CN103849662B - 海洋内生真菌生产生物碱类物质fc的发酵方法 - Google Patents

海洋内生真菌生产生物碱类物质fc的发酵方法 Download PDF

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本发明公开了一种海洋内生真菌生产生物碱类物质FC的发酵方法，包括：将海洋来源内生真菌CY018（<i>Aspergillus</i><i> fumigatus</i>）接种于发酵培养基中进行发酵培养，且在发酵过程中对通气和搅拌进行两阶段控制，同时，在整个发酵过程中采用流加酸的方法维持发酵液pH值的稳定，以及通过流加前体物溶液促进FC（Fumigaclavine C）合成；作为较为优选的方案，所述两阶段控制包括：发酵0~96h，通气量为4.0~6.0L/min，搅拌速率为300~500rpm；发酵96~264h，通气量为0.6~2.0L/min，搅拌速率为50~150rpm。本发明工艺操作简便，能耗低，同时能显著提高海洋来源内生真菌CY018中生物碱类物质FC的产量，较原始水平提高了6.9倍，具有广阔的应用前景。

Description

海洋内生真菌生产生物碱类物质FC的发酵方法
技术领域
本发明涉及一种海洋来源内生真菌的发酵工艺，特别涉及一种利用海洋来源内生真菌CY018（Aspergillusfumigatus）高效生产生物碱类选择性免疫抑制剂FumigaclavineC（简称FC）的发酵工艺，属于发酵工程技术领域。
背景技术
海洋是一个开放的复杂系统，在海洋特殊的生态环境下生活着40多万种动植物和上亿种微生物。近年来许多文献报道了海洋生物作为活性化合物和药物来源的巨大潜力，具有重要的研究意义与开发价值。为适应海洋特有环境，各种海洋生物必须与其共生菌长期共进化并建立稳定的互惠共生关系，有些共生菌似乎与宿主形成了类似于“整体”的统一体，缺一难活。研究表明该“互惠共生”的化学本质是共生菌可产生结构和功能都比较特殊的代谢物来保护或调节海洋生物的生长发育、抵御天敌、寻取食物等行为。故海洋共生菌被认为是新药源分子的重要来源，对其产物深入研究可为人类急需新药的发现与研发提供广阔的空间。
海洋来源内生真菌CY018属半知菌类、丝孢目(Hyphomycetales)、丛梗孢科(Moniliaceae)、曲霉属(Aspergillus)真菌，由南京大学谭仁祥教授分离得到。海洋来源内生真菌CY018经液体或固体发酵可产生多种代谢物，包括生物碱类、萜类化合物、多烯类化合物和鞘氨酸类化合物等天然物质。FumigaclavineC（FC）是其产生的一种生物碱类次级代谢物，FC纯品为白色针状结晶，其具有同环孢菌素A相媲美的免疫抑制活性，是一种潜在的免疫抑制剂候选药物。
然而，FC在初始发酵工艺下的得率相当低，已经成为制约FC用于临床前研究的瓶颈。因此通过改善其发酵工艺提高FC产量已成为当务之急。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种利用海洋来源内生真菌CY018高效生产生物碱类选择性免疫抑制剂FC的发酵工艺，该方法操作简便，能耗较低，同时能显著提高海洋来源内生真菌CY018中生物碱类物质FC的产量，从而解决现有技术中的问题。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种海洋内生真菌生产生物碱类物质FC的发酵方法，包括：
将海洋来源内生真菌CY018接种于发酵培养基中进行发酵培养，且在发酵过程中对通气和搅拌进行两阶段控制，同时，在整个发酵过程中采用流加酸的方法维持发酵液pH值的稳定，以及，通过流加前体物溶液促进FC合成。
进一步的讲，该发酵方法中，对通气进行两阶段控制的具体操作包括：
发酵0~96h，通气量为4.0~6.0L/min；
发酵96~264h，通气量为0.6~2.0L/min。
进一步的讲，该发酵方法中，对搅拌进行两阶段控制的具体操作包括：
发酵0~96h，搅拌速率为300~500rpm；
发酵96~264h，搅拌速率为50~150rpm。
作为较佳的实施方案之一，该发酵方法中流加的酸溶液包括盐酸溶液。
进一步的，该发酵方法中流加的酸溶液浓度为0.5~1.5mol/L。
该发酵方法中流加酸溶液的时间为发酵过程开始以后，流加量为保证发酵液的pH值在3.5~4.5之间。
作为较佳的实施方案之一，该发酵方法中流加的前体物溶液包括色氨酸溶液。
进一步的，该发酵方法中流加的前体物溶液浓度为6~10g/L。
进一步的，该发酵方法中流加前体物溶液的时间为发酵过程开始72h以后，流加量为发酵液体积的5%~10%。
作为较佳的实施方案之一，该发酵方法中是将海洋来源内生真菌CY018的新鲜种子液以5~20v/v%的接种量接种于发酵培养基内，放罐时间为240~300h。
