CN112807383A - 改善老年痴呆症的复方灵芝组合物及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了一种改善老年痴呆症的复方灵芝组合物及其制备方法，涉及中药领域；该复方灵芝组合物包括：灵芝提取物5份、银杏叶提取物3份，肉苁蓉7份、天麻6份、黄精5份、酸枣仁4份、丹参6份、当归6份；该灵芝组合物采用纯天然配方，无副作用，能够缓解和治疗老年性痴呆；可缩短Morris水迷宫的逃避潜伏期，对大鼠学习记忆功能有显著的改善作用。
Description
技术领域
本发明属于中药技术领域，特别是一种改善老年痴呆症的复方灵芝组合物及制备方法。
背景技术
老年痴呆症是一种神经系统退行性慢性病，主要表现为记忆功能障碍。目前，尚未有针对老年痴呆症的有效治疗药物及治疗方法，临床上常用胆碱酯酶抑制剂如加兰他敏、安贝氯铵；改善脑组织代谢的吡咯烷酮衍生物如吡拉西坦(脑复康)，减轻部分症状，减慢疾病发展进程，但上述药物存在恶心、出汗、心动过缓等副作用。中医学上把老年痴呆症成因归属为虚、瘀、痰，特点是本虚标实，本虚多为肾气肾精亏虚，不能上充于脑，标实多为痰阻血瘀,病机责之心、肝、脾、肾等功能失调,气血不足,肾精失充,脑髓失养,气血痰瘀互阻,蒙蔽清窍而致。张景岳认为该病是“痴呆症凡平素无痰，而或以郁结，或以不遂，渐致痴呆”。从传统中医学角度来讲，其治疗原则应该抓住气虚痰瘀，标本兼治，滋肝补肾，补气活血。我国正步入老龄化社会，老年痴呆症发病率呈上升趋势，给社会和家庭带来沉重负担，急需一种行之有效且副作用小，用于改善老年痴呆症的产品。
Aβ是指β-淀粉样蛋白，可由多种细胞产生，循环于血液、脑脊液和脑间质液中，一般Aβ沉积会与神经元的退行性病变有关，在阿尔茨海默病的病程进展中发挥着主要作用，可使血管周围沉积从而导致血管壁淀粉样变从而导致血管硬化。已有研究表明，将Aβ注入大鼠的大脑皮质，会导致注射部位的组织坏死，同时周围的神经元发生缺失以及神经角质的增生，这一点和老年痴呆的病理变化特点相似。
Morris水迷宫(Morris water maze,MWM)是一种强迫实验动物游泳，学习寻找隐藏在水中平台的一种实验，通过测量啮齿类动物寻找平台的时间，评价其空间学习和记忆功能。被广泛应用于学习记忆、老年痴呆、海马/外海马研究等多个学科的研究。
灵芝属于多孔菌科药用真菌，具有极高的药用价值，《神农本草经》记载“主胸中结，益心气，补中增智慧不忘，久食轻身不老，延年成仙”，被成为“仙草”。现代医学表明，灵芝具有抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂的生物学功能，根据灵芝研发的系列产品涵盖了医药、保健和日化品等领域，其中医药、保健品产品主要以提高免疫力、抗衰老为主要功效，尚未有针对老年痴呆症的保健食品。
发明内容
针对以上问题，本申请提供一种改善老年痴呆症的复方灵芝组合物及其制备方法。
首先，本发明提供一种改善老年痴呆症的复方灵芝组合物，由以下重量份的原料制备而成：灵芝提取物5份、银杏叶提取物3份，肉苁蓉7份、天麻6份、黄精5份、酸枣仁4份、丹参6份、当归6份。
灵芝：性味甘性平，入心经，能补心血、益心气、治虚劳短气。现代医学表明：灵芝具有抗氧化、抗衰老的生物学功能。
银杏叶：性味甘、苦、涩、平，归心肺经，活血化瘀，通络止痛，益心敛肺，化浊降脂。
