JPH06508610A - 医薬組成物 - Google Patents

医薬組成物

Info

Publication number
JPH06508610A
JPH06508610A JP4510527A JP51052792A JPH06508610A JP H06508610 A JPH06508610 A JP H06508610A JP 4510527 A JP4510527 A JP 4510527A JP 51052792 A JP51052792 A JP 51052792A JP H06508610 A JPH06508610 A JP H06508610A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
polysaccharide
compound
sialic acid
active ingredient
group
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP4510527A
Other languages
English (en)
Other versions
JP3671054B2 (ja
Inventor
グレゴリアデイス，グレゴリー
Original Assignee
リポクセン・リミテツド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by リポクセン・リミテツド filed Critical リポクセン・リミテツド
Publication of JPH06508610A publication Critical patent/JPH06508610A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP3671054B2 publication Critical patent/JP3671054B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Manufacturing Of Micro-Capsules (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 医薬組成物 本発明は、患者の血液循環（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）における医薬的活性化合 物の滞留時間を延ばすために、又は該化合物を患者の体内の特定ターゲットに送 るために、多糖又は多糖誘導体を医薬的活性化合物と組み合わせて使用する方法 に関する。
循環血液中で高濃度を維持する必要、又は作用部位に直接送る必要のある薬理学 的活性物質は極めて多岐に及ぶ。
この種の物質には、癌及び抗菌薬療法、酵素もしくはホルモン置換療法及び免疫 学で使用される一般的な薬物、ペプチド及びタンパク質、並びにオリゴヌクレオ チドなどがある。これらの物質は多くの場合、血液循環中で短い半減期を示し、 腎臓を介して速やかに排出されるか、又は細網内皮系（ＲＥＳ）及び他の組織に 取り込まれる。このような早発の薬物損失を補償するためには、治療を要する部 分に十分な量の薬物が集中し得るように、より多量の薬物が必要である。しかし ながら、薬物量の増加は費用がかかるばかりでなく、毒性と、「外来タンパク質 」に対する免疫応答とを誘起し得る。例えばインターフェロン（ＩＦＮ−γ）及 びインターロイキン−２（ＩＬ−２）のようなサイトカインは、血液循環におけ る滞留時間を延長することができれば、効果が増強され、毒性が低下し、使用量 を減らすことができると思われる。
最近では組換えＤＮＡ技術の発達によって、広範囲の生物学的活性タンパク質を 入手できるようになった。例えば連結遺伝子融合（Ｉｉｇａｔｅｄ　ｇｅｎｅ　 ｆｕｓｉ。
ｎ）又は部位特異的突然変異誘発による分子リモデリングによって、前述のよう なタンパク質に最適活性に適合した特性が付与された事例もあるが、通常は、こ れらの生成物の効果的な使用は給送システム（ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｓｙｓｔｅｍ ）を介してしか達成され得ない。ターゲットとなる給送システムなしに、又は該 システムに関連して、薬物の早発損失を防止するのは望ましいことであろう。
薬物給送システム（ｄｒｕｇ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｓｙｓ　ｔ　ｅｍ＝ＤＤＳ） は、分子又は粒状エンティティであって、該エンティティと組み合わせられた薬 物の宿命及び効果を我々に有利なように制御できる任意のエンティティである。
ＤＤＳは２つの一般的タイブに分類できる。第１のタイプは高分子からなり（Ｍ ＤＤＳ）　、例えば抗体、ネオグリコプロティン並びに合成ポリマー、例えばポ リ（ヒドロキシプロピルメタクリルアミド）、ポリリシン及び重合アルキルシア ノアクリレートなどがある。薬物を所望の部位に向けて送るために、モノクロー ナル抗体を含む種々のタイプの高分子キャリヤーに薬物を組み合わせる手法は、 例えばＧｒｅｇｏｒｉａｄｉｓによりＮａｔｕｒｅ　２６旦、４０７−４１１　 （１９７７）に記述されている。
第２のタイプは粒状ＤＤＳ　（ＰＤＤＳ）であり、例えば、アルブミンのような 生分解性物質もしくはデキストラン及びアルキルシアノアクリレートポリマーの ような半生分解性物質からなる極小球（ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅ）もしくは微小球 （ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ）　、又は非イオン界面活性剤もしくはリポソームで 形成された小胞からなる。
薬物はＤＤＳに共有的に結合するか、又はＤＤＳ内に受動的に捕捉される。例え ば、界面活性剤小胞又はリポソームからなるＰＤＤＳは、界面活性剤又は脂質分 子の層の適当な組み合わせで形成することによって、親水性又は疎水性の医薬的 活性化合物を捕捉し得る。医薬的活性化合物は通常、例えば活性化合物がその機 能を実施する前に又は実施した後で、体内で溶解され得る又はされ得ない結合（ ｂｏｎｄ）によりＭＤＤＳに共有的に結合する。リポソームについては、ＮＩＰ Ｓ、４．１４６−１５１　（１９８９）及びＧｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ編（１９８ ８）Ｗｉｌｅｙ“Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ　ａｓ　Ｄｒｕｇ　Ｃａｒｒｉｅｒｓ：Ｒ ｅｃｅｎｔ　Ｔｒｅｎｄｓ　ａｎｄ　Ｐｒｏｇｒｅｓｓ”でＧｒｅｇｏｒｉａｄ ｉｓが記述している。
ＭＤＤＳの多くは、標的細胞又は組織によりその表面の受容体を介して認識され る能力を本来備えている（例えば抗体）か、又は後で付与されている（例えばネ オグリコプロティン）。この種のＤＯＳは通常、注射後にターゲットによって特 異的に取り込まれる。しかしながら、特異的取り込みには制限があり、ＤＤＳの 大半は（療法に）関係のない別の組織に取り込まれる。その理由は、抗体及び別 のＤＤＳタンパク質が（ターゲットに対する特異性にもかかわらず）、他のタン パク質と同様に、生物学的寿命の最後には異化されなければならないことにある 。
タンパク質分子は一定の寿命を有しているのではなく、ランダムに死滅する。従 って、タンパク質分子は注射された瞬間から（該分子に組み合わせられた薬物と 一緒に）直線速度で異化され始め、ターゲットと接触して取り込まれることがで きるのは該分子の一部だけである。
マウス抗体のようなりＤＳは、別の種に注射した場合には外来である。宿主は次 の注射によって、該外来タンパク質に対処するための抗体を産生ずる。このよう なタンパク質は、まだ十分に解明されていないメカニズムによって、最初の注射 の後に血液循環から排除される。人造ポリマーのようなりＤＳはオプソニンによ って認識され、細網内皮系（ＲＥＳ）　、特に肝臓及び牌臓マクロファージによ って除去される。いずれの場合も、一連の事象は宿主生体タンパク質によるＤＤ Ｓ成分の認識及び該成分への結合を含み、通常はこれらの認識及び結合によって 開始される。該認識及び／又は結合ステップの崩壊は成分分子の異化作用を妨害 する。
高分子タイプのＭＤＤＳに使用される合成ポリマーは例えばポリ（ヒドロキシプ ロピルメタクリルアミド）ポリリシン及び重合アルキルシアノアクリレートであ る。これらのポリマーはＲＥＳ系又は別の組織で適当なりゾゾーム酵素により異 化され得る。このような生分解性高分子タイプＤＤＳの異化速度を、何らかの方 法、例えばＲＥＳもしくは別の組織によるＤＤＳの取り込みを低下させる方法、 又はＲＥＳに取り込まれた後でリゾシーム酵素による分解を軽減させる方法で低 下させるのは望ましいことであろう。
粒状ＤＤＳ　（ＰＤＤＳ）は通常ＲＥＳにより血液循環から排除される。ＰＤＤ ＳはＲＥＳに取り込まれ易いため、該組織に薬物を送るためにしばしば使用され る。しかしながら、ＰＤＤＳをＲＥＳの組織以外の組織に送ることが望ましいこ ともしばしばある。そのためには、ＲＥＳによるＰＤＤＳの捕捉を防止するか又 は遅延させなければならない。
これは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような、又は商品名Ｐｌｕｒｏｎ ｉｃ、Ｔｅｔｒｏｎｉｃ、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ及びＰｏｌｏｘａｍｉｎｅで市販 されている類いのエチレンジアミンからなるブロックを含む酸化エチレン及び酸 化プロピレンのブロックコポリマーのような親水性高分子でＰＤＤＳをコーティ ングすることによっである程度まで達成された。これらのポリマーは人造である 。
その使用は、１１１ｕｍによりＧＢ−Ａ−２１８５３９７に記述されており、Ｉ 　Ｉ　ｌ−ｕｍ及び［）ａｖｉｓによりＦＥ述されており、Ｉｌｌｕｍらにより Ｌｉｆｅ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　（１９８７）４０．３６７−３７４に記述されて おり、Ｈｕｎ　ｔ　ｅ　ｒらにより５ｃａｎｄ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎ。
１．２３．２８７　（１９８６）に記述されており、５ｅｎｉｏｒらによりＢｉ ｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　（１９９１）１０６２．７７−８２に 記述されており、またＷＯ−Ａ−９００４３８４にも記述されている。ＰＥＧ及 び酸化エチレンブロックコポリマーは親水性が高く、この性質のおかげで、（ａ ）ＰＤＤＳを早発に取り込む組織による該ＰＤＤＳ　（これらのポリマーが結合 している）の認識と、（ｂ）関係のない組織による単発排出もしくは取り込みに よって（これらのポリマーが結合している）薬物、ペプチド及びタンパク質が失 われる現象とを防止するか又は遅延させることができる。
ＡｂｕｃｈｏｗｓｋｉらはＪ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。
（１９７７）２５２．３２８２−８６で、２つの分子量（１９００及び５０００ ）のＰＥＧをカタラーゼに共有結合させる方法を開示している。この方法は、該 タンパク質の免疫原性を低下させ、マウスの血液循環における該タンパク質の半 減期を増加させた。Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉは、このプロセスが、例えば血液代謝 物質を変化させるための、又は蓄積症を治療するための酵素療法の使用を可能に すると示唆している。しかしながら、タンパク質（及びペプチド等）の半減期は 、ＰＥＧが可能にすると思われる長さよりも更に長くすることが望ましい。
Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉらは更に、ＰＥＧに代えてデキストラン（多糖）を使用す るという発想を捨てたと述べている。デキストランはヒトにおいては免疫原であ ることが知られているからである。ＧＢ−Ａ−２１８５３９７では、肝臓による コロイド粒子の取り込みを防止するために、酸化エチレン−酸化プロピレンブロ ックコポリマーに代えて、多糖類、キサンタン及びヒアルロン酸を使用し得るこ とが示唆されている。キサンタンゴムにカルボキシル基が存在していることが所 望の効果を得る上で有利だと述べられている。多糖類は実際には１つも試験され ておらず、多糖類がどのようにしてコロイド粒子表面に結合するのかという情報 も全（記述されていない。
５ｅｎｉｏｒら（前出の文献）及びＷＯ−Ａ−９００４３８４は、モノメトキシ ポリエチレングリコールをリン脂質に共有結合させることによりリポソームをポ リエチレングリコール（ＰＥＧ）でコーティングする方法を開示している。この コーティングによって、血液からのリポソームのクリアランス時間は３０％まで 増加し、リポソームは血漿成分をより緩慢に吸収するようになった。これら２つ のファクターは、ＰＥＧによって親水性を高められた小胞の表面に起因するもの と考えられた。
ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｓ、（１９８７）２８３．４２−４６でＡ１１ｅｎ及びＣｈ ｏｎｎは、リポソーム内へのガングリオシド及びその非シアリル（ａｓｉａｌｙ ｌ）誘導体の導入について記述している。ガングリオシドは、２つの脂肪酸１（ 主にステアリン酸）と、スフィンゴシンと、ガラクトース及び１つのシアル酸単 位を含む５つの単位を有するオリゴ糖成分とからなるグリコスフィンゴリピドで ある。ガングリオシドの導入はリポソームの循環時間を延長させ、肝臓と比較し た血液中のリポソームの割合を増加させた。これは、ＲＥＳによるリポソームの 取り込みが低下したことを意味する。この効果は、非シアリルガングリオシドの 場合にはそれほど顕著ではない。文献ではこれを、シアル酸、そして特にリポソ ーム表面における核酸の負の電荷が、前記効果を与えるのに重要であることを示 すものであると解釈している。
“Ｍｅｄｉｃａｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ”　（ Ｋ、Ｙｏｇｉ編）１９８６の“Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ　ｉｎ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ａｐｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ”と称する章のｐ１２１〜１２９ でＳｕｎａｍｏｔｏは、リポソームを特定の組織及び細胞、特に肺に向けるため に、デキストラン、プルラン、アミロペクチン、アミロース及びマンナンを含む 種々の多糖類でリポソームをコーティングする方法を記述している。データによ れば、該多糖コーティングしたリポソーム内に薬物を封入すると、血流中及び組 織中の薬物（イヌリン）の循環時間が遊離イヌリンの場合よりも長くなる。
血流中のコーティングしたリポソーム内の薬物及びコーティングしていないリポ ソーム内の薬物の安定性及びクリアランスを比較するためのデータは示されてい ない。また、リポソームからの薬物の漏洩に関するデータもない。これらの事実 は多糖コーティングの効果に関する結論の有効性に疑問を投じるものである。し かしながら、この文書からは、多糖コーティングすることによりリポソームを肺 又は他の組繊にめがけて送ると、リポソームの循環時間が減少するであろうこと は予測される。別の研究者は、リポソームをターゲットに送るための糖タンパク 質及び糖脂質の使用を記述している。これについては、例えば前出のＧｒｅｇ。
ｒｉａｄｉｓの文献、１９８９．１９８８及び１９８７を参照されたい。
Ｊｅｎｎｉｎｇｓ及びＬｕｇｏｗｓｋｉはＪ、Ｉｍｍｕｎｏ　＋Ｏｇｙ　（１９ ８１）１２７．１０１１−１０１８で、Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔ ｉｄｉｓのワクチンを製造すべく多糖の免疫原性を増加させるために、髄膜炎菌 グループＡ、Ｂ及びＣ多糖類を破傷風トキソイドに結合する方法を開示している 。グループＢ多糖の免疫原性は有、意には増加しなかったが、結合体は破傷風ト キソイドに対する抗体を依然として産生させた。
本発明では、多糖成分が１分子当たり５つ以上のシアル酸単位を含む多糖化合物 を、活性成分を含む医薬組成物の製造で使用する新規の方法を提供する。この使 用方法は、患者の血液循環における活性成分の有効時間（ａｖａｉｌａｂｉｌｉ ｔｙ）を延長させ、活性成分の免疫原性を低下させ、及び／又は活性成分のｉｎ 　ｖｉｖｏ安定性を増加させるのに十分な量の多糖を前記組成物中に含ませるこ とからなる。
本発明では、多糖成分が１分子当たり５つ以上のシアル酸単位を含む多糖化合物 を、患者の血液循環における活性成分の有効時間を延長させ、活性成分の免疫原 性を低下させ、及び／又は活性成分のｉｎ　ｖｉｖｏ安定性を増加させるのに十 分な量で活性成分と組み合わせて含む新規の医薬組成物も提供する。
本発明は更に別のアスペクトとして、患者の血液循環における活性成分の有効時 間を延長させ、活性成分の免疫原−性を低下させ、及び／又は活性成分のｉｎ　 ｖｉｖｏ安定性を増加させるために、多糖成分が１分子当たり５つ以上のシアル 酸単位を含む多糖化合物の新規の使用も提供する。
本発明では、患者の血液循環における活性成分の有効時間の延長を、そのままで は薬物又は薬物複合体を取り込むであろう組織によって医薬的活性成分又は該成 分を含む複合体が認識されるのを防止もしくは遅延するか、又は特異的認識以外 の方法で療法上無関係の組織により早発に排出されもしくは取り込まれるために 生じる医薬成分の損失を防止もしくは遅延させることにより達成し得る。これら の効果は、活性成分の安定性も増加させる。前記多糖化合物は更に、又はあるい は、そのままでは医薬的活性成分もしくは該成分を含む複合体によって誘起され るであろう免疫応答を、免疫応答の初期認識段階を妨害することによって抑制す る。本発明は主に非経口投与用医薬組成物で有用である。
本発明では、多糖化合物は天然多糖、天然多糖の誘導体、例えば糖残基上の１つ 以上の活性基の反応によって誘導体化した多糖、又は多糖鎖のいずれかの末端も しくは該鎖沿いの中途にある活性基により誘導体化用の基（ｄｅｒｉｖａｔｉｓ ｉｎｇ　ｇｒｏｕｐ）に共有的に結合した多糖であり得、あるいは天然の多糖誘 導体、例えば結合したリン脂質もしくはタンパク質を含むもの、又は天然の多糖 誘導体の誘導体、例えば加水分解もしくは他の化学反応による誘導体のような化 学的に誘導体化した化合物であり得る。
該化合物の多糖部分はポリマー鎖中に５つ以上、好ましくは１０以上、より好ま しくは少な（とも２０又は５０のシアル酸残基を有する。入手が容易な多糖化合 物はポリマー鎖中に合計５００までの糖残基を有し得るが、通常は３００以下の 残基を有する。該化合物の糖残基は、その大部分又は全てがシアル酸残基である のが好ましい。
該多糖化合物では、少なくともポリシアル酸部分が、そして好ましくは化合物全 体が、高親水性である。親水性が高いと、多糖化合物が組織によって認識され又 は取り込まれる可能性、及び異化される可能性が低下すると考えられる。該多糖 の親水性は主にシアル酸単位のカルボキシル側基とヒドロキシル基とによって与 えられる。糖単位上には、アミン、ヒドロキシル又はスルフェート基のような別 の糖単位上の基を含む別の基、又はこれらの基の組み合せを存在させ得る。これ らの基は天然の多糖化合物中に存在するものであり得、又は（それほど好ましく はないカリ存在する天然の基の化学反応によりて導入し得る。該多糖は、血液循 環に存在する条件下で、即ち注射された時に、負の電荷を有するのが好ましい。
該多糖は幾つかの異なる糖の単位を含み得る。
本発明で特に有用な多糖化合物は細菌によって産生された多糖化合物である。該 天然化合物は多くの場合糖脂質である。即ち、リン酸エステル結合を介してリン 脂質に結合された多糖成分を含む化合物である。本発明ではこの種の糖脂質を天 然の形態で使用し得るが、脂肪酸鎖を加水分解によって多糖から除去した誘導体 が好ましいこともある。
シアル酸多糖類はＴ細胞から独立した抗原（Ｔ−ｃｅｌＩ　１ｎｄｅｐｅｎｄｅ ｎｔ　ａｎｔｉｇｅｎ）であり得るため、（注射すると）Ｂ細胞を直接活性化し て主にＩｇＭ抗体を産生ずる。これらの抗体は数日しか生存せず、従って該多糖 類は免疫原性が低い。これは、該多糖類を本発明で使用する上で有利なことであ る。
前記多糖化合物は末端ガラクトース単位を実質的に含んでいないのが好ましい。
該単位は肝細胞及びＫｕｐｐｆｅｒ細胞上のガラ細胞−ス受容体によって認識さ れ得るため、血液循環から更に早（クリアされ得るからである。
シアル酸（ノヌロソン酸（ｎｏｎｕｌｏｓｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）としても知られ ている）は炭素原子数９以上のアミノ含有糖類の一種である。最も重要なシアル 酸は、下記の式 で示されるＮ−アセチルノイラミン酸（５−（アセチルアミノ）−３，５−ジデ オキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトーノヌロソニック、ラクタミン酸及び０− シアル酸としても知られている）である。
ポリシアル酸は、通常α配置で、２→８及び／又は２→９結合し得る。
ポリシアル酸は通常非毒性であり、実質的に非免疫原性である。また、生分解単 位であるシアル酸は毒性であるとは知れていない。実際、シアル酸は血液細胞を 含む動物の細胞に広く存在している。
多数のシアル酸単位を含む多糖化合物は、大腸菌（Ｅ−ｃｏｌｉ）、Ｍｏｒａｘ ｅｌｌａ　ｎｏｎｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎｓＳＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ　ａｅｒ ｏｇｉｎ。
ｓｉｓ及びＮｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉＳによって産生される 多糖類又はその誘導体である。例えば、大腸菌に１から（鎖長を短縮するための 加水分解によって）誘導されたコロミン酸は２→８α結合シアル酸単位を含み、 平均鎖長が約１６単位である。大腸菌に９２株由来の多糖は２→８結合シアル酸 単位及び２→９結合シアル酸単位を交互に含み、平均鎖長が約７８単位である。
Ｎ、　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓグループＣの多糖Ｃは２→９結合シアル酸単位 を含み、平均鎖長が約３６１単位である。最後に挙げた化合物を脱アセチル化し たものは、平均鎖長が約１７２単位である。
本発明で特に有用であることが判明した多糖化合物グループの１つは、グループ Ｂ多糖類である。これらの化合物はＮｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄ ｉｓＳｍ。