与现有技术相比，本发明的优点包括：首次在反应器水平确定了一种适合生物碱类物质FC规模化生产的发酵工艺，并且，该工艺操作简便，节约压缩空气用量，能耗较低，并且FC产量与初始发酵方法相比较有了大幅提高，为初始发酵方法的6.9倍，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1所示系与本发明实施例1-3及对照组实例中生物量（亦即，海洋来源内生真菌CY018在放罐时的菌体干重）与FC产量的检测结果相关图谱。
具体实施方式
如前所述，本发明旨在提供一种应用海洋来源内生真菌CY018（Aspergillusfumigatus）高效生产生物碱类选择性免疫抑制剂FC的发酵工艺。
作为本发明的一较为典型的实施方案，该发酵工艺可包括：
（1）培养基配制
种子培养基：取去皮马铃薯80g，葡萄糖8g，煮沸后过滤残渣，滤液加水补足至400mL，装入1000mL三角瓶中，115℃灭菌25min。
发酵培养基：取甘露醇180g，硝酸钠10.5g，MgSO4·7H2O0.9g，FeSO4·7H2O0.06g，KH2PO44.5g，酒石酸钠1.5g，谷氨酸钠3g，加水补至3000mL，pH值调至4.2，121℃灭菌30min。
（2）发酵
种子培养：用接种铲从新鲜的海洋来源内生真菌CY018的固体平板中挖取2块5×5mm琼脂块，接种至装有400ml种子培养基的1000ml挡板瓶中，28℃、150rpm摇床环境发酵培养3-4天，获得新鲜种子液；
发酵培养：将种子液接入装有2~3.5L无菌发酵培养基的反应器中，接种量优选为5~20%（v/v），尤其优选15%；发酵温度优选为25~30℃，尤其优选28℃；通气量在发酵过程前96h优选控制4.0~6.0L/min，尤其优选6.0L/min，96h后通气量优选降低至0.6-2.0L/min，尤其优选1.0L/min；搅拌转速在发酵过程前96h优选控制在300~500rpm，尤其优选400rpm，96h后优选降低至50~200rpm，尤其优选100rpm；pH值在整个发酵过程中优选控制在3.5~4.5，尤其优选控制在4.0~4.2之间；发酵开始72h后缓慢流加浓度优选为6~10g/L色氨酸，尤其优选浓度为8g/L，流加总量优选为发酵液总体积的5~10%，尤其优选7%，流加速率优选为5~15mL/h，尤其优选10mL/h；放罐时间优选为240~300h，尤其优选264h。
进一步的，前述发酵工艺还可包括如下步骤：
（3）产物检测
取发酵液20mL，用1mol/LNaOH调节pH至8~10，加入等体积乙酸乙酯和30颗直径3mm玻璃珠进行萃取，萃取条件为28℃和250rpm摇床环境萃取24h，静置分层后取适量上层有机相进行减压旋转蒸馏除去乙酸乙酯；残留物用甲醇溶解；以14000rpm高速离心5min后取适量上清液，用甲醇稀释若干倍后，用HPLC测定FC含量，进而通过标准曲线换算成所述发酵液中FC的实际含量。
该发酵工艺操作简便，能耗低，能显著提高海洋来源内生真菌CY018中生物碱类物质FC的产量。
以下结合附图及若干较佳实施例对本发明的技术方案作更为详尽的说明。
实施例1
（1）培养基配制
种子培养基：取去皮马铃薯80g，葡萄糖8g，煮沸后过滤残渣，滤液加水补足至400mL，装入1000mL三角瓶中，115℃灭菌25min。
发酵培养基：取甘露醇180g，硝酸钠10.5g，MgSO4·7H2O0.9g，FeSO4·7H2O0.06g，KH2PO44.5g，酒石酸钠1.5g，谷氨酸钠3g，加水补至3000mL，pH值调至4.2，121℃灭菌30min。
（2）发酵
种子培养：用接种铲从新鲜的海洋来源内生真菌CY018的固体平板中挖取2块5×5mm琼脂块，接种至装有400ml种子培养基的1000ml挡板瓶中，28℃、150rpm摇床环境发酵培养3-4天，获得新鲜种子液；
发酵培养：将种子液接入装有3L无菌发酵培养基的反应器中，接种量为15%；发酵温度为28℃；通气量在发酵过程前96h控制6.0L/min，96h后通气量降低至2.0L/min；搅拌转速在发酵过程前96h控制在300rpm，96h后降低至150rpm；pH在整个发酵过程中控制在3.5~4.0之间；发酵开始72h后缓慢流加浓度为8g/L，流加总量为发酵液总体积的7%，流加速率为10mL/h；放罐时间为264h。
（3）产物检测
取发酵液20mL，用1mol/LNaOH调节pH至8~10，加入等体积乙酸乙酯和30颗直径3mm玻璃珠进行萃取，萃取条件为28℃和200rpm摇床环境萃取24h，静置分层后取适量上层有机相进行减压旋转蒸馏除去乙酸乙酯；残留物用甲醇溶解；以14000rpm高速离心5min后取适量上清液，用甲醇稀释若干倍后，用HPLC测定FC的含量，进而通过标准曲线换算成所述发酵液中FC的实际含量，具体请参见图1。
实施例2
（1）培养基配制
同实施例1步骤1。
（2）发酵
种子培养：用接种铲从新鲜的海洋来源内生真菌CY018的固体平板中挖取2块5×5mm琼脂块，接种至装有400ml种子培养基的1000ml挡板瓶中，28℃、150rpm摇床环境发酵培养3-4天，获得新鲜种子液；
