CN105377289A - 用于下调Bcl-xL和/或Bcl-w的活性和/或量的试剂 - Google Patents

用于下调Bcl-xL和/或Bcl-w的活性和/或量的试剂 Download PDF

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Abstract

本文公开了在受试者中治疗炎性或纤维化疾病的方法。所述方法包括给予所述受试者治疗有效量的下调Bcl-xL和/或Bcl-w和/或p21的活性和/或量的试剂，条件是所述炎性疾病不是癌症。

Description

用于下调 Bcl-xL 和 / 或 Bcl-w 的活性和 / 或量的试剂
发明领域和 背景
本发明，在其一些实施方案中，涉及通过下调编码Bcl-2-家族蛋白和/或p21的基因而杀死衰老细胞以治疗年龄相关性障碍的方法。
细胞衰老是细胞周期停滞的一种稳定形式，是限制细胞增殖潜力的一种机制。衰老可以在许多细胞类型中响应于多种细胞应激形式而触发。它是肿瘤发生的有效屏障并促成某些抗癌药的细胞毒性。尽管衰老以细胞自主方式限制肿瘤发生和组织损伤，但是衰老细胞在其存在部位以细胞非自主方式诱导炎症、组织老化、组织破坏并促进肿瘤发生和转移。因此，将其消除可导致对肿瘤的预防和对组织老化的抑制。的确，在动物模型中，衰老细胞的消除显示出减缓组织老化(Baker等人, 2011)。
生物体可发展出精细机制以消除衰老细胞，以避免其对微环境的有害效应。然而，对它们在组织中的命运并未充分表征。一方面，良性黑素细胞性痣(黑痣)高度富集于衰老细胞，但可终生都在皮肤中存在，这意味着衰老细胞可以被稳定地并入组织。另一方面，先前已经显示出先天免疫系统的组分在体外特异性地识别和消除衰老细胞并在体内靶向衰老细胞，导致肿瘤的衰退和肝纤维化的逆转(Krizhanovsky等人, 2008b；Sagiv等人, 2012；Xue等人, 2007)。因此，衰老细胞可在体内周转(turn over)，免疫系统促进这样的周转。免疫系统所进行的对衰老细胞的识别和消除的努力表明(尽管并非直接地)衰老细胞对生物体是有害的，将其消除是有益的。
最近十年间，多项研究鉴定了衰老诱导所需的基因和途径或衰老表型的旁路。由p53 (TP53)和p16INK4a (CDKN2A)所控制的两种肿瘤抑制基因途径，调节衰老反应。p53通过反式激活能抑制增殖的基因而促进衰老，而p16INK4a，连同p53靶p21 (CDKN1A)一起，抑制细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK) 2和4，从而阻止pRB磷酸化和促进阻遏性异染色质形成，使增殖相关基因沉默。
Bcl-2-家族蛋白在细胞死亡调节中起到重要作用并且能够调节多种细胞死亡机制，其包括细胞凋亡、坏死和自噬(Cory等人, 2003；Reed, 2008)。对于该家族的创始成员Bcl-2在衰老中的功能仍然有争议。已经提出其在衰老细胞中上调或下调并且与这些细胞的细胞凋亡的阴性或阳性调节有关(Uraoka等人, 2011；Wang, 1995)。除了Bcl-2之外，该家族还包括抗凋亡蛋白Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-1和A1，并且集中研究了该家族作为癌症的药理学干涉的靶标(Azmi等人, 2011；Zeitlin等人, 2008)。
美国专利申请号20120189539教导了下调Bcl-xL用于癌症治疗的一种化学物。
美国专利申请号20040001811教导了用于癌症治疗的包含靶向Bcl-2家族成员的dsRNA的药物组合物。
美国专利申请号20070258952教导了靶向包括Bcl-xL和p-21的多种基因的siRNA的给予。
美国专利申请号20110301192教导了用于癌症治疗的下调p-21的化学试剂的给予。
发明概述
根据本发明的一些实施方案的一方面，提供了在有需要的受试者中治疗炎性或纤维化疾病的方法，其包括给予所述受试者治疗有效量的下调Bcl-xL和/或Bcl-w的活性和/或量的试剂，从而治疗所述炎性或纤维化疾病，条件是所述炎性疾病不是癌症。
根据本发明的一些实施方案的一方面，提供了制品，其包含：
(i) 下调Bcl-xL和/或Bcl-w的活性和/或量的试剂；和
(ii) 下调p21的活性和/或量的试剂。
根据本发明的一些实施方案的一方面，提供了药物组合物，其包含药学上可接受的载体和作为活性剂的：
(i) 下调Bcl-xL和/或Bcl-w的活性和/或量的试剂；和
(ii) 下调p21的活性和/或量的试剂。
根据本发明的一些实施方案的一方面，提供了下调细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1 (p21)的活性和/或量的试剂，用于治疗炎性或纤维化疾病，其中所述疾病不是癌症。
根据本发明的一些实施方案的一方面，提供了下调表达Bcl-xL的内源核酸序列的多核苷酸试剂和下调表达Bcl-w的内源核酸序列的多核苷酸试剂，用于治疗炎性或纤维化疾病。
根据本发明的一些实施方案的一方面，提供了组合物，其包含载体和下调p21的活性和/或量的至少一种活性剂和下调Bcl-xL和/或Bcl-w的活性和/或量的至少一种活性剂，其中所述组合物被配制为供局部给药用。
根据本发明的一些实施方案的一方面，提供了在有需要的受试者中治疗炎性或纤维化疾病的方法，包括给予所述受试者治疗有效量的下调细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1 (p21)的活性和/或量的试剂，从而治疗所述炎性或纤维化疾病，条件是所述疾病不是癌症。
根据本发明的一些实施方案的一方面，提供了在有需要的受试者中治疗炎性或纤维化疾病的方法，其包括给予所述受试者治疗有效量的下调表达Bcl-xL的内源核酸序列的至少一种多核苷酸试剂和下调表达Bcl-w的内源核酸序列的至少一种多核苷酸试剂，从而治疗所述炎性或纤维化疾病。
根据本发明的一些实施方案的一方面，提供了在有需要的受试者中治疗癌前病变的方法，其包括给予所述受试者治疗有效量的下调Bcl-xL和/或Bcl-w的活性和/或量的试剂，从而治疗所述癌前病变。
根据本发明的一些实施方案的一方面，提供了在有需要的受试者中治疗癌前病变的方法，其包括给予所述受试者治疗有效量的下调细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1 (p21)的活性和/或量的试剂，从而治疗所述癌前病变。
根据本发明的一些实施方案，所述试剂是化学试剂。
根据本发明的一些实施方案，所述试剂是靶向Bcl-xL和/或Bcl-w的多核苷酸试剂。
根据本发明的一些实施方案，所述疾病与软骨变性相关。
根据本发明的一些实施方案，所述疾病选自肝纤维化、伤口愈合、皮肤纤维化、肺病、骨质疏松症、肾纤维化、前列腺炎、动脉粥样硬化、关节炎和胰腺炎。
根据本发明的一些实施方案，所述肺病包括慢性阻塞性肺病(COPD)。
根据本发明的一些实施方案，所述下调Bcl-xL和/或Bcl-w的活性和/或量的试剂被包含在与所述下调p21的活性和/或量的试剂分开的包装中。
根据本发明的一些实施方案，所述下调Bcl-xL和/或Bcl-w的活性和/或量的试剂被包含在与所述下调p21的活性和/或量的试剂相同的包装中。
根据本发明的一些实施方案，所述制品进一步包含选自以下的至少一种试剂：皮脂调节剂、抗菌和/或抗真菌剂、角质软化剂和/或角质调节剂、收敛剂、抗炎和/或抗刺激剂、抗氧化剂和/或自由基清除剂、愈合剂、抗老化剂和保湿剂。
根据本发明的一些实施方案，所述至少一种试剂是抗老化剂。
根据本发明的一些实施方案，所述药物组合物被配制为供局部递送。
根据本发明的一些实施方案，所述多核苷酸试剂是siRNA试剂。
根据本发明的一些实施方案，下调Bcl-xL和/或Bcl-w的活性和/或量的至少一种活性剂是ABT-737或ABT-263。
根据本发明的一些实施方案，所述组合物进一步包含选自以下的至少一种试剂：皮脂调节剂、抗菌和/或抗真菌剂、角质软化剂和/或角质调节剂、收敛剂、抗炎和/或抗刺激剂、抗氧化剂和/或自由基清除剂、愈合剂、抗老化剂和保湿剂。
根据本发明的一些实施方案，所述至少一种试剂是抗老化剂。
根据本发明的一些实施方案，所述试剂是针对表达p21的内源核酸序列的多核苷酸。
根据本发明的一些实施方案，所述多核苷酸试剂是siRNA。
根据本发明的一些实施方案，所述方法进一步包括给予所述受试者下调Bcl-xL和/或Bcl-w的活性和/或量的至少一种试剂。
根据本发明的一些实施方案，所述至少一种试剂是针对表达Bcl-xL和/或Bcl-w的内源核酸序列的多核苷酸。
根据本发明的一些实施方案，所述试剂是针对Bcl-xL和/或Bcl-w的siRNA。
根据本发明的一些实施方案，所述至少一种试剂是化学试剂。
根据本发明的一些实施方案，所述化学试剂选自ABT-737、ABT-263、棉酚、AT-101、TW-37和Obatoclax。
根据本发明的一些实施方案，所述疾病与软骨变性相关。
根据本发明的一些实施方案，所述疾病选自肝纤维化、伤口愈合、皮肤纤维化、肺病、肾纤维化、前列腺炎、动脉粥样硬化、关节炎和胰腺炎。
根据本发明的一些实施方案，所述试剂被配制为局部组合物。
根据本发明的一些实施方案，所述至少一种多核苷酸试剂包含siRNA。
根据本发明的一些实施方案，所述疾病是癌症。
根据本发明的一些实施方案，所述疾病选自肝纤维化、伤口愈合、皮肤纤维化、肺病、肾纤维化、前列腺炎、动脉粥样硬化、关节炎和胰腺炎。
根据本发明的一些实施方案，所述至少一种试剂被配制为局部组合物。
根据本发明的一些实施方案，所述方法进一步包括给予所述受试者下调p21的活性和/或量的试剂。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和/或科学术语都具有本发明所属领域普通技术人员公知的相同含义。尽管类似于或等同于本文所述的那些的方法与材料可以用于本发明实施方案的实践或试验，但是以下描述了示例性的方法和/或材料。在有矛盾时，将以本专利说明书包括定义为准。另外，材料、方法和实施例仅仅是说明性的和无意作为必要限制。
附图简述
参考附图和图像，仅以实例的方式在本文中描述了本发明的一些实施方案。现将详细地对附图的具体提及，强调以实例的方式和为了本发明实施方案的说明性讨论的目的而显示了细节。在这一点上，附图说明使本领域技术人员清楚本发明的实施方案可以如何实践。
在附图中：
图1A-C说明了在衰老细胞中Bcl-w和Bcl-xL蛋白的升高的表达。(A) 对应于以下细胞的细胞裂解物(IMR-90和MEF)的免疫印迹：经溶媒处理的生长细胞(G)、经依托泊苷处理以诱导衰老的细胞(Eto)；用空载体(V)或用表达H-rasv12的逆转录病毒(H-rasv12)转导的细胞。β-微管蛋白用作上样对照。(B) 对如A所述处理的IMR-90细胞进行的SA-β-gal活性染色。(C)在如A所述处理的IMR-90细胞中的Bcl-2、Bcl-w和Bcl-xL的mRNA水平的定量RT-PCR分析。数值是平均值+SEM。
图2A-B说明了Bcl-w和Bcl-xL的组合敲减诱导杀死衰老细胞。(A)经依托泊苷处理的衰老IMR-90细胞用指定siRNA转染。转染后4天测定细胞活力。(B)经依托泊苷处理的衰老细胞用指定siRNA转染后4天，Bcl-2、Bcl-w和Bcl-xL表达的蛋白质印迹分析。β-微管蛋白用作上样对照。
图3A-D说明了Bcl-w和Bcl-xL的组合敲减诱导衰老细胞死亡。(A)经依托泊苷处理的衰老IMR-90细胞用指定siRNA转染。转染后4天测定细胞活力。(B)经依托泊苷处理的衰老IMR-90细胞用指定siRNA转染。转染后3天细胞用10μM ABT-199处理24小时或用DMSO(作为对照)处理。在孵育期结束时测定细胞成活力。(C) IMR-90或MEF经溶媒处理的生长细胞(G)、衰老的经依托泊苷处理的细胞(E)、用空载体(V)或用表达H-rasV12的逆转录病毒(H-rasV12)转导的细胞，用ABT-199处理24小时。在孵育期结束时测定细胞成活力。对Bcl-2抑制敏感的SH-SY5Y细胞用作处理的阳性对照。
图4A-B说明了BH3模拟ABT-737在衰老细胞中诱导细胞死亡。IMR-90 (图4A)或MEF (图4B)生长细胞(G)、经依托泊苷处理的细胞(Eto)、用空载体(V)或用表达H-rasV12的逆转录病毒(H-rasV12)转导的细胞用指定剂量的ABT-737或用DMSO(作为对照)处理24小时。在孵育期结束时测定细胞成活力。
图5A-B说明了IMR-90生长细胞(G)、经依托泊苷处理的细胞(Eto)或用表达H-rasv12的逆转录病毒(Ras)转导的细胞，在z-VAD-fmk存在或不存在时用ABT-737或DMSO(作为对照)处理24小时。(A)在孵育期结束时测定细胞成活力。(B)对应于以下细胞的细胞裂解物的免疫印迹：在如所示的DMSO、ABT-737或ABT-737加上z-VAD-fmk存在时的生长细胞(G)、经依托泊苷处理的细胞(Eto)或用表达H-rasv12的逆转录病毒(Ras)转导的细胞。β-微管蛋白用作上样对照。
图6A-E说明了p21影响衰老细胞的成活力。(A-D)生长(G)和经依托泊苷(Eto)处理的原代人(IMR-90, BJ)和小鼠(MEF)成纤维细胞以及人肺癌细胞(H1299)用针对p21的siRNA或对照siRNA转染。转染后4天(A-D)或在指定时间点(E)测定细胞成活力。
图7A-C说明了p21以p53和pRB非依赖性方式维持衰老细胞成活力。(A)在BJ生长细胞(G)和经依托泊苷处理的BJ细胞(Eto)用针对p21的siRNA或对照siRNA转染后4天的指定蛋白的蛋白质印迹分析。β-微管蛋白用作上样对照。(B-C)经依托泊苷处理的BJ细胞用指定siRNA转染。转染后4天测定细胞成活力。在同一时间，收集细胞裂解物并通过蛋白质印迹分析，证实指定蛋白的有效敲减。
图8是图，说明了对胱天蛋白酶活性的抑制部分地营救了衰老细胞免于细胞凋亡。经依托泊苷处理的BJ细胞用sip21或对照siRNA转染。在z-VAD-fmk (每天补充)存在或不存在时将细胞孵育4天。在孵育期结束时测定细胞成活力。
图9A-E说明了作为对p21敲减的响应，E2F靶和炎症基因被上调。生长(G)和经依托泊苷(Eto)处理的BJ细胞的指定基因的mRNA水平的定量RT-PCR分析。GAPDH mRNA用作参考。数据表示为3次独立的RT-PCR分析的平均值+SEM。