肉苁蓉：性温，味甘，入肾，可补肾阳，益精血。《开宝本草》记载肉苁蓉“益血气，黑髭鬓，……久服长筋骨，益精髓，延年不老”，其补肝肾，兼能收敛精气，且不寒、不燥，为“滋补良药”。
天麻：辛，温，无毒，质润多液，平抑肝阳，久服益力气，长阴肥健，轻身增年。
黄精：甘、平。归脾、肺、肾经。具有补脾益气，滋肾填精，养心安神等功效。常用于治疗老年痴呆心脾两虚，肝肾不足，筋骨软弱，食少口干等症，研究表明具有提高超氧化物歧化酶(SOD)、抗氧化、防治动脉硬化、预防心脑血管疾病等作用。
酸枣仁：甘,酸,平，补肝，宁心，剑汗，生津。《别录》记载其“补中，益肝气，坚筋骨，助阴气，令人肥健。
丹参：性微寒，归心、肝经。具有活血祛瘀，通经止痛，清心除烦，凉血消痈，功善活血痛经，祛瘀止痛之功效。《本草正义》记载：“丹参，专入血分，其功在于活血行血，内之达脏腑而化瘀滞”。《本草汇言》记载：“丹参，善治血分，去滞生新，调经顺脉之药也”。
当归：味甘、辛，性温。归肝、心、脾经。补血活血，抗老防老。
本申请经过研究合理上述8味药材配比，具有改善老年痴呆症的效果，可以应用于制备改善老年痴呆症的保健品中。
其次，本申请还提供了上述改善老年痴呆症的复方灵芝组合物的制备方法，包括如下步骤：
S1、按重量份分别取肉苁蓉、天麻、黄精、酸枣仁、丹参、当归混合后粗粉碎(即粉碎至物料粒径为3-6cm)，获得粗粉碎物；加入粗粉碎物6-10倍重量的热水，水煎1h，提取3次，合并提取液，获得水提液；待水提液自然冷却至室温，浓缩至密度为1.20-1.30g/cm3，加入浓度为90-95％的乙醇溶液，使溶液中含醇量达到60-65％，静置醇沉24h后，溶液分层，滤取上清液，减压浓缩至干燥(-0.09Mpa、55℃)，粉碎，过40目筛，获得干燥物；
S2、按重量份取灵芝提取物、银杏叶提取物、S1步骤获得的干燥物混合均匀，即获得该上述改善老年痴呆症的复方灵芝组合物。该组合可添加药学上可以接受的载体或添加剂，以进一步制备成片剂、胶囊、颗粒剂等药学上可以接受的剂型。该复合物推荐日服用量：每日一次，一次3g。
进一步的，上述上述改善老年痴呆症的复方灵芝组合物的制备方法中，所述灵芝提取物是通过如下方法获得的：取干燥灵芝子实体，粗粉碎(即粉碎至物料粒径为3-6cm)，加入6-8倍80-85℃的热水，于80-85℃保温浸泡4h后，再次加热并保持微沸状态(95～102℃)，浸提1h，滤渣重提2次，合并滤液，45-50℃下减压浓缩，喷雾干燥，进风温度控制在180℃，出风温度控制在72℃～76℃，得灵芝提取物。
进一步的，上述改善老年痴呆症的复方灵芝组合物的制备方法中，银杏叶提取物中总黄酮醇苷含量为24.0％(质量百分比)。
本发明的有益效果在于：本发明的灵芝组合物采用纯天然配方，无副作用，能够缓解和治疗老年性痴呆；可缩短Morris水迷宫的逃避潜伏期，对大鼠学习记忆功能有显著的改善作用。
具体实施方式
结合本发明实施例对本发明的制备方法进行清楚完整地描述，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，基于本发明中的实施例的前提下所获得的其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例中，银杏叶提取物购自于浙江尖峰健康科技有限公司，总黄酮醇苷含量为24.0％。
实施例1
以重量份计，本实施例组合物原料组成包括：灵芝提取物5份、银杏叶提取物3份，肉苁蓉7份、天麻6份、黄精5份、酸枣仁4份、丹参6份、当归6份。
