CN112125866B - 1,4-[二(1,2-苯并异硒唑-3(2h)-酮)]丁烷的晶型及其制备方法与应用 - Google Patents

1,4-[二(1,2-苯并异硒唑-3(2h)-酮)]丁烷的晶型及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

1,4‑[二(1,2‑苯并异硒唑‑3(2H)‑酮)]丁烷的晶型I使用Cu‑Kα辐射，以2θ角度表示的X‑射线粉末衍射在6.17±0.20°、12.28±0.20°、18.44±0.20°、25.92±0.20°、30.95±0.20°处具有特征峰。该晶型具有良好的稳定性，不宜发生转晶，有利于药物组合物、制剂的制备和使用、运输和贮存，充分保障了用药的安全性和药品质量。此外，该晶型具有高的溶解性、合理的生物利用度、低毒性和优异的肿瘤抑制活性。

Description

1,4-[二(1,2-苯并异硒唑-3(2H)-酮)]丁烷的晶型及其制备方法与应用
本申请要求2019年6月24日向中国国家知识产权局提交的专利申请号为201910550238.4，发明名称为“1,4-[二(1,2-苯并异硒唑-3(2H)-酮)]丁烷的晶型及其制备方法与应用”在先申请的优先权，该在先申请的全文通过引用的方式结合于本申请中。
技术领域
本发明属于晶型制备领域，具体涉及一种1,4-[二(1,2-苯并异硒唑-3(2H)-酮)]丁烷晶型及其制备方法与应用。
背景技术
1,4-[二(1,2-苯并异硒唑-3(2H)-酮)]丁烷的结构如下所示，
Figure BDA0002376107390000011
。
该化合物具有多种用途，具体表现为：1)可用于制备预治各类纤维化疾病药物，例如用于防治肝纤维化、肺纤维化、肾纤维化、骨髓纤维化、皮肤纤维化、囊性纤维化、口腔黏膜纤维化或心肌纤维化等疾病的药物；2)可用于制备治疗皮肤纤维化的美容用品；3)可用于制备防治关节炎的药物，例如用于防治风湿性关节炎、类风湿性关节炎等的药物；4)可用于制备防治炎症药物，如用于防治牙周炎、肩周炎或心肌炎等的药物；5)用于制备治疗各类合并纤维化的炎症疾病的药物；6)用于制备防治肿瘤转移扩散的药物。
在药物研发过程中，晶型的研发极为重要，同一药物的不同固体形态在外观、溶解度、熔点、溶出度、生物有效性等方面可能会有显著不同，从而影响药物的稳定性、生物利用度及疗效。药物多晶型现象是影响药品质量与临床疗效的重要因素之一，因此开发一种高纯度的、稳定的晶型、对于药品的生产和应用至关作用。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明首先提供1,4-[二(1,2-苯并异硒唑-3(2H)-酮)]丁烷的晶型I，所述晶型I使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X-射线粉末衍射在6.15±0.20°、12.28±0.20°、18.44±0.20°、25.92±0.20°、30.95±0.20°处具有特征峰。
根据本发明的实施方案，所述晶型I使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X-射线粉末衍射在6.15±0.20°、12.28±0.20°、18.44±0.20°、19.09±0.20°、22.20±0.20°、23.68±0.20°、25.92±0.20°、30.95±0.20°、32.45±0.20°处具有特征峰。
根据本发明的实施方案，所述晶型I使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X-射线粉末衍射在6.15±0.20°、12.28±0.20°、18.44±0.20°、19.09±0.20°、21.89±0.20°、22.20±0.20°、23.68±0.20°、25.92±0.20°、27.50±0.20°、30.95±0.20°、32.45±0.20°、35.79±0.20°、37.37±0.20°、37.72±0.20°处具有特征峰。