图10是照片，说明了在p21敲除小鼠中同时减少了衰老细胞和纤维化瘢痕的存在。野生型和p21-/- (敲除)小鼠经历6周CCl4处理以诱导纤维化。处理后对肝通过针对衰老细胞的存在情况的SA-β-gal和通过针对纤维化瘢痕形成的天狼星红(Sirius Red)染色进行评价。
本发明的 具体实施方案 的描述
本发明，在其一些实施方案中，涉及通过下调编码Bcl-2-家族蛋白和/或p21的基因而杀死衰老细胞用于治疗年龄相关性障碍的方法。
在详细解释本发明的至少一个实施方案之前，应当理解，本发明不一定将其应用限制在以下说明中给出的或通过实施例举例说明的细节上。本发明能够具有其它实施方案或以不同方式被实践或实施。
衰老细胞可以在皮肤、肝、肺、胰腺、前列腺的纤维化或炎性疾病中以及关节软骨、动脉粥样硬化斑块和其它年龄相关性疾病中找到。此外，衰老细胞显示出在正常组织、尤其是皮肤中随年龄增长而积累并表明促进组织老化。因此，消除衰老细胞可显著地延迟许多组织的老化并治疗其中存在衰老细胞的病理状况。
本发明人已经表明，通过siRNA (图2A-B和3A-B)或通过Bcl-2家族的特异性抑制剂(ABT-737；图4A-B和5A-B)对Bcl-xL和Bcl-w的组合抑制导致衰老细胞的特异性消除。对Bcl-2本身的抑制不能执行这项任务(图3C-D)。因此，本发明人提出对Bcl-xL和Bcl-w的组合抑制允许衰老细胞的特异性消除并可用于治疗其中存在衰老细胞的疾病。
令人惊奇的是，本发明人已经发现，对衰老细胞的相同效应可以通过降低p21表达而实现(图6A-E和7A-C)，p21是通常与衰老的发作(作为CDK4和CDK2的抑制剂)和肿瘤抑制相关的一种蛋白。尽管在生长细胞中的p21敲减对细胞成活力没有有害效应，但在衰老细胞中对p21敲减导致IMR-90、BJ、H1299和MEF细胞的细胞成活力分别下降30%、50%、75%和30%(图6A)。因此，本发明人提出p21对于维持衰老细胞成活力而言是必要的。
正如根据p21作为RB蛋白磷酸化抑制剂的功能所料的，注意到在响应p21敲减时，E2F介导的细胞周期调节相关的基因(例如，细胞周期蛋白-A2和CDK-1)的mRNA水平显著增加(图9)。另外，出乎意料的是，发现了p21敲减导致IL-8和IL-1β mRNA水平增加，指向衰老细胞生物相关的炎性反应。因此，本发明人推断p21敲减在衰老细胞中诱导促炎反应和细胞死亡。这可导致其治疗潜力增加，因为炎性细胞因子将会募集免疫系统，以杀死通过敲减本身未能消除的细胞。
因此，本发明人提出，由下调Bcl-xL和Bcl-w的试剂在衰老细胞中对细胞凋亡的直接诱导(其导致细胞死亡的诱导)连同由p21敲减所诱导的促炎反应的组合应在从癌前病变、损伤的和老化的组织中有效地消除衰老细胞方面达到极点。这将对其中存在着衰老细胞的各种各样的病症提供重要的治疗影响。
因此，根据本发明的一方面，提供了在有需要的受试者中治疗炎性或纤维化疾病的方法，其包括给予所述受试者治疗有效量的下调Bcl-xL和/或Bcl-w和/或p21的活性和/或量的试剂。
术语“Bcl-xL”是指具有SEQ ID NO: 21所示的序列的人蛋白(也称为B-细胞淋巴瘤-超大)及其同源物和直向同源物。人Bcl-xL的cDNA序列如SEQ ID NO: 22所示。
术语“Bcl-w”是指具有SEQ ID NO: 23所示的序列的人蛋白(也称为Bcl-2-样蛋白2)及其同源物和直向同源物。人Bcl-w的cDNA序列如SEQ ID NO: 24所示。
术语“p21”也称为“细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1”是指具有SEQ ID NO: 25所示的序列的人蛋白及其同源物和直向同源物。人p21的cDNA序列如SEQ ID NO: 26所示。
根据具体的实施方案，所述方法包括下调Bcl-xL和Bcl-w。
根据另一实施方案，所述方法包括下调Bcl-xL、Bcl-w和p21的每一种。
根据再一实施方案，所述方法包括下调p-21和下调Bcl-xL。
根据再一实施方案，所述方法包括下调p-21和下调Bcl-w。
本文使用的短语“下调(靶蛋白)的活性和/或量”是指下调至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或甚至至少90%。另外，术语“下调”也可指完全抑制。
使用化学试剂可实现对Bcl-xL和/或Bcl-w和/或p21的下调。已知能降低Bcl-xL和/或Bcl-w的活性的化学试剂包括ABT-737、ABT-263、棉酚、AT-101、TW-37和Obatoclax。
根据具体的实施方案，所述试剂是ABT-737或ABT-263。
ABT-737和ABT-263 (ABT-263是生物可利用形式，称为“Novatoclax”, Abbot)目前处于用于多发性骨髓瘤、淋巴瘤、急性白血病、CLL、小细胞肺癌的II期。
棉酚(天然的)用于头颈部肿瘤、胰腺癌的II/III期。
AT-101 (棉酚衍生物；Ascenta Therapeutics)用于胰腺癌、头颈部癌症、胶质瘤的II/III期。
TW-37 (Uni Michigan)用于胰腺癌、淋巴瘤的II期。
Obatoclax (GX15-070MS；Gemin X, 稍后称为Cephalon, 现在称为Teva)用于骨髓瘤、骨髓纤维化和套细胞淋巴瘤的II期。
下调p21活性的化学试剂的实例公开于美国专利申请号20110301192，通过引用结合到本文中。
使用干扰转录和/或翻译的各种分子(例如，RNA沉默剂、核酶、DNA核酶和反义物)，也可在基因组和/或转录本水平上实现Bcl-xL和/或Bcl-w和/或p21的下调，或者使用例如拮抗剂、切割多肽的酶等，也可在蛋白质水平上实现Bcl-xL和/或Bcl-w和/或p21的下调。
以下是能够下调Bcl-xL和/或Bcl-w和/或p21的表达水平和/或活性的试剂列表。
能够下调Bcl-xL和/或Bcl-w和/或p21的试剂的一个实例是能够与之特异性结合的抗体或抗体片段。优选地，所述抗体能够被细胞内在化。
本发明使用的术语“抗体”包括完整分子及其功能性片段，例如Fab、F(ab')2和Fv，其能够结合到巨噬细胞。这些功能性抗体片段定义如下：(1) Fab，其是含有抗体分子的单价抗原结合片段的片段，可以通过用木瓜蛋白酶对全抗体的消化以得到完整的轻链和一个重链的一部分而产生；(2) Fab'，其是可以通过用胃蛋白酶处理全抗体，紧接着还原以得到完整的轻链和部分重链而获得的抗体分子的片段；每个抗体分子获得两个Fab'片段；(3) (Fab')2，其是可以通过用胃蛋白酶处理全抗体而没有随后还原而获得的抗体片段；F(ab')2是两个Fab'片段通过两个二硫键连在一起的二聚体；(4) Fv，定义为基因工程的片段，其含有表达为两条链的轻链的可变区和重链的可变区；和(5)单链抗体(“SCA”)——一种基因工程的分子，其含有作为基因融合的单链分子的通过合适的多肽接头连接的轻链的可变区以及重链的可变区。
下调Bcl-xL和/或Bcl-w和/或p21也可以通过RNA沉默而达到。本文使用的短语“RNA沉默”是指由RNA分子介导的一组调节机制[例如，RNA干扰(RNAi)、转录基因沉默(TGS)、转录后基因沉默(PTGS)、抑制(quelling)、共抑制、和翻译阻遏]，所述RNA分子导致相应的蛋白编码基因表达的抑制或“沉默”。已在包括植物、动物和真菌在内的许多生物类型中观察到RNA沉默。
本文使用的术语“RNA沉默剂”是指能够抑制或“沉默”靶基因表达的RNA。在某些实施方案中，所述RNA沉默剂能够通过转录后沉默机制阻止mRNA分子的完全加工(例如完整翻译和/或表达)。RNA沉默剂包括非编码RNA分子，例如包含成对链的RNA双链体、以及前体RNA(自其可以产生这种小的非编码RNA)。示例性的RNA沉默剂包括dsRNs例如siRNA、miRNA和shRNA。在一个实施方案中，RNA沉默剂能够诱导RNA干扰。在另一个实施方案中，RNA沉默剂能够介导翻译阻遏。
RNA干扰是指在动物中的由短的干扰RNA (siRNA)介导的序列特异性转录后基因沉默的过程。在植物中的相应过程通常称为转录后基因沉默或RNA沉默，而在真菌中也称为抑制(quelling)。认为转录后基因沉默的过程是进化保守的细胞防御机制，用于阻止外源基因表达并由多种植物区系和门所共享。免于外源基因表达的这种保护可能是在响应双链RNA (dsRNA)的产生而进化的：所述双链RNA来源于病毒感染或来源于转座子元件通过细胞反应而随机整合到宿主基因组中，所述细胞反应特异性地破坏同源单链RNA或病毒基因组RNA。
在细胞中的长dsRNA的存在刺激核糖核酸酶III酶(称为切酶)的活性。切酶参与将dsRNA加工成小片dsRNA，称为短的干扰RNA (siRNA)。来源于切酶活性的短干扰RNA通常长度为约21至约23个核苷酸并且包含约19个碱基对双链体。RNAi反应的特征还在于内切核酸酶复合物，通常称为RNA-诱导的沉默复合物(RISC)，其介导具有与siRNA双链体的反义链互补的序列的单链RNA的切割。靶RNA的切割发生在与siRNA双链体的反义链互补的区域的中部。
因此，本发明考虑了使用dsRNA以下调自mRNA的蛋白表达。
根据一个实施方案，所述dsRNA大于30 bp。长dsRNA (即大于30 bp的dsRNA)的使用非常有限，因为认为双链RNA的这些较长区将导致干扰素的诱导和PKR反应。然而，使用长dsRNA可提供许多优势，因为细胞可选择最佳沉默序列，减少对测试大量siRNA的需求；长dsRNA将允许沉默文库具有比siRNA所需要的更低的复杂度；并且，也许最重要的是，当用作治疗药时，长dsRNA能阻止病毒逃逸突变。
多项研究表明长dsRNA可用于沉默基因表达，而不诱导应激反应或导致明显的脱靶效应-参见例如[Strat等人, Nucleic Acids Research, 2006, 第34卷,第13期, 3803–3810；Bhargava A等人 Brain Res. Protoc. 2004；13:115–125；Diallo M.,等人, Oligonucleotides. 2003；13:381–392；Paddison P.J.,等人, Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2002；99:1443–1448；Tran N.,等人, FEBS Lett. 2004；573:127–134]。
具体地讲，本发明也考虑了在细胞中引入长dsRNA (超过30个碱基转录物)用于基因沉默，在所述细胞中干扰素途径未被激活(例如胚胎细胞和卵母细胞)，参见例如Billy等人, PNAS 2001, 卷98, 页数14428-14433和Diallo等人, Oligonucleotides, 2003 年 10 月 1 日, 13(5): 381-392. doi:10.1089/154545703322617069。
本发明也考虑了引入长dsRNA用于下调基因表达，所述长dsRNA经特别设计而不会诱导干扰素和PKR途径。例如，Shinagwa和Ishii [Genes & Dev. 17 (11): 1340-1345，2003]已经开发出一种载体，称为pDECAP，以便自RNA聚合酶II (Pol II)启动子表达长的双链RNA。因为自pDECAP的转录缺乏促进ds-RNA输出到胞质的5'-帽结构和3'-聚(A)尾两者，所以来自pDECAP的长ds-RNA不诱导干扰素反应。
在哺乳动物系统中规避干扰素和PKR途径的另一方法是通过经由转染或内源表达而引入小的抑制性RNA (siRNA)。
术语“siRNA”是指诱导RNA干扰(RNAi)途径的小的抑制性RNA双链体(通常为18-30个碱基对)。典型地，siRNA经化学合成为21聚体，具有中心的19bp双链体区和在末端的对称的2-碱基3'-突出端，尽管最近已经描述了与在相同位置的21聚体相比，经化学合成的25-30个碱基长度的RNA双链体在效力上可具有多达100倍的增加。使用较长的RNAs所得到的在触发RNAi方面所观察到的效力增加据推论是由于给切酶提供底物(27聚体)而非产物(21聚体)，并且这提高siRNA双链体进入RISC的速率或效率。
已经发现3'-突出端的位置影响siRNA的效力并且在反义链上具有3'-突出端的不对称双链体通常比在有义链上具有3'-突出端的那些更有效(Rose等人，2005)。这可归因于加载到RISC的不对称的链，因为当靶向反义转录物时观察到相反的功效模式。
可以理解，不止一种siRNA试剂可用于靶向Bcl-xL或Bcl-w和/或p21。因此，本发明考虑了使用靶向Bcl-xL的至少2种siRNA，靶向Bcl-xL的至少3种siRNA，或靶向Bcl-xL的甚至至少4种siRNA，其各自靶向Bcl-xL基因中的不同序列。此外，本发明考虑了使用靶向Bcl-w的至少2种siRNA，靶向Bcl-w的至少3种siRNA，或靶向Bcl-w的甚至至少4种siRNA，其各自靶向Bcl-w基因中的不同序列。此外，本发明考虑了使用靶向p21的至少2种siRNA，靶向p21的至少3种siRNA，或靶向p21的甚至至少4种siRNA，其各自靶向p21基因中的不同序列。
双链干扰RNA(例如siRNA)的链可以连接在一起，构成发夹或茎环结构(例如shRNA)。因此，正如所述，本发明的RNA沉默剂也可以是短发夹RNA(shRNA)。
术语“shRNA”如本文所用，是指RNA试剂，其具有茎环结构，包括互补序列的第一和第二区，所述区的互补程度和取向足以使这些区之间发生碱基配对，第一和第二区通过环区连接，该环是由于环区内的核苷酸(或核苷酸类似物)之间缺乏碱基配对所致。环内的核苷酸数量介于并包括3-23、或5-15、或7-13、或4-9、或9-11的数量。环内的某些核苷酸可以参与与环内其它核苷酸的碱基对相互作用。可用于形成环的寡核苷酸序列的实例包括5'-UUCAAGAGA-3'(SEQ ID NO: 27；Brummelkamp, T. R.等人 (2002) Science 296: 550)和5'-UUUGUGUAG-3' (SEQ ID NO: 28；Castanotto, D.等人 (2002) RNA 8:1454)。本领域技术人员将会知道，所得单链寡核苷酸构成茎环或发夹结构，其包含能够与RNAi机构相互作用的双链区。