ｒａｘｅｌｌａ　ｎｏｎｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｐａ５ｔｅｕｒｅｌｌａ　 ａｅｒｏｇｉｎｏｓｉｓ　Ａ２及び大腸菌に１によって産生される。これらの化 合物は、シアル酸残基を含む多糖成分と、リン脂質成分とを含んでいる。
シアル酸残基は（２→８）−α結合されており、天然ポリマーは約２００の残基 を有する。該糖脂質は、多糖成分の還元末端（ｒｅｄｕｃ　ｉｎｇ　ｅｎｄ）に リン脂質が共有結合していると思われる。
多糖化合物の由来源たる細菌は、製造時の便宜上、非病原体であるのが好ましい 。従って多糖は、大腸菌の非病原株、例えば大腸菌に９２から誘導するのが特に 適当である。
大腸菌に９２単離体はよく知られており、この種の任意の株の任意のタイプを適 当な多糖の由来源として使用することができる。
糖脂質である多糖化合物は、天然の糖脂質の形態又は誘導体として使用し得る。
特に適当な誘導体は、加水分解によって脂肪酸鎖をグリセロホスフェート基から 除去し、ポリシアル酸グリセロホスフェートエステルを残すようにしたものであ る。加水分解は通常、穏やかなアルカリで処理することによって行う。この処理 は、糖脂質分子が凝集するのを防止する。この処理を行わないと、分子の脂肪酸 鏡開の疎水性相互作用によって水性媒質中で前記凝集が生起する。Ｎ、ｍｅｎｉ ｎｇｉｔｉｄｉｓ多糖Ｂの脱凝集（ｄｅａｇｇｒｅｇａ　ｔ　１ｏｎ）方法は、 Ｌｉｆｅｌｙらにより、Ｐｏｏｌｍａｎら編“Ｇｏｎｏｃｏｃｃｉ　ａｎｄＭｅ ｎｉｎｇｏｃｏｃｃｉ”　（１９８８）ｐｐ１４７〜１５２に記述されている。
天然多糖類は、例えばＬｉｆｅｌｙらによりＣａｒｂ。
ｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅｓ　（１９８６）１５６、ｐ１２３に記述されているよう に、鎖長を短くするために加水分解し得る。加水分解反応の条件（例えば時間及 び温度）は、選択した平均分子量の生成物が得られるように選択し得る。
前述の多糖類は更に、ノアル酸単位の５−Ｎ−アセチル基の一部又は全部をＮ− 悦アセチル化することによって誘導体化し得る。その結果得られた５−アミン基 は、例えば、アミノ酸、ペプチドモもしくは肪酸酸を含む酢酸以外の酸による部 分的Ｎ−再アセチル化、Ｎ−アシル化等により更に誘導体化し得る。
多糖類の別の誘導体化方法の１つでは、ポリシアル酸鎖の非還元末端でアルデヒ ド基を形成する過ヨウ素酸ナトリウムでの酸化を行う。このようにすれば、薬物 のアミノ基（例えばタンパク質側鎖又は末端基）との間でシッフ塩基反応が生じ 得る。
これらのシアル酸含有多糖化合物を患者の血流中に投与すると、一部分が血流か ら迅速に取り込まれ、残りが通常は一定の速度で排除されることが判明した。初 期の急速な取り込みステップの後の化合物の半減期は、本発明における多糖化合 物が、活性成分の循環時間及び／又は安定性の増加、及び／又は活性成分の免疫 原性の低下に適しているかどうかを示す良き指標であり、この半減期が長い化合 物が特に適当な化合物ということになる。また、最初の急速なステップで排除さ れる化合物の割合は、潜在的有用性の指標であり、有用な化合物は、最初のステ ップで血液循環から排除される化合物の割合が皆無であるか又は僅かでしかない 化合物である。
本発明で使用する多糖化合物は、静脈内投与後に、例えば注射してから約５分以 内に血液循環から排除される割合が約５０％以下、好ましくは約２５％以下、よ り好ましくは約２０％以下であるのが好ましい。適当な多糖化合物は、最適効果 を得るために、急速排除段階後の（当該組成物で処理した動物内での）半減期が １０時間以上、好ましくは２０時間以上、例えば３０時間以上であるのが好まし い。
多糖のシアル酸単位数と該化合物の急速排除及び半減期との間には相関関係があ り、平均単位数が約２０以上、より好ましくは５０以上、更に好ましくは一１０ ０以上の化合物は特に良好な特性を示すことが判明した。従って、最大限の鎖長 のポリシアル酸化合物を使用するのが好ましいことになるが、用途によっては、 例えばリポソームのコーティングを行うか又はタンパク質と結合させるために、 天然の多糖化合物を加水分解して鎖長を短縮するのが有利なこともある。
本発明では、医薬的活性化合物を多糖化合物に直接共有結合させ得る。活性化合 物は化学量論量で多糖化合物に結合させ得る。即ち、１つの活性成分分子を１つ の多糖化合物分子に結合し得る。あるいは、２つ以上の活性成分分子を１つの多 糖化合物分子に結合させるか、又は２つ以上の多糖化合物分子を１つの活性成分 分子に結合させるのが適当なこともある。
共有結合は例えば、一方の分子上のカルボキシル基と他方の分子上のアミン基と の間のペプチド結合によって行い得、又は一方の化合物のカルボキシル基と他方 の化合物のヒドロキシル基との間のエステル結合を介して行い得る。
結合は場合によっては、体内、例えば活性成分が効果を示す組織内で溶解できる ものであり得る。しかしながら、このような溶解は不要なことが多い。多糖は活 性成分の活性に有意な影響を及ぼすとは限らないからである。活性成分を多糖化 合物に共有結合させ得る別の結合としては、一方の化合物のアミノ基と他方の化 合物のアルデヒド基との間でシッフ塩基を介して行われるものがある。
医薬的活性化合物は、例えば、過ヨウ素酸塩酸化によりポリマーの非還元末端に 形成されたアルデヒド基と、該アルデヒド基と反応する活性成分上の遊離アミノ 基との間でシッフ塩基を形成することにより、シアル酸含有多糖又はその誘導体 に共有結合できる。あるいは、医薬的活性化合物上の遊離アミノ基をシアル酸残 基の１−カルボキシル基と反応させてペプチジル結合を形成してもよい。あるい は、１−カルボン酸基と活性成分上のヒドロキシル基又は別の適当な活性基との 間でエステル結合を形成することもできる。あるいは、医薬的活性化合物上のカ ルボキシル基が脱アセチル化５−アミノ基との間でペプチド結合を形成し得る。
あるいは、医薬的活性化合物の分子のアルデヒド基がシアル酸残基のＮ−説アセ チル化５−アミノ基との間でシッフ塩基を形成し得る。例えばアミン基とチオー ル基とを結合するために、又は２つのヒドロキシル基を結合するために、二官能 価結合化合物を使用してもよい。
多糖化合物は非共有的に医薬的活性化合物と組み合わせることもできる。例えば 、多糖化合物と医薬的活性化合物とを、例えば多糖化合物の脂質成分を介する疎 水性医薬的活性化合物との疎水性相互作用によって結合し得る。別の非共有的結 合は、逆の電荷のイオンが誘引し合う静電相互作用を介して実施し得る。例えば 、正の電荷の活性成分、例えば第４アンモニウムイオンを有する成分を、多糖の カルボキンレート基とイオン結合させ得る。多糖Ｂのカルボキシレート基にイオ ン結合した抗生物質ドキソルビシンはその一例である。
本発明の別の実施態様では、薬物給送システムを介して多糖化合物を医薬的活性 化合物と相互作用させ得る。例えば、前述したようなりＤＳの一般的な分子又は 粒状成分の認識及び取り込みを操作することによって血液循環における活性成分 の有効時間を操作するために、多糖化合物を使用し得る。この実施態様では、多 糖化合物を薬物給送システムの粒状又は分子エンティティに共有的に結合するか 又は非共有的に組み合わせ得る。例えば、多糖化合物は前述のポリエチレングリ コール及び／又はＰｌｕｒｏｎｉｃコポリマータイプの材料の作用と類似の作用 を示し得る。
多糖化合物とリポソームとの間の共有的相互作用（ＣＯｖａｌｅｎｔ　１ｎｔｅ ｒａｃｔｉｏｎ）の具体例としては、リン脂質のグリセロホスフェート頭（ｈ　 ｅ　ａ　ｄ）基の間のリン酸エステル結合を介するものが挙げられる。該共有結 合は、リン脂質の小胞形成の前又は後に形成され得る。
あるいは、シアル酸の１−カルボン酸基、多糖のヒドロキシル基、又は脱アセチ ル化によって生成されたアミン基と、疎水性鎖を含む分子上の反応基との間の相 互作用を介して、多糖を脂質成分に結合することもできる。例えば、疎水性分子 は、自己のアミン基に対して共有結合が形成され得る脂質、特にホスファチジル エタノールアミン誘導体であり得る。また、非イオン合成界面活性剤小胞と多糖 化合物との間の共有的相互作用は、小胞の形成の前又は後に形成された分子の疎 水性部分へのエステル、アミド又はエーテル結合を介して生起し得る。
多糖化合物はＰＤＤＳ成分に非共有的に結合することもできる。非共有的結合は 例えば、ＰＤＤＳ成分の疎水性部分と、疎水性基（例えば糖脂質）を含む多糖化 合物又は疎水性基に共有結合した多糖化合物との間の水素結合相互作用（ｈｙｄ ｒｏｇｅｎ　ｂｏｎｄｉｎｇ　１ｎｔｅｒａｃａｔｊｏｎ）であり得る。前述の ような多糖化合物の疎水性誘導体は、多糖化合物のシアル酸残基の１−カルボン 酸基、多糖化合物のヒドロキシル基、又は多糖分子のアルデヒド誘導体を、例え ばヒドロキシル基、カルボン酸基、ハロゲン原子又はアミン基と反応させること によって生成し得る。例えば、糖脂質化合物をリポソーム又は界面活性剤小胞の シェル内に導入して、その脂肪酸疎水性鎖部分を脂質又は界面活性剤の疎水性部 分と相互作用させ得る。例えば多糖Ｂ、に９２は、このような用途で使用するの に適している。糖脂質は、小胞の形成中に、又は小胞の形成後に、糖脂質と予形 成したリポソームとの平衡化によって、界面活性剤又はリン脂質と共有的に組み 合わせる。
ＤＤＳが、抗体、ネオグリコプロティン又は合成ポリマーのような高分子成分を 含んでいる場合は、多糖化合物を該高分子成分と共有的又は非共有的に結合し得 る。共有結合は、医薬的活性化合物と多糖化合物との間の結合に関して上述した タイプのエステル、ペプチド又は他の結合を介して行い得、最も有利には、高分 子のペプチド部分上のカルボキシル基又はアミン基との間のペプチド結合を介し て行う。
多糖類と別の化合物、例えばタンパク質、ペプチド又は脂質との間の共有結合を 形成する方法は多くの実施例が知られており、先に示唆した共有結合を達成する のに使用できる。例えば還元糖は、Ｇｒａｙ　Ｇ、、Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ 、Ｂｉｏｐｈｙｓ、上６３．４２６　（１９７４）に記載のような反応性アミン 化処理を行い、次いで、Ｂ。
ｒｃｈＲ，Ｆ、らがＪ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、９３゜２８９７　（１９７１ ）に記載しているようなシアノヒドリドポレートアニオンによるエナミン中間体 の選択的還元を行って第二アミンを生成することにより、アミン基、例えばペプ チドのＮ末端のアミン基、リシン含有ペプチドの側鎖のアミン基、又は脂質のエ タノールアミン基のアミン基に結合し得る。シアル酸残基を含む非還元糖はまず 、Ｊｅｎｎｉｎｇｓ　Ｈ，Ｊ、らがＪ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１２７゜１０１１　（ １９８１）に記述しているように、過ヨウ素酸塩を用いる選択的酸化により誘導 体化してアルデヒド基を形成し、その後反応アミン化処理で結合し得る。
ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｓ、２０２．８６　（１９８６）に記載のＷｅｉｓｓｉｇ　 Ｖ、らの方法に基づいて、糖単位のカルボン酸基、例えばシアル酸を、カルボジ イミドの存在下で、アミン基、例えばペプチドのＮ末端のアミン基又はリシン残 基の側鎖のアミン基に結合する反応方法もある。
勿論この方法は、シアル酸単位の５−説アセチル化アミン基を例えばタンパク質 側鎖又はＣ末端のカルボン酸基に結合するためにも使用し得る。
