CN108295198A - 包含蜈蚣草提取物或其部位作为活性成分的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于预防或治疗糖尿病或痴呆的药物组合物，所述药物组合物包含蜈蚣草(Eremochloa ophiuroides)提取物作为活性成分。已经由动物试验确认，蜈蚣草提取物、其部位、以及从所述部位中分离的活性部位有效地对血糖水平进行调节，并且抑制了β‑淀粉样蛋白(Aβ)的活性，所述β‑淀粉样蛋白参与了可能会导致痴呆的淀粉样蛋白斑的形成。因此，所述提取物、其部位、以及从所述部位中分离的活性部位可以有效地在用于预防和治疗糖尿病或痴呆的组合物中、用于预防或改善糖尿病或痴呆的功能食品中、以及用于血糖调节的药物组合物或保健食品中使用。

Description

包含蜈蚣草提取物或其部位作为活性成分的组合物
本申请是申请日为2012年11月26日、发明名称为“包含蜈蚣草提取物或其部位作为活性成分的组合物”的申请号为201280076849.6专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种用于预防或治疗糖尿病或痴呆的药物组合物，所述药物组合物包含蜈蚣草(Eremochloa ophiuroides)提取物或其部位作为活性成分。
背景技术
随着经济的快速发展、生活方式的改善和西式化，很高兴看到在身体方面得以理想地发展，但同时，疾病模式也已经转变为由过度摄入高热量饮食、缺乏运动和伴随着工业社会进步的压力引起的西式化的成人疾病。最具代表性的成人疾病为肝病、高血压、糖尿病、肥胖和高脂血症等。这些代表性的成人疾病之一的糖尿病是一种非传染性慢性疾病，它是由在胰腺β细胞中缺乏胰岛素或胰岛素分泌失常而引起的，从而使得葡萄糖不能用作体内的能量源，并以高浓度保留在血液中，随后在尿液中被排泄。根据病因和用于治疗症状的方法，将糖尿病大致分为以下两组：胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)和非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)。在韩国，至少95％的糖尿病患者是NIDDM患者。糖尿病已经成为严重的社会问题，而这并不是因为该疾病本身是一个严重的问题，而是因为它伴随着并发症(例如糖尿病性神经病、视网膜病变、白内障和肾病)，所述并发症可能成为患者正常生活的障碍，并且进一步引发致命结果。
最常见的抗糖尿病药物主要分成以下两组：口服降糖药和胰岛素注射剂。通常，胰岛素注射剂推荐用于体内胰岛素分泌不足的胰岛素依赖型糖尿病患者、妊娠糖尿病患者、以及难以通过口服降糖药来调节血糖的非胰岛素依赖型糖尿病患者。同时，口服降血糖药推荐用于难以通过饮食疗法和运动对血糖进行调节的非胰岛素依赖型患者。口服降糖药的实例为磺酰脲类药物和双胍类药物。
磺酰脲类药物的实例为格列吡嗪、格列齐特、格列喹酮、格列本脲和氯磺丙脲，磺酰脲类药物起到促进胰腺中胰岛素分泌的作用，但不能将它们用于上述胰岛素依赖型糖尿病患者、尤其是以无胰岛素分泌为特征的患者，并且，其仅可应用于显示出胰岛素分泌相对较弱的非胰岛素依赖型患者。由于所述药物具有生下畸形儿、流产和死胎等风险，其不能用于育龄妇女。大多数磺酰脲类药物在肝脏中代谢，然后通过肾脏排泄，这表明对肾或肝功能不全的患者给药时须慎重考虑。
即使药物机制尚未公开，但已经知晓以二甲双胍为实例的双胍类药物增加了胰腺中胰岛素的分泌。双胍类药物的降血糖作用低于磺酰脲类药物，但引起低血糖症的风险也较低。然而，在治疗的早期阶段，这些药物可能会引起伴有恶心、呕吐、腹泻的消化系统副作用和皮疹等副作用，并且还会引起乳酸性酸中毒(一种可能威胁生命的致命性副作用)。因此，这些药物在美国仅被允许用于实验使用。
由于近来磺酰脲类药物或双胍类药物存在问题或副作用，因此，需要开发一种副作用较少的、更安全的降血糖药剂，可有利地用于对国内或国际日益增加的糖尿病患者进行治疗。
近来的合成抗糖尿病药剂也具有严重的副作用，并引起抗药性、此外还伴有降低的药物作用。因此，已经积极地进行研究，以从天然来源中开发或筛选出具有抗糖尿病活性的新型材料，来取代上述化学合成抗糖尿病药剂的使用。
在正常大脑中，未观察到神经原纤维缠结和淀粉样蛋白斑。然而，在痴呆患者的大脑中，在神经元中形成了神经原纤维缠结，并且在神经细胞外形成了淀粉样蛋白斑。
不仅神经原纤维缠结和淀粉样蛋白斑(这是痴呆的主要原因和特征)的形成参与了痴呆的发展过程，而且遗传因子、例如早老素、β-APP(β-淀粉样前体蛋白)和ApoE(载脂蛋白)及其它因子均参与了痴呆的发展过程。其中，特别是诱导形成淀粉样蛋白斑和神经原纤维缠结的β-淀粉样蛋白和τ蛋白被认为是最重要的因素。β-淀粉样蛋白斑是痴呆(阿尔茨海默氏病)的典型特征之一，其见于神经元之间，是异常β-淀粉样蛋白积聚的结果。在脑神经元中，β-淀粉样蛋白和过度磷酸化τ蛋白的增加可以降低乙酰胆碱(参与记忆和学习的神经递质)的水平。因此，从而使痴呆患者显示出差的记忆力和判断力。痴呆是随年龄发展的、尤其是由神经元的选择性凋亡而引起的神经退行性疾病。
APP(淀粉样前体蛋白)是由位于染色体#21的基因产生的，它是一种在神经胶质细胞和神经母细胞中表达的、属于I型跨膜家族的糖蛋白。作为细胞表面受体，APP对细胞粘附和神经突的生长进行调节，并且还参与了细胞信号传导通路，以促进神经细胞的生长，并对它们进行保护。APP的突变是家族性痴呆(家族性阿尔茨海默氏病)的原因。异常APP介导的Aβ的生成是痴呆的最关键病理步骤。Aβ是分子量为4kD的蛋白，当APP被称为β和γ分泌酶的蛋白酶消化时，产生Aβ。具体而言，对分泌酶降解APP造成影响的早老素(PS)1和PS2的突变或者APP的突变诱导了Aβ的异常积聚。Aβ是在细胞正常代谢过程中产生、然后分泌至细胞外空间的水溶性蛋白。
APP是I型膜蛋白，它在神经元的发育、分化和存活中起到重要作用。在正常的APP代谢中，Aβ的产生被阻止，非淀粉样蛋白途径以进展。此时，被称为分泌酶的蛋白酶首先起作用。APP NTF(sAPPα)和APP CTF(C83)是由α分泌酶产生的，其再被γ分泌酶切割以产生P3，P3是比Aβ更短的肽，并且不沉积在老年斑和APP胞内结构域(AICD)片段中。Aβ是通常在痴呆患者中示出的老年斑的主要成分，为了产生Aβ，APP首先经β分泌酶切割，以产生APPNTF(sAPPβ)和APP CTF(C99)，导致淀粉样蛋白合成途径。预先经β分泌酶消化的APP CTF(C99)现在再次经γ分泌酶切割，并且由此产生的片段沉积在脑组织中，以产生已知用于生成老年斑的Aβ和AICD。
活化的β分泌酶和γ分泌酶增加了Aβ1-42的生成，增加的Aβ40和Aβ42增加了预纤维状聚集体，导致淀粉样蛋白斑(痴呆的原因)的形成。为了克服淀粉样蛋白斑积聚的问题，有必要通过使用天然的生物活性材料，来开发新的抗痴呆药剂。天然生物活性材料是有利的，因为它具有比化学合成材料更少的副作用，并且由于较少的纵向/化学变化使其具有优异的稳定性和安全性。因此，研究均集中在这种显示出对痴呆具有药效的天然植物资源上。
蜈蚣草(Eremochloa ophiuroides)是暖季型草坪草，其生长迟缓并且是匍匐的。这种草是多年生植物，其在大块草坪中生长。蜈蚣草属于禾本科(Poaceae)，其学名为Eremochloa ophiuroides(Munro)Hack。它主要分布在中国、东亚、印度支那、美国东北部、中美洲和加勒比地区。它耐受各种土壤，但特别喜欢低肥力的沙质土壤和潮湿酸性土壤。就其形态特征而言，叶片长15mm～30mm、宽2mm～4mm，并且是扁平的，具有白色中脉。除了凸缘部外，它不具有细毛，并且叶片的尖端是圆的。茎具有压扁的鞘，根为有细枝的匍匐枝。它的花具有3～5英寸的总状花序。这种总状花序是紫色的并且略呈扁平状，并具有两排小穗。这种植物主要用作草坪草或草皮。由于其叶繁盛和好的口感，它也可以用来作为鸟饲料。
研究一直集中在蜈蚣草的预防和治疗肥胖、预防和治疗癌症、防止皮肤老化和肌肤美白等作用。然而，目前并没有任何声明指出蜈蚣草的成分具有何种药效。特别地，蜈蚣草针对糖尿病和痴呆的作用尚未见报道。
在显示出对糖尿病具有优异治疗效果的天然植物的研究过程中，本发明人确证，蜈蚣草提取物、其部位、以及从这些部位中分离的活性片段能有效地对血糖进行调节，从而通过进一步确证蜈蚣草、其部位、以及从其中分离的活性片段可有效地用作新型抗糖尿病药剂，完成了本发明。
本发明人还研究开发出一种用于治疗痴呆的天然植物提取物。其结果是，本发明人确证了蜈蚣草提取物、其部位、以及从这些部位中分离的活性片段在动物模型中能够抑制β-淀粉样蛋白(Aβ)的活性。因此，本发明人提出蜈蚣草提取物、其部位、以及从中分离的活性片段可以作为活性成分有效地在用于预防和治疗痴呆的组合物中使用，从而完成本发明。
发明内容
发明目的
本发明的目的是提供用于预防和治疗糖尿病的组合物，所述组合物包含蜈蚣草(Eremochloa ophiuroides)提取物或其部位作为活性成分。
本发明的另一个目的是提供用于预防和治疗痴呆的药物组合物，所述药物组合物包含蜈蚣草(Eremochloa ophiuroides)提取物作为活性成分。
技术方案
为了达到上述目的，本发明提供了用于预防和治疗糖尿病的组合物，所述组合物包含蜈蚣草(Eremochloa ophiuroides)提取物作为活性成分。
本发明还提供了用于预防和治疗糖尿病的药物组合物，所述药物组合物包含有机溶剂部位作为活性成分，所述有机溶剂部位是通过用有机溶剂再次对所述蜈蚣草提取物进行提取而制备的。
本发明进一步提供了用于预防或改善糖尿病的保健食品，所述保健食品包含蜈蚣草提取物、其部位或活性部位作为活性成分，所述部位是通过用有机溶剂再次对蜈蚣草提取物进行提取而制备的，所述活性部位是通过使用甲醇从蜈蚣草甲醇提取物的乙酸酯部位中提取的。
本发明还提供了用于调节血糖的药物组合物，所述药物组合物包含蜈蚣草提取物作为活性成分。
本发明还提供了用于调节血糖的保健食品，所述保健食品包含蜈蚣草提取物作为活性成分。
本发明还提供了用于预防和治疗痴呆的药物组合物，所述药物组合物包含蜈蚣草(Eremochloa ophiuroides)提取物作为活性成分。
本发明还提供了用于预防和治疗痴呆的药物组合物，所述药物组合物包含有机溶剂部位作为活性成分，所述有机溶剂部位是通过用有机溶剂再次对所述蜈蚣草提取物进行提取而制备的。
本发明还提供了用于预防和改善痴呆的保健食品，所述保健食品包含蜈蚣草提取物作为活性成分。