根据另一实施方案，所述RNA沉默剂可以是miRNA。miRNA是自编码不同大小的初级转录物的基因制备的小的RNA。它们在动植物中都已被鉴定。初级转录物(称为“pri-miRNA”)通过不同的核酸分解步骤被加工为较短的前体miRNA、或“pre-miRNA”。pre-miRNA以折叠形式存在，使得最终(成熟) miRNA以双链体存在，这两条链称为miRNA (该链最终将与靶标进行碱基配对)。pre-miRNA是一种切酶形式的底物，该形式从前体中切除miRNA双链体，然后类似于siRNA，该双链体可被纳入RISC复合物中。已经证明miRNA可以被转基因地表达并且通过前体形式(而非整个初级形式)的表达而有效(Parizotto等人(2004) Genes & Development 18:2237-2242和Guo等人(2005) Plant Cell 17:1376-1386)。
不同于siRNA，miRNA仅以部分互补性与转录物序列结合(Zeng等人, 2002, Molec. Cell 9:1327-1333)并阻遏翻译，而不影响稳态的RNA水平 (Lee等人, 1993, Cell 75:843-854；Wightman等人, 1993, Cell 75:855-862)。miRNA和siRNA两者均被切酶加工并与RNA-诱导的沉默复合体的组分缔合(Hutvagner等人, 2001, Science 293:834-838；Grishok等人, 2001, Cell 106: 23-34；Ketting等人, 2001, Genes Dev. 15:2654-2659；Williams等人, 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:6889-6894；Hammond等人, 2001, Science 293:1146-1150；Mourlatos等人, 2002, Genes Dev. 16:720-728)。一份近期报告(Hutvagner等人, 2002, Sciencexpress 297:2056-2060)假定相比siRNA途径，通过miRNA途径的基因调节仅由与靶转录物的互补程度决定定。推测与mRNA靶标仅具有部分同一性的siRNA类似于miRNA将在翻译阻遏中起作用，而非触发RNA降解。
适用于本发明的RNA沉默剂的合成可以如下进行。首先，在AUG起始密码子下游扫描Bcl-xL和/或Bcl-w mRNA和/或p21序列的AA二核苷酸序列。记录每个AA和3'邻近的19个核苷酸的出现作为潜在的siRNA靶位点。优选地，siRNA靶位点选自可读框，因为非翻译区(UTR)在调节蛋白结合位点中较丰富。UTR-结合蛋白和/或翻译起始复合物可能干扰siRNA内切酶复合物的结合[Tuschl ChemBiochem. 2:239-245]。但可以理解，针对非翻译区的siRNA也可为有效的，但正如对于GAPDH所证明的那样，其中针对5' UTR的siRNA介导细胞GAPDH mRNA的约90%降低并完全消除蛋白水平
第二，使用任何序列比对软件，例如可得自NCBI服务器(wwwdotncbidotnlmdotnihdotgov/BLAST/)的BLAST软件，将潜在靶位点与合适的基因组数据库(例如人、小鼠、大鼠等)相比。过滤掉与其他编码序列具有明显同源性的推定的靶位点。
选择合格的靶序列作为siRNA合成的模板。优选的序列是包含低G/C含量的那些，因为它们已被证明在介导基因沉默中比G/C含量高于55%的那些更有效。优选地沿着用于评价的靶基因长度，选择若干靶位点。为了更好地评价所选siRNA，优选同时使用阴性对照。阴性对照siRNA优选地包括与siRNA相同的核苷酸组成，但缺乏与基因组的明显同源性。因此，优选使用siRNA的杂乱核苷酸序列，只要它不表现出与任何其他基因的任何明显同源性。
例如，能够下调Bcl-xL的合适的siRNA可以是SEQ ID NO: 29、30或31的siRNA。能够下调Bcl-w的合适的siRNA可以是SEQ ID NO: 32、33或34的siRNA。能够下调p21的合适的siRNA可以是SEQ ID NO: 35、36或37的siRNA。
可以理解，本发明的RNA沉默剂不必限制在仅含RNA的那些分子，而是进一步包括经化学修饰的核苷酸和非核苷酸。
在某些实施方案中，本文提供的RNA沉默剂可与细胞渗透肽在功能上相关。本文所用的“细胞渗透肽”是包含短的(约12-30个残基)氨基酸序列或功能性基序的肽，所述氨基酸序列或功能性基序赋予膜渗透性复合物跨越细胞质膜和/或核膜的运输相关的能量独立的(即非-内吞的)转位性质。用于本发明的膜渗透性复合物的细胞渗透肽优选地包含至少一个无功能的半胱氨酸残基，其是游离或经衍生，以与双链核糖核酸形成二硫键，所述双链核糖核酸已针对这样的键进行修饰。赋予这类性质的代表性氨基酸基序在美国专利号6,348,185中已列举，其内容通过引用明确结合到本文中。本发明的细胞渗透肽优选地包括但不限于penetratin、transportan、pIsl、TAT (48-60)、pVEC、MTS和MAP。
能够下调Bcl-xL或Bcl-w或p21的另一试剂是能够特异性切割mRNA转录物或其DNA序列的DNA核酶分子。DNA核酶是单链多核苷酸，其能够切割单链和双链靶序列两者(Breaker, R.R.和Joyce, G. Chemistry and Biology 1995；2:655；Santoro, S.W. & Joyce, G.F. Proc. Natl, Acad. Sci. USA 1997；943:4262)。已经提出了DNA核酶的通用模型(“10-23”模型)。“10-23”DNA核酶具有15个脱氧核糖核苷酸的催化域，侧接两个底物识别域，各自具有7-9个脱氧核糖核苷酸。该类DNA核酶可在嘌呤:嘧啶连接处有效切割其底物RNA (Santoro, S.W. & Joyce, G.F. Proc. Natl, Acad. Sci. USA 199；对于DNA核酶的综述参见Khachigian, LM [Curr Opin Mol Ther 4:119-21 (2002)]。
识别单链和双链靶切割位点的合成的、经工程改造的DNA核酶的构建和扩增的实例已经公开于美国专利号6,326,174 (授予Joyce等人)。近期已经观察到针对人尿激酶受体的类似设计的DNA核酶抑制尿激酶受体表达，并且成功地抑制了结肠癌细胞转移(Itoh等人，20002，Abstract 409，Ann Meeting Am Soc Gen Ther wwwdotasgtdotorg。在另一应用中，与bcr-abl癌基因互补的DNA核酶已经成功地抑制了在白血病细胞中的癌基因表达，和在CML和ALL的病例中在自体骨髓移植中降低了复发率。
通过使用与编码Bcl-xL或Bcl-w的mRNA转录物特异性地杂交的反义多核苷酸，也可实现Bcl-xL或Bcl-w或p21的下调。
当考虑对反义方法而言重要的两方面时，必须进行可用于有效下调Bcl-xL或Bcl-w或p21的反义分子的设计。第一方面是将寡核苷酸递送到合适细胞的细胞质中，而第二方面是设计寡核苷酸，所述寡核苷酸以抑制其翻译的方式特异性地结合细胞内的指定mRNA。
现有技术教导了许多递送策略，其可用于将寡核苷酸有效地递送到多种多样的细胞类型中[参见例如，Luft J Mol Med 76: 75-6 (1998)；Kronenwett等人 Blood 91: 852-62 (1998)；Rajur等人 Bioconjug Chem 8: 935-40 (1997)；Lavigne等人 Biochem Biophys Res Commun 237: 566-71 (1997)和Aoki等人 (1997) Biochem Biophys Res Commun 231: 540-5 (1997)]。
另外，用于根据解释靶mRNA和寡核苷酸两者中的结构改变的能量学的热力学循环，鉴定对其靶mRNA具有最高的预测结合亲和力的那些序列的算法也是可用的[参见例如，Walton等人Biotechnol Bioeng 65: 1-9 (1999)]。
这样的算法已经成功地用于在细胞中实施反义方法。例如，由Walton等人开发的算法使科学家们能够成功地设计反义寡核苷酸，用于兔β-珠蛋白(RBG)和小鼠肿瘤坏死因子-α(TNFα)转录物。同一研究小组新近已经报告，如通过动力PCR技术评价的在细胞培养中针对3个模型靶mRNA (人乳酸脱氢酶A和B和大鼠gp130)的合理选择的寡核苷酸的反义活性，证明了在几乎所有情况中都是有效的，包括在两种细胞类型中用磷酸二酯和硫代磷酸寡核苷酸化学物针对3个不同靶的测试。
另外，也发表了用于使用体外系统的设计和预测特定寡核苷酸功效的若干方法(Matveeva等人, Nature Biotechnology 16: 1374 - 1375 (1998)]。
能够下调Bcl-xL或Bcl-w或p21的另一试剂是能够特异性地切割编码Bcl-xL或Bcl-w或p21的mRNA转录物的核酶分子。核酶被越来越多地用于通过切割编码目标蛋白的mRNA进行的基因表达的序列特异性抑制[Welch等人，Curr Opin Biotechnol. 9:486-96 (1998)]。设计核酶以切割任何特异性靶RNA的可能性使其成为基础研究和治疗应用两者的有价值的工具。在治疗领域，核酶已被用于在感染性疾病中靶向病毒RNA，在癌症中靶向显性癌基因，在遗传障碍中靶向特定体细胞突变[Welch等人，Clin Diagn Virol. 10:163-71 (1998)]。最显著的是，用于HIV患者的若干核酶基因治疗方案已经处于1期试验。新近，核酶已被用于转基因动物研究、基因靶证实和途径的阐明。若干核酶处于不同临床试验期。ANGIOZYME是进行人体临床试验研究的首个经化学合成的核酶。ANGIOZYME特异性地抑制VEGF-r (血管内皮生长因子受体)的形成，VEGF-r是血管生成途径中的一种关键组分。Ribozyme Pharmaceuticals, Inc.以及其它公司已经证明抗血管生成治疗药在动物模型中的重要性。已经发现HEPTAZYME(经设计用于选择性地破坏丙肝病毒(HCV) RNA的一种核酶)在细胞培养测定中有效减少丙肝病毒RNA (Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated - WEB主页)。
调节Bcl-xL或Bcl-w或p21基因在细胞中的表达的一种额外方法是经由三链体形成寡核苷酸(TFO)。近期研究已经证明可以设计TFO，其可以序列特异性方式识别双链螺旋DNA中的多聚嘌呤/多聚嘧啶区并与之结合。这些识别法则概述于Maher III, L. J.,等人, Science,1989；245:725-730；Moser, H. E.,等人, Science,1987；238:645-630；Beal, P. A.,等人, Science,1992；251:1360-1363；Cooney, M.,等人, Science,1988；241:456-459；和Hogan, M. E.,等人, EP公布号375408。对寡核苷酸的修饰例如引入嵌入剂和主链取代，以及结合条件(pH和阳离子浓度)的优化，有助于克服TFO活性的固有障碍，例如电荷排斥和不稳定性，并且近来已经证明可将合成的寡核苷酸靶向特定序列(有关的近期综述参见Seidman和Glazer, J Clin Invest 2003；112:487-94)。
一般而言，三链体形成寡核苷酸具有下列序列对应性：
然而，已经证实A-AT和G-GC三链体具有最大三重螺旋稳定性(Reither和Jeltsch, BMC Biochem, 2002年9月12日, Epub)。相同作者已经证明根据A-AT和G-GC法则而设计的TFO不形成非特异性三链体，表明三链体形成确实是序列特异性的。
因此对于Bcl-xL或Bcl-w或p21调节区的任何给定序列，都可设计三链体形成序列。三链体形成寡核苷酸的长度优选是至少15、更优选25、再更优选30或更多个核苷酸，至多50或100 bp。
使用TFO转染细胞(例如经由阳离子脂质体)并与靶DNA形成三重螺旋结构，诱导了空间和功能变化，阻断转录起始和延长，使得在内源性DNA中引入所需序列变化并导致基因表达的特异性下调。在使用TFO处理的细胞中基因表达的这种抑制的实例包括哺乳动物细胞中的附加体supFG1和内源性HPRT基因的敲除(Vasquez等人,Nucl Acids Res. 1999；27:1176-81,和Puri,等人, J Biol Chem, 2001；276:28991-98)，和在前列腺癌病因中重要的Ets2转录因子表达的序列特异性和靶特异性下调(Carbone,等人, Nucl Acid Res. 2003；31:833-43)，以及促炎ICAM-I基因表达的序列特异性和靶特异性下调(Besch等人, J Biol Chem, 2002；277:32473-79)。另外，Vuyisich和Beal最近表明序列特异性TFO可结合dsRNA，抑制dsRNA依赖性酶如RNA依赖性激酶的活性(Vuyisich和Beal, Nuc. Acids Res 2000；28:2369-74)。
另外，根据上述原理设计的TFO可诱导定向诱变，所述定向诱变能够实现DNA修复，因此提供内源性基因表达的下调和上调两者(Seidman和Glazer, J Clin Invest 2003；112:487-94)。有效TFO的设计、合成以及给予的详细说明可见于美国专利申请号2003 017068和2003 0096980 (Froehler等人)，和2002 0128218和2002 0123476 (Emanuele等人)和美国专利号5,721,138 (Lawn)。
用于下调Bcl-xL和/或Bcl-w和/或p21的量或活性的多核苷酸试剂，通常作为表达构建体的组成部分来给予。在这种情况下，将多核苷酸试剂连接在核酸构建体中，处于顺式作用调节元件(例如，启动子)的控制之下，所述元件能够以组成型或诱导型方式指导能够下调Bcl-xL和/或Bcl-w和/或p21的试剂的表达。