根据本发明的实施方案，所述晶型I使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X-射线粉末衍射具有如下所示的特征峰和相对强度：
2θ 1％ 2-Theta 1％ 2-Theta 1％
6.147 14.3 20.215 1.5 30.949 16.2
11.07 0.1 20.572 1.7 32.447 5.7
12.276 100 20.804 0.8 34.15 0.2
14.949 0.5 21.888 2.9 35.159 0.1
15.371 0.4 22.201 3.1 35.792 2.4
16.901 0.6 22.599 1.3 36.342 2
18.053 0.9 23.678 3.3 37.367 2.7
18.441 9.3 24.806 0.5 37.723 2.4
19.091 4 25.315 0.2 38.471 1.5
19.565 0.2 25.924 8.4
26.301 0.8
27.503 2.6  
。
根据本发明的实施方案，所述晶型I具有基本如图1所示的XRD谱图。
根据本发明的实施方案，所述晶型I具有基本如图2所示的DSC-TGA谱图。
根据本发明的实施方案，所述晶型I为单晶，其具有如下所示的单晶数据，
Figure BDA0002376107390000031
Figure BDA0002376107390000041
。
本发明还提供如上所述晶型I的制备方法，包括：
将1,4-[二(1,2-苯并异硒唑-3(2H)-酮)]丁烷使用溶剂S1溶解，加入反溶剂S2得到晶型I；
其中，溶剂S1选自DMSO或者与占DMSO体积分数为1～10％的丙酮或四氢呋喃构成的混合溶剂；
溶剂S2选自水、乙腈、MTBE、乙酸异丙酯、甲醇、乙酸乙酯；条件是溶剂S1选自DMSO时，溶剂S2不为乙酸乙酯。
根据本发明的实施方案，溶剂S1与溶剂S2的体积比为1∶(0.5～2)，优选为1∶2或2∶1。
根据本发明的实施方案，结晶操作优选在30～70℃下进行，还优选在40～60℃下进行。
本发明还提供如上所述晶型I的用途，其用于制备抑制胶酶-2和明胶酶-9活性的药物或美容用品、或治疗免疫损伤疾病和免疫调节功能依赖或促进的相关疾病的药物。
根据本发明的实施方案，所述免疫损伤疾病和免疫调节功能依赖或促进的相关疾病选自感染、病毒性肝炎、变态反应性疾病、自身免疫病、获得性免疫缺陷综合症。
根据本发明的实施方案，所述抑制明胶酶-2和明胶酶-9活性的药物选自防治纤维化相关疾病、治疗炎症相关疾病、治疗结合炎症的纤维化并发症疾病或治疗肿瘤转移扩散的药物。
根据本发明优选的实施方案，所述纤维化疾病选自肝纤维化、肺纤维化、肾纤维化、骨髓纤维化、皮肤纤维化、囊性纤维化、口腔黏膜纤维化或心肌纤维化。
根据本发明优选的实施方案，所述的炎症相关疾病选自乙型肝炎、牙周炎、风湿性关节炎、类风湿性关节炎、肩周炎或心肌炎。
根据本发明优选的实施方案，将晶型I用于制备治疗乙型肝炎或肝癌的药物。
根据本发明的实施方案，所述乙型肝炎为病毒复制活跃，血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)持续升高或肝脏组织学显示有活动性病变的慢性成人乙型肝炎，或慢性乙型肝炎(HBV)感染代偿性儿童肝病。
根据本发明优选的实施方案，所述肝癌为HBV型肝癌，进一步的，为携带HBV的肝癌。
本发明还提供一种药物组合物，其包括如上所述晶型I。
本发明还提供如上所述药物组合物用于抑制胶酶-2和明胶酶-9活性、或治疗免疫损伤疾病和免疫调节功能依赖或促进的相关疾病。
有益效果
本发明制备得到了1,4-[二(1,2-苯并异硒唑-3(2H)-酮)]丁烷的晶型I，该晶型具有良好的稳定性，不宜发生转晶，有利于药物组合物、制剂的制备和使用、运输和贮存，充分保障了用药的安全性和药品质量。