本发明还提供了用于预防和改善痴呆的保健食品，所述保健食品包含有机溶剂部位作为活性成分，所述有机溶剂部位是通过用有机溶剂再次对所述蜈蚣草提取物进行提取而制备的。
本发明还提供了用于治疗糖尿病的方法，所述方法包括将部位或活性部位给予患有糖尿病的受试者的步骤，所述部位是通过用有机溶剂再次对蜈蚣草提取物进行提取而制备的，所述活性部位是通过使用甲醇从蜈蚣草甲醇提取物的乙酸酯部位中提取的。
本发明还提供了用于预防糖尿病的方法，所述方法包括将蜈蚣草提取物、其部位或活性部位给予受试者的步骤，所述部位是通过用有机溶剂再次对蜈蚣草提取物进行提取而制备的，所述活性部位是通过使用甲醇从蜈蚣草甲醇提取物的乙酸酯部位中提取的。
本发明还提供了蜈蚣草提取物、其部位或活性部位在制备用于预防或治疗糖尿病的药物组合物中的用途，所述部位是通过用有机溶剂再次对蜈蚣草提取物进行提取而制备的，所述活性部位是通过使用甲醇从蜈蚣草甲醇提取物的乙酸酯部位中提取的。
本发明还提供了蜈蚣草提取物、其部位或活性部位在制备用于预防或改善糖尿病的保健食品中的用途，所述部位是通过用有机溶剂再次对蜈蚣草提取物进行提取而制备的，所述活性部位是通过使用甲醇从蜈蚣草甲醇提取物的乙酸酯部位中提取的。
本发明还提供了一种用于调节血糖的方法，所述方法使用了蜈蚣草提取物、其部位或活性部位，所述部位是通过用有机溶剂再次对蜈蚣草提取物进行提取而制备的，所述活性部位是通过使用甲醇从蜈蚣草甲醇提取物的乙酸酯部位中提取的。
本发明还提供了蜈蚣草提取物、其部位或活性部位在制备用于调节血糖的药物组合物中的用途，所述部位是通过用有机溶剂再次对蜈蚣草提取物进行提取而制备的，所述活性部位是通过使用甲醇从蜈蚣草甲醇提取物的乙酸酯部位中提取的。
本发明还提供了蜈蚣草提取物、其部位或活性部位在制备用于调节血糖的保健食品中的用途，所述部位是通过用有机溶剂再次对蜈蚣草提取物进行提取而制备的，所述活性部位是通过使用甲醇从蜈蚣草甲醇提取物的乙酸酯部位中提取的。
本发明还提供了用于治疗痴呆的方法，所述方法包括将蜈蚣草提取物、其部位或活性部位给予患有痴呆的受试者的步骤，所述部位是通过用有机溶剂再次对蜈蚣草提取物进行提取而制备的，所述活性部位是通过使用甲醇从蜈蚣草甲醇提取物的乙酸酯部位中提取的。
本发明还提供了用于预防痴呆的方法，所述方法包括将蜈蚣草提取物、其部位或活性部位给予受试者的步骤，所述部位是通过用有机溶剂再次对蜈蚣草提取物进行提取而制备的，所述活性部位是通过使用甲醇从蜈蚣草甲醇提取物的乙酸酯部位中提取的。
本发明还提供了蜈蚣草提取物、其部位或活性部位在制备用于预防或治疗痴呆的药物组合物中的用途，所述部位是通过用有机溶剂再次对蜈蚣草提取物进行提取而制备的，所述活性部位是通过使用甲醇从蜈蚣草甲醇提取物的乙酸酯部位中提取的。
另外，本发明提供了蜈蚣草提取物、其部位或活性部位在制备用于预防或改善痴呆的保健食品中的用途，所述部位是通过用有机溶剂再次对蜈蚣草提取物进行提取而制备的，所述活性部位是通过使用甲醇从蜈蚣草甲醇提取物的乙酸酯部位中提取的。
有益效果
本发明的蜈蚣草提取物、其部位、或由上述部位中分离的活性部位是无毒性的天然材料，其可有效地对血糖进行调节，从而使得它们可以在用于预防或治疗糖尿病的组合物中使用，或应用于用于预防或治疗糖尿病的保健功能性食品。
在本发明中，确证了蜈蚣草(Eremochloa ophiuroides)提取物及其活性部位在动物试验中抑制了参与淀粉样蛋白斑形成(痴呆的原因)的β-淀粉样蛋白(Aβ)的活性，这表明它们可以有效地作为活性成分在用于预防或治疗痴呆的组合物中使用。
附图说明
图1是示出了本发明的蜈蚣草提取物、其部位、以及从上述部位中分离的活性部位的制备方法的图。
图2是示出了图3中脂肪积聚的数字化值的图。
图3是示出了受蜈蚣草提取物的乙酸乙酯-甲醇部位影响的、通过脂肪细胞的葡萄糖代谢产生的脂肪积聚的图。
图4是示出了在II型糖尿病小鼠中确证的蜈蚣草提取物乙酸乙酯-甲醇部位降血糖活性的图。
图5是示出了在II型糖尿病小鼠中确证的蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位的抗糖尿病活性的图。
图6是示出了在II型糖尿病小鼠中经口服葡萄糖耐量试验确证的血糖水平变化的图。
图7是示出了蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位在1mg/kg和10mg/kg浓度下的口服葡萄糖耐量试验结果的图。
图8是示出了蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位在1mg/kg和10mg/kg浓度下的腹膜内葡萄糖耐量试验结果的图。
图9是示出了在蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位腹膜内给予后通过所实施的口服葡萄糖耐量试验确证的血糖变化的图。
图10是示出了在链唑霉素(STZ)诱导的I性糖尿病模型中通过口服葡萄糖耐量试验确证的血糖变化的图，以对蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位的抗糖尿病活性进行考察。
图11是示出了蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位对β-淀粉样蛋白肽(Aβ1-42)的低聚聚合的抑制作用的图。
图12是示出了蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位对BACE1活性的抑制作用的图。
图13是示出了蜈蚣草乙酸乙酯-100％甲醇部位以剂量依赖性的方式对BACE1活性进行抑制的图。
图14是示出了蜈蚣草乙酸乙酯-70％甲醇部位以剂量依赖性的方式对BACE1活性进行抑制的图。
图15是示出了蜈蚣草乙酸乙酯-50％甲醇部位以剂量依赖性的方式对BACE1活性进行抑制的图。
图16是示出了蜈蚣草乙酸乙酯-70％甲醇部位以剂量依赖性的方式对LDH活性进行抑制的图。
图17是示出了蜈蚣草乙酸乙酯-50％甲醇部位以剂量依赖性的方式对LDH活性进行抑制的图。
图18是示出了蜈蚣草乙酸乙酯-70％甲醇部位以剂量依赖性的方式对ROS的产生进行抑制的图。
图19是示出了蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位对β-淀粉样蛋白的分泌进行抑制的图。
图20是示出了蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位不涉及肝毒性的图。
图21是示出了在用蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位处理的APP/PS1小鼠的脾脏中细胞分裂素mRNA的表达的图。
图22是示出了在用蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位处理的APP/PS1小鼠中免疫球蛋白的表达的图。
图23是示出了在用蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位处理的APP/PS1小鼠中免疫球蛋白(IgG和IgM)的表达的图。
图24是示出了在用蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位处理的APP/PS1小鼠中细胞因子(IL-2、IL-4和IL-10)的表达的图。
图25是示出了在用蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位处理的APP/PS1小鼠中Aβ的表达的图。
图26是示出了在用蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位处理的小鼠的海马体中通过强细胞死亡信号确证的、在脑组织中细胞凋亡的抑制的图。
图27是示出了在用蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位处理的小鼠的皮质中通过强细胞死亡信号确证的、对进行性退化的抑制作用的图。
图28是示出了由使用Aβ抗体的免疫组织化学试验确证的、在用蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇处理的小鼠和APP小鼠的海马体中Aβ的减少的图。
图29是示出了由使用Aβ抗体的免疫组织化学试验确证的、在用蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇处理的小鼠和APP小鼠的皮质中Aβ的减少的图。
具体实施方式
以下将对本发明进行详细说明。
本发明提供了用于预防和治疗糖尿病的组合物，所述组合物包含蜈蚣草(Eremochloa ophiuroides)提取物作为活性成分。
所述蜈蚣草提取物优选通过以下制备方法进行制备，所述制备方法包括以下步骤，但不总限于此：
1)通过加入提取溶剂对蜈蚣草进行提取；
2)将在步骤1)中获得的提取物进行冷却并过滤；以及
3)在减压下对步骤2)中过滤的提取物进行浓缩。
在上述方法中，步骤1)的蜈蚣草是栽培的或购买的。可以使用蜈蚣草的叶、茎或根，但更优选叶。
在上述制备方法中，步骤1)的提取溶剂优选为水、醇或上述物质的混合物。所述醇优选为C1～C2低级醇。本文所述的低级醇优选为乙醇或甲醇、更优选甲醇，但不总限于此。所述提取的方法优选振摇提取或回流提取，但不总限于此。提取溶剂以所述蜈蚣草总体积的2～10倍、更优选以10倍的体积加入到干燥的蜈蚣草中，但不总限于此。提取温度优选为50℃～120℃、更优选40℃～45℃，但不总限于此。提取时间优选为2～5天，但不总限于此。并且所述提取优选重复1～3次，但不总限于此。
在该方法中，步骤3)的减压下浓缩优选通过使用真空浓缩器或真空旋转蒸发仪进行，但不总限于此。减压下浓缩的温度优选为20℃～60℃、更优选45℃～55℃，但不总限于此。优选通过减压干燥、真空干燥、沸腾干燥、喷雾干燥或冷冻干燥进行干燥，但不总限于此。冷冻干燥优选在-50℃至-100℃、更优选在-70℃下进行，但不总限于此。
在上述方法中，蜈蚣草提取物优选通过热水提取进行制备，但不总限于此。
本发明还提供了用于预防和治疗糖尿病的组合物，所述组合物包含有机溶剂部位作为活性成分，所述有机溶剂部位是通过用有机溶剂再次对所述蜈蚣草提取物进行提取而制备的。
所述蜈蚣草提取物的部位或由上述部位中分离的活性部位可优选通过包括以下步骤的方法进行制备，但不总限于此：
1)通过将有机溶剂加入至蜈蚣草提取物中来制备所述有机溶剂部位；以及