可使用合适的基因递送载体/方法(转染、转导等)来递送核酸试剂。任选地，使用合适的表达系统。合适的构建体的实例包括但不限于pcDNA3、pcDNA3.1 (+/-)、pGL3、PzeoSV2 (+/-)、pDisplay、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto，其各自可购自Invitrogen Co. (wwwdotinvitrogendotcom)。
表达构建体也可以是病毒。病毒构建体的实例包括但不限于腺病毒载体、逆转录病毒载体、痘苗病毒载体、腺伴随病毒载体、多瘤病毒载体、甲病毒载体、弹状病毒载体、慢病毒载体和疱疹病毒载体。
病毒构建体例如逆转录病毒构建体，包括至少一个转录启动子/增强子或基因座限定元件、或通过其它方式控制基因表达的其它元件，所述其它方式例如可变剪接、核RNA输出、或信使的转录后修饰。这样的载体构建体也包括包装信号、长末端重复序列(LTR)或其部分、和适于所用病毒的正负链引物结合位点，除非它在病毒构建体中已经存在。另外，这样的构建体典型地包括信号序列，用于将肽从它所在的宿主细胞中分泌出来。优选地，用于该目的的信号序列是哺乳动物信号序列或本发明的肽变体的信号序列。任选地，构建体也可包括指导聚腺苷酸化的信号、以及一个或多个限制位点和翻译终止序列。举例来说，这样的构建体通常包括5' LTR、tRNA结合位点、包装信号、第二链DNA合成起点、和3' LTR或其部分。
优选地，用于感染的病毒剂量是至少103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015或更高pfu或病毒颗粒。
可通过在基因区段末端加入两个相对的启动子而合成双链RNA，其中一个启动子位于紧接着所述基因的5'，而相对的启动子位于紧接着所述基因区段的3'。然后可使用合适的聚合酶转录该dsRNA。
小的多核苷酸试剂(例如，siRNA)作为潜在治疗药的应用需要可增强其药理学性质的递送方法。这些递送方法旨在：(1)通过降低肾清除率而增加小的多核苷酸试剂在循环系统中的保留时间；(2)保护小的多核苷酸试剂免于血清核酸酶的分解；(3)确保有效的生物分布；(4)促进小的多核苷酸试剂向靶细胞的靶向和摄取；和(5)促进运送到细胞质和摄取入RISC。已经开发出促进小的多核苷酸试剂在体内递送的多种方法，包括阳离子纳米粒、脂质和脂质体、抗体(Ab)-融合分子[Ab-鱼精蛋白和Ab-多聚精氨酸、以及胆固醇和适体-缀合的试剂。凭它们自身，小的多核苷酸试剂例如siRNA低于肾滤过的大小阈值并从循环系统中被快速清除掉。小的多核苷酸试剂和不同递送试剂的复合物在循环中停留更长时间，或因为它们超过肾清除的截止大小或因为递送试剂促进了与血清蛋白(例如，血清白蛋白)的缔合。另外，将小的多核苷酸试剂包入纳米粒(使用基于脂质-或阳离子聚合物的系统)有助于遮蔽它们，以避开血清核酸酶。Ab-融合分子已用于将裸露的未经修饰的小的多核苷酸试剂在静脉内注射后有效地递送到特定细胞种类。尽管认为siRNA暴露在这些重组Ab-融合分子表面，但是它们被有效地递送到靶细胞，表明与这些分子的复合作用提供了免遭核水解降解的某种保护作用。将化学修饰引入小的多核苷酸试剂的磷酸主链、糖部分和核苷碱基，增加了其对血清核酸酶降解的抗性。然而，因为某些这些修饰对沉默功效不利，在引入化学修饰和小的多核苷酸试剂的抑制性活性之间必须保持平衡。降低达到有效沉默所需的小的多核苷酸试剂的剂量和在旁观者细胞中最小化脱靶沉默的一个吸引人的策略是，使用将小的多核苷酸试剂靶向特定细胞类型和组织的递送试剂。这已使用Ab或配体或通过将适体或配体直接缀合到小的多核苷酸试剂达到，所述Ab或配体与带高正电荷的肽或蛋白融合，小的多核苷酸试剂可通过静电相互作用与所述肽或蛋白缔合。这些试剂(Ab、配体和适体)可以高亲和力与细胞表面分子结合并将小的多核苷酸试剂特异性地递送到表达这些标记的细胞。通过将这些靶向试剂与纳米粒(例如，含有包被有特定Ab的脂质纳米粒的免疫脂质体)组合，可增加所递送的小的多核苷酸试剂的量，并因此增加沉默功效。
因此，本发明考虑了使用基于脂质的系统，用于递送这些试剂。对于脂质介导的基因转移有用的脂质是例如DOTMA、DOPE、和DC-Chol [Tonkinson等人, Cancer Investigation, 14(1): 54-65 (1996)]。最近，已经证实脱乙酰壳多糖可用于将核酸递送到肠细胞(Chen J. (2004) World J Gastroenterol 10(1):112-116)。可根据本发明的这一方面使用的其它基于非脂质的载体包括但不限于多聚赖氨酸和树状聚合物(dendrimer)、碳纳米管、纳米凝胶、基于聚合物的颗粒。
因为本文所述的试剂显示能杀死衰老细胞，所以本发明人提出，这些试剂可用于治疗患有与细胞衰老相关的疾病的受试者。
本文使用的术语“受试者”是指哺乳动物受试者，优选人类。
涉及炎性反应的许多疾病和病症可以用本文上述方法来治疗。这类疾病和病症的实例概述如下。
炎性疾病 - 包括但不限于慢性炎性疾病和急性炎性疾病。
超敏反应相关的炎性疾病
超敏反应的实例包括但不限于I型超敏反应、II型超敏反应、III型超敏反应、IV型超敏反应、速发型超敏反应、抗体介导的超敏反应、免疫复合物介导的超敏反应、T淋巴细胞介导的超敏反应和DTH。
I型或速发型超敏反应，例如哮喘。
II型超敏反应包括但不限于类风湿疾病、类风湿自身免疫性疾病、类风湿性关节炎(Krenn V.等人, Histol Histopathol 2000年7月；15 (3):791)、脊椎炎、强直性脊柱炎(Jan Voswinkel等人, Arthritis Res 2001；3 (3): 189)、系统性疾病、系统性自身免疫性疾病、系统性红斑狼疮(Erikson J.等人, Immunol Res 1998；17 (1-2):49)、硬化、系统性硬化(Renaudineau Y.等人, Clin Diagn Lab Immunol. 1999年3月；6 (2):156)；Chan OT.等人, Immunol Rev 1999年6月；169:107)、腺体疾病、腺体自身免疫性疾病、胰腺自身免疫性疾病、糖尿病、I型糖尿病(Zimmet P. Diabetes Res Clin Pract 1996年10月；34 Suppl:S125)、甲状腺疾病、自身免疫性甲状腺疾病、格雷夫斯病(Orgiazzi J. Endocrinol Metab Clin North Am 2000年6月；29 (2):339)、甲状腺炎、自发性自身免疫性甲状腺炎(Braley-Mullen H.和Yu S, J Immunol 2000年12月15日；165 (12):7262)、桥本甲状腺炎(Toyoda N.等人, Nippon Rinsho 1999年8月；57 (8):1810)、粘液水肿、特发性粘液水肿(Mitsuma T. Nippon Rinsho. 1999年8月；57 (8):1759)；自身免疫性生殖性疾病、卵巢疾病、卵巢自身免疫(Garza KM.等人, J Reprod Immunol 1998年2月；37 (2):87)、自身免疫性抗精子不育(Diekman AB.等人, Am J Reprod Immunol. 2000年3月；43 (3):134)、重复性流产(Tincani A.等人, Lupus 1998；7 Suppl 2:S107-9)、神经变性疾病、神经病、神经性自身免疫性疾病、多发性硬化 (Cross AH.等人,J Neuroimmunol 2001年1月1日；112 (1-2):1)、阿尔茨海默病(Oron L.等人, J Neural Transm Suppl. 1997；49:77)、重症肌无力(Infante AJ.和Kraig E, Int Rev Immunol 1999；18 (1-2):83)、运动神经病(Kornberg AJ. J Clin Neurosci. 2000年5月；7 (3):191)、格-巴综合征(Guillain-Barre syndrome)、神经病和自身免疫性神经病(Kusunoki S. Am J Med Sci. 2000年4月；319 (4):234)、肌无力疾病、兰-伊肌无力综合征(Lambert-Eaton myasthenic syndrome)(Takamori M. Am J Med Sci. 2000年4月；319 (4):204)、癌旁神经病、小脑萎缩、癌旁小脑萎缩、非癌旁僵人综合征(non-paraneoplastic stiff man syndrome)、小脑萎缩、渐进性小脑萎缩、脑炎、拉斯马森脑炎(Rasmussen’s encephalitis)、肌萎缩性侧索硬化、Sydeham舞蹈病、抽动秽语综合征、多内分泌腺病、自身免疫性多内分泌腺病(Antoine JC.和Honnorat J. Rev Neurol (Paris) 2000年1月；156 (1):23)；神经病、免疫异常神经病(Nobile-Orazio E.等人, Electroencephalogr Clin Neurophysiol Suppl 1999；50:419)；神经性肌强直、获得性神经性肌强直、先天性多关节挛缩症(arthrogryposis multiplex congenita) (Vincent A.等人, Ann N Y Acad Sci. 1998年5月13日；841:482)、心血管疾病、心血管性自身免疫性疾病、动脉粥样硬化(Matsuura E.等人, Lupus. 1998；7 Suppl 2:S135)、心肌梗塞(Vaarala O. Lupus. 1998；7 Suppl 2:S132)、血栓形成(Tincani A.等人, Lupus 1998；7 Suppl 2:S107-9)、肉芽肿病、韦格纳肉芽肿病(Wegener's granulomatosis)、动脉炎、无脉病和川崎综合征(Praprotnik S.等人, Wien Klin Wochenschr 2000年8月 25日；112 (15-16):660)；抗因子VIII 自身免疫性疾病(Lacroix-Desmazes S.等人, Semin Thromb Hemost.2000；26 (2):157)；脉管炎、坏死性小血管脉管炎、显微镜下多动脉炎(microscopic polyangiitis)、Churg-Strauss综合征、肾小球肾炎、寡免疫局灶坏死性肾小球肾炎(pauci-immune focal necrotizing glomerulonephritis)、新月体肾小球肾炎(Noel LH. Ann Med Interne (Paris). 2000年5月；151 (3):178)；抗磷脂综合征(Flamholz R.等人, J Clin Apheresis 1999；14 (4):171)；心力衰竭、心力衰竭中的激动剂-样β-肾上腺受体抗体(Wallukat G.等人, Am J Cardiol. 1999年6月 17日；83 (12A):75H)、血小板减少性紫癜(Moccia F. Ann Ital Med Int. 1999年4-6月；14 (2):114)；溶血性贫血、自身免疫性溶血性贫血(Efremov DG.等人, Leuk Lymphoma 1998年1月；28 (3-4):285)、胃肠病、胃肠道自身免疫性疾病、肠病、慢性炎性肠病(Garcia Herola A.等人, Gastroenterol Hepatol. 2000年1月；23 (1):16)、乳糜泻(Landau YE.和Shoenfeld Y. Harefuah 2000年1月16日；138 (2):122)、肌肉组织的自身免疫性疾病、肌炎、自身免疫性肌炎、斯耶格伦综合征(Feist E.等人, Int Arch Allergy Immunol 2000年9月；123 (1):92)；平滑肌自身免疫性疾病(Zauli D.等人,Biomed Pharmacother 1999年6月；53 (5-6):234)、肝病、肝脏自身免疫性疾病、自身免疫性肝炎(Manns MP. J Hepatol 2000年8月；33 (2):326)和原发性胆汁性肝硬变(Strassburg CP.等人, Eur J Gastroenterol Hepatol. 1999年6月；11 (6):595)。
IV型或T细胞介导的超敏反应，包括但不限于类风湿疾病、类风湿性关节炎(Tisch R, McDevitt HO. Proc Natl Acad Sci U S A 1994年1月18日；91 (2):437)、系统性疾病、系统性自身免疫性疾病、系统性红斑狼疮(Datta SK., Lupus 1998；7 (9):591)、腺体疾病、腺体自身免疫性疾病、胰腺疾病、胰腺自身免疫性疾病、I型糖尿病(Castano L.和Eisenbarth GS. Ann. Rev. Immunol. 8:647)；甲状腺疾病、自身免疫性甲状腺疾病、格雷夫斯病(Sakata S.等人, Mol Cell Endocrinol 1993年3月；92 (1):77)；卵巢疾病(Garza KM.等人, J Reprod Immunol 1998年2月；37 (2):87)、前列腺炎、自身免疫性前列腺炎(Alexander RB.等人, Urology 1997年12月；50 (6):893)、多腺性综合征、自身免疫性多腺性综合征、I型自身免疫性多腺性综合征(Hara T.等人, Blood. 1991年3月1日；77 (5):1127)、神经病、自身免疫性神经病、多发性硬化、神经炎、视神经炎(Soderstrom M.等人, J Neurol Neurosurg Psychiatry 1994年5月；57 (5):544)、重症肌无力(Oshima M.等人, Eur J Immunol 1990年12月；20 (12):2563)、僵人综合征(Hiemstra HS.等人, Proc Natl Acad Sci U S A 2001年3月27日；98 (7):3988)、心血管疾病、南美锥虫病(Chagas’ disease)中的心脏自身免疫(Cunha-Neto E.等人, J Clin Invest 1996年10月 15日；98 (8):1709)、自身免疫性血小板减少性紫癜(Semple JW.等人, Blood 1996年5月15日；87 (10):4245)、抗辅助T淋巴细胞自身免疫(Caporossi AP.等人,Viral Immunol 1998；11 (1):9)、溶血性贫血(Sallah S.等人, Ann Hematol 1997年3月；74 (3):139)、肝病、肝脏自身免疫性疾病、肝炎、慢性活动性肝炎(Franco A.等人, Clin Immunol Immunopathol 1990年3月；54 (3):382)、胆汁性肝硬变、原发性胆汁性肝硬变(Jones DE. Clin Sci (Colch) 1996年11月；91 (5):551)、肾病、肾脏自身免疫性疾病、肾炎、间质性肾炎(Kelly CJ. J Am Soc Nephrol 1990年8月；1 (2):140)、结缔组织病、耳病、自身免疫性结缔组织病、自身免疫性耳病(Yoo TJ.等人, Cell Immunol 1994年8月；157 (1):249)、内耳疾病(Gloddek B.等人, Ann N Y Acad Sci 1997年12月29日；830:266)、皮肤病(skin disease )、皮肤病(cutaneous disease)、皮肤病(dermal disease)、大庖性皮肤病、寻常性天疱疮、大庖性类天疱疮和落叶性天疱疮。