別の反応方法では、例えば、カルボン酸基に反応させたバラ−フェニレンジアミ ンを用いて多糖中に導入した芳香族アミン基をジアゾ化し、次いで、Ｂｉｏｃｈ ｅｍ、Ｂｉ載の５ｙｎｄｅｒ　Ｓ、Ｌ、らによって開発された方法をＢＢＡ　１ ００３．５８　（１９８９）に記載のようニ５ｅｎｉｏｒらが改変した方法と類 似の方法で、タンパク質のフェニルアラニン又はチロシン残基の側鎖と反応させ る。
多糖化合物上の遊離ヒドロキシル基は、例えば二塩基酸又は酸誘導体を用いるエ ステル化により、タンパク質又は脂質上の遊離ヒドロキシル基又はチオール基に 結合し得る。
炭水化物部分に結合すべき化合物がイソチオシアネート基を含んでいる（又は、 イソチオシアネート基を含むように、例えばアリール基を介して誘導体化できる ）場合は、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅｓ、（１９７３）３０゜３７５−３ ７８に記載のＢｅ１ｄｅｒらの方法に従い、例えばジブチルスズジラウレートで 促進させたメチルスルホキシド中での反応により、前記化合物を多糖の遊離ヒド ロキシル基に結合し得る。生成物はチオカルバモイル誘導体である。例えばフル オレセインイソチオシアネートを反応させてＯ−（フルオレセイニルチオカルバ モイル）シアル酸誘導体を生成し得る。
シアル酸含有多糖の別の反応では、遊離アミン基を露出するために、部′公的脱 アセチル化、即ちＮ−アセチル基の一部の除去を行い、次いでこれらのアミン基 を前述のように共有結合反応によって反応させる。この予備の脱アセチル化によ って可能になる更に別の反応は、ヘテロニ官能価反応体、例えばヨード酢酸のＮ −ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ブロ モアセチルアミノ）ベンゾエート、又はＮ−スクシイミジル−３−（２−ピリジ ルジチオ）プロピオネートとの反応であり、これに次いで、ペプチド又はタンパ ク質のチオール基への結合が行われる。この方法は、Ｗｏｌｆｆ及びＧｒｅｇｏ ｒｉａｄｉｓによりＢｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ。
Ａｃｔａ　（１９８４）８０２，２５９−２７３に記載されていると共に、Ｂａ ｒｂｅｔらによりＪ、Ｓｕｐｒａｍ。
１．５ｔｒｕｃｔ、Ｃｅｌ　１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、（１９８１）１６，２４３− ２５８に記述されている。
多糖化合物をリポソームのコーティングに使用する場合は、例えばアンカー付き （ａｎｃｈｏｒｅｄ）多糖化合物、即ち疎水性アンカ一部分を備えた多糖化合物 をリポソーム形成脂質と混合することによって、リポソームの形成時に該化合物 を導入し得る。多糖化合物は、リポソーム表面上の活性基、例えばアミン基、芳 香族アミン基、カルボン酸基又は誘導体、例えば酸塩化物基との反応によって、 予形成したリポソームの表面に後で反応させる（ｐｏｓｔ　ｒｅａｃｔ）ことも できる。例えば、Ｗｅｉｓｓｉｇ　Ｖ。
ら（前出の文献）は、ホスファチジルエタノールアミンのＮ−グルタリル誘導体 であるアンカーを記述している。カルボン酸基は、カルボジイミドの存在下で、 多糖化合物上のアミン基、例えば脱アセチル化又は部分的脱アセチル化ポリシア ル酸化合物のアミン基と反応させ得る。あるいは、パルミトイル又は別の脂肪酸 塩化物を用いて多糖化合物上のアミン基と反応させることもできる。シアル酸残 基の１−カルポン酸基は、カルボン酸ナトリウム塩のクラウンエーテルを形成し 次いでハロ炭化水素と反応させることにより、ヒドロカルビル−ハロゲン原子を 有する疎水性基含有化合物とのエステル結合を形成するのに使用できる。リポソ ーム及び脂質へのタンパク質結合方法であって、リポソーム及び脂質への多糖の 結合に容易に適用できる他の多（の方法がＧｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ　Ｇ、編“Ｌ ｉｐｏｓ。
ｍｅｓ　ａｓ　ｄｒｕｇ　ｃａｒｒｉｅｒｓ”ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ　＆　５ｏｎ ｓ（１９８８）、Ｈｅａｔｈ　Ｔ。
９８６）及びＭａｃｈｙ、Ｐ、　ら、”Ｌｉｐｏｓｏｍｅｉｎ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉ ｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ″　、Ｌｅｓ　Ｅｄｉｔｉｏｎ ｓ　Ｉｎｓｅｒｍｓ、Ｐａｒｉｓ　（１９８７）に記述されており検討されてい る。
本発明は更に別のアスペクトとして、１分子当たり５つ以上のシアル酸単位を含 む多糖部分が外表面に結合している新規のリポソームを提供する。該リポソーム は、療法又は診断による処理方法で使用し得る。
本発明は更に別のアスペクトとして、リポソーム形成脂質の混合物と、１分子当 たり５つ以上のシアル酸単位を有する多糖成分を含むと共に疎水性部分を含む多 糖化合物とから、リポソームを製造するための新規の方法も提供する。
本発明のこれらのアスペクトでは、多糖を前述の方法のいずれかを用いてリポソ ーム内に導入し得る。リポソームの形成に使用する多糖化合物が天然の糖脂質以 外のものである場合は、その化合物が、例えば１−位置又は窒素原子を介して多 糖成分のシアル酸単位に共有結合した疎水性部分を有するのが好ましい。１−位 置を介する結合は例えばエステル結合を含み得る。この種の多糖化合物は新規で あると考えられ、本発明の別のアスペクトを構成する。
１−位置のエステル結合は、１分子当たり５つ以上のシアル酸残基を含む多糖部 分を有するアルカリ金属又はアンモニウム塩形態の化合物にクラウンエーテルを 反応させる第１ステツプと、第１ステツプの生成物を式Ｘ−Ｒ１［Ｒ１は任意に 置換したＣ８−３゜−アルキル又は−アルケニル基であり、Ｘはハロゲン原子で ある］の化合物と反応させる第２ステツプとを含む新規の方法によって形成し得 る。該反応の第１ステツプは、１８−クラウン−６のようなりラウンエーテルの 存在下で、水溶液、例えば、多糖のナトリウム塩（即ちシアル酸のカルボキシル 基のナトリウム塩）の水溶液中で実施し得る。反応後は、例えば室温で反応が完 了するまで（例えば数分〜数時間、例えば５分〜５時間）、例えば蒸発により、 又は好ましくは凍結乾燥により、水を除去する。次いでクラウンエーテルを、例 えば有機溶媒、有利にはジメチルホルムアミドに再溶解し、その後ハロ炭化水素 又は置換化合物を加え、反応が生起するまで高温又は好ましくは室温で例えば数 時間又は数日、例えば５時間〜５日間撹拌する。化合物ＸＲＩのアルキル又はア ルケニル基は、任意にアルキル基もしくはアルケニル基のような置換基を含んで いてよい通常Ｃ１１−！４、好ましくはＣｌ４−２□のアルキル又はアルケニル 、アルキル又はアルケニル基が６〜３０個の炭素原子を有するアルカノイルオキ シ又はアルキルカルボキサミドである。
本発明の広いアスペクトでは、多糖が共有結合を介して活性成分の分子に直接結 合されるが、その場合は、例えば活性化合物が小分子又は比較的短いポリペプチ ドであれば、活性成分の各分子に単一の分子を結合し得る。単一の多糖分子を結 合する場合は、該分子が５０以上のシアル酸単位、好ましくは約１００以上のシ アル酸単位で形成されていると特に有効である。多糖を、ＤＤＳを介して活性成 分に結合するか、又は共有結合を介して比較的大きい分子、例えばタンパク質も しくはポリペプチドである活性成分に直接結合する場合は、１つ以上の多糖分子 を、それぞれの場合に応じて、ＤＤＳ単位又は各活性成分分子に組み合わせると 有利であり得る。多糖のシアル酸単位数が比較的少ない場合、例えば５０単位以 下又は２０単位以下の場合は、各ＤＤＳ単位又は活性成分分子に複数の分子を組 み合わせるのが好ましい。通常は、シアル酸単位数を比較的多（有する、例えば ５０以上又は約１００以上有する複数の分子を各ＤＤＳ単位又は活性成分分子と 組み合わせるのが好ましい。各ＤＤＳ単位又は活性成分分子と組み合わせられる シアル酸単位の総数は、活性成分に付与される総組水性に影響を及ぼす。比較的 高い分子量の多糖分子を使用すると、活性成分又はＤＤＳからより離れた地点に 立体効果（ｓｔｅｒｉｃ　ｅｆｆｅｃｔ）が得られる。これは、活性成分の血液 循環における半減期及び安定性を増加させ、免疫原性を低下させると考えられる 。高分子量多糖化合物を使用する場合は、特に活性成分が比較的低い分子量を有 する時、例えばペプチドである時は、１つ以上の活性成分分子を各多糖化合物分 子と組み合わせ得る。
本発明は、医薬的活性化合物が患者の血液循環中で長時間にわたって効果を示す 必要がある場合に特に有用である。
本発明は、組換えＤＮＡ技術によって形成されたタンパク質であって、自己の医 薬的活性が発揮されない組織に急速に取り込まれる傾向のあるタンパク質を含む 医薬的活性成分にとって特に有用である。本発明によって血液循環における有効 時間が延長されるような医薬的活性化合物は、インターロイキン、例えばＩＬ− ２、Ｉ　Ｌ−５又はＩＬ−１インターフエロン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）　、並 びに例えばＡｂｕｃｈｏｗｓｋｉ　（前出の文献）によって記述されているよう な酵素療法で使用される酵素等である。本発明で有利に使用し得る別の化合物類 は、血流中の細胞上に存在する特定の受容体との相互作用に関してＨＩＶのよう なウィルスと競合する化合物である。本発明で使用し得る活性化合物の１つは、 臨床検査で使用できる蛍光物質である。
例えば、フルオレセイン誘導体は多糖化合物に直接結合するか、又は多糖化合物 でコーティングしたリポソーム内に導入し得る。リポソーム又は他のＤ　Ｄ　Ｓ 内に通常導入するのに有用な活性成分としては、細胞成長抑止剤、サイトカイン 、抗生物質、ヘモグロビン、酵素、ホルモン、ステロイド等が挙げられる。
以下の実施例は、全ての哺乳動物のモデルとして使用したマウスにおける活性成 分のモデルとして使用した分子の循環時間の増加を明らかにするものである。活 性成分を多糖化合物と組み合わせてヒトに投与した場合にも同様の効果が観察さ れると予想される。
Ｎ、ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのグループＢ多糖は、約２００残基（シアル酸単 位）の鎖長を有する（２→８）α−結合シアル酸残基と、当該ポリマーの還元末 端のリン脂抽出される。該ポリマーは水溶液中で凝集する（凝集形態又は完全（ ｉｎｔａｃｔ）形態）。溶液を０．１ＭＮａＯＨで３７℃で４時間処理するとリ ン脂質のアシル鎖が除去され、ポリマー鎖は脱凝集（ｄｅａｇｇｒｅｇａｔｅ） される。
大腸菌Ｋｌ由来の多糖Ｂは約１９０個のシアル酸単位を有する２→８結合したシ アル酸のホモポリマーである。大腸菌に１は僅かな病原性を有する。以下の実施 例では大腸菌に１をｒＫＩＪと称する。
多１１Ｂは、１００℃、ｐＨ７，０ｔ’１〜９時間処理すると自己加水分解して 、おそらく８０単位未満の鎖長を有する低分子量ポリマーを形成する。以下の実 施例では該多糖を［低分子量（ｍｗ）多糖」と称する。
大腸菌に１由来の多糖Ｂは、鎖長を更に短くして平均鎖長約１５〜３０単位のコ ロミン酸として知られている生成物を形成すべ（加水分解し得る。コロミン酸は 市販されている。以下の実施例で使用するコロミン酸はＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃ ａｌ　Ｃｏ、から入手したものである。