2)通过用步骤1)的部位进行柱层析来制备所述活性部位。
在上述方法中，步骤1)中的有机溶剂优选正己烷或乙酸乙酯，但不总限于此。
在上述方法中，所述有机溶剂部位优选为从蜈蚣草甲醇提取物的再次提取中获得的乙酸乙酯部位。准确地说，用正己烷对所述蜈蚣草甲醇提取物进行提取，并弃去可溶层。然后，通过使用乙酸乙酯对剩余的水层进行提取。然而，所述部位并不限于此。
在上述方法中，对于所述活性部位的分离和纯化，可使用选自于由以下填料所组成的组中的填料进行步骤2)的柱层析：硅胶、葡聚糖凝胶(sephadex)、RP-18、聚酰胺、Toyopearl和XAD树脂。如果需要的话，填充有适当的填料的柱层析可以重复进行数次。
在上述方法中，可以将步骤2)的蜈蚣草提取物的乙酸乙酯部位再次装样至柱层析上，从而可通过使用甲醇作为洗脱溶剂来对所述活性部位进行分离。此时，所述甲醇优选20％～70％的甲醇。特别地，本发明人将蜈蚣草乙酸乙酯部位装样至Flex-ColumTM(3cm×25cm)和Toyoperarl HW-40(75μm)柱色谱上，向其中加入20％、50％或70％的甲醇作为洗脱溶剂。其结果是，获得了乙酸乙酯-20％甲醇活性部位、乙酸乙酯-50％甲醇活性部位和乙酸乙酯-70％甲醇活性部位。
为了考察蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位在脂肪细胞中将葡萄糖转化为脂肪，本发明人首先通过使用脂肪细胞细胞系(3T3-L1前体脂肪细胞细胞系)对乙酸乙酯-50％甲醇部位和乙酸乙酯-70％甲醇部位是否能够增加脂肪细胞的葡萄糖吸收进行了研究。其结果是，参照用低浓度胰岛素处理的组作为标准，在用100μg/ml乙酸乙酯-50％甲醇部位处理的组中，脂肪在脂肪细胞中的积聚增加了约300％(参见图2和图3)。还在II型糖尿病小鼠(db/db小鼠)中，对从蜈蚣草提取物中获得的部位的降血糖活性进行了考察。其结果是，用蜈蚣草乙酸乙酯-50％甲醇部位和乙酸乙酯-70％甲醇部位处理10天的组的血糖比糖尿病诱导模型中的血糖降低了70％～80％。当停止对样品进行处理时，小鼠血糖水平开始再次上升(参见图4)。进行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)以对蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位的作用进行考察。其结果是，与对照组相比，用蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位处理的组中的快速血糖增加被抑制了约25％，并且150分钟后，与对照组相比，降血糖作用增强了60％(参见图5和图6)。这次蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位在不同剂量下进行口服葡萄糖耐量试验。其结果是，与对照组相比，用蜈蚣草乙酸乙酯-50％甲醇部位处理的组显示出在给予60分钟后，血糖的快速上升被高剂量部位抑制在40％水平，并且被低剂量部位保持在60％的水平(参见图7)。在此期间，用不同剂量的蜈蚣草乙酸乙酯-50％甲醇部位进行腹膜内葡萄糖耐量试验(IPGTT)。其结果是，与对照组相比，用高浓度和低浓度蜈蚣草乙酸乙酯-50％甲醇部位处理的组显示出，2小时后降血糖作用增加了约80％(参见图8)。在将蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位经腹膜内给予小鼠后，进行了口服葡萄糖耐量试验。4.5小时后，对照组小鼠的血糖值维持在400mg/dL以上水平，但用蜈蚣草乙酸乙酯-50％甲醇部位处理的组的血糖值降低至250mg/dL以下水平。这一结果表明，与对照组相比，实验组的降血糖作用增加了约60％(参见图9)。在链唑霉素(STZ)诱导的I型糖尿病模型中，对蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位的抗糖尿病活性进行了考察。其结果是，用蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位处理的组的血糖水平从给予后4.5小时的时间点起，降低至正常组的水平。然而，即使在6小时后，对照组的血糖值仍维持高水平，准确地说，比正常组高出150mg/dL。与对照组相比较，在给予葡萄糖6小时后，用蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位处理的组的血糖水平降低了100％(参见图10)。
因此，确证了蜈蚣草提取物、其部位、以及从这些部位中分离的活性部位能够有效地对血糖进行调节，从而使得它们可以有利地在用于预防和治疗糖尿病的组合物、用于预防和改善糖尿病的保健功能食品、用于调节血糖的药物组合物以及用于调节血糖的保健食品中使用。
根据本发明的用于预防和治疗糖尿病的药物组合物，所述糖尿病优选I型糖尿病或II型糖尿病，但不总限于此。
本发明还提供了用于调节血糖的药物组合物，所述药物组合物包含蜈蚣草提取物作为活性成分。
所述蜈蚣草提取物是通过用水、C1～C2低级醇或上述物质的混合物对蜈蚣草进行提取而制备的，但不总限于此。
所述低级醇优选为乙醇或甲醇，但不总限于此。
所述蜈蚣草提取物优选通过热水提取而制备，但不总限于此。
本发明还提供了用于预防或改善糖尿病的保健食品，所述保健食品包含蜈蚣草(Eremochloa ophiuroides)提取物作为活性成分。
对于含有活性部位作为活性成分的组合物而言还优选的是，所述活性部位是通过柱层析从由蜈蚣草提取物获得的部位中分离的。
在本发明的用于预防或改善糖尿病的保健食品中，所述糖尿病优选I型糖尿病或II型糖尿病，但不总限于此。
本发明还提供了用于调节血糖的保健食品，所述保健食品包含蜈蚣草(Eremochloa ophiuroides)提取物作为活性成分。
本发明的药物组合物几乎没有毒性和副作用，因此即使长期给予也是安全的。
根据本领域技术人员公知的常规方法，将蜈蚣草提取物、其部位、或从所述部位中分离的活性部位以其本身或与其它食品成分混合加入至本发明的保健食品中。
未对本文的食品进行限制。例如，可以将蜈蚣草提取物、其部位、或从所述部位中分离的活性部位加入至肉、香肠、面包、巧克力、糖果、零食(snacks)、饼干、比萨饼、泡面(ramyuns)、面制品、口香糖、包括冰淇淋在内的乳制品、汤、饮料(beverages)、茶、饮品(drink)、酒精饮品和维生素复合物等，并且在广泛的意义上，可以包括几乎每一种适用于生产保健食品的食品。
本发明的药物组合物还可以包含任何普通的赋形剂、崩解剂、甜味剂、润滑剂和香精。所述组合物可以通过常规方法配制成片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、悬浮剂、乳剂、糖浆剂及其它溶液的形式。
具体而言，本发明的药物组合物可以配制为用于口服给予，例如片剂、锭剂(troches)、糖锭(lozenges)、可溶性或不溶性悬浮剂、粉剂、颗粒剂、乳剂、硬胶囊或软胶囊、糖浆或酏剂。对于所述制剂，可以包含：粘合剂，例如乳糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、支链淀粉、纤维素或明胶；赋形剂，例如磷酸二钙；崩解剂，例如玉米淀粉或甘薯淀粉；以及润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酰富马酸钠或聚乙二醇蜡。对于胶囊剂的制备，还可以包含液体载体，例如脂肪油。
本发明的药物组合物可通过口服或胃肠外给予，所述胃肠外给予包括皮下注射、静脉内注射、肌内注射和胸腔内注射。为了将所述组合物制备为用于胃肠外给予的制剂，将本发明的蜈蚣草提取物、其部位、或者从所述部位中分离的活性部位与稳定剂或缓冲剂混合，以制成溶液或悬浮液，然后将其配制成安瓿或小瓶。
本发明的药物组合物的有效剂量可以由本领域技术人员根据活性成分的吸收性、灭活速率、排泄速率、年龄、性别、健康状况和疾病的严重程度来确定。在口服给予的情况下，可将所述药物组合物以每天0.0001mg/kg～500mg/kg、更优选每天0.001mg/kg～100mg/kg的剂量给予成年人。给予频率为一天一次或一天数次。
本发明还提供了用于预防和治疗痴呆的药物组合物，所述药物组合物包含蜈蚣草(Eremochloa ophiuroides)提取物作为活性成分。
所述蜈蚣草提取物是通过用水、C1～C2低级醇或上述物质的混合物对蜈蚣草进行提取而制备的，但不总限于此。
本文的低级醇优选乙醇或甲醇，但不总限于此。
蜈蚣草提取物优选通过热水提取而制备，但不总限于此。
本发明还提供了用于预防和治疗痴呆的药物组合物，所述药物组合物包含有机溶剂部位作为活性成分，所述有机溶剂部位是通过用有机溶剂再次对蜈蚣草提取物进行提取而制备的。
本文所述有机溶剂优选正己烷或乙酸乙酯，但不总限于此。
所述有机溶剂部位优选为通过以下方法制备的乙酸乙酯部位，但不总限于此：用正己烷再次对蜈蚣草的甲醇提取物进行提取；弃去可溶层；以及用乙酸乙酯对剩余的水层进行提取。
所述组合物优选包含通过使用甲醇对蜈蚣草甲醇提取物的乙酸乙酯部位进行再次提取而制备的活性部位，但不总限于此。
本文的甲醇优选为20％～70％的甲醇，但不总限于此。
所述痴呆优选选自于由以下疾病组成的组：阿尔茨海默氏病、血管性痴呆、酒精性痴呆、帕金森氏病、路易体痴呆、皮克氏病、克雅病和亨廷顿氏病，但不总限于此。
本发明人对蜈蚣草提取物或其部位对Aβ(1-42)肽低聚-聚合(oligo-polymerization)的抑制进行了考察。其结果是，Aβ肽在未使用蜈蚣草提取物处理的对照组中聚集，而Aβ的低聚-聚合在用蜈蚣草提取物处理的组中受到抑制(参见图11)。还对蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位对BACE1活性的抑制进行了考察。其结果是，蜈蚣草提取物乙酸乙酯-50％甲醇部位、乙酸乙酯-70％甲醇部位和乙酸乙酯-100％甲醇部位均抑制了BACE1活性(参见图12)。对蜈蚣草提取物乙酸乙酯-100％甲醇部位对BACE1活性的抑制进行了考察。其结果是，确证了所述乙酸乙酯-100％甲醇部位抑制了BACE1活性(参见图13)。还对蜈蚣草乙酸乙酯-70％甲醇部位是否能抑制BACE1活性进行了考察，结果确证，该部位也抑制了反应样品中BACE1的活性(参见图14)。对蜈蚣草乙酸乙酯-50％甲醇部位对BACE1活性的抑制进行了考察，其结果是，确证该部位抑制了BACE1的活性(参见图15)。