迟发型超敏反应的实例包括但不限于接触性皮炎和药疹。
介导超敏反应的T淋巴细胞的类型的实例包括但不限于辅助T淋巴细胞和细胞毒性T淋巴细胞。
辅助T淋巴细胞-介导的超敏反应的实例包括但不限于Th1淋巴细胞介导的超敏反应和Th2淋巴细胞介导的超敏反应。
自身免疫性疾病
包括但不限于心血管疾病、类风湿疾病、腺体疾病、胃肠病、皮肤病、肝病、神经病、肌肉疾病、肾病、生殖相关疾病、结缔组织病和系统性疾病。
自身免疫性心血管疾病的实例包括但不限于动脉粥样硬化(Matsuura E.等人, Lupus. 1998；7 Suppl 2:S135)、心肌梗塞(Vaarala O. Lupus. 1998；7 Suppl 2:S132)、血栓形成(Tincani A.等人, Lupus 1998；7 Suppl 2:S107-9)、韦格纳肉芽肿病(Wegener's granulomatosis)、无脉病、川崎综合征(Praprotnik S.等人, Wien Klin Wochenschr 2000年8月 25日；112 (15-16):660)、抗因子VIII 自身免疫性疾病(Lacroix-Desmazes S.等人, Semin Thromb Hemost.2000；26 (2):157)、坏死性小血管脉管炎、显微镜下多动脉炎、Churg-Strauss综合征、寡免疫局灶坏死性和新月体肾小球肾炎(Noel LH. Ann Med Interne (Paris). 2000年5月；151 (3):178)、抗磷脂综合征(Flamholz R.等人, J Clin Apheresis 1999；14 (4):171)、抗体-诱导的心力衰竭(Wallukat G.等人, Am J Cardiol. 1999年6月 17日；83 (12A):75H)、血小板减少性紫癜(Moccia F. Ann Ital Med Int. 1999年4-6月；14 (2):114；Semple JW.等人, Blood 1996年5月15日；87 (10):4245)、自身免疫性溶血性贫血(Efremov DG.等人, Leuk Lymphoma 1998年1月；28 (3-4):285；Sallah S.等人, Ann Hematol 1997年3月；74 (3):139)、南美锥虫病中的心脏自身免疫(Cunha-Neto E.等人, J Clin Invest 1996年10月 15日；98 (8):1709)和抗辅助T 淋巴细胞自身免疫(Caporossi AP.等人,Viral Immunol 1998；11 (1):9)。
自身免疫性类风湿疾病的实例包括但不限于类风湿性关节炎(Krenn V.等人, Histol Histopathol 2000年7月；15 (3):791；Tisch R, McDevitt HO. Proc Natl Acad Sci units S A 1994年1月18日；91 (2):437)和强直性脊柱炎(Jan Voswinkel等人, Arthritis Res 2001；3 (3): 189)。
自身免疫性腺体疾病的实例包括但不限于胰腺疾病、I型糖尿病、甲状腺疾病、格雷夫斯病、甲状腺炎、自发性自身免疫性甲状腺炎、桥本甲状腺炎、特发性粘液水肿、卵巢自身免疫、自身免疫性抗精子不育、自身免疫性前列腺炎和I型自身免疫性多腺性综合征。疾病包括但不限于胰腺的自身免疫性疾病、1型糖尿病(Castano L.和Eisenbarth GS. Ann. Rev. Immunol. 8:647；Zimmet P. Diabetes Res Clin Pract 1996年10月；34 Suppl:S125)、自身免疫性甲状腺疾病、格雷夫斯病(Orgiazzi J. Endocrinol Metab Clin North Am 2000年6月；29 (2):339；Sakata S.等人, Mol Cell Endocrinol 1993年3月；92 (1):77)、自发性自身免疫性甲状腺炎(Braley-Mullen H.和Yu S, J Immunol 2000年12月15日；165 (12):7262)、桥本甲状腺炎(Toyoda N.等人, Nippon Rinsho 1999年8月；57 (8):1810)、特发性粘液水肿(Mitsuma T. Nippon Rinsho. 1999年8月；57 (8):1759)、卵巢自身免疫(Garza KM.等人, J Reprod Immunol 1998年2月；37 (2):87)、自身免疫性抗精子不育(Diekman AB.等人, Am J Reprod Immunol. 2000年3月；43 (3):134)、自身免疫性前列腺炎(Alexander RB.等人, Urology 1997年12月；50 (6):893)和I型自身免疫性多腺性综合征(Hara T.等人, Blood. 1991年3月1日；77 (5):1127)。
自身免疫性胃肠病的实例包括但不限于慢性炎性肠病(Garcia Herola A.等人,Gastroenterol Hepatol. 2000年1月；23 (1):16)、乳糜泻(Landau YE.和Shoenfeld Y. Harefuah 2000年1月16日；138 (2):122)、结肠炎、回肠炎和克罗恩病。
自身免疫性皮肤病的实例包括但不限于自身免疫性大庖性皮肤病，例如但不限于，寻常性天疱疮、大庖性类天疱疮和落叶性天疱疮。
自身免疫性肝病的实例包括但不限于肝炎、自身免疫性慢性活动性肝炎(Franco A.等人, Clin Immunol Immunopathol 1990年3月；54 (3):382)、原发性胆汁性肝硬变(Jones DE. Clin Sci (Colch) 1996年11月；91 (5):551；Strassburg CP.等人, Eur J Gastroenterol Hepatol. 1999年6月；11 (6):595)和自身免疫性肝炎(Manns MP. J Hepatol 2000年8月；33 (2):326)。
自身免疫性神经病的实例包括但不限于多发性硬化(Cross AH.等人,J Neuroimmunol 2001年1月1日；112 (1-2):1)、阿尔茨海默病(Oron L.等人, J Neural Transm Suppl. 1997；49:77)、重症肌无力(Infante AJ.和Kraig E, Int Rev Immunol 1999；18 (1-2):83；Oshima M.等人, Eur J Immunol 1990年12月；20 (12):2563)、神经病、运动神经病(Kornberg AJ. J Clin Neurosci. 2000年5月；7 (3):191)；格-巴综合征和自身免疫性神经病(Kusunoki S. Am J Med Sci. 2000年4月；319 (4):234)、肌无力、兰-伊肌无力综合征(Takamori M. Am J Med Sci. 2000年4月；319 (4):204)；癌旁神经病、小脑萎缩、癌旁小脑萎缩和僵人综合征(Hiemstra HS.等人, Proc Natl Acad Sci units S A 2001年3月27日；98 (7):3988)；非癌旁僵人综合征(non-paraneoplastic stiff man syndrome)、渐进性小脑萎缩、脑炎、拉斯马森脑炎、肌萎缩性侧索硬化、Sydeham舞蹈病、抽动秽语综合征和自身免疫性多内分泌腺病(Antoine JC.和Honnorat J. Rev Neurol (Paris) 2000年1月；156 (1):23)；免疫异常神经病(Nobile-Orazio E.等人, Electroencephalogr Clin Neurophysiol Suppl 1999；50:419)；获得性神经性肌强直、先天性多关节挛缩症(Vincent A.等人, Ann N Y Acad Sci. 1998年5月13日；841:482)、神经炎、视神经炎(Soderstrom M.等人, J Neurol Neurosurg Psychiatry 1994年5月；57 (5):544)和神经变性疾病。
自身免疫性肌肉疾病的实例包括但不限于肌炎、自身免疫性肌炎和原发性斯耶格伦综合征(Feist E.等人, Int Arch Allergy Immunol 2000年9月；123 (1):92)和平滑肌自身免疫性疾病(Zauli D.等人,Biomed Pharmacother 1999年6月；53 (5-6):234)。
自身免疫性肾病的实例包括但不限于肾炎和自身免疫性间质性肾炎(Kelly CJ. J Am Soc Nephrol 1990年8月；1 (2):140)。
生殖相关的自身免疫性疾病的实例包括但不限于重复性流产(Tincani A.等人, Lupus 1998；7 Suppl 2:S107-9)。
自身免疫性结缔组织病的实例包括但不限于耳病、自身免疫性耳病(Yoo TJ.等人, Cell Immunol 1994年8月；157 (1):249)和内耳的自身免疫性疾病(Gloddek B.等人, Ann N Y Acad Sci 1997年12月29日；830:266)。
自身免疫系统性疾病的实例包括但不限于系统性红斑狼疮(Erikson J.等人, Immunol Res 1998；17 (1-2):49)和系统性硬化(Renaudineau Y.等人, Clin Diagn Lab Immunol. 1999年3月；6 (2):156)；Chan OT.等人, Immunol Rev 1999年6月；169:107)。
感染性疾病
感染性疾病的实例包括但不限于慢性感染性疾病、亚急性感染性疾病、急性感染性疾病、病毒性疾病、细菌性疾病、原生动物性疾病、寄生虫性疾病、真菌性疾病、支原体性疾病和朊病毒性疾病。
移植物排斥疾病
移植物的移植相关的疾病的实例包括但不限于移植物排斥、慢性移植物排斥、亚急性移植物排斥、超急性移植物排斥、急性移植物排斥和移植物抗宿主病。
变应性疾病
变应性疾病的实例包括但不限于哮喘、荨麻疹(hives)、荨麻疹(urticaria)、花粉过敏、尘螨过敏、毒液过敏、化妆品过敏、乳胶过敏、化学品过敏、药物过敏、昆虫叮咬过敏、动物皮屑过敏、带刺植物过敏、毒叶藤过敏和食物过敏。
根据具体的实施方案，所述试剂(及其组合)用于治疗癌前病变。
本文使用的短语”癌前病变”是指大量细胞和/或组织转化为恶性肿瘤的可能性增加。癌前病变的实例包括但不限于腺瘤性息肉、巴雷特食管、IPMN (导管内乳头状粘液肿瘤)、乳房中的DCIS(导管内原位癌)、粘膜白斑和粘膜红斑。因此，用本发明的该方面的试剂治疗的癌前病变可转化为恶性实体或非实体(例如，血液恶性肿瘤)癌症(或肿瘤)。根据具体的实施方案，用本发明的试剂治疗的癌前病变是结肠的腺瘤性息肉、直肠的腺瘤性息肉、小肠的腺瘤性息肉和巴雷特食管。
纤维化疾病的实例包括上皮屏障组织的疾病、皮肤、肺或肠的疾病。
可用本文所述的试剂治疗的所考虑的纤维化疾病包括但不限于嗜酸性粒细胞性食管炎、嗜酸细胞增多综合征(HES)、Loeffler氏心肌内膜炎、心肌内膜纤维化、特发性肺纤维化和硬皮病。
根据具体的实施方案，所述试剂用于治疗肝纤维化、伤口愈合、皮肤纤维化、肺病、肾纤维化、前列腺炎、动脉粥样硬化、关节炎、骨质疏松症或胰腺炎。
本发明所考虑的示例性的肺病是慢性阻塞性肺病(COPD)。
根据再一实施方案，所述疾病是软骨变性相关的–例如，关节炎。
根据再一实施方案，所述疾病是骨变性相关的–例如，骨质疏松症。
根据再一实施方案，所述疾病不是癌症。
可以提供本发明的试剂(及其组合)本身或可以将其配制在预期用于特定用途的组合物中。可以理解，可以在单一制剂中提供本文所述的试剂的组合或可以在单独组合物中提供本文所述的试剂的组合。
所考虑的组合物包括包含下调Bcl-xL的试剂和下调Bcl-w的试剂(例如，siRNA试剂)的那些。
另一种所考虑的组合物是这样的：其包括下调Bcl-xL的试剂和下调Bcl-w的试剂(例如，siRNA试剂)和下调p21的试剂(例如，siRNA试剂)。
另一种所考虑的组合物是这样的：其包括下调Bcl-xL和Bcl-w的试剂(例如，化学试剂)和下调p21的试剂(例如，siRNA试剂)。
另一种所考虑的组合物是这样的：其包括下调Bcl-xL和Bcl-w的是(例如，化学试剂)和下调p21的试剂(例如，化学试剂)。
此外，本发明人考虑了提供单独包装在单一制品中的试剂组合。
因此，一种所考虑的制品包括下调Bcl-xL的试剂和下调Bcl-w的试剂(例如，siRNA试剂)。
另一种所考虑的制品是这样的：其包括下调Bcl-xL的试剂和下调Bcl-w的试剂(例如，siRNA试剂)和下调p21的试剂(例如，siRNA试剂)。
另一种所考虑的制品是这样的：其包括下调Bcl-xL和Bcl-w的试剂(例如，化学试剂)和下调p21的试剂(例如，siRNA试剂)。