大腸菌に９２由来の多糖に９２は、多糖部分がシアル酸２−８結合及び２→９結 合を交互に有する鎖長約８０〜１００単位のホモポリマーからなる糖脂質である 。以下の実施例では該多糖をｒＫ９２Ｊと称する。大腸菌に９２は実質的に非病 原性である。リン脂質部分はＮ、ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ多糖Ｂの場合と同様 に加水分解によって除去し得る。
Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓグループＣ由来の多糖Ｃは、２ →９結合したシアル酸単位のホモポリマーであり、鎖長は約１２０単位である。
該多糖は糖脂質であり、リン脂質部分はＮ、ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉＳ多糖Ｂの 場合と同様に除去し得る。
フルオレセイン結合（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｃｏｎｊｕｇａ　ｔ　ｉ　ｏｎ ） フルオレセインは臨床検査用の物質として使用され、そのままで、例えばｉｎ　 ｖｉｖｏの透過性及び微小循環を検査するための医薬化合物である。以下の実験 の一部では、（マウスの）血液循環からのフルオレセインのクリアランス速度に 対する多糖結合の効果を調べるためにフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩ ＴＣ）を使用する。フルオレセインは良く知られている方法で１２Ｊを用いて放 射性標識することができる。このようにすれば、＋２Ｊ放射性標識の存在を検出 することによって、「ホット（ｈａ　ｔ）　Ｊフルオレセイン１２５Ｉをアッセ イすることができる。ＦＩＴＣは、多糖のテトラブチルアミノ塩を形成すること によってポリシアル酸多糖化合物に結合する。次いで、最初にＡ。
Ｎ、ｄｅ　Ｂｅ１ｄｅｒらによりＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅｓ、３０，３ ７５　（１９７３）に記述された方法を用いて、前記塩をＤＭＳＯ／ピリジン溶 液中で撹拌しながら室温で２４時間ＦＩＴＣと反応させる。この基本的反応は下 記の通りである・ 透析によって非結合ＦＩＴＣを抽出し、次いでエタノールで結合体を沈降させ、 ゲル濾過にかけ、最後に再びエタノール中で生成物を沈降させることによって、 ０．９３ｎｍｏｌのＦＩＴＣ１５０，０００ダルトンのＢ多糖を含む結合体を回 収する。この結合後に１２５Ｉ標識を行う。
当業者には公知のように、非結合フルオレセインは約５分以内に血液循環から実 質的にクリアされる。
ポリシアル酸のアッセイ 血液試料中でグループＢ多糖（Ｐ　Ｓ　Ｂ）を含むポリシアル酸をアッセイする ために、血漿試料をまずトリクロロ酢酸（最終濃度１０％）で処理して血清タン パク質を沈降させる。該タンパク質の多くは、シアル酸を該タンパク質の末端基 として含む。処理した血清を、Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、ｖ ｏｌ、２４，６０４〜６１１ページ（１９５７）に記載のＳｖｅｎｎｅｒｈｏｌ ｍの方法を少し改変したものを用いてアッセイする。このア・ソセイは、ポリマ ーシアル酸又は別のシアル酸を次のように測定するものである・多糖含有試料（ ０，５ｍ１）をＲｅ５ｏｒｃｉｎｏｌ試薬（０，５ｍ１）と混合し、激しく沸騰 している水中で３０分間加熱する。試料を冷却し、そのまま５７０ｎｍで読み取 るか、又は色をアミルアルコール（１ｍｌ）で抽出して５９０ｎｍで読み取る。
既知量の適当な多糖を血清に加え、さもなければ前述のように血清タンパク質を 沈降させるために血清を同様の方法で処理し、これを前述の比色方法で分析する ことによって標準曲線を体重２５〜３０ｇのＴ、Ｏ，異系交配マウスに、凝集又 は脱凝集状態のＮ、ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓグループＢ多糖を１．４〜２．８ ｍｇ含むｐＨ７，４のリン酸塩緩衝食塩水を０．２ｍｌ静脈（尾の静脈）注射し た。注射の直前と、注射後に時間間隔をおいて動物の尾の静脈から血液を採取し 、血清試料をグループＢ多糖についてアッセイした。該アッセイは、血清タンパ ク質の沈降後に比色法によってシアル酸を測定するものである。前記タンパク質 の多（はシアル酸も含んでおり、さもなければ該方法を妨害する。
血清中のグループＢ多糖の値を対数グラフにプロットし、凝集又は脱凝集状態で 注射したポリマーの半減期を算出した。結果を下記の表１及び第１図のグラフに 示す。
表　１ ＊　５つの個別の実験で、Ｔ、Ｏ，マウスのペアに、それぞれ完全な又は脱アシ ル化したＰＳＢを１．４〜２．８ｍｇ含むＰＢＳ中１％ＮａＣｌを０．２ｍｌ静 脈注射した。
時間間隔をおいてマウスの尾の静脈から採血し、血漿を多糖Ｂのアッセイにかけ た。結果はマウス血液総量当たりの注射物質量の％で表す。表１に数値で示した 結果は、注射後２〜４分以内では、注射した多糖の４０．０〜５７．８％が血液 循環中に残留している、即ち凝集多糖の注射量の４２．２〜６０％が注射後２〜 ４分以内に血液循環から排除されることを示している。その後、排除速度は低下 し、約２０時間の半減期を示している。初期の急速な多糖排除の原因は、多糖が 凝集状態を有しているため、形成された粒子が最初の通過（ｐａｓｓａｇｅ）時 に肺又はＲＥＳに捕捉されることにあると思われる。これに対し、注射後最初の ２〜４分の間に組織によって排除された脱凝集多糖は１０〜１９％にすぎない。
注射量の残りは約３０時間の半減期でゆっくりと排除された。
脱凝集状グループＢ多糖の注射量の殆ど全部が長い半減期（３０時間）と直線的 な血液循環からのクリアランス速度（対数スケールで）とを示したという事実は 、該（脱凝集形態の）ポリマーが、該ポリマーに共有的に結合した薬物、ペプチ ド及びタンパク質の循環時間を延長させるための手段として極めて有望であるこ とを示唆するものである。
該ポリマーは、薬物含有又は薬物結合ＤＤＳ又はＰＤＤＳの血液循環における半 減期を延ばすために、これらＤＤＳ又はＰＤＤＳをコーティングする材料として も使用し得る。
また、凝集（糖脂質）形態もリン脂質−小胞ＰＤＤＳの半減期を延ばすのに有用 であり得る。
実施例２ フルオレセインに結合した完全低分子量ＰＳＢの血液循環からのクリアランス： 用量の効果 完全「低」分子量多糖Ｂをフルオレセインと結合し、該フルオレセインを１２８ １で放射能標識したものを含むリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）をＴ、Ｏ，マウス に０．２〜０゜２５ｍ１静脈注射した。時間間隔をおいて動物の採血を行い、血 漿中の１２１１■放射能を測定した。値は個々の動物から得たものであり、総血 液（体重の７．５％で計算）中の注射物質の放射能の％を表す。用量を記した列 は、注射前に混合したコールド（ｃｏｌｄ）（非放射性ヨウ素化）及びホット（ 放射性ヨウ素化）ＦＩＴＣ−多糖Ｂ結合体の総量を示す。括弧内の数字は前記混 合物中の放射性ヨウ素化結合体の量（μｇ）を表す。
結果を下記の表２及び第２図のグラフに示す。
表　２ これらの結果は、結合フルオレセインが非結合フルオレセインの既知のクリアラ ンス速度と比べて比較的遅い速度で血液循環からクリアされることを示している 。低分子量多糖結合は、注射後３０分以内に約７０％のＦＩＴＣ結合体を血液循 環からクリアさせている。半減期は約６時間であり、用量には依存していない。
最後に挙げた事実は、比較的高い用量で投与する必要のある何らかの活性成分に ついて、即ち多糖の用量を多（する場合に、多糖が活性成分の循環時間を延長さ せる効果を発揮するのを妨害し得る「飽和濃度」が存在しないことを意味する。
別の利点は、極めて少量の多糖の使用によって活性成分の循環時間を延ばすこと ができることにある。また、クリアランス速度がホットＦＩＴＣ対総ＦＩＴＣの 比に作用されないため、コールドＦＩＴＣと異なるであろうホットＦＩＴＣのク リアランス速度を測定するだけではない。
実施例３ フルオレセインに結合した脱アシル化低分子量多糖Ｂ　（Ｎ。
ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の血液からのクリアランス：用量の効果 加水分解（脱アシル化）「低」分子量多糖ＢをＦＩＴＣに結合しその後ＦＩＴＣ を１０Ｉで放射能標識したものを含むＰＢＳを、Ｔ、Ｏ，マウスｉ：０．２〜０ ．２５ｍ１静脈注射した。放射性ヨウ素化結合体と混合したＦ　ｒ　ＴＣ−多糖 Ｂ結合体を用いて、リン脂質のアシル基を除去するための加水分解を行った（３ ７℃、ｐＨ８，０で４時間）。
結果を下記の表３及び第３図のグラフに示す。
これらの結果は実施例２の結果と類似しており、実施例２で使用したものと類似 しているが加水分解によってリン脂質部分を脱アシル化した該多糖化合物との結 合を行った場合には、注射後最初の３０分程度で２９．３〜７０．２％のＦＩＴ Ｃ結合体が血液循環からクリアされ、従って半減期は約５時間半であることを示 している。リン脂質部分の脱アシル化は循環時間の増加に関する限りは多糖化合 物の特性に殆ど影響しないと思われる。但し、脱アシル化多糖（表３）の対応す る時間の濃度がより高い最初の数分間は例外である（表３）。これはおそらく、 天然多糖を加水分解して鎖長を短くすると、多糖分子の僅かな部分だけがリン脂 質鎖を結合してもつことになるためである。従つて、リン脂質の脱アシル化は少 数の分子にしか作用しない。
実施例４ 静脈注射後の血液循環からの多糖Ｃ（ＰＳＣ）（Ｎ、ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ ）のクリアランスＮ、ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ多糖Ｃを用いて実施例１の方法 で操作を行った。完全多糖と、リン脂質基を脱アシル化した加水分解形態の多糖 とを比較した。
完全な、又はリン脂質を脱アシル化するために加水分解した多糖Ｃ（ＰＳＣ）を Ｔ、Ｏ，マウスに１２５０μｇ静脈注射した。時間間隔をおいてこれらの動物の 採血を行い、血漿試料をＮ−アセチルノイラミン酸（ＮａＮａ）（シアル酸）に ついて分析した。個々の動物の結果を総血液当たりの注射物質の％で表す。
結果は下記の表４及び第４図のグラフに示した。
これらの結果は、実施例１の結果と同様に、完全ＰＳＣの場合も、加水分解（脱 アシル化）したＰＳＣの場合も、注射後に多糖化合物の一部が比較的急速に血液 循環から排除されるが、その後は排除速度が低下することを示している。加水分 解形態多糖の排除速度（半減期２０時間）よりも完全多糖の排除速度の方が高く （従って半減期がより小さく、８時間）、加水分解形態多糖は循環時間を延長さ せ且つ活性成分を安定させるための物質として有望である。
多糖に９２を完全形態及び（リン脂質基を脱アシル化するために）加水分解した 形態で使用して、実施例１及び４の操作を繰り返した。
Ｔ、０．マウスに１２３０μｇの完全又は加水分解（脱アシル化）多糖に９２　 （ＰＳ　Ｋ９２）を静脈注射した。
時間間隔をおいてこれらの動物の採血を行い、血漿試料をＮ−アセチルノイラミ ン酸（ＮａＮａ）について分析した。
個々の動物の結果は、総血液当たりの注射物質の％を表す。
結果は下記の表５及び第５図のグラフに示した。
表　５ これらの結果は、どちらの多糖化合物でも、注射後の最初の数分における初期損 失が比較的少ないことを示している（試験したその他の多糖化合物と比較して） 。また、その後の血液循環からの排除速度は極めて低（、いずれの場合も半減期 は約４０時間である。従って、５日後でも、有意な割合の多糖が循環中に残留し ている。