还对蜈蚣草乙酸乙酯-70％甲醇部位是否具有抑制痴呆诱导酶(dementiainducing enzyme)活性的作用进行了考察。其结果是，确证了该部位显著抑制由β-淀粉样蛋白诱导的细胞毒性(参见图16)。还对蜈蚣草乙酸乙酯-50％甲醇部位对痴呆相关的酶活性的抑制作用进行了考察。其结果是，所述乙酸乙酯-50％甲醇部位显著抑制了由β-淀粉样蛋白引起的细胞毒性(参见图17)。进一步考察了蜈蚣草提取物乙酸乙酯-50％甲醇部位是否能够抑制活性氧(ROS)，活性氧(ROS)是痴呆的另一个原因。其结果是，所述乙酸乙酯-50％甲醇部位显著抑制了由β-淀粉样蛋白诱导的活性氧物质的产生(参见图18)。
在过度表达BACE1(产生APP的酶)的细胞和β-淀粉样蛋白诱导的痴呆中，对β-淀粉样蛋白的分泌是否受到蜈蚣草提取乙酸乙酯-甲醇部位的影响进行了考察。其结果是，所述蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位降低了BACE1的活性，这表明减少了β-淀粉样蛋白的产生(参见图19)。用蜈蚣乙酸乙酯-甲醇部位对APP/PS1小鼠进行处理，随后进行肝毒性考察。其结果是，在对照APP小鼠中的AST、ALT和ALP水平与用蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位处理的实验组小鼠的水平没有太大的不同，这表明这些水平均在正常范围内。因此，确证了蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位没有造成肝毒性(参见图20)。为了测量细胞因子基因mRNA在APP小鼠和用蜈蚣乙酸乙酯-甲醇部位处理的小鼠中的表达，首先测量了IL-1α、IFN-g和IL-6 mRNA在对照APP小鼠的脾脏中的表达。其结果是，在用蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位处理的实验组小鼠的脾脏中，IL-1α、IFN-g和IL-6 mRNA的水平高于对照APP小鼠(参见图21)。在对照APP小鼠中和用蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位处理的小鼠中均通过酶免疫分析法对免疫活性、细胞因子活性以及INF-1β、IFN-γ和β-淀粉样蛋白(Aβ)的表达进行了测量。其结果是，用蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位处理的实验组小鼠的上述活性和水平都更高(参见图22)。更具体而言，在用蜈蚣草乙酸乙酯-50％甲醇部位、蜈蚣草乙酸乙酯-70％甲醇部位和蜈蚣草乙酸乙酯-100％甲醇部位处理的各组中，细胞因子水平均较高，这表明在用蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位处理的上述组中的免疫活性更高(参见图23)。另外，在用蜈蚣草乙酸乙酯-50％甲醇部位、蜈蚣草乙酸乙酯-70％甲醇部位和蜈蚣草乙酸乙酯-100％甲醇部位处理的上述组中的INF-1β和INF-γ水平均显著高于对照APP小鼠(参见图24)，但用蜈蚣草乙酸乙酯-50％甲醇部位、蜈蚣草乙酸乙酯-70％甲醇部位和蜈蚣草乙酸乙酯-100％甲醇部位处理的上述组中的β-淀粉样蛋白的水平则低于对照APP小鼠的水平(参见图25)。
用蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位对试验动物进行处理，随后进行H-E染色。其结果是，与APP小鼠相比，在用蜈蚣草乙酸乙酯-50％甲醇部位和蜈蚣草乙酸乙酯-100％甲醇部位处理的小鼠的海马体中强烈地观察到细胞死亡信号，这表明在脑组织中的细胞凋亡受到抑制(参见图26)。与APP小鼠相比，在用蜈蚣草乙酸乙酯-50％甲醇部位和蜈蚣草乙酸乙酯-100％甲醇部位处理的小鼠的皮质中也强烈地观察到细胞死亡信号，这表明进行性退化受到抑制(参见图27)。
用蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位对试验动物进行处理，随后进行免疫组织化学分析。其结果是，在用蜈蚣草乙酸乙酯-50％甲醇和乙酸乙酯-100％甲醇部位处理的组中Aβ显著减少(参见图28)。更具体而言，在分别用蜈蚣草乙酸乙酯-50％甲醇部位、蜈蚣草乙酸乙酯-70％甲醇部位和蜈蚣草乙酸乙酯-100％甲醇部位处理的小鼠中，Aβ均显著减少，这表明蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位可以减少β-淀粉样蛋白在大脑皮质中的积聚(参见图29)。
因此，确证了蜈蚣草提取物、其部位、以及从所述部位中分离的活性部位在动物试验中具有Aβ活性抑制作用，因此，它们可以有效地在用于预防和治疗痴呆的组合物中和用于预防或改善痴呆的保健食品中使用。
本发明的药物组合物几乎没有毒性和副作用，因此即使长期给予也是安全的。
本发明的药物组合物还可以包含任何普通的赋形剂、崩解剂、甜味剂、润滑剂和香精。所述组合物可以通过常规方法配制成片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、悬浮剂、乳剂、糖浆剂及其它溶液的形式。
具体而言，本发明的药物组合物可以配制为用于口服给予，例如片剂、锭剂(troches)、糖锭(lozenges)、可溶性或不溶性悬浮剂、粉剂、颗粒剂、乳剂、硬胶囊或软胶囊、糖浆或酏剂。对于所述制剂，可以包含：粘合剂，例如乳糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、支链淀粉、纤维素或明胶；赋形剂，例如磷酸二钙；崩解剂，例如玉米淀粉或甘薯淀粉；以及润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酰富马酸钠或聚乙二醇蜡。对于胶囊剂的制备，还可以包含液体载体，例如脂肪油。
本发明的药物组合物可通过口服或胃肠外给予，所述胃肠外给予包括皮下注射、静脉内注射、肌内注射和胸腔内注射。为了将所述组合物制备为用于胃肠外给予的制剂，将本发明的蜈蚣草提取物、其部位、或者从所述部位中分离的活性部位与稳定剂或缓冲剂混合，以制成溶液或悬浮液，然后将其配制成安瓿或小瓶。
本发明的药物组合物的有效剂量可以由本领域技术人员根据活性成分的吸收性、灭活速率、排泄速率、年龄、性别、健康状况和疾病的严重程度来确定。在口服给予的情况下，可将所述药物组合物以每天0.0001mg/kg～500mg/kg、更优选每天0.001mg/kg～100mg/kg的剂量给予成年人。给予频率为一天一次或一天数次。
本发明还提供了用于预防和改善痴呆的保健食品，所述保健食品包含蜈蚣草(Eremochloa ophiuroides)提取物作为活性成分。
所述蜈蚣草提取物是通过用水、C1～C2低级醇或上述物质的混合物对蜈蚣草进行提取而制备的，但不总限于此。
本文的低级醇优选乙醇或甲醇，但不总限于此。
蜈蚣草提取物优选通过热水提取而制备，但不总限于此。
本发明还提供了用于预防和改善痴呆的保健食品，所述保健食品包含有机溶剂部位作为活性成分，所述有机溶剂部位是通过用有机溶剂再次对蜈蚣草提取物进行提取而制备的。
本文所述有机溶剂优选正己烷或乙酸乙酯，但不总限于此。
所述组合物优选包含通过使用甲醇对蜈蚣草甲醇提取物的乙酸乙酯部位再次进行提取而制备的活性部位，但不总限于此。
所述痴呆优选选自于由以下疾病组成的组：阿尔茨海默氏病、血管性痴呆、酒精性痴呆、帕金森氏病、路易体痴呆、皮克氏病、克雅病和亨廷顿氏病，但不总限于此。
根据本领域技术人员公知的常规方法，将蜈蚣草提取物、其部位、或从所述部位中分离的活性部位以其本身或与其它食品成分混合加入至本发明的保健食品中。
未对本文的食物进行限制。例如，可以将蜈蚣草提取物、其部位、或从所述部位中分离的活性部位加入至肉、香肠、面包、巧克力、糖果、零食(snacks)、饼干、比萨饼、泡面(ramyuns)、面制品、口香糖、包括冰淇淋在内的乳制品、汤、饮料(beverages)、茶、饮品(drink)、酒精饮品和维生素复合物等，并且在广泛的意义上，可以包括几乎每一种适用于生产保健食品的食品。
本发明还提供了用于治疗糖尿病的方法，所述方法包括将部位或活性部位给予患有糖尿病的受试者的步骤，所述部位是通过用有机溶剂再次对蜈蚣草提取物进行提取而制备的，所述活性部位是通过使用甲醇从蜈蚣草甲醇提取物的乙酸酯部位中提取的。
本发明还提供了预防糖尿病的方法，所述方法包括将蜈蚣草提取物、其部位或活性部位给予受试者的步骤，所述部位是通过用有机溶剂再次对蜈蚣草提取物进行提取而制备的，所述活性部位是通过使用甲醇从蜈蚣草甲醇提取物的乙酸酯部位中提取的。
本发明还提供了蜈蚣草提取物、其部位或活性部位在制备用于预防或治疗糖尿病的药物组合物中的用途，所述部位是通过用有机溶剂再次对蜈蚣草提取物进行提取而制备的，所述活性部位是通过使用甲醇从蜈蚣草甲醇提取物的乙酸酯部位中提取的。
本发明还提供了蜈蚣草提取物、其部位或活性部位在制备用于预防或改善糖尿病的保健食品中的用途，所述部位是通过用有机溶剂再次对蜈蚣草提取物进行提取而制备的，所述活性部位是通过使用甲醇从蜈蚣草甲醇提取物的乙酸酯部位中提取的。
本发明还提供了用于调节血糖的方法，所述方法使用了蜈蚣草提取物、其部位或活性部位，所述部位是通过用有机溶剂再次对蜈蚣草提取物进行提取而制备的，所述活性部位是通过使用甲醇从蜈蚣草甲醇提取物的乙酸酯部位中提取的。
本发明还提供了蜈蚣草提取物、其部位或活性部位在制备用于调节血糖的药物组合物中的用途，所述部位是通过用有机溶剂再次对蜈蚣草提取物进行提取而制备的，所述活性部位是通过使用甲醇从蜈蚣草甲醇提取物的乙酸酯部位中提取的。
本发明还提供了蜈蚣草提取物、其部位或活性部位在制备用于调节血糖的保健食品中的用途，所述部位是通过用有机溶剂再次对蜈蚣草提取物进行提取而制备的，所述活性部位是通过使用甲醇从蜈蚣草甲醇提取物的乙酸酯部位中提取的。
本发明还提供了用于治疗痴呆的方法，所述方法包括将蜈蚣草提取物、其部位或活性部位给予患有痴呆的受试者的步骤，所述部位是通过用有机溶剂再次对蜈蚣草提取物进行提取而制备的，所述活性部位是通过使用甲醇从蜈蚣草甲醇提取物的乙酸酯部位中提取的。
本发明还提供了用于预防痴呆的方法，所述方法包括将蜈蚣草提取物、其部位或活性部位给予受试者的步骤，所述部位是通过用有机溶剂再次对蜈蚣草提取物进行提取而制备的，所述活性部位是通过使用甲醇从蜈蚣草甲醇提取物的乙酸酯部位中提取的。