其制备步骤如下：
S1、按重量份取肉苁蓉、天麻、黄精、酸枣仁、丹参、当归混合后粗粉碎(即粉碎至物料粒径为3-6cm)，获得粗粉碎物；加入粗粉碎物6倍重量的热水，水煎1h，提取3次，合并提取液，即为水提液；水提液冷却至室温，浓缩至密度为1.26g/cm3，加入浓度为90％的乙醇溶液，使含醇量达到60％，静置醇沉24h后，滤取上清液，减压浓缩至干燥(-0.09Mpa、55℃)，粉碎后过40目筛，即获得干燥物，；
S2、按重量份取灵芝提取物、银杏叶提取物、S1步骤获得的干燥物混合均匀，粉碎过50目筛，获得复方灵芝组合物。
本实施例中，所述灵芝提取物是通过如下方法获得的：取干燥的灵芝子实体(购自黄山云乐灵芝有限公司)，粗粉碎(即粉碎至物料粒径为3-6cm)，加入灵芝子实体8倍重量的热水(85℃)，保温浸泡4h后，再加热保持液体处于微沸状态(95～102℃)，浸提1h，滤渣重提2次，合并滤液，于55℃下减压浓缩，喷雾干燥，进风温度控制在180℃，出风温度控制在75℃，即获得灵芝提取物。
实施例2
以重量份计，本实施例组合物原料组成包括：灵芝提取物4份、银杏叶提取物3份，肉苁蓉6份、天麻6份、黄精5份、酸枣仁7份、丹参6份、当归5份。
制备方法同实施例1。
以下通过对大鼠水迷宫实验对实施例1获得的复方灵芝组合物进行进一步说明：
1、大鼠水迷宫测试试验
1)、实验动物
SD雄性大鼠，体重220±20g，由中国药科大学动物实验室提供，饲料为常规颗粒饲料，饲养条件：空调房间，温度18-24℃，相对湿度70％。将动物在22℃、50％相对湿度和12小时光照-12小时黑暗条件下适应两天，淘汰敏感胆小的大鼠。动物可自由进食和饮水。
2)、模型制备
建立Aβ25～35诱导老年痴呆(AD)大鼠模型，分为正常对照组和模型组。正常对照组侧脑室注射10μl无菌生理盐水，其他各组侧脑室注射老化的Aβ25～35溶液10μl建立AD动物模型。
Aβ25～35老化方法:将2mg Aβ25～35用无菌生理盐水溶解为1mg/ml浓度的储备液，用0.22μmol/L滤膜过滤除菌后置于37℃培养箱中孵育7d，使之老化为纤丝状凝聚态备用。
3)、实验方法
将实验动物随机分组，SD大鼠一组10只，老年痴呆大鼠5组，每组10只。各实验组的给药方案如下：
阴性对照组和模型对照组：灌服蒸馏水，10ml/kg；
阳性药对照组：灌服脑复康200mg/kg；
低剂量组，中剂量组及高剂量组，分别灌服实施例1获得的复方灵芝组合物0.25g/kg(体重)、0.5g/kg、1.0g/kg。灌胃体积为10ml/kg，每天一次，连续灌服7天。
水迷宫测试具体操作方法如下，将水迷宫圆形水池(直径120cm，高度60cm)注入蒸馏水，水深12cm，水温23～25℃。将圆形水池均分为4个象限，每个象限边缘中心即为入水点，将大鼠面向池壁放入水池中，找到平台的时间为逃避潜伏期，若超过60s未能找，则记录逃避潜伏期为60s，同时将大鼠放到平台休息30s。每次测试为3天，前2d为训练记忆期，每日2次，第三天做测试。训练时，按顺时针方向将大鼠从4个入水点面向池壁放入水池中，记录逃避潜伏期，若超过1min则引导至平台上休息10s。第3d测试，记录大鼠从任意入水点进入水迷宫在1min内找到跳台的时间，若超过1min则记录为1min。
各组大鼠分别于建模后，试验进行4d、7d进行水迷宫测试。所有数据用SPSS20.0软件进行单因素方差分析，结果见表1：