此外，该晶型具有高的溶解性、合理的生物利用度、低毒性和优异的肿瘤抑制活性。发明人意外地发现，晶型I对肝癌，特别是对HBV型肝癌具有较好的抑制活性。由于我国80％肝癌患者均是HBV携带者，因此本化合物晶型在肝癌治疗中的应用具有合理的针对性。
最后，晶型I的制备方法操作简便，重现性好，收率高，宜于工业化生产，有较大的应用价值。
附图说明
图1为晶型I的XRD谱图(图1中为两个批次晶型I的检测结果)。
图2为晶型I的DSC-TGA谱图。
图3为晶型I-a及晶型I的XRD谱图。
图4为晶型I在不同条件下放置后测试的XRD谱图。
图5为晶型I的单晶结构图。
图6为测试例4中的动物模型图。
图7为不同晶型I浓度对HSC细胞生长抑制率(％)。
图8为不同晶型I浓度对于肝纤维化模型下动物体重(A)、肝生化指标(E、F、G)以及TR活性(C、D)和TGF水平(B)的影响。
图9为不同晶型I浓度对于肝纤维化模型下动物肝脏表面粗糙程度(A)、HE染色(B)及Masson染色(C)。
图10为不同晶型I浓度对于肝纤维化模型实验结束时，各组小鼠肝脏(A)α-SMA、(B)Collagen1A1表达情况。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
X射线粉末衍射(XRD)用D8 advance粉末X射线衍射分析仪(Bruker)和D2 phaser粉末X射线衍射分析仪(Bruker)进行分析。该仪器配备了LynxEye检测器。X射线衍射分析仪(Bruker)测试样品的2θ扫描角度从3°到40°，扫描步长为0.02°。测定样品时的光管电压和光管电流分别为40KV和40mA。
热重分析仪的型号为TGA Q500或Discovery TGA 55(TA，美国)。将样品置于已平衡的开口铝制样品盘中，质量在TGA加热炉内自动称量。样品以10℃/min的速率加热至最终温度。
差示扫描量热分析的仪器型号为DSC Q200或Discovery DSC 250(TA，美国)。样品经精确称重后置于DSC扎孔样品盘中，并记录下样品的准确质量。样品以10℃/min的升温速率加热至最终温度。
制备例1制备化合物1,4-[二(1,2-苯并异硒唑-3(2H)-酮)]丁烷
制备1.1 2,2′-二硒化双苯甲酸[2,2′-diselenibis(benzoic acid)]
(1)制备氯化2-苯甲酸重氮盐
4.0g邻氨基苯甲酸和体积比为1∶1的盐酸40ml冰浴下搅拌混合，使体系温度<5℃，再慢慢滴入25g亚硝酸钠溶于20ml水的溶液，继续反应2小时，得到氯化2-苯甲酸重氮盐。产物不经纯化，直接用于下一步。
(2)120m水中加入12g硒粉和氢氧化钠，搅拌下慢慢加入10g保险粉反应2小时，得到二硒化钠溶液。溶液不经纯化，直接用于下一步反应。
(3)搅拌下将步骤(1)得到的氯化2-苯甲酸重氮盐溶液滴加到步骤(2)得到的二硒化钠溶液中，混合物继续搅拌4小时直到产生的氮气排完。反应混合物用盐酸酸化，过滤沉淀固体，水洗后置干燥器中干燥，得到2,2’-二硒化双苯甲酸化合物，结晶后测试产物熔点：m.p.294℃。
1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ：7.33-8.04(m，4H，ph-H)13.6(br,COOH)；
IR(KBr)cm-1：(O-H)3005,(CO2)1672,(C-N)1264,C＝C(苯环)1560,1460,1417；MS-FAB(m/z):201[1/2M+]。
1.2制备2-硒氯苯甲酰氯[2-(chloroseleno)benzoyl chloride]
将2,2’-二硒化双苯甲酸(40.0g)和200ml氯化亚砜及DMF搅拌回流3小时，旋蒸除去多余的二氯亚砜，残渣用正己烷重结晶，得到2-硒氯苯甲酰氯化合物。熔点66℃。
1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ：7.33-8.16(m,4H,ph-H)。