本发明还提供了蜈蚣草提取物、其部位或活性部位在制备用于预防或治疗痴呆的药物组合物中的用途，所述部位是通过用有机溶剂再次对蜈蚣草提取物进行提取而制备的，所述活性部位是通过使用甲醇从蜈蚣草甲醇提取物的乙酸酯部位中提取的。
另外，本发明提供了蜈蚣草提取物、其部位或活性部位在制备用于预防或改善痴呆的保健食品中的用途，所述部位是通过用有机溶剂再次对蜈蚣草提取物进行提取而制备的，所述活性部位是通过使用甲醇从蜈蚣草甲醇提取物的乙酸酯部位中提取的。
实施例
本发明的实际且目前优选的实施方式如下列实施例所示加以说明。
然而，可以理解的是，本领域技术人员在考虑本公开文本的基础上，可以在本发明的精神和范围内进行修改和改进。
实施例1：蜈蚣草提取物的制备
<1-1>蜈蚣草甲醇提取物的制备
蜈蚣草种子购自于Fukukaen Nursery和Blub Co.Ltd，日本，将其种植在AdvancedRadiation Technology Institute，Korea Atomic Energy Research Institute，Jeongeup，韩国。从种植的蜈蚣草中对叶片进行收集。将所得到的叶片在-80℃下保存。将5kg蜈蚣草叶片与20L 100％的甲醇(MeOH)进行混合，并在混合器中对该混合物进行研磨。在室温下放置3天以促使沉淀。在50℃下，将得到的提取物在减压下浓缩。其结果是，制备了210g蜈蚣草甲醇提取物。
<1-2>蜈蚣草乙醇提取物的制备
蜈蚣草种子购自于Fukukaen Nursery和Blub Co.Ltd，日本，将其种植在AdvancedRadiation Technology Institute，Korea Atomic Energy Research Institute，Jeongeup，韩国。从种植的蜈蚣草中对叶片进行收集。将所得到的叶片在-80℃下保存。将5kg蜈蚣草叶片与20L 100％的乙醇(EtOH)进行混合，并在混合器中对该混合物进行研磨。在室温下放置3天以促使沉淀。在50℃下，将得到的提取物在减压下浓缩。其结果是，制备了203g蜈蚣草乙醇提取物。
<1-3>蜈蚣草水提取物的制备
蜈蚣草种子购自于Fukukaen Nursery和Blub Co.Ltd，日本，将其种植在AdvancedRadiation Technology Institute，Korea Atomic Energy Research Institute，Jeongeup，韩国。从种植的蜈蚣草中对叶片进行收集。将所得到的叶片在-8℃下保存。将5kg蜈蚣草叶片与20L水进行混合，并在混合器中对该混合物进行研磨。在室温下放置3天以促使沉淀。在50℃下，将得到的提取物在减压下浓缩。其结果是，制备了198g蜈蚣草水提取物。
<1-4>蜈蚣草热水提取物的制备
蜈蚣草种子购自于Fukukaen Nursery和Blub Co.Ltd，日本，将其种植在AdvancedRadiation Technology Institute，Korea Atomic Energy Research Institute，Jeongeup，韩国。从种植的蜈蚣草中对叶片进行收集。将所得到的叶片在-8℃下保存。将40g蜈蚣草叶片与40L水进行混合，然后在90℃下沉淀6小时。其结果是，制备了87g蜈蚣草热水提取物。
实施例2：蜈蚣草部位的制备
根据极性，使用有机溶剂对实施例<1-1>中得到的蜈蚣草甲醇提取物进行分级分离。
<2-1>正己烷部位的制备
首先，如图1所示，在减压下对蜈蚣草100％甲醇提取物进行浓缩，将其悬浮于水中，使用正己烷(低极性溶剂)进行提取。
<2-2>乙酸乙酯部位的制备
用乙酸乙酯(EtOAc)再次对在实施例<2-1>中得到的正己烷部位的水层进行分级分离。
<2-3>水部位的制备
在使用正己烷和乙酸乙酯完成分级分离后，如实施例<2-2>所述，通过使用水最后获得可溶性部位。将各溶剂提取部位在减压下浓缩，然后干燥。其结果是，得到了水部位(21g)。
实施例3：蜈蚣草活性部位的制备
<3-1>乙酸乙酯-20％甲醇部位的制备
将实施例2中得到的乙酸乙酯部位与用作洗脱溶剂的20％甲醇进行混合，然后使用Flex-ColumTM(3cm×25cm)和Toyoperarl HW-40(75μm)进行柱层析。其结果是，得到了9.41g乙酸乙酯-20％甲醇活性部位。
<3-2>乙酸乙酯-50％甲醇部位的制备
将实施例2中得到的乙酸乙酯部位与用作洗脱溶剂的50％甲醇进行混合，然后使用Flex-ColumTM(3cm×25cm)和Toyoperarl HW-40(75μm)进行柱层析。其结果是，得到了5.74g乙酸乙酯-50％甲醇活性部位。
<3-3>乙酸乙酯-70％甲醇部位的制备
将实施例2中得到的乙酸乙酯部位与用作洗脱溶剂的70％甲醇进行混合，然后使用Flex-ColumTM(3cm×25cm)和Toyoperarl HW-40(75μm)进行柱层析。其结果是，得到了1g乙酸乙酯-70％甲醇活性部位。
<3-4>乙酸乙酯-30％甲醇部位和乙酸乙酯-70％甲醇部位的组分分析
在乙酸乙酯-30％甲醇部位和乙酸乙酯-70％甲醇部位中，特别对masyin及其衍生物的含量进行分析。具体而言，将20μl样品溶液装样至Agilent Technologies 1200系列HPLC中，并且将1％甲酸(溶液A)和100％甲醇(溶液B)的混合物用作流动相。流动相进行合并步骤；线性梯度100:0(溶液A:B)至50:50持续30分钟；然后，线性梯度50:50至0:100持续60分钟，以对该部位中的组分进行洗脱。流速为0.5ml/min，在OD360处对洗脱的化合物进行检测。洗脱的maysin及其衍生物的含量示于表1中。
表1
实验实施例1：蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位在脂肪细胞中将葡萄糖转化为脂肪
本发明人通过使用3T3-L1前体脂肪细胞系，对乙酸乙酯-50％甲醇部位和乙酸乙酯-70％甲醇部位是否能够增加脂肪细胞的葡萄糖吸收进行了考察。具体而言，所述前体脂肪细胞系购自American Type Culture Collect(ATCC)。将前体脂肪细胞(3T3-L1)以1×106个细胞/孔的密度分布在6孔板中，接着在CO2培养箱中培养24小时，直至融合达到90％。弃去培养基，并且加入另一种有助于增加脂肪细胞分化的培养基，接着诱导脂肪细胞分化，持续48小时。上述有助于增加脂肪细胞分化的培养基为补充有10％FBS、0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、10nm/ml胰岛素和1μM地塞米松的DMEM。一旦3T3-L1细胞分化成脂肪细胞，分别用蜈蚣草粗提物、阴性对照、乙酸乙酯-50％甲醇部位和乙酸乙酯-70％甲醇部位在补充有低浓度胰岛素的培养基中对脂肪细胞进行处理。当葡萄糖流入脂肪细胞时，它经糖代谢以脂肪的形式进行积聚。此时，通过Oil-Red-O染色对积聚的脂肪的量进行测定。Oil-Red-O染色溶液为脂肪(特别是在脂肪细胞中)特异性试剂，可以对来自葡萄糖降解而生物合成的脂肪进行染色。所以，这种试剂有利地用于每个样品中脂肪生成的分析。通过使用异丙醇对红色染色溶液进行提取，接着在OD490下进行测量。
其结果是，与用低浓度胰岛素处理的组相比，在用100μg/ml乙酸乙酯-50％甲醇部位处理的组的脂肪细胞中，脂肪的积聚增加了大约至少300％。这一结果表明，乙酸乙酯-50％甲醇部位增加了葡萄糖流入脂肪细胞中(图2和图3)。
实验实施例2：蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位对试验动物的降血糖作用
用II型糖尿病小鼠(db/db小鼠)对蜈蚣草提取物部位的降血糖活性进行了考察。使用C57BL/6小鼠作为正常对照组，并使用C57BLKS/J-db/db小鼠作为糖尿病诱导的小鼠组。这两种动物均经由Central Lab Animal Inc.购自SLC Co.(日本)，并且在购买时，所述动物为7周龄。抵达动物实验室后，使这些动物在22℃、50％湿度条件下，适应一周。当它们9周龄以上时，从尾部收集血液并对血糖进行测量。当它们14周龄以上，动物的血糖水平达到350mg/dL时，进行糖尿病活性试验。将显示出血糖高于标准(350mg/dL)的小鼠随机混入各组。正常对照组和糖尿病诱导组每日经口服仅给予玉米油，而其余实验组每日经口服给予制备为适用于各组的样品，所述样品在玉米油中混合。口服给予的剂量为200～300μl/小鼠。将试剂和样品连续给予10日，然后，样品给予停止2日，在此期间，对血糖的变化进行了检测。再次开始进行样品给予并对血糖的变化进行观察。
其结果是，与糖尿病诱导组相比，用蜈蚣草乙酸乙酯-50％部位或蜈蚣草乙酸乙酯-70％甲醇部位处理10日的组的血糖水平降低了70％～80％。当样品给予停止时，小鼠血糖水平再次上升，这表明乙酸乙酯-50％甲醇部位和乙酸乙酯-70％甲醇部位可降低血糖水平(图4)。
实验实施例3：蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位的口服葡萄糖耐量试验(OGTT)
口服葡萄糖耐量试验是现今最广泛用于诊断糖尿病的方法之一，其中，在禁食状态经口服给予葡萄糖，然后对血糖进行测量。用于本次测试的动物经由Central LabAnimal Inc.购自于SLC Co.(日本)，所述动物为C57BLKS/J-db/db小鼠。通过使用蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位对动物进行为期2周的抗糖尿病测试。2周的测试之后，使动物适应2周。然后，将动物用于OGTT。具体而言，使小鼠禁食18小时，以保持空腹。在葡萄糖给予前30分钟，将样品(50％部位或70％部位；10mg/kg体重)混合于玉米油中，将其经口服给予小鼠。葡萄糖以2g/kg体重的浓度口服给予。然后，每间隔30分钟对血糖的变化进行观察，总共进行6次。
其结果是，与相应的对照组相比，在用蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位处理的小鼠组中，葡萄糖给予后预期的血糖的急速上升受到约25％的抑制。150分钟后，降血糖作用比相应的对照组增加了60％的水平。结果表明，蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位可以调节血糖(图5和图6)。
实验实施例4：蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位在不同浓度下的口服葡萄糖耐量试验(OGTT)