另一种所考虑的制品是这样的：其包括下调Bcl-xL和Bcl-w的试剂(例如，化学试剂)和下调p21的试剂(例如，化学试剂)。
因为本发明的试剂选择性地杀死衰老细胞，本发明人考虑了其另一用途是在化妆用组合物中作为抗老化剂，用于修护皮肤。因此，本发明的试剂可配制用于化妆品。
这类组合物典型地包含药学上可接受的赋形剂，尤其是皮肤学可接受的适于外部局部使用的。
本发明的化妆用组合物可进一步包含至少一种本领域技术人员已知的药用佐剂，其选自增稠剂、防腐剂、香料、着色剂、化学或矿物滤器(filter)、保湿剂、温泉水等。
所述组合物可包含选自以下的至少一种试剂：皮脂调节剂、抗菌剂、抗真菌剂、角质软化剂、角质调节剂、收敛剂、抗炎/抗刺激剂、抗氧化剂/自由基清除剂、愈合剂、抗老化剂和/或保湿剂。
术语“皮脂调节剂”是指例如5-α-还原酶抑制剂，尤其是活性剂5-α-AvocutaRTM (由Laboratories Expanscience销售)。锌及其葡糖酸盐、水杨酸盐和焦谷氨酸也具有皮脂抑制活性。也可提到螺内酯，一种抗雄激素和醛甾酮拮抗剂，其在施用12周后显著地减少皮脂分泌率。其它提取的分子例如来自南瓜西葫芦(pumpkin Cucurbita pepo)的种子和南瓜子油(squash seed oil)以及椰菜(palm cabbage)的提取的分子，通过抑制5-α-还原酶转录和活性而限制皮脂的产生。作用于皮脂品质的脂质来源的其它皮脂调节剂例如亚油酸令人感兴趣。
术语“抗细菌剂”和“抗真菌剂”是指限制病原微生物的生长或破坏病原微生物的分子，所述病原微生物例如某些细菌，如痤疮丙酸杆菌(P. acnes)或某些真菌(糠秕马拉色氏霉菌(Malassezia furfur))。最传统的是通常用于化妆品或营养制品中的防腐剂、具有抗细菌活性的分子(伪-防腐剂(pseudo-preservative))例如辛酸衍生物(辛酰甘氨酸、辛酸甘油酯等)、例如己二醇和乙酰丙酸钠、锌和铜衍生物(葡糖酸盐和PCA)、植物鞘氨醇及其衍生物、过氧化苯甲酰、吡罗克酮乙醇胺(piroctone olamine)、吡硫锌、硫化硒、益康唑、酮康唑、或局部抗生素例如红霉素和克林霉素等。
术语“角质调节剂”和“角质软化剂”是指调节或有助于消除表皮角质层死细胞的试剂。最常用的角质调节/角质软化剂包括：水果的α-羟基酸(AHA)(柠檬酸、乙醇酸、苹果酸、乳酸等)、AHA酯、AHA与其它分子的组合，例如苹果酸和杏仁蛋白(KeratoliteRTM)的组合，乙醇酸或乳酸与精氨酸的组合，或羟基酸与脂质分子例如LHARTM (脂-羟基酸)的组合，两性羟基酸复合物(AHCare)、柳树皮(白柳树(Salix alba)皮提取物)、壬二酸及其盐和酯、水杨酸及其衍生物例如辛酰水杨酸或与其它分子的组合，例如水杨酸和多糖(β-羟基酸、或BHA)的组合、他扎罗汀、阿达帕林以及类视色素家族的分子例如维甲酸、视黄醛、异维甲酸和视黄醇。
术语“收敛剂”是指有助于收紧毛孔的试剂，最常用的是多酚、锌衍生物和金缕梅。
术语“抗炎/抗刺激剂”是指限制由细胞因子或花生四烯酸代谢介质所致的炎性反应并具有舒缓和抗刺激性质的试剂。最传统的是甘草次酸(甘草衍生物)及其盐和酯、α-没药醇、银杏(Ginkgo biloba,)、金盏花属(Calendula)、硫辛酸、β-胡萝卜素、维生素B3(烟酰胺)、维生素E、维生素C、维生素B12、黄酮类(绿茶、槲皮素等)、番茄红素或叶黄素、鳄梨糖类、鳄梨油馏出物(oleodistillate)、阿拉伯半乳聚糖、羽扇豆肽、羽扇豆总提取物、奎奴亚藜肽提取物(quinoa peptide extract)、CycloceramideRTM (噁唑啉衍生物)、抗糖化试剂例如肌肽、N-乙酰基-半胱氨酸、异黄酮类(例如，染料木素/染料木苷、黄豆苷元/黄豆苷)、矿泉水或温泉水(eau d'Avene、eau de la Roche Posay、eau de Saint Gervais、eau d'Uriage、eau de Gamarde)、枸杞提取物(宁夏枸杞(Lycium barbarum))、植物氨基酸肽或复合物、局部用氨苯砜或抗炎药。
术语“抗氧化剂”是指减少或阻止其它化学物氧化的分子。可组合使用的抗氧化剂/自由基清除剂有利地选自：硫醇和酚类、甘草衍生物(例如甘草次酸及其盐和酯)、α-没药醇、银杏提取物、金盏花属提取物、CycloceramideRTM (噁唑啉衍生物)、鳄梨肽、痕量元素(例如铜、锌和硒)、硫辛酸、维生素B12、维生素B3 (烟酰胺)、维生素C、维生素E、辅酶Q10、磷虾(krill)、谷胱甘肽、丁基化羟基甲苯(BHT)、丁基化羟基茴香醚(BHA)、番茄红素或叶黄素、β-胡萝卜素、多酚家族例如丹宁酸、酚酸、花青素、黄酮类(例如，绿茶、红浆果、可可、葡萄、西番莲(Passiflora incarnata)或柑橘(Citrus)的提取物)、或异黄酮类(例如，染料木素/染料木苷和黄豆苷元/黄豆苷)。抗氧化剂组进一步包括物抗糖化剂例如肌肽或某些肽、N-乙酰基-半胱氨酸、以及抗氧化剂或自由基清除酶例如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、硫氧还蛋白还原酶及其激动剂。
可组合使用的愈合/修复屏障功能的试剂有利地是维生素A、泛醇(维生素B5)、AvocadofuraneRTM、鳄梨糖类、羽扇豆醇、玛卡肽提取物、奎奴亚藜肽提取物、阿拉伯半乳聚糖、氧化锌、镁、硅、羟基积雪草酸或亚细亚酸、葡聚糖硫酸酯、辅酶Q10、葡糖胺及其衍生物、硫酸软骨素和总体上糖胺聚糖(GAG)、葡聚糖硫酸酯、神经酰胺类、胆固醇、角鲨烷、磷脂、发酵的或非发酵的大豆肽类、植物肽类、海洋生物、植物或生物技术多糖类(例如藻类提取物或蕨类提取物、痕量元素、富含丹宁酸的植物的提取物(例如源自没食子酸的丹宁酸，称为没食子酸或可水解的丹宁酸，其最初在栎五倍子中发现，和由黄烷单元聚合产生的儿茶素丹宁酸，黄烷单元的模型是由儿茶(Acacia catechu)提供的)。可以使用的痕量元素有利地选自铜、镁、锰、铬、硒、硅、锌及其混合物。
可以组合起效而在成熟受试者中治疗痤疮的抗老化剂是抗氧化剂和尤其是维生素C、维生素A、视黄醇、视黄醛、任何分子量的透明质酸、AvocadofuraneRTM、羽扇豆肽和玛卡肽提取物。
最常用的保湿剂/润肤剂是甘油或其衍生物、尿素、吡咯烷酮羧酸及其衍生物、任何分子量的透明质酸、糖胺聚糖、以及海洋生物、植物或生物技术来源的任何其它多糖类(例如，黄原胶、Fucogel.RTM.)、某些脂肪酸(例如月桂酸、豆蔻酸、单不饱和和多不饱和ω-3、-6、-7和-9脂肪酸(亚油酸、棕榈油酸等)、向日葵油馏出物、鳄梨肽类和古朴阿苏果油(cupuacu butter)。
为了治疗疾病，可将本发明的试剂配制在药物组合物中。
本文所用的“药物组合物”是指本文描述的一种或多种活性成分和其他化学组分例如生理学上合适的载体和赋形剂的制剂。药物组合物的目的是促进将化合物给予生物体。
本文的术语“活性成分”是指对生物效应负责的下调Bcl-xL、Bcl-w和/或p21的试剂。可以理解，所述药物组合物可包含已知可用于治疗特定疾病的额外的活性剂。因此，例如对于皮肤纤维化疾病的治疗，本发明人考虑了药物组合物，其包含上述试剂以及至少一种如本文上述的皮脂调节剂、抗菌剂、抗真菌剂、角质软化剂、角质调节剂、收敛剂、抗炎/抗刺激剂、抗氧化剂/自由基清除剂、愈合剂、抗老化剂和/或保湿剂。
在下文中，可以互换使用的短语“生理学上可接受的载体”和“药学上可接受的载体”是指这样的载体或稀释剂，其并不引起对生物体的显著刺激并且并不废除所给予化合物的生物活性和性质。这些短语包括佐剂。
本文的术语“赋形剂”是指惰性物质，其被加入药物组合物用来进一步促进活性成分的给予。赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖和各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
可以通过本领域中众所周知的工艺来制造本发明的药物组合物，例如，通过常规混合、溶解、造粒、制作糖锭剂、磨细、乳化、封装、俘获或冷冻干燥工艺。
因此，依据本发明使用的药物组合物可使用一种或多种生理学上可接受的载体(包括赋形剂和助剂，其有助于将活性成分加工成可以药用的制剂)，以常规方式加以配制。合适的制剂取决于所选的给药途径。
对于注射，可以将药物组合物的活性成分配制在水溶液中，优选在生理学上相容的缓冲液如Hank溶氏液、林格氏液或生理盐缓冲液中。
适宜的给药途径可以例如包括口服、直肠、跨粘膜途径，尤其是经鼻、肠道或胃肠外递送，包括肌内、皮下和髓内注射以及鞘内、直接心室内、心内注射，例如注入右或左心室腔、注入总冠状动脉，静脉内、腹膜内、鼻内、或眼内注射。
根据具体的实施方案，给药途径是经由局部递送。
或者，可以以局部而不是全身方式来给予药物组合物，例如，通过将药物组合物直接注射到患者的组织区域。
可以通过本领域中众所周知的工艺来制造本发明的药物组合物，例如，通过常规混合、溶解、造粒、制作糖锭剂、磨细、乳化、封装、包埋或冷冻干燥工艺。
因此，依据本发明使用的药物组合物可使用一种或多种生理学上可接受的载体(包括赋形剂和助剂，其有助于将活性成分加工成可以药用的制剂)，以常规方式加以配制。合适的制剂取决于所选的给药途径。
对于注射，可以将药物组合物的活性成分配制在水溶液中，优选在生理学上相容的缓冲液如Hank氏溶液、林格氏液、或生理盐缓冲液中。对于跨粘膜给予，在制剂中使用适合于待渗透的屏障的渗透剂。这样的渗透剂通常是本领域已知的。
对于口服给予，可以通过将活性化合物和本领域中众所周知的药学上可接受的载体混合来容易地配制药物组合物。这类载体能够将药物组合物配制为片剂、丸剂、糖锭剂、胶囊剂、液体剂、凝胶剂、糖浆剂、浆液、混悬剂等，用于由患者口服摄取。可以在添加适宜的助剂(如果需要的话)以后，利用固体赋形剂，任选地研磨所得混合物，并处理颗粒混合物，以获得片剂或糖锭剂核心来制备用于口服的药理学制剂。适宜的赋形剂尤其是填充剂，例如糖类，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制剂，例如，玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠；和/或生理上可接受的聚合物如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要的话，可以添加崩解剂，如交联聚乙烯基吡咯烷酮、琼脂、或海藻酸或其盐如海藻酸钠。
提供有适当的包衣的糖锭剂核心。为此目的，可以使用浓缩糖溶液，其可以任选地包含阿拉伯树胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡巴普凝胶、聚乙二醇、二氧化钛、漆溶液和适宜的有机溶剂或溶剂混合物。可以将染料或颜料加入片剂或糖锭剂包衣，用于识别或表征活性化合物剂量的不同组合。
可以口服使用的药物组合物包括由明胶制成的推入配合的胶囊剂(push-fit capsule)以及由明胶和增塑剂(如甘油或山梨醇)制成的软质密封胶囊剂。推入配合的胶囊剂可以包含活性成分与填充剂(如乳糖)、粘合剂(如淀粉)、润滑剂(如滑石粉或硬脂酸镁)以及任选的稳定剂的混合物。在软胶囊剂中，可以将活性成分溶解或悬浮于适宜的液体，如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。另外，可以添加稳定剂。用于口服给予的所有制剂应呈适用于所选给药途径的剂量。
对于颊部给予，组合物可以采用以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。
对于通过鼻吸入的给予，以来自加压包装或使用适宜的推进剂(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳)的喷雾器的气溶胶喷雾剂形式，来方便地递送依据本发明使用的活性成分。在加压气溶胶的情况下，可以通过提供阀门以递送计量的量来确定剂量单位。用于分药器的例如明胶的胶囊剂和药筒可以配制成包含化合物和适宜粉末基质(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
可以配制本文所述的药物组合物，用于胃肠外给予，例如，通过推注或连续输注。可以例如在安瓿中或在任选具有添加的防腐剂的多剂量容器中以单位剂型来提供用于注射的制剂。组合物可以是处于油性或水性载体中的混悬剂、溶液剂或乳剂，并且可以包含配制剂如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。
用于胃肠外给予的药物组合物包括水溶性形式的活性制剂的水溶液剂。另外，可以将活性组分的混悬剂制备成适当的油基或水基注射混悬剂。适宜的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油如芝麻油，或合成的脂肪酸酯如油酸乙酯、甘油三酯或脂质体。水性注射混悬剂可以包含增加混悬剂粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选地，混悬剂还可以包含适宜的稳定剂或增加活性组分可溶性的试剂，以允许制备高度浓缩的溶液剂。
或者，活性成分可以呈粉剂形式，用于在使用前用适宜载体(例如，无菌、无热原水基溶液)进行复溶。
还可以使用例如常规栓剂基质如可可脂或其他甘油酯将本发明的药物组合物配制成直肠组合物如栓剂或滞留型灌肠剂。
适用于本发明上下文的药物组合物包括这样的组合物，其中以有效达到预期目的的量包含活性成分。更具体地，治疗有效量是指活性成分(例如siRNA试剂)的量，其有效预防、缓解或改善障碍(例如，纤维化或炎性疾病)的症状或延长进行治疗的受试者的生存期。
确定治疗有效量完全在本领域技术人员的能力内，尤其是考虑到本文提供的详细公开内容。
对于在本发明的方法中使用的任何制剂，治疗有效量或剂量可以由动物模型(例如，CCl4诱导的肝纤维化的小鼠模型，蛙皮素诱导的胰腺炎的小鼠模型，COPD的小鼠模型)来估计，以实现所期望的浓度或滴度。这类信息可以用来更准确地确定在人体内的有用剂量。
可以通过在实验动物中的标准制药程序来确定本文描述的活性成分的毒性和疗效。由这些动物研究得到的数据可以用于配制用于人类的剂量范围。剂量可变化，这取决于所采用的剂型和所使用的给药途径。确切的制剂、给药途径和剂量可以由个体医师考虑到患者的病情来选择。(参见例如Fingl,等人, 1975, 载于〃 The Pharmacological Basis of Therapeutics 〃，第 1章第1页)。