1.3制备1,4-[二(1,2-苯并异硒唑-3(2H)-酮)]丁烷[1,4-Bis[benzisoselenazol-3(2H)-one]-butane]
1,4-丁二胺3.ml溶于50mlTHF中，加入三乙胺，冰浴，N2保护。2.9g 2-硒氯苯甲酰氯溶于60mlTHF中，缓慢滴入1,4-丁二胺溶液，有黄色固体生成。滴完后升至室温继续反应2小时。过滤固体，溶剂洗涤，乙醇和乙醚洗涤数次，产物用DMSO-水重结晶，得到淡黄色固体2g，m.p.243-248℃。
1H-NMR:(300MHz,DMSO-d6)δ7.37-8.04(m,4H,Ph-H),3.75(s,2H,CH2),1.64(s,2H,CH2)；MS-FAB(m/z):451[M]+。
实施例1晶型I的制备
将上述制备例1制备的1,4-[二(1,2-苯并异硒唑-3(2H)-酮)]使用溶剂进行溶解，再加入反溶剂制备得到晶型I，具体使用的溶剂及溶剂的体积如下表所示：
Figure BDA0002376107390000081
晶型I的XRD检测结果如图1所示。DSC-TGA检测结果如图2所示。
进一步测试表明，晶型I为单晶，其单晶结构如图5所示，单晶数据如下所示：
Figure BDA0002376107390000091
。
对比例1
取上述制备例1制备的1,4-[二(1,2-苯并异硒唑-3(2H)-酮)]溶于DMSO中，蒸干溶剂后得到结晶，经检测为晶型I-a，其XRD谱图如图3所示。
对比例2
取上述制备例1制备的1,4-[二(1,2-苯并异硒唑-3(2H)-酮)]溶于良溶剂DMSO中，再加入反溶剂丁酮、乙醇或乙酸乙酯(良溶剂与反溶剂的体积比为1:2)，均得到晶型I-a。
对比例3
取上述制备例1制备的1,4-[二(1,2-苯并异硒唑-3(2H)-酮)]溶于良溶剂(10％丙酮/DMSO或10％四氢呋喃/DMSO)中，再加入反溶剂乙醇(良溶剂与反溶剂的体积比为1:2)，均得到晶型I-a。
测试例1晶型I的稳定性测试
(1)对实施例1制备的晶型I进行稳定性测试。测试方法为：将晶型I样品放入稳定性试验箱中，分别在40℃，75％相对湿度和60℃条件下保持3-7天，检测结果如图4所示。由图4可知晶型I在不同条件下放置后，XRD图谱未发生变化，表明晶型I在高温和高湿条件下可以稳定存在，具有良好的稳定性。
(2)将对比例1-3制备的晶型I-a进行研磨，XRD检测得到晶型I。因此可以证明晶型I为1,4-[二(1,2-苯并异硒唑-3(2H)-酮)]丁烷的稳定晶型。
样品 研磨前 研磨后
实施例1 晶型I 晶型I
对比例1 晶型I-a 晶型I
对比例2 晶型I-a 晶型I
对比例3 晶型I-a 晶型I
由上述结果可知，晶型I具有良好的稳定性，其晶型不易发生转变，有利于药物组合物、制剂的制备和使用、运输和贮存，充分保障了用药的安全性和药品质量。
测试例2晶型I对H22小鼠肿瘤抑制活性测试
晶型I按照剂量(180mg/Kg)给药：称取180mg(晶型I)，溶于5mL 5‰CMC-Na溶液中，制成混悬液，给药剂量为5mL/Kg；
测试过程如下：空白对照组(5‰CMC-Na，每日一次灌胃给药)；晶型I组(180mg/Kg，每日一次灌胃给药)。动物适应性饲养2天后，保留合格动物随机分为4组，每组10只。于小鼠右腋皮下接种H22细胞，1×104/只，此即为治疗第0天。接种24h后开始给药。每日记录小鼠肿瘤长、短径，并根据公式：长径×短径2×0.5236计算肿瘤体积，每2日测量动物体重。给药21天后，水合氯醛麻醉后，摘眼球取血。处死小鼠，迅速分离肿瘤，实验结束时，对肿瘤进行称重统计分析，相关数据统计如下表：
晶型I对H22小鼠肿瘤体积抑瘤率(n＝10)
Figure BDA0002376107390000111
Figure BDA0002376107390000112