发酵培养：将种子液接入装有3L无菌发酵培养基的反应器中，接种量为15%；发酵温度为28℃；通气量在发酵过程前96h控制6.0L/min，96h后通气量降低至1.0L/min；搅拌转速在发酵过程前96h控制在400rpm，96h后降低至100rpm；pH在整个发酵过程中控制在4.0~4.2之间；发酵开始72h后缓慢流加浓度为8g/L，流加总量为发酵液总体积的7%，流加速率为10mL/h；放罐时间为264h。
（3）产物检测
同实施例1步骤3，具体检测结果请参见图1。
实施例3
（1）培养基配制
同实施例1步骤1。
（2）发酵
种子培养：用接种铲从新鲜的海洋来源内生真菌CY018的固体平板中挖取2块5×5mm琼脂块，接种至装有400ml种子培养基的1000ml挡板瓶中，28℃、150rpm摇床环境发酵培养3-4天，获得新鲜种子液；
发酵培养：将种子液接入装有3L无菌发酵培养基的反应器中，接种量为15%；发酵温度为28℃；通气量在发酵过程前96h控制6.0L/min，96h后通气量降低至2.0L/min；搅拌转速在发酵过程前96h控制在300rpm，96h后降低至150rpm；pH在整个发酵过程中控制在4.2~4.5之间；发酵开始72h后缓慢流加浓度为10g/L，流加总量为发酵液总体积的5%，流加速率为10mL/h；放罐时间为264h。
（3）产物检测
同实施例1步骤3，具体检测结果请参见图1。
对照组实例
（1）培养基配制
同实施例1步骤1。
（2）发酵
种子培养：用接种铲从新鲜的海洋来源内生真菌CY018的固体平板中挖取2块5×5mm琼脂块，接种至装有400ml种子培养基的1000ml挡板瓶中，28℃、150rpm摇床环境发酵培养3-4天，获得新鲜种子液；
发酵培养：将种子液接入装有3L无菌发酵培养基的反应器中，接种量为15%；发酵温度为28℃；通气量在整个发酵过程中控制在6.0L/min；搅拌转速在整个发酵过程中控制在300rpm；pH在整个发酵过程中不进行控制；放罐时间为264h。
（3）产物检测
同实施例1步骤3，具体检测结果请参见图1。
需要指出的是，以上说明所示的较佳实施例，不可解析为限定本发明的设计思想。在本发明的技术领域里持有相同知识者可以将本发明的技术性思想以多样的形态改良变更，这样的改良及变更应理解为属于本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.一种海洋内生真菌生产生物碱类物质FC的发酵方法，所述生物碱类物质FC为FumigaclavineC，其特征在于，包括：
将海洋来源内生真菌AspergillusfumigatusCY018接种于发酵培养基中进行发酵培养，且在发酵过程中对通气和搅拌进行两阶段控制，同时，在整个发酵过程中采用流加酸的方法维持发酵液pH值的稳定，以及通过流加前体物溶液促进FumigaclavineC合成；
该发酵方法中，对通气进行两阶段控制的具体操作包括：
发酵0～96h，通气量为4.0～6.0L/min；
发酵96～264h，通气量为0.6～2.0L/min；
该发酵方法中，对搅拌进行两阶段控制的具体操作包括：
发酵0～96h，搅拌速率为300～500rpm；
发酵96～264h，搅拌速率为50～150rpm；
该发酵方法中流加酸溶液的时间为发酵过程开始以后，流加量为保证发酵液的pH值在3.5～4.5之间；
该发酵方法中流加的前体物溶液包括色氨酸溶液。
2.根据权利要求1所述的海洋内生真菌生产生物碱类物质FC的发酵方法，其特征在于，该发酵方法中流加的酸溶液包括盐酸溶液。
3.根据权利要求1或2所述的海洋内生真菌生产生物碱类物质FC的发酵方法，其特征在于，该发酵方法中流加的酸溶液浓度为0.5～1.5mol/L。
4.根据权利要求1所述的海洋内生真菌生产生物碱类物质FC的发酵方法，其特征在于，该发酵方法中流加的前体物溶液浓度为6～10g/L。
5.根据权利要求1所述的海洋内生真菌生产生物碱类物质FC的发酵方法，其特征在于，该发酵方法中流加前体物溶液的时间为发酵过程开始72h以后，流加量为发酵液体积的5％～10％。
6.根据权利要求1所述的海洋内生真菌生产生物碱类物质FC的发酵方法，其特征在于，该发酵方法中是将海洋来源内生真菌AspergillusfumigatusCY018的新鲜种子液以5～20v/v％的接种量接种于发酵培养基内，放罐时间为240～300h。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Aspergillus fumigatus CY018, an endophytic fungus in Cynodon dactylon as a versatile producer of new and bioactive metabolites;Liu J.等;《J. Biotechnol.》;20041231(第114期);全文 *

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