該化合物のリン脂質部分からのアシル基の除去″は半減期に有意な影響を及ぼす ように思われないが、その理由は十分には解明されていない。化合物の特定の構 成が特性に著しい影響を与えるためにリン脂質の存在が効果を殆ど示さないのか もしれない。これらの化合物は、薬物の循環時間及び安定性の増加に極めて有効 であると予想され、薬物に十分に長い放出特性を付与し、ターゲツティング基に よって器官又は細胞へのターゲティングを最適化させると思わ完全コロミン酸に ついて実施例１の方法を繰り返した。
目５■で標識したＦＩＴＣ−コロミン酸結合体も別の組の実験で投与し、結果を 実施例２と同様に評価した。
Ｔ、０．マウスに１６００μｇ（ＦＩＴＣ−コロミン酸）又は１９２０μｇの完 全コロミン酸を静脈注射した。時間間隔をおいてこれらの動物の採血を行い、血 漿試料をＮａＮａについて分析した。個々の動物の結果は総血液当たりの注射物 質の％である。
結果を下記の表６及び第６図のグラフに示す。
これらの結果は、ＦＩＴＣ−コロミン酸結合体の血液循環からの排除速度が単独 コロミン酸の排除速度と実質的に同じであることを示している。該多糖はＦＩＴ Ｃの循環時間の増加についてはある程度の効果を示すが、その改善度は半減期の より長い高分子量多糖の場合はど著しくはない。
卵レシチンをＬｉｐｉｄ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｎｕｔｈｉｌｌ、５ｕｒｒｅｙか ら入手した。コレステロール、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、ジメチルホルムアミ ド（ＤＭＦ）、クロロホルム及びメタノールはＥ、Ｍｅｒｃｋ　（ドイツ）から 入手し、それ以上精製せずに使用した。大腸菌由来のコロミン酸ナトリウム塩（ （ポリ−２，８−Ｎ−アセチルノイラミン酸）及び５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２０ ０（粗）はＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｌｏｎｄｏｎから入手した。１８ −クラウン−６，２−ブロモヘキサデカン酸、１−テトラデシルアミン、１−ブ ロモオクタデカン及び２゜４．６トリクロｏフエノールはＡｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈ ｅｍｉｃａ１社から入手し、それ以上精製せずに使用した。
（ａ）コロミン酸クラウンエーテルの調製コロミン酸（ナトリウム塩）（５０ｍ ｇ）を２０ｍ１の蒸留水に溶解し、１８−クラウン−６（３０ｍｇ）を加え、２ ０℃で３０分間撹拌した。水を凍結乾燥によって蒸発さコロミン酸クラウンエー テル（３５ｍｇ）を１．５ｍｌのＤＭＦに溶解し、１−ブロモオクタデカン（６ ｍｇ）を加え、２０℃で２４時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、生成物を１ｍｌの 蒸留水に再溶解した。凍結乾燥によつて水を除去した。
Ｎ−テトラデシル−（２−ブロモヘキサデシルカルボキサミド）の合成 （ａ）２−ブロモヘキサデカン酸フェニルエステルの調製２−ブロモヘキサデカ ン酸（１ｇ）を乾燥クロロホルム（２０ｍｌ）に溶解した。２，４．６）ジシク ロフェノール（０，５５８ｇ）を加えた後、該反応混合物を水浴中に配置した。
乾燥クロロホルム（２ｍｌ）に溶解したジシクロへキシルカルボジイミド（０， ７３６ｇ）を前記溶液に加えた。該溶液を水浴中で１５分間撹拌した後、温度を ２０℃に調整した。ジクロロメタン／メタノール（１０：０゜１　ｖ／ｖ）混合 物を溶剤とするケイ酸プレート上での薄層クロマトグラフィーにより生成物の形 成を確認した。前記溶液を２０℃で２４時間撹拌し、沈殿した尿素を濾過によっ て除去した。濾液を重炭酸ナトリウム（０，０５Ｍ）溶液及び水で２回洗浄した 。粗反応生成物を、同じ溶剤系を溶離剤として用いてシリカゲル上で液体クロマ トグラフィーにかけることにより精製した。
（ｂ）Ｎ−テトラデシル＝（２−ブロモヘキサデシルカルボキサミド）の調製 １−テトラデシルアミン（０，５９１ｇ）を、乾燥クロロホルム中の２−ブロモ ヘキサデカン酸フェニルエステル（１，４２５ｇ）の溶液に加え、２０℃で２４ 時間撹拌した。ジクロロメタン／メタノール（１０：　Ｏ，ｌｖ／ｖ）混合物を 溶剤としてケイ酸プレート上で薄層クロマトグラフィーにかけることによりペプ チドの形成を確認した。該反応混合物をクエン酸溶液（１０％、ｗ／ｖ）、重炭 酸ナトリウム溶液（０，０５Ｍ）及び水（×３）で洗浄した。
コロミン酸クラウンエーテル（８０ｍｇ）を乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ ）（４ｍｌ）に溶解した。Ｎ−テトラデシル−（２−ブロモヘキサデシルカルボ キサミド）（６０ｍｇ）を加え、得られた溶液を２０℃で２４時間撹拌した。次 いで、該溶媒を真空下で蒸発させた。残渣を水（２ｍｌ）に溶解し、該水を凍結 乾燥によって除去した。
前記誘導体を包含した小さい一枚膜リポソーム（ＳＵＶ）を調製するために、ク ロロホルム中の卵ホスファチジルコリン（ＰＣ）（３２μｍｏ　１）とコレステ ロール（３２μｍｏｌ）とを１＝１のモル比で混合した。前述のように合成した コロミン酸−脂質誘導体（総リポソーム脂質の１０％ｗ　／　ｗ　）をクロロホ ルム／メタノール（１：１　ｖ／ｖ）に溶解し、前記脂質混合物に加えた。真空 下で回転蒸発を用いて溶媒を除去し、乾燥脂質を２ｍｌのリン酸カリウム緩衝液 （ｐＨ７，４，０，１Ｍ）に加えて静かに震盪させて懸濁させた。得られた乳状 懸濁液を水浴中で、１分間の超音波処理に３０秒間隔で１０回かけた。超音波処 理した試料を２０℃で２時間静置した。包含されな、かった材料を、リン酸カリ ウム緩衝液（ｐＨ７，４、Ｏ，１Ｍ）で予め平衡化した５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ− ２００上でのカラムクロマトグラフィーによりリポソームから分離した。
コロミン酸の測定 前述の一般的方法を用いてクロマトグラフィーで得たフラクション０．１ｍｌ中 で、コロミン酸を分光測光により測定した。リポソーム内へのコロミン酸の導入 （包含）の程度（使用総量の％）を、リポソームピークに属するフラクションと 、その後で回収されたフラクション（導入されなかった材料の第２ピーク）で回 収された総量に基づいて計算した。
２−ブロモヘキサデカン酸と１−テトラデシルアミンとの結合（図式２ｂ）を質 量分析法によって確認した。結合前に、２−ブロモヘキサデカン酸の活性エステ ルを合成した（図式２ａ）。生成物の質量スペクトルでは、５１４ｍ／２のピー クの存在が２−ブロモヘキサデカン酸と２．４゜６トリクロロフエノールとの間 の結合の形成を示す。次いで生成物を１−テトラデシルアミンと結合させると、 得られた材料の質量スペクトルは５３０ｍ／ｚにピークを示した。これは、前記 ２つの化合物の結合が完了したことを意実験全体を通して、小さい一枚膜小胞（ ＳＵＶ）はＰＣ及びコレステロールでモル比１：１で調製し、コロミン酸−脂質 誘導体は必要に応じて脂質混合物に加えた（総脂質重量の１０％）。ＳＵＶは、 ５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２００を用いる分子ふるいクロマトグラフィーによって 非導入材料から分離した。
第７図は、コロミン酸及び５ＵＶ（適用前に混合）の溶離プロフィルを示してい る。リポソーム（フラクション１４〜２２）及びコロミン酸（フラクション２２ 〜２４）を表す２つの別個のピークが見られる。これらのフラクションでは適用 したコロミン酸の約９５％が検出された。Ｄ。
又はＤｚ（スキーム１及び２参照ン包含ＳＵＶを５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２００ カラムにかけた。第８図はリポソームＤ６の溶離プロフィルを示している。該コ ロミン酸誘導体（Ｄ６）の約５１％がリポソームと共に回収された（即ち、二重 層に包含されていた）。コロミン酸誘導体Ｄｌｌ（第９図）も同じくらい（５２ ，１４％）ＳＵＶ内に包含されていた。
実施例８ リポソームへの多糖Ｂの導入 多糖Ｂ（ＰＳＢ）がそのリン脂質部分を小さい一枚膜リポソーム（ＳＵＶ）の二 重層に挿入し、リポソーム表面を親水性にし、それによって血液循環における小 胞の半減期を延ばすことができるかどうかを確かめるために実験を行った。
方法 卵ホスファチジルコリン（Ｐ　Ｃ）又はジステアロイルホスファチジルコリン（ Ｄ　Ｓ　Ｐ　Ｃ）と等モルのコレステロール（２５ｍｇのリン脂質及び１２．５ ｍｇのコレステロール）とをクロロホルムに溶解した。回転蒸発によって溶媒を 除去した後、１．２ｍｇの多糖Ｂを含む０．０６Ｍカルボキシフルオレセイン（ ＣＦ）を２ｍｌ加えた。容器を激しく震盪して脂質膜を破壊し、該懸濁液を４℃ （ＰＣ）及び６０℃（ＤＳＰＣＳＵ、Ｖ）で３分間浴超音波処理した。
該懸濁液を同じ温度で、１分毎に３０秒の休止時間をおきながら６分間プローブ 超音波処理した。次いで、ＳＵＶを含んだ透明懸濁液を５ｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｃ Ｌ−４Ｂカラムに通してリポソーム包含ＣＦ及びＰＢＳを遊離物質から分離した 。典型的な実験での分離パターンは、１９．２％のＰＳＢがＳＵＶフラクション と共に回収されたことを示している。８つの実験で得たＰＣ又はＤＳＰＣＳＵＶ へのＰＳＢ導入の結果を表７に示す。
表　７ ＳＵＶ中のＰＳＥが静脈注射後のマウスの血液循環からの小胞クリアランスに及 ぼす効果 Ｔ、０．マウスを２匹ずつ２つのグループに分割し、ＰＣとコレステロールとか らなり（モル比１：１）且つＰＳＢを導入した又はしていないＣＦを含むＳＵＶ を尾の静脈に注射した。ＣＦ含有ＳＵＶ又は１１８μｇのＰＳＢでコーティング したＣＦ含有ＳＵＶを静脈注射した。注射後、時間間隔をおいて、これらの動物 の採血を行い、血漿試料をＫｉｒｂｙ、Ｃ１ａｒｋｅ及びＧｒｅｇｏｒｉａｄｉ ｓの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊｏｕｒｎａｌ　１８６．５９１　（１９８０）’ ）に従って、総ＣＦの分析にかけた。数値は個々の動物から得たものであり、総 血液当たりの注射リポソームＣＦの％を表す。
表８及び第１０図のグラフに示した結果は、注射後に時間間隔をおいて測定した 血液中のリポソームＣＦ濃度を示している。２つのグループの数値の比較から明 らかなように、リポソーム表面にＰＳＢが存在するとクリアランス速度が低下す る。ＤＳＰＣとコレステロールとを用いて前述のように調製したＰＳＥコーティ ングしたＳＵＶを用いて行った別の実験、並びにＤＳＰＣとコレステロールとで 調製したＰＳＢコーティングしたＳＵＶを用いて実施した実験でも同様の結果が 得られた。
表　８ 静脈注射後のリポソーム内ＣＦのクリアランスＦｉｇ、１ １注射後の時間（時） Ｆｉｇ、２ ・、　１５２８　ｐｇ　ＦＩＴＳ−ＰＳＢｏ　５　１０　１５　２０　２５ 注射後の時間（時） Ｆｊ９．３ ＠、　１５２８　ＪＪ９　加水分解ＦＩＴＣ−ＰＳＢ注射後の時間（時） Ｆｉｇ、４ 注射後の時間（時） Ｆｉｇ、　５ 注射後の時間（時） Ｆｉｇ、　６ ０．０　１．２　２．４　３．６　４．８　６．０注射後の時間（時） Ｆｉｇ、７ 管番号。
Ｆｉｇ、８ 管番号。
Ｆｉｇ、　９ 管番号 Ｆｉｇ、１０ 注射後の時間（時） ”Ｄ１６” 図式１ １−ブロモオクタデカンとコロミン酸との結合