表1：大鼠避潜伏期的影响试验(x±s，n＝10)
注:1：与阴性对照组比较:＊P＜0.01；
与模型对照组比较:#P＜0.05，##P＜0.01；
与阳性药对照组比较：Δ)P＜0.05，ΔΔP＜0.01
2：P＜0.05：差异有统计学意义
由上表1可知：与阴性对照组比较，模型对照组逃避潜伏期显著延长(P＜0.01)；
与模型对照组，第4d，中、高剂量组逃避潜伏期明显缩短(P＜0.05，P＜0.01)，第7d，低中高剂量组逃避潜伏期显著缩短(P＜0.05，P＜0.01)；与阳性药对照组相比，低中剂量组在第7天逃避潜伏期明显较短(P＜0.05)，高剂量组在4d、7d，均显著缩短(P＜0.01)。
结论：实施例1获得的组合物可明显缩短模型大鼠逃避潜伏期，可以改善老年痴呆大鼠的记忆功能障碍。本实施例水迷宫试验方法为脑试验的常规方法，具体也参见文献“中国医院药学杂志，1988年11期，脑复康的临床应用，王希明”；或者文献“张璇.脯氨酸羟化酶抑制剂FG-4592对阿尔茨海默病模型的干预作用及机制研究〔D〕上海：上海交通大学，2016”中公开的水迷宫检测方法。
2、毒性试验
1)实验条件
昆明种小白鼠，体重在20±2g，雌雄各半，由中国药科大学动物实验室提供。雌雄各半。实验环境：净化室温度保持在20～25℃；相对湿度保持在45～70％。
实施例1获得的灵芝组合物5.0g，加水搅匀至最大浓度(以不堵塞灌胃针头为限度)，溶剂体积为13.7ml，制备最大给药浓度为0.36g/ml。
最大给药浓度＝组合物质量/溶剂总体积；
2)动物急性毒性试验
取小鼠6只，雌雄各3只，给药前禁食12小时，按545mg/ml的最大给药浓度，按40mL/kg的最大给药体积灌胃给药一次，未求出小鼠半数致死量LD50；
取小鼠6只，雌雄各3只，给药前禁食12小时，按最大给药浓度，按最大给药体积，灌胃给药2次，间隔8小时，观察24小时，6只小鼠表现无异常，无明显中毒反应，最大耐受量(MTD)为28.8g/kg，约为临床日用量的576倍。
MTD＝最大给药浓度×最大给药体积×给药次数；
3)长期毒性试验
雌雄小鼠各半，体重20±2g，分为四组：阴性对照组、低、中、高剂量组，一组10只，雌雄各半，给药前禁食12小时，阴性对照组以20mL/kg灌服生理盐水，低、中、高剂量组，以20mL/kg灌服0.025g/ml、0.075g/ml、0.225g/ml本发明组合物(相当于临床日服用量10倍、30倍、90倍)，每日灌服1次，观察60天。分别于给药前，给药14天，给药30天，给药60天测量小鼠体重，结果见表2。60天后，用颈椎脱臼法处死小鼠，观察内脏变化。
表2：长期毒性试验小鼠体重(x±s，n＝10)
| 组别 | 给药前体重(g) | 14d(g) | 30d(g) | 60d(g) |
| 阴性对照组 | 20.46±1.64 | 28.20±2.83 | 33.84±2.13 | 39.24±2.14 |
| 低剂量组 | 20.45±1.67 | 27.24±1.96 | 34.41±1.81 | 37.96±1.70 |
| 中剂量组 | 19.65±1.63 | 26.44±1.70 | 34.59±2.14 | 38.350±2.45 |
| 高剂量组 | 20.6±1.86 | 27.60±2.31 | 33.88±1.38 | 37.26±1.97 |
各组间比较P＞0.05