使用C57BL/6小鼠作为正常对照组，并使用C57BLKS/J-db/db小鼠作为糖尿病诱导的小鼠组。这两种动物均经由Central Lab Animal Inc.购自SLC Co.(日本)，并且在购买时，所述动物为7周龄。抵达动物实验室后，使这些动物在22℃、50％湿度条件下，适应一周。在测试之前，使动物禁食12小时，以保持空腹。在葡萄糖给予前30分钟，将样品(粗品或50％部位或70％部位；1mg/kg体重或10mg/kg体重)混合于玉米油中，将其经口服给予小鼠。葡萄糖以2g/kg体重的浓度口服给予。然后，每间隔30分钟对血糖的变化进行观察，总共进行6次。
其结果是，在处理后60分钟，在蜈蚣草乙酸乙酯-50％甲醇部位的高剂量和低剂量下，葡萄糖给予后预期的血糖的急速上升分别被抑制为相应的对照组水平的40％和60％(图7)。
实验实施例5：蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位在不同浓度下的腹膜内葡萄糖耐量试验(IPGTT)
使用C57BL/6小鼠作为正常对照组，并使用C57BLKS/J-db/db小鼠作为糖尿病诱导的小鼠组。这两种动物均经由Central Lab Animal Inc.购自SLC Co.(日本)，并且在购买时，所述动物为7周龄。抵达动物实验室后，使这些动物在22℃、50％湿度条件下，适应一周。在测试之前，使动物禁食12小时，以保持空腹。在葡萄糖给予前30分钟，将样品(粗品或50％部位或70％部位；1mg/kg体重或10mg/kg体重)溶解在10mM KOH中，将其经口服给予小鼠。葡萄糖以2g/kg体重的浓度口服给予。然后，每间隔30分钟对血糖的变化进行观察，总共进行6次。
其结果是，用蜈蚣草乙酸乙酯-50％甲醇部位在的高剂量和低剂量下处理后2小时，血糖降低作用比相应的对照组增加了约80％(图8)。实验实施例6：根据腹膜内给予的蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位的口服葡萄糖耐量试验(OGTT)
使用C57BLKS/J-db/db小鼠作为糖尿病诱导的小鼠组。该动物经由Central LabAnimal Inc.购自SLC Co.(日本)，并且在购买时，所述动物为7周龄。抵达动物实验室后，使这些动物在22℃、50％湿度条件下，适应一周。在测试之前，使动物禁食12小时，以保持空腹。在葡萄糖给予前30分钟，将样品(粗品或50％部位或70％部位；1mg/kg体重或50mg/kg体重)溶解在10mM KOH中，将其经腹膜内给予小鼠。葡萄糖以2g/kg体重的浓度口服给予。此时，给予的总量分别为200μl。然后，在5小时内对血糖进行9次测量。
其结果是，4.5小时后对照组的血糖水平保持在400mg/dL以上，而用蜈蚣草乙酸乙酯-50％甲醇部位处理的组的血糖水平降低至250mg/dL，表明与对照组相比，血糖降低作用增加了约60％(图9)。
实验实施例7：蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位在链唑霉素(STZ)I型糖尿病模型中的抗糖尿病活性
使用糖尿病诱导的ICR小鼠、精确地讲是链唑霉素(STZ)I型糖尿病诱导模型，对蜈蚣草提取物的抗糖尿病活性进行了考察。所述动物经由Central Lab Animal Inc.购自SLCCo.(日本)，并且在购买时，所述动物为7周龄。抵达动物实验室后，使这些动物在22℃、50％湿度条件下，适应一周。为了在动物中诱导I型糖尿病，使用STZ选择性地破坏胰腺中的β细胞，以降低胰岛素分泌。将STZ溶于50mM柠檬酸盐缓冲液(pH4.5)中，将其经腹膜内进行注射以诱导I型糖尿病。用于给予的剂量为80mg/kg体重，间隔2日，共给予三次。3天后，对血糖进行测量。选择显示出血糖水平高于350mg/dL的小鼠，并随机分配至各测试组。测试开始前，使动物禁食12小时，以保持空腹。在葡萄糖给予前30分钟，将样品(50％部位或70％部位；20mg/kg体重)混合于玉米油中，将其经口服给予小鼠。葡萄糖以2g/kg体重的浓度口服给予。在6小时内共对血糖进行10次测量。
其结果是，4.5小时后，用蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位处理的组的血糖水平下降至正常水平。然而，即使经过6个小时，对照组的血糖值仍较高，准确地说高出正常组150mg/dL。用蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位处理的组在葡萄糖给予6小时后显示出相对于对照组100％的血糖降低作用(图10)。
实验实施例8：蜈蚣草提取物或其部位对Aβ(1-42)肽低聚-聚合的抑制
为了考察蜈蚣草提取物或其部位是否能够抑制Aβ(1-42)肽的低聚-聚合，将重组的Aβ肽(Sigma)溶解于1mM六氟异丙醇中，然后将其分布在无菌微量离心管中。在Speed Vac中去除六氟异丙醇之后，将肽溶解于5mM DMSO中。将肽溶解于100μM Ham's F-12(终浓度)中，接着在4℃下反应24小时。24小时后，将300ug的各蜈蚣草提取物加入至Aβ肽样品中，接着反应30分钟。通过免疫印迹法对该Aβ低聚-聚合进行考察。
其结果是，在未经蜈蚣草提取物处理的对照组中，该Aβ肽通过形成Aβ肽单体、二聚体、三聚体、四聚体和原纤维形式而聚集。然而，在用蜈蚣草提取物处理的组中，Aβ肽的低聚-聚合受到抑制。具体而言，在用蜈蚣草乙酸乙酯-50％甲醇部位和蜈蚣草乙酸乙酯-70％甲醇部位处理的组中，低聚-聚合受到显著抑制。蜈蚣草提取物对低聚-聚合的抑制可以使神经死亡复原，并在痴呆病变中抑制经由Aβ肽的信号传导通路(图11)。
实验实施例9：蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位对痴呆诱导酶活性的抑制
<9-1>蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位对BACE1活性的抑制
使用BACE1(β分泌酶)FRET试验试剂盒(Panvera)进行蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位的BACE1活性抑制分析。具体而言，将10ul BACE1底物加入至10ul蜈蚣草部位(1ug/ul)中，将其与10ul BACE1酶混合，接着在室温下反应60分钟。在向其中加入10ul终止液后，在545nm下对荧光进行测量。
其结果是，在反应样品中，蜈蚣草乙酸乙酯-50％甲醇部位、蜈蚣草乙酸乙酯-70％甲醇部位和蜈蚣草乙酸乙酯-100％甲醇部位均被确证抑制了BACE1活性。至于抑制水平，蜈蚣草乙酸乙酯-50％甲醇部位显示出最强的BACE1抑制作用，蜈蚣草乙酸乙酯-70％甲醇部位和蜈蚣草乙酸乙酯-100％甲醇部位紧随其后(图12)。
<9-2>蜈蚣草乙酸乙酯-100％甲醇部位对BACE1活性的抑制
使用BACE1(β分泌酶)FRET试验试剂盒(Panvera)进行蜈蚣草乙酸乙酯-100％甲醇部位的BACE1活性抑制分析。具体而言，将10ul BACE1底物加入至10ul不同浓度(2ug/ul、0.75ug/ul和0.2ug/ul)的蜈蚣草部位中。向其中加入10ul BACE1酶，接着在室温下反应60分钟。在向其中加入10ul终止液后，在545nm下对荧光进行测量。
其结果是，在反应样品中，所有蜈蚣草乙酸乙酯-100％甲醇部位均被确证抑制了BACE1活性。至于抑制水平，2ug蜈蚣草乙酸乙酯-100％甲醇部位表现出最强的BACE1抑制作用，0.75ug蜈蚣草乙酸乙酯-100％甲醇部位和0.2ug蜈蚣草乙酸乙酯-100％甲醇部位紧随其后(图13)。
<9-3>蜈蚣草乙酸乙酯-70％甲醇部位对BACE1活性的抑制
使用BACE1(β分泌酶)FRET试验试剂盒(Panvera)进行蜈蚣草乙酸乙酯-70％甲醇部位的BACE1活性抑制分析。具体而言，将10ul BACE1底物与10ul不同浓度(2ug/ul、0.75ug/ul和0.2ug/ul)的蜈蚣草部位进行混合。向其中加入10ul BACE1酶，接着在室温下反应60分钟。在向其中加入10ul终止液后，在545nm下对荧光进行测量。
其结果是，在反应样品中，所有蜈蚣草乙酸乙酯-70％甲醇部位均被确证抑制了BACE1活性。至于抑制水平，2ug蜈蚣草乙酸乙酯-70％甲醇部位表现出最强的BACE1抑制作用，0.75ug蜈蚣草乙酸乙酯-70％甲醇部位和0.2ug蜈蚣草乙酸乙酯-70％甲醇部位紧随其后(图14)。
<9-4>蜈蚣草乙酸乙酯-50％甲醇部位对BACE1活性的抑制
使用BACE1(β分泌酶)FRET试验试剂盒(Panvera)进行蜈蚣草乙酸乙酯-50％甲醇部位的BACE1活性抑制分析。具体而言，将10ul BACE1底物与10ul不同浓度(2ug/ul、0.75ug/ul和0.2ug/ul)的蜈蚣草部位进行混合。向其中加入10ul BACE1酶，接着在室温下反应60分钟。在向其中加入10ul终止液后，在545nm下对荧光进行测量。
其结果是，在反应样品中，所有蜈蚣草乙酸乙酯-50％甲醇部位均被确证抑制了BACE1活性。至于抑制水平，2ug蜈蚣草乙酸乙酯-50％甲醇部位表现出最强的BACE1抑制作用，0.75ug蜈蚣草乙酸乙酯-50％甲醇部位和0.2ug蜈蚣草乙酸乙酯-50％甲醇部位紧随其后(图15)。
实验实施例10：蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位对痴呆诱导酶活性的抑制
<10-1>蜈蚣草乙酸乙酯-70％甲醇部位对痴呆诱导酶活性的抑制
用β-淀粉样蛋白低聚物对海马HT-22细胞(American Type Culture Collection，ATCC)进行处理，其中用不同浓度(1ug/ml、25ug/ml、50ug/ml和75ug/ml)的蜈蚣草乙酸乙酯-70％甲醇部位进行处理。氧化应激增加了线粒体周围的ROS，引起细胞凋亡。这种氧化应激诱发的线粒体损伤引起LDH的胞外分泌，从而对LDH活性进行测定。
其结果是，在正常组中的LDH活性为约16％，并且在用β-淀粉样蛋白低聚物处理的对照组中的LDH活性为约100％。在此期间，在用蜈蚣草乙酸乙酯-70％甲醇部位处理的组中的LDH活性以蜈蚣草提取物剂量依赖性的方式降低，准确地说，经浓度为1ug/ml、25ug/ml、50ug/ml和75ug/ml的蜈蚣草提取物处理的LDH活性分别降低至81％、63％、和45％。上述结果表明，蜈蚣草乙酸乙酯-70％甲醇部位显著抑制了由β-淀粉样蛋白引起的细胞毒性(图16)。