可以单独地调节剂量和间隔以提供足以诱导血糖量正常的细胞数(最小有效浓度，MEC)。对于每种制剂，MEC将有变化，但可以由体外数据估计。为实现MEC所必要的剂量将取决于个体特征和给药途径。检测测定可以用来确定血浆浓度。
待给予的组合物的量当然将取决于接受治疗的受试者、病痛的严重性、给予方式、处方医师的判断等。
如果需要的话，可以以包装或分药器装置来提供本发明的组合物，所述包装或分药器装置例如FDA批准的药盒，其可以包含含有活性成分的一个或多个单位剂型。包装可以例如包括金属或塑料箔，如泡罩包装。包装或分药器装置可以伴随有给药说明书。包装或分药器还可以由管理药品的制造、使用或出售的政府机构规定形式提供有与容器相关的通告，该通告反映机构批准该组合物或人用或兽用给予的形式。这类通告例如可具有由美国食品和药物管理局对处方药批准的标记或批准的产品插页。还可将包含配制在相容的药用载体中的本发明制剂的组合物制备，放置在适当容器中，并标示用于指定病症的治疗，如上文进一步详述的那样。
预计在自本申请慎重形式的专利的生命期内，能够下调Bcl-xL和/或Bcl-w和/或p21的多种相关试剂将得以开发，并且短语“能够下调...的试剂”的范围意图先验地包括所有这类新技术。
术语“包含”、“含有”、“包括”、“含”、“具有”和它们的同根词是指“包括但不限于”。
术语“由…组成”是指“包括且限于”。
术语“基本上由...组成”是指组合物、方法或结构可包括额外成分、步骤和/或部分，但仅当额外成分、步骤和/或部分并不会实质性改变要求保护的组合物、方法或结构的基本的和新的特征时才如此。
本文所用的术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，其包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者已知的或由这些从业者根据已知的方式、手段、技术和程序容易地开发的那些方式、手段、技术和程序。
本文使用的术语“治疗”包括废除、基本上抑制、减缓或逆转病症的进程、基本上改善病症的临床或美学症状或基本上阻止病症的临床或美学症状的出现。
应当理解，为了清楚而在单独的实施方案的背景中描述的本发明的某些特征，也可以组合在单个实施方案中而提供。相反，为了简要而在单个实施方案的背景中描述的本发明的各种特征，也可以分别地或以任何适宜的子组合提供或在适合时提供于本发明描述的任何其他实施方案。除非实施方案在没有那些要素的情况下是无效的，否则在各种实施方案的背景中描述的某些特征不认为是所述实施方案的必要特征。
在以下实施例中可以找到上文描述的和在所附权利要求书部分要求保护的本发明各种实施方案和方面的实验性支持。
实施例
现在提及下列实施例，其结合上述说明书以非限制性方式阐述本发明的一些实施方案。
通常，本文所使用的术语和本发明所使用的实验室程序包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。这些技术在文献中有充分解释。参见，例如，“Molecular Cloning: A laboratory Manual” Sambrook等人(1989)；“Current Protocols in Molecular Biology” 卷I-III Ausubel, R. M.编辑(1994)；Ausubel等人, “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley和Sons, Baltimore, Maryland (1989)；Perbal, “A Practical Guide to Molecular Cloning”, John Wiley & Sons, New York (1988)；Watson等人, “Recombinant DNA”, Scientific American Books, New York；Birren等人 (编辑) “Genome Analysis: A Laboratory Manual Series”, 卷1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)；在美国专利号 4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中提出的方法；“Cell Biology: A Laboratory Handbook”, 卷I-III Cellis, J. E.编辑(1994)；“Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique”，Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), 第三版；“Current Protocols in Immunology” 卷I-III Coligan J. E.编辑(1994)；Stites等人 (编辑), “Basic and Clinical Immunology” (第8版), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994)；Mishell和Shiigi (编辑), “Selected Methods in Cellular Immunology”, W. H. Freeman和Co., New York (1980)；可用的免疫测定在专利和科学文献中有广泛描述，参见，例如， 美国专利号 3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；“Oligonucleotide Synthesis” Gait, M. J.编辑(1984)；“Nucleic Acid Hybridization” Hames, B. D.,和Higgins S. J., 编著. (1985)；“Transcription and Translation” Hames, B. D.,和Higgins S. J., 编著. (1984)；“Animal Cell Culture” Freshney, R. I.编辑(1986)；“Immobilized Cells and Enzymes ” IRL Press, (1986)；“A Practical Guide to Molecular Cloning” Perbal, B., (1984)和“Methods in Enzymology” 卷1-317, Academic Press；“PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications”, Academic Press, San Diego, CA (1990)；Marshak等人, “Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual” CSHL Press (1996)；所有这些都通过引用并入，如同完整在本文描述一样。其他一般参考文献在本文件全文中有提供。认为其中的程序为本领域周知并且为了方便读者而提供。其中所包含的所有信息通过引用并入本文。
通用材料与方法
组织培养 : 人原代成纤维细胞(IMR-90, BJ) 得自ATCC。MEF自13.5天胚胎制备而来。将所有培养物维持在补充有10% 胎牛血清(Hyclone)的DMEM中。通过用依托泊苷(50 mM, Sigma)处理，或使用感染将致癌的H-rasV12引入IMR-90细胞(如Narita( 2003)所述)，诱导衰老。
免疫印迹 ： 将细胞在RIPA缓冲液中裂解。将等量蛋白在12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离并转移到PVDF膜。用以下抗体进行检测：抗Rb (9313)、抗切割的parp (9541)、抗切割的胱天蛋白酶-3 (9661)、抗磷酸-p53 (9284)、抗小鼠-p53 (2524)、抗磷酸-NF-κB (3033)、抗Bcl-2 (2870)、抗Bcl-w (2724)和抗Bcl-xL (2764)购自Cell Signaling Technology。抗人p53 (DO1和PAb1801)、抗p16 (sc-759)、抗小鼠-p21 (sc-397)、抗NFκB p65 (sc-372)和抗α-微管蛋白(sc-9104)得自Santa Cruz Biotechnology。抗人-p21 (556431)得自BD Pharmingen，抗Mcl-1 (1239-1)得自Epitomics。
RNA 分离 和定量 RT-PCR : 对于定量RT–PCR，使用NucleoSpin试剂盒(Macherey Nagel, Düren, Germany)分离总RNA。使用莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶(Promega)和随机六聚体引物(Applied Biosystems)将1 μg等分试样的总RNA逆转录。使用Platinum SYBR Green qPCR SuperMix (Invitrogen)在ABI StepOnePlus仪器(Applied Biosystems)上进行实时PCR。
将特定基因的数值针对GAPDH而标准化。引物序列如下：(1) GAPDH正向, 5’-GACAGTCAGCCGCATCTTC -3’ (SEQ ID NO: 1)；反向, 5’- CGTTGACTCCGACCTTCAC -3’ (SEQ ID NO: 2)；(2) Bcl-2正向, 5’- ACTGGAGAGTGCTGAAGATTGATG -3’ (SEQ ID NO: 3)；反向, 5’- CTACTTCCTCTGTGATGTTGTATTTTTTAAG- 3’ (SEQ ID NO: 4)；(3) Bcl-w正向, 5’- TGACACCTGGGTGGAAAGAG- 3’ (SEQ ID NO: 5)；反向, 5’-CCACTGTGGTCCCATCTAAG- 3’ (SEQ ID NO: 6)；(4) Bcl-xL正向, 5’ -CCATACTGAGGGACCAACTG- 3’ (SEQ ID NO: 7)；反向, 5’- GGCTGCTCTTGTAGGAAGTG- 3’ (SEQ ID NO: 8)；(5) p21正向, 5’- TGTCTTTCCTGGCACTAACG -3’ (SEQ ID NO: 9)；反向, 5’- AAACAGTCCAGGCCAGTATG-3’ (SEQ ID NO: 10)；(6) IL-8正向, 5’- GTCTGCTAGCCAGGATCCAC- 3’ (SEQ ID NO: 11)；反向, 5’- GCTTCCACATGTCCTCACAA- 3’ (SEQ ID NO: 12)；(7) MMP-3,正向, 5’- TCTGAGGGGAGAAATCCTGA- 3’ (SEQ ID NO: 13)；反向, 5’- GGAAGAGATGGCCAAAATGA- 3’ (SEQ ID NO: 14)；(8) 细胞周期蛋白A2,正向, 5’- ATGGACCTTCACCAGACCTA- 3’ (SEQ ID NO: 15)；反向, 5’- TGGGTTGAGGAGAGAAACAC-3’ (SEQ ID NO: 16)；(9) CDK1正向, 5’- AGCCGGGATCTACCATAC-3’ (SEQ ID NO: 17)；反向, 5’- TCATGGCTACCACTTGAC-3’ (SEQ ID NO: 18)；(10) IL-1β正向, 5’- GCTGCTCTGGGATTCTCTTC-3’ (SEQ ID NO: 19)；反向, 5’- TGGCGAGCTCAGGTACTTC- 3’ (SEQ ID NO: 20)。
成活力测定 : 以7.5 X 104细胞每孔的密度，将生长的和衰老的细胞接种在12-孔板。次日，将细胞用DMSO对照、ABT-737 (Selleckchem, USA)或ABT-199 (ChemieTek, USA)处理，并在24小时后分析细胞成活力。将300µl PrestoBlue试剂(Invitrogen, USA)加入各孔中，将各板在37C孵育20分钟。一式两份地取出100µl样品到96孔板并使用Tecan读板器(Infinite® M200)在540nm处读取OD。与100µM z-VAD-fmk (Santa Cruz, USA)进行3小时预孵育，然后按照指示加入ABT-737。
siRNA : 使用Dharmafect 1试剂，将靶向p21、Bcl-2、Bcl-w、Bcl-xL的ON-TARGETplus SMARTpool小干扰RNA和非靶向库siRNA (对照)转染入细胞中(都来自Dharmacon, Lafayette, CO, USA)。转染24小时后洗去siRNA并在4天后如上所述分析成活力。
实施例 1
Bcl-w 和 Bcl-xL 蛋白的表达在衰老细胞中升高
分析了在生长和衰老正常人(IMR-90)和小鼠(MEF)二倍体成纤维细胞中的Bcl-2家族成员的蛋白水平。在这些细胞中通过致癌H-rasV12的表达或通过用DNA破坏试剂依托泊苷处理而诱导衰老。Bcl-w和Bcl-xL水平在人和小鼠来源的衰老细胞中都升高。该作用与用于诱导衰老的刺激物无关(图1A)。相比之下，Mcl-1和Bcl-2水平的变化不那么明显或依赖于细胞来源和用于诱导衰老的应激刺激。衰老p16、p21或p53的典型标记的水平与阳性SA-β-gal染色一起，用作细胞衰老表型的阳性对照(图1A-B)。注意的是，这些基因的mRNA水平在生长和衰老细胞之间并无相当大的变化，表明蛋白水平的增加可在转录后水平上得以调控(图1C)。
实施例 2
Bcl-w 和 Bcl-xL 的组合敲减 诱导衰老细胞死亡