相同时间段，各组间小鼠一般状态、行为活动及饮食状况无明显差异，各组间小鼠体重无显著性差异(P＞0.05)。60d后处死解剖：胸腔，腹腔未见异常液体，肠管未见胀气，心、肝、脾、肺、肾等重要脏器未见颜色、形态异常，没有出血点或其它病理改变，胃粘膜颜色红润，无出血点或溃疡，各组间无明显差异。
可见，实施例1获得的灵芝组合物急性毒性试验未求得LD50，最大耐受量(MTD)为28.8g/kg，为临床日服用量的576倍；长期毒性试验，高剂量组相当于日服用量的90倍，60天未见毒性反应，说明本发明组合物的日用量是安全的，长期服用是安全可靠的。
对比例1：
本实施例组合物的原料配比如下：以重量份计，灵芝提取物5份、天麻6份、黄精5份、酸枣仁4份、丹参6份、当归6份；
制备方法：
S1:按比例取天麻、黄精、酸枣仁、丹参、当归粗粉碎，加入6-10倍重量的热水，水煎1h，提取3次，合并提取液，即为水提液；水提液冷却至室温，浓缩至密度为1.26g/cm3，加入浓度为90％的乙醇溶液，使含醇量达到60％，静置醇沉24h后，滤取上清液，减压浓缩至干燥，获得干燥物，粉碎；
S2：按重量份取灵芝提取物(制备方法同实施例1)、S1步骤获得的干燥物混合均匀，粉碎过50目筛，可进一步制备成片剂、胶囊、颗粒剂等。即获得对比例组合物1。
对比例2：
本实施例组合物的原料配比如下：以重量份计，灵芝提取物5份、银杏叶提取物3份、天麻6份、黄精5份、酸枣仁4份、丹参6份、当归6份；
制备方法：
S1:按比例取天麻、黄精、酸枣仁、丹参、当归粗粉碎，加入6-10倍重量的热水，水煎1h，提取3次，合并提取液，即为水提液；水提液冷却至室温，浓缩至密度为1.26g/cm3，加入浓度为90％的乙醇溶液，使含醇量达到60％，静置醇沉24h后，滤取上清液，减压浓缩至干燥，获得干燥物，粉碎；
S2、按重量份取灵芝提取物(制备方法同实施例1)、银杏叶提取物、S1干燥物混合均匀，粉碎过50目筛，即获得对比例组合物2。
对比例3：
本实施例组合物的原料配比如下：以重量份计，灵芝提取物5份、天麻6份、黄精5份、酸枣仁4份、丹参6份、肉苁蓉7份、当归6份。
制备方法：
S1：按比例取肉苁蓉、天麻、黄精、酸枣仁、丹参、当归粗粉碎，加入6-10倍重量的热水，水煎1h，提取3次，合并提取液，即为水提液；水提液冷却至室温，浓缩至密度为1.26g/cm3，加入浓度为90％的乙醇溶液，使含醇量达到60％，静置醇沉24h后，滤取上清液，减压浓缩至干燥，获得干燥物，粉碎；
S2、按重量份取灵芝提取物(制备方法同实施例1)、S1干燥物混合均匀，粉碎过50目筛，即获得对比例组合物3。
通过对大鼠水迷宫实验对对比例1-3，实施例1-2获得的组合物进行进一步验证：
1、实验动物
SD雄性大鼠，18月龄，由中国药科大学动物实验室提供，饲料为颗粒饲料，饲养条件：空调房间，温度18-24℃，相对湿度70％。将动物在22℃、50％相对湿度和12小时光照-12小时黑暗条件下适应两天，淘汰敏感胆小的大鼠。动物可自由进食和饮水。
2、模型制备
Aβ25～35老化方法:将2mg Aβ25～35用无菌生理盐水溶解为1mg/ml浓度的储备液，用0.22μmol/L滤膜过滤除菌后置于37℃培养箱中孵育7d，使之老化为纤丝状凝聚态备用。
建立Aβ25～35诱导老年痴呆(AD)大鼠模型，分为正常对照组和模型组。正常对照组侧脑室注射10μl无菌生理盐水，其他各组侧脑室注射老化的Aβ25～35溶液10μl建立AD动物模型。
3、实验方法