<10-2>蜈蚣草乙酸乙酯-50％甲醇部位对痴呆诱导酶活性的抑制
用β-淀粉样蛋白低聚物对海马HT-22细胞(American Type Culture Collection，ATCC)进行处理，其中用不同浓度(1ug/ml、25ug/ml、50ug/ml和75ug/ml)的蜈蚣草乙酸乙酯-50％甲醇部位进行处理。氧化应激增加了线粒体周围的ROS，引起细胞凋亡。这种氧化应激诱发的线粒体损伤引起LDH的胞外分泌，从而对LDH活性进行测定。
其结果是，在正常组中的LDH活性为约17％，在用β-淀粉样蛋白低聚物处理的对照组中的LDH活性为约100％。在此期间，在用蜈蚣草乙酸乙酯-50％甲醇部位处理的组中的LDH活性以蜈蚣草提取物剂量依赖性的方式降低，精确地说，经浓度为1ug/ml、25ug/ml、50ug/ml和75ug/ml的蜈蚣草提取物处理的LDH活性分别降低至79％、57％、和42％。上述结果表明，蜈蚣草乙酸乙酯-50％甲醇部位显著抑制了由β-淀粉样蛋白引起的细胞毒性(图17)。
<10-3>蜈蚣草乙酸乙酯-50％甲醇部位对痴呆诱导活性氧(ROS)的抑制
用β-淀粉样蛋白低聚物对海马HT-22细胞(American Type Culture Collection，ATCC)进行处理，其中用不同浓度(1ug/ml、25ug/ml、50ug/ml和75ug/ml)的蜈蚣草乙酸乙酯-50％甲醇部位进行处理。氧化应激增加了线粒体周围的ROS，引起细胞凋亡。这种氧化应激诱发的线粒体损伤引起LDH的胞外分泌，从而对LDH活性进行测定。
具体而言，用β-淀粉样蛋白以10μM的最终浓度对海马HT-22细胞进行处理，接着培养过夜。然后，对伴随的氧化应激是否能够增加线粒体周围的ROS进行了考察。使用CytoFluor 40000荧光分光光度计(TECAN infinite M200)对DCF变化进行定量。其结果是，用β-淀粉样蛋白处理的对照组的活性氧定量为100％，并且不同浓度(10ug/ml、25ug/ml、50ug/ml和75ug/ml)的蜈蚣草乙酸乙酯-70％甲醇部位处理的组显示出的ROS分别为77％、58％、45％、38％和36％。上述结果表明，乙酸乙酯-50％甲醇部位显著抑制了由β-淀粉样蛋白诱导的ROS生成(图18)。
实验实施例11：蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位对BACE1介导的β-淀粉样蛋白分泌的抑制
对蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位对β-淀粉样蛋白在过表达BACE1(β-APP分裂酶1)的细胞中的分泌所造成的作用进行了考察，所述BACE1为产生痴呆诱导的β-淀粉样蛋白和淀粉样前体蛋白(APP)的酶。
其结果是，通过BACE1的表达增加了β-淀粉样蛋白的分泌，但在用蜈蚣草乙酸乙酯-50％甲醇部位或乙酸乙酯-70％甲醇部位处理的培养基中，β-淀粉样蛋白的分泌量显著降低。因此，确证了蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位通过抑制BACE1活性减少了β-淀粉样蛋白的产生(图19)。
实验实施例12：蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位对肝毒性的作用
通过用所述部位对APP/PS1小鼠(Central Lab Animal Inc.)进行处理，考察蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位对肝脏毒性的作用。
具体而言，用蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位对APP/PS1小鼠进行处理，然后进行肝酶测试，以对天门冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)和碱性磷酸酶(ALP)进行测量。
其结果是，在对照APP小鼠血液中的AST、ALT和ALP没有太大不同，但是，用蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位处理的实验组的AST、ALT和ALP处于正常范围，这表明蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位没有肝脏毒性(图20)。
实验实施例13：根据蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位在测试动物中的处理，对细胞因子基因mRNA表达进行的考察
为了测量在APP小鼠(Sigma Co.)中和用蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位处理的小鼠中细胞因子基因mRNA的表达，将在对照APP小鼠脾脏中表达的IL-1α、IFN-g和IL-6的mRNA的表达与用蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位处理的实验组中的表达进行比较，为此，从各组织中提取RNA，并由RNA合成cDNA，接着进行RT-PCR。
具体而言，为了从脾组织中提取总RNA，在加入Trizol溶液(Invitrogen，美国)(1ml/100mg组织)后，通过使用均化器将组织粉碎。为了分离蛋白和RNA层，将200μl氯仿溶液(Sigma Co.)加入至上述混合物中，接着进行强力涡旋。将混合物在室温下放置3分钟，然后以12000rpm的转速离心15分钟。通过移液器将无色上清液转移至新管中。将异丙醇(Sigma)加入至Trizol试剂，每1ml Trizol试剂加入0.5ml异丙醇，将其在室温下放置10分钟。将混合物以13000rpm离心15分钟，然后弃去上清液，并且用75％的乙醇对沉淀物进行洗涤。在检测RNA浓度之后，通过使用1ug总RNA作为带有低聚-dT引物和逆转录酶的模板，由RNA合成cDNA。靶基因为IL-1α、IFN-γ和IL-6。为了控制PCR定量进行，使用β肌动蛋白引物。作为引物，使用IL-1α(Sense-AGGAGAGCCGGGTGACAGTA(SEQ.ID.NO：1))和(Antisense-AACTCAGCCGTCTCTTCTTCAGA(SEQ.ID.NO：2))、IFN-γ(Sence-TGAACGCTACACACTGCATCTTG(SEQ.ID.NO：3))和((Antisense-GTTATTCAGACTTTCTAGGCTTTCAATG(SEQ.ID.NO：4))、以及IL-6(Sence-GAGGATACCACTCCCAACAGACC(SEQ.ID.NO：5))和(Antisense-AAGTGCATCATCGTTGTTCATACA(SEQ.ID.NO：6))。将合成的cDNA、引物、dNTP混合物(2.5mM)、Ex-tag聚合酶(Takara)以及PCR缓冲液全部进行混合，并如下进行PCR：在94℃下变性30秒，在55℃下退火40秒，并在72℃下延伸50秒。
其结果是，与对照APP小鼠相比，在用蜈蚣草乙酸乙酯-50％甲醇提取物、乙酸乙酯-70％甲醇提取物或乙酸乙酯-100％甲醇提取物处理的小鼠的脾脏中，IL-1α、IFN-g和IL-6的mRNA的表达更高(图21)。
实验实施例14：根据蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位处理，免疫球蛋白、细胞因子、INF-1β、IFN-γ和β-淀粉样蛋白在测试动物中的表达
进行ELISA(酶联免疫吸附试验，Diagnostic Automation/Cortez Diagnostics，INC.)，从而对于对照APP小鼠和用蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位处理的小鼠的血液中的免疫活性、细胞因子活性、以及INF-1β、IFN-γ和β-淀粉样蛋白(Aβ)的水平进行检测。
具体而言，将乙酰丙嗪(Sigma Co.)和氯胺酮(Sigma Co.)进行混合以制备麻醉液体，通过肌内注射将其给予测试小鼠(B6C3-Tg((APPswe，PSEN1dE9)85Dbo/Mmjax，杰克逊实验室)。然后，从心脏中取血，将其转移至肝素管中。将该管以10000rpm的转速离心10分钟，以分离血清。使用各细胞因子试验试剂盒(Enzo)进行ELISA。将样品血液加样至抗体缀合板，接着在板振荡器中反应1～2小时。在对该板进行4～5次洗涤去除非特异性反应产物之后，加入与样品匹配的各抗体，接着反应1小时。再次对板进行4～5次洗涤后，加入HRP缀合物，进行二级抗体缀合1小时。在对其洗涤4～5次之后，向其中加入底物以诱导酶反应。当抗原存在时，反应混合物变为蓝色。通过加入终止溶液终止显色。当颜色变为黄色时，对OD450进行测量。
其结果是，与对照相比，在用蜈蚣草乙酸乙酯-50％甲醇部位、蜈蚣草乙酸乙酯-70％甲醇部位和蜈蚣草乙酸乙酯-100％甲醇部位处理的组中，免疫球蛋白活性较高。与对照组相比，在用蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位处理的组中，免疫活性也较高(图22)。
与对照相比，在用蜈蚣草乙酸乙酯-50％甲醇部位、蜈蚣草乙酸乙酯-70％甲醇部位和蜈蚣草乙酸乙酯-100％甲醇部位处理的组中，细胞因子水平也较高。这一结果还支持了用蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位处理的组中的免疫活性较高(图23)。
与对照组相比，在用蜈蚣草乙酸乙酯-50％甲醇部位、蜈蚣草乙酸乙酯-70％甲醇部位和蜈蚣草乙酸乙酯-100％甲醇部位处理的小鼠组中，INF-1β和INF-γ的水平也较高(图24)。
与此同时，与对照组相比，在用蜈蚣草乙酸乙酯-50％甲醇部位、蜈蚣草乙酸乙酯-70％甲醇部位和蜈蚣草乙酸乙酯-100％甲醇部位处理的小鼠组中，β-淀粉样蛋白的水平较低(图25)。
实验实施例15：用蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位处理的试验动物的组织学分析(H-E染色)
通过H-E染色，对用蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位处理的小鼠和APP小鼠的脑组织的病变进行检测。