为了区分3种蛋白Bcl-2、Bcl-w和Bcl-xL中哪一种提供了经依托泊苷处理的衰老IMR-90细胞的凋亡抗性，本发明人试图分别地特异性地抑制这些蛋白质的每一种的功能。siRNA用于敲减Bcl-w和Bcl-xL，特异性抑制剂ABT-199用于阻断Bcl-2，因为siRNA在蛋白质水平上敲减该基因上是无效的(图2B)。在衰老细胞中分别敲减Bcl-w和Bcl-xL，导致其成活力的微弱降低(图3A)。有趣的是，组合敲减具有协同效应，导致细胞50%死亡。为了在Bcl-w和Bcl-xL敲减之上评价Bcl-2抑制的累加贡献，使用了Bcl-2抑制剂ABT-199 (图3B)。Bcl-2的抑制具有统计显著性，但对于Bcl-w和Bcl-xL对衰老细胞成活力的影响而言具有微弱累加效应。另外，单用ABT-199抑制Bcl-2对衰老细胞成活力而言几乎无效，除了对于致癌H-rasV12诱导的衰老IMR-90细胞的细胞成活力的微弱降低之外(图3C-D)。
实施例 3
BH3 模拟 ABT-737 诱导衰老细胞的细胞死亡
为了通过独立方法进一步测试抗凋亡蛋白Bcl-w和Bcl-xL水平的增加可解释衰老细胞的凋亡抗性这一假设，细胞用Bcl-2蛋白家族的药理学抑制剂ABT-737处理(Chauhan等人, 2007)。通过诱导DNA破坏或通过用致癌H-RasV12转导，诱导正常人(IMR-90)和小鼠(MEF)成纤维细胞经历衰老。建立衰老表型之后，细胞用ABT-737处理24小时。生长的、经溶媒处理的或载体转导的细胞分别用作DNA破坏或致癌H-RasV12的对照。该处理降低衰老细胞的成活力达50%，而对对照细胞仅具有微弱效应(图4A-B)。因此，已经表明Bcl-2家族蛋白的药理学抑制导致衰老细胞的特异性消除。
实施例 4
ABT-737 经由胱天蛋白酶 - 依赖性细胞凋亡而 杀死 衰老细胞
Bcl-2家族成员负面地调节凋亡途径(Azmi等人, 2011；Cory等人, 2003；Reed, 2008)。为了确定ABT-737是否经由凋亡途径而杀死衰老细胞，DNA破坏诱导的衰老IMR-90细胞、致癌H-RasV12诱导的衰老细胞和对照生长细胞用单独或与泛胱天蛋白酶抑制剂z-VAD-fmk组合的ABT-737处理。正如所料，ABT-737诱导衰老细胞死亡，而z-VAD-fmk阻止了ABT-737处理后的细胞死亡(图5A)。因为胱天蛋白酶-3被凋亡机构切割，所以本发明人在用单独或与泛胱天蛋白酶抑制剂z-VAD-fmk组合的ABT-737处理后检查了其活化切割形式的存在。仅用ABT-737处理的衰老细胞显示胱天蛋白酶-3切割(图5B)。z-VAD-fmk的添加废除了这种切割。可以得出结论：ABT-737在衰老细胞中诱导细胞凋亡。
实施例 5
p21 (CDKN1A) 维持 衰老细胞的 成活力
作为CDK4和CDK2的抑制剂，p21是细胞衰老的主要调节物(Campisi和d'Adda di Fagagna, 2007)。也已提出它在某些情况下抑制细胞凋亡(Abbas和Dutta, 2009)。为了研究p21对衰老细胞成活力的贡献，使用siRNA在生长和衰老细胞正常人(IMR-90, BJ)和小鼠(MEF)成纤维细胞以及在肺癌细胞(H1299)中将其敲减。虽然在生长细胞中的p21敲减对细胞成活力无有害效应，但其在衰老细胞中的敲减导致IMR-90、BJ、H1299和MEF细胞的细胞成活力分别降低30%、50%、75%和30%(图6A-D)。有趣的是，观察到了用针对p21的siRNA转染的衰老BJ细胞成活力随时间的连续降低，表明对于p21敲减的累积效应(图6E)。因此，p21是维持衰老细胞成活力所必需的。
实施例 6
衰老细胞死亡是 p53- 和 pRB- 非依赖性的并且涉及胱天蛋白酶 -3 活化
产生DNA破坏反应的刺激(例如，电离辐射和端粒功能异常)主要通过p53途径诱导衰老(Campisi和d'Adda di Fagagna, 2007)。活性p53部分地通过诱导p21表达而建立衰老生长停滞，p21是一种细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂，其尤其抑制磷酸化并因此使pRB失活。pRB通过抑制E2F活性而停止细胞增殖，E2F是一种转录因子，其刺激细胞周期进程所需的基因表达。
在衰老而非在生长BJ细胞中敲减p21导致由细胞凋亡效应物胱天蛋白酶-3和PARP的切割所指示的细胞凋亡机构的活化。这伴随着p53水平和活性(p-p53)的明显增加和pRB水平的降低(图7A)。因为已知p53和E2F在响应DNA破坏时诱导细胞凋亡，所以我们检查了p21敲减是否以p53或pRB-依赖性方式影响衰老细胞的成活力。
在经依托泊苷处理的BJ细胞中，将p21、p53或pRB单独敲减或与p21组合敲减。令人惊奇的是，p53敲减降低了衰老细胞成活力，但与单独p21相比以更小的程度降低(图7B)。当这两个基因被同时敲减时，相比单独的p21敲减而言，对于p53未检测到累加效应。正如蛋白质印迹所示，p53敲减导致p21水平降低。因此可以得出结论：p21水平在p53下游负责维持衰老细胞成活力，而非p53本身。
相比单独敲减p21而言，pRB以及p21的敲减对衰老细胞成活力无累加效应(图7C)。令人惊奇的是，当pRB被单独敲减时，对细胞成活力无影响，但导致p21水平增加。因此，p21以p53和pRB非依赖性方式维持衰老细胞成活力。
实施例 7
p21 敲减后的衰老细胞死亡仅仅是部分地 胱天蛋白酶 依赖性的
为了阐明p21敲减所致的细胞死亡类型，通过加入泛胱天蛋白酶抑制剂z-VAD-fmk评价胱天蛋白酶介导的细胞死亡。z-VAD-fmk能够拯救细胞死亡仅达20%(图8)。在经依托泊苷处理的细胞中用p21敲减活化胱天蛋白酶-3，因为切割的胱天蛋白酶-3和切割的PARP条带是明显的(图8)。鉴于z-VAD-fmk不能完全拯救由p21敲减所介导的细胞成活力的降低，可推断胱天蛋白酶依赖性细胞凋亡仅仅部分地负责所观察到的细胞死亡。因此，可以假设其它细胞死亡机制例如坏死性凋亡可由衰老细胞中的p21敲减诱导。
实施例 8
作为对 p21 敲减的响应， E2F 靶和炎症基因被上调
p21可以通过直接结合和抑制转录因子(例如E2F1、STAT3和MYC)的反式激活活性而抑制所述转录因子的转录活性(Abbas和Dutta, 2009)。因此测定了在响应p21敲减时的E2F靶以及SASP组分的mRNA水平的变化。在p21敲减后检测到E2F靶细胞周期蛋白-A2和CDK-1的mRNA水平的显著增加(图9A-E)。另外，p21敲减导致IL-8和IL-1β mRNA水平增加，其可指向衰老细胞死亡相关的炎性反应。因此，p21敲减在衰老细胞中诱导促炎性反应和细胞死亡。该方法可能导致该方法的治疗潜力增加，因为炎性细胞因子将会募集免疫系统以杀死通过敲减本身未能消除的细胞。
实施例 9
p21 敲减减少 肝纤维化
在纤维化肝中，衰老细胞主要源自活化的肝星状细胞，所述细胞最初响应于肝损伤而增殖并产生胞外基质，其沉积在纤维化瘢痕中(Krizhanovsky等人, Cell, 2008)。为了评价通过p21敲减方式对衰老细胞的消除对肝纤维化的作用，本发明人在野生型和p21-/-小鼠中诱导了纤维化。如先前所述，小鼠经历用CCl4的6周处理，诱导肝纤维化(Krizhanovsky等人, Cell 2008)。处理后，测试两种基因型的小鼠的肝脏中的衰老细胞的存在情况(通过SA-β-gal染色)和纤维化程度(通过天狼星红染色)。与组织培养实验一致，来自p21敲除小鼠的肝脏相比野生型含有明显更少的衰老细胞(图10)。重要的是，这种减少伴随着纤维化瘢痕量的明显减少(图10)。
这些观察结果表明，在体内，在p21不存在时，衰老细胞的频率下降并导致纤维化减少。因此，本发明人提出，通过p21抑制的方式对衰老细胞的消除可对纤维化具有疗效。
尽管已结合其具体实施方案描述了本发明，显然许多备选、修改和变化对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，意图包括落在所附权利要求的精神和广阔范围内的所有这类备选、修改和变化。
在本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请在此通过引用以其整体结合到本说明书，其结合程度就如同每个单独的出版物、专利或专利申请明确地并且单独地指出通过引用结合在此一样。另外，在本申请中任何参考文献的引用或标识不应解释为承认这样的参考文献可作为本发明的现有技术。就使用章节标题而言，它们不应该解释为必要限制。
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Claims (40)

1. 在有需要的受试者中治疗炎性或纤维化疾病的方法，其包括给予所述受试者治疗有效量的下调(Bcl-xL)和/或Bcl-w的活性和/或量的试剂，从而治疗所述炎性或纤维化疾病，条件是所述炎性疾病不是癌症。
2. 权利要求1的方法，其中所述试剂是化学试剂。
3. 权利要求1的方法，其中所述试剂是靶向Bcl-xL和/或Bcl-w的多核苷酸试剂。
4. 权利要求1-3中任一项的方法，其中所述疾病与软骨变性相关。
5. 权利要求1-3中任一项的方法，其中所述疾病选自肝纤维化、伤口愈合、皮肤纤维化、肺病、肾纤维化、前列腺炎、动脉粥样硬化、关节炎和胰腺炎。
6. 制品，其包含：
(i) 下调Bcl-xL和/或Bcl-w的活性和/或量的试剂；和
(ii) 下调p21的活性和/或量的试剂。
7. 权利要求6的制品，其中所述下调Bcl-xL和/或Bcl-w的活性和/或量的试剂被包含在与所述下调p21的活性和/或量的试剂分开的包装中。
8. 权利要求6的制品，其中所述下调Bcl-xL和/或Bcl-w的活性和/或量的试剂被包含在与所述下调p21的活性和/或量的试剂相同的包装中。
9. 权利要求6的制品，其进一步包含选自以下的至少一种试剂：皮脂调节剂、抗菌和/或抗真菌剂、角质软化剂和/或角质调节剂、收敛剂、抗炎和/或抗刺激剂、抗氧化剂和/或自由基清除剂、愈合剂、抗老化剂和保湿剂。
10. 权利要求9的制品，其中所述至少一种试剂是抗老化剂。
11. 药物组合物，其包含药学上可接受的载体和作为活性剂的：
(i) 下调Bcl-xL和/或Bcl-w的活性和/或量的试剂；和
(ii) 下调p21的活性和/或量的试剂。
12. 权利要求11的药物组合物，其配制为供局部递送用。
13. 用于治疗炎性或纤维化疾病的下调细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1 (p21)的活性和/或量的试剂，其中所述疾病不是癌症。
14. 用于治疗炎性或纤维化疾病的下调表达Bcl-xL的内源核酸序列的多核苷酸试剂和下调表达Bcl-w的内源核酸序列的多核苷酸试剂。
15. 权利要求14的试剂，其中所述多核苷酸试剂是siRNA试剂。
16. 组合物，其包含载体和下调p21的活性和/或量的至少一种活性剂和下调Bcl-xL和/或Bcl-w的活性和/或量的至少一种活性剂，其中所述组合物被配制为供局部给药用。
17. 权利要求16的组合物，其中所述下调Bcl-xL和/或Bcl-w的活性和/或量的至少一种活性剂是ABT-737或ABT-263。
18. 权利要求16的组合物，其进一步包含选自以下的至少一种试剂：皮脂调节剂、抗菌和/或抗真菌剂、角质软化剂和/或角质调节剂、收敛剂、抗炎和/或抗刺激剂、抗氧化剂和/或自由基清除剂、愈合剂、抗老化剂和保湿剂。
19. 权利要求18的组合物，其中所述至少一种试剂是抗老化剂。
20. 在有需要的受试者中治疗炎性或纤维化疾病的方法，其包括给予所述受试者治疗有效量的下调细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1 (p21)的活性和/或量的试剂，从而治疗所述炎性或纤维化疾病，条件是所述疾病不是癌症。
21. 权利要求20的方法，其中所述试剂是针对表达所述p21的内源核酸序列的多核苷酸。
22. 权利要求21的方法，其中所述多核苷酸试剂是siRNA。
23. 权利要求20的方法，其进一步包括给予所述受试者下调Bcl-xL和/或Bcl-w的活性和/或量的至少一种试剂。
24. 权利要求23的方法，其中所述至少一种试剂是针对表达所述Bcl-xL和/或Bcl-w的内源核酸序列的多核苷酸。
25. 权利要求24的方法，其中所述试剂是针对Bcl-xL和/或Bcl-w的siRNA。
26. 权利要求23的方法，其中所述至少一种试剂是化学试剂。
27. 权利要求26的方法，其中所述化学试剂选自ABT-737、ABT-263、棉酚、AT-101、TW-37和Obatoclax。
28. 权利要求20-27中任一项的方法，其中所述疾病与软骨变性相关。
29. 权利要求20-27中任一项的方法，其中所述疾病选自肝纤维化、伤口愈合、皮肤纤维化、肺病、骨质疏松症、肾纤维化、前列腺炎、动脉粥样硬化、关节炎和胰腺炎。
30. 权利要求29的方法，其中所述肺病包括慢性阻塞性肺病(COPD)。
31. 权利要求20-27中任一项的方法，其中所述试剂被配制为局部组合物。
32. 在有需要的受试者中治疗炎性或纤维化疾病的方法，其包括给予所述受试者治疗有效量的下调表达Bcl-xL的内源核酸序列的至少一种多核苷酸试剂和下调表达Bcl-w的内源核酸序列的至少一种多核苷酸试剂，从而治疗所述炎性或纤维化疾病。
33. 权利要求32的方法，其中所述至少一种多核苷酸试剂包含siRNA。
34. 权利要求32-33中任一项的方法，其中所述疾病是癌症。
35. 权利要求中32-33中任一项的方法，其中所述疾病选自肝纤维化、伤口愈合、皮肤纤维化、肺病、骨质疏松症、肾纤维化、前列腺炎、动脉粥样硬化、关节炎和胰腺炎。
36. 权利要求35的方法，其中所述肺病包括慢性阻塞性肺病(COPD)。
37. 权利要求32的方法，其中所述至少一种试剂被配制为局部组合物。
38. 在有需要的受试者中治疗癌前病变的方法，其包括给予所述受试者治疗有效量的下调Bcl-xL和/或Bcl-w的活性和/或量的试剂，从而治疗所述癌前病变。
39. 权利要求38的方法，其进一步包括给予所述受试者下调p21的活性和/或量的试剂。
40. 在有需要的受试者中治疗癌前病变的方法，其包括给予所述受试者治疗有效量的下调细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1 (p21)的活性和/或量的试剂，从而治疗所述癌前病变。
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