将实验动物随机分组，健康大鼠一组10只，老年痴呆大鼠6组，每组10只。各实验组的给药方案如下：
阴性对照组和模型对照组：灌服蒸馏水；
对比例1、对比例2、对比例3、实施例1、实施例2，分别灌服相应组合物，剂量0.5g/kg，各组灌胃体积为10ml/kg，每日一次，连续灌服7d。
水迷宫测试具体操作方法如下，将水迷宫圆形水池(直径120cm，高度60cm)注入蒸馏水，水深12cm，水温23～25℃。将圆形水池均分为4个象限，每象限边缘中心即为入水点，将大鼠面向池壁放入水池中，找到平台的时间为逃避潜伏期，若超过60s未能找，则记录逃避潜伏期为60s，同时将大鼠放到平台休息30s。每次测试为3天，前2d为训练记忆期，每日2次，第三天做测试。训练时，按顺时针方向将大鼠从4个入水点面向池壁放入水池中，记录逃避潜伏期，若超过1min则引导至平台上休息10s。第3d测试，记录大鼠从任意入水点进入水迷宫在1min内找到跳台的时间，若超过1min则记录为1min。
各组大鼠分别于建模后、试验进行7d进行水迷宫测试。所有数据用SPSS20.0软件进行单因素方差分析，结果见表3。
表3：对比例、实施例组合物对大鼠避潜伏期的影响(x±s，n＝10)
与模型对照组比较:＊P＜0.01；与对比例1、对比例3比较:#P＜0.01；与对比例2、实施例2比较：2)P＜0.05
Aβ造模后，各组大鼠逃避潜伏期比阴性对照组显著延长，各组间无统计学意义(P＞0.05)即造模成功。第7d时，与模型对照组相比，对比例2、实施例1-2大鼠逃避潜伏期皆显著延长(P＜0.01)；实施例2，与对比例1、3相比显著缩短(P＜0.01)；实施例1，与对比例2、实施例2相比大鼠逃避潜伏期明显缩短(P＜0.05)，与对比例1、对比例3相比显著缩短(P＜0.01)。可见，实施例1获得的组合物可缩短Morris水迷宫的逃避潜伏期，对大鼠学习记忆功能有明显的改善作用。
Claims (5)
1.一种改善老年痴呆症的复方灵芝组合物，其特征在于，该组合物包括以下原料，以重量份计：灵芝提取物5份、银杏叶提取物3份，肉苁蓉7份、天麻6份、黄精5份、酸枣仁4份、丹参6份、当归6份。
2.根据权利要求1所述的改善老年痴呆症的复方灵芝组合物，其特征在于，所述银杏叶提取物中，总黄酮醇苷所占质量百分比为24%。
3.如权利要求1-2之一所述改善老年痴呆症的复方灵芝组合物的制备方法，其特征在于，具体步骤如下： 1）分别按重量份取肉苁蓉、天麻、黄精、酸枣仁、丹参、当归混合后粉碎，加入6-10倍重量的热水，水煎1h，提取至少3次，合并提取液，获得水提液；将水提液浓缩至密度为1.20-1.30g/cm3 ，然后加入乙醇溶液，使溶液含醇量达到60-65%，静置后取清液，减压浓缩至干燥，获得干燥物；
分别按重量份取灵芝提取物、银杏叶提取物、S1步骤获得的干燥物混合均匀，即获得所述改善老年痴呆症的复方灵芝组合物。
4.根据权利要求3所述改善老年痴呆症的复方灵芝组合物的制备方法，其特征在于，步骤1）中乙醇溶液浓度为90-95%。
5.根据权利要求3所述改善老年痴呆症的复方灵芝组合物的制备方法，其特征在于，步骤2）中灵芝提取物是通过如下方法获得的：灵芝子实体粉碎后加入6-8倍热水，浸泡4h后，加热并浸提1h，滤渣重提2次，合并滤液，45-50℃减压浓缩，喷雾干燥，即获得灵芝提取物。
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