟去除，以0.3體積% triton X-100/PBS增加細胞膜通透性，再將組織切片放入3重量/體積%過氧化氫溶液中達10分鐘，以0.05體積% triton X-100/PBS(清洗緩衝液)清洗切片三次，於室溫下，以5重量/體積%無脂牛奶(non-fat Milk)進行阻斷作用(blocking)兩小時。之後，添加經適當稀釋之一級抗體(anti-caspase-3)於室溫下作用1小時，再以清洗緩衝液清洗組織切片3次，然後使用Super Sensitive^TM Polymer-HRP IHC Detection System 29(購自Biogenex)添加二級抗體，再以清洗緩衝液清洗3次，然後，添加三級抗體放大訊號，再用清洗緩衝液清洗組織切片3次。最後，添加二胺基聯苯胺(diaminobenzidine，DAB)呈色劑，至呈紅色陽性反應即可取出組織切片，並以滅菌水終止反應，若於添加呈色劑後10分鐘未有顏色出現則為陰性反應。以蘇木精(hematoxylin)進行細胞核染色，再以流動的水浸泡組織切片10分鐘，風乾後，以DPX Mountant(購自Fluka)封片。免疫組織染色之結果係如第8圖所示。

第8圖顯示，順式異柴胡內酯可增加硫胱胺酸蛋白酶-3之活性，有效抑制攝護腺腫瘤的生長。

由以上實施例可知，不論是雄性素依賴性或非雄性素依賴性之攝護腺癌細胞，異柴胡內酯皆可於體內或體外抑制其生長，且可促使其進行細胞凋亡。因此，異柴胡內酯可用於治療雄激素依賴性或非雄性素依賴性之攝護腺癌。

上述實施例僅係用以例示說明本發明之原理及功效，而非用於限制本發明。任何熟於此項技藝之人士均可在不違背本發明之技術原理及精神的情況下，對上述實施例進行修改及變化。因此，本發明之權利保護範圍應如後述之申請專利範圍所列者。

第1圖所示為順式及反式異柴胡內酯抑制LNCaP攝護腺癌細胞之統計直條圖；

第2圖所示為順式異柴胡內酯抑制LNCaP攝護腺癌細胞及PC-3攝護腺癌細胞之統計直條圖；

第3圖所示為順式異柴胡內酯抑制LNCaP攝護腺癌細胞之雄性素受體及攝護腺特異抗原之表現的cDNA電泳圖；

第4圖所示為順式異柴胡內酯影響LNCaP攝護腺癌細胞之細胞週期的統計直條圖；

第5圖所示為順式異柴胡內酯促進LNCaP攝護腺癌細胞之硫胱胺酸蛋白酶-3活性的統計直條圖；

第6圖所示為順式及反式異柴胡內酯抑制小鼠體內LNCaP攝護腺腫瘤生長之曲線圖；

第7圖所示為順式異柴胡內酯抑制小鼠體內LNCaP攝護腺腫瘤生長之曲線圖；以及

第8圖所示為小鼠體內LNCaP攝護腺腫瘤之組織切片的染色圖。

Claims

一種使用下式(I)化合物及/或其醫藥可接受鹽及/或酯在製造藥劑之應用，其中，R為H或烷氧基，且該藥劑係用於抑制雄性素依賴性及/或非依賴性之攝護腺癌細胞及/或胃癌細胞之生長。
如請求項1所述之應用，其中R為H或C₁ 至C₆ 烷氧基。
如請求項2所述之應用，其中R為甲氧基。
如請求項1至3中任一項所述之應用，其中該藥劑係用於抑制雄性素依賴性之攝護腺癌細胞之生長。
如請求項1至3中任一項所述之應用，其中該藥劑係用於抑制雄性素受體之表現、抑制攝護腺特異抗原(prostate specific antigen，PSA)之表現、促進攝護腺癌細胞之凋亡、及/或活化硫胱胺酸蛋白酶-3(caspase-3)。
如請求項1至3中任一項所述之應用，其中該藥劑係用於抗攝護腺癌及/或抗胃癌。
如請求項6所述之應用，其中該藥劑之用量，以式(I) 化合物計，為每天約10毫克/公斤體重至約40毫克/公斤體重。
如請求項7所述之應用，其中該藥劑之用量，以式(I)化合物計，為每天約15毫克/公斤體重至約35毫克/公斤體重。