具体而言，对脑组织进行提取，并固定在4％的中性缓冲多聚甲醛中，持续48～72小时。对固定的组织进行洗涤，以去除固定液。然后，将组织在70％的乙醇中反应1小时、在80％的乙醇中反应1小时、在90％的乙醇中反应1小时、在95％的乙醇中反应1小时、并在100％的乙醇中反应2小时，在二甲苯中反应2小时，导致脱水和玻璃化。将组织在石蜡包埋中心(Leica，Wetzlar，德国)中进行格式化(formatted)。将石蜡块切成5μm厚的切片。将切好的组织切片进行去石蜡化，并依次在二甲苯中水化15分钟(两次)，在100％的乙醇中水化3分钟、在95％的乙醇中水化3分钟、在90％的乙醇中水化3分钟、在80％的乙醇中水化3分钟、并在70％的乙醇中水化3分钟，接着用苏木精染色10分钟，并用曙红染色1分钟。通过使用permount对组织进行密封，然后在光学显微镜下进行观察。
其结果是，在用蜈蚣草乙酸乙酯-50％甲醇部位或蜈蚣草乙酸乙酯-100％甲醇部位处理的小鼠的海马体中，细胞死亡信号强于APP小鼠，这表明该部位能够抑制脑组织中的细胞死亡(图26)。
此外，在用蜈蚣草乙酸乙酯-50％甲醇部位或蜈蚣草乙酸乙酯-100％甲醇部位处理的小鼠的皮质中，细胞死亡信号强于APP小鼠，这表明该部位能够抑制进行性退化(图27)。
实验实施例16：用蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位处理的试验动物的免疫组织化学分析
在APP小鼠和用蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位处理的小鼠的皮质和海马体中，通过使用Aβ抗体的免疫组织化学分析对Aβ进行了考察。
具体而言，对脑组织进行提取，并固定在4％的中性缓冲多聚甲醛中，持续48～72小时。对固定的组织进行洗涤，以去除固定液。然后，将组织在70％的乙醇中反应1小时、在80％的乙醇中反应1小时、在90％的乙醇中反应1小时、在95％的乙醇中反应1小时、并在100％的乙醇中反应2小时，在二甲苯中反应2小时，导致脱水和玻璃化。将组织在石蜡包埋中心(Leica，Wetzlar，德国)中进行格式化(formatted)。将石蜡块切成10μm厚的切片。将切好的组织切片进行去石蜡化，并在二甲苯、100％的乙醇、95％的乙醇、90％的乙醇、80％的乙醇和70％的乙醇中依次进行水化。用0.1M磷酸钠缓冲液(0.1M PB)对组织切片洗涤5分钟，重复3次，然后在室温下与一级抗体6E10(Covance公司，1:50)反应2小时。通过以1:100～1:200的比例对FITC缀合抗体(Sigma Co.)进行稀释，制备二级抗体，使其与组织切片反应2小时。对于每种抗体的稀释，使用含有1％正常山羊血清(Sigma)和0.3％Triton X-100(Sigma)的0.1M PB。在抗体处理的每个阶段，用PBS洗涤5分钟，每阶段洗涤三次。将发出荧光的细胞认定为阳性细胞，对其分布进行检测。
其结果是，在用蜈蚣草乙酸乙酯-50％甲醇部位和蜈蚣草乙酸乙酯-100％甲醇部位处理的小鼠中，Aβ显著降低(图28)。
上述结果确证了，在用蜈蚣草乙酸乙酯-50％甲醇部位、蜈蚣草乙酸乙酯-70％甲醇部位和蜈蚣草乙酸乙酯-100％甲醇部位处理的小鼠中，Aβ显著降低，这表明蜈蚣草乙酸乙酯-甲醇部位能够抑制小鼠大脑皮质中β-淀粉样蛋白的积聚(图29)。
制备实施例1：包含蜈蚣草提取物作为活性成分的、用于预防和治疗糖尿病和痴呆的组合物的制备
制造实施例1：药物制剂的制备
<1-1>粉剂的制备
实施例<1-1>的蜈蚣草甲醇提取物 0.1g
乳糖 1.5g
滑石 0.5g
根据用于制备粉剂的常规方法，通过将所有上述组分混合，将其填充在气密包装中来制备粉剂。
<1-2>片剂的制备
根据在表3中示出的组成制备包含本发明的蜈蚣草提取物作为活性成分的片剂。
表3
组成 含量(重量份)
蜈蚣草提取物 250
乳糖 175.9
马铃薯淀粉 180
胶体硅酸 32
10％的明胶溶液 5
淀粉 160
滑石 50
硬脂酸镁 5
将250g本发明的提取物、175.9g乳糖、180g马铃薯淀粉和32g胶体硅酸全部混合在一起。将10％的明胶溶液加入至混合物中，然后将其粉碎并用14目筛过滤。将粉碎的混合物干燥，向其中加入160g马铃薯淀粉、50g滑石和5g硬脂酸镁，制成片剂。
<1-3>胶囊的制备
实施例<1-1>的蜈蚣草甲醇提取物 0.1g
玉米淀粉 5g
羧基纤维素 4.9g
根据用于制备胶囊的常规方法，通过将所有上述组分进行混合，将其填充在硬胶囊中来制备胶囊。
<1-4>可注射溶液的制备
实施例<1-1>的蜈蚣草甲醇提取物 0.1g
灭菌蒸馏水 适量
pH调节剂 适量
根据用于制备可注射溶液的常规方法，通过将所有上述组分进行混合，将该混合物置入2ml安瓿中，并对其进行灭菌来制备可注射溶液。
<1-5>液体制剂的制备
将所有上述组分溶解于纯化水中。加入柠檬香精后，通过加入纯化水将总体积调整至100ml。通过用于制备液体制剂的常规方法，经由将该混合物置入棕色瓶中，并对其进行灭菌来制备液体制剂。
<1-6>糖浆剂的制备
根据在表2中示出的组成制备包含本发明的蜈蚣草提取物作为活性成分的糖浆剂。
表2
组成 含量(重量份)
蜈蚣草提取物 2
糖精 0.8
蔗糖 25.4
甘油 8
调味剂 0.04
乙醇 4
山梨酸 0.4
蒸馏水 60
制造实施例2：包含蜈蚣草提取物作为活性成分的保健食品的制备
<2-1>面食的制备
将0.5～5.0重量份的实施例<1-3>的蜈蚣草水提取物加入至面粉中。根据常规方法，用该面粉混合物制备健康增强食品，如面包、蛋糕、饼干、薄脆饼干和面条。
<2-2>汤和肉汁的制备
将0.1～5.0重量份的实施例<1-3>的蜈蚣草水提取物加入至汤和肉汁中。通过常规方法制备健康增强的肉制品、汤和肉汁。
<2-3>碎牛肉的制备
根据常规方法，通过将10重量份的实施例<1-3>的蜈蚣草水提取物与碎牛肉进行混合，来制备健康增强的碎牛肉。
<2-4>乳制品的制备
将5～10重量份的实施例<1-3>的蜈蚣草水提取物加入至牛奶中。根据常规方法，用该牛奶混合物制备健康增强的乳制品，如黄油和冰淇淋。
<2-5>Sun-Sik的制备
将糙米、大麦、糯米和Yulmu(薏苡)根据常规方法糊化、干燥并粉碎，得到60目粉末。
将黑豆、黑芝麻和野芝麻根据常规方法蒸制并干燥，粉碎得到60目粉末。
将实施例<1-3>的蜈蚣草水提取物在减压下浓缩、喷雾干燥并粉碎，得到60目干粉。
通过将谷物、种子和实施例<1-3>的蜈蚣草水提取物的干粉按照以下比例进行混合，来制备Sun-Sik：
谷物(糙米：30质量份；Yulmu：15质量份；大麦：20质量份)；
种子(野芝麻：7重量份；黑豆：8重量份；黑芝麻：7重量份)；
实施例<1-3>的蜈蚣草水提取物干粉(3重量份)；
灵芝(0.5重量份)；
地黄(0.5重量份)
制造实施例3：包含蜈蚣草提取物作为活性成分的功能饮料的制备
<3-1>保健饮料的制备
将本发明的蜈蚣草提取物(5g)与液态果糖(0.5％)、低聚糖(2％)、糖(2％)、盐(0.5％)和水(75％)进行混合。充分混合后，将该混合物立即灭菌并装入小容器(如玻璃瓶、PET瓶等)，制备保健饮料。
<3-2>蔬菜汁的制备
根据常规方法，将5g本发明的蜈蚣草提取物加入至1,000ml番茄汁或胡萝卜汁中，来制备健康增强的蔬菜汁。
<3-3>果汁的制备
根据常规方法，将1g本发明的蜈蚣草提取物加入至1,000ml苹果汁或葡萄汁中，来制备健康增强的果汁。
序列表
<110> 韩国原子力研究院
<120> 包含蜈蚣草提取物作为活性成分的药物组合物
<130> 12p-08-22
<160> 6
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-1a Sence
<400> 1
aggagagccg ggtgacagta 20
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-1a Antisence
<400> 2
aactcagccg tctcttcttc aga 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IFN-gamma Sence
<400> 3
tgaacgctac acactgcatc ttg 23
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IFN-gamma Antisence
<400> 4
gttattcaga ctttctaggc tttcaatg 28
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-6 Sence
<400> 5
gaggatacca ctcccaacag acc 23
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-6 Antisence
<400> 6
aagtgcatca tcgttgttca taca 24

Claims (8)

1.蜈蚣草(Eremochloa ophiuroides)提取物、或通过对所述蜈蚣草提取物进行提取而制备的有机溶剂部位、或由蜈蚣草甲醇提取物的乙酸乙酯部位提取的活性部位在制造用于预防或治疗痴呆的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其中，通过使用水、C1～C2低级醇或上述物质的混合物对蜈蚣草进行提取，来制备所述蜈蚣草提取物。
3.根据权利要求2所述的用途，其中，所述低级醇为乙醇或甲醇。
4.根据权利要求1所述的用途，其中，所述蜈蚣草提取物是通过热水提取而提取的。
5.根据权利要求1所述的用途，其中，所述有机溶剂为正己烷或乙酸乙酯。
6.根据权利要求1所述的用途，其中，所述有机溶剂部位为通过下列步骤从蜈蚣草甲醇提取物中提取的乙酸乙酯部位：用正己烷对所述蜈蚣草甲醇提取物进行提取；弃去可溶层；以及用乙酸乙酯对剩余的水层进行提取。
7.根据权利要求1所述的用途，其中，所述甲醇为20％～70％的甲醇。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的用途，其中，所述痴呆选自于由以下疾病组成的组：阿尔茨海默氏病、血管性痴呆、酒精性痴呆、帕金森氏病、路易体痴呆、皮克氏病、克雅病和亨廷顿氏病。
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