Claims (25)

    【特許請求の範囲】
  1. １．活性成分を含む医薬組成物の製造方法における多糖化合物の使用であって、 多糖化合物が多糖１分子当たり５つ以上のシアル酸単位を含んでおり、該多糖化 合物を、患者の血液循環における前記活性成分の有効時間を延ばし、前記活性成 分の免疫原性を低下させ、及び／又はｉｎ　ｖｉｖｏでの前記活性成分の安定性 を増加させるのに十分な量で含ませる前記使用。
  2. ２．活性成分と、患者の血液循環における前記活性成分の有効時間を延ばし、前 記活性成分の免疫原性を低下させ、及び／又はｉｎ　ｖｉｖｏでの前記活性成分 の安定性を増加させるのに十分な量の多糖化合物とを組み合わせて含む医薬組成 物であって、前記多糖化合物が多糖１分子当たり５つ以上のシアル酸単位を含ん でいる医薬組成物。
  3. ３．患者の血液循環における医薬的活性成分の有効時間を延ばし、前記活性成分 の免疫原性を低下させ、及び／又はｉｎ　ｖｉｖｏでの前記活性成分の安定性を 増加させるための、多糖１分子当たり５つ以上のシアル酸単位を含む多糖化合物 の使用。
  4. ４．活性成分と多糖とが、例えば共有結合又は疎水性結合によって互いに直接結 合している、請求項１もしくは３に記載の使用、又は請求項２に記載の組成物。
  5. ５．活性成分と多糖とが、例えば高分子薬物給送システム又は粒状薬物給送シス テムのような薬物給送システムを介して互いに結合している、請求項１もしくは ３に記載の使用、又は請求項２に記載の組成物。
  6. ６．多糖化合物が、例えば疎水性結合又はイオン結合のような共有的又は非共有 的結合によって薬物給送システムに結合する請求項５に記載の使用又は組成物。
  7. ７．薬物給送システムが、表面に多糖化合物の多糖成分を含んでいるリボソーム からなる請求項５又は６に記載の使用又は組成物。
  8. ８．薬物給送システムが高分子ＤＤＳであり、多糖化合物に共有的に結合するペ プチド又はタンパク質からなる請求項５又は６に記載の使用又は組成物。
  9. ９．多糖化合物が、任意の初期の急速排除ステップ後の血液循環における該化合 物の半減期が１０時間以上、好ましくは２０時間以上、より好ましくは３０時間 以上であるような化合物である請求項１から８のいずれか一項に記載の使用又は 組成物。
  10. １０．多糖化合物が細菌多糖もしくはその誘導体、又はこの種の多糖もしくは誘 導体の合成類似体である請求項１から９のいずれか一項に記載の使用又は組成物 。
  11. １１．多糖が多糖成分中に、１分子当たり２０以上、好ましくは５０以上、より 好ましくは１００以上、例えば約２００のシアル酸残基を有している請求項１か ら１０のいずれか一項に記載の組成物又は使用。
  12. １２．多糖が末端ガラクトース、フコース及びマンノース単位を実質的に含んで いない請求項１から１１のいずれか一項に記載の組成物又は使用。
  13. １３．多糖化合物が、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、大腸菌Ｋ１、ｍｏｒａｘ ｅ１１ａ　ｎｏｎｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎｓ及びＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ　ａｅ ｒｏｇｉｎｏｓｉｓのグループＢ多糖、並びにＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの グループＣ、大腸菌Ｋ９２多糖及び大腸菌Ｋ１から誘導したコロミン酸から選択 したものである請求項１２に記載の組成物又は使用。
  14. １４．多糖化合物が、脂肪酸鎖を除去するためにアルカリ加水分解にかけた糖脂 質の誘導体である請求項１３に記載の組成物又は使用。
  15. １５．活性成分が、好ましくは共有的に多糖化合物に結合しているペプチド又は タンパク質からなる請求項１から１４のいずれか一項に記載の組成物又は使用。
  16. １６．１分子当たり５つ以上のシアル酸単位を有する多糖部分が外面に結合して いるリボソーム。
  17. １７．多糖部分が、リボソームの脂質層中に導入された疎水部分も含む多糖化合 物の一部分をなしている請求項１６に記載のリボソーム。
  18. １８．多糖化合物が天然の糖脂質であるか、又は天然の脂質基を含む前記糖脂質 の誘導体である請求項１７に記載のリボソーム。
  19. １９．多糖化合物が、疎水部分を共有的に結合した天然多糖の誘導体であり、前 記疎水部分が、好ましくは多糖部分のシアル酸単位に共有結合しており、より好 ましくは１−位置又は窒素原子を介して共有結合している請求項１７に記載のリ ボソーム。
  20. ２０．療法又は診断方法で使用するための医薬の製造における請求項１６から１ ９のいずれか一項に記載のリボソームの使用。
  21. ２１．リボソーム形成脂質の混合物と、１分子当たり５つ以上のシアル酸単位を 含む多糖成分を有すると共に疎水部分を有する多糖化合物とからリボソームを製 造する方法。
  22. ２２．多糖化合物が天然の糖脂質であるか、又は天然の脂質基を含む前記糖脂質 の誘導体である請求項２１に記載の方法。
  23. ２３．多糖化合物が、疎水部分を共有的に結合した天然多糖の誘導体であり、前 記疎水部分が、好ましくは多糖部分のシアル酸単位に共有結合しており、より好 ましくは１−位置又は窒素原子を介して共有結合している請求項２１に記載の方 法。
  24. ２４．多糖化合物が、シアル酸残基の１−位置で共有結合により結合した疎水基 を含んでいる請求項２３に記載の方法。
  25. ２５．疎水基と多糖部分とを含む多糖化合物であって、多糖部分が１分子当たり ５つ以上のシアル酸単位を有し、疎水基が１−位置又は窒素原子を介して多糖部 分のシアル酸残基に共有結合している多糖化合物。
JP51052792A 1991-06-06 1992-06-08 医薬組成物 Expired - Fee Related JP3671054B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB919112212A GB9112212D0 (en) 1991-06-06 1991-06-06 Pharmaceutical compositions
GB9112212.7 1991-06-06
PCT/GB1992/001022 WO1992022331A1 (en) 1991-06-06 1992-06-08 Pharmaceutical compositions