由上述结果可知，本发明制备的晶型I具有高达88.7％的肿瘤生长抑制率。说明该特定晶型形式进一步提升了化合物的治疗活性。推测其原因可能在于晶型I形式使得对活性不利或有害的杂质大大减少，晶型I在给药时具有良好的溶剂相容性，从而有利于制剂的吸收等。
测试例3晶型I对HBV的抑制
细胞种板：向24孔板中接种HepAD38细胞，密度为8×104个/孔，每孔培养基500μl。含药细胞培养：铺板后9h，观察细胞，待其贴壁，加入终浓度为0.5、1、5、20、50μM的药物(晶型I和ETV(恩替卡韦))。培养至48h，使用PBS清洗2遍，加入上述药物继续培养48h，待48h后，收获上清，检测上清HBV DNA、HBsAg、HBeAg。优先测定HBV DNA。
培养上清中HBV DNA含量测定：测定方法按照全式金viral Nucleic acidextraction kit提取核酸，提取后SYBR green qPCR法检测病毒DNA载量。
培养上清中HBsAg、HBeAg含量测定：测定方法为时间分辨免疫荧光实验(ELISA)，测定方法按照PE公司HBsAg、HBeAg测定试剂盒进行。
检测细胞上清HBV DNA、HBV RNA、HBsAg、HBeAg具体操作步骤：
1)于12孔板铺相应数量的细胞，24h后，换新鲜无双抗、无FBS培养基，用Lipo2000转染HBV质粒，6h后换成含双抗、10％FBS的培养基继续培养细胞。
48h后，收集1ml细胞培养上清，用于检测HBsAg、HBeAg，PBS洗涤细胞至少5次。收取最后一次洗涤的PBS，1ml，用作质粒是否洗涤干净的基线检测。注意：洗涤细胞时PBS沿着皿壁缓慢加入培养皿内，勿将细胞吹起，轻轻摇动培养皿洗涤细胞，每次洗涤后弃尽残留的PBS，尽量减少质粒的残留。
将细胞传至更大一级的培养皿，加入培养基继续培养3天后，收集1ml细胞上清用于后续检测细胞上清的HBV DNA、HBV RNA，如果不及时检测，于-20℃储存。
将收集的1ml细胞培养上清和48h时收集的最后一次洗涤细胞的PBS，5000rpm离心5min，吸取离心后上清200μl，加入5μl DNaseI+5μl DNaseI buffer，混匀后瞬时离心，37℃处理上清1h，每30min混匀一次，瞬时离心。1h后加入5μl EDTA，65℃，10min终止DNaseI反应。
用全式金HBV核酸提取试剂盒，将200μl细胞上清的HBV核酸浓缩为20μl的体系。
real-time PCR检测上清HBV DNA水平和DNase处理后的PBS中质粒的基线水平。HBV RNA经逆转录成cDNA后，real time PCR检测其水平。
(1)HBV DNA定量体系：
Figure BDA0002376107390000131
HD-F：5-CGGCGTTTTATCATMTTCCTCT-3
HD-R1：5-GACAAACGGGCAACATACCTT-3
Probe-HD VIC–CATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTT-BHQ1
引物位置在386-476S区
(2)HBV RNA经逆转录后的cDNA定量体系：
Figure BDA0002376107390000132
Figure BDA0002376107390000141
HR-F2：5-AGACCACCAAATGCCCCT-3
HR-R2：5-TCACACCGTAACACACGACAC-3
HR-RT：
5-TCTCACACCGTAACACACGACACAGGCGAGGGAGTTCTTCTTCTA-3
Probe-HR
FAM-5-CAACACTTCCGGARACTACTGTTGTTAGACG-3-BHQ1
定量引物序列设计在preC/C区(2297-2287)
Figure BDA0002376107390000142
晶型I对HBV DNA和上清HBeAg有良好的抑制作用。说明晶型I可以更有效地治疗HBV诱导的肝癌。
测试例4
试验药物：实施例1制备的晶型
实验动物：Balb/c近交系小鼠，雄性，六周龄，购买自北京大学医学部实验动物中心，实验动物生产许可证号SCXK(京)2016-0010。饲养环境清洁级，饲养温度25±2℃，12小时光照12小时黑暗，充足食水供应。
动物实验相关溶液配制：
CMC-Na溶液配制
CMC-Na                 5g
去离子水               1000ml
加入搅拌子以较高转速搅拌，初期CMC-Na会成团如棉花状，搅拌之后会逐渐溶解，作为溶剂使用。
晶型I(BS)溶液的配制
Figure BDA0002376107390000151
制备成溶液或者混悬液后，小鼠的给药剂量均为5ml/Kg。
25％CCl4溶液的配制
CCl4                     10ml
橄榄油                   40ml
加入搅拌子以较高转速搅拌，混匀后室温保存。
实验材料：
BS1801(北京大学药学院)、mHSC细胞系(北纳生物公司，河北，中国)、AML12细胞系、胎牛血清(Gibco)、DMEM培养基(M&C)、F12培养基、TGF-β1(Novoprotein)、细胞培养因子混合物(Sigma)、地塞米松(Solarbio)、四氯化碳(偶合)、橄榄油(Macklin)、磺酰罗丹明B(Sigma)、多聚甲醛(源叶)、Tris(Ameresco)、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、动物组织固定液。
实验方法：
1.细胞培养和细胞活力测定
小鼠肝星状细胞系mHSC使用20％FBS培养，烘箱培养条件为37℃，5％CO2。细胞增殖实验中，细胞密度为5000个/well，5ng/ml TGF-β1诱导24h后给药，SRB检测细胞增殖抑制率。
2.免疫印迹
每皿106个mHSC细胞，贴壁12h后给药。48h后，收集上清中的细胞，与贴壁细胞合并后，使用添加了蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液冰上裂解30min，16000rpm离心15min，留存上清。BCA法检测细胞裂解液浓度，加入一定量loading buffer制成2.5μg/μL的蛋白样品。SDS-PAGE检测α-SMA、CollagenⅠ、CollagenⅢ的含量。
3.动物实验
20只6周龄Balb/c雄鼠，随机分为4组，使用25％CCl4分期梯度诱导4周后(一周诱导三次)，BSL(90mg/kg)组、BSM(180mg/kg)组开始给药，每天一次，对照组与模型组给予5‰CMC-Na溶液。诱导8周后，处死小鼠，3000rpm离心15min得到小鼠血清，用于检测TGF-β1、TrxR1、AST、ALT、ALP、TP、表达情况(肝纤维化动物模型如图6所示)。部分肝脏经4％多聚甲醛固定后，进行免疫组化HE染色、Masson染色，免疫组化检测肝脏组织中a-SMA、CollagenⅠ的表达情况，部分肝脏冻存于液氮保存。
图7为测得的IC50值，由图7测得的结果可知由于TGFβ1在纤维化病变中发挥非常重要的病理作用，正常肝脏细胞中HSC占肝脏细胞5％，肝损伤通常导致HSC转化和激活，其中TGFβ1就是强效致纤维化因子。本发明的晶型对活化的HSC有效抑制是抗纤维化的重要环节功能之一。
图8为纤维化模型小鼠给BS药物后各种生化指标以及重要蛋白标志物指标血清检测变化比较图(对应的检查结果如下表所示)。由图8和下表的结果可知，与对照组小鼠相比，模型组及给药组小鼠体重均出现显著下降，模型组尤为明显。实验结束时，四组小鼠的平均体重分别为24.76±4.84g、14.08±1.51g、17.00±0.68g、18.04±2.23g。
表1实验结束时，各组小鼠体重及血清生化指标恢复水平
Figure BDA0002376107390000161
Figure BDA0002376107390000171
n≥4
图9为对照组、模型组、BS低剂量(BSL组)和BS中剂量(BSM组)干预后动物肝脏以及组织免疫组化染色结果。由A组结果可知，对照组小鼠肝脏表面光滑，富有光泽，颜色暗红，质地柔软，呈正常肝脏表现。实验结束时，模型组小鼠活动减少，体重下降高达43.2％，其肝脏表面呈磨砂状，颜色变浅，质地较硬，颗粒感强，呈现肝脏纤维化样，表明造模成功。而给药组小鼠肝脏以上症状有所改善，肝脏表面颗粒感减轻。
HE染色结果显示，模型组与对照组相比，肝细胞呈重度水肿，出现重度炎症现象，且肝细胞界板大部分破坏(>50％)；而BSL组与BSM组与模型组相比肝细胞坏死、炎症的症状显著减轻。
Masson染色结果显示，模型组小鼠汇管区-汇管区之间桥接纤维化，纤维间隔形成；而BSL组与BSM组与模型组相比逐渐减轻；对照组仅汇管区周围有少量纤维存在。
图10为不同晶型I浓度对于肝纤维化模型实验结束时，各组小鼠肝脏(A)α-SMA、(B)Collagen1A1表达情况。图10中a-SMA染色结果Collagen1染色结果显示，与对照组相比，模型组小鼠肝脏对应蛋白表达量显著上升，而BSL组与BSM组症状显著减轻，与模型组、对照组相比均具有显著性差异。
综上，本发明制备得到了1,4-[二(1,2-苯并异硒唑-3(2H)-酮)]丁烷的晶型I，该晶型具有良好的稳定性，有利于药物组合物、制剂的制备和使用、运输和贮存，充分保障了用药的安全性和药品质量。
此外，该晶型具有高的溶解性、合理的生物利用度、低毒性和优异的肿瘤抑制活性，特别是对携带HBV肝癌的整体抑制，肝纤维化过程以及核心成纤维化环节，以及肝癌形成和生长抑制等表现功能性抑制作用。具有对于从HBV到肝癌形成全程的保护功能。
最后，本发明新晶型的制备方法操作简便，重现性好，收率高，宜于工业化生产，有较大的应用价值。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.1,4-[二(1,2-苯并异硒唑-3(2H)-酮)]丁烷的晶型I，其特征在于，所述晶型I使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X-射线粉末衍射在6.15±0.20°、12.28±0.20°、18.44±0.20°、19.09±0.20°、21.89±0.20°、22.20±0.20°、23.68±0.20°、25.92±0.20°、27.50±0.20°、30.95±0.20°、32.45±0.20°、35.79±0.20°、37.37±0.20°、37.72±0.20°处具有特征峰。
2.根据权利要求1所述的晶型I，其特征在于，其具有基本如图1所示的XRD谱图或等同于XRD图谱相关对应的晶型。
3.1,4-[二(1,2-苯并异硒唑-3(2H)-酮)]丁烷的晶型I，其特征在于，所述晶型I为单晶，其具有如下所示的单晶数据，
Figure FDA0004047849500000011
。
4.权利要求1-3任一项所述晶型I的制备方法，其特征在于，包括：
将1,4-[二(1,2-苯并异硒唑-3(2H)-酮)]丁烷使用溶剂S1溶解，加入反溶剂S2得到晶型I；
其中，溶剂S1选自DMSO或者与占DMSO体积分数为1～10％的丙酮或四氢呋喃构成的混合溶剂；
溶剂S2选自水、乙腈、MTBE、乙酸异丙酯、甲醇、乙酸乙酯；条件是溶剂S1选自DMSO时，溶剂S2不为乙酸乙酯。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，溶剂S1与溶剂S2的体积比为1:(0.5～2)。
6.权利要求1-3任一项所述晶型I的用途，其特征在于，将晶型I用于制备治疗肝纤维化、乙型肝炎或肝癌的药物。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述肝癌为HBV型肝癌。
8.一种药物组合物，其包括权利要求1-3任一项所述晶型I。
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