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2005042054A Division JP4332507B2 (ja) 1991-06-06 2005-02-18 医薬組成物

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH06508610A true JPH06508610A (ja) 1994-09-29
JP3671054B2 JP3671054B2 (ja) 2005-07-13

Family

ID=10696221

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP51052792A Expired - Fee Related JP3671054B2 (ja) 1991-06-06 1992-06-08 医薬組成物
JP2005042054A Expired - Lifetime JP4332507B2 (ja) 1991-06-06 2005-02-18 医薬組成物

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2005042054A Expired - Lifetime JP4332507B2 (ja) 1991-06-06 2005-02-18 医薬組成物

Country Status (10)

Country Link
EP (1) EP0587639B1 (ja)
JP (2) JP3671054B2 (ja)
KR (1) KR100354944B1 (ja)
AT (1) ATE204179T1 (ja)
CA (1) CA2109952C (ja)
DE (1) DE69232006T2 (ja)
DK (1) DK0587639T3 (ja)
ES (1) ES2161214T3 (ja)
GB (1) GB9112212D0 (ja)
WO (1) WO1992022331A1 (ja)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004509900A (ja) 2000-09-22 2004-04-02 オーファン　メディカル，インコーポレイティド 炭水化物、脂質、またはアミノ酸キャリアを含むγ−ヒドロキシブチレート組成物
JP2007501888A (ja) * 2003-08-12 2007-02-01 リポクセン テクノロジーズ リミテッド ポリシアル酸誘導体
JP2007501889A (ja) * 2003-08-12 2007-02-01 リポクセン テクノロジーズ リミテッド タンパク質の誘導体化及び結合のためのシアル酸誘導体
JP2008510025A (ja) * 2004-08-12 2008-04-03 リポクセン テクノロジーズ リミテッド シアル酸誘導体
JP2008531764A (ja) * 2005-02-23 2008-08-14 リポクセン テクノロジーズ リミテッド タンパク質の誘導体化及び結合のための活性化シアル酸誘導体
JP2010512753A (ja) * 2006-12-15 2010-04-30 バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド 延長されたｉｎｖｉｖｏ半減期を有する第ＶＩＩａ因子−（ポリ）シアル酸結合体

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6221386B1 (en) 1996-03-08 2001-04-24 Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Minister Of National Defence Use of virulence factors of pathogens to improve liposomal delivery of therapeutic agents
JP2003533537A (ja) 2000-05-16 2003-11-11 リポクセン テクノロジーズ リミテッド タンパク質の誘導体化
GB0129121D0 (en) * 2001-12-05 2002-01-23 Ic Vec Ltd Compound
AU2003233464A1 (en) * 2002-03-29 2003-10-13 Bristol-Myers Squibb Corporation Lipid mediated screening of drug candidates for identification of active compounds
US7875708B2 (en) * 2004-08-12 2011-01-25 Lipoxen Technologies Limited Sialic acid derivatives
TWI376234B (en) 2005-02-01 2012-11-11 Msd Oss Bv Conjugates of a polypeptide and an oligosaccharide
JP2009544681A (ja) 2006-07-25 2009-12-17 リポクセン テクノロジーズ リミテッド エリスロポエチンの多糖誘導体
RU2473567C2 (ru) 2007-02-28 2013-01-27 Липоксен Текнолоджиз Лимитед Способ снижения содержания эндотоксина в образце, содержащем полисиаловую кислоту и эндотоксин
US9925209B2 (en) 2008-03-19 2018-03-27 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Heparosan-polypeptide and heparosan-polynucleotide drug conjugates and methods of making and using same
US9687559B2 (en) 2008-03-19 2017-06-27 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Heparosan polymers and methods of making and using same for the enhancement of therapeutics
EP2341941A4 (en) * 2008-09-09 2014-12-10 Univ Oklahoma HEPAROSANE POLYMERS AND METHODS OF MAKING AND USING THEM TO ENHANCE THERAPEUTIC COMPOUNDS
HUE028056T2 (en) 2009-07-27 2016-11-28 Baxalta GmbH Blood coagulation protein conjugates
WO2011012850A2 (en) * 2009-07-27 2011-02-03 Lipoxen Technologies Limited Glycopolysialylation of non-blood coagulation proteins
US9919002B2 (en) 2013-10-21 2018-03-20 North Carolina State University Methods and constructs for compound delivery
WO2015130963A2 (en) 2014-02-27 2015-09-03 Xenetic Biosciences, Inc. Compositions and methods for administering insulin or insulin-like protein to the brain
WO2020099513A1 (en) 2018-11-13 2020-05-22 Lipoxen Technologies Limited Glycopolysialylation of blinatumomab

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4501728A (en) * 1983-01-06 1985-02-26 Technology Unlimited, Inc. Masking of liposomes from RES recognition
DK17685D0 (da) * 1985-01-14 1985-01-14 Hans Goeran Magnusson Glycosidderivater
JP2666345B2 (ja) * 1987-04-16 1997-10-22 武田薬品工業株式会社 リポソーム製剤およびその製造法
EP0349127B1 (en) * 1988-07-01 1993-09-29 The Biomembrane Institute Antibody-mediated and ligand-mediated targeting of differentiation-inducers to tumor cells
US5073543A (en) * 1988-07-21 1991-12-17 G. D. Searle & Co. Controlled release formulations of trophic factors in ganglioside-lipsome vehicle
JP2975632B2 (ja) * 1990-03-30 1999-11-10 生化学工業株式会社 グリコサミノグリカン修飾プロテイン

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004509900A (ja) 2000-09-22 2004-04-02 オーファン　メディカル，インコーポレイティド 炭水化物、脂質、またはアミノ酸キャリアを含むγ−ヒドロキシブチレート組成物
JP2007501888A (ja) * 2003-08-12 2007-02-01 リポクセン テクノロジーズ リミテッド ポリシアル酸誘導体
JP2007501889A (ja) * 2003-08-12 2007-02-01 リポクセン テクノロジーズ リミテッド タンパク質の誘導体化及び結合のためのシアル酸誘導体
US9452224B2 (en) 2003-08-12 2016-09-27 Lipoxen Technologies Limited Sialic acid derivatives for protein derivatisation and conjugation
US10406209B2 (en) 2003-08-12 2019-09-10 Lipoxen Technologies Limited Sialic acid derivatives for protein derivatisation and conjugation
JP2008510025A (ja) * 2004-08-12 2008-04-03 リポクセン テクノロジーズ リミテッド シアル酸誘導体
JP2008531764A (ja) * 2005-02-23 2008-08-14 リポクセン テクノロジーズ リミテッド タンパク質の誘導体化及び結合のための活性化シアル酸誘導体
JP2010512753A (ja) * 2006-12-15 2010-04-30 バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド 延長されたｉｎｖｉｖｏ半減期を有する第ＶＩＩａ因子−（ポリ）シアル酸結合体

Also Published As

Publication number Publication date
WO1992022331A1 (en) 1992-12-23
CA2109952A1 (en) 1992-12-23
GB9112212D0 (en) 1991-07-24
KR100354944B1 (ko) 2002-12-31
JP2005232172A (ja) 2005-09-02
EP0587639A1 (en) 1994-03-23
DE69232006D1 (de) 2001-09-20
JP3671054B2 (ja) 2005-07-13
EP0587639B1 (en) 2001-08-16
DE69232006T2 (de) 2002-04-25
ATE204179T1 (de) 2001-09-15
DK0587639T3 (da) 2001-12-10
ES2161214T3 (es) 2001-12-01
JP4332507B2 (ja) 2009-09-16
KR940701274A (ko) 1994-05-28
CA2109952C (en) 2003-11-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4332507B2 (ja) 医薬組成物
US5846951A (en) Pharmaceutical compositions
Gregoriadis et al. Polysialic acids: potential in drug delivery
Jain et al. A review of glycosylated carriers for drug delivery
Minko Drug targeting to the colon with lectins and neoglycoconjugates
US9526705B2 (en) Lipidated glycosaminoglycan particles and their use in drug and gene delivery for diagnosis and therapy
CA1324080C (en) Bioadhesion drug carriers for endothelial and epithelial uptake and lesional localization of therapeutic and diagnostic agents
EP0662002B1 (en) Alginate-bioactive agent conjugates
WO1988007365A1 (en) Biodadhesion drug carriers for endothelial and epithelial uptake and lesional localization of therapeutic and diagnostic agents
US20060127310A1 (en) Amplification of biotin-mediated targeting
JPH06500795A (ja) 選択的トロピズムを有する粒状物ベクター、その製造法及びその製薬学的組成物
JP2005535604A (ja) 治療剤を含むポリマーナノ物品
Pawar et al. Polysaccharides as carriers of bioactive agents for medical applications
WO2008007932A1 (en) Chitosan complex containing ph sensitive imidazole group and preparation method thereof
Yu et al. Saccharide modified pharmaceutical nanocarriers for targeted drug and gene delivery
Turánek et al. Modification of liposomal surface by polysaccharides: Preparation, characterization, and application for drug targeting
EP1011722B1 (en) Substrates materials with bound cytokine-stimulating polysaccharides or bacterial nucleic acids
JPH07291853A (ja) リポソームおよび薬物運搬体
AU2003280761B2 (en) Liposome
JPH09124512A (ja) 肝臓ターゲティングのための水溶性の薬物−プルラン結合体製剤
US6087342A (en) Substrates having bound polysaccharides and bacterial nucleic acids
WO2005027873A2 (en) Therapeutic aminoglycoside-containing hydrogel nanoparticles
McCormack et al. Polysialic acids: in vivo properties and possible uses in drug delivery
JP2004284991A (ja) Ｎ−アシルアミン化合物及びそれを用いた医療用組成物
AU2002326564A1 (en) Lipidated glycosaminoglycan particles and their use in drug and gene delivery for diagnosis and therapy

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20031222

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20040119

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20040304

A912 Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912

Effective date: 20040408

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20041124

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20041206

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20050218

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20050418

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090422

Year of fee payment: 4

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100422

Year of fee payment: 5

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees