BR112020012220A2

BR112020012220A2 - segmentos de liberação e composições de ligação que compreende os mesmos

Info

Publication number: BR112020012220A2
Application number: BR112020012220-3A
Authority: BR
Inventors: Fan Yang; Volker Schellenberger; Vladimir Podust; Bee-Cheng Sim; Desiree THAYER; John BEABER
Original assignee: Amunix Pharmaceuticals, Inc.
Priority date: 2017-12-21
Filing date: 2018-12-20
Publication date: 2021-01-26
Also published as: AU2018393111A1; EP3728326A1; EP3728326A4; SG11202005674XA; JP2021507706A; MX2020006619A; IL275395A; CN111819202A; KR20200111176A; US20200385469A1; WO2019126576A1; TW201930341A; CA3085950A1

Abstract

A presente invenção refere-se a composições de polipeptídeo recombinante ativáveis compreendendo um segmento de liberação de clivagem. Em alguns casos, as composições de polipeptídeo recombinante ativáveis incluem um XTEN ligado a porções de ligação por segmentos de liberação cliváveis que, quando clivados, as porções de ligação são capazes de ligar células T efetoras a células tumorais ou cancerígenas direcionadas e efetuar citólise das células tumorais ou células cancerosas. A invenção também fornece composições e métodos para fabricar e usar as composições recombinantes ativáveis cliváveis.

Description

SEGMENTOS DE LIBERAÇÃO E COMPOSIÇÕES DE LIGAÇÃO QUE COMPREENDE OS MESMOS REFERÊNCIA CRUZADA COM PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Esse pedido reivindica o benefício de prioridade para do Pedido U.S. Provisório Nº de Série 62/609.296, depositado em 21 de dezembro de 2017 e Pedido U.S. Provisório Nº de Série 62/780.719, depositado em 17 de dezembro de 2018, que são incorporados nesse relatório descritivo por referência em suas totalidades.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] Um objetivo primário da terapia do câncer é destruir especificamente células tumorais deixando, ao mesmo tempo, células e tecidos saudáveis o mais intactos possível. Uma abordagem que gerou interesse recentemente é induzir uma resposta imune contra o tumor, na qual células imunes efetoras como, por exemplo, células natural killer (NK) ou linfócitos T citotóxicos (CTLs), são induzidas para atacar e destruir células tumorais.

[003] Embora o uso de anticorpos monoclonais (MAb) intactos com afinidade para um antígeno associado a tumor tenha sido aplicado com sucesso na área de terapia do câncer, o grande tamanho de MAbs intactos, o que resulta em baixa biodistribuição, junto com sua persistência longa no pool sangüíneo, limitam sua utilidade. Além disso, em função da necrose tumoral e distribuição não homogênea de antígeno, freqüentemente não é possível alcançar as porções centrais de um tumor com MAbs intactos. Para superar isso, o uso de fragmentos de anticorpo menores pode resultar em localização rápida do tumor e penetração mais profunda no tumor, bem como remoção rápida da corrente sangüínea. Para essa finalidade, fragmentos de cadeia única (scFv) derivados de MAb oferecem melhor biodistribuição do que MAbs intactos e podem visar células tumorais mais eficientemente.

Apesar das vantagens de scFv, o uso de scFv monoespecífico impede sua aplicação clínica plena na quimioterapia do câncer para alvos comumente expressos por tecido tanto doente quanto saudável.

Para superar essa e outras desvantagens, o uso de anticorpos biespecíficos projetados especificamente oferece uma abordagem diferente, na medida em que podem ser projetados para direcionar as células imunes efetoras para matar células de câncer.

Anticorpos biespecíficos combinam os benefícios de especificidades de ligação diferentes derivadas de dois anticorpos monoclonais em uma única composição, permitindo abordagens ou combinações de coberturas que não são possíveis com anticorpos monoespecíficos.

Essa abordagem se baseia na ligação de um braço do anticorpo biespecífico a um antígeno ou marcador associado a tumor, enquanto o outro braço, mediante ligação do marcador de uma célula efetora (por exemplo, uma molécula de CD3 em células T), desencadeia sua atividade citotóxica pela liberação de moléculas efetoras como, por exemplo, TNF-alfa, IFN-gama, interleucinas 2, 4 e 10, perforina e granzimas.

Avanços na criação de anticorpos por engenharia genética levaram ao desenvolvimento de diversos formatos e composições de anticorpo biespecífico para o redirecionamento de células efetoras a alvos tumorais, incluindo Engagers de Células T Biespecíficos (BiTEs®) como, por exemplo, blinatumomab.

BiTEs funcionam por recrutamento e ativação de populações policlonais de células T em sítios tumorais, e o fazem sem a necessidade de coestimulação ou reconhecimento de MHC convencional.

Permanece, no entanto,

os problemas duplos de certos pacientes que apresentam efeitos colaterais sérios chamados de “tempestade de citocinas” ou “síndrome de liberação de citocinas” (Lee D.W. e cols. “Current Concepts in the Diagnosis and Management of Cytokine Release Syndrome”. Blood. 2014 124 (2): 188-195) mediados pela liberação de TNF-alfa e IFN-gama, entre outras citocinas, além do fato de que as composições de BiTE possuem uma meia-vida muito curta, necessitando de infusões contínuas de quatro a oito semanas a fim de manter BiTE dentro da janela terapêutica por tempo suficiente até obter um efeito terapêutico.

[004] Proteases são enzimas que são capazes de clivar proteínas e peptídeos por hidrólise de ligações peptídicas. As proteases estão envolvidas em diversas funções, regulam o destino e atividade de muitas proteínas, criam ou inativam moléculas bioativas, afetam proliferação e diferenciação celulares, morfogênese e remodelagem de tecidos, contribuem para o processamento de proteínas, e estão até mesmo envolvidas na sinalização molecular. Como resultado da ação de proteases e respostas de proteína, elas participam da angiogênese, reparo de feridas, hemostasia, coagulação sangüínea, inflamação, imunidade, necrose, apoptose, e da progressão ou melhora de doenças, incluindo cânceres. Como exemplo, estudos demonstraram o valor de matriptase como um marcador prognóstico em vários cânceres humanos. No câncer de próstata e cervical, mRNA e proteína de matriptase estão supra-regulados em lesões cancerosas, comparadas com tecido normal, e há uma correlação positiva entre expressão de matriptase e grau histopatológico do tumor (Lee J.W., e cols. “Increased Expression of Matriptase is Associated with

Histopathologic Grades of Cervical Neoplasia”. Hum Pathol. (2005) 36 (6): 626-33). Embora matriptase seja expressa em níveis baixos no ovário normal, ela se torna altamente expressa no carcinoma ovariano em estágio inicial (Tanimoto H., e cols., “Transmembrane Serine Protease TADG-15 (ST14/Matriptase/MT-SP1): Expression and Prognostic Value in Ovarian Cancer”. Br.

J.

Cancer. (2005) 92 (2): 278-83). Similarmente, metaloproteinases da matriz (MMPs) são marcadores de câncer importantes, na medida em que estão presentes em quase todos os cânceres humanos.

MMPs podem ser expressas por fibroblastos saudáveis no estroma adjacente a tumores, fibroblastos associados ao câncer, ou por células de câncer não fibroblásticas, nas quais influenciam o ambiente tumoral por promoção de angiogênese, crescimento tumoral e metástase (Bhowmick, N.A., “Stromal Fibroblasts in Cancer Initiation and Progression”. Nature, 432 (2004), páginas 332-337). Similarmente, legumaína está superexpressa na maioria dos tumores sólidos humanos (Liu, C., e cols. “Overexpression of Legumain in Tumors is Significant for Invasion/Metastasis and a Candidate Enzymatic Target for Prodrug Therapy”. Cancer Res. (2003) 63 (11): 2.957-2.964). Uma função essencial de proteases tumorais é dissolver a matriz extracelular para permitir que as células tumorais invadam e cresçam de uma forma infiltrante no tecido normal.

Essas proteases também protegem o tumor dos mecanismos de defesa do corpo por clivagem e inativação, por exemplo, de anticorpos, citocinas, fatores de crescimento, fatores do complemento, fatores de coagulação e mediadores que, de outro modo, limitariam a inibição do tumor.

Por causa da presença dessas proteases associadas ao câncer, é reconhecido agora que há a necessidade do design de composições de fragmentos de anticorpo biespecífico ativável que são ativados seletivamente nas vizinhanças das proteases de células de câncer ou tumorais, resultando na habilidade para direcionar células efetoras para alvos da célula de câncer e efetuam a morte das células.

[005] Na medida em que peptídeos sensíveis à protease podem ser incorporados em produtos biológicos terapêuticos para conferir certas propriedades no fármaco intacto e/ou no produto de um fármaco ou produto biológico tratado com protease, há uma necessidade para a identificação de novos substratos peptídicos para proteases associadas aos tecidos doentes e para incorporar esses substratos peptídicos em diversas composições terapêuticas, diagnósticas e profiláticas de pró-fármaco como um mecanismo-chave para ativar essas composições, aumentando o índice e desfecho terapêuticos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[006] Permanece uma necessidade considerável por terapêuticas alternativas que ofereçam as vantagens farmacológicas de formatos de anticorpo biespecífico, mas com segurança aumentada, efeitos colaterais reduzidos, seletividade aumentada e/ou propriedades farmacêuticas ou farmacocinéticas aprimoradas, por exemplo, via de administração, que exigem dosagem menos freqüente ou simplesmente dosagem por uma única injeção.

[007] A presente revelação fornece polipeptídeos recombinantes que compreendem segmentos de liberação cliváveis (RS) que são úteis no tratamento ou prevenção de doenças incluindo, sem limitação, cânceres, distúrbios autoimunes e inflamatórios. Os polipeptídeos recombinantes que compreendem segmentos de liberação descritos nesse relatório descritivo podem solucionar uma necessidade não atendida e são superiores em um ou mais aspectos, incluindo designs customizados que resultam em propriedades benéficas descritas nesse relatório descritivo.

[008] Em um primeiro aspecto, a revelação fornece polipeptídeos recombinantes que compreendem um primeiro segmento de liberação (RS1), em que o RS1 é um substrato para clivagem por uma protease de mamífero. Em uma modalidade, o RS1 compreende uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos 88%, ou pelo menos 89%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 91%, ou pelo menos 92%, ou pelo menos 93%, ou pelo menos 94%, ou pelo menos 95%, ou pelo menos 100% de identidade de seqüência para uma seqüência selecionada das seqüências apresentadas na Tabela 1, em que o RS1 é um substrato para uma ou mais proteases de mamíferos. Em outra modalidade, o RS1 compreende uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos 88%, ou pelo menos 89%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 91%, ou pelo menos 92%, ou pelo menos 93%, ou pelo menos 94%, ou pelo menos 95%, ou pelo menos 96%, ou pelo menos 97%, ou pelo menos 100% de identidade de seqüência para uma seqüência selecionada das seqüências apresentadas na Tabela 2, em que o RS1 é um substrato para uma ou mais proteases de mamíferos. Em outra modalidade, o RS1 compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada das seqüências da Tabela 1, em que o RS1 é um substrato para uma ou mais proteases de mamíferos. Em outra modalidade, o RS1 compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada das seqüências da Tabela 2, em que o RS1 é um substrato para uma ou mais proteases de mamíferos.

[009] Em outro aspecto, a presente revelação fornece polipeptídeos recombinantes que compreendem um RS1 e que ainda compreendem uma primeira porção de ligação (FBM) que possui afinidade de ligação para um marcador de célula-alvo em um tecido ou célula-alvo. Em uma modalidade, a FBM é um anticorpo, uma citocina, um receptor celular, ou um fragmento destes. Em uma modalidade na qual o polipeptídeo recombinante compreende um RS1 e uma FBM, o RS1 é um substrato para clivagem por uma protease de mamífero, em que a protease de mamífero é produzida por ou está colocalizada com o tecido ou célula-alvo. Em outra modalidade na qual o polipeptídeo recombinante compreende um RS1 e uma FBM, o RS1 é um substrato para clivagem por múltiplas proteases de mamíferos, em que as proteases de mamíferos são produzidas por ou estão colocalizadas com o tecido ou célula-alvo. O RS1 das composições em questão pode ser um substrato para uma serina-protease e/ou uma cisteína-protease e/ou uma metaloproteinase. Em uma modalidade, o RS1 é um substrato para uma protease selecionada de legumaína, MMP-2, MMP-7, MMP-9, MMP-11, MMP-14, uPA e matriptase. Em outra modalidade, o RS1 é um substrato para uma protease apresentada na Tabela

3. Em algumas modalidades, o RS1 das modalidades é projetado para clivagem por múltiplas proteases em um, dois ou três sítios de clivagem na seqüência de RS1. Em uma modalidade do citado anteriormente, o RS1 é um substrato para clivagem em dois ou mais sítios de clivagem por duas ou mais proteases selecionadas de legumaína, MMP-2, MMP-7, MMP-9, MMP-11, MMP- 14, uPA e matriptase. Em outra modalidade do citado anteriormente, o RS1 é um substrato para clivagem em três ou mais sítios de clivagem por três ou mais proteases selecionadas de legumaína, MMP-2, MMP-7, MMP-9, MMP-11, MMP- 14, uPA e matriptase.

[010] Em uma característica particular, os segmentos de liberação das composições em questão podem ser projetados para ter taxas de clivagem diferentes pelas proteases de mamíferos em cada um dos sítios de clivagem. No design dos segmentos de liberação, as taxas de clivagem foram determinadas em relação a um segmento de liberação de controle que possui a seqüência de aminoácidos EAGRSANHEPLGLVAT, que pode ser clivada por serina, cisteína e metaloproteinases, como descrito no Exemplo 43. Em uma modalidade, a revelação fornece polipeptídeos recombinantes que compreendem um RS1 e uma FBM, em que a taxa de clivagem do RS1 por legumaína, MMP-2, MMP-7, MMP-9, MMP-11, MMP-14, uPA ou matriptase é pelo menos duas vezes mais rápida, comparada com a taxa de clivagem da seqüência de controle que possui a seqüência EAGRSANHEPLGLVAT pela mesma protease, quando testada in vitro sob concentrações molares equivalentes. Em outra modalidade, a revelação fornece polipeptídeos recombinantes que compreendem um RS1 e uma FBM, em que a taxa de clivagem do RS1 por legumaína, MMP-2, MMP-7, MMP-9, MMP-11, MMP-14, uPA ou matriptase é pelo menos duas vezes mais lenta, comparada com a taxa de clivagem da seqüência de controle que possui a seqüência EAGRSANHEPLGLVAT pela mesma protease, quando testada in vitro sob concentrações molares equivalentes. Em outra modalidade, a revelação fornece polipeptídeos recombinantes que compreendem um RS1 e uma FBM, em que o RS1 é um substrato para clivagem por uma protease selecionada de legumaína,

MMP-2, MMP-7, MMP-9, MMP-11, MMP-14, uPA ou matriptase e em que o RS1 possui uma eficiência de clivagem pelo menos 0,2 log2, ou 0,4 log2, ou 0,8 log2 ou 1,0 log2 maior em um ensaio bioquímico competitivo in vitro, comparada com a clivagem pela mesma protease de uma seqüência de controle que possui a seqüência EAGRSANHEPLGLVAT. Em outra modalidade, a revelação fornece polipeptídeos recombinantes que compreendem um RS1 e uma FBM, em que o RS1 é um substrato para clivagem por uma protease selecionada de legumaína, MMP-2, MMP-7, MMP-9, MMP-11, MMP-14, uPA ou matriptase e em que o RS1 possui uma eficiência de clivagem pelo menos 0,2 log2, ou 0,4 log2, ou 0,8 log2, ou 1,0 log2 menor em um ensaio bioquímico competitivo in vitro, comparada com a clivagem pela mesma protease de uma seqüência de controle que possui a seqüência EAGRSANHEPLGLVAT.

[011] Em outro aspecto, a revelação está relacionada aos polipeptídeos recombinantes que compreendem um RS1, uma FBM, e pelo menos uma primeira porção volumosa. Uma vantagem de várias composições de polipeptídeo recombinante é que elas podem ser montadas na forma de um pró-fármaco, em que a composição intacta pode ser ativada quando nas proximidades de um tecido-alvo ou de certo ambiente celular no qual proteases de mamíferos estão presentes que são capazes de clivar o segmento de liberação e liberar a FBM no local onde sua atividade é a mais desejável. Por exemplo, a FBM, quando o polipeptídeo recombinante está em um estado não clivado, intacto, possui afinidade de ligação menor para seu ligante em função do efeito de blindagem da porção volumosa. Mediante sua liberação por meio de clivagem do segmento de liberação por uma protease de mamífero colocalizada em um tecido-alvo,

por exemplo, um tecido tumoral, a FBM recupera seu potencial pleno para se ligar ao marcador de célula-alvo, na medida em que não está mais sendo blindada pela porção volumosa. Em algumas modalidades, a porção volumosa é um primeiro polipeptídeo recombinante estendido (XTEN1). Em uma modalidade, o XTEN1 compreende uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de seqüência para uma seqüência selecionada das seqüências apresentadas na Tabela 8 ou Tabela 10. Em outra modalidade, o XTEN1 compreende uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de seqüência para uma seqüência selecionada de AE 144_1A, AE 144_2A, AEE144_2B, AE 144_3A, AE144_3B, AE 144_4A, AE 144_4B, AE 144_5A, AE 144_6B, AE284, AE288_1, AE288_2, AE288_3, AE576, AE864, AE864_2, AE865, AE866, AE867, AE867_2 e AE868. Em uma modalidade, o polipeptídeo recombinante que compreende um RS1, uma FBM e um XTEN1 possui, em um estado não clivado, um arranjo estrutural do terminal-N para o terminal-C de FBM-RS1-XTEN1. Em outra modalidade, o polipeptídeo recombinante que compreende um RS1, uma FBM e um XTEN1 possui, em um estado não clivado, um arranjo estrutural do terminal-N para o terminal-C de XTEN1-RS1-FBM. Dessa forma, nas modalidades de polipeptídeos recombinantes que compreendem um RS1, uma FBM e um XTEN1, mediante clivagem do RS1 pela protease de mamífero, o XTEN1 e a FBM são liberados do polipeptídeo recombinante.

[012] Em outro aspecto, a revelação está relacionada aos polipeptídeos recombinantes que compreendem um RS1, uma

FBM e um XTEN1 em que A FBM é um fragmento de anticorpo.

Em uma modalidade, a FBM é um fragmento de anticorpo selecionado do grupo que consiste em Fv, Fab, Fab′, Fab′-SH, anticorpo linear e fragmento variável de cadeia única (scFv). Em algumas modalidades, o fragmento de anticorpo de FBM possui afinidade de ligação para um antígeno da célula efetora expresso na superfície de uma célula efetora selecionada de uma célula plasmática, uma célula T, uma célula B, uma célula killer induzida por citocina (célula CIK), um mastócito, uma célula dendrítica, uma célula T reguladora (célula TReg), uma célula T helper, uma célula mielóide e uma célula NK.

Em uma modalidade, o fragmento de anticorpo de FBM possui afinidade de ligação para um antígeno da célula efetora expresso na superfície de uma célula T.

Em outra modalidade, Fragmento de anticorpo de FBM possui afinidade de ligação para CD3. Em uma modalidade do fragmento de anticorpo de FBM com afinidade de ligação para CD3, o fragmento de anticorpo compreende uma VL e uma VH derivadas de um anticorpo monoclonal que possui especificidade de ligação para CD3. Em outra modalidade do fragmento de anticorpo de FBM com afinidade de ligação para CD3, o fragmento de anticorpo compreende uma VL e VH selecionadas das seqüências apresentadas na Tabela 4. Em outra modalidade do fragmento de anticorpo de FBM com afinidade de ligação para CD3, o fragmento de anticorpo compreende regiões determinantes de complementaridade (CDR) derivadas de um anticorpo monoclonal que possui especificidade de ligação para CD3. Em outra modalidade do fragmento de anticorpo de FBM com afinidade de ligação para CD3, o fragmento de anticorpo compreende uma região CDR-H1, uma região CDR-H2, uma região CDR-H3, uma região CDR-L1, uma região CDR-L2 e uma região CDR-H3, em que cada uma é derivada de um anticorpo monoclonal da Tabela 4.

[013] Em outro aspecto, a revelação está relacionada aos polipeptídeos recombinantes que compreendem um RS1, um XTEN1, uma FBM e uma segunda porção de ligação (SBM), em que a SBM é um fragmento de anticorpo que possui afinidade de ligação para um marcador de célula-alvo. Em uma modalidade, a FBM e a SBM são, cada uma, um fragmento de anticorpo selecionado do grupo que consiste em Fv, Fab, Fab′, Fab′-SH, anticorpo linear e fragmento variável de cadeia única (scFv) ou as VL e VH da FBM e SBM são configuradas como um diabody de cadeia única. Em algumas modalidades, o fragmento de anticorpo de SBM possui afinidade de ligação para um marcador de célula-alvo em uma célula tumoral ou uma célula de câncer. Em uma modalidade, o fragmento de anticorpo de SBM possui afinidade de ligação para um marcador de célula-alvo selecionado dos marcadores de célula-alvo apresentados na Tabela 5. Em outra modalidade, o fragmento de anticorpo de SBM possui afinidade de ligação para um marcador de célula- alvo selecionado de antígeno A33, alfa-fetoproteína (AFP), integrina alfa 4, Ang2, B7-H3, B7-H6, antígeno de maturação de célula B (BCMA), antígeno de câncer 19-9 (CA19-9), antígeno de câncer 125 (CA-125), Anidrase Carbônica 6 (CA6), anidrase carbônica IX (CAIX), CEACAM5, cMET, CTLA4, Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 1 (CCR1), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 2 (CCR2), Receptor de Quimiocina de Motivo C- C 3 (CCR3), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 4 (CCR4), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 5 (CCR5), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 6 (CCR6), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 7 (CCR7), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 8

(CCR8), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 9 (CCR9), Agrupamento de Diferenciação 7 (CD7), CD22, CD70, CD79a, CD79b, CD19, CCR8, CEA, βhCG, Lewis-Y, CA19-9, CA-125, CD20, CD22, CD25, CD33, CD38, CD30, CD44v6, CD47, CD56 (NCAM), CD63, CD79b, CD123, CD133, CD138, CD166, claudina-1, claudina 18.2, molécula do tipo lectina do tipo-C-1 (CLL-1), família do domínio de lectina do tipo-C 12 (CLEC12), antígeno Cora, ligante Notch canônico do tipo delta 3 (DDL3), desmogleína 4, ligante Notch não canônico do tipo delta 1 (DLK1), Ectonucleotídeo-Pirofosfatase/Fosfodiesterase 3 (ENPP3), EGFR, EGFRvIII, EpCAM, endosialina (CD248), variante do receptor do fator de crescimento epidérmico III (EGFRvIII), EphA2, antígeno F19, receptor de acetilcolina fetal (fnAChR), antígeno de ativação de fibroblasto (FAP), antígeno relacionado ao Fos 1 (FRA1), Receptor de Folato 1 (FOLR1), fucosil GM1, G250, gangliosídeo GD3, glipicano-3 (GPC3), 9-O-Acetil-GD3, GM2, Receptor de TNF induzido por glicocorticóide (GITR), globohexaosilceramida (globo-H), GD2, Glipicano 3 (GPC3), guanilil ciclase C (GCC), HER2, HER2 neu, HER3, HER4, HER1, IL13Rα2, receptor do fator de crescimento do tipo insulina I (IGF-IR ), Proteína Lisossomal Associada à Membrana 1 (LAMP1), Molécula de Adesão Celular L1 (L1CAM), antígeno de linfócito 6 (Ly-6), proteoglicano de sulfato de condroitina do melanoma (MCSP), Metaloproteinase do tipo membrana (MT-MMP), mesotelina, mucina 1 (MUC1), MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC7, MUC16, receptor de substância inibidora muelleriana tipo II (MISIIR), molécula de adesão celular de nectina 4 (Nectina-4), antígeno epitelial transmembrana da próstata-6 (STEAP), antígeno de célula plasmática 1, antígeno de célula-tronco da próstata

(PSCA), Morte Celular Programada 1 (PD1), Ligante de morte programada 1 (PD-L1), PSMA, Receptor Órfão do Tipo Receptor Tirosina-Quinase 1 (ROR1), antígeno Tn sialilado (s TN), proteína de transporte de fosfato sódio-dependente 2b (NaPi2b), Sonic Hedgehog (Shh), SAS, Membro 7 da Família SLAM (SLAM7), Receptor de Somatostatina 2 (SSTR2), Proteína Autoantigênica Espermática 17 (SP17), TAG72, Antígeno de Thomsen-Friedenreich (antígeno-TF), antígeno associado a tumor L6 (TAL6), glicoproteína trofoblástica (5T4), Trop-2, Wue-1, VEGFR1, VEGFR2 e proteína de tumor de Wilms (WT1). Em outra modalidade, o fragmento de anticorpo de SBM compreende uma VL e uma VH derivadas de um anticorpo monoclonal que possui afinidade de ligação para o marcador de célula-alvo.

Em outra modalidade, o fragmento de anticorpo de SBM compreende uma VL e uma VH derivadas de um anticorpo monoclonal, em que as VL e VH são selecionadas das seqüências apresentadas na Tabela 5. Em outra modalidade, o fragmento de anticorpo de SBM compreende uma região CDR-H1, uma região CDR-H2, uma região CDR-H3, uma região CDR-L1, uma região CDR-L2 e uma região CDR-H3, em que cada uma é derivada de um anticorpo monoclonal apresentado na Tabela 5. Nas modalidades apresentadas anteriormente, nas quais o polipeptídeo recombinante compreende a FBM, a SBM, o RS1 e o XTEN1, em um estado não clivado, o polipeptídeo recombinante possui um arranjo estrutural do terminal-N para o terminal-C de SBM-FBM-RS1-XTEN1, FBM-SBM-RS1-XTEN1, XTEN1- RS1-SBM-FBM, XTEN1-RS1-FBM-SBM, ou diabody-RS1-XTEN1 ou XTEN1-RS1-diabody, em que o diabody compreende VL e VH das FBM e SBM.

Em uma modalidade, a revelação fornece um polipeptídeo recombinante que compreende uma FBM, SBM, RS1 e um XTEN1, em que o polipeptídeo recombinante compreende uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de seqüência para uma seqüência selecionada do grupo de seqüências apresentadas na Tabela 14. Em uma característica projetada particular das modalidades apresentadas anteriormente, mediante clivagem do RS1 pela protease de mamífero e liberação das FBM e SBM do polipeptídeo recombinante, as FBM e SBM permanecem fundidas e são capazes de se ligar e de se unir junto com uma célula T que abriga o antígeno CD3 e uma célula tumoral que abriga o marcador de célula-alvo em um ensaio in vitro que compreende tanto as células T quanto as células tumorais.

Mediante a ligação e união da célula T que abriga o antígeno CD3 e da célula tumoral que abriga o marcador de célula-alvo pelas FBM e SBM fundidas, a ligação em conjunto da célula T e da célula tumoral resulta em atividade citotóxica contra a célula tumoral no ensaio in vitro, como determinado por quantificação da lise celular ou liberação de componentes intracelulares.

Em uma modalidade do polipeptídeo recombinante, em que o RS1 é clivado e as FBM e SBM são liberadas, as FBM e SBM fundidas liberadas são capazes de produzir uma quantidade maior de lise celular da célula tumoral, comparada com a lise celular produzida pelo polipeptídeo recombinante não clivado em ensaios in vitro realizados sob concentrações molares equivalentes, como determinado por quantificação da lise celular ou liberação de componentes intracelulares.

Em uma modalidade, a quantidade de lise celular produzida pelas FBM e SBM liberadas do polipeptídeo recombinante é pelo menos 10 vezes maior, ou pelo menos 30 vezes, ou pelo menos 100 vezes, ou pelo menos 300 vezes, ou pelo menos 1.000 vezes, ou pelo menos 10.000 vezes maior, comparada com a lise celular produzida pelo polipeptídeo recombinante não clivado nos ensaios in vitro realizados sob concentrações molares equivalentes, como determinado por quantificação da lise celular ou liberação de componentes intracelulares. Nas modalidades apresentadas anteriormente, a atividade citotóxica e/ou lise celular da célula tumoral pode ser mediada por ativação da célula T alvo-específica. Em uma modalidade, a quantidade de ativação da célula T produzida pelas FBM e SBM liberadas é pelo menos 10 vezes maior, ou pelo menos 30 vezes, ou pelo menos 100 vezes, ou pelo menos 300 vezes, ou pelo menos 1.000 vezes maior, ou pelo menos

10.000 vezes maior, comparada com a ativação produzida pelo polipeptídeo recombinante não clivado, como determinado por quantificação de moléculas efetoras derivadas de células T em ensaios in vitro realizados sob concentrações molares equivalentes. Em uma característica particular transmitida pelo design dos polipeptídeos recombinantes em questão, mediante clivagem do RS1 pela protease de mamífero e liberação das FBM e SBM do polipeptídeo recombinante, as FBM e SBM permanecem fundidas e exibem afinidade de ligação aumentada para o antígeno CD3 e/ou para o marcador de célula- alvo em um ensaio in vitro que compreende antígeno CD3 ou marcador de célula-alvo, comparada com a afinidade de ligação do polipeptídeo recombinante não clivado, intacto, para o antígeno CD3 ou para o marcador de célula-alvo, quando testada sob concentrações molares equivalentes. Em uma modalidade, a afinidade de ligação da FBM liberada para o antígeno CD3 ou da SBM liberada para o marcador de célula- alvo é pelo menos 10 vezes maior, ou pelo menos 30 vezes, ou pelo menos 100 vezes, ou pelo menos 300 vezes, ou pelo menos

1.000 vezes maior, como determinada como uma constante Kd no ensaio in vitro, comparada com a afinidade de ligação do polipeptídeo recombinante não clivado, intacto, para o antígeno CD3 ou para o marcador de célula-alvo, quando testada sob concentrações molares equivalentes. Na modalidade apresentada anteriormente, a constante Kd da ligação da FBM liberada do polipeptídeo recombinante para o antígeno CD3 é entre 10-5 a 10-9 M e a Kd da ligação da SBM liberada para o marcador alvo-específico é entre 10-5 a 10-9 M. Em outra modalidade, a afinidade de ligação da SBM liberada para o marcador de célula-alvo é pelo menos uma ordem de magnitude maior, comparada com a afinidade de ligação menor da FBM liberada para o antígeno CD3, como determinada como constantes Kd no ensaio in vitro, quando testada sob concentrações molares equivalentes. O ensaio in vitro utilizado pode ser selecionado de ensaio de integridade da membrana celular, ensaio de cultura de células mistas, ensaio de iodeto de propídio baseado em FACS, ensaio de influxo de Azul tripano, ensaio fotométrico de liberação de enzima, ensaio radiométrico de liberação de 51Cr, ensaio fluorimétrico de liberação de európio, ensaio de liberação de Calceína-AM, ensaio fotométrico de MTT, ensaio de XTT, ensaio de WST-1, ensaio de Azul de Alamar, ensaio radiométrico de incorporação de 3H-Thd, ensaio clonogênico que mede atividade de divisão celular, ensaio fluorimétrico de rodamina-123 que mede o gradiente transmembrana mitocondrial, ensaio de apoptose monitorado por exposição à fosfatidilserina baseado em FACS, ensaio de teste de TUNEL baseado em ELISA, ELISA em sanduíche, ensaio de atividade de caspase, ensaio de liberação de LDH baseado em células e ensaio de morfologia celular, ou qualquer combinação destes.

[014] Em outro aspecto, a revelação está relacionada aos polipeptídeos recombinantes que compreendem um RS1, FBM, SBM, XTEN1 que possuem os elementos descritos nas modalidades acima, e que ainda compreendem um segundo segmento de liberação (RS2) que é um substrato para clivagem por uma protease de mamífero, e um segundo XTEN (XTEN2). A revelação contempla diferentes configurações dos polipeptídeos recombinantes, em que, em um estado não clivado, o polipeptídeo recombinante possui um arranjo estrutural do terminal-N para o terminal-C do seguinte modo: XTEN1-RS1- SBM-FBM-RS2-XTEN2, XTEN1-RS1-FBM-SBM-RS2-XTEN2, XTEN2-RS2- SBM-FBM-RS1-XTEN1, XTEN2-RS2-FBM-SBM-RS1-XTEN1, XTEN2-RS2- diabody-RS1-XTEN1, em que o diabody compreende VL e VH das FBM e SBM, ou XTEN1-RS1-diabody-RS2-XTEN2, em que o diabody compreende VL e VH das FBM e SBM. Em uma modalidade, o XTEN2 do polipeptídeo recombinante compreende uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de seqüência para uma seqüência selecionada do grupo de seqüências apresentadas na Tabela 8 ou Tabela 10. Em outra modalidade, o XTEN2 do polipeptídeo recombinante compreende uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de seqüência para uma seqüência selecionada de AE 144_1A, AE 144_2A, AEE144_2B, AE 144_3A, AE144_3B, AE 144_4A, AE 144_4B, AE 144_5A, AE 144_6B, AE284, AE288_1, AE288_2,

AE288_3, AE576, AE864, AE864_2, AE865, AE866, AE867, AE867_2 e AE868. Em algumas modalidades dos polipeptídeos recombinantes em questão, a seqüência de RS2 é idêntica, comparada com a seqüência de RS1. Em outras modalidades, a seqüência de RS2 é diferente, comparada com a seqüência de RS1 e cada uma compreende uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos 88%, ou pelo menos 89%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 91%, ou pelo menos 92%, ou pelo menos 93%, ou pelo menos 94%, ou pelo menos 95% de identidade de seqüência para seqüências selecionadas das seqüências da Tabela 1 ou Tabela 2. Em outra modalidade, a seqüência de RS2 é diferente, comparada com a seqüência de RS1 e cada compreende uma seqüência selecionada das seqüências da Tabela 1 ou Tabela 2. Em outra modalidade, a revelação fornece um polipeptídeo recombinante que compreende um XTEN1, RS1, SBM, FBM, RS2 e XTEN2, em que o polipeptídeo recombinante compreende uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de seqüência para uma seqüência selecionada do grupo de seqüências apresentadas na Tabela 15 ou Tabela 18.

[015] Em uma modalidade, a revelação fornece um polipeptídeo recombinante que compreende um RS1, RS2, FBM, SBM, XTEN1 e XTEN2, em que i) o RS1 e RS2, em que o RS1 e RS2 são cada um, um substrato para clivagem por uma protease de mamífero e cada um compreende uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos 90%, pelo menos 93%, pelo menos 97%, ou 100% de identidade de seqüência para uma seqüência selecionada das seqüências da Tabela 2; ii) a FBM é um fragmento de anticorpo que compreende uma VL e uma VH derivadas de um anticorpo monoclonal que possui especificidade de ligação para uma célula efetora; iii) a SBM é um fragmento de anticorpo que compreende uma VL e uma VH derivadas de um anticorpo monoclonal que possui afinidade de ligação para um marcador de célula-alvo; iv) o XTEN1 e XTEN2, cada um, compreendem uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de seqüência para uma seqüência selecionada do grupo de seqüências apresentadas na Tabela 10; e v) o polipeptídeo recombinante possui um arranjo estrutural do terminal-N para o terminal- C do seguinte modo: XTEN1-RS1-SBM-FBM-RS2-XTEN2, XTEN1-RS1- FBM-SBM-RS2-XTEN2, XTEN2-RS2-SBM-FBM-RS1-XTEN1, XTEN2-RS2- FBM-SBM-RS1-XTEN1, XTEN2-RS2-diabody-RS1-XTEN1, em que o diabody compreende VL e VH das FBM e SBM.

Na modalidade apresentada anteriormente, a célula efetora é uma célula T e o marcador de célula-alvo é selecionado de antígeno A33, alfa-fetoproteína (AFP), integrina alfa 4, Ang2, B7-H3, B7- H6, antígeno de maturação de célula B (BCMA), antígeno de câncer 19-9 (CA19-9), antígeno de câncer 125 (CA-125), Anidrase Carbônica 6 (CA6), anidrase carbônica IX (CAIX), CEACAM5, cMET, CTLA4, Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 1 (CCR1), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 2 (CCR2), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 3 (CCR3), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 4 (CCR4), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 5 (CCR5), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 6 (CCR6), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 7 (CCR7), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 8 (CCR8), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 9 (CCR9), Agrupamento de Diferenciação 7 (CD7), CD22, CD70, CD79a, CD79b, CD19, CCR8,

CEA, βhCG, Lewis-Y, CA19-9, CA-125, CD20, CD22, CD25, CD33, CD38, CD30, CD44v6, CD47, CD56 (NCAM), CD63, CD79b, CD123, CD133, CD138, CD166, claudina-1, claudina 18.2, molécula do tipo lectina do tipo-C-1 (CLL-1), família do domínio de lectina do tipo-C 12 (CLEC12), antígeno Cora, ligante Notch canônico do tipo delta 3 (DDL3), desmogleína 4, ligante Notch não canônico do tipo delta 1 (DLK1), Ectonucleotídeo Pirofosfatase/ Fosfodiesterase 3 (ENPP3), EGFR, EGFRvIII, EpCAM, endosialina (CD248), variante do receptor do fator de crescimento epidérmico III (EGFRvIII), EphA2, antígeno F19, receptor de acetilcolina fetal (fnAChR), antígeno de ativação de fibroblasto (FAP), antígeno relacionado ao Fos 1 (FRA1), Receptor de Folato 1 (FOLR1), fucosil GM1, G250, gangliosídeo GD3, glipicano-3 (GPC3), 9-O-Acetil-GD3, GM2, Receptor de TNF induzido por glicocorticóide (GITR), globohexaosilceramida (globo-H), GD2, Glipicano 3 (GPC3), guanilil ciclase C (GCC), HER2, HER2 neu, HER3, HER4, HER1, IL13Rα2, receptor do fator de crescimento do tipo insulina I (IGF-IR ), Proteína Lisossomal Associada à Membrana 1 (LAMP1), Molécula de Adesão Celular L1 (L1CAM), antígeno de linfócito 6 (Ly-6), proteoglicano de sulfato de condroitina do melanoma (MCSP), Metaloproteinase do tipo membrana (MT- MMP), mesotelina, mucina 1 (MUC1), MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC7, MUC16, receptor de substância inibidora muelleriana tipo II (MISIIR), molécula de adesão celular de nectina 4 (Nectina-4), antígeno epitelial transmembrana da próstata-6 (STEAP), antígeno de célula plasmática 1, antígeno de célula-tronco da próstata (PSCA), Morte Celular Programada 1 (PD1), Ligante de morte programada 1 (PD-L1), PSMA, Receptor Órfão do Tipo Receptor Tirosina-Quinase 1

(ROR1), antígeno Tn sialilado (s TN), proteína de transporte de fosfato sódio-dependente 2b (NaPi2b), Sonic Hedgehog (Shh), SAS, Membro 7 da Família SLAM (SLAM7), Receptor de Somatostatina 2 (SSTR2), Proteína Autoantigênica Espermática 17 (SP17), TAG72, Antígeno de Thomsen-Friedenreich (antígeno-TF), antígeno associado a tumor L6 (TAL6), glicoproteína trofoblástica (5T4), Trop-2, Wue-1, VEGFR1, VEGFR2 e proteína de tumor de Wilms (WT1). As seqüências de RS1 e de RS2 podem ser idênticas ou podem ser seqüências diferentes selecionadas da Tabela 2. Em uma modalidade, a seqüência de RS2 é diferente, comparada com a seqüência de RS1 e cada uma é um substrato para uma protease diferente apresentada na Tabela 3. Em outra modalidade, as seqüências de RS1 e de RS2 são idênticas e cada uma é um substrato para duas ou mais proteases selecionadas de legumaína, MMP-2, MMP-7, MMP-9, MMP-11, MMP-14, uPA e matriptase.

Em uma característica projetada particular das modalidades apresentadas anteriormente, mediante clivagem do RS1 e do RS2 pela protease(s) de mamífero e liberação das FBM e SBM do polipeptídeo recombinante, as FBM e SBM permanecem fundidas e são capazes de se ligar e de se unir junto com uma célula T que abriga o antígeno CD3 e uma célula tumoral que abriga o marcador de célula-alvo em um ensaio in vitro que compreende tanto as células T quanto as células tumorais.

Em outra característica projetada das modalidades apresentadas anteriormente, a habilidade menor do polipeptídeo recombinante em um estado não clivado para induzir lise da célula tumoral que abriga o antígeno de marcador de célula-alvo em um ensaio in vitro que compreende tanto células T quanto células tumorais é pelo menos duas ordens de magnitude menor, ou pelo menos três ordens de magnitude menor, ou pelo menos quatro ordens de magnitude menor, comparada com a quantidade de lise maior induzida pela FBM ou pela SBM que foi liberada do polipeptídeo recombinante por clivagem do RS1 e RS2, como determinada por quantificação da lise celular ou liberação de componentes intracelulares quando testada sob concentrações molares equivalentes.

Em outra característica projetada particular das modalidades apresentadas anteriormente do polipeptídeo recombinante que compreende um RS1, RS2, FBM, SBM, XTEN1 e XTEN2, a afinidade de ligação do polipeptídeo recombinante não clivado para o antígeno CD3 ou para o marcador de célula- alvo em um ensaio in vitro que compreende antígeno CD3 ou marcador de célula-alvo é pelo menos uma ordem de magnitude menor, como determinada como uma constante Kd, comparada com a afinidade de ligação para o antígeno CD3 ou para o marcador de célula-alvo de um polipeptídeo recombinante não clivado que compreende um RS1, RS2, FBM, SBM, XTEN1, mas que não compreende um segundo segmento de liberação e um segundo XTEN, quando testada sob concentrações molares equivalentes.

Em uma modalidade, a afinidade de ligação do polipeptídeo recombinante não clivado que compreende um RS1, RS2, FBM, SBM, XTEN1 e XTEN2 para o antígeno CD3 ou para o marcador de célula-alvo em um ensaio in vitro que compreende antígeno CD3 ou marcador de célula-alvo é pelo menos duas ordens de magnitude menor, ou pelo menos três ordens de magnitude menor, ou pelo menos quatro ordens de magnitude menor, como determinada como uma constante Kd no ensaio in vitro, comparada com a afinidade de ligação para antígeno CD3 ou marcador de célula-alvo da FBM ou da SBM que foi liberada do polipeptídeo recombinante por clivagem do RS1 e o RS2, quando testada sob concentrações molares equivalentes. O ensaio in vitro utilizado pode ser selecionado de ensaio de integridade da membrana celular, ensaio de cultura de células mistas, ensaio de iodeto de propídio baseado em FACS, ensaio de influxo de Azul tripano, ensaio fotométrico de liberação de enzima, ensaio radiométrico de liberação de 51Cr, ensaio fluorimétrico de liberação de európio, ensaio de liberação de Calceína-AM, ensaio fotométrico de MTT, ensaio de XTT, ensaio de WST-1, ensaio de Azul de Alamar, ensaio radiométrico de incorporação de 3H-Thd, ensaio clonogênico que mede atividade de divisão celular, ensaio fluorimétrico de rodamina-123 que mede o gradiente transmembrana mitocondrial, ensaio de apoptose monitorado por exposição à fosfatidilserina baseado em FACS, ensaio de teste de TUNEL baseado em ELISA, ELISA em sanduíche, ensaio de atividade de caspase, ensaio de liberação de LDH baseado em células e ensaio de morfologia celular, ou qualquer combinação destes.

[016] As composições de polipeptídeo recombinante fornecidas nesse relatório descritivo podem ser úteis para diversas finalidades, incluindo fins terapêuticos e diagnósticos. Em um aspecto, a revelação está relacionada às composições de polipeptídeo recombinante administradas a um indivíduo. Como será observado por aqueles habilitados na técnica, a administração de um polipeptídeo recombinante que possui os elementos descritos nas modalidades acima, a um indivíduo que possui uma célula-alvo, por exemplo, um tumor, os segmentos de liberação do polipeptídeo recombinante são capazes de serem clivados quando nas proximidades do tumor, em que o tumor ou tecido circundante está expressando uma ou mais proteases para as quais os segmentos de liberação são a substrato. Em uma modalidade, mediante clivagem do(s) segmento(s) de liberação pela protease e liberação das FBM e SBM no polipeptídeo recombinante administrado no indivíduo, as FBM e SBM fundidas são capazes de se ligar e de se unir junto com uma célula T que abriga o antígeno CD3 e uma célula tumoral que abriga um marcador tumor-específico que é um ligante para a SBM no indivíduo. Mediante a ligação em conjunto da célula T que abriga o antígeno CD3 e da célula tumoral que abriga o marcador de célula tumoral pelas FBM e SBM liberadas, formando uma sinapse imunológica, a ligação resulta na liberação de uma ou mais moléculas efetoras derivadas de células T pela célula T. Em uma modalidade, as (uma ou mais) moléculas efetoras são selecionadas de TNF- alfa, IFN-gama, interleucina 2, perforina e granzimas. Mediante a ligação em conjunto da célula T que abriga o antígeno CD3 e da célula tumoral que abriga o marcador tumor- específico, a lise da célula tumoral no indivíduo é produzida pelas moléculas efetoras derivadas de células T. Nas modalidades apresentadas anteriormente, o indivíduo é selecionado do grupo que consiste em camundongo, rato, macaco, cão e humano.

[017] Em outro aspecto, a revelação está relacionada às propriedades farmacocinéticas dos polipeptídeos recombinantes em questão e aos componentes liberados após administrações a um indivíduo. Em uma modalidade, o polipeptídeo recombinante não clivado exibe uma meia-vida terminal após administração de uma dose única a um indivíduo que é pelo menos cinco vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes ou 100 vezes maior, comparada com a meia-

vida terminal das FBM e SBM fundidas não ligadas ao polipeptídeo recombinante quando o polipeptídeo recombinante não clivado e as FBM e SBM fundidas são, cada um administrados a um indivíduo em uma dose molar equivalente.

Em outra modalidade, após a administração de a dose única terapeuticamente eficaz do polipeptídeo recombinante a um indivíduo que possui uma ou mais proteases associadas a tumores capazes de clivar o(s) segmento(s) de liberação do polipeptídeo recombinante, as FBM e SBM fundidas clivadas e liberadas do polipeptídeo recombinante exibem uma meia-vida terminal que é pelo menos cinco vezes, 10 vezes, ou 20 vezes, ou 30 vezes, ou 50 vezes ou 100 vezes menor, comparada com a meia-vida terminal do polipeptídeo recombinante correspondente que não é clivado no indivíduo.

Em outra modalidade, após a administração de uma dose única terapeuticamente eficaz do polipeptídeo recombinante a um indivíduo que possui uma protease associada a tumores capaz de clivar o(s) segmento(s) de liberação do polipeptídeo recombinante, a concentração plasmática Cmax das FBM e SBM liberadas fundidas não excede cerca de 0,01 ng/ml, ou cerca de 0,1 ng/ml, ou cerca de 1 ng/ml, ou cerca de 10 ng/ml, ou cerca de 100 ng/ml.

Em outra modalidade, após a administração de uma dose única terapeuticamente eficaz do polipeptídeo recombinante a um indivíduo que possui uma protease associada a tumores capaz de clivar o(s) segmento(s) de liberação do polipeptídeo recombinante, a área plasmática sob a curva das FBM e SBM liberadas é pelo menos 10 vezes menor, ou pelo menos 30 vezes menor, ou pelo menos 100 vezes menor, comparada com a área plasmática sob a curva do polipeptídeo recombinante não clivado no indivíduo.

Nas modalidades apresentadas anteriormente, o indivíduo é selecionado do grupo que consiste em camundongo, rato, macaco, cão e humano.

[018] A presente revelação fornece composições farmacêuticas que compreendem qualquer um dos polipeptídeos recombinantes descritos nesse relatório descritivo, junto com um ou mais excipientes farmaceuticamente adequados. Em uma modalidade, a composição farmacêutica é formulada para administração intradérmica, subcutânea, intravenosa, intra- arterial, intra-abdominal, intraperitoneal, intratecal ou intramuscular. Em outra modalidade, a composição farmacêutica está em uma forma líquida. Em outra modalidade, a composição farmacêutica está em uma seringa pré-preenchida para uma injeção única. Em outra modalidade, a composição farmacêutica é formulada como um pó liofilizado para ser reconstituído antes da administração.

[019] A presente revelação contempla o uso do polipeptídeo recombinante de qualquer uma das modalidades descritas nesse relatório descritivo na preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença em um indivíduo. Em uma modalidade, a doença a ser tratada pelo medicamento é selecionada do grupo que consiste em carcinoma, linfoma de Hodgkin e linfoma não-Hodgkin, linfoma difuso de grandes células B, linfoma folicular, linfoma de célula do manto, blastoma, câncer de mama, câncer de mama ER/PR+, câncer de mama Her2+, câncer de mama triplo-negativo, câncer de cólon, câncer de cólon com ascite maligna, tumores mucinosos, câncer de próstata, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pele, melanoma, câncer do trato geniturinário, câncer ovariano, câncer ovariano com ascite maligna, carcinomatose peritoneal, carcinoma seroso uterino, câncer endometrial,

câncer cervical, câncer cólon-retal, câncer uterino, mesotelioma no peritônio, câncer renal, tumor de Wilm, câncer de pulmão, câncer de pulmão de pequena célula, câncer de pulmão de célula não-pequena, câncer gástrico, câncer do estômago, câncer do intestino delgado, câncer do fígado, hepatocarcinoma, hepatoblastoma, lipossarcoma, câncer pancreático, câncer da vesícula biliar, cânceres do ducto biliar, câncer esofágico, carcinoma da glândula salivar, câncer da tireóide, câncer epitelial, arrenoblastoma, adenocarcinoma, sarcoma e leucemia linfática crônica derivada de células B.

[020] Em outro aspecto, a revelação está relacionada aos métodos de tratamento de uma doença em um indivíduo. Em uma modalidade, a revelação fornece um método de tratamento de uma doença em um indivíduo, que compreende a administração ao indivíduo necessitado de uma ou mais doses terapeuticamente eficazes do polipeptídeo recombinante ou de uma composição farmacêutica que compreende o polipeptídeo recombinante de qualquer uma das modalidades descritas nesse relatório descritivo. Em uma modalidade, a doença a ser tratada pelo método é selecionada do grupo que consiste em carcinomas, linfoma de Hodgkin, linfoma não-Hodgkin, linfoma de célula B, linfoma de célula T, linfoma folicular, linfoma de célula do manto, blastoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer de próstata, câncer de cabeça e pescoço, qualquer forma de câncer de pele, melanoma, câncer do trato geniturinário, câncer ovariano, câncer ovariano com ascite maligna, carcinomatose peritoneal, carcinoma seroso uterino, câncer endometrial, câncer cervical, câncer cólon-retal, uma malignidade intraperitoneal dos epitélios com ascite maligna, câncer uterino, mesotelioma no peritônio, cânceres renais, câncer de pulmão, câncer de pulmão de pequena célula, câncer de pulmão de célula não-pequena, câncer gástrico, câncer esofágico, câncer do estômago, câncer do intestino delgado, câncer do fígado, hepatocarcinoma, hepatoblastoma, lipossarcoma, câncer pancreático, câncer da vesícula biliar, cânceres do ducto biliar, carcinoma da glândula salivar, câncer da tireóide, câncer epitelial, adenocarcinoma, sarcomas de qualquer origem, malignidades hematológicas primárias, incluindo leucemias linfocíticas agudas ou crônicas, leucemias mielógenas agudas ou crônicas, distúrbios neoplásicos mieloproliferativos, ou distúrbios mielodisplásicos, miastenia grave, doença de Graves, tireoidite de Hashimoto ou síndrome de Goodpasture.

Em outra modalidade, a revelação fornece um método de tratamento no qual a composição farmacêutica ou polipeptídeo recombinante é administrado ao indivíduo como uma ou mais doses terapeuticamente eficazes administradas duas vezes por semana, uma vez por semana, a cada duas semanas, a cada três semanas ou mensalmente.

Em outra modalidade do método de tratamento, a composição farmacêutica ou polipeptídeo recombinante é administrado ao indivíduo como uma ou mais doses terapeuticamente eficazes ao longo de um período de pelo menos duas semanas, ou pelo menos um mês, ou pelo menos dois meses, ou pelo menos três meses, ou pelo menos quatro meses, ou pelo menos cinco meses, ou pelo menos seis meses.

No método de tratamento, a dose pode ser administrada por via intradérmica, subcutânea, intravenosa, intra-arterial, intra-abdominal, intraperitoneal, intratecal ou intramuscular.

Em outra modalidade do método de tratamento,

a composição farmacêutica ou polipeptídeo recombinante dose é administrada como uma dose em bolo ou por infusão de 5 minutos a 96 horas, como tolerada para segurança e eficácia máximas.

Nas modalidades apresentadas anteriormente do método de tratamento, a dose a ser administrada é selecionada do grupo que consiste em pelo menos cerca de 0,005 mg/kg, pelo menos cerca de 0,01 mg/kg, pelo menos cerca de 0,02 mg/kg, pelo menos cerca de 0,04 mg/kg, pelo menos cerca de 0,08 mg/kg, pelo menos cerca de 0,1 mg/kg, pelo menos cerca de 0,12 mg/kg, pelo menos cerca de 0,14 mg/kg, pelo menos cerca de 0,16 mg/kg, pelo menos cerca de 0,18 mg/kg, pelo menos cerca de 0,20 mg/kg, pelo menos cerca de 0,22 mg/kg, pelo menos cerca de 0,24 mg/kg, pelo menos cerca de 0,26 mg/kg, pelo menos cerca de 0,27 mg/kg, pelo menos cerca de 0,28 mg/kg, pelo menos 0,3 mg/kg, pelo menos 0,4 mg/kg, pelo menos cerca de 0,5 mg/kg, pelo menos cerca de 0,6 mg/kg, pelo menos cerca de 0,7 mg/kg, pelo menos cerca de 0,8 mg/kg, pelo menos cerca de 0,9 mg/kg, pelo menos cerca de 1,0 mg/kg, pelo menos cerca de 1,5 mg/kg, ou pelo menos cerca de 2,0 mg/kg.

Em outra modalidade do método de tratamento, uma dose inicial é selecionada do grupo que consiste em pelo menos cerca de 0,005 mg/kg, pelo menos cerca de 0,01 mg/kg, pelo menos cerca de 0,02 mg/kg, pelo menos cerca de 0,04 mg/kg, pelo menos cerca de 0,08 mg/kg, pelo menos cerca de 0,1 mg/kg, e uma dose subseqüente é selecionada do grupo que consiste em pelo menos cerca de 0,1 mg/kg, pelo menos cerca de 0,12 mg/kg, pelo menos cerca de 0,14 mg/kg, pelo menos cerca de 0,16 mg/kg, pelo menos cerca de 0,18 mg/kg, pelo menos cerca de 0,20 mg/kg, pelo menos cerca de 0,22 mg/kg, pelo menos cerca de 0,24 mg/kg, pelo menos cerca de 0,26 mg/kg, pelo menos cerca de 0,27 mg/kg, pelo menos cerca de 0,28 mg/kg, pelo menos 0,3 mg/kg, pelo menos 0,4. mg/kg, pelo menos cerca de 0,5 mg/kg, pelo menos cerca de 0,6 mg/kg, pelo menos cerca de 0,7 mg/kg, pelo menos cerca de 0,8 mg/kg, pelo menos cerca de 0,9 mg/kg, pelo menos cerca de 1,0 mg/kg, pelo menos cerca de 1,5 mg/kg, ou pelo menos cerca de 2,0 mg/kg. Em outra modalidade do método de tratamento, a administração ao indivíduo resulta em uma concentração plasmática do polipeptídeo recombinante de pelo menos cerca de 0,1 ng/ml até pelo menos cerca de 2 ng/ml ou mais no indivíduo por pelo menos cerca de 3 dias, pelo menos cerca de 7 dias, pelo menos cerca de 10 dias, pelo menos cerca de 14 dias, ou pelo menos cerca de 21 dias. Nas modalidades apresentadas anteriormente do método de tratamento, o indivíduo é selecionado do grupo que consiste em camundongo, rato, macaco e humano.

[021] Em outro aspecto, a revelação está relacionada aos regimes de tratamento. Em uma modalidade, o regime de tratamento usa um polipeptídeo recombinante ou composição farmacêutica descrita nesse relatório descritivo para uso em um método para o tratamento de uma doença, o método compreendendo a administração da composição farmacêutica ou do polipeptídeo recombinante a um indivíduo com a doença, opcionalmente de acordo com um regime de tratamento que compreende duas ou mais doses consecutivas com o uso de uma dose terapeuticamente eficaz. A doença a ser tratada pelo regime é selecionada do grupo que consiste em carcinomas, linfoma de Hodgkin, linfoma não-Hodgkin, linfoma de célula B, linfoma de célula T, linfoma folicular, linfoma de célula do manto, blastoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer de próstata, câncer de cabeça e pescoço, qualquer forma de câncer de pele, melanoma, câncer do trato geniturinário, câncer ovariano, câncer ovariano com ascite maligna, carcinomatose peritoneal, carcinoma seroso uterino, câncer endometrial, câncer cervical, câncer cólon-retal, uma malignidade intraperitoneal dos epitélios com ascite maligna, câncer uterino, mesotelioma no peritônio, cânceres renais, câncer de pulmão, câncer de pulmão de pequena célula, câncer de pulmão de célula não-pequena, câncer gástrico, câncer esofágico, câncer do estômago, câncer do intestino delgado, câncer do fígado, hepatocarcinoma, hepatoblastoma, lipossarcoma, câncer pancreático, câncer da vesícula biliar, cânceres do ducto biliar, carcinoma da glândula salivar, câncer da tireóide, câncer epitelial, adenocarcinoma, sarcomas de qualquer origem, malignidades hematológicas primárias, incluindo leucemias linfocíticas agudas ou crônicas, leucemias mielógenas agudas ou crônicas, distúrbios neoplásicos mieloproliferativos, ou distúrbios mielodisplásicos, miastenia grave, doença de Graves, tireoidite de Hashimoto, e síndrome de Goodpasture.

Em outra modalidade, a composição farmacêutica ou o polipeptídeo recombinante para o uso no regime de tratamento é parte de um ciclo de tratamento especificado.

O ciclo de tratamento pode compreender a administração da composição farmacêutica ou do polipeptídeo recombinante duas vezes por semana, a cada semana, a cada 10 dias, a cada duas semanas, a cada três semanas, ou a cada mês por cada ciclo de tratamento.

Nas modalidades de regime apresentadas anteriormente, o regime de tratamento resulta na melhora de um parâmetro ou desfecho clínico associado com a doença no indivíduo.

O parâmetro ou desfecho clínico associado com a doença no indivíduo pode ser um ou qualquer combinação do grupo que consiste em redução da massa tumoral como uma resposta completa, parcial ou incompleta; tempo até progressão, tempo até fracasso do tratamento, resposta de biomarcador; sobrevida livre de progressão; sobrevida livre de doença; tempo até recorrência; tempo até metástase; tempo de sobrevida global; melhora da qualidade de vida; e melhora de sintomas.

[022] Em outro aspecto, a revelação fornece kits. Em uma modalidade, a revelação fornece um kit que compreende a composição farmacêutica de qualquer uma das modalidades descritas nesse relatório descritivo, junto com um recipiente e um rótulo ou bula sobre ou associado ao recipiente.

[023] Ainda em outra modalidade, a revelação fornece uma ou mais ácidos nucleicos isolados, o ácido nucleico compreendendo (a) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo recombinante de qualquer uma das modalidades descritas nesse relatório descritivo; ou (b) o complemento do polinucleotídeo de (a). A revelação também fornece um vetor de expressão que compreende as seqüências de polinucleotídeos que codificam o polipeptídeo recombinante de qualquer uma das modalidades descritas nesse relatório descritivo e uma seqüência reguladora recombinante ligada operativamente à seqüência de polinucleotídeos. A revelação também fornece uma célula hospedeira isolada, que compreende o vetor de expressão citado anteriormente. Em uma modalidade a célula hospedeira é um procariota. Em outra modalidade, a célula hospedeira é E. coli.

[024] Em outro aspecto, a revelação está relacionada aos métodos de fabricação de um polipeptídeo recombinante ativável.

Em uma modalidade, a revelação fornece um método de fabricação de uma composição de polipeptídeo recombinante ativável, o método compreendendo: a) cultivo de uma célula hospedeira que compreende uma construção de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo recombinante ativável sob condições que levam à expressão do polipeptídeo recombinante ativável, em que o polipeptídeo recombinante ativável compreende um RS1, RS2, FBM, SBM, XTEN1 e XTEN2, em que: i) o RS1 e RS2, em que o RS1 e RS2 são, cada um, substratos para clivagem por uma protease de mamífero e cada um compreende uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos 88%, ou pelo menos 89%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 91%, ou pelo menos 92%, ou pelo menos 93%, ou pelo menos 94%, ou pelo menos 95%, ou 100% de identidade de seqüência para uma seqüência selecionada das seqüências da Tabela 1 ou Tabela 2; ii) a FBM é um fragmento de anticorpo que compreende uma VL e uma VH derivadas de um anticorpo monoclonal que possui especificidade de ligação para CD3; iii) a SBM é um fragmento de anticorpo que compreende uma VL e uma VH derivadas de um anticorpo monoclonal que possui afinidade de ligação para o marcador de célula-alvo selecionado de antígeno A33, alfa-fetoproteína (AFP), integrina alfa 4, Ang2, B7-H3, B7-H6, antígeno de maturação de célula B (BCMA), antígeno de câncer 19-9 (CA19-9), antígeno de câncer 125 (CA-125), Anidrase Carbônica 6 (CA6), anidrase carbônica IX (CAIX), CEACAM5, cMET, CTLA4, Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 1 (CCR1), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 2 (CCR2), Receptor de Quimiocina de Motivo C-

C 3 (CCR3), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 4 (CCR4), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 5 (CCR5), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 6 (CCR6), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 7 (CCR7), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 8 (CCR8), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 9 (CCR9), Agrupamento de Diferenciação 7 (CD7), CD22, CD70, CD79a, CD79b, CD19, CCR8, CEA, βhCG, Lewis-Y, CA19-9, CA-125, CD20, CD22, CD25, CD33, CD38, CD30, CD44v6, CD47, CD56 (NCAM), CD63, CD79b, CD123, CD133, CD138, CD166, claudina-1, claudina 18.2, molécula do tipo lectina do tipo-C-1 (CLL-1), família do domínio de lectina do tipo-C 12 (CLEC12), antígeno Cora, ligante Notch canônico do tipo delta 3 (DDL3), desmogleína 4, ligante Notch não canônico do tipo delta 1 (DLK1), Ectonucleotídeo Pirofosfatase/ Fosfodiesterase 3 (ENPP3), EGFR, EGFRvIII, EpCAM, endosialina (CD248), variante do receptor do fator de crescimento epidérmico III (EGFRvIII), EphA2, antígeno F19, receptor de acetilcolina fetal (fnAChR), antígeno de ativação de fibroblasto (FAP), antígeno relacionado ao Fos 1 (FRA1), Receptor de Folato 1 (FOLR1), fucosil GM1, G250, gangliosídeo GD3, glipicano-3 (GPC3), 9-O-Acetil-GD3, GM2, Receptor de TNF induzido por glicocorticóide (GITR), globohexaosilceramida (globo-H), GD2, Glipicano 3 (GPC3), guanilil ciclase C (GCC), HER2, HER2 neu, HER3, HER4, HER1, IL13Rα2, receptor do fator de crescimento do tipo insulina I (IGF-IR ), Proteína Lisossomal Associada à Membrana 1 (LAMP1), Molécula de Adesão Celular L1 (L1CAM), antígeno de linfócito 6 (Ly-6), proteoglicano de sulfato de condroitina do melanoma (MCSP), Metaloproteinase do tipo membrana (MT-MMP), mesotelina, mucina 1 (MUC1), MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC7, MUC16, receptor de substância inibidora muelleriana tipo II (MISIIR), molécula de adesão celular de nectina 4 (Nectina-4), antígeno epitelial transmembrana da próstata-6 (STEAP), antígeno de célula plasmática 1, antígeno de célula-tronco da próstata (PSCA), Morte Celular Programada 1 (PD1), Ligante de morte programada 1 (PD-L1), PSMA, Receptor Órfão do Tipo Receptor Tirosina-Quinase 1 (ROR1), antígeno Tn sialilado (s TN), proteína de transporte de fosfato sódio-dependente 2b (NaPi2b), Sonic Hedgehog (Shh), SAS, Membro 7 da Família SLAM (SLAM7), Receptor de Somatostatina 2 (SSTR2), Proteína Autoantigênica Espermática 17 (SP17), TAG72, Antígeno de Thomsen-Friedenreich (antígeno-TF), antígeno associado um tumor L6 (TAL6), glicoproteína trofoblástica (5T4), Trop-2, Wue-1, VEGFR1, VEGFR2 e proteína de tumor de Wilms (WT1); iv) o XTEN1 e XTEN2, cada um, compreendem uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de seqüência para uma seqüência selecionada do grupo de seqüências apresentadas na Tabela 8 ou Tabela 10; iv) o polipeptídeo recombinante possui um arranjo estrutural do terminal-N para o terminal-C do seguinte modo: XTEN1-RS1- SBM-FBM-RS2-XTEN2, XTEN1-RS1-FBM-SBM-RS2-XTEN2, XTEN2-RS2- SBM-FBM-RS1-XTEN1, XTEN2-RS2-FBM-SBM-RS1-XTEN1, XTEN2-RS2- diabody-RS1-XTEN1, em que o diabody compreende VL e VH das FBM e SBM; e b) recuperação da composição de polipeptídeo ativável.

No método citado anteriormente, o polipeptídeo recombinante ativável é ativado por clivagem do RS1 e RS2 por uma ou mais proteases capazes de clivar o RS1 e RS2, resultando na liberação das FBM e SBM da composição, em que as FBM e SBM permanecem fundidas.

Em uma modalidade do método, o XTEN1 e XTEN2 do polipeptídeo recombinante ativável em um estado não clivado interferem com a ligação específica da FBM ao CD3 e da SBM ao marcador de célula-alvo, de modo que a constante de dissociação (Kd) da FBM do polipeptídeo recombinante ativável em um estado não clivado para CD3 ou da SBM para o marcador de célula-alvo é pelo menos 100 vezes maior, comparada com a FBM ou com a SBM liberadas do polipeptídeo recombinante ativável por clivagem do RS1 e RS2, quando medida em ensaios in vitro que compreendem o marcador de célula-alvo sob concentrações molares equivalentes.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[025] As características e vantagens da invenção podem ser adicionalmente explicadas por referência à descrição detalhada seguinte e aos desenhos que a acompanham que apresentam modalidades ilustrativas.

[026] A FIG. 1 retrata as várias figuras esquemáticas usadas em vários desenhos, junto com descrições do que representam.

[027] A FIG. 2 retrata uma composição de ProTIA (uma forma de composição de polipeptídeo recombinante descrita nesse relatório descritivo) que está na forma “pro”, não clivada, e no estado clivado após ser acionada por uma protease associada a tumor. A figura também descreve algumas das propriedades não limitantes de ambas as formas das composições.

[028] A FIG. 3 mostra a forma “pro” não clivada de ProTIA na FIG. 3A e a forma clivada na FIG. 3B, na qual a forma não clivada é retratada nas proximidades de uma célula efetora e uma célula associada ao tumor, cada uma com antígenos da superfície celular; no entanto, a forma não clivada na FIG. 3A é incapaz de se ligar concomitantemente às duas células por causa do impedimento estérico e dos efeitos de blindagem do XTEN nas porções de ligação, enquanto a forma clivada na FIG. 3B, com as porções de ligação liberadas, permite a ligação concomitante das duas células e permite a ativação imune pela célula efetora contra a célula-alvo associada ao tumor.

[029] A FIG. 4 mostra representações esquemáticas de duas configurações das composições de ProTIA, que ilustram que o Segmento de liberação e o XTEN podem ser anexados a qualquer porção de ligação da célula efetora ou à porção de ligação do antígeno tumoral.

[030] A FIG. 5 mostra representações esquemáticas de duas configurações das composições de ProTIA nas quais dois Segmentos de liberação e dois XTENs estão ligados às porções de ligação. No caso da FIG. 5A, um RS e XTEN estão ligados à porção de ligação da célula efetora e o outro RS e XTEN estão ligados à porção de ligação do antígeno tumoral, e a composição estaria em uma configuração de scFv. No caso da FIG. 5B, tanto RS quanto XTEN estão anexados à porção de ligação da célula efetora (à esquerda) ou à porção de ligação do antígeno tumoral (à direita), e as porções de ligação estariam em uma configuração de diabody (permitindo, dessa forma, que a composição seja produzida em forma recombinante).

[031] A FIG. 6 mostra representações esquemáticas de duas configurações das composições de ProTIA nas quais o XTEN é um polipeptídeo XTEN, e o RS e XTEN estão ligados à porção de ligação da célula efetora (à esquerda) ou o RS e

XTEN estão ligados à porção de ligação do antígeno tumoral (à direita). As FIGS. 6A-D mostram configurações alternativas do terminal-N e terminal-C para as porções de ligação.

[032] A FIG. 7 mostra representações esquemáticas de duas configurações das composições de ProTIA nas quais dois Segmentos de liberação e dois XTENs estão ligados às porções de ligação. No caso da FIG. 7A, um RS e um XTEN estão ligados à porção de ligação da célula efetora e o outro RS e XTEN estão ligados à porção de ligação do antígeno tumoral, e a composição estaria em uma configuração de scFv. No caso da FIG. 7B, tanto RS quanto XTEN estão anexados à porção de ligação da célula efetora (à direita) ou à porção de ligação do antígeno tumoral (à esquerda), e as porções de ligação estariam em uma configuração de diabody (permitindo, dessa forma, que a composição seja produzida em forma recombinante).

[033] A FIG. 8 mostra representações esquemáticas de duas configurações das composições de ProTIA nas quais o RS e XTEN estão ligados à porção de ligação da célula efetora (à esquerda) ou à porção de ligação do antígeno tumoral (à direita). A FIG. 8A retrata as porções de ligação como XTEN. A FIG. 8B retrata as porções de ligação como albumina. A FIG. 8C retrata as porções de ligação como um fragmento Fc.

[034] A FIG. 9 mostra representações esquemáticas de configurações das composições de ProTIA nas quais dois Segmentos de liberação e dois XTENs estão ligados às porções de ligação. A FIG. 9A retrata três configurações nas quais os dois RS e XTEN estão ligados tanto à porção de ligação da célula efetora quanto à porção de ligação do antígeno tumoral

(à esquerda), à porção de ligação do antígeno tumoral (o centro) ou à porção de ligação da célula efetora (à direita).

[035] A FIG. 9B retrata quatro configurações nas quais um RS e XTEN estão ligados à porção de ligação da célula efetora e um RS e albumina estão ligados à porção de ligação do antígeno tumoral (à esquerda superior), um RS e um XTEN estão ligados à porção de ligação do antígeno tumoral e um RS e albumina estão ligados à porção de ligação da célula efetora (à direita superior), tanto o RS e um XTEN quanto o RS e albumina estão ligados à porção de ligação do antígeno tumoral (à esquerda inferior) e tanto o RS e um XTEN quanto o RS e albumina estão ligados à porção de ligação da célula efetora (à direita inferior). A FIG. 9C retrata quatro configurações nas quais um RS e XTEN estão ligados à porção de ligação da célula efetora e um RS e Fc estão ligados à porção de ligação do antígeno tumoral (à esquerda superior), um RS e um XTEN estão ligados à porção de ligação do antígeno tumoral e um RS e Fc estão ligados à porção de ligação da célula efetora (à direita superior), tanto o RS e um XTEN quanto o RS e Fc estão ligados à porção de ligação do antígeno tumoral (à esquerda inferior) e tanto o RS e um XTEN quanto o RS e Fc estão ligados à porção de ligação da célula efetora (à direita inferior).

[036] A FIG. 10 mostra representações esquemáticas de um ProTIA nas proximidades de tecido tumoral (à esquerda) e tecido normal (à direita), em que a vasculatura mais permeável no tecido tumoral permite que o ProTIA extravase para dentro do tecido onde as proteases associadas a tumores podem atuar sobre o RS, clivando-o e liberando as porções de ligação, as quais, por sua vez, podem se ligar e unir em conjunto a célula efetora e a célula associada ao tumor. No caso do tecido normal, o extravasamento é bloqueado pelas barreiras mais firmes da vasculatura ou, no caso em que o ProTIA extravasa, o ProTIA permanece na forma “pro” e, embora capaz de se ligar à célula efetora, nenhuma célula tumoral está presente ou, se presente, estão presentes proteases insuficientes para liberar as porções de ligação, com o efeito líquido de que uma sinapse imunológica não é formada.

[037] A FIG. 11 mostra uma representação esquemática de uma configuração de scFv da porção de ligação da célula efetora e da porção de ligação do antígeno tumoral, cada uma com pares de VH/VL unidos por ligantes, e em um formato em tandem.

[038] A FIG. 12 mostra uma representação esquemática de uma configuração de diabody de cadeia única da porção de ligação da célula efetora e da porção de ligação do antígeno tumoral, cada com pares de VH/VL unidos por ligantes.

[039] A FIG. 13 mostra representações esquemáticas de construções. A FIG. 13A mostra uma representação esquemática de um design genérico de construção. As FIGS. 13B e 13C mostram representações esquemáticas de composições de ProTIA nas quais a porção de ligação da célula efetora e a porção de ligação do antígeno tumoral estão em várias permutações em configurações de scFv (FIG. 13B) [com domínios variáveis pesados (VH) e variáveis leves (VL) ligados por ligante intramolecular longo (L) ou ligante intermolecular mais curto (l)] e em configurações de diabody de cadeia única (FIG. 13C) [com os domínios VH e VL ligados por ligante longo (L) ou ligante intermolecular mais curto (l).

[040] A FIG. 14 mostra a purificação de AC1278 não clivado de meios de fermentação, como descrito no Exemplo 2. A FIG. 14A mostra SDS-PAGE exemplar de captura por IMAC de AC1278 de meios de fermentação; a FIG. 14B mostra a análise por SDS-PAGE de frações na etapa de polimento por HIC; a FIG. 14C mostra a análise por SDS-PAGE de frações na etapa de polimento por ImpRes-Q.

[041] A FIG. 15 mostra a análise de liberação de lote de AC1278 não clivado, como descrito no Exemplo 2. A FIG. 15A mostra a cromatografia SEC da análise de liberação de lote de AC1278 não clivado (em linha sólida) contra padrão de comprimento de XTEN (em linha tracejada); a FIG. 15B mostra a SDS-PAGE de liberação de lote de AC1278 não clivado.

[042] A FIG. 16 mostra a preparação de ProTIA-A clivado usando AC1278 não clivado, como descrito no Exemplo 2. A FIG. 16A mostra a análise por SDS-PAGE da mistura de reação de digestão com MMP-9; a FIG. 16B mostra a análise por SDS- PAGE de purificação por IMAC da mistura de digestão com MMP- 9 para remover segmento de XTEN clivado.

[043] A FIG. 17 mostra a análise de liberação de lote de AC1278 clivado, como descrito no Exemplo 2. A FIG. 17A mostra a cromatografia SEC da análise de liberação de lote de AC1278 clivado (em linha sólida) contra padrão de proteína globular (em linha tracejada); a FIG. 17B mostra a SDS-PAGE de liberação de lote de AC1278 clivado.

[044] A FIG. 18 mostra a purificação de AC1476 não clivado de meios de fermentação, como descrito no Exemplo 3. A FIG. 18A mostra SDS-PAGE exemplar de captura por IMAC de AC1476 de meios de fermentação; a FIG. 18B mostra a análise por SDS-PAGE de frações na etapa de polimento por HIC; a FIG. 18C mostra a análise por SDS-PAGE de frações na etapa de polimento por ImpRes-Q.

[045] A FIG. 19 mostra a análise de liberação de lote de AC1476 não clivado como descrito no Exemplo 3. A FIG. 19A mostra a cromatografia SEC da análise de liberação de lote de AC1476 não clivado (em linha sólida) contra padrão de comprimento de XTEN (em linha tracejada); a FIG. 19B mostra a SDS-PAGE de liberação de lote de AC1476 não clivado com coloração Coomassie; a FIG. 19C mostra a SDS-PAGE de liberação de lote de AC1476 não clivado com coloração com prata.

[046] A FIG. 20 mostra análise adicional de liberação de lote de AC1476 não clivado como descrito no Exemplo 3. A FIG. 20A mostra a liberação de lote ESI-MS de AC1476 não clivado; a FIG. 20B mostra a cromatografia por troca de cátions de liberação de lote de AC1476 não clivado.

[047] A FIG. 21 mostra a preparação de ProTIA-A clivado usando AC1476 não clivado como descrito no Exemplo 3. A FIG. 21A mostra a análise por SDS-PAGE da mistura de reação de digestão com MMP-9; a FIG. 21B mostra a análise por SDS-PAGE de frações de troca de ânions da mistura de digestão com MMP-9 para remover não clivada substrato, bem como segmento de XTEN clivado.

[048] A FIG. 22 mostra a análise de liberação de lote de AC1476 clivado como descrito no Exemplo 3. A FIG. 22A mostra a SEC analítica de liberação de lote de AC1476 clivado (em linha sólida) contra padrão de proteína globular (em linha tracejada); a FIG. 22B mostra a SDS-PAGE de liberação de lote de AC1476 clivado com coloração Coomassie; a FIG. 22C mostra a SDS-PAGE de liberação de lote de AC1476 clivado com coloração com prata.

[049] A FIG. 23 mostra a análise adicional de liberação de lote de AC1476 clivado como descrito no Exemplo 3. A FIG. 23A mostra a liberação de lote ESI-MS de AC1476 clivado; a FIG. 23B mostra a cromatografia por troca de cátions de liberação de lote de AC1476 clivado.

[050] FIG. 24 mostra ligação de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado e não tratado com protease para seu ligante, como descrito no Exemplo 4.

[051] A FIG. 25 retrata os resultados do experimento para determinar a atividade in vitro de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado e não tratado com protease, como descrito no Exemplo 6.

[052] A FIG. 26 retrata os resultados do experimento para determinar a especificidade in vitro de ProTIA anti- EpCAM x anti-CD3, como descrito no Exemplo 6.

[053] A FIG. 27 retrata os resultados do experimento para determinar a atividade in vitro de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease, não tratado com protease e não-clivável por protease, como descrito no Exemplo 6.

[054] A FIG. 28 retrata os resultados do experimento para determinar a PK de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado e não tratado com protease, como descrito no Exemplo 9.

[055] A FIG. 29 mostra representações esquemáticas das configurações alternativas do terminal-N para o terminal-C de uma composição de ligação de célula T. A FIG. 29A mostra a configuração da porção de ligação da célula efetora (ECBM), seguida por segmento do sítio de liberação (RS) e XTEN, enquanto a FIG. 29B mostra a configuração de XTEN, seguida pelo segmento RS e depois ECBM.

[056] A FIG. 30 retrata os resultados do experimento para determinar a atividade in vitro de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease, não tratado com protease e não-clivável por protease em SK-OV-3, como descrito no Exemplo 6.

[057] A FIG. 31 retrata os resultados do volume tumoral do experimento para determinar o efeito antitumoral de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado e não tratado com protease, como descrito no Exemplo 10.

[058] A FIG. 32 retrata os resultados do peso corporal de um experimento para determinar o efeito antitumoral de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado e não tratado com protease, como descrito no Exemplo 10.

[059] A FIG. 33 retrata os resultados de um experimento para determinar o perfil de citocinas de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado e não tratado com protease, como descrito no Exemplo 12. A FIG. 33A mostra os resultados do ensaio para detectar IL-2 e a FIG. 33B mostra os resultados para detectar IL-4.

[060] A FIG. 34 retrata os resultados de um experimento para determinar o perfil de citocinas de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado e não tratado com protease, como descrito no Exemplo 12. A FIG. 34A mostra os resultados do ensaio para detectar IL-6 e a FIG. 34B mostra os resultados para detectar IL-10.

[061] A FIG. 35 retrata os resultados de um experimento para determinar o perfil de citocinas de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado e não tratado com protease, como descrito no Exemplo 12. A FIG. 35A mostra os resultados do ensaio para detectar IFN-gama e a FIG. 35B mostra os resultados para detectar TNF-alfa.

[062] A FIG. 36 retrata a seqüência de aminoácidos do segmento de liberação RSR-1517 e a localização dos três sítios de clivagem onde as proteases listadas são capazes de clivar o peptídeo.

[063] A FIG. 37 retrata os resultados de um ensaio de citotoxicidade contra huEp-CHO 4-12B que mede caspase 3/7 liberada em sobrenadantes de cultura, como descrito no Exemplo 55.

[064] A FIG. 38 retrata os resultados do volume do tumor de HCT-116 do experimento para determinar o efeito antitumoral de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3, ProTIA anti- EpCAM x anti-CD3 tratado com protease e ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não-clivável, como descrito no Exemplo 13.

[065] A FIG. 39 retrata os resultados do peso corporal do experimento para determinar o efeito anti-tumor de HCT- 116 de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3, ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease e ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não-clivável, como descrito no Exemplo 13.

[066] A FIG. 40 retrata os resultados do experimento para determinar a atividade in vitro de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease, não tratado com protease e não-clivável por protease em SK-OV-3 com células T humanas purificadas CD3-positivas, como descrito no Exemplo 14.

[067] A FIG. 41 retrata os resultados do experimento para determinar a atividade in vitro de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease, não tratado com protease e não-clivável por protease em OVCAR-3 com células T humanas purificadas CD3-positivas, como descrito no Exemplo 14.

[068] A FIG. 42 retrata os resultados do experimento para medir a ativação de CD69 em células CD8 e CD4 em cocultura de PBMC e células SK-OV-3 com ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease, não tratado com protease e não-clivável por protease, como descrito no Exemplo 8. A FIG. 42A retrata a ativação de CD69 em células CD8, enquanto a FIG. 42B retrata a ativação de CD69 em células CD4.

[069] A FIG. 43 retrata os resultados do experimento para medir a ativação tanto de CD69 quanto de CD25 em células CD8 e CD4 em cocultura de PBMC e células SK-OV-3 com ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease, não tratado com protease e não-clivável por protease, como descrito no Exemplo 8. A FIG. 43A retrata a ativação tanto de CD69 quanto de CD25 em células CD8, enquanto a FIG. 43B retrata a ativação tanto de CD69 quanto de CD25 em células CD4.

[070] A FIG. 44 retrata os resultados do experimento para medir a ativação de CD69 em células CD8 e CD4 em cocultura de células CD3+ purificadas e células SK-OV-3 com ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease, não tratado com protease e não-clivável por protease, como descrito no Exemplo 8. A FIG. 44A retrata a ativação de CD69 em células CD8, enquanto a FIG. 44B retrata a ativação de CD69 em células CD4.

[071] A FIG. 45 retrata os resultados do experimento para medir a ativação tanto de CD69 quanto de CD25 em células CD8 e CD4 em cocultura de células CD3+ purificadas e células SK-OV-3 com ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease, não tratado com protease e não-clivável por protease, como descrito no Exemplo 8. A FIG. 45A retrata a ativação tanto de CD69 quanto de CD25 em células CD8, enquanto a FIG. 45B retrata a ativação tanto de CD69 quanto de CD25 em células CD4.

[072] A FIG. 46 retrata os resultados do experimento para medir a ativação de CD69 em células CD8 e CD4 em cocultura de células CD3+ purificadas e células OVCAR3 com ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease, não tratado com protease e não-clivável por protease, como descrito no Exemplo 8. A FIG. 46A retrata a ativação de CD69 em células CD8, enquanto a FIG. 46B retrata a ativação de CD69 em células CD4.

[073] A FIG. 47 retrata os resultados do experimento para medir a ativação tanto de CD69 quanto de CD25 em células CD8 e CD4 em cocultura de células CD3+ purificadas e células OVCAR3 com ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease, não tratado com protease e não-clivável por protease, como descrito no Exemplo 8. A FIG. 47A retrata a ativação tanto de CD69 quanto de CD25 em células CD8, enquanto a FIG. 47B retrata a ativação tanto de CD69 quanto de CD25 em células CD4.

[074] A FIG. 48 retrata os resultados do experimento para medir a ativação de CD69 em células CD8 e CD4 em cocultura de PBMC e células OVCAR3 com ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease, não tratado com protease e não-clivável por protease, como descrito no Exemplo 8. A FIG. 48A retrata a ativação de CD69 em células CD8, enquanto a FIG. 48B retrata a ativação de CD69 em células CD4.

[075] A FIG. 49 retrata os resultados do experimento para medir a ativação tanto de CD69 quanto de granzima B em células CD8 e CD4 em cocultura de PBMC e células OVCAR3 com ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease, não tratado com protease e não-clivável por protease, como descrito no Exemplo 8. A FIG. 49A retrata a ativação tanto de CD69 quanto de granzima B em células CD8, enquanto a FIG. 49B retrata a ativação tanto de CD69 quanto de granzima B em células CD4.

[076] A FIG. 50 retrata os resultados do experimento para medir a liberação de citocinas IL-2 e IL-4 em cocultura de células CD3+ purificadas e células SK-OV-3 com ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease, não tratado com protease e não-clivável por protease, como descrito no Exemplo 15. A FIG. 50A retrata a concentração de IL-2 liberada, enquanto a FIG. 50B retrata a concentração de IL- 4 liberada.

[077] A FIG. 51 retrata os resultados do experimento para medir a liberação de citocinas IL-6 e IL-10 em cocultura de células CD3+ purificadas e células SK-OV-3 com ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease, não tratado com protease e não-clivável por protease, como descrito no Exemplo 15. A FIG. 51A retrata a concentração de IL-6 liberada, enquanto a FIG. 51B retrata a concentração de IL- 10 liberada.

[078] A FIG. 52 retrata os resultados do experimento para medir a liberação de citocinas TNF-alfa e IFN-gama em cocultura de células CD3+ purificadas e células SK-OV-3 com ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease, não tratado com protease e não-clivável por protease, como descrito no Exemplo 15. A FIG. 52A retrata a concentração de TNF-alfa liberado, enquanto a FIG. 52B retrata a concentração de IFN-gama liberado.

[079] A FIG. 53 mostra as curvas de ligação de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease, não tratado com protease e não-clivável para ligantes de CD3εδ, como descrito no Exemplo 16.

[080] A FIG. 54 mostra a especificidade de ligação de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease para o ligante de rhEpCAM, como descrito no Exemplo 17.

[081] A FIG. 55 retrata resultados do volume do tumor de SW480 do experimento para determinar o efeito antitumoral de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3, ProTIA anti-EpCAM x anti- CD3 tratado com protease e ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não- clivável, como descrito no Exemplo 18.

[082] A FIG. 56 retrata os resultados do peso corporal do experimento para determinar o efeito anti-tumor de SW480 de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3, ProTIA anti-EpCAM x anti- CD3 tratado com protease e ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não- clivável, como descrito no Exemplo 18.

[083] A FIG. 57 retrata os resultados do experimento para determinar a atividade in vitro de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease, não tratado com protease e não-clivável por protease em SKOV3 com PBMCs humanas, como descrito no Exemplo 23.

[084] A FIG. 58 retrata os resultados do experimento para determinar a atividade in vitro de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease, não tratado com protease e não-clivável por protease em OVCAR3 com PBMCs humanas, como descrito no Exemplo 23.

[085] A FIG. 59 retrata os resultados do experimento para determinar a atividade in vitro de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease, não tratado com protease e não-clivável por protease em HCT116 com PBMCs humanas, como descrito no Exemplo 23.

[086] A FIG. 60 retrata os resultados do experimento para determinar a atividade in vitro de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease, não tratado com protease e não-clivável por protease em SW480 com PBMCs humanas, como descrito no Exemplo 23.

[087] A FIG. 61 retrata os resultados do volume do tumor de HCT-116 do experimento para determinar o efeito antitumoral de ProTIAs anti-EpCAM x anti-CD3 tratados com protease, não tratados com protease e não-cliváveis, como descrito no Exemplo 25.

[088] A FIG. 62 retrata os níveis de CA125 humano no Grupo de controle 1 que abriga OVCAR-3 e PBMC, Grupo 8 que abriga somente PBMC e Grupo 9 que abriga somente OVCAR-3, como descrito no Exemplo 26.

[089] A FIG. 63 retrata os níveis de CA125 humano do experimento para determinar o efeito antitumoral de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease em dose baixa (Grupo 2), ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease (Grupo 4) e ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não- clivável (Grupo 6), como descrito no Exemplo 26.

[090] A FIG. 64 retrata os níveis de CA125 humano do experimento para determinar o efeito antitumoral de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease em dose alta (Grupo 3), ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease (Grupo 5) e ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não- clivável (Grupo 7), como descrito no Exemplo 26.

[091] A FIG. 65 retrata os níveis de CA125 humano do experimento para determinar o efeito antitumoral de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease administrado por via intraperitoneal versus por via intravenosa em camundongos que abrigam tumor de OVCAR-3, como descrito no

Exemplo 27.

[092] A FIG. 66 retrata o volume tumoral total do experimento para determinar o efeito antitumoral de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease administrado por via intraperitoneal versus por via intravenosa em camundongos que abrigam tumor de OVCAR-3, como descrito no Exemplo 27.

[093] A FIG. 67 retrata o volume tumoral total do experimento para determinar o efeito antitumoral de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease versus bevacizumab em camundongos que abrigam tumor de OVCAR-3, como descrito no Exemplo 27.

[094] A FIG. 68 retrata a ligação de variantes de anti- EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease para ligante de CD3-épsilon/delta, como descrito no Exemplo 28.

[095] A FIG. 69 retrata resultados farmacocinéticos (FIG. 69A) no plasma e (FIG. 69B) em ascite de ProTIAs anti- EpCAM x anti-CD3 tratados com protease, não tratados com protease e não-cliváveis administrados por via intravenosa, como descrito no Exemplo 30.

[096] A FIG. 70 retrata (FIG. 70A) plasma e (FIG. 70B) ascite resultados farmacocinéticos de ProTIAs anti-EpCAM x anti-CD3 tratados com protease, não tratados com protease e não-cliváveis administrados por via intraperitoneal, como descrito no Exemplo 30.

[097] As FIGS. 71A-F mostram os resultados de ensaios de citocina de amostras de uma avaliação de toxicidade in vivo das construções de ProTIA intacto, clivado e não- clivável, comparadas com uma construção configurada como um BiTE, como descrito no Exemplo 33.

[098] A FIG. 72 mostra os resultados de um experimento para determinar a dose máxima tolerada de um ProTIA intacto, comparado com a forma ativada, clivada, representados graficamente como uma curva de Kaplan-Meier, como descrito no Exemplo 34.

[099] As FIGS. 73A-F mostram os resultados de um experimento para determinar a dose máxima tolerada de um ProTIA intacto AC1553, comparado com a forma ativada, clivada, representados graficamente como peso corporal dos camundongos dosados ao longo do tempo, como descrito no Exemplo 34.

[100] A FIG. 74 mostra géis de SDS-PAGE da produção de variantes de segmento de liberação-XTEN, como descrito no Exemplo 41. A FIG. 74A é uma análise de titulação da expressão da variante de RS-XTEN. As FIGS. 74(B)-(D) mostram a purificação por IMAC em etapa única das variantes de RS- XTEN AC1602, AC1609, AC1610, AC1604, AC1608, AC1611, AC1612, AC1649, AC1650. A FIG. 74E é o gel da liberação de lote das variantes de RS-XTEN purificadas.

[101] A FIG. 75 mostra um gel de SDS-PAGE do perfil de clivagem de AC1611, quando submetido a sete proteases humanas implicadas no câncer, como descrito no Exemplo 42.

[102] A FIG. 76 mostra um gel de SDS-PAGE da digestão de uPA de variantes de RS-XTEN com AC1611 como a referência, como descrito no Exemplo 43.

[103] A FIG. 77 mostra os resultados de determinações do peso corporal nos grupos de veículo e de tratamento, como descrito no Exemplo 56.

[104] A FIG. 78 mostra os resultados de determinações do peso corporal no grupos de tratamento, como descrito no

Exemplo 57.

[105] A FIG. 79 mostra os resultados do volume tumoral em grupos de veículo e de tratamento, como descrito no Exemplo 60. A FIG. 79A mostra os resultados de animais dosados com 0,5 mg/kg e a FIG. 79B mostra os resultados de animais dosados com 0,1 mg/kg.

[106] A FIG. 80 mostra os resultados de ensaios de citotoxicidade celular redirecionada de composições de ProTIA anti-EGFR x anti-CD3 não tratado com protease, comparado com ProTIA anti-EGFR x anti-CD3 tratado com protease e não-clivável por protease, como descrito no Exemplo 61. A FIG. 80A mostra os resultados do ensaio de caspase 3/7 in vitro de AC1955 e AC1958 contra células HCT- 116 com PBMCs humanas. A FIG. 80B mostra os resultados do ensaio de caspase 3/7 in vitro de AC1955 e AC1958 contra células HT-29 com PBMCs humanas.

[107] A FIG. 81 mostra os resultados de ensaios de citotoxicidade celular redirecionada de composições de ProTIA anti-Her2 x anti-CD3 não tratado com protease AC2038 e AC2040, comparado com ProTIA anti-Her2 x anti-CD3 tratado com protease e não-clivável por protease AC2039), avaliada em um ensaio baseado em células in vitro de atividades de caspase 3/7 de células apoptóticas, como descrito no Exemplo

62. A FIG. 81A mostra os resultados com BT474 com PBMCs humanas. A FIG. 81B mostra os resultados com SK-OV-3 e PBMCs humanas. A FIG, 81C mostra os resultados com JIMT-1 com PBMCs humanas. FIG. 81D mostra os resultados com MDA-MB-231 com PBMCs humanas.

[108] A FIG. 82 mostra os resultados de experimentos in vivo para determinar o efeito antitumoral de ProTIA anti-

EGFR x anti-CD3 tratado com protease e não tratado com protease contra Cetuximab, como descrito no Exemplo 63. A FIG. 82A retrata os resultados do volume tumoral de animais com células tumorais HT-29. A FIG. 82B retrata os resultados do peso corporal de animais com células tumorais HT-29.

[109] A FIG. 83 mostra os resultados de experimentos in vivo para determinar o efeito antitumoral de ProTIA anti- EGFR x anti-CD3 tratado com protease e não tratado com protease em um modelo estabelecido de tumor de mama, como descrito no Exemplo 64. A FIG. 83A retrata os resultados do volume tumoral de animais com células tumorais BT-474. A FIG. 83B retrata os resultados do peso corporal de animais com células tumorais BT-474.

[110] A FIG. 84 mostra uma SDS-PAGE da análise de liberação de lote de substância farmacológica formulada, como descrito no Exemplo 46.

[111] A FIG. 85 mostra análises por HPLC de liberação de lote de substância farmacológica formulada, como descrito no Exemplo 46. A FIG. 85A mostra a análise por SE-HPLC e a FIG. 85B mostra a análise por HI-HPLC.

[112] A FIG. 86 mostra análises de liberação de lote de substância farmacológica formulada, como descrito no Exemplo 47. A FIG. 86A mostra uma SDS-PAGE da análise de liberação de lote de substância farmacológica formulada. A FIG. 86B mostra uma ESI-MS da análise de liberação de lote de substância farmacológica formulada.

[113] A FIG. 87 mostra análises por HPLC de liberação de lote de substância farmacológica formulada, como descrito no Exemplo 46. A FIG. 87A mostra a análise por SE-HPLC e a FIG. 87B mostra a análise por HI-HPLC.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[114] Antes da descrição das modalidades da revelação, deve ser subentendido que essas modalidades são fornecidas apenas como exemplo, e que várias alternativas às modalidades da revelação reveladas nesse relatório descritivo podem ser empregadas na prática de invenção. Diversas variações, alterações e substituições ocorrerão agora àqueles habilitados na técnica, sem se afastar da invenção.

[115] Salvo definição em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados nesse relatório descritivo possuem os mesmo significados comumente subentendidos por aqueles habilitados na técnica à qual essa invenção pertence. Embora métodos e materiais similar ou equivalentes àqueles descritos nesse relatório descritivo possam ser usados na prática ou testagem da presente invenção, métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Em caso de conflito, o relatório descritivo da patente, incluindo definições, prevalecerá. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos, e não visam ser limitantes. Diversas variações, alterações e substituições ocorrerão agora àqueles habilitados na técnica, sem se afastar da invenção. Definições

[116] No contexto do presente pedido, os termos seguintes possuem os significados atribuídos a eles, salvo especificação em contrário:

[117] Como usados ao longo do relatório descritivo e nas reivindicações, os termos “um”, “uma”, “o” e “a” são usados no sentido de que significam “pelo menos um”, “pelo menos um primeiro”, “um ou mais” ou “diversos” dos componentes ou etapas citados, exceto quando um limite superior é posteriormente especificamente estabelecido. Portanto, uma “seqüência de clivagem”, como usada nesse relatório descritivo, significa “pelo menos uma primeira seqüência de clivagem”, mas inclui diversas seqüências de clivagem. Os limites operáveis e parâmetros de combinações, por exemplo, as quantidades de qualquer agente único, serão conhecidos por aqueles habilitados na técnica à luz da presente revelação.

[118] Os termos “polipeptídeo”, “peptídeo” e “proteína” são usados de forma intercambiável nesse relatório descritivo para se referir aos polímeros de aminoácidos de qualquer comprimento. O polímero pode ser linear ou ramificado, ele pode compreender aminoácidos modificados, e ele pode ser interrompido por não aminoácidos. Os termos também englobam um polímero de aminoácido que foi modificado, por exemplo, por formação de ligação dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação, ou qualquer outra manipulação, por exemplo, conjugação com um componente de marcação.

[119] Como usados nesse relatório descritivo no contexto da estrutura de um polipeptídeo, “terminal-N” (ou “terminal amino”) e “terminal-C” (ou “terminal carboxil”) se referem às extremidades extremas amino e carboxil do polipeptídeo, respectivamente.

[120] O termo “monomérico”, como aplicado a um polipeptídeo, se refere ao estado do polipeptídeo como sendo uma única seqüência de aminoácidos contínua substancialmente não associada a um ou mais polipeptídeos adicionais da mesma seqüência ou de uma seqüência diferente. O estado monomérico do polipeptídeo pode ser verificado como uma entidade proteinácea única do mesmo peso molecular por cromatografia por exclusão de tamanho.

[121] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “aminoácido” se refere aos aminoácidos naturais e/ou não naturais ou sintéticos incluindo, sem limitação, os isômeros ópticos tanto D quanto L, e análogos de aminoácido e peptidomiméticos. Códigos padronizados de uma única letra ou de três letras podem ser usados para designar aminoácidos.

[122] O termo “L-aminoácido natural” ou “L-aminoácido” significa as formas L do isômero óptico de glicina (G), prolina (P), alanina (A), valina (V), leucina (L), isoleucina (I), metionina (M), cisteína (C), fenilalanina (F), tirosina (Y), triptofano (W), histidina (H), lisina (K), arginina (R), glutamina (Q), asparagina (N), ácido glutâmico (E), ácido aspártico (D), serina (S) e treonina (T).

[123] O termo “de ocorrência não natural”, como aplicado às seqüências e como usado nesse relatório descritivo, significa seqüências de polipeptídeos ou de polinucleotídeos que não possuem uma contraparte, não são complementares, ou não possuem um grau elevado de homologia com uma seqüência do tipo selvagem ou de ocorrência natural encontrada em um mamífero. Por exemplo, um polipeptídeo ou fragmento de ocorrência não natural pode compartilhar no máximo 99%, 98%, 95%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50% ou até menos de identidade de seqüência de aminoácidos, quando comparada com uma seqüência natural quando adequadamente alinhadas.

[124] Os termos “hidrofílico” e “hidrofóbico” se referem ao grau de afinidade que uma substância possui com água. Uma substância hidrofílica possui uma forte afinidade para água, tendendo a se dissolver, misturar ou ser umedecida por água, enquanto uma substância hidrofóbica substancialmente não possui afinidade para água, tendendo a repelir e não absorver água e tendendo a não se dissolver ou misturar ou ser umedecida por água. Aminoácidos podem ser caracterizados com base em sua hidrofobicidade. Foram desenvolvidas várias escalas. Um exemplo é uma escala desenvolvida por Levitt, M., e cols., J. Mol. Biol. (1976) 104: 59, que está listada em Hopp, T.P., e cols., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1981) 78: 3.824. Exemplos de “aminoácidos hidrofílicos” são arginina, lisina, treonina, alanina, asparagina e glutamina. De interesse particular são os aminoácidos hidrofílicos aspartato, glutamato, e serina, e glicina. Exemplos de “aminoácidos hidrofóbicos” são triptofano, tirosina, fenilalanina, metionina, leucina, isoleucina e valina.

[125] Um “fragmento”, quando aplicado a uma proteína biologicamente ativa (e não a um anticorpo), é uma forma truncada de uma proteína biologicamente ativa que retém pelo menos uma porção da atividade terapêutica e/ou biológica. O termo “variante”, quando aplicado a uma proteína biologicamente ativa, é uma proteína com homologia de seqüência para a proteína biologicamente ativa nativa que retém pelo menos uma porção da atividade terapêutica e/ou biológica da proteína biologicamente ativa. Por exemplo, uma proteína variante pode compartilhar pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de seqüência de aminoácidos, comparada com a proteína biologicamente ativa de referência. Como usado nesse relatório descritivo, o termo “variante da proteína biologicamente ativa” inclui proteínas modificadas deliberadamente como, por exemplo, por mutagênese sítio- dirigida, síntese do gene codificador, inserções, ou acidentalmente por meio de mutações e que retêm atividade.

[126] O termo “variante de seqüência” significa polipeptídeos que foram modificados, comparados com sua seqüência nativa ou original, por uma ou mais inserções, deleções ou substituições de aminoácidos. Inserções podem estar localizadas em um dos terminais, ou em ambos os terminais, da proteína, e/ou podem estar posicionadas dentro de regiões internas da seqüência de aminoácidos. Um exemplo não limitante é a substituição de um aminoácido em um XTEN com um aminoácido diferente. Em variantes de deleção, um ou mais resíduos de aminoácidos em um polipeptídeo como descrito nesse relatório descritivo são removidos. Variantes de deleção, portanto, incluem todos os fragmentos de uma seqüência polipeptídica descrita. Em variantes de substituição, um ou mais resíduos de aminoácidos de um polipeptídeo são removidos e substituídos com resíduos alternativos. Em um aspecto, as substituições têm natureza conservativa e substituições conservativas desse tipo são bem conhecidas na técnica. No contexto de um anticorpo ou de um polipeptídeo biologicamente ativo, uma variante de seqüência reteria pelo menos uma porção da afinidade de ligação ou da atividade biológica, respectivamente, do polipeptídeo não modificado.

[127] O termo “porção” significa um componente de uma composição maior ou que visa ser incorporado em uma composição maior, por exemplo, uma porção proteinácea unida a um polipeptídeo maior como uma seqüência contígua ou não contígua. Uma porção de uma composição maior pode conferir uma funcionalidade desejada. Por exemplo, um fragmento de anticorpo pode reter a habilidade para se ligar ao seu ligante, embora tenha um tamanho molecular menor e esteja em um formato de cadeia única. XTEN pode conferir a funcionalidade de aumento do peso molecular e/ou da meia- vida de uma composição maior resultante com a qual o XTEN está associado.

[128] O termo “segmento de liberação” ou “RS” se refere a um peptídeo com um ou mais sítios de clivagem na seqüência que podem ser reconhecidos e clivados por uma ou mais proteases. Como usado nesse relatório descritivo, o termo “protease de mamíferos” significa uma protease que normalmente existe nos fluidos corporais, células, tecidos, e pode ser encontrada em níveis mais elevados em certos tecidos- ou células-alvo, por exemplo, em tecidos doentes (por exemplo, tumor) de um mamífero. Seqüências de RS podem ser modificadas geneticamente para serem clivadas por várias proteases de mamíferos ou múltiplas proteases de mamíferos que estão presentes ou próximas a tecidos-alvo em um indivíduo, ou são introduzidas em um ensaio in vitro. Outras proteases equivalentes (endógenas ou exógenas) que são capazes de reconhecer um sítio de clivagem definido podem ser utilizadas. É especificamente contemplado que a seqüência de RS pode ser ajustada e customizada para a protease utilizada e pode incorporar aminoácidos ligantes para se unir a polipeptídeos adjacentes da composição; por exemplo, as porções de ligação e o XTEN.

[129] O termo “dentro”, quando se refere a um primeiro polipeptídeo que está sendo ligado a um segundo polipeptídeo, engloba a união ou fusão de um componente adicional que conecta o terminal-N do primeiro ou segundo polipeptídeo ao terminal-C do segundo ou primeiro polipeptídeo, respectivamente, bem como inserção do primeiro polipeptídeo na seqüência do segundo polipeptídeo. Por exemplo, quando um componente de RS está ligado “dentro” de um polipeptídeo recombinante, o RS pode estar ligado ao terminal-N, ao terminal-C, ou pode ser inserido entre quaisquer dois aminoácidos de um polipeptídeo XTEN.

[130] O termo “atividade”, como aplicado à forma (ou formas) de uma composição fornecida nesse relatório descritivo, se refere a uma ação ou efeito incluindo, sem limitação, ligação ao receptor, atividade antagonista, atividade agonista, uma resposta celular ou fisiológica, lise celular, morte celular, ou um efeito geralmente conhecido na técnica para o componente efetor da composição, seja ele medido por um ensaio in vitro, ex vivo ou in vivo ou um efeito clínico.

[131] O termo “célula efetora”, como usado nesse relatório descritivo, inclui quaisquer células eucarióticas capazes de conferir um efeito em uma célula-alvo. Por exemplo, um célula efetora pode induzir perda de integridade da membrana, picnose, cariorréxis, apoptose, lise e/ou morte de uma célula-alvo. Em outro exemplo, uma célula efetora pode induzir divisão, crescimento, diferenciação de uma célula-alvo ou, de algum outro modo, alterar a transdução de sinal de uma célula-alvo. Exemplos não limitantes de células efetoras incluem células plasmática, células T, células CD4, células CD8, células B, células killer induzidas por citocina (células CIK), mastócitos, células dendríticas, células T reguladoras (células TReg), células T helper, células mielóides, macrófagos e células NK.

[132] O termo “antígeno da célula efetora” se refere às moléculas expressas por uma célula efetora incluindo, sem limitação, moléculas da superfície celular como, por exemplo, proteínas, glicoproteínas ou lipoproteínas. Antígenos da célula efetora exemplares incluem proteínas do complexo CD3 ou do receptor de célula T (TCR), CD4, CD8, CD25, CD38, CD69, CD45RO, CD57, CD95, CD107 e CD154, bem como moléculas efetoras como, por exemplo, citocinas, em associação com, ligadas a, expressas dentro, ou expressas e liberadas por, uma célula efetora. Um antígeno da célula efetora pode servir como a contraparte de ligação de uma porção de ligação do polipeptídeo recombinante em questão. Exemplos não limitantes de antígenos da célula efetora aos quais a composição em questão pode se ligar incluem antígenos na superfície celular como, por exemplo, CD3, CD4, CD8, CD25, CD38, CD69, CD45RO, CD57, CD95, CD107 e CD154, bem como citocinas Th1 selecionadas de IL2, IL10, IL12, IFN-gama e TNF-alfa.

[133] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “ELISA” se refere a um ensaio imunoabsorvente ligado à enzima, como descrito nesse relatório descritivo ou como de outro modo conhecido na técnica.

[134] Uma “célula hospedeira” inclui uma célula individual ou cultura de células que pode ser ou foi uma receptora para os vetores em questão nos quais o ácido nucleico exógeno foi introduzido, por exemplo, aqueles descritos nesse relatório descritivo. Células hospedeiras incluem a prole de uma única célula hospedeira. A prole pode não ser necessariamente completamente idêntica (em morfologia ou em genômica do complemento de DNA total) à célula-mãe original em conseqüência de mutação natural, acidental ou deliberada. Uma célula hospedeira inclui células transfectadas in vivo com um vetor dessa revelação.

[135] O termo “isolado”, quando usado para descrever os vários polipeptídeos revelados nesse relatório descritivo, significa um polipeptídeo que foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente de seu ambiente natural ou de uma mistura mais complexa (por exemplo, durante purificação de proteína). Componentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais que tipicamente interfeririam com usos diagnósticos ou terapêuticos para o polipeptídeo, e podem incluir enzimas, hormônios, e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Como é evidente para aqueles habilitados na técnica, um polinucleotídeo, peptídeo, polipeptídeo, proteína, anticorpo de ocorrência não natural, ou fragmentos destes, não precisa de “isolamento” para distingui-lo de sua contraparte de ocorrência natural. Além disso, um polinucleotídeo, peptídeo, polipeptídeo, proteína, anticorpo “concentrado”, “separado” ou “diluído”, ou fragmentos destes, é distinguível de sua contraparte de ocorrência natural pelo fato de que a concentração ou número de moléculas por volume é geralmente maior do que aquele de sua contraparte de ocorrência natural. Em geral, um polipeptídeo feito por meio recombinante e expresso em uma célula hospedeira é considerado como sendo “isolado”.

[136] Um “ácido nucleico isolado” é uma molécula de ácido nucleico que é identificada e separada de pelo menos uma molécula de ácido nucleico contaminante com a qual está normalmente associado na fonte natural do ácido nucleico codificador de polipeptídeo. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico codificadora de polipeptídeo isolada é diferente na forma ou configuração na qual é encontrada na natureza. Moléculas de ácido nucleico codificadoras de polipeptídeo isoladas, portanto, são distinguíveis da molécula de ácido nucleico codificadora de polipeptídeo específica como ela existe em células naturais. No entanto, uma molécula de ácido nucleico codificadora de polipeptídeo isolada inclui moléculas de ácido nucleico codificadoras de polipeptídeo contidas em células que normalmente expressam o polipeptídeo em que, por exemplo, a molécula de ácido nucleico está em uma localização cromossômica ou extracromossômica diferente daquela de células naturais.

[137] Uma proteína ou polipeptídeo “quimérico” contém pelo menos um polipeptídeo de fusão que compreende pelo menos uma região em uma posição diferente na seqüência daquela que ocorre na natureza. As regiões podem existir normalmente em proteínas separadas e são reunidas juntas no polipeptídeo de fusão; ou elas podem normalmente existir na mesma proteína, mas são colocadas em um novo arranjo no polipeptídeo de fusão. Uma proteína quimérica pode ser criada, por exemplo, por síntese química, ou por criação e tradução recombinantemente de um polinucleotídeo no qual as regiões do peptídeo são codificadas no relacionamento desejado.

[138] Os termos “fundido” e “fusão” são usados de forma intercambiável nesse relatório descritivo, e se referem à união em conjunto de duas ou mais seqüências peptídicas ou polipeptídicas por meios recombinantes. Uma “proteína de fusão” ou “proteína quimérica” compreende uma primeira seqüência de aminoácidos ligada a uma segunda seqüência de aminoácidos com a qual não está naturalmente ligada na natureza.

[139] Os termos “não clivado” e “estado não clivado” são usados de forma intercambiável nesse relatório descritivo, e se referem a um polipeptídeo que não foi clivado ou digerido por uma protease, de modo que o polipeptídeo permanece intacto.

[140] O termo “XTENilado” é usado para significar um peptídeo ou polipeptídeo que foi modificado pela união ou fusão de um ou mais polipeptídeos XTEN (descritos, abaixo) ao peptídeo ou polipeptídeo, seja por meio recombinante ou união química cruzada.

[141] O termo “ligado operativamente” significa que as seqüências de DNA que estão sendo ligadas são contíguas, e em fase de leitura ou in frame. Uma “fusão in frame” se refere à união de dois ou mais quadros de leitura aberta (ORFs) para formar uma ORF contínua mais longa, de modo a manter o quadro de leitura correto das ORFs originais. Por exemplo, um promotor ou intensificador está ligado operativamente a uma seqüência codificadora para um polipeptídeo se ele afeta a transcrição da seqüência polipeptídica. Dessa forma, a proteína de fusão recombinante resultante é uma única proteína que contém dois ou mais segmentos que correspondem aos polipeptídeos codificados pelas ORFs originais (cujos segmentos não estão normalmente unidos dessa forma na natureza).

[142] Os termos “união cruzada” e “conjugação”, são usados de forma intercambiável nesse relatório descritivo, e se referem à união covalente de duas moléculas diferentes por uma reação química. A união cruzada pode ocorrer em uma ou mais reações químicas, como conhecido na técnica.

[143] No contexto de polipeptídeos, uma “seqüência linear” ou uma “seqüência” é uma ordem de aminoácidos em um polipeptídeo em uma direção do terminal amino para o carboxil (do terminal-N para o terminal-C) na qual resíduos vizinhos entre eles na seqüência são contíguos na estrutura primária do polipeptídeo. Uma “seqüência parcial” é uma seqüência linear de parte de um polipeptídeo que sabidamente compreende resíduos adicionais em uma ou ambas as direções.

[144] O termo “heteróloga” significa derivada de uma entidade genotipicamente distinta do resto da entidade com a qual ela está sendo comparada. Por exemplo, uma seqüência rica em glicina removida de sua seqüência codificadora nativa e ligada operativamente a uma seqüência codificadora diferente da seqüência nativa é uma seqüência rica em glicina heteróloga. O termo “heterólogo”, como aplicado a um polinucleotídeo, um polipeptídeo, significa que o polinucleotídeo ou polipeptídeo é derivado de uma entidade genotipicamente distinta daquela do resto da entidade com a qual está sendo comparada.

[145] Os termos “polinucleotídeos”, “ácidos nucleicos”, “nucleotídeos” e “oligonucleotídeos” são usados de forma intercambiável. Eles se referem aos nucleotídeos de qualquer comprimento, englobando um ácido nucleico singular, bem como ácidos nucleicos plurais, desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos, ou análogos destes. Polinucleotídeos podem ter qualquer estrutura tridimensãoal, e podem realizar qualquer função, conhecida ou desconhecida. A seguir, serão apresentados exemplos não limitantes de polinucleotídeos:

regiões codificadoras ou não codificadoras de um gene ou fragmento gênico, loci (lócus) definidos por análise de ligação, éxons, íntrons, RNA mensageiro (mRNA), RNA de transferência, RNA ribossomal, ribozimas, cDNA, polinucleotídeos recombinantes, polinucleotídeos ramificados, plasmídeos, vetores, DNA isolado de qualquer seqüência, RNA isolado de qualquer seqüência, sondas de ácido nucleico e iniciadores. Um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, por exemplo, nucleotídeos metilados e análogos de nucleotídeo. Se presente, modificações à estrutura do nucleotídeo podem ser transmitidas antes ou após a montagem do polímero. A seqüência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes não nucleotídicos. Um polinucleotídeo pode ser adicionalmente modificado após a polimerização, por exemplo, por conjugação com um componente de marcação.

[146] O termo “complemento de um polinucleotídeo” significa uma molécula de polinucleotídeo que possui uma seqüência de base complementar e orientação reversa, comparada com uma seqüência de referência, de modo que ela possa hibridizar com uma seqüência de referência com fidelidade completa.

[147] O termo “recombinante”, como aplicado a um polinucleotídeo, significa que o polinucleotídeo é o produto de várias combinações de etapas de recombinação que podem incluir etapas de clonagem, restrição e/ou ligação, e outros procedimentos que resultam na expressão de uma proteína recombinante em uma célula hospedeira.

[148] Os termos “gene” e “fragmento gênico” são usados de forma intercambiável nesse relatório descritivo. Eles se referem a um polinucleotídeo que contém pelo menos um quadro de leitura aberta que é capaz de codificar uma proteína particular após ser transcrito e traduzido. Um gene ou fragmento gênico pode ser genômico ou cDNA, desde que o polinucleotídeo contenha pelo menos um quadro de leitura aberta, que pode cobrir a região codificadora inteira ou um segmento desta. Um “gene de fusão” é um gene composto por pelo menos dois polinucleotídeos heterólogos que estão ligados juntos.

[149] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “região codificadora” ou “seqüência codificadora” é uma porção de polinucleotídeo que consiste em códons traduzíveis em aminoácidos. Embora um “códon de parada” (TAG, TGA ou TAA) tipicamente não seja traduzido em um aminoácido, ele pode ser considerado como sendo parte de uma região codificadora, mas quaisquer seqüências de flanqueamento, por exemplo, promotores, sítios de ligação ao ribossomo, terminadores da transcrição, íntrons, e semelhantes, não são parte de uma região codificadora. Os limites de uma região codificadora são tipicamente determinados por um códon de início no terminal 5’, que codifica o terminal amino do polipeptídeo resultante, e um códon de parada da tradução no terminal 3’, que codifica o terminal carboxil do polipeptídeo resultante. Duas ou mais regiões codificadoras da presente revelação podem estar presentes em uma única construção de polinucleotídeo, por exemplo, em um único vetor, ou em construções de polinucleotídeo separadas, por exemplo, em vetores separados (diferentes). Conseqüentemente, um único vetor pode conter apenas uma única região codificadora, ou compreender duas ou mais regiões codificadoras, por exemplo,

um único vetor pode codificar separadamente uma porção de ligação-A e uma porção de ligação-B, como descrito abaixo. Além disso, um vetor, polinucleotídeo ou ácido nucleico da revelação pode codificar regiões codificadoras heterólogas, fundidas ou não fundidas a um ácido nucleico que codifica uma porção de ligação da revelação. Regiões codificadoras heterólogas incluem, sem limitação, elementos ou motivos especializados, por exemplo, um peptídeo sinalizador secretor ou um domínio funcional heterólogo.

[150] O termo “a jusante” se refere a uma seqüência de nucleotídeos que está localizada 3’ a uma seqüência de nucleotídeos de referência. Em certas modalidades, seqüências de nucleotídeos a jusante estão relacionadas às seqüências que se seguem ao ponto de partida de transcrição. Por exemplo, o códon de iniciação da tradução de um gene está localizado a jusante do sítio de início de transcrição.

[151] O termo “a montante” se refere a uma seqüência de nucleotídeos que está localizada 5’ para uma seqüência de nucleotídeos de referência. Em certas modalidades, seqüências de nucleotídeos a montante estão relacionadas às seqüências que estão localizadas no lado 5’ de uma região codificadora ou ponto de partida da transcrição. Por exemplo, a maior parte dos promotores está localizada a montante do sítio de início da transcrição.

[152] Os termos “homologia” ou “homóloga” ou “identidade” se referem de forma intercambiável à similaridade de seqüência entre duas ou mais seqüências de polinucleotídeos ou entre duas ou mais seqüências polipeptídicas. Quando se utiliza um programa como, por exemplo, BestFit, para determinar a identidade, similaridade ou homologia de seqüência entre duas seqüências de aminoácidos diferentes, os ajustes padronizados podem ser usados, ou uma matriz de pontuação apropriada, por exemplo, blosum45 ou blosum80, pode ser selecionada para otimizar as pontuações de identidade, similaridade ou homologia. De preferência, polinucleotídeos que são homólogos são aqueles que hibridizam sob condições rigorosas como definidas nesse relatório descritivo e possuem pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente 95%, mais preferivelmente 97%, mais preferivelmente 98% e, ainda mais preferivelmente, 99% de identidade de seqüência, quando otimamente alinhadas, comparadas com aquelas seqüências. Polipeptídeos que são homólogos preferivelmente possuem identidades de seqüência que são pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 80%, ainda mais preferivelmente pelo menos 90%, ainda mais preferivelmente pelo menos 95-99% idênticas, quando otimamente alinhadas sobre seqüências de comprimento comparável.

[153] O termo “ligação”, como aplicado aos ácidos polinucléicos, se refere ao processo de formação de ligações fosfodiéster entre dois fragmentos de ácido nucleico ou genes, unindo-os juntos. Para ligar os fragmentos de DNA ou genes juntos, as extremidades do DNA devem ser compatíveis entre elas. Em alguns casos, as extremidades serão diretamente compatíveis após digestão por endonuclease. No entanto, pode ser necessário primeiro converter as extremidades escalonadas comumente produzidas após digestão por endonuclease para fazer com que as extremidades fiquem rombas para torná-las compatíveis para ligação.

[154] Os termos “condições rigorosas” ou “condições de hibridização rigorosas” incluem referência às condições sob as quais um polinucleotídeo hibridizará para sua seqüência- alvo, até um grau maior de forma detectável do que outras seqüências (por exemplo, pelo menos 2 vezes em relação ao nível de fundo). Geralmente, o rigor de hibridização é expresso, em parte, com referência à temperatura e concentração de sal sob as quais a etapa de lavagem é realizada.

Tipicamente, condições rigorosas serão aquelas nas quais a concentração de sal é menor do que cerca de 1,5 M de íon Na, tipicamente cerca de 0,01 a 1,0 M de concentração de íon Na (ou outros sais) em pH 7,0 a 8,3, e a temperatura é pelo menos cerca de 30°C, para polinucleotídeos curtos (por exemplo, 10 a 50 nucleotídeos), e pelo menos cerca de 60°C, para polinucleotídeos longos (por exemplo, maiores do que 50 nucleotídeos); por exemplo, “condições rigorosas” podem incluir hibridização em formamida 50%, 1 M de NaCl, SDS 1% a 37°C, e três lavagens por 15 min cada em 0,1 x SSC/SDS 1% a 60°C até 65°C.

Alternativamente, temperaturas de cerca de 65°C, 60°C, 55°C ou 42°C podem ser usadas.

A concentração de SSC pode ser variada de cerca de 0,1 a 2 x SSC, com SDS estando presente a cerca de 0,1%. Essas temperaturas de lavagem são tipicamente selecionadas para serem cerca de 5°C a 20°C menores do que o ponto de fusão térmica para a seqüência específica em uma força iônica e pH definidos.

A Tm é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) na qual 50% da seqüência-alvo hibridizam para uma sonda perfeitamente compatível.

Uma equação para o cálculo da Tm e condições para hibridização de ácido nucleico são bem conhecidas e podem ser encontradas em Sambrook, J. e cols., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 3ª Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. Tipicamente, reagentes de bloqueio são usados para bloquear hibridização não específica. Esses reagentes de bloqueio incluem, por exemplo, DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado a cerca de 100-200 µg/ml. Um solvente orgânico, por exemplo, formamida, em uma concentração de cerca de 35-50% v/v, também pode ser usado sob circunstâncias particulares, por exemplo, para hibridizações RNA:DNA. Variações úteis nessas condições de lavagem serão prontamente evidentes para aqueles habilitados na técnica.

[155] Os termos “percentual de identidade”, percentagem de identidade de seqüência” e “% de identidade”, como aplicados às seqüências de polinucleotídeos, se referem à percentagem de combinações de resíduo entre pelo menos duas seqüências de polinucleotídeos alinhadas usando um algoritmo padronizado. Esse algoritmo pode inserir, de forma padronizada e reprodutível, lacunas (gaps) nas seqüências que estão sendo comparadas a fim de otimizar o alinhamento entre duas seqüências e, portanto, obter uma comparação mais significativa das duas seqüências. O percentual de identidade pode ser medido ao longo do comprimento de uma seqüência de polinucleotídeos definida inteira, ou pode ser medido sobre um comprimento mais curto, por exemplo, ao longo do comprimento de um fragmento retirado de uma seqüência de polinucleotídeos definida maior, por exemplo, um fragmento de pelo menos 45, pelo menos 60, pelo menos 90, pelo menos 120, pelo menos 150, pelo menos 210 ou pelo menos 450 resíduos contíguos. Esses comprimentos são apenas exemplares, e subentende-se que qualquer comprimento de fragmento suportado pelas seqüências mostradas nesse relatório descritivo, nas tabelas, figuras ou Listagem de seqüências, possa ser usado para descrever um comprimento sobre o qual o percentual de identidade pode ser medido. A percentagem de identidade de seqüência é calculada por comparação de duas seqüências otimamente alinhadas sobre a janela de comparação, determinação do número de posições combinadas (nas quais resíduos idênticos ocorrem em ambas as seqüências polipeptídicas), divisão do número de posições combinadas pelo número total de posições na janela de comparação (ou seja, o tamanho da janela), e multiplicação do resultado por 100 para gerar uma percentagem de identidade de seqüência. Quando seqüências de comprimento diferente devem ser comparadas, a seqüência mais curta define o comprimento da janela de comparação. Substituições conservativas não são consideradas quando se calcula a identidade de seqüência.

[156] Os termos “percentual (%) de identidade de seqüência” e “percentual (%) de identidade”, com relação às seqüências polipeptídicas identificadas nesse relatório descritivo, são definidos como uma percentagem de resíduos de aminoácidos em uma seqüência interrogada que são idênticos aos resíduos de aminoácidos de uma segunda seqüência polipeptídica, de referência, de comprimento comparável, ou uma porção desta, após alinhamento das seqüências e introdução de lacunas, se necessário, para obter o percentual máximo de identidade de seqüência, e não considerando quaisquer substituições conservativas como parte da identidade de seqüência resultando, dessa forma, em alinhamento ótimo. O alinhamento, para fins de determinação do percentual de identidade de seqüência de aminoácidos, pode ser obtido de várias formas que fazem parte dos conhecimentos na técnica, por exemplo, com o uso de softwares de computador publicamente disponíveis como, por exemplo, os softwares BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Aqueles habilitados na técnica podem determinar parâmetros apropriados para medição de alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para obter alinhamento ótimo sobre o comprimento completo das seqüências que estão sendo comparadas. O percentual de identidade pode ser medido sobre o comprimento de uma seqüência polipeptídica definida inteira, ou pode ser medido sobre um comprimento mais curto, por exemplo, sobre o comprimento de um fragmento retirado de uma seqüência polipeptídica definida maior, por exemplo, um fragmento de pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 70 ou pelo menos 150 resíduos contíguos. Esses comprimentos são apenas exemplares, e subentende-se que qualquer comprimento de fragmento suportado pelas seqüências mostradas nesse relatório descritivo, nas tabelas, figuras ou Listagem de seqüências, possa ser usado para descrever um comprimento sobre o qual o percentual de identidade pode ser medido.

[157] O termo “repetitividade”, usado no contexto de seqüências de polinucleotídeos, se refere ao grau de homologia interna na seqüência como, por exemplo, a freqüência de seqüências de nucleotídeos idênticas de certo comprimento. A repetitividade pode ser medida, por exemplo, por análise da freqüência de seqüências idênticas.

[158] O termo “expressão”, como usado nesse relatório descritivo, se refere a um processo pelo qual um polinucleotídeo produz um produto gênico, por exemplo, um RNA ou um polipeptídeo. Ele inclui, sem limitação, transcrição do polinucleotídeo em RNA mensageiro (mRNA), RNA de transferência (tRNA), pequeno RNA hairpin (shRNA), pequeno RNA interferente (siRNA) ou qualquer outro produto de RNA, e a tradução de um mRNA em um polipeptídeo. A expressão produz um “produto gênico”. Como usado nesse relatório descritivo, um produto gênico pode ser um ácido nucleico, por exemplo, um RNA mensageiro produzido por transcrição de um gene, ou um polipeptídeo que é traduzido por um transcrito. Os produtos gênicos descritos nesse relatório descritivo ainda incluem ácidos nucleicos com modificações pós-transcrição, por exemplo, poliadenilação ou splicing, ou polipeptídeos com modificações pós-tradução, por exemplo, metilação, glicosilação, a adição de lipídeos, associação com outras subunidades de proteína, ou clivagem proteolítica.

[159] Os termos “vetor” ou “vetor de expressão” são usados de forma intercambiável e se referem a uma molécula de ácido nucleico, preferivelmente auto-replicante em um hospedeiro apropriado, que transfere uma molécula de ácido nucleico inserida em e/ou entre células hospedeiras. O termo inclui vetores que funcionam primariamente para inserção de DNA ou RNA em uma célula, replicação de vetores que funcionam primariamente para a replicação de DNA ou RNA, e vetores de expressão que funcionam para transcrição e/ou tradução do DNA ou RNA. Também estão incluídos vetores que fornecem mais de uma das funções acima. Um “vetor de expressão” é um polinucleotídeo que, quando introduzido em uma célula hospedeira apropriada, pode ser transcrito e traduzido em um polipeptídeo (ou polipeptídeos). Um “sistema de expressão” normalmente significa uma célula hospedeira adequada composta por um vetor de expressão que pode funcionar para gerar um produto de expressão desejado.

[160] O termo “resistência à degradação sérica”, como aplicado a um polipeptídeo, se refere à habilidade dos polipeptídeos para resistir à degradação no sangue ou componentes deste, que tipicamente envolve proteases no soro ou plasma. A resistência à degradação sérica pode ser medida por combinação da proteína com soro ou plasma humano (ou de camundongo, rato, cão, macaco, como apropriado), tipicamente por vários dias (por exemplo, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8, 16 dias), tipicamente a cerca de 37°C. As amostras para esses pontos do tempo podem ser processadas em um ensaio Western blot e a proteína é detectada com um anticorpo. O anticorpo pode ser um tag na proteína. Se a proteína mostra uma banda única no western, em que o tamanho da proteína é idêntico àquele da proteína injetada, então não ocorreu nenhuma degradação. Nesse método exemplar, o ponto do tempo no qual 50% da proteína são degradados, como avaliado por Western blots ou técnicas equivalentes, é a meia-vida de degradação sérica ou “meia-vida sérica” da proteína.

[161] Os termos “t1/2”, “meia-vida”, “meia-vida terminal”, “meia-vida de eliminação” e “meia-vida circulante” são usados de forma intercambiável nesse relatório descritivo e, como usados nesse relatório descritivo, significam a meia-vida terminal calculada como ln(2)/Kel. Kel é a constante da taxa de eliminação terminal calculada por regressão linear da porção linear terminal da curva concentração log vs. tempo. “Meia-vida” tipicamente se refere ao tempo necessário para que metade da quantidade de uma substância administrada depositada em um organismo vivo seja metabolizada ou eliminada por processos biológicos normais. Quando uma curva de depuração de certo polipeptídeo é construída em função do tempo, a curva é normalmente bifásica, com uma fase-α rápida e uma fase-beta mais longa. A meia-vida da fase-beta típica de um anticorpo humano em humanos é de 21 dias. A meia-vida pode ser medida com o uso de amostras sincronizadas de qualquer fluido corporal, mas é mais tipicamente medida em amostras de plasma.

[162] O termo “peso molecular” geralmente se refere à soma de pesos atômicos dos átomos constituintes em uma molécula. O peso molecular pode ser determinado teoricamente somando-se as massas atômicas dos átomos constituintes em uma molécula. Quando aplicado no contexto de um polipeptídeo, o peso molecular é calculado por adição, com base na composição de aminoácidos, do peso molecular de cada tipo de aminoácido na composição ou por estimativa da comparação com os padrões de peso molecular em um gel de eletroforese de SDS. O peso molecular calculado de uma molécula pode diferir do peso molecular aparente de uma molécula, que geralmente se refere ao peso molecular de uma molécula como determinado por uma ou mais técnicas analíticas. O “fator do peso molecular aparente” e “peso molecular aparente” são termos relacionados e, quando usados no contexto de um polipeptídeo, os termos se referem a uma medida do aumento ou diminuição relativo no peso molecular aparente exibido por uma seqüência de aminoácidos ou polipeptídica particular. O peso molecular aparente pode ser determinado, por exemplo, com o uso de cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) ou métodos similares por comparação com padrões de proteína globular, medido em unidades de “kD aparente”. O fator do peso molecular aparente é a proporção entre o peso molecular aparente e o “peso molecular”; esse último é calculado por adição, com base na composição de aminoácidos como descrito acima, ou por estimativa da comparação com os padrões de peso molecular em um gel de eletroforese de SDS. A determinação do peso molecular aparente e do fator do peso molecular aparente é descrita in Patente U.S. Número

8.673.860.

[163] Os termos “raio hidrodinâmico” ou “raio de Stokes” consiste no raio efetivo (Rh em nm) de uma molécula em uma solução medido presumindo-se que ela seja um corpo se movendo através da solução e resistida pela viscosidade da solução. Nas modalidades da revelação, as medições do raio hidrodinâmico do polipeptídeos XTEN se correlacionam com o “fator do peso molecular aparente”, que é uma medida mais intuitiva. O “raio hidrodinâmico” de uma proteína afeta sua taxa de difusão em solução aquosa, bem como sua habilidade para migrar em géis de macromoléculas. O raio hidrodinâmico de uma proteína é determinado por seu peso molecular, bem como por sua estrutura, incluindo formato e compactação. Métodos para determinação do raio hidrodinâmico são bem conhecidos na técnica, por exemplo, pelo uso de cromatografia por exclusão de tamanho (SEC), como descrito nas Patentes U.S. Nos 6.406.632 e 7.294.513. A maioria das proteínas possui estrutura globular, que é a estrutura tridimensãoal mais compacta que uma proteína pode ter, com o menor raio hidrodinâmico. Algumas proteínas adotam uma conformação aleatória e aberta, não estruturada ou ‘linear’ e, como resultado, possuem um raio hidrodinâmico bem maior, comparadas com as proteínas globulares típicas de peso molecular similar.

[164] O termo “coeficiente de difusão” significa a magnitude do fluxo molar através de uma superfície por gradiente de concentração unitário fora do plano. No transporte de espécies diluídas, o fluxo decorrente da difusão é dado pela primeira lei de Fick, que só depende de uma única propriedade da interação do soluto com o solvente: o coeficiente de difusão.

[165] O termo “condições fisiológicas” se refere a um conjunto de condições em um hospedeiro vivo, bem como condições in vitro, incluindo temperatura, concentração de sal, pH, que simulam aquelas condições de um indivíduo vivo. Um hospedeiro de condições fisiologicamente relevantes para uso em ensaios in vitro foi estabelecido. Geralmente, um tampão fisiológico contém uma concentração fisiológica de sal e é ajustado até um pH neutro que varia de cerca de 6,5 até cerca de 7,8 e, preferivelmente, de cerca de 7,0 até cerca de 7,5. Diversos tampões fisiológicos estão listados em Sambrook e cols. (2001). Faixas de temperatura fisiologicamente relevantes de cerca de 25°C até cerca de 38°C e, preferivelmente, de cerca de 35°C até cerca de 37°C.

[166] O termo “porção de ligação” é usado nesse relatório descritivo no sentido mais amplo, e visa especificamente incluir as categorias de citocinas, receptores celulares, anticorpos ou fragmentos de anticorpo que possuem afinidade específica para um antígeno ou ligante como, por exemplo, receptores da superfície celular, marcadores de célula-alvo, ou antígenos ou glicoproteínas,

oligonucleotídeos, substratos enzimáticos, determinantes antigênicos, ou sítios de ligação que podem estar presentes dentro ou na superfície de um tecido ou célula.

[167] O termo “anticorpo” é usado nesse relatório descritivo no sentido mais amplo e engloba várias estruturas de anticorpo incluindo, sem limitação, anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), e fragmentos de anticorpo, desde que exibam a atividade de ligação ao antígeno desejada. Os anticorpos de comprimento total podem ser, por exemplo, anticorpos monoclonais, recombinantes, quiméricos, desimunizados, humanizados e humanos.

[168] O termo “anticorpo monoclonal”, como usado nesse relatório descritivo, se refere a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos e/ou se ligam ao mesmo epitopo, exceto para anticorpos variantes possíveis, por exemplo, que contêm mutações de ocorrência natural ou que surgem durante a produção de uma preparação de anticorpo monoclonal, essas variantes geralmente estando presentes em quantidades menores. Em contraste com preparações de anticorpo policlonal, que tipicamente incluem anticorpos diferentes dirigidos contra determinantes (epitopos) diferentes, cada anticorpo monoclonal de um preparação de anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante em um antígeno. Dessa forma, o modificador “monoclonal” indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser considerado como necessitando da produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a presente invenção podem ser feitos por diversas técnicas incluindo, sem limitação, o método de hibridoma, métodos de DNA recombinante, métodos de apresentação em fago, e métodos que utilizam animais transgênicos que contêm todos ou parte dos loci de imunoglobulina humana, com esses métodos e outros métodos exemplares para a produção de anticorpos monoclonais sendo conhecidos na técnica ou descritos nesse relatório descritivo.

[169] O termo “fragmento de anticorpo” se refere a uma molécula diferente de um anticorpo intacto que compreende uma porção de um anticorpo intacto e que se liga ao antígeno ao qual o anticorpo intacto se liga. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, sem limitação, Fv, Fab, Fab′, Fab′-SH, F(ab′)2, diabodies, diabodies de cadeia única, anticorpos lineares, um anticorpo de domínio único, um anticorpo de domínio único de camelídeo, moléculas de anticorpo de fragmento variável de cadeia única (scFv), e anticorpos multiespecíficos formados por fragmentos de anticorpo.

[170] Os termos “scFv” ou “fragmento variável de cadeia única” são usados de forma intercambiável nesse relatório descritivo para se referir a um formato de fragmento de anticorpo que compreende regiões de cadeias variáveis pesadas (“VH”) e variáveis leves (“VL”) ou duas cópias de uma cadeia VH ou VL, que são unidas juntas por um ligante peptídico flexível curto. O scFv não é verdadeiramente um fragmento de um anticorpo, mas sim uma proteína de fusão das regiões variáveis das cadeias pesadas

(VH) e leves (VL) de imunoglobulinas, e pode ser facilmente expresso em forma funcional em E. coli na orientação do terminal-N- para o terminal-C; VL-VH ou VH-VL.

[171] Os termos “antígeno”, “marcador de célula-alvo” e “ligante” são usados de forma intercambiável nesse relatório descritivo para se referir à estrutura ou determinante de ligação ao qual uma porção de ligação, um anticorpo, fragmento de anticorpo ou um molécula baseada em fragmento de anticorpo se liga ou contra o qual possui especificidade de ligação.

[172] O termo “epitopo” se refere ao sítio particular em uma molécula de antígeno ao qual um anticorpo, fragmento de anticorpo ou porção de ligação se liga. Um epitopo é um ligante de um anticorpo, fragmento de anticorpo ou uma porção de ligação.

[173] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “CD3” ou “agrupamento de diferenciação 3” significa o complexo CD3 de antígeno de superfície de célula T, que inclui, em forma individual ou em forma combinada independentemente, todas as subunidades de CD3 conhecidas, por exemplo, CD3 épsilon, CD3 delta, CD3 gama, CD3 zeta, CD3 alfa e CD3 beta. Os domínios extracelulares de CD3 épsilon, gama e delta contêm um domínio do tipo imunoglobulina e, portanto, são considerados parte da superfamília da imunoglobulina.

[174] Os termos “ligação específica” ou “se liga especificamente” ou “especificidade de ligação” são usados de forma intercambiável nesse relatório descritivo para se referir ao grau elevado de afinidade de ligação de uma porção de ligação para seu alvo correspondente. Tipicamente, a ligação específica como medida por um ou mais dos ensaios revelados nesse relatório descritivo teria uma constante de dissociação ou Kd de menos do que cerca de 10-6 M; por exemplo, 10-7 M - 10-12 M.

[175] O termo “afinidade” se refere à potência da soma total de interações não covalentes entre um único sítio de ligação de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). Salvo indicação em contrário, como usada nesse relatório descritivo, “afinidade de ligação” se refere à afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação 1:1 entre membros de um par de ligação (por exemplo, anticorpo e antígeno). A afinidade de uma molécula X por seu parceiro Y pode geralmente ser representada pela constante de dissociação (Kd). Como usado nesse relatório descritivo, o termo “uma afinidade de ligação maior” ou “afinidade de ligação aumentada” significa um valor Kd menor; por exemplo, 1 x 10-9 M é uma afinidade de ligação maior do que 1 x 10-8 M, enquanto uma “afinidade de ligação menor” significa um valor Kd menor; por exemplo, 1 x 10-7 M é uma afinidade de ligação menor do que 1 x 10-8 M.

[176] O termo “constante de inibição”, ou “Ki”, são usados de forma intercambiável e significam a constante de dissociação do complexo enzima-inibidor, ou a recíproca da afinidade de ligação do inibidor para a enzima.

[177] O termo “constante de dissociação”, ou “Kd”, são usados de forma intercambiável e significam a afinidade entre um ligante “L” e uma proteína “P”; ou seja, quão firmemente um ligante se liga a uma proteína em particular. Ela pode ser calculada usando a fórmula Kd = [L][P]/[LP], em que [P],

[L] e [LP] representam concentrações molares da proteína, ligante e complexo, respectivamente. O termo “kon”, como usado nesse relatório descritivo, visa se referir à constante da taxa on para associação de um anticorpo ao antígeno para formar o complexo antígeno/anticorpo, como é conhecido na técnica. O termo “koff”, como usado nesse relatório descritivo, visa se referir à constante da taxa off para dissociação de um anticorpo do complexo antígeno/anticorpo, como é conhecido na técnica. Técnicas como, por exemplo, citometria de fluxo ou ressonância de plásmon de superfície, podem ser usadas para detectar eventos de ligação. Os ensaios podem compreender moléculas de antígenos solúveis ou receptor, ou podem determinar a ligação aos receptores expressos pela célula. Esses ensaios podem incluir ensaios baseados em células, incluindo ensaios para proliferação celular, morte celular, apoptose e migração celular. A afinidade de ligação das composições em questão para os ligantes-alvo pode ser avaliada com o uso de ensaios de ligação ou de ligação competitiva, por exemplo, ensaios Biacore com receptores ou proteínas de ligação ligados a um chip, ou ensaios ELISA, como descritos na Patente U.S.

5.534.617, ensaios descritos nos Exemplos nesse relatório descritivo, ensaios radio-receptor, ou outros ensaios conhecidos na técnica. A constante da afinidade de ligação pode então ser determinada com o uso de métodos padronizados, por exemplo, análise de Scatchard, como descrito por van Zoelen, e cols., Trends Pharmacol. Sciences (1998) 19 (12): 487, ou outros métodos conhecidos na técnica.

[178] O termo “antagonista”, como usado nesse relatório descritivo, inclui qualquer molécula que bloqueia,

inibe ou neutraliza parcialmente ou totalmente uma atividade biológica de um polipeptídeo nativo revelado nesse relatório descritivo. Métodos para a identificação de antagonistas de um polipeptídeo podem compreender o contato de um polipeptídeo nativo com uma molécula antagonista candidata e medição de uma alteração detectável em uma ou mais atividades biológicas normalmente associadas ao polipeptídeo nativo. No contexto da presente revelação, antagonistas podem incluir proteínas, ácidos nucleicos, carboidratos, anticorpos ou quaisquer outras moléculas que diminuem o efeito de uma proteína biologicamente ativa.

[179] O termo “marcador de célula-alvo” se refere a uma molécula expressa por uma célula-alvo incluindo, sem limitação, receptores da superfície celular, receptores de citocina, antígenos, antígenos associados a tumores, glicoproteínas, oligonucleotídeos, substratos enzimáticos, determinantes antigênicos, ou sítios de ligação que possam estar presentes na superfície de um tecido ou célula-alvo que possam servir como ligantes para uma porção de ligação. Exemplos não limitantes de marcadores de célula-alvo incluem os marcadores-alvo da Tabela 5.

[180] O termo “tecido-alvo” se refere a um tecido que é a causa ou é parte de uma condição de doença como, por exemplo, sem limitação, câncer ou condições inflamatórias. Fontes de tecido-alvo doente incluem um órgão do corpo, um tumor, uma célula cancerosa ou população de células cancerosas ou células que formam uma matriz ou são encontradas em associação com uma população de células cancerosas, osso, pele, células que produzem citocinas ou fatores que contribuem para uma condição de doença.

[181] O termo “meio definido” se refere a um meio que compreende os requisitos nutricionais e hormonais necessárias à sobrevida e/ou crescimento das células em cultura, de tal modo que os componentes do meio são conhecidos. Tradicionalmente, o meio definido foi formulado pela adição de fatores nutricionais e de crescimento necessários ao crescimento e/ou sobrevida. Tipicamente, o meio definido fornece pelo menos um componente de uma ou mais das seguintes categorias: a) todos os aminoácidos essenciais e, normalmente, o conjunto básico de vinte aminoácidos mais cisteína; b) uma fonte de energia, normalmente na forma de um carboidrato, por exemplo, glicose; c) vitaminas e/ou outros compostos orgânicos necessários em concentrações baixas; d) ácidos graxos livres; e e) elementos-traço, em que elementos-traço são definidos como compostos inorgânicos ou elementos de ocorrência natural que são tipicamente necessários em concentrações muito baixas, normalmente na faixa micromolar. O meio definido também pode ser opcionalmente suplementado com um ou mais componentes de qualquer uma das seguintes categorias: a) um ou mais agentes mitogênicos; b) sais e tampões como, por exemplo, cálcio, magnésio e fosfato; c) nucleosídeos e bases como, por exemplo, adenosina e timidina, hipoxantina; e d) hidrolisados de proteína e de tecido.

[182] O termo “agonista” é usado no sentido mais amplo e inclui qualquer molécula que imite uma atividade biológica de um polipeptídeo nativo revelado nesse relatório descritivo. Moléculas agonistas adequadas especificamente incluem anticorpos agonistas ou fragmentos de anticorpo agonista, fragmentos ou variantes de seqüência de aminoácidos de polipeptídeos nativos, peptídeos, pequenas moléculas orgânicas etc. Métodos para a identificação de agonistas de um polipeptídeo nativo podem compreender o contato de um polipeptídeo nativo com uma molécula agonista candidata e medição de uma alteração detectável em uma ou mais atividades biológicas normalmente associadas ao polipeptídeo nativo.

[183] Como usados nesse relatório descritivo, os termos “tratamento” ou “que trata”, ou “paliativo” ou “melhora” são usados de forma intercambiável nesse relatório descritivo. Esses termos se referem a uma abordagem para obtenção de resultado benéfico ou desejado incluindo, sem limitação, um benefício terapêutico e/ou um benefício profilático. Por benefício terapêutico entende-se erradicação ou melhora do distúrbio subjacente que está sendo tratado. Além disso, um benefício terapêutico é obtido com a erradicação ou melhora de um ou mais dos sintomas fisiológicos ou melhora em um ou mais parâmetros clínicos associados ao distúrbio subjacente, de tal modo que seja observada uma melhora no indivíduo, apesar de o indivíduo ainda sofrer do distúrbio subjacente. Para benefício profilático, as composições podem ser administradas a um indivíduo em risco para o desenvolvimento de uma doença particular, ou a um indivíduo que relata um ou mais dos sintomas fisiológicos de uma doença, embora um diagnóstico dessa doença possa não ter sido feito.

[184] Os termos “efeito terapêutico” ou “benefício terapêutico”, como usados nesse relatório descritivo, se referem a um efeito fisiológico incluindo, sem limitação, a atenuação, melhora ou prevenção da doença ou uma melhora em um ou mais parâmetros clínicos associados ao distúrbio subjacente em humanos ou outros animais, ou para, de algum outro modo, aumentar o bem-estar físico ou mental de humanos ou animais, resultante da administração de um polipeptídeo da revelação, diferente da habilidade para induzir a produção de um anticorpo contra um epitopo antigênico possuída pela proteína biologicamente ativa. Para benefício profilático, as composições podem ser administradas a um indivíduo em risco para o desenvolvimento de uma doença particular, uma recorrência de uma doença, condição ou sintoma prévio da doença, ou a um indivíduo que relata um ou mais dos sintomas fisiológicos de uma doença, embora um diagnóstico dessa doença possa não ter sido feito.

[185] Os termos “quantidade terapeuticamente eficaz” e “dose terapeuticamente eficaz”, como usados nesse relatório descritivo, se referem a uma quantidade de um fármaco ou de uma proteína biologicamente ativa, isoladamente ou como uma parte de uma composição de polipeptídeo, que é capaz de ter qualquer efeito benéfico, detectável, sobre qualquer sintoma, aspecto, parâmetro medido ou características de um estado ou condição de doença quando administrada em uma dose ou doses repetidas a um indivíduo. Esse efeito não precisa ser absoluto para ser benéfico. A determinação de uma quantidade terapeuticamente eficaz faz parte dos conhecimentos daqueles habilitados na técnica, especialmente à luz da revelação detalhada fornecida nesse relatório descritivo.

[186] O termo “dose molar equivalente” significa que as quantidades de materiais administradas a um indivíduo possuem uma quantidade equivalente de moles, com base no peso molecular do material usado na dose.

[187] Os termos “dose terapeuticamente eficaz” e “dose atóxica”, como usados nesse relatório descritivo, se referem a uma dose tolerável das composições, como definida nesse relatório descritivo, que é suficientemente alta para causar depleção de células tumorais ou de câncer, eliminação do tumor, redução da massa tumoral ou estabilização da doença sem ou basicamente sem efeitos tóxicos importantes no indivíduo. Essas doses terapeuticamente eficazes e atóxicas podem ser determinadas por estudos de escalonamento de dose descritos na técnica e deve estar abaixo da dose que induz efeitos colaterais adversos severos.

[188] O termo “regime de dose”, como usado nesse relatório descritivo, se refere a uma posologia para várias doses administradas consecutivamente (ou seja, pelo menos duas ou mais) de uma composição, em que as doses são dadas em quantidades terapeuticamente eficazes para resultar em efeito benéfico sustentado sobre qualquer sintoma, aspecto, parâmetro medido, desfecho ou característica de um estado ou condição de doença.

[189] Os termos “câncer” e “cancerosa” se referem ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada por crescimento/proliferação celular desregulado. Exemplos de câncer incluem, sem limitação, carcinomas, linfoma de Hodgkin, linfoma não- Hodgkin, linfoma de célula B, linfoma de célula T, linfoma folicular, linfoma de célula do manto, blastoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer de próstata, câncer de cabeça e pescoço, qualquer forma de câncer de pele, melanoma, câncer do trato geniturinário, câncer ovariano, câncer ovariano com ascite maligna, carcinomatose peritoneal, carcinoma seroso uterino, câncer endometrial, câncer cervical, câncer cólon- retal, uma malignidade intraperitoneal dos epitélios com ascite maligna, câncer uterino, mesotelioma no peritônio, cânceres renais, câncer de pulmão, câncer de pulmão de pequena célula, câncer de pulmão de célula não-pequena, câncer gástrico, câncer esofágico, câncer do estômago, câncer do intestino delgado, câncer do fígado, hepatocarcinoma, hepatoblastoma, lipossarcoma, câncer pancreático, câncer da vesícula biliar, cânceres do ducto biliar, carcinoma da glândula salivar, câncer da tireóide, câncer epitelial, adenocarcinoma, sarcomas de qualquer origem, malignidades hematológicas primárias, incluindo leucemias linfocíticas agudas ou crônicas, leucemias mielógenas agudas ou crônicas, distúrbios neoplásicos mieloproliferativos, ou distúrbios mielodisplásicos, miastenia grave, doença de Graves, tireoidite de Hashimoto ou síndrome de Goodpasture.

[190] O termo “marcador específico para tumores”, como usado nesse relatório descritivo, se refere a um antígeno que é encontrado sobre ou em uma célula de câncer.

[191] O termo “célula-alvo” se refere a uma célula que possui o ligante de uma porção de ligação, um anticorpo ou fragmento de anticorpo das composições em questão e está associada ou causa uma doença ou condição patológica, incluindo células de câncer, células tumorais e células inflamatórias. O ligante de uma célula-alvo é referido nesse relatório descritivo como um “marcador de célula-alvo” ou “antígeno de célula-alvo” e inclui, sem limitação, receptores ou antígenos da superfície celular, citocinas,

receptores de citocina, proteínas MHC e proteínas ou peptídeos do citosol que são apresentados exogenamente. Como usado nesse relatório descritivo, o termo “célula-alvo” não incluiria uma célula efetora. I. TÉCNICAS GERAIS

[192] A prática da presente revelação emprega, salvo indicação em contrário, técnicas convencionais de imunologia, bioquímica, química, biologia molecular, microbiologia, biologia celular, genômica e DNA recombinante, que fazem parte dos conhecimentos da técnica. Veja Sambrook, J. e cols., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 3ª Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001; “Current Protocols in Molecular Biology”, F.M. Ausubel, e cols. eds., 1987; a série “Methods in Enzymology”, Academic Press, San Diego, CA.; “PCR 2: a Practical Approach”, M.J. MacPherson, B.D. Hames e G.R. Taylor eds., Oxford University Press, 1995; “Antibodies, a Laboratory Manual” Harlow, E. e Lane, D. eds., Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; “Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics”, 11ª Edição, McGraw-Hill, 2005; e Freshney, R.I., “Culture de Animal Cells: A Manual of Basic Technique”, 4ª Edição, John Wiley & Sons, Somerset, NJ, 2000, cujos conteúdos são incorporados em sua totalidade nesse relatório descritivo por referência.

[193] Células hospedeiras podem ser cultivadas em diversos meios. Meios comercialmente disponíveis como, por exemplo, F10 de Ham (Sigma), Meio Essencial Mínimo (MEM, Sigma), RPMI-1640 (Sigma) e Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma) são adequados para o cultivo de células eucarióticas. Além disso, células hospedeiras animais podem ser desenvolvidas em um meio definido desprovido de soro, mas é suplementado com hormônios, fatores de crescimento ou quaisquer outros fatores necessários para a sobrevida e/ou crescimento de um tipo de célula particular.

Enquanto um meio definido que dá suporte a sobrevida da célula mantém a viabilidade, morfologia, capacidade para metabolizar e, potencialmente, capacidade da célula para se diferenciar, um meio definido que promove o crescimento celular fornece todas as substâncias químicas necessárias para a proliferação ou multiplicação da célula.

Os parâmetros gerais que governam a sobrevida e crescimento da célula hospedeira in vitro são bem estabelecidos na técnica.

Parâmetros físico-químicos que podem ser controlados em diferentes sistemas de cultura de células são, por exemplo, pH, pO2, temperatura e osmolaridade.

Os requisitos nutricionais das células são normalmente fornecidos em formulações de meios padronizadas desenvolvidas para fornecer um ambiente ótimo.

Os nutrientes podem ser divididos em várias categorias: aminoácidos e seus derivados, carboidratos, açúcares, ácidos graxos, lipídeos complexos, derivados de ácido nucleico e vitaminas.

Com exceção dos nutrientes para manutenção do metabolismo da célula, a maioria das células também necessita de um ou mais hormônios de pelo menos um dos seguintes grupos: esteróides, prostaglandinas, fatores de crescimento, hormônios da hipófise e hormônios peptídicos para proliferar em meios isentos de soro (Sato, G.

H., e cols. em “Growth of Cells in Hormonally Defined Media”, Cold Spring Harbor Press, N.Y., 1982). Além de hormônios, as células podem necessitar de proteínas de transporte como, por exemplo, transferrina

(proteína plasmática de transporte de ferro), ceruloplasmina (uma proteína de transporte de cobre) e lipoproteína de alta densidade (um carreador de lipídeo) para sobrevida e crescimento in vitro. O conjunto de hormônios ou proteínas de transporte ótimas irá variar para cada tipo de célula. A maioria desses hormônios ou proteínas de transporte foi adicionada exogenamente ou, em um caso raro, foi encontrada uma linhagem de células mutantes que não necessita de um fator particular. Aqueles habilitados na técnica saberão de outros fatores necessários para a manutenção de uma cultura de células sem experimentação desnecessária.

[194] Os meios de crescimento para o crescimento de células hospedeiras procarióticas incluem caldos nutrientes (meio nutriente líquido) ou meio LB (Luria Bertani). Meios adequados incluem meios definidos e não definidos. Em geral, os meios contêm uma fonte de carbono como, por exemplo, glicose, necessária para o crescimento bacteriano, água e sais. Os meios também podem incluir uma fonte de aminoácidos e nitrogênio, por exemplo, carne bovina ou extrato de levedura (em um meio não definido) ou quantidades conhecidas de aminoácidos (em um meio definido). Em algumas modalidades, o meio de crescimento é caldo LB, por exemplo, caldo LB de Miller ou caldo LB de Lennox. O caldo LB compreende peptona (produto da digestão enzimática de caseína), extrato de levedura e cloreto de sódio. Em algumas modalidades, é usado um meio seletivo que compreende um antibiótico. Nesse meio, só crescerão células desejadas que possuem resistência ao antibiótico. II. POLIPEPTÍDEOS RECOMBINANTES E COMPOSIÇÕES DE

ANTICORPO ATIVÁVEL

[195] A presente revelação fornece polipeptídeos recombinantes que compreendem pelo menos três categorias de componentes; porções de ligação, segmentos de liberação (RS) e porções volumosas; cada uma das quais é descrita mais detalhadamente nesse relatório descritivo. A revelação também fornece configurações de polipeptídeos recombinantes que são projetadas especificamente para conferir propriedades farmacêuticas e terapêuticas vantajosas às composições, em comparação com terapêuticas à base de anticorpo e de citocina convencionais.

[196] Em um primeiro aspecto, a revelação fornece composições de polipeptídeo recombinante que possuem uma primeira porção de ligação (FBM) projetada para se ligar a um ligante-alvo, um segmento de liberação que é um substrato para uma protease de mamífero, e uma porção volumosa como, por exemplo, um XTEN, em que a FBM é um anticorpo, uma citocina, um receptor celular, ou um fragmento destes. Os polipeptídeos recombinantes que compreendem uma única porção de ligação podem ser projetados para conferir uma propriedade de pró-fármaco à composição a fim de torná-la menos reativa quando na circulação ou quando exposta aos tecidos saudáveis, mas, quando nas proximidades de tecidos ou células doentes que produzem ou possuem proteases colocalizadas que são capazes de clivar o RS incorporado no polipeptídeo recombinante, a FBM e XTEN são liberados, de forma que o XTEN não protege mais a FBM e a FBM recupera seu potencial pleno para afinidade de ligação para seu ligante. Em algumas modalidades, FBMs adequadas para incorporação nas composições em questão incluem citocinas, quimiocinas e interleucinas (por exemplo, sem limitação, interleucina-

1 (IL-1), IL-12, e IL-18, fator de necrose tumoral (TNF), interferon-gama (IFN-gama), fator estimulante de colônia de granulócitos-macrófagos, quimiocinas C-C (RANTES, proteína quimioatraente de monócito ou MCP-1, proteína inflamatória de monócito ou MIP-1α e MIP-1β), quimiocinas C-X-C (IL-8, também denominada oncogene relacionado ao crescimento ou GRO/KC), quimiocinas C (linfotactina) e quimiocinas CXXXC (fractalquina). Em outras modalidades, FBM adequada para incorporação nas composições em questão incluem fragmentos de anticorpo que possuem afinidade de ligação por antígenos associados a tumores incluindo, sem limitação, os marcadores de célula-alvo da Tabela 5. Nas modalidades apresentadas anteriormente, os polipeptídeos recombinantes ainda compreendem RS1 das Tabelas 1 ou 2 e XTEN das Tabelas 8 ou 10, ou variantes de seqüência destes (como descrito com mais detalhes, abaixo).

[197] E um segundo aspecto, a revelação fornece composições de polipeptídeo recombinante que compreendem dois fragmentos de anticorpo, um ou mais segmentos de liberação, e um ou mais XTENs que são ativáveis por clivagem dos segmentos de liberação, de modo que os fragmentos de anticorpo são liberados da composição e readquirem seu potencial pleno para afinidade de ligação para seus respectivos ligantes. Esses polipeptídeos recombinantes que possuem dois fragmentos de anticorpo também são referidos nesse relatório descritivo como composições de anticorpo ativável (AAC). Em uma modalidade, uma AAC que possui uma primeira porção de ligação (FBM) fundida a uma segunda porção de ligação (SBM) na qual as FBM e SBM são, ambas, fragmentos de anticorpo, ainda compreende pelo menos um primeiro segmento de liberação e pelo menos um primeiro XTEN.

[198] As construções de AAC descritas nesse relatório descritivo conferem múltiplas vantagens terapêuticas em relação aos anticorpos monoclonais tradicionais e outras moléculas biespecíficas menores. É de particular importância a ativação condicional da AAC da presente revelação. A AAC não clivada, intacta, possui uma habilidade reduzida para se ligar aos seus marcadores de célula-alvo visados em função do efeito de blindagem do XTEN não estruturado, volumoso, amarrado à AAC pelo segmento de liberação. Dessa forma, a atividade específica para tecido normal, não doente, das composições da revelação exemplares é significantemente reduzida, quando comparada com aquela de anticorpos e fragmentos de anticorpo análogos. A habilidade dos polipeptídeos da AAC para ativar em seu local de ação desejado (por exemplo, nas proximidades de um tecido doente como, por exemplo, uma célula tumoral ou de câncer), enquanto permanece basicamente inativo durante seu progresso até esse local, é um avanço no campo da terapêutica imuno-oncológica, oferecendo a promessa de produtos terapêuticos potentes e específicos com índice terapêutico aumentado, bem como um prontamente formato projetável e fabricável que pode ser aplicado a múltiplas células-alvo, tais como aquelas reveladas nesse relatório descritivo.

[199] A AAC descrita nesse relatório descritivo com um fragmento de anticorpo de FBM e SBM são projetadas para permitir direcionamento e morte específicos de células que expressam um marcador de célula-alvo por recrutamento de células efetoras citotóxicas, por exemplo, células T. A AAC não clivada, intacta, está em uma forma de pró-fármaco, pelo fato de que o XTEN blinda as porções de ligação, reduzindo sua afinidade de ligação para seus ligantes até ser liberado da composição por clivagem por protease de qualquer um dos sítios de clivagem por protease localizados dentro do RS. Isso aumenta a especificidade da composição para tecidos ou células doentes, comparada com terapêuticas que empregam células T biespecíficas que não estão em um formato de pró- fármaco. Em contraste, por ativação da AAC especificamente no microambiente da célula-alvo ou do tecido doente, onde o marcador de célula-alvo e proteases capazes de clivar o RS são altamente expressos, as porções de ligação biespecíficas e XTEN das construções de AAC são liberados mediante clivagem do RS e os fragmentos de anticorpo de FBM e SBM fundidos podem reticular células efetoras citotóxicas com células que expressam um marcador de célula-alvo de uma forma altamente específica direcionando, dessa forma, o potencial citotóxico da célula T para a célula-alvo.

[200] Em uma característica exemplar da AAC, uma vez liberado, o fragmento de anticorpo de FBM-SBM fundido, que possui um tamanho bem menor, comparado com a AAC não clivada, está então livre para permear os locais-alvo, por exemplo, uma massa tumoral, a fim de alcançar e se ligar e se unir a célula-alvo e a célula T citotóxica. Adicionalmente, todo o processo não é dependente de internalização da composição. Em uma modalidade, as construções de AAC descritas nesse relatório descritivo engajam células T citotóxicas por meio de ligação ao CD3 expresso na superfície, que forma parte do complexo receptor de célula T, causando ativação de célula T que medeia a lise subseqüente da célula que expressa o marcador de célula-alvo particular. Dessa forma, é contemplado que AAC exibe morte forte, específica e eficiente da célula-alvo.

[201] Sem se prender a uma teoria em particular, acredita-se que a AAC descrita nesse relatório descritivo estimula a morte da célula-alvo por células efetoras citotóxicas para eliminar as células que expressam o marcador de célula-alvo particular ligada pela porção de direcionamento alvo-específica da AAC em microambientes ricos em protease (por exemplo, tumores). Nesse caso, as células são eliminadas seletivamente reduzindo, dessa forma, o potencial para efeitos tóxicos colaterais. Proteases que sabidamente estão associadas com células ou tecidos doentes incluem, sem limitação, serina-proteases, cisteína- proteases, aspartato proteases e metaloproteases.

[202] A AAC da revelação pode conferir vantagens terapêuticas e farmacêuticas adicionais em relação aos anticorpos monoclonais reconhecidos e a outras moléculas biespecíficas menores. Moléculas biespecíficas convencionais são projetadas para se ligar a uma célula-alvo que possui uma marcador célula-específico associado com uma célula patogênica. A toxicidade e os efeitos colaterais indesejáveis são possíveis quando, em alguns casos, células ou tecidos saudáveis expressam o mesmo marcador que as célula-alvo. Um benefício para uma AAC da revelação é que a ligação ao CD3 e à células-alvo é aumentada mediante a liberação das porções de ligação por uma protease expressa por, ou em associação com, o tecido doente que abriga a célula-alvo, por exemplo, uma célula tumoral, permitindo a ligação dos fragmentos de anticorpo de FBM e SBM fundidos liberados ao marcador de célula-alvo e à célula efetora,

criando uma sinapse imunológica. Com referência às FIGS. 11 e 12, em modalidades exemplares, as duas porções de ligação do fragmento de anticorpo da AAC estão fundidas umas às outras por um ligante curto, e são, por sua vez, conectadas ao XTEN pelo segmento de liberação que possui um ou mais sítios de clivagem para permitir a liberação dos fragmentos de anticorpo de FBM e SBM fundidos do XTEN mediante clivagem por uma ou mais proteases colocalizadas com o tecido doente. As porções de ligação da AAC podem estar em qualquer formato de uma porção de ligação de cadeia única incluindo Fv, Fab, Fab′, Fab′-SH, F(ab′)2, anticorpos lineares, um anticorpo de domínio único, um anticorpo de domínio único e moléculas de fragmento de anticorpo variável de cadeia única (scFv). Os dois fragmentos de anticorpo FBM e SBM fundidos também podem ser configurados em um formato de diabody de cadeia única pelo arranjo seletivo das VL e VH e dos ligantes que as unem.

[203] Composições de polipeptídeo capazes de ligação a tecidos doentes como, por exemplo, tumores, possuem um tamanho ótimo para penetração e distribuição no tecido aumentadas do produto terapêutico. No entanto, isso é contrabalanceado pelo desejo de ter depuração renal de primeira passagem reduzida, bem como extravasamento reduzido da circulação para o tecido normal. Como o rim geralmente retira por filtração moléculas abaixo de cerca de 50 kDa, esforços para reduzir a depuração no design de produtos terapêuticos de proteína se concentraram no aumento do tamanho molecular por meio de fusões com proteínas como albumina ou na adição de polímeros de polietileno glicol. No entanto, enquanto o aumento do tamanho de uma proteína terapêutica pode evitar a depuração renal e o extravasamento,

o tamanho maior também impede a penetração da molécula nos tecidos-alvo. A AAC exemplar descrita nesse relatório descritivo evita isso por fusão das porções de ligação com segmentos de liberação e porções volumosas como, por exemplo, XTEN, o que aumenta acentuadamente o peso molecular aparente da composição (descrito com mais detalhes, abaixo), e evitará a depuração renal rápida e extravasamento na vasculatura normal tendo, ao mesmo tempo, a habilidade para que o XTEN seja liberado pela ação de proteases associadas ao tecido- alvo no RS, resultando na liberação das porções de ligação que possuem um tamanho pequeno, permitindo a penetração e distribuição no tecido aumentadas e eficácia ótima. Dessa forma, o XTEN confere diversas propriedades favoráveis nas modalidades de AAC incluindo, sem limitação, meia-vida aumentada, extravasamento reduzido na normal vasculatura, solubilidade aumentada, ligação reduzida aos tecidos saudáveis, índice terapêutico aumentado, e um formato de pró-fármaco.

[204] Em uma modalidade exemplar, a presente revelação fornece AAC que possui um polipeptídeo da porção de ligação de cadeia única dirigido a um ligante de uma célula-alvo e outro polipeptídeo da porção de ligação de cadeia única dirigido a um ligante da célula efetora, por exemplo, um antígeno CD3, tornando a configuração desse componente da AAC similar às composições de ligação bifuncional como, por exemplo, blinatumomab (referida como uma composição BiTE®). Um marcador de célula-alvo representativo é um antígeno encontrado na superfície de uma célula de câncer, por exemplo, EGFR, EpCAM, HER2, ou qualquer um dos marcadores- alvo da Tabela 5. Nas modalidades, os polipeptídeos da AAC compreendem uma FBM e uma SBM, que podem ser scFvs ligados por meio de um ligante flexível, tais como aqueles da Tabela 7, ou podem estar configuradas como um diabody de cadeia única. Embora cada uma das FBM e SBM tenha afinidade de ligação para seus respectivos ligantes comparável às porções de ligação de cadeia única típicas, o XTEN da composição AAC não clivada, intacta, serve para reduzir acentuadamente a habilidade de ambos os scFvs da composição intacta para se ligar aos seus respectivos ligantes por impedimento estérico em função da habilidade do XTEN não estruturado, flexível, para circundar as porções de ligação da composição. Mediante clivagem por protease do RS em qualquer um dos sítios de clivagem por protease, as porções de ligação fundidas se separam do XTEN, permitindo que a porção de ligação anti- alvo e a porção de ligação anti-CD3 fundidas se liguem cooperativamente aos seus respectivos ligantes e formem uma sinapse imunológica entre a célula-alvo e a célula T efetora. Naquelas modalidades nas quais o polipeptídeo recombinante contém uma única porção de ligação anti-alvo, por exemplo, uma citocina ou anti-citocina, a porção de ligação liberada teria similarmente uma habilidade aumentada para se ligar ao seu ligante mediante liberação da composição intacta por ação de uma protease no RS. III. Segmentos de liberação

[205] Em outro aspecto, a revelação fornece peptídeos do segmento de liberação (RS) que são substratos para uma ou mais proteases de mamíferos associadas com ou produzidas por tecidos ou células doentes encontradas nas proximidades de tecidos doentes. Essas proteases podem incluir, sem limitação, as classes de proteases como, por exemplo,

metaloproteinases, cisteína-proteases, aspartato proteases, e serina-proteases incluindo, sem limitação, as proteases da Tabela 3. Os RSs são úteis para, entre outras coisas, incorporação nos polipeptídeos recombinantes em questão, conferindo um formato de pró-fármaco que pode ser ativado pela clivagem do RS por proteases de mamíferos. Como descrito nesse relatório descritivo, os RSs são incorporados nas composições de polipeptídeo recombinante em questão, união das porções de ligação incorporadas ao XTEN (cujas configurações são descritas com mais detalhes, abaixo), de modo que, mediante clivagem do RS por ação das (uma ou mais) proteases para as quais os RSs são substratos, as porções de ligação e XTEN são liberados da composição e as porções de ligação, não mais blindadas pelo XTEN, readquirem seu potencial pleno para se ligar aos seus ligantes. Naquelas composições de polipeptídeo recombinante que compreendem um primeiro e um segundo fragmento de anticorpo, as composições também são referidas nesse relatório descritivo como composições de anticorpo ativável (AAC).

[206] Em uma modalidade, a revelação fornece polipeptídeos recombinantes ativáveis que compreendem uma primeira seqüência do segmento de liberação (RS1) que possui pelo menos 88%, ou pelo menos 94%, ou 100% de identidade de seqüência, quando otimamente alinhada, para uma seqüência selecionada das seqüências apresentadas na Tabela 1, em que a RS1 é um substrato para uma ou mais proteases de mamíferos. Em outras modalidades, a revelação fornece polipeptídeos recombinantes ativáveis que compreendem uma RS1 e uma segunda seqüência do segmento de liberação (RS2), cada uma tendo pelo menos 88%, ou pelo menos 94%, ou 100% de identidade de seqüência, quando otimamente alinhada, para uma seqüência selecionada das seqüências apresentadas na Tabela 1, em que a RS1 e a RS2 são, cada uma, um substrato para uma ou mais proteases de mamíferos. Em outra modalidade, a revelação fornece polipeptídeos recombinantes ativáveis que compreendem uma primeira seqüência do RS (RS1) que possui pelo menos 90%, pelo menos 93%, pelo menos 97%, ou 100% de identidade, quando otimamente alinhada, para uma seqüência selecionada das seqüências apresentadas na Tabela 2, em que o RS é um substrato para uma ou mais proteases de mamíferos. Em outras modalidades, a revelação fornece polipeptídeos recombinantes ativáveis que compreendem uma RS1 e uma segunda seqüência do segmento de liberação (RS2), cada uma tendo pelo menos 88%, ou pelo menos 94%, ou 100% de identidade de seqüência, quando otimamente alinhada, para uma seqüência selecionada das seqüências apresentadas na Tabela 2, em que a RS1 e a RS2 são, cada uma, um substrato para uma ou mais proteases de mamíferos. Nas modalidades de polipeptídeos recombinantes ativáveis que compreendem RS1 e RS2, os dois segmentos de liberação podem ser idênticos ou as seqüências podem ser diferentes.

[207] A presente revelação contempla segmentos de liberação que são substratos para uma, duas ou três classes diferentes de proteases selecionadas de metaloproteinases, cisteína-proteases, aspartato proteases, e serina-proteases, incluindo as proteases da Tabela 3. Em uma característica particular, os RSs servem como substratos para proteases encontradas em associação íntima ou que estão colocalizados com tecidos ou células doentes, por exemplo, sem limitação, tumores, células de câncer e tecidos inflamatórios e,

mediante clivagem do RS, as porções de ligação que, de outro modo, estão blindadas pelo XTEN das composições de polipeptídeo recombinante em questão (e, dessa forma, possuem uma afinidade de ligação menor para seus respectivos ligantes) são liberadas da composição e readquirem seu potencial pleno para se ligar ao alvo e/ou ligantes da célula efetora. Em outra modalidade, o RS das composições de polipeptídeo recombinante em questão compreende uma seqüência de aminoácidos que é um substrato para uma protease celular localizada dentro de uma célula visada incluindo, sem limitação, as proteases da Tabela 3. Em outra característica particular das composições de polipeptídeo recombinante em questão, os RSs que são substratos para duas ou três classes de proteases foram projetados com seqüências que são capazes de serem clivadas em localizações diferentes da seqüência de RS pelas proteases diferentes, com um exemplo representativo retratado na FIG. 36. Dessa forma, os RSs que são substratos para duas, três ou mais classes de proteases possuem dois, três ou diversos sítios de clivagem distintos na seqüência de RS, mas a clivagem por uma única protease, no entanto, resulta na liberação das porções de ligação e do XTEN da composição de polipeptídeo recombinante que compreende o RS.

[208] Em uma modalidade, o RS da revelação para incorporação nas composições de polipeptídeo recombinante em questão é um substrato para uma ou mais proteases selecionadas do grupo que consiste em meprina, neprilisina (CD10), PSMA, BMP-1, A desintegrina e metaloproteinases (ADAMs), ADAM8, ADAM9, ADAM10, ADAM12, ADAM15, ADAM17 (TACE), ADAM19, ADAM28 (MDC-L), ADAM com motivos de trombospondina (ADAMTS), ADAMTS1, ADAMTS4, ADAMTS5, MMP-1 (colagenase 1), metaloproteinase da matriz-1 (MMP-1), metaloproteinase da matriz-2 (MMP-2, gelatinase A), metaloproteinase da matriz-3 (MMP-3, estromelisina 1), metaloproteinase da matriz-7 (MMP-7, Matrilisina 1), metaloproteinase da matriz-8 (MMP-8, colagenase 2), metaloproteinase da matriz-9 (MMP-9, gelatinase B), metaloproteinase da matriz-10 (MMP-10, estromelisina 2), metaloproteinase da matriz-11 (MMP-11, estromelisina 3), metaloproteinase da matriz-12 (MMP-12, macrófago elastase), metaloproteinase da matriz-13 (MMP-13, colagenase 3), metaloproteinase da matriz-14 (MMP-14, MT1-MMP), metaloproteinase da matriz-15 (MMP-15, MT2-MMP), metaloproteinase da matriz-19 (MMP-19), metaloproteinase da matriz-23 (MMP-23, CA-MMP), metaloproteinase da matriz-24 (MMP-24, MT5-MMP), metaloproteinase da matriz-26 (MMP-26, matrilisina 2), metaloproteinase da matriz-27 (MMP-27, CMMP), legumaína, catepsina B, catepsina C, catepsina K, catepsina L, catepsina S, catepsina X, catepsina D, catepsina E, secretase, uroquinase (uPA), ativador de plasminogênio do tipo tecidual (tPA), plasmina, trombina, antígeno específico da próstata (PSA, KLK3), elastase de neutrófilo humano (HNE), elastase, triptase, serina-proteases transmembrana Tipo II (TTSPs), DESC1, hepsina (HPN), matriptase, matriptase-2, TMPRSS2, TMPRSS3, TMPRSS4 (CAP2), proteína de ativação de fibroblasto (FAP), peptidase relacionada à calicreína (KLK família), KLK4, KLK5, KLK6, KLK7, KLK8, KLK10, KLK11, KLK13 e KLK14. Em uma modalidade, o RS é um substrato para ADAM17. Em uma modalidade, o RS é um substrato para BMP-1. Em uma modalidade, o RS é um substrato para catepsina.

Em uma modalidade, o RS é um substrato para HtrA1. Em uma modalidade, o RS é um substrato para legumaína.

Em uma modalidade, o RS é um substrato para MMP-1. Em uma modalidade, o RS é um substrato para MMP-2. Em uma modalidade, o RS é um substrato para MMP-7. Em uma modalidade, o RS é um substrato para MMP-9. Em uma modalidade, o RS é um substrato para MMP-11. Em uma modalidade, o RS é um substrato para MMP-14. Em uma modalidade, o RS é um substrato para uPA.

Em uma modalidade, o RS é um substrato para matriptase.

Em uma modalidade, o RS é um substrato para MT-SP1. Em uma modalidade, o RS é um substrato para elastase de neutrófilo.

Em uma modalidade, o RS é um substrato para trombina.

Em uma modalidade RS é um substrato para TMPRSS3. Em uma modalidade, o RS é um substrato para TMPRSS4. Em uma modalidade, o RS das composições de polipeptídeo recombinante em questão é um substrato para pelo menos duas proteases selecionadas do grupo que consiste em legumaína, MMP-1, MMP-2, MMP-7, MMP- 9, MMP-11, MMP-14, uPA e matriptase.

Em outra modalidade, o RS das composições de polipeptídeo recombinante em questão é um substrato para legumaína, MMP-1, MMP-2, MMP-7, MMP-9, MMP-11, MMP-14, uPA e matriptase.

Tabela 1: Seqüências do segmento de liberação.

Nome ID da construção Seqüência de aminoácidos RSR-1517 AC1611 EAGRSANHEPLGLVAT BSRS-A1 AC1605 ASGRSTNAGPSGLAGP BSRS-A2 AC1606 ASGRSTNAGPQGLAGQ BSRS-A3 AC1607 ASGRSTNAGPPGLTGP VP-1 AC1608 ASSRGTNAGPAGLTGP RSR-1752 AC1609 ASSRTTNTGPSTLTGP

Nome ID da construção Seqüência de aminoácidos RSR-1512 AC1610 AAGRSDNGTPLELVAP RSR-1517 AC1611 EAGRSANHEPLGLVAT VP-2 AC1612 ASGRGTNAGPAGLTGP RSR-1018 AC1613 LFGRNDNHEPLELGGG RSR-1053 AC1614 TAGRSDNLEPLGLVFG RSR-1059 AC1615 LDGRSDNFHPPELVAG RSR-1065 AC1616 LEGRSDNEEPENLVAG RSR-1167 AC1617 LKGRSDNNAPLALVAG RSR-1201 AC1618 VYSRGTNAGPHGLTGR RSR-1218 AC1619 ANSRGTNKGFAGLIGP RSR-1226 AC1620 ASSRLTNEAPAGLTIP RSR-1254 AC1621 DQSRGTNAGPEGLTDP RSR-1256 AC1622 ESSRGTNIGQGGLTGP RSR-1261 AC1623 SSSRGTNQDPAGLTIP RSR-1293 AC1624 ASSRGQNHSPMGLTGP RSR-1309 AC1625 AYSRGPNAGPAGLEGR RSR-1326 AC1626 ASERGNNAGPANLTGF RSR-1345 AC1627 ASHRGTNPKPAILTGP RSR-1354 AC1628 MSSRRTNANPAQLTGP RSR-1426 AC1629 GAGRTDNHEPLELGAA RSR-1478 AC1630 LAGRSENTAPLELTAG RSR-1479 AC1631 LEGRPDNHEPLALVAS RSR-1496 AC1632 LSGRSDNEEPLALPAG RSR-1508 AC1633 EAGRTDNHEPLELSAP RSR-1513 AC1634 EGGRSDNHGPLELVSG RSR-1516 AC1635 LSGRSDNEAPLELEAG RSR-1524 AC1636 LGGRADNHEPPELGAG RSR-1622 AC1637 PPSRGTNAEPAGLTGE

Nome ID da construção Seqüência de aminoácidos RSR-1629 AC1638 ASTRGENAGPAGLEAP RSR-1664 AC1639 ESSRGTNGAPEGLTGP RSR-1667 AC1640 ASSRATNESPAGLTGE RSR-1709 AC1641 ASSRGENPPPGGLTGP RSR-1712 AC1642 AASRGTNTGPAELTGS RSR-1727 AC1643 AGSRTTNAGPGGLEGP RSR-1754 AC1644 APSRGENAGPATLTGA RSR-1819 AC1645 ESGRAANTGPPTLTAP RSR-1832 AC1646 NPGRAANEGPPGLPGS RSR-1855 AC1647 ESSRAANLTPPELTGP RSR-1911 AC1648 ASGRAANETPPGLTGA RSR-1929 AC1649 NSGRGENLGAPGLTGT RSR-1951 AC1650 TTGRAANLTPAGLTGP RSR-2295 AC1761 EAGRSANHTPAGLTGP RSR-2298 AC1762 ESGRAANTTPAGLTGP RSR-2038 AC1679 TTGRATEAANLTPAGLTGP RSR-2072 AC1680 TTGRAEEAANLTPAGLTGP RSR-2089 AC1681 TTGRAGEAANLTPAGLTGP RSR-2302 AC1682 TTGRATEAANATPAGLTGP RSR-3047 AC1697 TTGRAGEAEGATSAGATGP RSR-3052 AC1698 TTGEAGEAANATSAGATGP RSR-3043 AC1699 TTGEAGEAAGLTPAGLTGP RSR-3041 AC1700 TTGAAGEAANATPAGLTGP RSR-3044 AC1701 TTGRAGEAAGLTPAGLTGP RSR-3057 AC1702 TTGRAGEAANATSAGATGP RSR-3058 AC1703 TTGEAGEAAGATSAGATGP RSR-2485 AC1763 ESGRAANTEPPELGAG RSR-2486 AC1764 ESGRAANTAPEGLTGP

Nome ID da construção Seqüência de aminoácidos RSR-2488 AC1688 EPGRAANHEPSGLTEG RSR-2599 AC1706 ESGRAANHTGAPPGGLTGP RSR-2706 AC1716 TTGRTGEGANATPGGLTGP RSR-2707 AC1717 RTGRSGEAANETPEGLEGP RSR-2708 AC1718 RTGRTGESANETPAGLGGP RSR-2709 AC1719 STGRTGEPANETPAGLSGP RSR-2710 AC1720 TTGRAGEPANATPTGLSGP RSR-2711 AC1721 RTGRPGEGANATPTGLPGP RSR-2712 AC1722 RTGRGGEAANATPSGLGGP RSR-2713 AC1723 STGRSGESANATPGGLGGP RSR-2714 AC1724 RTGRTGEEANATPAGLPGP RSR-2715 AC1725 ATGRPGEPANTTPEGLEGP RSR-2716 AC1726 STGRSGEPANATPGGLTGP RSR-2717 AC1727 PTGRGGEGANTTPTGLPGP RSR-2718 AC1728 PTGRSGEGANATPSGLTGP RSR-2719 AC1729 TTGRASEGANSTPAPLTEP RSR-2720 AC1730 TYGRAAEAANTTPAGLTAP RSR-2721 AC1731 TTGRATEGANATPAELTEP RSR-2722 AC1732 TVGRASEEANTTPASLTGP RSR-2723 AC1733 TTGRAPEAANATPAPLTGP RSR-2724 AC1734 TWGRATEPANATPAPLTSP RSR-2725 AC1735 TVGRASESANATPAELTSP RSR-2726 AC1736 TVGRAPEGANSTPAGLTGP RSR-2727 AC1737 TWGRATEAPNLEPATLTTP RSR-2728 AC1738 TTGRATEAPNLTPAPLTEP RSR-2729 AC1739 TQGRATEAPNLSPAALTSP RSR-2730 AC1740 TQGRAAEAPNLTPATLTAP RSR-2731 AC1741 TSGRAPEATNLAPAPLTGP

Nome ID da construção Seqüência de aminoácidos RSR-2732 AC1742 TQGRAAEAANLTPAGLTEP RSR-2733 AC1743 TTGRAGSAPNLPPTGLTTP RSR-2734 AC1744 TTGRAGGAENLPPEGLTAP RSR-2735 AC1745 TTSRAGTATNLTPEGLTAP RSR-2736 AC1746 TTGRAGTATNLPPSGLTTP RSR-2737 AC1747 TTARAGEAENLSPSGLTAP RSR-2738 AC1748 TTGRAGGAGNLAPGGLTEP RSR-2739 AC1749 TTGRAGTATNLPPEGLTGP RSR-2740 AC1750 TTGRAGGAANLAPTGLTEP RSR-2741 AC1751 TTGRAGTAENLAPSGLTTP RSR-2742 AC1752 TTGRAGSATNLGPGGLTGP RSR-2743 AC1753 TTARAGGAENLTPAGLTEP RSR-2744 AC1754 TTARAGSAENLSPSGLTGP RSR-2745 AC1755 TTARAGGAGNLAPEGLTTP RSR-2746 AC1756 TTSRAGAAENLTPTGLTGP RSR-2747 AC1757 TYGRTTTPGNEPPASLEAE RSR-2748 AC1758 TYSRGESGPNEPPPGLTGP RSR-2749 AC1759 AWGRTGASENETPAPLGGE RSR-2750 AC1760 RWGRAETTPNTPPEGLETE RSR-2751 AC1765 ESGRAANHTGAEPPELGAG RSR-2754 AC1801 TTGRAGEAANLTPAGLTES RSR-2755 AC1802 TTGRAGEAANLTPAALTES RSR-2756 AC1803 TTGRAGEAANLTPAPLTES RSR-2757 AC1804 TTGRAGEAANLTPEPLTES RSR-2758 AC1805 TTGRAGEAANLTPAGLTGA RSR-2759 AC1806 TTGRAGEAANLTPEGLTGA RSR-2760 AC1807 TTGRAGEAANLTPEPLTGA RSR-2761 AC1808 TTGRAGEAANLTPAGLTEA

Nome ID da construção Seqüência de aminoácidos RSR-2762 AC1809 TTGRAGEAANLTPEGLTEA RSR-2763 AC1810 TTGRAGEAANLTPAPLTEA RSR-2764 AC1811 TTGRAGEAANLTPEPLTEA RSR-2765 AC1812 TTGRAGEAANLTPEPLTGP RSR-2766 AC1813 TTGRAGEAANLTPAGLTGG RSR-2767 AC1814 TTGRAGEAANLTPEGLTGG RSR-2768 AC1815 TTGRAGEAANLTPEALTGG RSR-2769 AC1816 TTGRAGEAANLTPEPLTGG RSR-2770 AC1817 TTGRAGEAANLTPAGLTEG RSR-2771 AC1818 TTGRAGEAANLTPEGLTEG RSR-2772 AC1819 TTGRAGEAANLTPAPLTEG RSR-2773 AC1820 TTGRAGEAANLTPEPLTEG Tabela 2: Seqüências do segmento de liberação. Seqüência de Nome Nome Seqüência de aminoácidos aminoácidos

GSAPGSAGGYAELRMGGAIATS GTAEAASASGGSAGGYAELRMGGA RSN-0001 RSC-0001

GSETPGT IPGSP

GSAPGTGGGYAPLRMGGGAATS GTAEAASASGGTGGGYAPLRMGGG RSN-0002 RSC-0002

GSETPGT APGSP

GSAPGAEGGYAALRMGGEIATS GTAEAASASGGAEGGYAALRMGGE RSN-0003 RSC-0003

GSETPGT IPGSP

GSAPGGPGGYALLRMGGPAATS GTAEAASASGGGPGGYALLRMGGP RSN-0004 RSC-0004

GSETPGT APGSP

GSAPGEAGGYAFLRMGGSIATS GTAEAASASGGEAGGYAFLRMGGS RSN-0005 RSC-0005

GSETPGT IPGSP

GSAPGPGGGYASLRMGGTAATS GTAEAASASGGPGGGYASLRMGGT RSN-0006 RSC-0006

GSETPGT APGSP RSN-0007 GSAPGSEGGYATLRMGGAIATS RSC-0007 GTAEAASASGGSEGGYATLRMGGA

Seqüência de Nome Nome Seqüência de aminoácidos aminoácidos

GSETPGT IPGSP

GSAPGTPGGYANLRMGGGAATS GTAEAASASGGTPGGYANLRMGGG RSN-0008 RSC-0008

GSETPGT APGSP

GSAPGASGGYAHLRMGGEIATS GTAEAASASGGASGGYAHLRMGGE RSN-0009 RSC-0009

GSETPGT IPGSP

GSAPGGTGGYGELRMGGPAATS GTAEAASASGGGTGGYGELRMGGP RSN-0010 RSC-0010

GSETPGT APGSP

GSAPGEAGGYPELRMGGSIATS GTAEAASASGGEAGGYPELRMGGS RSN-0011 RSC-0011

GSETPGT IPGSP

GSAPGPGGGYVELRMGGTAATS GTAEAASASGGPGGGYVELRMGGT RSN-0012 RSC-0012

GSETPGT APGSP

GSAPGSEGGYLELRMGGAIATS GTAEAASASGGSEGGYLELRMGGA RSN-0013 RSC-0013

GSETPGT IPGSP

GSAPGTPGGYSELRMGGGAATS GTAEAASASGGTPGGYSELRMGGG RSN-0014 RSC-0014

GSETPGT APGSP

GSAPGASGGYTELRMGGEIATS GTAEAASASGGASGGYTELRMGGE RSN-0015 RSC-0015

GSETPGT IPGSP

GSAPGGTGGYQELRMGGPAATS GTAEAASASGGGTGGYQELRMGGP RSN-0016 RSC-0016

GSETPGT APGSP

GSAPGEAGGYEELRMGGSIATS GTAEAASASGGEAGGYEELRMGGS RSN-0017 RSC-0017

GSETPGT IPGSP

GSAPGPGIGPAELRMGGTAATS GTAEAASASGGPGIGPAELRMGGT RSN-0018 RSC-0018

GSETPGT APGSP

GSAPGSEIGAAELRMGGAIATS GTAEAASASGGSEIGAAELRMGGA RSN-0019 RSC-0019

GSETPGT IPGSP

GSAPGTPIGSAELRMGGGAATS GTAEAASASGGTPIGSAELRMGGG RSN-0020 RSC-0020

GSETPGT APGSP

Seqüência de Nome Nome Seqüência de aminoácidos aminoácidos

GSAPGASIGTAELRMGGEIATS GTAEAASASGGASIGTAELRMGGE RSN-0021 RSC-0021

GSETPGT IPGSP

GSAPGGTIGNAELRMGGPAATS GTAEAASASGGGTIGNAELRMGGP RSN-0022 RSC-0022

GSETPGT APGSP

GSAPGEAIGQAELRMGGSIATS GTAEAASASGGEAIGQAELRMGGS RSN-0023 RSC-0023

GSETPGT IPGSP

GSAPGPGGPYAELRMGGTAATS GTAEAASASGGPGGPYAELRMGGT RSN-0024 RSC-0024

GSETPGT APGSP

GSAPGSEGAYAELRMGGAIATS GTAEAASASGGSEGAYAELRMGGA RSN-0025 RSC-0025

GSETPGT IPGSP

GSAPGTPGVYAELRMGGGAATS GTAEAASASGGTPGVYAELRMGGG RSN-0026 RSC-0026

GSETPGT APGSP

GSAPGASGLYAELRMGGEIATS GTAEAASASGGASGLYAELRMGGE RSN-0027 RSC-0027

GSETPGT IPGSP

GSAPGGTGIYAELRMGGPAATS GTAEAASASGGGTGIYAELRMGGP RSN-0028 RSC-0028

GSETPGT APGSP

GSAPGEAGFYAELRMGGSIATS GTAEAASASGGEAGFYAELRMGGS RSN-0029 RSC-0029

GSETPGT IPGSP

GSAPGPGGYYAELRMGGTAATS GTAEAASASGGPGGYYAELRMGGT RSN-0030 RSC-0030

GSETPGT APGSP

GSAPGSEGSYAELRMGGAIATS GTAEAASASGGSEGSYAELRMGGA RSN-0031 RSC-0031

GSETPGT IPGSP

GSAPGTPGNYAELRMGGGAATS GTAEAASASGGTPGNYAELRMGGG RSN-0032 RSC-0032

GSETPGT APGSP

GSAPGASGEYAELRMGGEIATS GTAEAASASGGASGEYAELRMGGE RSN-0033 RSC-0033

GSETPGT IPGSP RSN-0034 GSAPGGTGHYAELRMGGPAATS RSC-0034 GTAEAASASGGGTGHYAELRMGGP

Seqüência de Nome Nome Seqüência de aminoácidos aminoácidos

GSETPGT APGSP

GSAPGEAGGYAEARMGGSIATS GTAEAASASGGEAGGYAEARMGGS RSN-0035 RSC-0035

GSETPGT IPGSP

GSAPGPGGGYAEVRMGGTAATS GTAEAASASGGPGGGYAEVRMGGT RSN-0036 RSC-0036

GSETPGT APGSP

GSAPGSEGGYAEIRMGGAIATS GTAEAASASGGSEGGYAEIRMGGA RSN-0037 RSC-0037

GSETPGT IPGSP

GSAPGTPGGYAEFRMGGGAATS GTAEAASASGGTPGGYAEFRMGGG RSN-0038 RSC-0038

GSETPGT APGSP

GSAPGASGGYAEYRMGGEIATS GTAEAASASGGASGGYAEYRMGGE RSN-0039 RSC-0039

GSETPGT IPGSP

GSAPGGTGGYAESRMGGPAATS GTAEAASASGGGTGGYAESRMGGP RSN-0040 RSC-0040

GSETPGT APGSP

GSAPGEAGGYAETRMGGSIATS GTAEAASASGGEAGGYAETRMGGS RSN-0041 RSC-0041

GSETPGT IPGSP

GSAPGPGGGYAELAMGGTRATS GTAEAASASGGPGGGYAELAMGGT RSN-0042 RSC-0042

GSETPGT RPGSP

GSAPGSEGGYAELVMGGARATS GTAEAASASGGSEGGYAELVMGGA RSN-0043 RSC-0043

GSETPGT RPGSP

GSAPGTPGGYAELLMGGGRATS GTAEAASASGGTPGGYAELLMGGG RSN-0044 RSC-0044

GSETPGT RPGSP

GSAPGASGGYAELIMGGERATS GTAEAASASGGASGGYAELIMGGE RSN-0045 RSC-0045

GSETPGT RPGSP

GSAPGGTGGYAELWMGGPRATS GTAEAASASGGGTGGYAELWMGGP RSN-0046 RSC-0046

GSETPGT RPGSP

GSAPGEAGGYAELSMGGSRATS GTAEAASASGGEAGGYAELSMGGS RSN-0047 RSC-0047

GSETPGT RPGSP

Seqüência de Nome Nome Seqüência de aminoácidos aminoácidos

GSAPGPGGGYAELTMGGTRATS GTAEAASASGGPGGGYAELTMGGT RSN-0048 RSC-0048

GSETPGT RPGSP

GSAPGSEGGYAELQMGGARATS GTAEAASASGGSEGGYAELQMGGA RSN-0049 RSC-0049

GSETPGT RPGSP

GSAPGTPGGYAELNMGGGRATS GTAEAASASGGTPGGYAELNMGGG RSN-0050 RSC-0050

GSETPGT RPGSP

GSAPGASGGYAELEMGGERATS GTAEAASASGGASGGYAELEMGGE RSN-0051 RSC-0051

GSETPGT RPGSP

GSAPGGTGGYAELRPGGPIATS GTAEAASASGGGTGGYAELRPGGP RSN-0052 RSC-0052

GSETPGT IPGSP

GSAPGEAGGYAELRAGGSAATS GTAEAASASGGEAGGYAELRAGGS RSN-0053 RSC-0053

GSETPGT APGSP

GSAPGPGGGYAELRLGGTIATS GTAEAASASGGPGGGYAELRLGGT RSN-0054 RSC-0054

GSETPGT IPGSP

GSAPGSEGGYAELRIGGAAATS GTAEAASASGGSEGGYAELRIGGA RSN-0055 RSC-0055

GSETPGT APGSP

GSAPGTPGGYAELRSGGGIATS GTAEAASASGGTPGGYAELRSGGG RSN-0056 RSC-0056

GSETPGT IPGSP

GSAPGASGGYAELRNGGEAATS GTAEAASASGGASGGYAELRNGGE RSN-0057 RSC-0057

GSETPGT APGSP

GSAPGGTGGYAELRQGGPIATS GTAEAASASGGGTGGYAELRQGGP RSN-0058 RSC-0058

GSETPGT IPGSP

GSAPGEAGGYAELRDGGSAATS GTAEAASASGGEAGGYAELRDGGS RSN-0059 RSC-0059

GSETPGT APGSP

GSAPGPGGGYAELREGGTIATS GTAEAASASGGPGGGYAELREGGT RSN-0060 RSC-0060

GSETPGT IPGSP RSN-0061 GSAPGSEGGYAELRHGGAAATS RSC-0061 GTAEAASASGGSEGGYAELRHGGA

Seqüência de Nome Nome Seqüência de aminoácidos aminoácidos

GSETPGT APGSP

GSAPGTPGGYAELRMPGGIATS GTAEAASASGGTPGGYAELRMPGG RSN-0062 RSC-0062

GSETPGT IPGSP

GSAPGASGGYAELRMAGEAATS GTAEAASASGGASGGYAELRMAGE RSN-0063 RSC-0063

GSETPGT APGSP

GSAPGGTGGYAELRMVGPIATS GTAEAASASGGGTGGYAELRMVGP RSN-0064 RSC-0064

GSETPGT IPGSP

GSAPGEAGGYAELRMLGSAATS GTAEAASASGGEAGGYAELRMLGS RSN-0065 RSC-0065

GSETPGT APGSP

GSAPGPGGGYAELRMIGTIATS GTAEAASASGGPGGGYAELRMIGT RSN-0066 RSC-0066

GSETPGT IPGSP

GSAPGSEGGYAELRMYGAIATS GTAEAASASGGSEGGYAELRMYGA RSN-0067 RSC-0067

GSETPGT IPGSP

GSAPGTPGGYAELRMSGGAATS GTAEAASASGGTPGGYAELRMSGG RSN-0068 RSC-0068

GSETPGT APGSP

GSAPGASGGYAELRMNGEIATS GTAEAASASGGASGGYAELRMNGE RSN-0069 RSC-0069

GSETPGT IPGSP

GSAPGGTGGYAELRMQGPAATS GTAEAASASGGGTGGYAELRMQGP RSN-0070 RSC-0070

GSETPGT APGSP

GSAPGANHTPAGLTGPGARATS GTAEAASASGGANHTPAGLTGPGA RSN-0071 RSC-0071

GSETPGT RPGSP

GSAPGANTAPEGLTGPSTRATS GTAEAASASGGANTAPEGLTGPST RSN-0072 RSC-0072

GSETPGT RPGSP

GSAPGTGAPPGGLTGPGTRATS GTAEAASASGGTGAPPGGLTGPGT RSN-0073 RSC-0073

GSETPGT RPGSP

GSAPGANHEPSGLTEGSPRATS GTAEAASASGGANHEPSGLTEGSP RSN-0074 RSC-0074

GSETPGT RPGSP

Seqüência de Nome Nome Seqüência de aminoácidos aminoácidos

GSAPGANTEPPELGAGTERATS GTAEAASASGGANTEPPELGAGTE RSN-0075 RSC-0075

GSETPGT RPGSP

GSAPGASGPPPGLTGPPGRATS GTAEAASASGGASGPPPGLTGPPG RSN-0076 RSC-0076

GSETPGT RPGSP

GSAPGASGTPAPLGGEPGRATS GTAEAASASGGASGTPAPLGGEPG RSN-0077 RSC-0077

GSETPGT RPGSP

GSAPGPAGPPEGLETEAGRATS GTAEAASASGGPAGPPEGLETEAG RSN-0078 RSC-0078

GSETPGT RPGSP

GSAPGPTSGQGGLTGPESRATS GTAEAASASGGPTSGQGGLTGPES RSN-0079 RSC-0079

GSETPGT RPGSP

GSAPGSAGGAANLVRGGAIATS GTAEAASASGGSAGGAANLVRGGA RSN-0080 RSC-0080

GSETPGT IPGSP

GSAPGTGGGAAPLVRGGGAATS GTAEAASASGGTGGGAAPLVRGGG RSN-0081 RSC-0081

GSETPGT APGSP

GSAPGAEGGAAALVRGGEIATS GTAEAASASGGAEGGAAALVRGGE RSN-0082 RSC-0082

GSETPGT IPGSP

GSAPGGPGGAALLVRGGPAATS GTAEAASASGGGPGGAALLVRGGP RSN-0083 RSC-0083

GSETPGT APGSP

GSAPGEAGGAAFLVRGGSIATS GTAEAASASGGEAGGAAFLVRGGS RSN-0084 RSC-0084

GSETPGT IPGSP

GSAPGPGGGAASLVRGGTAATS GTAEAASASGGPGGGAASLVRGGT RSN-0085 RSC-0085

GSETPGT APGSP

GSAPGSEGGAATLVRGGAIATS GTAEAASASGGSEGGAATLVRGGA RSN-0086 RSC-0086

GSETPGT IPGSP

GSAPGTPGGAAGLVRGGGAATS GTAEAASASGGTPGGAAGLVRGGG RSN-0087 RSC-0087

GSETPGT APGSP RSN-0088 GSAPGASGGAADLVRGGEIATS RSC-0088 GTAEAASASGGASGGAADLVRGGE

Seqüência de Nome Nome Seqüência de aminoácidos aminoácidos

GSETPGT IPGSP

GSAPGGTGGAGNLVRGGPAATS GTAEAASASGGGTGGAGNLVRGGP RSN-0089 RSC-0089

GSETPGT APGSP

GSAPGEAGGAPNLVRGGSIATS GTAEAASASGGEAGGAPNLVRGGS RSN-0090 RSC-0090

GSETPGT IPGSP

GSAPGPGGGAVNLVRGGTAATS GTAEAASASGGPGGGAVNLVRGGT RSN-0091 RSC-0091

GSETPGT APGSP

GSAPGSEGGALNLVRGGAIATS GTAEAASASGGSEGGALNLVRGGA RSN-0092 RSC-0092

GSETPGT IPGSP

GSAPGTPGGASNLVRGGGAATS GTAEAASASGGTPGGASNLVRGGG RSN-0093 RSC-0093

GSETPGT APGSP

GSAPGASGGATNLVRGGEIATS GTAEAASASGGASGGATNLVRGGE RSN-0094 RSC-0094

GSETPGT IPGSP

GSAPGGTGGAQNLVRGGPAATS GTAEAASASGGGTGGAQNLVRGGP RSN-0095 RSC-0095

GSETPGT APGSP

GSAPGEAGGAENLVRGGSIATS GTAEAASASGGEAGGAENLVRGGS RSN-0096 RSC-0096

GSETPGT IPGSP

GSAPEAGRSANHEPLGLVATAT GTAEAASASGEAGRSANHEPLGLV RSN-1517 RSC-1517

SGSETPGT ATPGSP

GSAPASGRSTNAGPSGLAGPAT GTAEAASASGASGRSTNAGPSGLA BSRS-A1 BSRS-A1

SGSETPGT GPPGSP

GSAPASGRSTNAGPQGLAGQAT GTAEAASASGASGRSTNAGPQGLA BSRS-A2 BSRS-A2

SGSETPGT GQPGSP

GSAPASGRSTNAGPPGLTGPAT GTAEAASASGASGRSTNAGPPGLT BSRS-A3 BSRS-A3

SGSETPGT GPPGSP

GSAPASSRGTNAGPAGLTGPAT GTAEAASASGASSRGTNAGPAGLT VP-1 VP-1

SGSETPGT GPPGSP

Seqüência de Nome Nome Seqüência de aminoácidos aminoácidos

GSAPASSRTTNTGPSTLTGPAT GTAEAASASGASSRTTNTGPSTLT RSN-1752 RSC-1752

SGSETPGT GPPGSP

GSAPAAGRSDNGTPLELVAPAT GTAEAASASGAAGRSDNGTPLELV RSN-1512 RSC-1512

SGSETPGT APPGSP

GSAPEAGRSANHEPLGLVATAT GTAEAASASGEAGRSANHEPLGLV RSN-1517 RSC-1517

SGSETPGT ATPGSP

GSAPASGRGTNAGPAGLTGPAT GTAEAASASGASGRGTNAGPAGLT VP-2 VP-2

SGSETPGT GPPGSP

GSAPLFGRNDNHEPLELGGGAT GTAEAASASGLFGRNDNHEPLELG RSN-1018 RSC-1018

SGSETPGT GGPGSP

GSAPTAGRSDNLEPLGLVFGAT GTAEAASASGTAGRSDNLEPLGLV RSN-1053 RSC-1053

SGSETPGT FGPGSP

GSAPLDGRSDNFHPPELVAGAT GTAEAASASGLDGRSDNFHPPELV RSN-1059 RSC-1059

SGSETPGT AGPGSP

GSAPLEGRSDNEEPENLVAGAT GTAEAASASGLEGRSDNEEPENLV RSN-1065 RSC-1065

SGSETPGT AGPGSP

GSAPLKGRSDNNAPLALVAGAT GTAEAASASGLKGRSDNNAPLALV RSN-1167 RSC-1167

SGSETPGT AGPGSP

GSAPVYSRGTNAGPHGLTGRAT GTAEAASASGVYSRGTNAGPHGLT RSN-1201 RSC-1201

SGSETPGT GRPGSP

GSAPANSRGTNKGFAGLIGPAT GTAEAASASGANSRGTNKGFAGLI RSN-1218 RSC-1218

SGSETPGT GPPGSP

GSAPASSRLTNEAPAGLTIPAT GTAEAASASGASSRLTNEAPAGLT RSN-1226 RSC-1226

SGSETPGT IPPGSP

GSAPDQSRGTNAGPEGLTDPAT GTAEAASASGDQSRGTNAGPEGLT RSN-1254 RSC-1254

SGSETPGT DPPGSP RSN-1256 GSAPESSRGTNIGQGGLTGPAT RSC-1256 GTAEAASASGESSRGTNIGQGGLT

Seqüência de Nome Nome Seqüência de aminoácidos aminoácidos

SGSETPGT GPPGSP

GSAPSSSRGTNQDPAGLTIPAT GTAEAASASGSSSRGTNQDPAGLT RSN-1261 RSC-1261

SGSETPGT IPPGSP

GSAPASSRGQNHSPMGLTGPAT GTAEAASASGASSRGQNHSPMGLT RSN-1293 RSC-1293

SGSETPGT GPPGSP

GSAPAYSRGPNAGPAGLEGRAT GTAEAASASGAYSRGPNAGPAGLE RSN-1309 RSC-1309

SGSETPGT GRPGSP

GSAPASERGNNAGPANLTGFAT GTAEAASASGASERGNNAGPANLT RSN-1326 RSC-1326

SGSETPGT GFPGSP

GSAPASHRGTNPKPAILTGPAT GTAEAASASGASHRGTNPKPAILT RSN-1345 RSC-1345

SGSETPGT GPPGSP

GSAPMSSRRTNANPAQLTGPAT GTAEAASASGMSSRRTNANPAQLT RSN-1354 RSC-1354

SGSETPGT GPPGSP

GSAPGAGRTDNHEPLELGAAAT GTAEAASASGGAGRTDNHEPLELG RSN-1426 RSC-1426

SGSETPGT AAPGSP

GSAPLAGRSENTAPLELTAGAT GTAEAASASGLAGRSENTAPLELT RSN-1478 RSC-1478

SGSETPGT AGPGSP

GSAPLEGRPDNHEPLALVASAT GTAEAASASGLEGRPDNHEPLALV RSN-1479 RSC-1479

SGSETPGT ASPGSP

GSAPLSGRSDNEEPLALPAGAT GTAEAASASGLSGRSDNEEPLALP RSN-1496 RSC-1496

SGSETPGT AGPGSP

GSAPEAGRTDNHEPLELSAPAT GTAEAASASGEAGRTDNHEPLELS RSN-1508 RSC-1508

SGSETPGT APPGSP

GSAPEGGRSDNHGPLELVSGAT GTAEAASASGEGGRSDNHGPLELV RSN-1513 RSC-1513

SGSETPGT SGPGSP

GSAPLSGRSDNEAPLELEAGAT GTAEAASASGLSGRSDNEAPLELE RSN-1516 RSC-1516

SGSETPGT AGPGSP

Seqüência de Nome Nome Seqüência de aminoácidos aminoácidos

GSAPLGGRADNHEPPELGAGAT GTAEAASASGLGGRADNHEPPELG RSN-1524 RSC-1524

SGSETPGT AGPGSP

GSAPPPSRGTNAEPAGLTGEAT GTAEAASASGPPSRGTNAEPAGLT RSN-1622 RSC-1622

SGSETPGT GEPGSP

GSAPASTRGENAGPAGLEAPAT GTAEAASASGASTRGENAGPAGLE RSN-1629 RSC-1629

SGSETPGT APPGSP

GSAPESSRGTNGAPEGLTGPAT GTAEAASASGESSRGTNGAPEGLT RSN-1664 RSC-1664

SGSETPGT GPPGSP

GSAPASSRATNESPAGLTGEAT GTAEAASASGASSRATNESPAGLT RSN-1667 RSC-1667

SGSETPGT GEPGSP

GSAPASSRGENPPPGGLTGPAT GTAEAASASGASSRGENPPPGGLT RSN-1709 RSC-1709

SGSETPGT GPPGSP

GSAPAASRGTNTGPAELTGSAT GTAEAASASGAASRGTNTGPAELT RSN-1712 RSC-1712

SGSETPGT GSPGSP

GSAPAGSRTTNAGPGGLEGPAT GTAEAASASGAGSRTTNAGPGGLE RSN-1727 RSC-1727

SGSETPGT GPPGSP

GSAPAPSRGENAGPATLTGAAT GTAEAASASGAPSRGENAGPATLT RSN-1754 RSC-1754

SGSETPGT GAPGSP

GSAPESGRAANTGPPTLTAPAT GTAEAASASGESGRAANTGPPTLT RSN-1819 RSC-1819

SGSETPGT APPGSP

GSAPNPGRAANEGPPGLPGSAT GTAEAASASGNPGRAANEGPPGLP RSN-1832 RSC-1832

SGSETPGT GSPGSP

GSAPESSRAANLTPPELTGPAT GTAEAASASGESSRAANLTPPELT RSN-1855 RSC-1855

SGSETPGT GPPGSP

GSAPASGRAANETPPGLTGAAT GTAEAASASGASGRAANETPPGLT RSN-1911 RSC-1911

SGSETPGT GAPGSP RSN-1929 GSAPNSGRGENLGAPGLTGTAT RSC-1929 GTAEAASASGNSGRGENLGAPGLT

Seqüência de Nome Nome Seqüência de aminoácidos aminoácidos

SGSETPGT GTPGSP

GSAPTTGRAANLTPAGLTGPAT GTAEAASASGTTGRAANLTPAGLT RSN-1951 RSC-1951

SGSETPGT GPPGSP

GSAPEAGRSANHTPAGLTGPAT GTAEAASASGEAGRSANHTPAGLT RSN-2295 RSC-2295

SGSETPGT GPPGSP

GSAPESGRAANTTPAGLTGPAT GTAEAASASGESGRAANTTPAGLT RSN-2298 RSC-2298

SGSETPGT GPPGSP

GSAPTTGRATEAANLTPAGLTG GTAEAASASGTTGRATEAANLTPA RSN-2038 RSC-2038

PATSGSETPGT GLTGPPGSP

GSAPTTGRAEEAANLTPAGLTG GTAEAASASGTTGRAEEAANLTPA RSN-2072 RSC-2072

PATSGSETPGT GLTGPPGSP

GSAPTTGRAGEAANLTPAGLTG GTAEAASASGTTGRAGEAANLTPA RSN-2089 RSC-2089

PATSGSETPGT GLTGPPGSP

GSAPTTGRATEAANATPAGLTG GTAEAASASGTTGRATEAANATPA RSN-2302 RSC-2302

PATSGSETPGT GLTGPPGSP

GSAPTTGRAGEAEGATSAGATG GTAEAASASGTTGRAGEAEGATSA RSN-3047 RSC-3047

PATSGSETPGT GATGPPGSP

GSAPTTGEAGEAANATSAGATG GTAEAASASGTTGEAGEAANATSA RSN-3052 RSC-3052

PATSGSETPGT GATGPPGSP

GSAPTTGEAGEAAGLTPAGLTG GTAEAASASGTTGEAGEAAGLTPA RSN-3043 RSC-3043

PATSGSETPGT GLTGPPGSP

GSAPTTGAAGEAANATPAGLTG GTAEAASASGTTGAAGEAANATPA RSN-3041 RSC-3041

PATSGSETPGT GLTGPPGSP

GSAPTTGRAGEAAGLTPAGLTG GTAEAASASGTTGRAGEAAGLTPA RSN-3044 RSC-3044

PATSGSETPGT GLTGPPGSP

GSAPTTGRAGEAANATSAGATG GTAEAASASGTTGRAGEAANATSA RSN-3057 RSC-3057

PATSGSETPGT GATGPPGSP

Seqüência de Nome Nome Seqüência de aminoácidos aminoácidos

GSAPTTGEAGEAAGATSAGATG GTAEAASASGTTGEAGEAAGATSA RSN-3058 RSC-3058

PATSGSETPGT GATGPPGSP

GSAPESGRAANTEPPELGAGAT GTAEAASASGESGRAANTEPPELG RSN-2485 RSC-2485

SGSETPGT AGPGSP

GSAPESGRAANTAPEGLTGPAT GTAEAASASGESGRAANTAPEGLT RSN-2486 RSC-2486

SGSETPGT GPPGSP

GSAPEPGRAANHEPSGLTEGAT GTAEAASASGEPGRAANHEPSGLT RSN-2488 RSC-2488

SGSETPGT EGPGSP

GSAPESGRAANHTGAPPGGLTG GTAEAASASGESGRAANHTGAPPG RSN-2599 RSC-2599

PATSGSETPGT GLTGPPGSP

GSAPTTGRTGEGANATPGGLTG GTAEAASASGTTGRTGEGANATPG RSN-2706 RSC-2706

PATSGSETPGT GLTGPPGSP

GSAPRTGRSGEAANETPEGLEG GTAEAASASGRTGRSGEAANETPE RSN-2707 RSC-2707

PATSGSETPGT GLEGPPGSP

GSAPRTGRTGESANETPAGLGG GTAEAASASGRTGRTGESANETPA RSN-2708 RSC-2708

PATSGSETPGT GLGGPPGSP

GSAPSTGRTGEPANETPAGLSG GTAEAASASGSTGRTGEPANETPA RSN-2709 RSC-2709

PATSGSETPGT GLSGPPGSP

GSAPTTGRAGEPANATPTGLSG GTAEAASASGTTGRAGEPANATPT RSN-2710 RSC-2710

PATSGSETPGT GLSGPPGSP

GSAPRTGRPGEGANATPTGLPG GTAEAASASGRTGRPGEGANATPT RSN-2711 RSC-2711

PATSGSETPGT GLPGPPGSP

GSAPRTGRGGEAANATPSGLGG GTAEAASASGRTGRGGEAANATPS RSN-2712 RSC-2712

PATSGSETPGT GLGGPPGSP

GSAPSTGRSGESANATPGGLGG GTAEAASASGSTGRSGESANATPG RSN-2713 RSC-2713

PATSGSETPGT GLGGPPGSP RSN-2714 GSAPRTGRTGEEANATPAGLPG RSC-2714 GTAEAASASGRTGRTGEEANATPA

Seqüência de Nome Nome Seqüência de aminoácidos aminoácidos

PATSGSETPGT GLPGPPGSP

GSAPATGRPGEPANTTPEGLEG GTAEAASASGATGRPGEPANTTPE RSN-2715 RSC-2715

PATSGSETPGT GLEGPPGSP

GSAPSTGRSGEPANATPGGLTG GTAEAASASGSTGRSGEPANATPG RSN-2716 RSC-2716

PATSGSETPGT GLTGPPGSP

GSAPPTGRGGEGANTTPTGLPG GTAEAASASGPTGRGGEGANTTPT RSN-2717 RSC-2717

PATSGSETPGT GLPGPPGSP

GSAPPTGRSGEGANATPSGLTG GTAEAASASGPTGRSGEGANATPS RSN-2718 RSC-2718

PATSGSETPGT GLTGPPGSP

GSAPTTGRASEGANSTPAPLTE GTAEAASASGTTGRASEGANSTPA RSN-2719 RSC-2719

PATSGSETPGT PLTEPPGSP

GSAPTYGRAAEAANTTPAGLTA GTAEAASASGTYGRAAEAANTTPA RSN-2720 RSC-2720

PATSGSETPGT GLTAPPGSP

GSAPTTGRATEGANATPAELTE GTAEAASASGTTGRATEGANATPA RSN-2721 RSC-2721

PATSGSETPGT ELTEPPGSP

GSAPTVGRASEEANTTPASLTG GTAEAASASGTVGRASEEANTTPA RSN-2722 RSC-2722

PATSGSETPGT SLTGPPGSP

GSAPTTGRAPEAANATPAPLTG GTAEAASASGTTGRAPEAANATPA RSN-2723 RSC-2723

PATSGSETPGT PLTGPPGSP

GSAPTWGRATEPANATPAPLTS GTAEAASASGTWGRATEPANATPA RSN-2724 RSC-2724

PATSGSETPGT PLTSPPGSP

GSAPTVGRASESANATPAELTS GTAEAASASGTVGRASESANATPA RSN-2725 RSC-2725

PATSGSETPGT ELTSPPGSP

GSAPTVGRAPEGANSTPAGLTG GTAEAASASGTVGRAPEGANSTPA RSN-2726 RSC-2726

PATSGSETPGT GLTGPPGSP

GSAPTWGRATEAPNLEPATLTT GTAEAASASGTWGRATEAPNLEPA RSN-2727 RSC-2727

PATSGSETPGT TLTTPPGSP

Seqüência de Nome Nome Seqüência de aminoácidos aminoácidos

GSAPTTGRATEAPNLTPAPLTE GTAEAASASGTTGRATEAPNLTPA RSN-2728 RSC-2728

PATSGSETPGT PLTEPPGSP

GSAPTQGRATEAPNLSPAALTS GTAEAASASGTQGRATEAPNLSPA RSN-2729 RSC-2729

PATSGSETPGT ALTSPPGSP

GSAPTQGRAAEAPNLTPATLTA GTAEAASASGTQGRAAEAPNLTPA RSN-2730 RSC-2730

PATSGSETPGT TLTAPPGSP

GSAPTSGRAPEATNLAPAPLTG GTAEAASASGTSGRAPEATNLAPA RSN-2731 RSC-2731

PATSGSETPGT PLTGPPGSP

GSAPTQGRAAEAANLTPAGLTE GTAEAASASGTQGRAAEAANLTPA RSN-2732 RSC-2732

PATSGSETPGT GLTEPPGSP

GSAPTTGRAGSAPNLPPTGLTT GTAEAASASGTTGRAGSAPNLPPT RSN-2733 RSC-2733

PATSGSETPGT GLTTPPGSP

GSAPTTGRAGGAENLPPEGLTA GTAEAASASGTTGRAGGAENLPPE RSN-2734 RSC-2734

PATSGSETPGT GLTAPPGSP

GSAPTTSRAGTATNLTPEGLTA GTAEAASASGTTSRAGTATNLTPE RSN-2735 RSC-2735

PATSGSETPGT GLTAPPGSP

GSAPTTGRAGTATNLPPSGLTT GTAEAASASGTTGRAGTATNLPPS RSN-2736 RSC-2736

PATSGSETPGT GLTTPPGSP

GSAPTTARAGEAENLSPSGLTA GTAEAASASGTTARAGEAENLSPS RSN-2737 RSC-2737

PATSGSETPGT GLTAPPGSP

GSAPTTGRAGGAGNLAPGGLTE GTAEAASASGTTGRAGGAGNLAPG RSN-2738 RSC-2738

PATSGSETPGT GLTEPPGSP

GSAPTTGRAGTATNLPPEGLTG GTAEAASASGTTGRAGTATNLPPE RSN-2739 RSC-2739

PATSGSETPGT GLTGPPGSP

GSAPTTGRAGGAANLAPTGLTE GTAEAASASGTTGRAGGAANLAPT RSN-2740 RSC-2740

PATSGSETPGT GLTEPPGSP RSN-2741 GSAPTTGRAGTAENLAPSGLTT RSC-2741 GTAEAASASGTTGRAGTAENLAPS

Seqüência de Nome Nome Seqüência de aminoácidos aminoácidos

PATSGSETPGT GLTTPPGSP

GSAPTTGRAGSATNLGPGGLTG GTAEAASASGTTGRAGSATNLGPG RSN-2742 RSC-2742

PATSGSETPGT GLTGPPGSP

GSAPTTARAGGAENLTPAGLTE GTAEAASASGTTARAGGAENLTPA RSN-2743 RSC-2743

PATSGSETPGT GLTEPPGSP

GSAPTTARAGSAENLSPSGLTG GTAEAASASGTTARAGSAENLSPS RSN-2744 RSC-2744

PATSGSETPGT GLTGPPGSP

GSAPTTARAGGAGNLAPEGLTT GTAEAASASGTTARAGGAGNLAPE RSN-2745 RSC-2745

PATSGSETPGT GLTTPPGSP

GSAPTTSRAGAAENLTPTGLTG GTAEAASASGTTSRAGAAENLTPT RSN-2746 RSC-2746

PATSGSETPGT GLTGPPGSP

GSAPTYGRTTTPGNEPPASLEA GTAEAASASGTYGRTTTPGNEPPA RSN-2747 RSC-2747

EATSGSETPGT SLEAEPGSP

GSAPTYSRGESGPNEPPPGLTG GTAEAASASGTYSRGESGPNEPPP RSN-2748 RSC-2748

PATSGSETPGT GLTGPPGSP

GSAPAWGRTGASENETPAPLGG GTAEAASASGAWGRTGASENETPA RSN-2749 RSC-2749

EATSGSETPGT PLGGEPGSP

GSAPRWGRAETTPNTPPEGLET GTAEAASASGRWGRAETTPNTPPE RSN-2750 RSC-2750

EATSGSETPGT GLETEPGSP

GSAPESGRAANHTGAEPPELGA GTAEAASASGESGRAANHTGAEPP RSN-2751 RSC-2751

GATSGSETPGT ELGAGPGSP

GSAPTTGRAGEAANLTPAGLTE GTAEAASASGTTGRAGEAANLTPA RSN-2754 RSC-2754

SATSGSETPGT GLTESPGSP

GSAPTTGRAGEAANLTPAALTE GTAEAASASGTTGRAGEAANLTPA RSN-2755 RSC-2755

SATSGSETPGT ALTESPGSP

GSAPTTGRAGEAANLTPAPLTE GTAEAASASGTTGRAGEAANLTPA RSN-2756 RSC-2756

SATSGSETPGT PLTESPGSP

Seqüência de Nome Nome Seqüência de aminoácidos aminoácidos

GSAPTTGRAGEAANLTPEPLTE GTAEAASASGTTGRAGEAANLTPE RSN-2757 RSC-2757

SATSGSETPGT PLTESPGSP

GSAPTTGRAGEAANLTPAGLTG GTAEAASASGTTGRAGEAANLTPA RSN-2758 RSC-2758

AATSGSETPGT GLTGAPGSP

GSAPTTGRAGEAANLTPEGLTG GTAEAASASGTTGRAGEAANLTPE RSN-2759 RSC-2759

AATSGSETPGT GLTGAPGSP

GSAPTTGRAGEAANLTPEPLTG GTAEAASASGTTGRAGEAANLTPE RSN-2760 RSC-2760

AATSGSETPGT PLTGAPGSP

GSAPTTGRAGEAANLTPAGLTE GTAEAASASGTTGRAGEAANLTPA RSN-2761 RSC-2761

AATSGSETPGT GLTEAPGSP

GSAPTTGRAGEAANLTPEGLTE GTAEAASASGTTGRAGEAANLTPE RSN-2762 RSC-2762

AATSGSETPGT GLTEAPGSP

GSAPTTGRAGEAANLTPAPLTE GTAEAASASGTTGRAGEAANLTPA RSN-2763 RSC-2763

AATSGSETPGT PLTEAPGSP

GSAPTTGRAGEAANLTPEPLTE GTAEAASASGTTGRAGEAANLTPE RSN-2764 RSC-2764

AATSGSETPGT PLTEAPGSP

GSAPTTGRAGEAANLTPEPLTG GTAEAASASGTTGRAGEAANLTPE RSN-2765 RSC-2765

PATSGSETPGT PLTGPPGSP

GSAPTTGRAGEAANLTPAGLTG GTAEAASASGTTGRAGEAANLTPA RSN-2766 RSC-2766

GATSGSETPGT GLTGGPGSP

GSAPTTGRAGEAANLTPEGLTG GTAEAASASGTTGRAGEAANLTPE RSN-2767 RSC-2767

GATSGSETPGT GLTGGPGSP

GSAPTTGRAGEAANLTPEALTG GTAEAASASGTTGRAGEAANLTPE RSN-2768 RSC-2768

GATSGSETPGT ALTGGPGSP

GSAPTTGRAGEAANLTPEPLTG GTAEAASASGTTGRAGEAANLTPE RSN-2769 RSC-2769

GATSGSETPGT PLTGGPGSP RSN-2770 GSAPTTGRAGEAANLTPAGLTE RSC-2770 GTAEAASASGTTGRAGEAANLTPA

Seqüência de Nome Nome Seqüência de aminoácidos aminoácidos

GATSGSETPGT GLTEGPGSP

GSAPTTGRAGEAANLTPEGLTE GTAEAASASGTTGRAGEAANLTPE RSN-2771 RSC-2771

GATSGSETPGT GLTEGPGSP

GSAPTTGRAGEAANLTPAPLTE GTAEAASASGTTGRAGEAANLTPA RSN-2772 RSC-2772

GATSGSETPGT PLTEGPGSP

GSAPTTGRAGEAANLTPEPLTE GTAEAASASGTTGRAGEAANLTPE RSN-2773 RSC-2773

GATSGSETPGT PLTEGPGSP

GSAPTTGRAGEAEGATSAGATG GTAEAASASGTTGRAGEAEGATSA RSN-3047 RSC-3047

PATSGSETPGT GATGPPGSP

GSAPEAGRSAEATSAGATGPAT GTAEAASASGEAGRSAEATSAGAT RSN-2783 RSC-2783

SGSETPGT GPPGSP

GSAPSASGTYSRGESGPGSPAT GTAEAASASGSASGTYSRGESGPG RSN-3107 RSC-3107

SGSETPGT SPPGSP

GSAPSASGEAGRTDTHPGSPAT GTAEAASASGSASGEAGRTDTHPG RSN-3103 RSC-3103

SGSETPGT SPPGSP

GSAPSASGEPGRAAEHPGSPAT GTAEAASASGSASGEPGRAAEHPG RSN-3102 RSC-3102

SGSETPGT SPPGSP

GSAPSPAGESSRGTTIAGSPAT GTAEAASASGSPAGESSRGTTIAG RSN-3119 RSC-3119

SGSETPGT SPPGSP

GSAPTTGEAGEAAGLTPAGLTG GTAEAASASGTTGEAGEAAGLTPA RSN-3043 RSC-3043

PATSGSETPGT GLTGPPGSP

GSAPEAGESAGATPAGLTGPAT GTAEAASASGEAGESAGATPAGLT RSN-2789 RSC-2789

SGSETPGT GPPGSP

GSAPSASGAPLELEAGPGSPAT GTAEAASASGSASGAPLELEAGPG RSN-3109 RSC-3109

SGSETPGT SPPGSP

GSAPSASGEPPELGAGPGSPAT GTAEAASASGSASGEPPELGAGPG RSN-3110 RSC-3110

SGSETPGT SPPGSP

Seqüência de Nome Nome Seqüência de aminoácidos aminoácidos

GSAPSASGEPSGLTEGPGSPAT GTAEAASASGSASGEPSGLTEGPG RSN-3111 RSC-3111

SGSETPGT SPPGSP

GSAPSASGTPAPLTEPPGSPAT GTAEAASASGSASGTPAPLTEPPG RSN-3112 RSC-3112

SGSETPGT SPPGSP

GSAPSASGTPAELTEPPGSPAT GTAEAASASGSASGTPAELTEPPG RSN-3113 RSC-3113

SGSETPGT SPPGSP

GSAPSASGPPPGLTGPPGSPAT GTAEAASASGSASGPPPGLTGPPG RSN-3114 RSC-3114

SGSETPGT SPPGSP

GSAPSASGTPAPLGGEPGSPAT GTAEAASASGSASGTPAPLGGEPG RSN-3115 RSC-3115

SGSETPGT SPPGSP

GSAPSPAGAPEGLTGPAGSPAT GTAEAASASGSPAGAPEGLTGPAG RSN-3125 RSC-3125

SGSETPGT SPPGSP

GSAPSPAGPPEGLETEAGSPAT GTAEAASASGSPAGPPEGLETEAG RSN-3126 RSC-3126

SGSETPGT SPPGSP

GSAPSPTSGQGGLTGPGSEPAT GTAEAASASGSPTSGQGGLTGPGS RSN-3127 RSC-3127

SGSETPGT EPPGSP

GSAPSESAPPEGLETESTEPAT GTAEAASASGSESAPPEGLETEST RSN-3131 RSC-3131

SGSETPGT EPPGSP

GSAPSEGSEPLELGAASETPAT GTAEAASASGSEGSEPLELGAASE RSN-3132 RSC-3132

SGSETPGT TPPGSP

GSAPSEGSGPAGLEAPSETPAT GTAEAASASGSEGSGPAGLEAPSE RSN-3133 RSC-3133

SGSETPGT TPPGSP

GSAPSEPTPPASLEAEPGSPAT GTAEAASASGSEPTPPASLEAEPG RSN-3138 RSC-3138

SGSETPGT SPPGSP

[209] Em outro aspecto, o RS para incorporação nos polipeptídeos recombinantes em questão pode ser projetado para ser seletivamente sensível a fim de ter taxas de clivagem diferentes e eficiências de clivagem diferentes para as várias proteases para as quais são substratos. Na medida em que certa protease pode ser encontrada em concentrações diferentes em tecidos doentes incluindo, sem limitação, um tumor, um câncer sangüíneo ou um tecido inflamatório ou local de inflamação, comparados com tecidos saudáveis ou na circulação, a revelação fornece RSs que tiveram as seqüências de aminoácidos individuais modificadas geneticamente para terem uma eficiência de clivagem maior ou menor para certa protease a fim de assegurar que o polipeptídeo recombinante é preferencialmente convertido da forma de pró-fármaco para a forma ativa (ou seja, pela separação e liberação das porções de ligação e XTEN do polipeptídeo recombinante após clivagem do RS) quando nas proximidades da célula- ou tecido-alvo e suas proteases colocalizadas, comparada com a taxa de clivagem do RS em tecido saudável ou na circulação, de modo que as porções de ligação do fragmento de anticorpo liberadas possuem uma habilidade maior para se ligar aos ligantes nos tecidos doentes, comparada com a forma de pró-fármaco que permanece em circulação. Por esses designs seletivos, o índice terapêutico das composições resultantes pode ser aumentado, resultando em efeitos colaterais reduzidos em relação às terapêuticas convencionais que não incorporam essa ativação sítio-específica.

[210] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “eficiência de clivagem” é definido como o valor log2 da proporção da percentagem do substrato de teste que compreende o RS clivado para uma percentagem do substrato AC1611 clivado de controle quando cada um é submetido à enzima protease em ensaios bioquímicos (mais detalhados nos Exemplos) nos quais a reação é realizada, em que a concentração inicial de substrato é 6 µM, as reações são incubadas a 37°C por 2 horas antes de serem interrompidas por adição de EDTA, com a quantidade de produtos de digestão e substrato não clivado analisado por SDS-PAGE não redutora para estabelecer a proporção da percentagem de clivado. A eficiência de clivagem é calculada do seguinte modo:

[211] Dessa forma, uma eficiência de clivagem de -1 significa que a quantidade de substrato de teste clivada foi de 50%, comparada com aquela do substrato de controle, enquanto uma eficiência de clivagem de +1 significa que a quantidade de substrato de teste clivada foi de 200%, comparada com aquela do substrato de controle. Uma taxa de clivagem maior pela protease em teste em relação ao controle resultaria em uma eficiência de clivagem maior, e uma taxa de clivagem mais lenta pela protease em teste em relação ao controle resultaria em uma eficiência de clivagem menor. Como detalhado nos Exemplos, uma seqüência de RS AC1611 de controle (RSR-1517), que possui a seqüência de aminoácidos EAGRSANHEPLGLVAT, foi estabelecida como tendo uma eficiência de clivagem no nível de base apropriada pelas proteases legumaína, MMP-2, MMP-7, MMP-9, MMP-14, uPA e matriptase, quando testadas em ensaios bioquímicos in vitro para taxas de clivagem pelas proteases individuais. Por substituição seletiva de aminoácidos em localizações individuais nos peptídeos do RS, foram criadas e avaliadas bibliotecas de RS contra o painel das 7 proteases (detalhada com mais detalhes nos Exemplos), resultando em perfis que foram usados para estabelecer diretrizes para substituições de aminoácidos apropriadas a fim de obter RS com eficiências de clivagem desejadas.

Na produção do RS com eficiências de clivagem desejadas, substituições que utilizam os aminoácidos hidrofílicos A, E, G, P, S e T são preferidas; no entanto, outros L-aminoácidos podem ser substituídos em certas posições a fim de ajustar a eficiência de clivagem, desde que o RS retenha pelo menos alguma suscetibilidade à clivagem por uma protease.

Substituições de aminoácidos conservativas em um peptídeo para reter ou efetuar atividade fazem parte dos conhecimentos e capacidades daqueles habilitados na técnica.

Em uma modalidade, a revelação fornece RS no qual o RS é clivado por uma protease selecionada de legumaína, MMP-1, MMP-2, MMP-7, MMP-9, MMP-11, MMP-14, uPA ou matriptase com uma eficiência de clivagem pelo menos 0,2 log2, ou 0,4 log2, ou 0,8 log2, ou 1,0 log2 maior em um ensaio bioquímico competitivo in vitro, comparada com a clivagem pela mesma protease de uma seqüência de controle RSR-1517 que possui a seqüência EAGRSANHEPLGLVAT.

Em outra modalidade, a revelação fornece RS no qual o RS é clivado por uma protease selecionada de legumaína, MMP-1, MMP-2, MMP-7, MMP-9, MMP- 11, MMP-14, uPA ou matriptase com uma eficiência de clivagem pelo menos 0,2 log2, ou 0,4 log2, ou 0,8 log2, ou 1,0 log2 menor em um ensaio bioquímico competitivo in vitro, comparada com a clivagem pela mesma protease de uma seqüência de controle RSR-1517 que possui a seqüência EAGRSANHEPLGLVAT.

Em uma modalidade, a revelação fornece RS no qual a taxa de clivagem do RS por uma protease selecionada de legumaína,

MMP-1, MMP-2, MMP-7, MMP-9, MMP-11, MMP-14, uPA ou matriptase é pelo menos 2 vezes, ou pelo menos 4 vezes, ou pelo menos 8 vezes, ou pelo menos 16 vezes mais rápida, comparada com a seqüência de controle RSR-1517 que possui a seqüência EAGRSANHEPLGLVAT. Em outra modalidade, a revelação fornece RS no qual a taxa de clivagem do RS por uma protease selecionada de legumaína, MMP-1, MMP-2, MMP-7, MMP-9, MMP- 11, MMP-14, uPA ou matriptase é pelo menos 2 vezes, ou pelo menos 4 vezes, ou pelo menos 8 vezes, ou pelo menos 16 vezes mais lenta, comparada com a seqüência de controle RSR-1517 que possui a seqüência EAGRSANHEPLGLVAT.

[212] Em outro aspecto, a revelação fornece AAC que compreende múltiplos RSs em que cada seqüência de RS é selecionada do grupo de seqüências apresentadas na Tabela 1 e os RSs estão ligados uns aos outros por 1 a 6 aminoácidos selecionados de glicina, serina, alanina e treonina. Em uma modalidade, a AAC compreende um primeiro RS e um segundo RS diferente do primeiro RS, em que cada seqüência de RS é selecionada do grupo de seqüências apresentadas na Tabela 1 e os RSs estão ligados uns aos outros por 1 a 6 aminoácidos selecionados de glicina, serina, alanina e treonina. Em outra modalidade, a AAC compreende um primeiro RS, um segundo RS diferente do primeiro RS, e um terceiro RS diferente do primeiro e do segundo RS, em que cada seqüência é selecionada do grupo de seqüências apresentadas na Tabela 1 e o primeiro e o segundo e o terceiro RS estão ligados uns aos outros por 1 a 6 aminoácidos selecionados de glicina, serina, alanina e treonina. Deseja-se especificamente que os múltiplos RSs da AAC possam ser concatenadas para formar uma seqüência que pode ser clivada por múltiplas proteases em taxas ou eficiências de clivagem diferentes. Em outra modalidade, a revelação fornece AAC que compreende um RS1 e um RS2 selecionados do grupo de seqüências apresentadas nas Tabelas 1 e 2 e um XTEN 1 e um XTEN 2 selecionados do grupo de seqüências apresentadas nas Tabelas 8 e 10, em que o RS1 é fundido entre o XTEN1 e as porções de ligação e o RS2 é fundido entre o XTEN2 e as porções de ligação. É contemplado que essas composições seriam mais prontamente clivadas por tecidos-alvo doentes que expressam múltiplas proteases, comparados com tecidos saudáveis ou quando na circulação normal, com o resultado de que os fragmentos resultantes que abrigam as porções de ligação penetrariam mais prontamente no tecido-alvo; por exemplo, um tumor, e possuem uma habilidade aumentada para se ligar e unir a célula-alvo e a célula efetora (ou apenas a célula-alvo, no caso de AAC projetada com uma única porção de ligação. Tabela 3: Proteases de tecidos-alvo. Classe de proteases Protease Meprina Neprilisina (CD10)

PSMA BMP-1 A desintegrina e metaloproteinases (ADAMs) ADAM8 Metaloproteinases ADAM9 ADAM10 ADAM12 ADAM15 ADAM17 (TACE) ADAM19

Classe de proteases Protease

ADAM28 (MDC-L)

ADAM com motivos de trombospondina (ADAMTS)

ADAMTS1

ADAMTS4

ADAMTS5

Matrix Metaloproteinases (MMPs)

MMP-1 (Colagenase 1)

MMP-2 (Gelatinase A)

MMP-3 (m1)

MMP-7 (Matrilisina 1)

MMP-8 (Colagenase 2)

MMP-9 (Gelatinase B)

MMP-10 (Estromelisina 2)

MMP-11(Estromelisina 3)

MMP-12 (elastase de macrófago)

MMP-13 (Colagenase 3)

MMP-14 (MT1-MMP)

MMP-15 (MT2-MMP)

MMP-19

MMP-23 (CA-MMP)

MMP-24 (MT5-MMP)

MMP-26 (Matrilisina 2)

MMP-27 (CMMP)

Legumaína

Cisteína-catepsinas

Cisteína-proteases Catepsina B

Catepsina C

Catepsina K

Classe de proteases Protease

Catepsina L

Catepsina S

Catepsina X

Catepsina D

Aspartato -proteases Catepsina E

Secretase

Uroquinase (uPA)

Ativador de plasminogênio do tipo tecidual (tPA)

Plasmina

Trombina

Antígeno específico da próstata (PSA, KLK3)

Elastase de neutrófilo humano (HNE)

Elastase

Triptase

Serina-proteases transmembrana Tipo II (TTSPs)

DESC1

Hepsina (HPN) Serina-proteases Matriptase

Matriptase-2

TMPRSS2

TMPRSS3

TMPRSS4 (CAP2)

Proteína de ativação de fibroblasto (FAP)

Peptidase relacionada à calicreína (família KLK)

KLK4

KLK5

KLK6

KLK7

Classe de proteases Protease KLK8 KLK10 KLK11 KLK13 KLK14

[213] Os RSs da revelação são úteis para inclusão em polipeptídeos recombinantes como produtos terapêuticos para o tratamento de cânceres, doenças autoimunes, doenças inflamatórias e outras condições nas quais a ativação localizada do polipeptídeo recombinante é desejável. As composições em questão abordam uma necessidade não atendida e são superiores em um ou mais aspectos, incluindo meia-vida terminal aumentada, liberação direcionada e proporção terapêutica aumentada com toxicidade reduzida para os tecidos saudáveis, comparados com produtos terapêuticos de anticorpo ou produtos terapêuticos de anticorpo biespecífico convencionais que são ativos mediante injeção. IV. Porções de ligação

[214] Em outro aspecto, a revelação fornece polipeptídeos recombinantes que compreendem uma primeira porção de ligação (FBM) que possui afinidade de ligação específica para um ligante. Em uma modalidade, a porção de ligação é selecionada de um anticorpo, uma citocina, uma interleucina, uma quimiocina, ou um fragmento destes. Em outra modalidade, a porção de ligação é um receptor celular ou um fragmento destes. Em outra modalidade, a porção de ligação é um fragmento de anticorpo que possui afinidade de ligação para um receptor celular ou marcador de célula-alvo.

[215] Em algumas modalidades, a revelação fornece polipeptídeos recombinantes que são AACs que compreendem uma primeira porção de ligação (FBM) e uma segunda porção de ligação (SBM), cada uma tendo afinidade de ligação específica para a seus respectivos ligantes.

Em algumas modalidades, as AACs compreendem uma primeira e uma segunda porção de ligação, cada uma delas sendo fragmentos de anticorpo.

Nessas composições, uma porção de ligação dirigida contra um marcador de célula-alvo de uma tecido doente é usada em combinação com uma segunda porção de ligação dirigida para uma célula efetora marcador; dessa forma, ela é bifuncional.

Como usado nesse relatório descritivo, o fragmento de anticorpo é um fragmento de anticorpo que contém um domínio de ligação ao antígeno que é capaz de ligação, especialmente ligação específica, a um ligante-alvo de interesse.

Nessas modalidades, o fragmento de anticorpo pode ser, sem limitação, regiões variáveis ou hipervariáveis de cadeias leves e/ou pesadas de um anticorpo (VL, VH), fragmentos variáveis (Fv), fragmentos Fab’, fragmentos F(ab’)2, fragmentos Fab, anticorpos de cadeia única (scAb), fragmento variável de cadeia única (scFv), anticorpos lineares, um anticorpo de domínio único, regiões determinantes de complementaridade (CDR), anticorpos de domínio (dAbs), imunoglobulinas de cadeia pesada de domínio único do tipo BHH ou BNAR, imunoglobulinas de cadeia leve de domínio único, ou outros polipeptídeos conhecidos na técnica que contêm um fragmento de anticorpo capaz de ligação a proteínas ou epitopos-alvo on proteínas-alvo associadas a uma célula-alvo ou efetora.

A VL e VH dos fragmentos de anticorpo também podem ser configuradas em uma configuração de diabody de cadeia única.

Em uma modalidade, a primeira das duas porções de ligação do polipeptídeo contém um fragmento de anticorpo direcionado a um ligante da célula efetora (por exemplo, sem limitação CD3, CD16, TCRa, TCRp, CD28 e semelhantes) e a segunda porção de ligação contém um fragmento de anticorpo que possui um domínio de direcionamento a uma doença (por exemplo, um marcador de célula-alvo produzido por um tecido ou célula doente).

[216] A origem dos fragmentos de anticorpo contemplados pela revelação pode ser derivada de um anticorpo de ocorrência natural ou fragmento deste, um anticorpo de ocorrência não natural ou fragmento deste, um anticorpo humanizado ou fragmento deste, um anticorpo sintético ou fragmento deste, um anticorpo híbrido ou fragmento deste, ou um anticorpo modificado geneticamente ou fragmento deste. Métodos para a geração de um anticorpo para certo marcador- alvo são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser feitos usando o método de hibridoma primeiro descrito por Kohler e cols., Nature, 256: 495 (1975), ou podem ser feitos por métodos de DNA recombinante (Patente U.S. Nº 4.816.567). A estrutura de anticorpos e fragmentos destes, regiões variáveis de cadeias pesadas e leves de um anticorpo (VH e VL), regiões variáveis de cadeia única (scFv), regiões determinantes de complementaridade (CDR) e anticorpos de domínio (dAbs) são bem compreendidos. Métodos para a geração de um polipeptídeo que possui uma porção de ligação ao antígeno desejada de um marcador de célula-alvo são conhecidos na técnica.

[217] Anticorpos monoclonais terapêuticos dos quais domínios VL e VH e CDR podem ser derivados para as composições em questão são conhecidos na técnica. Esse anticorpos terapêuticos incluem, sem limitação, rituximab, IDEC/Genentech/Roche (veja, por exemplo, a Patente U.S. Nº

5.736.137), um anticorpo anti-CD20 quimérico usado no tratamento de muitos linfomas, leucemias e alguns distúrbios autoimunes; ofatumumab, um anticorpo anti-CD20 aprovado para uso para leucemia linfocítica crônica, e sob desenvolvimento para linfoma folicular não-Hodgkin, linfoma difuso de grandes células B, artrite reumatóide e esclerose múltipla remintente recorrente, sendo desenvolvido por GlaxoSmithKline; lucatumumab (HCD122), um anticorpo anti- CD40 desenvolvido por Novartis para linfoma não-Hodgkin ou de Hodgkin (veja, por exemplo, a Patente U.S. Nº 6.899.879), AME-133, um anticorpo desenvolvido por Applied Molecular Evolution que se liga às células que expressam CD20 para tratar linfoma não-Hodgkin, veltuzumab (hA20), um anticorpo desenvolvido por Immunomedics, Inc. que se liga às células que expressam CD20 para tratar púrpura trombocitopênica imune, HumaLYM desenvolvido por Intracel para o tratamento de linfoma de célula B de baixo grau, e ocrelizumab, desenvolvido por Genentech que é um anticorpo monoclonal anti-CD20 para o tratamento de artrite reumatóide (veja, por exemplo, o Pedido de Patente U.S. 20090155257), trastuzumab (veja, por exemplo, a Patente U.S. Nº 5.677.171), um anticorpo anti-HER2/neu humanizado aprovado para tratar câncer de mama desenvolvido por Genentech; pertuzumab, um anticorpo inibidor de dimerização anti-HER2 desenvolvido por Genentech no tratamento de cânceres de próstata, mama e ovarianos; (veja, por exemplo, a Patente U.S. Nº 4.753.894); cetuximab, um anticorpo anti-EGFR usado para tratar câncer cólon-retal metastático e câncer de cabeça e pescoço que expressam receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), KRAS do tipo selvagem, desenvolvido por Imclone e BMS (veja a Patente U.S. Nº 4.943.533; PCT WO 96/40210); panitumumab, um anticorpo monoclonal totalmente humano específico para o receptor do fator de crescimento epidérmico (também conhecido como receptor de EGF, EGFR, ErbB-1 e HER1, atualmente comercializado por Amgen para o tratamento de câncer cólon-retal metastático (veja a Patente U.S. Nº

6.235.883); zalutumumab, um anticorpo monoclonal IgG1 totalmente humano desenvolvido por Genmab que é dirigido ao receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) para o tratamento de carcinoma de célula escamosa da cabeça e pescoço (veja, por exemplo, a Patente U.S. Nº 7.247.301); nimotuzumab, um anticorpo quimérico para EGFR desenvolvido por Biocon, YM Biosciences, Cuba, e Oncosciences, Europa) no tratamento de carcinomas de célula escamosa da cabeça e pescoço, câncer nasofaríngeo e glioma (veja, por exemplo, a Patente U.S. Nº 5.891.996; Patente U.S. Nº 6.506.883); matuzumab, um anticorpo monoclonal humanizado que é dirigido ao receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) que foi desenvolvido por Takeda Pharmaceutical para o tratamento de câncer cólon-retal, de pulmão, esofágico e do estômago (veja, por exemplo, o Pedido de Patente U.S. 20090175858A1); cetuximab, um anticorpo monoclonal quimérico (camundongo/humano) que é dirigido ao receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) usado para o tratamento de câncer cólon-retal metastático, câncer de pulmão de célula não-pequena metastático e câncer de cabeça e pescoço, que foi desenvolvido por Bristol-Myers Squibb e Merck KGaA (veja, por exemplo, a Patente U.S. Nª 6.217.866); alemtuzumab, um anticorpo monoclonal humanizado para CD52 comercializado por Bayer Schering Pharma para o tratamento de leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma de célula T cutâneo (CTCL) e linfoma de célula T; muromonab-CD3, um anticorpo anti-CD3 desenvolvido por Ortho Biotech/Johnson & Johnson usado como um biológico imunossupressor administrado para reduzir rejeição aguda em pacientes com transplantes de órgãos; ibritumomab tiuxetan, um anticorpo monoclonal anti-CD20 desenvolvido por IDEC/Schering AG como tratamento para algumas formas de linfoma de célula B não-Hodgkin; gemtuzumab ozogamicina, um anticorpo anti-CD33 (proteína p67) ligado ao quelante citotóxico tiuxetan, ao qual um isótopo radioativo está anexado, desenvolvido por Celltech/Wyeth e usado para tratar leucemia mielógena aguda; ABX-CBL, um anticorpo anti- CD147 desenvolvido por Abgenix; ABX-IL8, um anticorpo anti- IL8 desenvolvido por Abgenix, ABX-MA1, um anticorpo anti- MUC18 desenvolvido por Abgenix, Pemtumomab (R1549, 90Y- muHMFG1), um anticorpo anti-MUC1 em desenvolvimento por Antisoma, Therex (R1550), um anticorpo anti-MUC1 desenvolvido por Antisoma, AngioMab (AS1405), desenvolvido por Antisoma, HuBC-1, desenvolvido por Antisoma, Tioplatina (AS1407) desenvolvido por Antisoma, ANTEGREN (natalizumab), um anticorpo anti-alfa-4-beta-1 (VLA4) e alfa-4-beta-7 desenvolvido por Biogen, VLA-1 mAb, um anticorpo anti- integrina VLA-1 desenvolvido por Biogen, LTBR mAb, um anticorpo anti-receptor de linfotoxina beta (LTBR) desenvolvido por Biogen, CAT-152, um anticorpo anti-TGF-β2 desenvolvido por Cambridge Antibody Technology, J695, um anticorpo anti-IL-12 desenvolvido por Cambridge Antibody Technology e Abbott, CAT-192, um anticorpo anti-TGFβ1 desenvolvido por Cambridge Antibody Technology e Genzyme, CAT-213, um anticorpo anti-Eotaxina 1 desenvolvido por Cambridge Antibody Technology, LYMPHOSTAT-B, um anticorpo anti-Blys desenvolvido por Cambridge Antibody Technology e Human Genome Sciences Inc., TRAIL-R1mAb, um anticorpo anti- TRAIL-R1 desenvolvido por Cambridge Antibody Technology e Human Genome Sciences, Inc.; Herceptin, um anticorpo anti- família do receptor HER desenvolvido por Genentech; Anti- Fator Tecidual (ATF), um anticorpo anti-Fator Tecidual desenvolvido por Genentech; Xolair (Omalizumab), um anticorpo anti-IgE desenvolvido por Genentech, Anticorpo MLN-02 (anteriormente LDP-02), desenvolvido por Genentech e Millennium Pharmaceuticals; HuMax CD4®, um anticorpo anti- CD4 desenvolvido por Genmab; tocilizumab, e um anticorpo anti-IL6R desenvolvido por Chugai; HuMax-IL15, um anticorpo anti-IL15 desenvolvido por Genmab e Amgen, HuMax-Inflam, desenvolvido por Genmab e Medarex; HuMax-Cancer, um anticorpo anti-Heparanase I desenvolvido por Genmab e Medarex e Oxford GlycoSciences; HuMax-Lymphoma, desenvolvido por Genmab e Amgen, HuMax-TAC, desenvolvido por Genmab; IDEC- 131, um anticorpo anti-CD40L desenvolvido por IDEC Pharmaceuticals; IDEC-151 (Clenoliximab), um anticorpo anti- CD4 desenvolvido por IDEC Pharmaceuticals; IDEC-114, um anticorpo anti-CD80 desenvolvido por IDEC Pharmaceuticals; IDEC-152, um anticorpo anti-CD23 desenvolvido por IDEC Pharmaceuticals; um anticorpo anti-KDR desenvolvido por Imclone, DC101, um anticorpo anti-flk-1 desenvolvido por Imclone; anticorpos anti-caderina VE desenvolvidos por Imclone; CEA-CIDE (labetuzumab), um anticorpo anti-antígeno carcinoembrionário (CEA) desenvolvido por Immunomedics;

Yervoy (ipilimumab), um anticorpo anti-CTLA4 desenvolvido por Bristol-Myers Squibb no tratamento de melanoma; Lumphocide® (Epratuzumab), um anticorpo anti-CD22 desenvolvido por Immunomedics, AFP-Cide, desenvolvido por Immunomedics; MyelomaCide, desenvolvido por Immunomedics; Lk°Cide, desenvolvido por Immunomedics; ProstaCide, desenvolvido por Immunomedics; MDX-010, um anticorpo anti- CTLA4 desenvolvido por Medarex; MDX-060, um anticorpo anti- CD30 desenvolvido por Medarex; MDX-070 desenvolvido por Medarex; MDX-018 desenvolvido por Medarex; OSIDEM (IDM-1), um anticorpo anti-HER2 desenvolvido por Medarex e Immuno- Designed Molecules; HuMax®-CD4, um anticorpo anti-CD4 desenvolvido por Medarex e Genmab; HuMax-IL15, um anticorpo anti-IL15 desenvolvido por Medarex e Genmab; anticorpos anti-molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1) (CD54) desenvolvidos por MorphoSys, MOR201; tremelimumab, um anticorpo anti-CTLA-4 desenvolvido por Pfizer; visilizumab, um anticorpo anti-CD3 desenvolvido por Protein Design Labs; Anti-Integrina 5β1, desenvolvido por Protein Design Labs; anti-IL-12, desenvolvido por Protein Design Labs; ING-1, um anticorpo anti-Ep-CAM desenvolvido por Xoma; e MLN01, um anticorpo anti-integrina Beta2 desenvolvido por Xoma; todas as referências dos anticorpos citados acima nesse parágrafo são expressamente incorporadas nesse relatório descritivo por referência.

As seqüências para os anticorpos acima podem ser obtidas de bases de dados disponíveis publicamente, patentes ou referências da literatura.

Além disso, exemplos não limitantes de anticorpos monoclonais e seqüências VH e VL (e, em alguns casos, com seqüências CDR indicadas) de anticorpos anti-CD3 são apresentados na Tabela 4 e exemplos não limitantes de anticorpos monoclonais e seqüências VH e VL (e, em alguns casos, com seqüências CDR indicadas) para marcadores de células de câncer, tumor ou células-alvo são apresentados na Tabela 5.

[218] Em certos casos, as regiões determinantes de complementaridade da cadeia pesada e/ou da cadeia leve para o fragmento de anticorpo dirigido às células efetoras a serem incorporadas nas composições AAC em questão são derivadas de anticorpos anti-CD3 conhecidos como, por exemplo, muromonab- CD3 (OKT3), otelixizumab (TRX4), teplizumab (MGA031), visilizumab (Nuvion), SP-34 ou I2C, TR-66 ou X35-3, VIT3, BMA030 (BW264/56), CLB-T3/3, CRIS7, YTH12.5, Fl 11-409, CLB- T3.4.2, TR-66, WT32, SPv-T3b, 11D8, XIII-141, XIII-46, XIII- 87, 12F6, T3/RW2-8C8, T3/RW2-4B6, OKT3D, M-T301, SMC2, F101.01, UCHT-1 e WT-31. Em algumas modalidades, a porção de ligação da célula efetora da AAC em questão é um fragmento de anticorpo de cadeia única que compreende uma seqüência VL e VH pareadas como apresentadas na Tabela 4. Na modalidade apresentada anteriormente, as VL e VH estão ligadas por ligantes longos de aminoácidos hidrofílicos selecionados das seqüências apresentadas na Tabela 6 e os scFvs estão ligados juntos por um ligante curto de aminoácidos hidrofílicos selecionado do grupo de seqüências apresentadas na Tabela 7. Em uma modalidade, o ligante longo usado para ligar as VL e VH é L7 da Tabela 6 e o ligante intermolecular que funde os dois scFvs é S-1 ou S-2 da Tabela 7. Em outra modalidade, a revelação fornece composições AAC que compreendem um diabody de cadeia única no qual, após enovelamento, o primeiro domínio (VL ou VH) é pareado com o último domínio (VH ou VL) para formar um scFv e os dois domínios no meio são pareados para formar o outro scFv no qual o primeiro e segundo domínios, bem como o terceiro e último domínios, são fundidos juntos por um ligante curto de aminoácidos hidrofílicos selecionado das seqüências apresentadas na Tabela 7 e o segundo e o terceiro domínios variáveis são fundidos por um ligante longo selecionado da Tabela 6. Como será observado por aqueles habilitados na técnica, a seleção do ligante curto e do ligante longo visa evitar o pareamento incorreto de domínios variáveis adjacentes facilitando, dessa forma, a formação da configuração de diabody de cadeia única que compreende as VL e VH da primeira porção de ligação e da segunda porção de ligação. Tabela 4: Anticorpos monoclonais anti-CD3 e seqüências. Nome do Nome do Alvo Seqüência VH Seqüência VL clone anticorpo

QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLS DIQMTQSPSSLSASVGDRVT CKASGYTFTRYTMHWVRQAPG ITCSASSSVSYMNWYQQTPG

KGLEWIGYINPSRGYTNYNQK KAPKRWIYDTSKLASGVPSR huOKT3 CD3

VKDRFTISRDNSKNTAFLQMD FSGSGSGTDYTFTISSLQPE SLRPEDTGVYFCARYYDDHYC DIATYYCQQWSSNPFTFGQG LDYWGQGTPVTVSS TKLQITR EVQLVESGGGLVQPGGSLRLS DIQMTQSPSSLSASVGDRVT CAASGYSFTGYTMNWVRQAPG ITCRASQDIRNYLNWYQQKP

KGLEWVALINPYKGVSTYNQK GKAPKLLIYYTSRLESGVPS huUCHT1 CD3

FKDRFTISVDKSKNTAYLQMN RFSGSGSGTDYTLTISSLQP SLRAEDTAVYYCARSGYYGDS EDFATYYCQQGNTLPWTFGQ DWYFDVWGQGTLVTVSS GTKVEIK

QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLS DIQMTQSPSSLSASVGDRVT hu12F6 CD3 CKASGYTFTSYTMHWVRQAPG MTCRASSSVSYMHWYQQTPG

KGLEWIGYINPSSGYTKYNQK KAPKPWIYATSNLASGVPSR

Nome do Nome do Alvo Seqüência VH Seqüência VL clone anticorpo

FKDRFTISADKSKSTAFLQMD FSGSGSGTDYTLTISSLQPE SLRPEDTGVYFCARWQDYDVY DIATYYCQQWSSNPPTFGQG FDYWGQGTPVTVSS TKLQITR QVQLQQSGAELARPGASVKMS QIVLTQSPAIMSASPGEKVT CKASGYTFTRYTMHWVKQRPG MTCSASSSVSYMNWYQQKSG

QGLEWIGYINPSRGYTNYNQK TSPKRWIYDTSKLASGVPAH mOKT3 CD3

FKDKATLTTDKSSSTAYMQLS FRGSGSGTSYSLTISGMEAE SLTSEDSAVYYCARYYDDHYC DAATYYCQQWSSNPFTFGSG LDYWGQGTTLTVSS TKLEINR DIKLQQSGAELARPGASVKMS DIQLTQSPAIMSASPGEKVT

CKTSGYTFTRYTMHWVKQRPG MTCRASSSVSYMNWYQQKSG Blina- QGLEWIGYINPSRGYTNYNQK TSPKRWIYDTSKVASGVPYR MT103 CD3 tumomab FKDKATLTTDKSSSTAYMQLS FSGSGSGTSYSLTISSMEAE

SLTSEDSAVYYCARYYDDHYC DAATYYCQQWSSNPLTFGAG LDYWGQGTTLTVSS TKLELK DVQLVQSGAEVKKPGASVKVS DIVLTQSPATLSLSPGERAT CKASGYTFTRYTMHWVRQAPG LSCRASQSVSYMNWYQQKPG

QGLEWIGYINPSRGYTNYADS KAPKRWIYDTSKVASGVPAR MT110 solitomab CD3

VKGRFTITTDKSTSTAYMELS FSGSGSGTDYSLTINSLEAE SLRSEDTATYYCARYYDDHYC DAATYYCQQWSSNPLTFGGG LDYWGQGTTVTVSS TKVEIK EVQLVESGGGLVQPGGSLKLS QTVVTQEPSLTVSPGGTVTL CAASGFTFNKYAMNWVRQAPG TCGSSTGAVTSGYYPNWVQQ

KGLEWVARIRSKYNNYATYYA KPGQAPRGLIGGTKFLAPGT CD3.7 CD3

DSVKDRFTISRDDSKNTAYLQ PARFSGSLLGGKAALTLSGV MNNLKTEDTAVYYCVRHGNFG QPEDEAEYYCALWYSNRWVF

NSYISYWAYWGQGTLVTVSS GGGTKLTVL CD3.8 CD3 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLS QAVVTQEPSLTVSPGGTVTL

Nome do Nome do Alvo Seqüência VH Seqüência VL clone anticorpo

CAASGFTFNTYAMNWVRQAPG TCGSSTGAVTTSNYANWVQQ KGLEWVGRIRSKYNNYATYYA KPGQAPRGLIGGTNKRAPGV DSVKGRFTISRDDSKNTLYLQ PARFSGSLLGGKAALTLSGA MNSLRAEDTAVYYCVRHGNFG QPEDEAEYYCALWYSNLWVF NSYVSWFAYWGQGTLVTVSS GGGTKLTVL EVQLLESGGGLVQPGGSLKLS ELVVTQEPSLTVSPGGTVTL CAASGFTFNTYAMNWVRQAPG TCRSSTGAVTTSNYANWVQQ

KGLEWVARIRSKYNNYATYYA KPGQAPRGLIGGTNKRAPGT CD3.9 CD3

DSVKDRFTISRDDSKNTAYLQ PARFSGSLLGGKAALTLSGV MNNLKTEDTAVYYCVRHGNFG QPEDEAEYYCALWYSNLWVF NSYVSWFAYWGQGTLVTVSS GGGTKLTVL EVKLLESGGGLVQPKGSLKLS QAVVTQESALTTSPGETVTL CAASGFTFNTYAMNWVRQAPG TCRSSTGAVTTSNYANWVQE

KGLEWVARIRSKYNNYATYYA KPDHLFTGLIGGTNKRAPGV CD3.10 CD3

DSVKDRFTISRDDSQSILYLQ PARFSGSLIGDKAALTITGA MNNLKTEDTAMYYCVRHGNFG QTEDEAIYFCALWYSNLWVF

NSYVSWFAYWGQGTLVTVSS GGGTKLTVL * seqüências sublinhadas, se presentes, são CDRs dentro da VL e VH. Tabela 5: Anticorpos monoclonais anti-célula-alvo e Seqüências. Nome Nome do Marcador de Seqüência VH Seqüência VL comercial anticorpo célula-alvo

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTI

CKASGFNIKDTYIHWVRQAPG TCKTSQDINKYMAWYQQTPGK Integrina Tysabri™ Natalizumab QRLEWMGRIDPANGYTKYDPK APRLLIHYTSALQPGIPSRFS alfa 4

FQGRVTITADTSASTAYMELS GSGSGRDYTFTISSLQPEDIA SLRSEDTAVYYCAREGYYGNY TYYCLQYDNLWTFGQGTKVEI

Nome Nome do Marcador de Seqüência VH Seqüência VL comercial anticorpo célula-alvo

GVYAMDYWGQGTLVTVSS K EVQLVESGGGLVQPGGSLRLS EIVLTQSPGTLSLSPGERATL CAASGFTFSSYDIHWVRQATG SCRASQSVSSTYLAWYQQKPG

KGLEWVSAIGPAGDTYYPGSV QAPRLLIYGASSRATGIPDRF REGN910 Nesvacumab Ang2

KGRFTISRENAKNSLYLQMNS SGSGSGTDFTLTISRLEPEDF LRAGDTAVYYCARGLITFGGL AVYYCQHYDNSQTFGQGTKVE IAPFDYWGQGTLVTVSS IK QVKLEQSGAEVVKPGASVKLS ENVLTQSPSSMSASVGDRVNI CKASGFNIKDSYMHWLRQGPG ACSASSSVSYMHWFQQKPGKS

QRLEWIGWIDPENGDTEYAPK PKLWIYSTSNLASGVPSRFSG hMFE23 CEA

FQGKATFTTDTSANTAYLGLS SGSGTDYSLTISSMQPEDAAT SLRPEDTAVYYCNEGTPTGPY YYCQQRSSYPLTFGGGTKLEI YFDYWGQGTLVTVSS K EVQLVESGGGLVQPGGSLRLS DIQLTQSPSSLSASVGDRVTI

CAASGFNIKDTYMHWVRQAPG TCRAGESVDIFGVGFLHWYQQ M5A (T84.66 KGLEWVARIDPANGNSKYADS KPGKAPKLLIYRASNLESGVP

CEA humanizado) VKGRFTISADTSKNTAYLQMN SRFSGSGSRTDFTLTISSLQP

SLRAEDTAVYYCAPFGYYVSD EDFATYYCQQTNEDPYTFGQG YAMAYWGQGTLVTVSS TKVEIK EVQLVESGGGLVQPGGSLRLS DIQLTQSPSSLSASVGDRVTI

CAASGFNIKDTYMHWVRQAPG TCRAGESVDIFGVGFLHWYQQ M5B

KGLEWVARIDPANGNSKYVPK KPGKAPKLLIYRASNLESGVP (T84.66 CEA

FQGRATISADTSKNTAYLQMN SRFSGSGSRTDFTLTISSLQP humanizado)

SLRAEDTAVYYCAPFGYYVSD EDFATYYCQQTNEDPYTFGQG YAMAYWGQGTLVTVSS TKVEIK

EVQLVESGGGVVQPGRSLRLS DIQLTQSPSSLSASVGDRVTI CEA-Cide Labetuzumab CEACAM5 CSASGFDFTTYWMSWVRQAPG TCKASQDVGTSVAWYQQKPGK (MN-14)

KGLEWIGEIHPDSSTINYAPS APKLLIYWTSTRHTGVPSRFS

LKDRFTISRDNAKNTLFLQMD GSGSGTDFTFTISSLQPEDIA SLRPEDTGVYFCASLYFGFPW TYYCQQYSLYRSFGQGTKVEI FAYWGQGTPVTVSS K EVKLVESGGGLVQPGGSLRLS QTVLSQSPAILSASPGEKVTM CATSGFTFTDYYMNWVRQPPG TCRASSSVTYIHWYQQKPGSS

KALEWLGFIGNKANGYTTEYS PKSWIYATSNLASGVPARFSG CEA-Scan Arcitumomab CEACAM5

ASVKGRFTISRDKSQSILYLQ SGSGTSYSLTISRVEAEDAAT MNTLRAEDSATYYCTRDRGLR YYCQHWSSKPPTFGGGTKLEI FYFDYWGQGTTLTVSS KR EVQLVESGGGLVQPGRSLRLS QAVLTQPASLSASPGASASLT CAASGFTVSSYWMHWVRQAPG CTLRRGINVGAYSIYWYQQKP

KGLEWVGFIRNKANGGTTEYA GSPPQYLLRYKSDSDKQQGSG MT110 CEACAM5

ASVKGRFTISRDDSKNTLYLQ VSSRFSASKDASANAGILLIS MNSLRAEDTAVYYCARDRGLR GLQSEDEADYYCMIWHSGASA FYFDYWGQGTTVTVSS VFGGGTKLTVL QVQLQQSGAELVRPGSSVKIS DIQLTQSPASLAVSLGQRATI

CKASGYAFSSYWMNWVKQRPG SCKASQSVDYDGDSYLNWYQQ Blinatumo- QGLEWIGQIWPGDGDTNYNGK IPGQPPKLLIYDASNLVSGIP MT103 CD19 mab FKGKATLTADESSSTAYMQLS PRFSGSGSGTDFTLNIHPVEK

SLASEDSAVYFCARRETTTVG VDAATYHCQQSTEDPWTFGGG RYYYAMDYWGQGTTVTVSS TKLEIK EVQLVESGGGLVQPGRSLRLS EIVLTQSPATLSLSPGERATL CAASGFTFNDYAMHWVRQAPG SCRASQSVSSYLAWYQQKPGQ

KGLEWVSTISWNSGSIGYADS APRLLIYDASNRATGIPARFS Arzerra Ofatumumab CD20

VKGRFTISRDNAKKSLYLQMN GSGSGTDFTLTISSLEPEDFA SLRAEDTALYYCAKDIQYGNY VYYCQQRSNWPITFGQGTRLE

YYGMDVWGQGTTVTVSS IK Bexxar™ Tositumomab CD20 QAYLQQSGAELVRPGASVKMS QIVLSQSPAILSASPGEKVTM

CKASGYTFTSYNMHWVKQTPR TCRASSSVSYMHWYQQKPGSS QGLEWIGAIYPGNGDTSYNQK PKPWIYAPSNLASGVPARFSG FKGKATLTVDKSSSTAYMQLS SGSGTSYSLTISRVEAEDAAT SLTSEDSAVYFCARVVYYSNS YYCQQWSFNPPTFGAGTKLEL YWYFDVWGTGTTVTVSG K QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVS DIVMTQTPLSLPVTPGEPASI

CKASGYAFSYSWINWVRQAPG SCRSSKSLLHSNGITYLYWYL Obinutuzu- QGLEWMGRIFPGDGDTDYNGK QKPGQSPQLLIYQMSNLVSGV CD20 GAZYVA mab FKGRVTITADKSTSTAYMELS PDRFSGSGSGTDFTLKISRVE

SLRSEDTAVYYCARNVFDGYW AEDVGVYYCAQNLELPYTFGG LVYWGQGTLVTVSS GTKVEIK EVQLVESGGGLVQPGGSLRLS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTI

CAASGYTFTSYNMHWVRQAPG TCRASSSVSYMHWYQQKPGKA Ocrelizumab KGLEWVGAIYPGNGDTSYNQK PKPLIYAPSNLASGVPSRFSG CD20 / 2H7 v16 FKGRFTISVDKSKNTLYLQMN SGSGTDFTLTISSLQPEDFAT

SLRAEDTAVYYCARVVYYSNS YYCQQWSFNPPTFGQGTKVEI YWYFDVWGQGTLVTVSS K QVQLQQPGAELVKPGASVKMS QIVLSQSPAILSASPGEKVTM CKASGYTFTSYNMHWVKQTPG TCRASSSVSYIHWFQQKPGSS

RGLEWIGAIYPGNGDTSYNQK PKPWIYATSNLASGVPVRFSG Rituxan™ Rituximab CD20

FKGKATLTADKSSSTAYMQLS SGSGTSYSLTISRVEAEDAAT SLTSEDSAVYYCARSTYYGGD YYCQQWTSNPPTFGGGTKLEI WYFNVWGAGTTVTVSA K QAYLQQSGAELVRPGASVKMS QIVLSQSPAILSASPGEKVTM

CKASGYTFTSYNMHWVKQTPR TCRASSSVSYMHWYQQKPGSS Ibritumomab Zevalin™ CD20 QGLEWIGAIYPGNGDTSYNQK PKPWIYAPSNLASGVPARFSG tieuxetan

FKGKATLTVDKSSSTAYMQLS SGSGTSYSLTISRVEAEDAAT SLTSEDSAVYFCARVVYYSNS YYCQQWSFNPPTFGAGTKLEL

YWYFDVWGTGTTVTVSA K QLVQSGAEVKKPGSSVKVSCK DIQLTQSPSTLSASVGDRVTI

ASGYTITDSNIHWVRQAPGQS TCRASESLDNYGIRFLTWFQQ Gemtuzumab LEWIGYIYPYNGGTDYNQKFK KPGKAPKLLMYAASNQGSGVP Mylotarg CD33 (hP67.6) NRATLTVDNPTNTAYMELSSL SRFSGSGSGTEFTLTISSLQP

RSEDTDFYYCVNGNPWLAYWG DDFATYYCQQTKEVPWSFGQG QGTLVTVSS TKVEVK EVQLLESGGGLVQPGGSLRLS EIVLTQSPATLSLSPGERATL CAVSGFTFNSFAMSWVRQAPG SCRASQSVSSYLAWYQQKPGQ

KGLEWVSAISGSGGGTYYADS APRLLIYDASNRATGIPARFS Daratumumab CD38

VKGRFTISRDNSKNTLYLQMN GSGSGTDFTLTISSLEPEDFA SLRAEDTAVYFCAKDKILWFG VYYCQQRSNWPPTFGQGTKVE EPVFDYWGQGTLVTVSS IK QIQLVQSGPEVKKPGETVKIS DIVLTQSPASLAVSLGQRATI CKASGYTFTNYGMNWVKQAPG SCRASKSVSTSGYSFMHWYQQ

KGLKWMGWINTYTGEPTYADA KPGQPPKLLIYLASNLESGVP 1F6 CD70

FKGRFAFSLETSASTAYLQIN ARFSGSGSGTDFTLNIHPVEE NLKNEDTATYFCARDYGDYGM EDAATY DYWGQGTSVTVSS YCQHSREVPWTFGGGTKLEIK QVQLQQSGTELMTPGASVTMS DIVLTQSPASLTVSLGQKTTI CKTSGYTFSTYWIEWVKQRPG SCRASKSVSTSGYSFMHWYQL

HGLEWIGEILGPSGYTDYNEK KPGQSPKLLIYLASDLPSGVP 2F2 CD70

FKAKATFTADTSSNTAYMQLS ARFSGSGSGTDFTLKIHPVEE SLASEDSAVYYCARWDRLYAM EDAATY DYWGGGTSVTVSS YCQHSREIPYTFGGGTKLEIT

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLS EIVLTQSPATLSLSPGERATL 2H5 CD70 CAASGFTFSSYIMHWVRQAPG SCRASQSVSSYLAWYQQKPGQ

KGLEWVAVISYDGRNKYYADS APRLLIYDASNRATGIPARFS

VKGRFTISRDNSKNTLYLQMN GSGSGTDFTLTISSLEPEDFA SLRAED VYYCQQ TAVYYCARDTDGYDFDYWGQG RTNWPLTFGGGTKVEIK TLVTVSS QIQLVESGGGVVQPGRSLRLS AIQLTQSPSSLSASVGDRVTI CAASGFTFGYYAMHWVRQAPG TCRASQGISSALAWYQQKPGK

KGLEWVAVISYDGSIKYYADS APKFLIYDASSLESGVPSRFS 10B4 CD70 VKGRFTISRDNSKNTLYLQMN GSGSGTDFTLTISSLQPEDFA

SLRAED TYYCQQ TAVYYCAREGPYSNYLDYWGQ FNSYPFTFGPGTKVDIK GTLVTVSS QVQLVESGGGVVQPGRSLRLS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTI CATSGFTFSDYGMHWVRQAPG TCRASQGISSWLAWYQQKPEK

KGLEWVAVIWYDGSNKYYADS APKSLIYAASSLQSGVPSRFS 8B5 CD70 VKGRFTISRDNSKKTLSLQMN GSGSGTDFTLTISSLQPEDFA

SLRAED TYYCQQ TAVYYCARDSIMVRGDYWGQG YNSYPLTFGGGTKVEIK TLVTVSS QVQLVESGGGVVQPGRSLRLS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTI CAASGFTFSDHGMHWVRQAPG TCRASQGISSWLAWYQQKPEK

KGLEWVAVIWYDGSNKYYADS APKSLIYAASSLQSGVPSRFS 18E7 CD70 VKGRFTISRDNSKNTLYLQMN GSGSGTDFTLTISSLQPEDFA

SLRAED TYYCQQ TAVYYCARDSIMVRGDYWGQG YNSYPLTFGGGTKVEIK TLVTVSS

QVQLQESGPGLVKPSETLSLT EIVLTQSPATLSLSPGERATL 69A7 CD70 CTVSGGSVSSDYYYWSWIRQP SCRASQSVSSYLAWYQQKPGQ

PGKGLEWLGYIYYSGSTNYNP APRLLIFDASNRATGIPARFS

SLKSRVTISVDTSKNQFSLKL GSGSGTDFTLTISSLEPEDFA RSVTTA VYYCQQ DTAVYYCARGDGDYGGNCFDY RSNWPLTFGGGTKVEIK WGQGTLVTVSS QVQLVQSGAEVKKPGASVKVS DIQMTQSPSSVSASVGDRVTI CKASGYTFTSYGFSWVRQAPG TCRASQGINTWLAWYQQKPGK

QGLEWMGWISASNGNTYYAQK APKLLIYAASSLKSGVPSRFS CE-355621 cMET

LQGRVTMTTDTSTSTAYMELR GSGSGTDFTLTISSLQPEDFA SLRSDDTAVYYCARVYADYAD TYYCQQANSFPLTFGGGTKVE YWGQGTLVTVSS IK QVQLVQSGAEVKKPGASVKVS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTI

CKASGYTFTDYYMHWVRQAPG TCSVSSSVSSIYLHWYQQKPG Emibetuzu- QGLEWMGRVNPNRRGTTYNQK KAPKLLIYSTSNLASGVPSRF LY2875358 cMET mab FEGRVTMTTDTSTSTAYMELR SGSGSGTDFTLTISSLQPEDF

SLRSDDTAVYYCARANWLDYW ATYYCQVYSGYPLTFGGGTKV GQGTTVTVSS EIK EVQLVESGGGLVQPGGSLRLS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTI CAASGYTFTSYWLHWVRQAPG TCKSSQSLLYTSSQKNYLAWY

KGLEWVGMIDPSNSDTRFNPN QQKPGKAPKLLIYWASTRESG MetMAb Onartuzumab cMET

FKDRFTISADTSKNTAYLQMN VPSRFSGSGSGTDFTLTISSL SLRAEDTAVYYCATYRSYVTP QPEDFATYYCQQYYAYPWTFG LDYWGQGTLVTVSS QGTKVEIK

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTI Tremelimu- CAASGFTFSSYGMHWVRQAPG TCRASQSINSYLDWYQQKPGK mab KGLEWVAVIWYDGSNKYYADS APKLLIYAASSLQSGVPSRFS CTLA4 (CP-675206 VKGRFTISRDNSKNTLYLQMN GSGSGTDFTLTISSLQPEDFA ou 11.2.1) SLRAEDTAVYYCARDPRGATL TYYCQQYYSTPFTFGPGTKVE

YYYYYGMDVWGQGTTVTVSS IK

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLS EIVLTQSPGTLSLSPGERATL

CAASGFTFSSYTMHWVRQAPG SCRASQSVGSSYLAWYQQKPG Ipilimumab KGLEWVTFISYDGNNKYYADS QAPRLLIYGAFSRATGIPDRF Yervoy CTLA4 10D1 VKGRFTISRDNSKNTLYLQMN SGSGSGTDFTLTISRLEPEDF

SLRAEDTAIYYCARTGWLGPF AVYYCQQYGSSPWTFGQGTKV DYWGQGTLVTVSS EIK QVQLQESGPGLVKPSQTLSLT EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTI CTVSGGSISSGGYYWSWIRQH TCRASQSIGISLHWYQQKPDQ

PGKGLEWIGIIYYSGSTYYNP SPKLLIKYASQSFSGVPSRFS AGS16F H16-7.8 ENPP3

SLKSRVTISVDTSKNQFSLKL GSGSGTDFTLTINSLEAEDAA NSVTAADTAVFYCARVAIVTT TYYCHQSRSFPWTFGQGTKVE IPGGMDVWGQGTTVTVSS IK EVQLLEQSGAELVRPGTSVKI ELVMTQSPSSLTVTAGEKVTM SCKASGYAFTNYWLGWVKQRP SCKSSQSLLNSGNQKNYLTWY

GHGLEWIGDIFPGSGNIHYNE QQKPGQPPKLLIYWASTRESG MT110 Solitomab EpCAM

KFKGKATLTADKSSSTAYMQL VPDRFTGSGSGTDFTLTISSV SSLTFEDSAVYFCARLRNWDE QAEDLAVYYCQNDYSYPLTFG PMDYWGQGTTVTVSS AGTKLEIK EVQLLESGGGVVQPGRSLRLS ELQMTQSPSSLSASVGDRVTI CAASGFTFSSYGMHWVRQAPG TCRTSQSISSYLNWYQQKPGQ

KGLEWVAVISYDGSNKYYADS PPKLLIYWASTRESGVPDRFS Adecatumu- MT201 EpCAM VKGRFTISRDNSKNTLYLQMN GSGSGTDFTLTISSLQPEDSA mab

SLRAEDTAVYYCAKDMGWGSG TYYCQQSYDIPYTFGQGTKLE WRPYYYYGMDVWGQGTTVTVS IK S

QVQLQQSGAELVRPGTSVKVS NIVMTQSPKSMSMSVGERVTL Edrecolomab Panorex EpCAM CKASGYAFTNYLIEWVKQRPG TCKASENVVTYVSWYQQKPEQ Mab CO17-1A

QGLEWIGVINPGSGGTNYNEK SPKLLIYGASNRYTGVPDRFT

FKGKATLTADKSSSTAYMQLS GSGSATDFTLTISSVQAEDLA SLTSDDSAVYFCARDGPWFAY DYHCGQGYSYPYTFGGGTKLE WGQGTLVTVSA IK QIQLVQSGPELKKPGETVKIS QILLTQSPAIMSASPGEKVTM CKASGYTFTNYGMNWVRQAPG TCSASSSVSYMLWYQQKPGSS

KGLKWMGWINTYTGEPTYADD PKPWIFDTSNLASGFPARFSG Tucotuzumab EpCAM

FKGRFVFSLETSASTAFLQLN SGSGTSYSLIISSMEAEDAAT NLRSEDTATYFCVRFISKGDY YYCHQRSGYPYTFGGGTKLEI WGQGTSVTVSS K VQLQQSDAELVKPGASVKISC DIVMTQSPDSLAVSLGERATI KASGYTFTDHAIHWVKQNPEQ NCKSSQSVLYSSNNKNYLAWY

GLEWIGYFSPGNDDFKYNERF QQKPGQPPKLLIYWASTRESG UBS-54 EpCAM

KGKATLTADKSSSTAYVQLNS VPDRFSGSGSGTDFTLTISSL LTSEDSAVYFCTRSLNMAYWG QAEDVAVYYCQQYYSYPLTFG QGTSVTVSS GGTKVKES EVQLVQSGPEVKKPGASVKVS DIVMTQSPLSLPVTPGEPASI CKASGYTFTNYGMNWVRQAPG SCRSSINKKGSNGITYLYWYL

QGLEWMGWINTYTGEPTYGED QKPGQSPQLLIYQMSNLASGV 3622W94 323/A3 EpCAM

FKGRFAFSLDTSASTAYMELS PDRFSGSGSGTDFTLKISRVE SLRSEDTAVYFCARFGNYVDY AEDVGVYYCAQNLEIPRTFGQ WGQGSLVTVSS GTKVEIK EVQLVQSGPGLVQPGGSVRIS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTI CAASGYTFTNYGMNWVKQAPG TCRSTKSLLHSNGITYLYWYQ

KGLEWMGWINTYTGESTYADS QKPGKAPKLLIYQMSNLASGV 4D5MOCBv2 EpCAM

FKGRFTFSLDTSASAAYLQIN PSRFSSSGSGTDFTLTISSLQ SLRAEDTAVYYCARFAIKGDY PEDFATYYCAQNLEIPRTFGQ

WGQGTLLTVSS GTKVEIK 4D5MOCB EpCAM EVQLVQSGPGLVQPGGSVRIS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTI

CAASGYTFTNYGMNWVKQAPG TCRSTKSLLHSNGITYLYWYQ KGLEWMGWINTYTGESTYADS QKPGKAPKLLIYQMSNLASGV FKGRFTFSLDTSASAAYLQIN PSRFSSSGSGTDFTLTISSLQ SLRAEDTAVYYCARFAIKGDY PEDFATYYCAQNLEIPRTFGQ WGQGTLLTVSS GTKVELK EVQLLESGGGLVQPGGSLRLS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTI CAASGFTFSHYMMAWVRQAPG TCRASQSISTWLAWYQQKPGK

KGLEWVSRIGPSGGPTHYADS APKLLIYKASNLHTGVPSRFS MEDI-547 1C1 EphA2 VKGRFTISRDNSKNTLYLQMN GSGSGTEFSLTISGLQPDDFA

SLRAEDTAVYYCAGYDSGYDY TYYCQQYNSYSRTFGQGTKVE VAVAGPAEYFQHWGQGTLVTV IK SS EVQLVESGGGVVQPGRSLRLS DIQLTQSPSSLSASVGDRVTI

CSASGFTFSGYGLSWVRQAPG TCSVSSSISSNNLHWYQQKPG Farletuzu- KGLEWVAMISSGGSYTYYADS KAPKPWIYGTSNLASGVPSRF MORAb-003 FOLR1 mab VKGRFAISRDNAKNTLFLQMD SGSGSGTDYTFTISSLQPEDI

SLRPEDTGVYFCARHGDDPAW ATYYCQQWSSYPYMYTFGQGT FAYWGQGTPVTVSS KVEIK QVQLVQSGAEVVKPGASVKIS DIVLTQSPLSLAVSLGQPAII

CKASGYTFTGYFMNWVKQSPG SCKASQSVSFAGTSLMHWYHQ huMOV19 QSLEWIGRIHPYDGDTFYNQK KPGQQPRLLIYRASNLEAGVP M9346A FOLR1 (vLCv1.00) FQGKATLTVDKSSNTAHMELL DRFSGSGSKTDFTLNISPVEA

SLTSEDFAVYYCTRYDGSRAM EDAATYYCQQSREYPYTFGGG DYWGQGTTVTVSS TKLEIK

QVQLVQSGAEVVKPGASVKIS DIVLTQSPLSLAVSLGQPAII huMOV19 CKASGYTFTGYFMNWVKQSPG SCKASQSVSFAGTSLMHWYHQ M9346A FOLR1 (vLCv1.60) QSLEWIGRIHPYDGDTFYNQK KPGQQPRLLIYRASNLEAGVP

FQGKATLTVDKSSNTAHMELL DRFSGSGSKTDFTLTISPVEA

SLTSEDFAVYYCTRYDGSRAM EDAATYYCQQSREYPYTFGGG DYWGQGTTVTVSS TKLEIK GPELVKPGASVKISCKASDYS PASLSASVGETVTITCRTSEN FTGYFMNWVMQSHGKSLEWIG IFSYLAWYQQKQGISPQLLVY

RIFPYNGDTFYNQKFKGRATL NAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQ 26B3.F2 FOLR1

TVDKSSSTAHMELRSLASEDS FSLKINSLQPEDFGSYYCQHH AVYFCARGTHYFDYWGQGTTL YAFPWTFGGGSKLEIK TVSS QVQLVQSGAEVKKPGASVKVS DVVMTQSPLSLPVTPGEPASI CKASGYTFTDYEMHWVRQAPG SCRSSQSLVHSNGNTYLHWYL

QGLEWMGALDPKTGDTAYSQK QKPGQSPQLLIYKVSNRFSGV RG7686 GC33 GPC3 FKGRVTLTADKSTSTAYMELS PDRFSGSGSGTDFTLKISRVE

SLTSED AEDVGV TAVYYCTRFYSYTYWGQGTLV YYCSQNTHVPPTFGQGTKLEI TVSS K EVQLVQSGAEVKKPGESLKIS EIVLTQSPGTLSLSPGERATL CKGSGYSFTSYWIAWVRQMPG SCRAVQSVSSSYLAWYQQKPG

KGLEWMGIIFPGDSDTRYSPS QAPRLLIYGASSRATGIPDRF 4A6 GPC3 FQGQVTISADRSIRTAYLQWS SGSGSGTDFTLTISRLEPEDF

SLKASD AVYYCQ TALYYCARTREGYFDYWGQGT QYGSSPTFGGGTKVEIK LVTVSS EVQLVQSGAEVKKPGESLKIS EIVLTQSPGTLSLSPGERATL CKGSGYSFTNYWIAWVRQMPG SCRASQSVSSSYLAWYQQKPG

KGLEWMGIIYPGDSDTRYSPS QAPRLLIYGASSRATGIPDRF 11E7 GPC3

FQGQVTISADKSIRTAYLQWS SGSGSGTDFTLTISRLEPEDF SLKASD AVYYCQ TAMYYCARTREGYFDYWGQGT QYGSSPTFGGGTKVEIK

LVTVSS EVQLVQSGADVTKPGESLKIS EILLTQSPGTLSLSPGERATL CKVSGYRFTNYWIGWMRQMSG SCRASQSVSSSYLAWYQQKPG

KGLEWMGIIYPGDSDTRYSPS QAPRLLIYGASSRATGIPDRF 16D10 GPC3 FQGHVTISADKSINTAYLRWS SGSGSGTDFTLTISRLEPEDF

SLKASD AVYYCQ TAIYYCARTREGFFDYWGQGT QYGSSPTFGQGTKVEIK PVTVSS QVQLVESGGGVVQSGRSLRLS DTVMTQTPLSSHVTLGQPASI CAASGFTFRNYGMHWVRQAPG SCRSSQSLVHSDGNTYLSWLQ

KGLEWVAVIWYDGSDKYYADS QRPGQPPRLLIYRISRRFSGV AMG-595 EGFR

VRGRFTISRDNSKNTLYLQMN PDRFSGSGAGTDFTLEISRVE SLRAEDTAVYYCARDGYDILT AEDVGVYYCMQSTHVPRTFGQ GNPRDFDYWGQGTLVTVSS GTKVEIK QVQLKQSGPGLVQPSQSLSIT DILLTQSPVILSVSPGERVSF CTVSGFSLTNYGVHWVRQSPG SCRASQSIGTNIHWYQQRTNG

KGLEWLGVIWSGGNTDYNTPF SPRLLIKYASESISGIPSRFS Erubitux™ Cetuximab EGFR

TSRLSINKDNSKSQVFFKMNS GSGSGTDFTLSINSVESEDIA LQSNDTAIYYCARALTYYDYE DYYCQQNNNWPTTFGAGTKLE FAYWGQGTLVTVSA LK QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTI CKASGFTFTDYKIHWVRQAPG TCRASQGINNYLNWYQQKPGK

QGLEWMGYFNPNSGYSTYAQK APKRLIYNTNNLQTGVPSRFS GA201 Imgatuzumab EGFR

FQGRVTITADKSTSTAYMELS GSGSGTEFTLTISSLQPEDFA SLRSEDTAVYYCARLSPGGYY TYYCLQHNSFPTFGQGTKLEI VMDAWGQGTTVTVSS K

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLS AIQLTQSPSSLSASVGDRVTI Humax Zalutumumab EGFR

CAASGFTFSTYGMHWVRQAPG TCRASQDISSALVWYQQKPGK

KGLEWVAVIWDDGSYKYYGDS APKLLIYDASSLESGVPSRFS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMN GSESGTDFTLTISSLQPEDFA SLRAEDTAVYYCARDGITMVR TYYCQQFNSYPLTFGGGTKVE GVMKDYFDYWGQGTLVTVSS IK QVQLQESGPGLVKPSQTLSLT EIVMTQSPATLSLSPGERATL CTVSGGSISSGDYYWSWIRQP SCRASQSVSSYLAWYQQKPGQ

PGKGLEWIGYIYYSGSTDYNP APRLLIYDASNRATGIPARFS IMC-11F8 Necitumumab EGFR

SLKSRVTMSVDTSKNQFSLKV GSGSGTDFTLTISSLEPEDFA NSVTAADTAVYYCARVSIFGV VYYCHQYGSTPLTFGGGTKAE GTFDYWGQGTLVTVSS IK QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVS DIQMTQSPSTLSASVGDRVTI CKASGGTFSSYAISWVRQAPG TCRASQSISSWWAWYQQKPGK

QGLEWMGSIIPIFGTVNYAQK APKLLIYDASSLESGVPSRFS MM-151 P1X EGFR

FQGRVTITADESTSTAYMELS GSGSGTEFTLTISSLQPDDFA SLRSEDTAVYYCARDPSVNLY TYYCQQYHAHPTTFGGGTKVE WYFDLWGRGTLVTVSS IK QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVS DIVMTQSPDSLAVSLGERATI CKASGGTFGSYAISWVRQAPG NCKSSQSVLYSPNNKNYLAWY

QGLEWMGSIIPIFGAANPAQK QQKPGQPPKLLIYWASTRESG MM-151 P2X EGFR

SQGRVTITADESTSTAYMELS VPDRFSGSGSGTDFTLTISSL SLRSEDTAVYYCAKMGRGKVA QAEDVAVYYCQQYYGSPITFG FDIWGQGTMVTVSS GGTKVEIK QVQLVQSGAEVKKPGASVKVS EIVMTQSPATLSVSPGERATL CKASGYAFTSYGINWVRQAPG SCRASQSVSSNLAWYQQKPGQ

QGLEWMGWISAYNGNTYYAQK APRLLIYGASTRATGIPARFS MM-151 P3X EGFR

LRGRVTMTTDTSTSTAYMELR GSGSGTEFTLTISSLQSEDFA SLRSDDTAVYYCARDLGGYGS VYYCQDYRTWPRRVFGGGTKV GSVPFDPWGQGTLVTVSS EIK

QVQLQQSGAEVKKPGSSVKVS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTI CKASGYTFTNYYIYWVRQAPG TCRSSQNIVHSNGNTYLDWYQ

QGLEWIGGINPTSGGSNFNEK QTPGKAPKLLIYKVSNRFSGV TheraCIM Nimotuzumab EGFR

FKTRVTITADESSTTAYMELS PSRFSGSGSGTDFTFTISSLQ SLRSEDTAFYFCTRQGLWFDS PEDIATYYCFQYSHVPWTFGQ DGRGFDFWGQGTTVTVSS GTKLQIT QVQLQESGPGLVKPSETLSLT DIQMTQSPSSLSASVGDRVTI CTVSGGSVSSGDYYWTWIRQS TCQASQDISNYLNWYQQKPGK

PGKGLEWIGHIYYSGNTNYNP APKLLIYDASNLETGVPSRFS Vectibix™ Panitumimab EGFR

SLKSRLTISIDTSKTQFSLKL GSGSGTDFTFTISSLQPEDIA SSVTAADTAIYYCVRDRVTGA TYFCQHFDHLPLAFGGGTKVE FDIWGQGTMVTVSS IK QIQLVQSGPELKKPGETVKIS DVVMTQTPLSLPVSLGDQASI CKASGYTFTEYPIHWVKQAPG SCRSSQSLVHSNGNTYLHWYL

KGFKWMGMIYTDIGKPTYAEE QKPGQSPKLLIYKVSNRFSGV 07D06 EGFR

FKGRFAFSLETSASTAYLQIN PDRFSGSGSGTDFTLKISRVE NLKNEDTATYFCVRDRYDSLF AEDLGVYFCSQSTHVPWTFGG DYWGQGTTLTVSS GTKLEIK EMQLVESGGGFVKPGGSLKLS DVVMTQTPLSLPVSLGDQASI CAASGFAFSHYDMSWVRQTPK SCRSSQSLVHSNGNTYLHWYL

QRLEWVAYIASGGDITYYADT QKPGQSPKLLIYKVSNRFSGV 12D03 EGFR

VKGRFTISRDNAQNTLYLQMS PDRFSGSGSGTDFTLKISRVE SLKSEDTAMFYCSRSSYGNNG AEDLGVYFCSQSTHVLTFGSG DALDFWGQGTSVTVSS TKLEIK QVQLVESGGGLVQPGGSLRLS QSPSFLSAFVGDRITITCRAS

CAASGFTFSSYAMGWVRQAPG PGIRNYLAWYQQKPGKAPKLL C1 HER2

KGLEWVSSISGSSRYIYYADS IYAASTLQSGVPSRFSGSGSG VKGRFTISRDNSKNTLYLQMN TDFTLTISSLQPEDFATYYCQ

SLRAEDTAVYYCAKMDASGSY QYNSYPLSFGGGTKVEIK FNFWGQGTLVTVSS QVQLLQSAAEVKKPGESLKIS QAVVTQEPSFSVSPGGTVTLT CKGSGYSFTSYWIGWVRQMPG CGLSSGSVSTSYYPSWYQQTP

KGLEWMGIIYPGDSDTRYSPS GQAPRTLIYSTNTRSSGVPDR Erbicin HER2

FQGQVTISADKSISTAYLQWS FSGSILGNKAALTITGAQADD SLKASDTAVYYCARWRDSPLW ESDYYCVLYMGSGQYVFGGGT GQGTLVTVSS KLTVL EVQLVESGGGLVQPGGSLRLS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTI CAASGFNIKDTYIHWVRQAPG TCRASQDVNTAVAWYQQKPGK

KGLEWVARIYPTNGYTRYADS APKLLIYSASFLYSGVPSRFS Herceptin trastuzumab HER2

VKGRFTISADTSKNTAYLQMN GSRSGTDFTLTISSLQPEDFA SLRAEDTAVYYCSRWGGDGFY TYYCQQHYTTPPTFGQGTKVE AMDYWGQGTLVTVSS IK QVQLQQSGPELVKPGASLKLS DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSI

CTASGFNIKDTYIHWVKQRPE TCKASQDVNTAVAWYQQKPGH Margetuxima QGLEWIGRIYPTNGYTRYDPK SPKLLIYSASFRYTGVPDRFT MAGH22 HER2 b FQDKATITADTSSNTAYLQVS GSRSGTDFTFTISSVQAEDLA

RLTSEDTAVYYCSRWGGDGFY VYYCQQHYTTPPTFGGGTKVE AMDYWGQGASVTVSS IK QVQLVESGGGLVQPGGSLRLS QSVLTQPPSVSGAPGQRVTIS CAASGFTFRSYAMSWVRQAPG CTGSSSNIGAGYGVHWYQQLP

KGLEWVSAISGRGDNTYYADS GTAPKLLIYGNTNRPSGVPDR MM-302 F5 HER2

VKGRFTISRDNSKNTLYLQMN FSGFKSGTSASLAITGLQAED SLRAEDTAVYYCAKMTSNAFA EADYYCQFYDSSLSGWVFGGG FDYWGQGTLVTVSS TKLTVL

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTI Perjeta Pertuzumab HER2

CAASGFTFTDYTMDWVRQAPG TCKASQDVSIGVAWYQQKPGK

KGLEWVADVNPNSGGSIYNQR APKLLIYSASYRYTGVPSRFS FKGRFTLSVDRSKNTLYLQMN GSGSGTDFTLTISSLQPEDFA SLRAEDTAVYYCARNLGPSFY TYYCQQYYIYPYTFGQGTKVE FDYWGQGTLVTVSS IK EVQLLESGGGLVQPGGSLRLS QSALTQPASVSGSPGQSITIS

CAASGFTFSHYVMAWVRQAPG CTGTSSDVGSYNVVSWYQQHP MM-121/ KGLEWVSSISSSGGWTLYADS GKAPKLIIYEVSQRPSGVSNR HER3 SAR256212 VKGRFTISRDNSKNTLYLQMN FSGSKSGNTASLTISGLQTED

SLRAEDTAVYYCTRGLKMATI EADYYCCSYAGSSIFVIFGGG FDYWGQGTLVTVSS TKVTVL EVQLVESGGGLVQPGGSLRLS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTI CAASGFTLSGDWIHWVRQAPG TCRASQNIATDVAWYQQKPGK

KGLEWVGEISAAGGYTDYADS APKLLIYSASFLYSGVPSRFS MEHD7945A Duligotumab EGFR/HER3

VKGRFTISADTSKNTAYLQMN GSGSGTDFTLTISSLQPEDFA SLRAEDTAVYYCARESRVSFE TYYCQQSEPEPYTFGQGTKVE AAMDYWGQGTLVTVSS IK QVQLQESGGGLVKPGGSLRLS QSALTQPASVSGSPGQSITIS CAASGFTFSSYWMSWVRQAPG CTGTSSDVGGYNFVSWYQQHP

KGLEWVANINRDGSASYYVDS GKAPKLMIYDVSDRPSGVSDR MM-111 HER2/3

VKGRFTISRDDAKNSLYLQMN FSGSKSGNTASLIISGLQADD SLRAEDTAVYYCARDRGVGYF EADYYCSSYGSSSTHVIFGGG DLWGRGTLVTVSS TKVTVL QVQLVQSGAEVKKPGESLKIS QSVLTQPPSVSAAPGQ CKGSGYSFTSYWIAWVRQMPG KVTISCSGSSSNIGNNYVSWY

KGLEYMGLIYPGDSDTKYSPS QQLPGTAPKLLIYDHTNRPAG MM-111 HER2/3

FQGQVTISVDKSVSTAYLQWS VPDRFSGSKSGTSASLAISGF SLKPSDSAVYFCARHDVGYCT RSEDEADYYCASWDYTLSGWV DRTCAKWPEWLGVWGQGTLVT FGGGTKLTVL

VSS EVQLVESGGGVVQPGRSLRLS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTI CSTSGFTFSDYYMYWVRQAPG TCRSSQRIVHSNGNTYLEWYQ

KGLEWVAYMSNVGAITDYPDT QTPGKAPKLLIYKVSNRFSGV Hu3S193 Lewis-Y

VKGRFTISRDNSKNTLFLQMD PSRFSGSGSGTDFTFTISSLQ SLRPEDTGVYFCARGTRDGSW PEDIATYYCFQGSHVPFTFGQ FAYWGQGTPVTVSS GTKLQIT QVELVQSGAEVKKPGESLKIS DIALTQPASVSGSPGQSITIS

CKGSGYSFTSYWIGWVRQAPG CTGTSSDIGGYNSVSWYQQHP Anetumab KGLEWMGIIDPGDSRTRYSPS GKAPKLMIYGVNNRPSGVSNR BAY 94-9343 Mesotelina ravtansina FQGQVTISADKSISTAYLQWS FSGSKSGNTASLTISGLQAED

SLKASDTAMYYCARGQLYGGT EADYYCSSYDIESATPVFGGG YMDGWGQGTLVTVSS TKLTVL QVQLQQSGPELEKPGASVKIS DIELTQSPAIMSASPGEKVTM CKASGYSFTGYTMNWVKQSHG TCSASSSVSYMHWYQQKSGTS

KSLEWIGLITPYNGASSYNQK PKRWIYDTSKLASGVPGRFSG SS1 Mesotelina

FRGKATLTVDKSSSTAYMDLL SGSGNSYSLTISSVEAEDDAT SLTSEDSAVYFCARGGYDGRG YYCQQWSGYPLTFGAGTKLEI FDYWGQGTTVTVSS K QVYLVESGGGVVQPGRSLRLS EIVLTQSPATLSLSPGERATL CAASGITFSIYGMHWVRQAPG SCRASQSVSSYLAWYQQKPGQ

KGLEWVAVIWYDGSHEYYADS APRLLIYDASNRATGIPARFS Mesotelina VKGRFTISRDNSKNTLYLLMN GSGSGTDFTLTISSLEPEDFA

SLRAED VYYCQQ TAVYYCARDGDYYDSGSPLDY RSNWPLTFGGGTKVEIK WGQGTLVTVSS

QVHLVESGGGVVQPGRSLRLS EIVLTQSPATLSLSPGERATL Mesotelina

CVASGITFRIYGMHWVRQAPG SCRASQSVSSYLAWYQQKPGQ

KGLEWVAVLWYDGSHEYYADS APRLLIYDASNRATGIPARFS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMN GSGSGTDFTLTISSLEPEDFA SLRAED VYYCQQ TAIYYCARDGDYYDSGSPLDY RSNWPLTFGGGTKVEIK WGQGTLVTVSS EVHLVESGGGLVQPGGSLRLS EIVLTQSPGTLSLSPGERATL CAASGFTFSRYWMSWVRQAQG SCRASQSVSSSYLAWYQQKPG

KGLEWVASIKQAGSEKTYVDS QAPRLLIYGASSRATGIPDRF Mesotelina VKGRFTISRDNAKNSLSLQMN SGSGSGTDFTLTISRLEPEDF

SLRAED AVYYCQ TAVYYCAREGAYYYDSASYYP QYGSSQYTFGQGTKLEIK YYYYYSMDVWGQGTTVTVSS QVQLQQSGPELEKPGASVKIS DIELTQSPAIMSASPGEKVTM CKASGYSFTGYTMNWVKQSHG TCSASSSVSYMHWYQQKSGTS

KSLEWIGLITPYNGASSYNQK PKRWIYDTSKLASGVPGRFSG MORAb-009 Amatuximab Mesotelina

FRGKATLTVDKSSSTAYMDLL SGSGNSYSLTISSVEAEDDAT SLTSEDSAVYFCARGGYDGRG YYCQQWSKHPLTFGSGTKVEI FDYWGSGTPVTVSS K EVQLQESGPELVKPGASVKMS DIVMTQSPAIMSASPGEKVTM CKASGYTFPSYVLHWVKQKPG TCSASSSVSSSYLYWYQQKPG

QGLEWIGYINPYNDGTQYNEK SSPKLWIYSTSNLASGVPARF hPAM4 MUC-1 FKGKATLTSDKSSSTAYMELS SGSGSGTSYSLTISSMEAEDA

RLTSED ASYFCH SAVYYCARGFGGSYGFAYWGQ QWNRYPYTFGGGTKLEIK GTLITVSA

QVQLQQSGAEVKKFGASVKVS DIQLTQSPSSLSASVGDRVTM Clivatuzuma hPAM4-Cide MUC1 CEASGYTFPSYVLHWVKQAPG TCSASSSVSSSYLYWYQQKPG b

QGLEWIGYINPYNDGTQTNKK KAPKLWIYSTSNLASGVPARF

FKGKATLTRDTSINTAYMELS SGSGSGTDFTLTISSLQPEDS RLRSDDTAVYYCARGFGGSYG ASYFCHQWNRYPYTFGGGTRL FAYNGQGTLVTVSS EIK QAQLQVSGAEVVKPGASVKMS EIVLTQSPATMSASPGERVTI CKASGYTFTSYNMHWVKQTPG TCSAHSSVSFMHWFQQKPGTS

QGLEWIGYIYPGNGATNYNQK PKLWIYSTSSLASGVPARFGG SAR566658 huDS6v1.01 MUC1

FQGKATLTADTSSSTAYMQIS SGSGTSYSLTISSMEAEDAAT SLTSEDSAVYFCARGDSVPFA YYCQQRSSFPLTFGAGTKLEL YWGQGTLVTVSA K QVQLQQSGAELMKPGASVKIS DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTM

CKATGYTFSAYWIEWVKQRPG SCKSSQSLLYSSNQKIYLAWY Pemtumomab HGLEWIGEILPGSNNSRYNEK QQKPGQSPKLLIYWASTRESG Theragyn MUC1 muHMFG1 FKGKATFTADTSSNTAYMQLS VPDRFTGGGSGTDFTLTISSV

SLTSEDSAVYYCSRSYDFAWF KAEDLAVYYCQQYYRYPRTFG AYWGQGTPVTVSA GGTKLEIK

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTI Sontuzumab CKASGYTFSAYWIEWVRQAPG TCKSSQSLLYSSNQKIYLAWY huHMFG1 KGLEWVGEILPGSNNSRYNEK QQKPGKAPKLLIYWASTRESG Therex MUC1 AS1402 FKGRVTVTRDTSTNTAYMELS VPSRFSGSGSGTDFTFTISSL R1150 SLRSEDTAVYYCARSYDFAWF QPEDIATYYCQQYYRYPRTFG

AYWGQGTLVTVSS QGTKVEIK QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVS EIVLTQSPATLSLSPGERATL

CKTSGDTFSTYAISWVRQAPG SCRASQSVSSYLAWYQQKPGQ MDX-1105 ou QGLEWMGGIIPIFGKAHYAQK APRLLIYDASNRATGIPARFS PD-L1 BMS-936559 FQGRVTITADESTSTAYMELS GSGSGTDFTLTISSLEPEDFA

SLRSEDTAVYFCARKFHFVSG VYYCQQRSNWPTFGQGTKVEI

SPFGMDVWGQGTTVTVSS K MEDI-4736 Durvalumab PD-L1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLS EIVLTQSPGTLSLSPGERATL

CAASGFTFSRYWMSWVRQAPG SCRASQRVSSSYLAWYQQKPG KGLEWVANIKQDGSEKYYVDS QAPRLLIYDASSRATGIPDRF VKGRFTISRDNAKNSLYLQMN SGSGSGTDFTLTISRLEPEDF SLRAEDTAVYYCAREGGWFGE AVYYCQQYGSLPWTFGQGTKV LAFDYWGQGTLVTVSS EIK EVQLVESGGGLVQPGGSLRLS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTI CAASGFTFSDSWIHWVRQAPG TCRASQDVSTAVAWYQQKPGK

KGLEWVAWISPYGGSTYYADS APKLLIYSASFLYSGVPSRFS Atezolizuma MPDL3280A PD-L1 VKGRFTISADTSKNTAYLQMN GSGSGTDFTLTISSLQPEDFA b

SLRAEDTAVYYCARRHWPGGF TYYCQQYLYHPATFGQGTKVE DYWGQGTLVTVSS IK EVQLLESGGGLVQPGGSLRLS QSALTQPASVSGSPGQSITIS CAASGFTFSSYIMMWVRQAPG CTGTSSDVGGYNYVSWYQQHP

KGLEWVSSIYPSGGITFYADT GKAPKLMIYDVSNRPSGVSNR MSB0010718C Avelumab PD-L1

VKGRFTISRDNSKNTLYLQMN FSGSKSGNTASLTISGLQAED SLRAEDTAVYYCARIKLGTVT EADYYCSSYTSSSTRVFGTGT TVDYWGQGTLVTVSS KVTVL EVQLVQSGPEVKKPGATVKIS DIQMTQSPSSLSTSVGDRVTL

CKTSGYTFTEYTIHWVKQAPG TCKASQDVGTAVDWYQQKPGP MLN591 KGLEWIGNINPNNGGTTYNQK SPKLLIYWASTRHTGIPSRFS

PSMA FEDKATLTVDKSTDTAYMELS GSGSGTDFTLTISSLQPEDFA SLRSEDTAVYYCAAGWNFDYW DYYCQQYNSYPLTFGPGTKVD GQGTLLTVSS IK

QVQLVESGGGLVKPGESLRLS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTI Pasotuxi- MT112 PSMA CAASGFTFSDYYMYWVRQAPG TCKASQNVDTNVAWYQQKPGQ zumab

KGLEWVAIISDGGYYTYYSDI APKSLIYSASYRYSDVPSRFS

IKGRFTISRDNAKNSLYLQMN GSASGTDFTLTISSVQSEDFA SLKAEDTAVYYCARGFPLLRH TYYCQQYDSYPYTFGGGTKLE GAMDYWGQGTLVTVSS IK QEQLVESGGRLVTPGGSLTLS ELVLTQSPSVSAALGSPAKIT CKASGFDFSAYYMSWVRQAPG CTLSSAHKTDTIDWYQQLQGE

KGLEWIATIYPSSGKTYYATW APRYLMQVQSDGSYTKRPGVP ROR1 VNGRFTISSDNAQNTVDLQMN DRFSGSSSGADRYLIIPSVQA

SLTAAD DDEADY RATYFCARDSYADDGALFNIW YCGADYIGGYVFGGGTQLTVT GPGTLVTISS G EVKLVESGGGLVKPGGSLKLS DIKMTQSPSSMYASLGERVTI CAASGFTFSSYAMSWVRQIPE TCKASPDINSYLSWFQQKPGK

KRLEWVASISRGGTTYYPDSV SPKTLIYRANRLVDGVPSRFS ROR1 KGRFTISRDNVRNILYLQMSS GGGSGQDYSLTINSLEYEDMG

LRSEDT IYYCLQ AMYYCGRYDYDGYYAMDYWGQ YDEFPYTFGGGTKLEMK GTSVTVSS QSLEESGGRLVTPGTPLTLTC ELVMTQTPSSVSAAVGGTVTI TVSGIDLNSHWMSWVRQAPGK NCQASQSIGSYLAWYQQKPGQ

GLEWIGIIAASGSTYYANWAK PPKLLIYYASNLASGVPSRFS ROR1 GRFTISKTSTTVDLRIASPTT GSGSGTEYTLTISGVQREDAA

EDTATY TYYCLG FCARDYGDYRLVTFNIWGPGT SLSNSDNVFGGGTELEIL LVTVSS QSVKESEGDLVTPAGNLTLTC ELVMTQTPSSTSGAVGGTVTI

TASGSDINDYPISWVRQAPGK NCQASQSIDSNLAWFQQKPGQ ROR1

GLEWIGFINSGGSTWYASWVK PPTLLIYRASNLASGVPSRFS GRFTISRTSTTVDLKMTSLTT GSRSGTEYTLTISGVQREDAA

DDTATY TYYCLG FCARGYSTYYCDFNIWGPGTL GVGNVSYRTSFGGGTEVVVK VTISS QVQLVQSGAEVVKPGASVKIS DIVMSQSPDSLAVSLGERVTL

CKASGYTFTDHAIHWVKQNPG NCKSSQSLLYSGNQKNYLAWY CC49 QRLEWIGYFSPGNDDFKYNER QQKPGQSPKLLIYWASARESG TAG-72 (Humanizado) FKGKATLTADTSASTAYVELS VPDRFSGSGSGTDFTLTISSV

SLRSEDTAVYFCTRSLNMAYW QAEDVAVYYCQQYYSYPLTFG GQGTLVTVSS AGTKLELK QIQLVQSGPELKKPGETVKIS SIVMTQTPKFLLVSAGDRVTI CKASGYTFTNFGMNWVKQGPG TCKASQSVSNDVAWYQQKPGQ

EGLKWMGWINTNTGEPRYAEE SPKLLINFATNRYTGVPNRFT A1 murídeo TPBG/5T4

FKGRXAFSLETTASTAYLQIN GSGYGTDFTFTISTVQAEDLA NLKNEDTATYFCARDWDGAYF LYFCQQ FDYWGQGTTLTVSS DYSSPWTFGGGTKLEIK QVQLQQSRPELVKPGASVKMS SVIMSRGQIVLTQSPAIMSAS CKASGYTFTDYVISWVKQRTG LGERVTLTCTASSSVNSNYLH

QGLEWIGEIYPGSNSIYYNEK WYQQKPGSSPKLWIYSTSNLA A2 murídeo TPBG/5T4 FKGRATLTA SGVPARFSGSGSGTSYSLTIS

DKSSSTAYMQLSSLTSEDSAV SMEAEDAATYYCHQYHRSPLT YFCAMGGNYGFDYWGQGTTLT FGAGTKLELK VSS EVQLVESGGGLVQPKGSLKLS DIVMTQSHIFMSTSVGDRVSI CAASGFTFNTYAMNWVRQAPG TCKASQDVDTAVAWYQQKPGQ

KGLEWVARIRSKSNNYATYYA SPKLLIYWASTRLTGVPDRFT A3 murídeo TPBG/5T4

DSVKDRFTISRDDSQSMLYLQ GSGSGTDFTLTISNVQSEDLA MNNLKTEDTAMYXCVRQWDYD DYFCQQ VRAMNYWGQGTSVTVSS YSSYPYTFGGGTKLEIK

QVQLQQSGSELKKPGASVKVS DIQLTQSPSSLSASVGDRVSI CKASGYTFTNYGMNWVKQAPG TCKASQDVSIAVAWYQQKPGK

QGLKWMGWINTYTGEPTYTDD APKLLIYSASYRYTGVPDRFS IMMU-132 hRS-7 TROP-2

FKGRFAFSLDTSVSTAYLQIS GSGSGTDFTLTISSLQPEDFA SLKADDTAVYFCARGGFGSSY VYYCQQHYITPLTFGAGTKVE WYFDVWGQGSLVTVSS IK QAQVVESGGGVVQSGRSLRLS EIVLTQSPGTLSLSPGERATL CAASGFAFSSYGMHWVRQAPG SCRASQSVSSSYLAWYQQKPG

KGLEWVAVIWYDGSNKYYADS QAPRLLIYGASSRATGIPDRF IMC-18F1 Icrucumab VEGFR1

VRGRFTISRDNSENTLYLQMN SGSGSGTDFTLTISRLEPEDF SLRAEDTAVYYCARDHYGSGV AVYYCQQYGSSPLTFGGGTKV HHYFYYGLDVWGQGTTVTVSS EIK EVQLVQSGGGLVKPGGSLRLS DIQMTQSPSSVSASIGDRVTI CAASGFTFSSYSMNWVRQAPG TCRASQGIDNWLGWYQQKPGK

KGLEWVSSISSSSSYIYYADS APKLLIYDASNLDTGVPSRFS Cyramza Ramucirumab VEGFR2

VKGRFTISRDNAKNSLYLQMN GSGSGTYFTLTISSLQAEDFA SLRAEDTAVYYCARVTDAFDI VYFCQQAKAFPPTFGGGTKVD WGQGTMVTVSSA IK EVQLVESGGGLVQPGGSLRLS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTI CAASGFTFSSYGMSWVRQAPG TCRASQDIAGSLNWLQQKPGK

KGLEWVATITSGGSYTYYVDS AIKRLIYATSSLDSGVPKRFS Alacizuma- g165DFM-PEG VEGFR2 VKGRFTISRDNAKNTLYLQMN GSRSGSDYTLTISSLQPEDFA bpegol

SLRAEDTAVYYCVRIGEDALD TYYCLQYGSFPPTFGQGTKVE YWGQGTLVTVSS IK

KVQLQQSGTELVKPGASVKVS DIVLTQSPASLAVSLGQRATI Imclone6.64 VEGFR2 CKASGYIFTEYIIHWVKQRSG SCRASESVDSYGNSFMHWYQQ

QGLEWIGWLYPESNIIKYNEK KPGQPPKLLIYRASNLESGIP

FKDKATLTADKSSSTVYMELS ARFSGSGSRTDFTLTINPVEA RLTSEDSAVYFCTRHDGTNFD DDVATYYCQQSNEDPLTFGAG

YWGQGTTLTVSSA TKLELK * seqüências sublinhadas e em negrito, se presentes, são CDRs dentro da VL e VH Tabela 6: Ligantes longos intramoleculares. # do Nome Seqüência de aminoácidos ligante L1 (G4S)3 GGGGSGGGGSGGGGS L2 MT110_18 GEGTSTGSGGSGGSGGAD L3 MT103_18 VEGGSGGSGGSGGSGGVD L4 UCHT1_29 RTSGPGDGGKGGPGKGPGGEGTKGTGPGG L5 Y30 GSGEGSEGEGGGEGSEGEGSGEGGEGEGSG L6 Y32 TGSGEGSEGEGGGEGSEGEGSGEGGEGEGSGT L7 G1_30_3 GATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEG L8 G9_30_1 GSAAPTAGTTPSASPAPPTGGSSAAGSPST L9 Y30_modificao GEGGESGGSEGEGSGEGEGGSGGEGESEGG L10 G1_30_1 STETSPSTPTESPEAGSGSGSPESPSGTEA L11 G1_30_2 PTGTTGEPSGEGSEPEGSAPTSSTSEATPS L12 G1_30_4 SESESEGEAPTGPGASTTPEPSESPTPETS UCHT1_ L13 PEGGESGEGTGPGTGGEPEGEGGPGGEGGT modificado Tabela 7: Ligantes curtos intermoleculares. Nome Seqüência de aminoácidos S-1 SGGGGS S-2 GGGGS S-3 GGS

S-4 GSP V. PORÇÕES VOLUMOSAS E POLIPEPTÍDEOS RECOMBINANTES ESTENDIDOS (XTEN)

[219] Em outro aspecto, a revelação está relacionada aos polipeptídeos recombinantes que compreendem pelo menos uma primeira porção volumosa que são incorporados nas composições em questão tanto a fim de aumentar a massa quanto o tamanho da construção, mas que também servem para reduzir acentuadamente a habilidade das porções de ligação para se ligar aos seus ligantes quando a molécula está no estado não clivado, intacto, descrito com mais detalhes, abaixo. Em algumas modalidades, a revelação fornece um polipeptídeo recombinante que compreende uma única porção volumosa fundida ao terminal-N- ou -C do RS que está localizada entre a porção de ligação e a porção volumosa. Exemplos não limitantes de porções volumosas incluem polipeptídeo recombinante estendido (XTEN, como descrito nesse relatório descritivo, abaixo); domínio de ligação à albumina; albumina; domínio de ligação à IgG; polipeptídeos de pelo menos 350 resíduos de aminoácidos que consistem em prolina, serina e alanina; ácido graxo; proteína do tipo elastina (ELP) (a subunidade individual ou blocos construtivos de ELPs são derivados de um motivo de cinco aminoácidos encontrado na proteína humana elastina que é repetido várias vezes para formar o biopolímero de ELP, como descrito em WO 2016081884), domínio Fc, polietileno glicol (PEG), PLGA e hidroxiletil amido.

[220] Em uma modalidade preferida, a revelação fornece um polipeptídeo recombinante que compreende pelo menos um primeiro XTEN fundido ao terminal-N- ou -C do RS, que, por sua vez, está fundido à porção de ligação adjacente. Em outra modalidade, o polipeptídeo recombinante compreende duas seqüências de XTEN diferentes, em que os dois XTENs são, cada um, ligados a dois RSs da composição que, por sua vez, estão ligados às porções de ligação. Em uma modalidade, as composições de polipeptídeo recombinante compreendem uma primeira seqüência de XTEN que possui pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de seqüência, quando otimamente alinhada, para uma seqüência de XTEN de comprimento comparável selecionada do grupo de seqüências apresentadas na Tabela 8 ou Tabela 10. Em outra modalidade, o polipeptídeo recombinante compreende uma primeira e uma segunda seqüência de XTEN (XTEN1 e XTEN2), cada seqüência possuindo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de seqüência, quando otimamente alinhada, para uma seqüência selecionada de seqüências apresentadas na Tabela 8. Em outra modalidade, o polipeptídeo recombinante compreende uma primeira e uma segunda seqüência de XTEN (XTEN1 e XTEN2), cada seqüência possuindo pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de seqüência, quando otimamente alinhada, para uma seqüência selecionada de seqüências apresentadas na Tabela 10.

[221] Sem se prender a uma teoria em particular, a incorporação da porção volumosa foi incorporada no design das composições em questão para conferir certas propriedades; 1) fornecimento de composições de polipeptídeo recombinante com um XTEN da porção volumosa que blinda as porções de ligação e reduz a afinidade de ligação para os marcadores de célula-alvo e antígenos da célula efetora quando a composição está em sua forma intacta, de pró- fármaco; ii) fornecimento de composições de polipeptídeo recombinante com um XTEN da porção volumosa que fornece meia- vida aumentada quando administradas a um indivíduo, iii) contribuir para a solubilidade e estabilidade da composição intacta aprimorando, dessa forma, as propriedades farmacêuticas das composições em questão; e iv) fornecimento de composições de polipeptídeo recombinante com um XTEN da porção volumosa que reduz o extravasamento em tecidos e órgãos normais, embora permita um grau de extravasamento em tecidos doentes (por exemplo, um tumor) com tamanhos de poro maiores na vasculatura, embora pudessem ser liberadas da composição por ação de certas proteases de mamíferos permitindo, dessa forma, que as porções de ligação da composição penetrem mais prontamente nos tecidos doentes, por exemplo, um tumor, e se liguem e unam em conjunto os marcadores de célula-alvo na célula efetora e célula tumoral.

Para atender a essas necessidades, a revelação fornece composições que compreendem um ou mais XTENs nos quais o XTEN fornece massa e raio hidrodinâmico aumentados à composição resultante.

Os polipeptídeos XTEN das modalidades fornecem certas vantagens no design das composições em questão, na medida em que fornecem não apenas massa e raio hidrodinâmico aumentados, mas suas características não estruturadas, flexíveis, fornecem um efeito de blindagem sobre as porções de ligação da composição reduzindo, dessa forma, a probabilidade de ligação aos antígenos em tecidos normais ou na vasculatura de tecidos normais que não expressam ou expressam níveis reduzidos de marcadores de célula-alvo e/ou antígenos da célula efetora, e aumenta a solubilidade e enovelamento adequado das porções de ligação do fragmento de anticorpo de cadeia única durante sua expressão e recuperação.

[222] XTENs são polipeptídeos com seqüências substancialmente não repetitivas, de ocorrência não natural, que possuem um grau baixo ou nenhuma estrutura secundária ou terciária sob condições fisiológicas, bem como propriedades adicionais descritas nos parágrafos seguintes. XTENs tipicamente possuem de pelo menos cerca de 100 até pelo menos cerca de 1.000 ou mais aminoácidos e, mais preferivelmente, pelo menos cerca de 200 até pelo menos cerca de 900 aminoácidos, dos quais a maioria ou a totalidade é formada por aminoácidos hidrofílicos pequenos selecionados de glicina, serina, treonina, glutamato e prolina. Como usado nesse relatório descritivo, XTEN especificamente exclui anticorpos inteiros ou fragmentos de anticorpos inteiros (por exemplo, anticorpos de cadeia única e fragmentos Fc). Polipeptídeos XTEN possuem utilidade como parceiros de fusão, na medida em que servem a vários papéis, conferindo certas propriedades desejáveis quando ligados a uma composição que compreende, por exemplo, as porções de ligação biespecíficas das composições AAC em questão descritas nesse relatório descritivo. As composições resultantes possuem propriedades aprimoradas, tais como propriedades farmacocinéticas, físico-químicas, farmacológicas aprimoradas e propriedades toxicológicas e farmacêuticas aprimoradas, comparadas com as porções de ligação correspondentes não ligadas ao XTEN, tornando-as úteis no tratamento de certas condições para as quais as porções de ligação são conhecidas na técnica como sendo usadas.

[223] A característica não estruturada e as propriedades físico-químicas do XTEN resultam, em parte, da composição global de aminoácidos que é desproporcionalmente limitada a 4-6 tipos de aminoácidos hidrofílicos, da seqüência dos aminoácidos em um design quantificável, substancialmente não repetitivo, e do comprimento do polipeptídeo XTEN resultante.

Em uma característica vantajosa comum ao XTEN, mas incomum aos polipeptídeos nativos, as propriedades do XTEN revelado nesse relatório descritivo não estão vinculadas a uma seqüência de aminoácidos primária absoluta, como evidenciado pela diversidade das seqüências exemplares das Tabelas 8 e 10 que, dentro de faixas de comprimento variáveis, possuem propriedades similares e conferem propriedades aprimoradas nas composições às quais estão ligados, muitas das quais estão documentadas nos Exemplos.

Na verdade, é especificamente contemplado que as composições da revelação não estão limitadas àqueles XTENs especificamente enumerados nas Tabelas 8 ou 10, mas, ao invés disso, as modalidades incluem seqüências que possuem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de seqüência, quando otimamente alinhadas, para as seqüências da Tabela 8 ou Tabela 10, na medida em que exibem as propriedades de XTEN descritas nesse relatório descritivo.

Foi estabelecido que esses XTENs possuem propriedades mais como polímeros hidrofílicos, não proteináceos (por exemplo, polietileno glicol, ou “PEG”) do que como proteínas.

Os XTENs da presente revelação exibem uma ou mais das seguintes propriedades vantajosas: comprimento definido e uniforme (para certa seqüência), flexibilidade conformacional,

estrutura secundária reduzida ou ausente, grau elevado de formação de espiral aleatória, grau elevado de solubilidade aquosa, grau elevado de resistência à protease, imunogenicidade baixa, baixa ligação a receptores de mamíferos, um grau definido de carga e raios hidrodinâmicos (ou de Stokes) aumentados; propriedades que são similares a certos polímeros hidrofílicos (por exemplo, polietileno glicol) que os tornam particularmente úteis como parceiros de fusão.

[224] O componente (ou componentes) de XTEN dos polipeptídeos recombinantes e AAC em questão são projetados para se comportar como seqüências peptídicas desnaturadas sob condições fisiológicas, apesar do comprimento estendido do polímero. O termo “desnaturada” descreve o estado de um peptídeo em solução que é caracterizado por uma grande liberdade conformacional do arcabouço peptídico. A maioria dos peptídeos e proteínas adota uma conformação desnaturada na presença de concentrações elevadas de desnaturantes ou em temperatura elevada. Peptídeos em conformação desnaturada possuem, por exemplo, espectros de dicroismo circular (CD) característicos e são caracterizados por uma ausência de interações de longo alcance, como determinado por ressonância magnética nuclear RMN. Os termos “conformação desnaturada” e “conformação não estruturada” são usados de forma sinônima nesse relatório descritivo. Em algumas modalidades, a revelação fornece composições que compreendem seqüências de XTEN que, sob condições fisiológicas, são semelhantes às seqüências desnaturadas que são substancialmente desprovidas de estrutura secundária sob condições fisiológicas. O termo “substancialmente desprovidas”, como usado nesse contexto, significa que pelo menos cerca de 80%, ou cerca de 90%, ou cerca de 95%, ou cerca de 97%, ou pelo menos cerca de 99% do resíduos de aminoácidos do XTEN da seqüência de XTEN não contribuem para a estrutura secundária, como medido ou determinado pelos métodos descritos nesse relatório descritivo, incluindo algoritmos ou ensaios espectrofotométricos.

[225] Diversos métodos e ensaios bem estabelecidos são conhecidos na técnica para determinação e confirmação das propriedades físico-químicas do XTEN em questão e das composições de polipeptídeo em questão nas quais são incorporados. Essas propriedades incluem, sem limitação, estrutura secundária ou terciária, solubilidade, agregação de proteína, estabilidade, peso molecular absoluto e aparente, pureza e uniformidade, propriedades de fusão, contaminação e teor de água. Os métodos para medir essas propriedades incluem centrifugação analítica, EPR, HPLC- troca iônica, HPLC-cromatografia por exclusão de tamanho (SEC), HPLC-fase reversa, espalhamento de luz, eletroforese capilar, dicroismo circular, calorimetria de varredura diferencial, fluorescência, HPLC-troca iônica, HPLC-exclusão de tamanho, IR, RMN, espectroscopia de Raman, refratometria, e espectroscopia UV/Visível. Em particular, a estrutura secundária pode ser medida espectrofotometricamente, por exemplo, por espectroscopia de dicroismo circular na região espectral “UV-distante” (190-250 nm). Cada um dos elementos da estrutura secundária, por exemplo, hélice-alfa e lâmina- beta, dá origem a um formato e magnitude característicos dos espectros de CD, bem como o faz a ausência desses elementos da estrutura. A estrutura secundária também pode ser prevista para uma seqüência polipeptídica por meio de certos programas de computador ou algoritmos como, por exemplo, o algoritmo bem conhecido de Chou-Fasman (Chou, P.Y., e cols. (1974) Biochemistry, 13: 222-45) e o algoritmo de Garnier- Osguthorpe-Robson (“algoritmo de GOR IV”) (Garnier J., Gibrat J.F., Robson B. (1996), “GOR Method for Predicting Protein Secondary Structure from Amino Acid Sequence”. Methods Enzymol. 266: 540-553), como descrito na Publicação do Pedido de Patente U.S.

Nº 20030228309A1. Para certa seqüência, os algoritmos podem prever se há alguma ou nenhuma estrutura secundária, expressa como o total e/ou uma percentagem de resíduos da seqüência que formam, por exemplo, hélices-alfa ou lâminas-beta, ou uma percentagem de resíduos da seqüência prevista que resulta em formação de espiral aleatória (que não possui estrutura secundária). Seqüências de polipeptídeos podem ser analisadas usando o algoritmo de Chou-Fasman usando páginas da Internet, por exemplo, em fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_www.cgi?rm=misc1 e o algoritmo de GOR IV em npsa-pbil.ibcp.fr/cgi- bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html (ambas acessadas em 8 de dezembro de 2017). A espiral aleatória pode ser determinada por diversos métodos, incluindo por utilização de medições da viscosidade intrínseca, que escalonam com comprimento de cadeia de uma forma conformação-dependente (Tanford, C., Kawahara, K. e Lapanje, S. (1966) J.

Biol.

Chem. 241, 1.921–1.923), bem como por cromatografia por exclusão de tamanho (Squire, P.G., “Calculation of Hydrodynamic Parameters of Random Coil Polymers from Size Exclusion Chromatography and Comparison with Parameters by Conventional Methods”. Journal of Chromatography, 1981, 5,

433-442). Métodos adicionais são revelados em Arnau, e cols., Prot. Expr. and Purif. (2006) 48, 1-13.

[226] Em uma modalidade, as seqüências de XTEN das composições em questão possuem uma percentagem de hélice- alfa que varia de 0% até menos do que cerca de 5% e uma percentagem de lâmina-beta que varia de 0% até menos do que cerca de 5% como determinado pelo algoritmo de Chou-Fasman e pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de formação de espiral aleatória como determinado pelo algoritmo de GOR IV. Em outra modalidade, as seqüências de XTEN das composições reveladas possuem uma percentagem de hélice-alfa de menos do que cerca de 2% e uma percentagem de lâmina-beta de menos do que cerca de 2% como determinado pelo algoritmo de Chou-Fasman e pelo menos cerca de 90% de formação de espiral aleatória como determinado pelo algoritmo de GOR IV. Em outra modalidade, as seqüências de XTEN das composições são substancialmente desprovidas de estrutura secundária, como medido por dicroismo circular.

[227] Em uma modalidade, a seqüência de XTEN usada nas composições em questão da revelação é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma seqüência selecionada do grupo que consiste em AE 144_1A, AE 144_2A, AEE144_2B, AE 144_3A, AE144_3B, AE 144_4A, AE 144_4B, AE 144_5A, AE 144_6B, AE288_1, AE288_2, AE288_3, AE284, AE292, AE576, AE864, AE864_2, AE865, AE866, AE867, AE867_2 e AE868.

[228] Em algumas modalidades, nas quais menos do que 100% dos aminoácidos de um XTEN nas composições em questão são selecionados de glicina (G), alanina (A), serina (S),

treonina (T), glutamato (E) e prolina (P), ou nas quais menos do que 100% da seqüência consiste nas seqüências de XTEN da Tabela 8 ou Tabela 10, os resíduos de aminoácidos do XTEN restantes são selecionados de qualquer um dos outros 14 L- aminoácidos naturais, mas são preferencialmente selecionados de aminoácidos hidrofílicos, de modo que a seqüência de XTEN contenha pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou pelo menos cerca de 99% de aminoácidos hidrofílicos. O teor de aminoácidos hidrofóbicos no XTEN utilizado nas composições em questão pode ser menos do que 5%, ou menos do que 2%, ou menos do que 1% de teor de aminoácido hidrofóbico. Resíduos hidrofóbicos que estão menos favorecidos na construção de XTEN incluem triptofano, fenilalanina, tirosina, leucina, isoleucina, valina e metionina. Adicionalmente, as seqüências de XTEN podem conter menos do que 5% ou menos do que 4% ou menos do que 3% ou menos do que 2% ou menos do que 1% ou nenhum dos seguintes aminoácidos: metionina (por exemplo, para evitar oxidação), ou asparagina e glutamina (para evitar desamidação).

[229] Em uma modalidade, as seqüências de aminoácidos para certos XTENs utilizados nas modalidades de AAC da revelação são mostradas na Tabela 8. Tabela 8: Polipeptídeos XTEN. Nome do Seqüência de aminoácidos

XTEN AE144 GSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGSE

PATSGSETPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPAT

SGSETPGTSTEPSEGSAP AE144_1A SPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTST

EPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESAT

Nome do Seqüência de aminoácidos

XTEN

PESGPGTSTEPSEGSAPG AE144_2A TSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTST

EPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESAT

PESGPGTSESATPESGPG AE144_2B TSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTST

EPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESAT

PESGPGTSESATPESGPG AE144_3A SPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTST

EPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSP

TSTEEGTSTEPSEGSAPG AE144_3B SPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTST

EPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSP

TSTEEGTSTEPSEGSAPG AE144_4A TSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTST

EPSEGSAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESAT

PESGPGTSTEPSEGSAPG AE144_4B TSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTST

EPSEGSAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESAT

PESGPGTSTEPSEGSAPG AE144_5A TSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTST

EPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSP

TSTEEGSPAGSPTSTEEG AE144_6B TSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEP

ATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESAT

PESGPGTSTEPSEGSAPG AE288_1 GTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTS

TEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGS PTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPE

Nome do Seqüência de aminoácidos

XTEN SGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAP

GSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAP AE288_2 GSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTS

TEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGS PTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGS ETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEE

GSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAP AE576 GSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTS

TEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESA TPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEG SAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSAP GTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSE PATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEP SEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPE SGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAP GTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTS

TEPSEGSAP AE624 MAEPAGSPTSTEEGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGASPGTSSTGSPGSPAGSPTSTEEGT

SESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSES ATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSE GSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESG PGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGT SESATPESGPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSES ATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSE GSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSET PGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGS

PAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAP AE864 GSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTS

Nome do Seqüência de aminoácidos

XTEN TEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESA TPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEG SAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSAP GTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSE PATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEP SEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPE SGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAP GTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTS TEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESA TPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPE SGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGP GTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTS

TEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAP AE865 GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGT

STEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSES ATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSE GSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSA PGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGS EPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTE PSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATP ESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSA PGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGT STEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSES ATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATP ESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESG PGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGT

STEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAP AE866 PGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGT

Nome do Seqüência de aminoácidos

XTEN STEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSES ATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSE GSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSA PGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGS EPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTE PSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATP ESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSA PGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGT STEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSES ATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATP ESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESG PGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGT

STEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPG AE1152 GSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTS

TEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESA TPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEG SAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSAP GTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSE PATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEP SEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPE SGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAP GTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTS TEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESA TPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPE SGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGP GTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTS TEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPAT SGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTS

Nome do Seqüência de aminoácidos

XTEN TEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEE GTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSE PATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESA

TPESGPGTSTEPSEGSAP AE144A STEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSES

ATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSPAGSPT

STEEGSPAGSPTSTEEGS AE144B SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPA

GSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSP

TSTEEGTSTEPSEGSAPG AE180A TSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTST

EEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPG

SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSEPATS AE216A PESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPES

GPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPG TSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTST

EPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESAT AE252A ESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESG

PGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGT SESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAG

SPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSE AE288A TPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGS

ETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETP GTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTS ESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEP

SEGSAPGTSTEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESA AE324A PESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGS

APGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPG

Nome do Seqüência de aminoácidos

XTEN TSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPA GSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESAT PESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGS

APGSEPATS AE360A PESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTST

EEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPG SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEP ATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESAT PESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTST

EEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESAT AE396A PESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSPAGSPTST

EEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPG SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPA GSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSP TSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSE

TPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPS AE432A EGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPES

GPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEG SPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEP ATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSP TSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTST EEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPG

SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSEPATS AE468A EGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPES

GPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPG TSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTST EPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESAT PESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPES

Nome do Seqüência de aminoácidos

XTEN GPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPG TSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTST

EPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESAT AE504A EGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTST

EEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPG TSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPA GSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESAT PESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPES GPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPG TSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPA

GSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPS AE540A TPESGPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG

SAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAP GSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSE PATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGS PTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGS ETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEE GTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTS TEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPAT

SGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEP AE576A TPESGPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPE

SGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAP GTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTS ESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSPAGS PTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPE SGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAP GSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSP AGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPAT

Nome do Seqüência de aminoácidos

XTEN SGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSEPATSGS

ETPGTSESA AE612A GSETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSPAGSPTST

EEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPG TSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTST EPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESAT PESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTST EEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPG SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEP ATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESAT PESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTST

EEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESAT AE648A PESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGS

APGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPG TSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTST EPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATS GSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPES GPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPG TSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTST EPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSP TSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPES GPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPG

SEPATSGSETPGTSESAT AE684A EGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGS

APGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPG TSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTST EPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPS EGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPES

Nome do Seqüência de aminoácidos

XTEN GPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEG SPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEP ATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSP TSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTST EEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPG

SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSEPATS AE720A TSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSE

GSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSA PGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGT SESATPESGPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTE PSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSE GSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESG PGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGS PAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPA TSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPT STEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTE EGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGS

EPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTE AE756A TSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSE

GSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSA PGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGT SESATPESGPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTE PSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSE GSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESG PGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGS PAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPA TSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPT STEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTE

Nome do Seqüência de aminoácidos

XTEN EGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGS

EPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSES AE792A EGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPES

GPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPG TSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSAPGTST EPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATS GSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGS APGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPG SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSE SATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPS EGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPES GPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPG SPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSE SATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPS

EGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPS AE828A PESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPES

GPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPG TSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTST EPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESAT PESGPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPES GPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPG TSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSE SATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSPAGSP TSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPES GPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPG SPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPA GSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATS GSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSEPATSGSE

Nome do Seqüência de aminoácidos

XTEN

TPGTSESAT AE869 GSPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAP

GTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTS ESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEP SEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSEG SAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGP GSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTS TEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESA TPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG SAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGP GTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTS ESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESA TPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPE SGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAP

GTSTEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGR AE144_R1 SAGSPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGS

APGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEG

TSESATPESGPGTESASR AE288_R1 SAGSPTGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPS

EGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTST EEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPG SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSEP

ATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPSASR AE432_R1 SAGSPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGS

APGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEG TSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTST EPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPS EGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGTSESATPES

Nome do Seqüência de aminoácidos

XTEN GPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPG

TSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTESASR AE576_R1 SAGSPTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPS

EGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTST EEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPG TSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPA GSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESAT PESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPES GPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPG TSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPA GSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPS

EGSAPSASR AE864_R1 SAGSPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGS

APGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEG TSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTST EPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPS EGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGTSESATPES GPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPG TSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSE SATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPS EGSAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPES GPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPG TSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSE SATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESAT PESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGS

APGTSTEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTESASR AE712 PGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGT

STEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSES

Nome do Seqüência de aminoácidos

XTEN ATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSE GSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSA PGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGS EPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTE PSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATP ESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSA PGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGT STEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSES ATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATP

ESGPGSPAGSPTSTEAHHH AE864_R2 GSPGAGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGS

APGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEG TSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTST EPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPS EGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGTSESATPES GPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPG TSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSE SATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPS EGSAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPES GPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPG TSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSE SATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESAT PESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGS APGTSTEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTESASR

[230] A revelação contempla composições que compreendem XTENs de comprimentos intermediários em relação àqueles da Tabela 8, bem como XTENs de comprimentos mais longos nos quais motivos de 12 aminoácidos são adicionados ao terminal-N ou -C de um XTEN da Tabela 8 incorporado na composição. Em uma modalidade, uma composição em questão compreende um XTEN da Tabela 8 com a adição de uma ou mais cópias de um ou mais motivos selecionados do grupo de motivos apresentado na Tabela 9. Tabela 9: Motivos de seqüência de XTEN de 12 aminoácidos e famílias de motivos. Família de motivo * SEQÜÊNCIA DO MOTIVO

AD GESPGGSSGSES AD GSEGSSGPGESS AD GSSESGSSEGGP AD GSGGEPSESGSS AE GSPAGSPTSTEE AE GSEPATSGSETP AE GTSESATPESGP AE GTSTEPSEGSAP AF GSTSESPSGTAP AF GTSTPESGSASP AF GTSPSGESSTAP AF GSTSSTAESPGP AG GTPGSGTASSSP AG GSSTPSGATGSP AG GSSPSASTGTGP

AG GASPGTSSTGSP * Significa seqüências de motivo individuais que, quando fundidas em conjunto em várias permutações, resultam em uma “seqüência de família”

[231] Em outra modalidade, as seqüências de aminoácidos para certos XTENs utilizados nas modalidades da revelação são mostradas na Tabela 10. Em uma modalidade, a

AAC compreende um primeiro XTEN (XTEN1) que compreende uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de seqüência, quando otimamente alinhada, para uma seqüência selecionada das seqüências apresentadas na Tabela 10. Em outras modalidades, a AAC compreende um XTEN1 e um segundo XTEN (XTEN2) que compreende uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de seqüência, quando otimamente alinhada, para uma seqüência selecionada das seqüências apresentadas na Tabela 10. Em uma modalidade do citado anteriormente, o XTEN1 e XTEN2 são idênticos.

Em outra modalidade do citado anteriormente, o XTEN1 e XTEN2 são diferentes.

Em outra modalidade, a AAC compreende um XTEN1 e um XTEN2 que compreende seqüências de aminoácidos que possuem pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de seqüência, quando otimamente alinhadas, para uma seqüência selecionada das seqüências apresentadas nas Tabelas 8 e 10. Em outra modalidade, a AAC compreende um XTEN1 e um XTEN2 que compreende seqüências de aminoácidos que possuem pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de seqüência, quando otimamente alinhadas, para uma seqüência selecionada das seqüências apresentadas nas Tabelas 8 e 10 e que ainda compreende um His tag de HHHHHH ou HHHHHHHH no terminal-N ou terminal-C da composição.

Tabela 10: Polipeptídeos XTEN.

Nome do XTEN Seqüência de aminoácidos

AE288_3 SPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPG

Nome do XTEN Seqüência de aminoácidos

TSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEG TSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEG TSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPG

SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPG AE284 GTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGP

GTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGP GSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGP GTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAP

GTSTEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSE AE292 SPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPG

SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGGSAP AE864_2 AGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTS

TEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTS ESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTS TEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTS TEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGTS ESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTS TEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTS TEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTS ESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSP AGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTS ESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTS ESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTS TEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSE PATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTS ESATPESGPGTSTEPSEGAAEPEA

Nome do XTEN Seqüência de aminoácidos AE867 GSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAP

GTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEE GTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAP GTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETP GTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEE GTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAP GTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEE GTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETP GTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEE GSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETP GTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEE GTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEE GTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETP GSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSEPATSGSETP

GTSESATPESGPGTSTEPSEGAAEPEA AE867_2 SPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGS

APGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTST EEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGS APGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSE TPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSPAGSPTST EEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGS APGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTST EEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSE TPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTST EEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSE TPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTST EEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTST EEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSE TPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSEPATSGSE

Nome do XTEN Seqüência de aminoácidos

TPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPG AE868 PGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSA

PGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTE EGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSA PGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSET PGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTE EGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSA PGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTE EGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSET PGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTE EGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSET PGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTE EGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTE EGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSET PGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSEPATSGSET PGTSESATPESGPGTSTEPSEGAAEPEA

[232] Exemplos adicionais de seqüências de XTEN que podem ser usadas de acordo com a presente revelação e são revelados na Publicações de Patente U.S. Nos 2010/0239554 A1, 2010/0323956 A1, 2011/0046060 A1, 2011/0046061 A1, 2011/0077199 A1, ou 2011/0172146 A1, ou Publicações de Patente International Nos WO 2010091122 A1, WO 2010144502 A2, WO 2010144508 A1, WO 2011028228 A1, WO 2011028229 A1, WO 2011028344 A2, WO 2014/011819 A2, ou WO 2015/023891. VI. Polipeptídeo recombinante e configurações e propriedades da AAC

[233] É um objetivo da revelação fornecer polipeptídeos recombinantes que são projetados e criados em uma forma de pró-fármaco, ativável, a fim de conferir certas propriedades estruturais, de atividade, farmacêuticas e farmacológicas. Em uma propriedade conferida pelo design dos polipeptídeos recombinantes, as porções de ligação possuem habilidade reduzida para se ligar a seus ligantes até que o componente de XTEN dos polipeptídeos recombinantes, que blinda as porções de ligação e reduz sua afinidade de ligação para seus ligantes, seja liberado da composição por clivagem do segmento de liberação que funde as porções de ligação ao XTEN.

[234] O design das composições em questão que possuem uma primeira porção de ligação foi dirigido levando em consideração pelo menos três propriedades: 1) composições que possuem uma porção de ligação com a capacidade para se ligar ao marcador (ou marcadores) de célula-alvo desejado em uma célula-alvo; 2) composições com um ou mais XTENs que i) blindam a porção de ligação e reduzem a afinidade de ligação para o marcador de célula-alvo quando a composição está em uma forma intacta (o que a torna, dessa forma, uma forma de pró-fármaco), ii) fornecem meia-vida aumentada quando administradas a um indivíduo, iii) reduzem o extravasamento da composição intacta da circulação em tecidos e órgãos normais, comparados com tecidos doentes (por exemplo, tumor), e iv) conferem um perfil de segurança aumentado, comparadas com produtos terapêuticos de anticorpo convencionais; e 3) são ativados quando o RS é clivado por uma ou mais proteases de mamíferos nas proximidades ou colocalizados com tecidos ou células doentes liberando, dessa forma, a porção de ligação, de modo que a porção de ligação recupere seu potencial pleno de afinidade de ligação para o ligante-alvo. O design das composições em questão se benéfica das propriedades dos componentes de XTEN e do segmento de liberação (RS), e seu posicionamento em relação à porção de ligação obtém as propriedades citadas anteriormente, como evidenciado pelo resultado nos Exemplos ilustrativos, abaixo.

[235] Em modalidades de polipeptídeos recombinantes que possuem uma única porção de ligação, um único RS e um único XTEN, os polipeptídeos recombinantes podem ter, em um estado não clivado, um arranjo estrutural do terminal-N para o terminal-C de FBM-RS1-XTEN1 ou XTEN1-RS1-FBM.

[236] Em outras modalidades, a revelação fornece polipeptídeos recombinantes que possuem duas porções de ligação que são fragmentos de anticorpo e são ativáveis (referidos como “AAC”) com uma primeira porção de ligação que visa uma célula efetora e uma segunda porção de ligação que visa uma marcador celular associado a um tecido ou célula doente; ambas tendo afinidade de ligação específica para seus respectivos ligantes. O design das composições em questão que possuem uma primeira e uma segunda porção de ligação (FBM e SBM, respectivamente) foi dirigido levando em consideração de pelo menos três propriedades: 1) composições que possuem porções de ligação biespecíficas com a capacidade de se ligar e unir em conjunto uma célula efetora e uma célula-alvo com a formação resultante de uma sinapse imunológica; 2) composições com um XTEN que i) blinda ambas as porções de ligação e reduz a afinidade de ligação para o alvo e ligantes da célula efetora quando a composição está em uma forma de pró-fármaco intacta, ii) fornece meia-vida aumentada quando administradas a um indivíduo, iii) reduz o extravasamento da composição intacta da circulação em tecidos e órgãos normais, comparados com tecidos doentes (por exemplo, tumor), e iv) confere um perfil de segurança aumentado, comparadas com produtos terapêuticos biespecíficos citotóxicos de anticorpo convencionais; e 3) é ativado quando o RS é clivado por uma ou mais proteases de mamíferos nas proximidades de tecidos doentes liberando, dessa forma, as porções de ligação biespecíficas, de modo a readquirir seu potencial pleno de afinidade de ligação para o ligantes-alvo. O design das composições em questão se beneficia das propriedades dos componentes de XTEN e do segmento de liberação (RS), e seu posicionamento em relação às porções de ligação biespecíficas obtém as propriedades citadas anteriormente, como evidenciado pelo resultado nos Exemplos ilustrativos, abaixo.

[237] Com referência às FIGS. 11 e 12, em modalidades exemplares, as duas porções de ligação da AAC estão conectadas umas às outras por um ligante curto, e são, por sua vez, conectadas ao XTEN pelo peptídeo do segmento de liberação (RS) que inclui até três sítios de clivagem diferentes projetados ara permitir a separação e liberação das porções de ligação do XTEN mediante clivagem de qualquer um ou todos os sítios de clivagem. Em modalidades de AAC que possuem duas porções de ligação, um único RS, e um único XTEN, a AAC pode ter, em um estado não clivado, um arranjo estrutural do terminal-N para o terminal-C de SBM-FBM-RS1- XTEN1, FBM-SBM-RS1-XTEN1, XTEN1-RS1-SBM-FBM, XTEN1-RS1-FBM- SBM, ou diabody-RS1-XTEN1 ou XTEN1-RS1-diabody, em que o diabody compreende VL e VH das FBM e SBM. Para as configurações de AAC citadas anteriormente, e como descrito acima, a FBM possui VL e VH derivadas de anticorpos que possuem afinidade de ligação para células efetoras, incluindo os anticorpos da Tabela 4, a SBM VL e VH são derivadas de anticorpos que possuem afinidade de ligação para marcadores de célula-alvo incluindo, sem limitação, os anticorpos da Tabela 5, os segmentos de liberação possuem seqüências que possuem 88-100% de identidade para as seqüências da Tabela 1 ou Tabela 2, e o XTENs possuem seqüências que possuem 90-100% de identidade para as seqüências da Tabela 8 ou Tabela 10.

[238] Em outras modalidades, a revelação fornece AAC que possui duas porções de ligação, dois RS e dois XTENs. O design dessas AACs foi dirigido levando em consideração uma redução adicional da afinidade de ligação das composições não clivadas para os respectivos ligantes dos fragmentos de anticorpo de FBM e SBM pela adição do segundo XTEN a fim de reduzir a ligação indesejada da AAC aos tecidos ou células saudáveis quando administrada a um indivíduo aumentando ainda mais, dessa forma, o índice terapêutico das composições em questão, comparada com a AAC que possui apenas um RS e um XTEN. Como descrito nos Exemplos, a adição do segundo RS e do segundo XTEN resultou em uma redução surpreendente da afinidade de ligação da AAC não clivada, intacta, para os respectivos ligantes dos fragmentos de anticorpo de FBM e SBM em relação àquelas AACs que possuem um único RS e XTEN, quando testadas in vitro, e também resultou em toxicidade reduzida em modelos animais de doença. Em modalidades de AAC que possui duas porções de ligação, dois RS e dois XTENs, a AAC pode ter, em um estado não clivado, um arranjo estrutural do terminal-N para o terminal-C de XTEN1-RS1-SBM-FBM-RS2- XTEN2, XTEN1-RS1-FBM-SBM-RS2-XTEN2, XTEN2-RS2-SBM-FBM-RS1-

XTEN1, XTEN2-RS2-FBM-SBM-RS1-XTEN1, XTEN2-RS2-diabody-RS1- XTEN1, em que o diabody compreende VL e VH das FBM e SBM, ou XTEN1-RS1-diabody-RS2-XTEN2, em que o diabody compreende VL e VH das FBM e SBM. Para as configurações de AAC citadas anteriormente, e como descrito acima, a FBM possui VL e VH derivadas de anticorpos que possuem afinidade de ligação para células efetoras, incluindo os anticorpos da Tabela 4, a SBM VL e VH são derivadas de anticorpos que possuem afinidade de ligação para marcadores de célula-alvo incluindo, sem limitação, os anticorpos da Tabela 5, os segmentos de liberação possuem seqüências que possuem 88- 100% de identidade para as seqüências da Tabela 1 ou Tabela 2, e o XTENs possuem seqüências que possuem 90-100% de identidade para as seqüências da Tabela 8 ou Tabela 10.

[239] É um objetivo da revelação que a afinidade de ligação de cada porção de ligação liberada da AAC seja maior para os respectivos ligantes-alvo, comparadas com as porções de ligação da composição intacta que não foram clivadas, por exemplo, quando testadas em um ensaio de ligação in vitro como descrito nesse relatório descritivo. Em uma modalidade, a afinidade de ligação da porção de ligação da célula efetora liberada da composição por clivagem do RS por uma protease é pelo menos 3 vezes, ou pelo menos 4 vezes, ou pelo menos 5 vezes, ou pelo menos 6 vezes, ou pelo menos 7 vezes, ou pelo menos 8 vezes, ou pelo menos 9 vezes, ou pelo menos 10 vezes, ou pelo menos 100 vezes, ou pelo menos 1.000 vezes, ou pelo menos 10.000 vezes maior para o antígeno da célula efetora liberado, comparada à porção de ligação da célula efetora da AAC intacta, como medida em um ensaio de células in vitro com uma célula efetora que possui o referido antígeno da célula efetora na superfície celular da referida célula ou em um ELISA com antígeno da célula efetora ligado, quando testada sob condições comparáveis, por exemplo, concentrações molares equivalentes.

Em uma modalidade, o antígeno da célula efetora é CD3. Em outras modalidades, a afinidade de ligação da porção de ligação à célula-alvo liberada da composição por clivagem do RS por uma protease é pelo menos 2 vezes, ou pelo menos 3 vezes, ou pelo menos 4 vezes, ou pelo menos 5 vezes, ou pelo menos 6 vezes, ou pelo menos 7 vezes, ou pelo menos 8 vezes, ou pelo menos 9 vezes, ou pelo menos 10 vezes, ou pelo menos 100 vezes, ou pelo menos 1.000 vezes ou pelo menos 10.000 vezes maior para o marcador-alvo ou antígeno de célula-alvo, comparada com a porção de ligação à célula-alvo da AAC intacta,, como medida em um in vitro ensaio de células com uma célula tumoral que possui o referido antígeno na superfície celular da referida célula ou em um ELISA com antígeno da célula efetora ligado, quando testada sob condições comparáveis, por exemplo, concentrações molares equivalentes.

Em uma modalidade do citado anteriormente, o marcador-alvo ou um antígeno de uma célula-alvo é selecionado do grupo que consiste em integrina alfa 4, Ang2, B7-H3, B7-H6, CEACAM5, cMET, CTLA4, FOLR1, EpCAM, CCR5, CD19, HER2, HER2 neu, HER3, HER4, HER1 (EGFR), PD-L1, PSMA, CEA, MUC1 (mucina), MUC-2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC7, MUC16 βhCG, Lewis-Y, CD20, CD33, CD38, CD30, CD56 (NCAM), CD133, gangliosídeo GD3; 9-O-Acetil-GD3, GM2, Globo H, fucosil GM1, GD2, anidrase carbônica IX, CD44v6, Sonic Hedgehog (Shh), Wue-1, antígeno de célula plasmática 1, proteoglicano de sulfato de condroitina do melanoma (MCSP), CCR8, antígeno epitelial transmembrana da próstata-

6 (STEAP), mesotelina, antígeno A33, antígeno de célula- tronco da próstata (PSCA), Ly-6, desmogleína 4, receptor de acetilcolina fetal (fnAChR), CD25, antígeno de câncer 19-9 (CA19-9), antígeno de câncer 125 (CA-125), receptor de substância inibidora muelleriana tipo II (MISIIR), antígeno Tn sialilado (s TN), antígeno de ativação de fibroblasto (FAP), endosialina (CD248), variante do receptor do fator de crescimento epidérmico III (EGFRvIII), antígeno associado um tumor L6 (TAL6), SAS, CD63, TAG72, Antígeno de Thomsen- Friedenreich (antígeno-TF), receptor do fator de crescimento do tipo insulina I (IGF-IR ), antígeno Cora, CD7, CD22, CD70, CD79a, CD79b, G250, MT-MMPs, antígeno F19, CA19-9, CA-125, alfa-fetoproteína (AFP), VEGFR1, VEGFR2, DLK1, SP17, ROR1, e EphA2. É especificamente contemplado nas modalidades do parágrafo que o efeito de blindagem do XTEN se aplica a ambas as porções de ligação das modalidades apresentadas anteriormente da forma de pró-fármaco, intacta, da composição de polipeptídeo recombinante ativável, e que, mediante liberação do XTEN da AAC por clivagem do RS, o potencial de ligação pleno das respectivas porções de ligação é restaurado.

[240] Sem se prender a uma teoria em particular, acredita-se que, com o uso do formato de porção de ligação biespecífica da AAC como descrito acima, os fragmentos de anticorpo de FBM e SBM fundidos liberados são capazes de morte de células-alvo por recrutamento de células efetoras citotóxicas sem nenhuma necessidade de pré- e/ou coestimulação. Além disso, a independência de pré- e/ou coestimulação da célula efetora pode contribuir substancialmente para a citotoxicidade excepcionalmente elevada mediada pelas porções de ligação liberadas.

Em algumas modalidades, a FBM liberada é projetada com especificidades de ligação de modo que possua a capacidade de ligar e unir juntas células efetoras citotóxicas (por exemplo, células T, células NK, célula killer induzida por citocina (célula CIK)), a marcadores de célula-alvo pré- selecionados pela SBM (que permanece ligada à FBM por um ligante peptídeo) que possui especificidade de ligação para marcadores de célula-alvo associados com células tumorais ou células de câncer efetuando, dessa forma, uma sinapse imunológica e um efeito seletivo, dirigido e localizado de citocinas e moléculas efetoras liberadas contra a célula tumoral ou de câncer-alvo, com o resultado de que as células tumorais ou de câncer são danificadas ou destruídas, resultando em benefício terapêutico a um indivíduo.

Em uma modalidade, a FBM liberada que se liga a um antígeno da célula efetora é capaz de modular uma ou mais funções de uma célula efetora, resultando ou contribuindo para o efeito citolítico na célula tumoral-alvo.

O antígeno da célula efetora pode ser expresso pela célula efetora ou por outras células.

Em uma modalidade, o antígeno da célula efetora é expresso na superfície celular da célula efetora.

Exemplos não limitantes são CD3, CD4, CD8, CD16, CD25, CD38, CD45RO, CD56, CD57, CD69, CD95, CD107 e CD154. Dessa forma, será subentendido por aqueles habilitados na técnica que as configurações das composições em questão visam liberar seletivamente ou desproporcionalmente a forma ativa da composição ao tecido tumoral- ou célula de câncer-alvo, comparado com tecido saudável ou células saudáveis em um indivíduo no qual a composição é administrada, com benefício terapêutico resultante. Como é evidente a partir do citado anteriormente, a revelação fornece uma grande família de polipeptídeos em configurações projetadas para efetuar as propriedades desejadas.

[241] É um objetivo da revelação que o design da AAC, com o XTEN de blindagem da AAC intacta e a redução concomitante na ligação às células T e tecidos-alvo, resulte em produção reduzida de citocinas ou outros mediadores pró- inflamatórios associados às células T Th1 durante exposição sistêmica, quando administrada a um indivíduo, de modo que o perfil global de efeitos colaterais e de segurança seja aprimorado, comparada com composições de ligação biespecífica não ligadas a uma porção volumosa como, por exemplo, XTEN. Como um componente importante da imunidade celular, a produção de IL-2, TNF-alfa e IFN-gama é um marco fundamental de uma resposta Th1 (Romagnani S. “T-Cells Subsets (Th1 versus Th2)”. Ann. Allergy Asthma Immunol. 2000. 85 (1): 9-18), particularmente em células T estimuladas por anti-CD3 (Yoon, S.H. “Selective Addition of CXCR3+CCR4-CD4+ Th1 Cells Enhances Generation of Cytotoxic T Cells by Dendritic Cells in vitro”. Exp. Mol. Med. 2009. 41 (3): 161– 170), e IL-4, IL-6 e IL-10 também são citocinas pró- inflamatórias importantes em uma resposta citotóxica para composição de anticorpo biespecífico (Zimmerman, Z., e cols. “Unleashing the Clinical Power of T Cells: CD19/CD3 Bi- Specific T Cell Engager (BiTE®) Antibody Composition Blinatumomab as a Potencial Therapy”. Int. Immunol. (2015) 27 (1): 31-37). Em uma modalidade, uma AAC não clivada, intacta, exibe potencial pelo menos 3 vezes, ou pelo menos 4 vezes, ou pelo menos 5 vezes, ou pelo menos 6 vezes, ou pelo menos 7 vezes, ou pelo menos 8 vezes, ou pelo menos 9 vezes, ou pelo menos 10 vezes, ou pelo menos 20 vezes, ou pelo menos 30 vezes, ou pelo menos 50 vezes, ou pelo menos 100 vezes, ou pelo menos 1.000 vezes reduzido para resultar na produção de citocinas Th1 e/ou pró-inflamatórias quando a AAC não clivada, intacta, está em contato com a célula efetora e uma célula-alvo em um ensaio in vitro baseado em células de estimulação de citocina (como descrito nos Exemplos, abaixo), comparado com os níveis de citocina estimulados pela primeira e segunda porções de ligação liberadas correspondentes (que permanecem ligadas juntas após liberação) de uma AAC tratada com protease no ensaio in vitro baseado em células de estimulação de citocina realizado sob condições comparáveis, por exemplo, concentrações molares equivalentes.

Exemplos não limitantes de citocinas Th1 e/ou pró-inflamatórias são IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF- alfa e IFN-gama.

Em uma modalidade do citado anteriormente, a produção da citocina Th1 é avaliada em um ensaio in vitro que compreende células efetoras como, por exemplo, PBMCs ou células T CD3+, e células-alvo que possuem um antígeno de marcador tumor-específico selecionado do grupo que consiste em antígeno A33, alfa-fetoproteína (AFP), integrina alfa 4, Ang2, B7-H3, B7-H6, antígeno de maturação de célula B (BCMA), antígeno de câncer 19-9 (CA19-9), antígeno de câncer 125 (CA-125), Anidrase Carbônica 6 (CA6), anidrase carbônica IX (CAIX), CEACAM5, cMET, CTLA4, Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 1 (CCR1), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 2 (CCR2), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 3 (CCR3), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 4 (CCR4), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 5 (CCR5), Receptor de Quimiocina de

Motivo C-C 6 (CCR6), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 7 (CCR7), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 8 (CCR8), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 9 (CCR9), Agrupamento de Diferenciação 7 (CD7), CD22, CD70, CD79a, CD79b, CD19, CCR8, CEA, βhCG, Lewis-Y, CA19-9, CA-125, CD20, CD22, CD25, CD33, CD38, CD30, CD44v6, CD47, CD56 (NCAM), CD63, CD79b, CD123, CD133, CD138, CD166, claudina-1, claudina 18.2, molécula do tipo lectina do tipo-C-1 (CLL-1), família do domínio de lectina do tipo-C 12 (CLEC12), antígeno Cora, ligante Notch canônico do tipo delta 3 (DDL3), desmogleína 4, ligante Notch não canônico do tipo delta 1 (DLK1), Ectonucleotídeo-Pirofosfatase/Fosfodiesterase 3 (ENPP3), EGFR, EGFRvIII, EpCAM, endosialina (CD248), variante do receptor do fator de crescimento epidérmico III (EGFRvIII), EphA2, antígeno F19, receptor de acetilcolina fetal (fnAChR), antígeno de ativação de fibroblasto (FAP), antígeno relacionado ao Fos 1 (FRA1), Receptor de Folato 1 (FOLR1), fucosil GM1, G250, gangliosídeo GD3, glipicano-3 (GPC3), 9-O-Acetil-GD3, GM2, Receptor de TNF induzido por glicocorticóide (GITR), globohexaosilceramida (globo-H), GD2, Glipicano 3 (GPC3), guanilil ciclase C (GCC), HER2, HER2 neu, HER3, HER4, HER1, IL13Rα2, receptor do fator de crescimento do tipo insulina I (IGF-IR ), Proteína Lisossomal Associada à Membrana 1 (LAMP1), Molécula de Adesão Celular L1 (L1CAM), antígeno de linfócito 6 (Ly-6), proteoglicano de sulfato de condroitina do melanoma (MCSP), Metaloproteinase do tipo membrana (MT-MMP), mesotelina, mucina 1 (MUC1), MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC7, MUC16, receptor de substância inibidora muelleriana tipo II (MISIIR), molécula de adesão celular de nectina 4 (Nectina-4), antígeno epitelial transmembrana da próstata-6 (STEAP), antígeno de célula plasmática 1, antígeno de célula-tronco da próstata (PSCA), Morte Celular Programada 1 (PD1), Ligante de morte programada 1 (PD-L1), PSMA, Receptor Órfão do Tipo Receptor Tirosina-Quinase 1 (ROR1), antígeno Tn sialilado (s TN), proteína de transporte de fosfato sódio-dependente 2b (NaPi2b), Sonic Hedgehog (Shh), SAS, Membro 7 da Família SLAM (SLAM7), Receptor de Somatostatina 2 (SSTR2), Proteína Autoantigênica Espermática 17 (SP17), TAG72, Antígeno de Thomsen-Friedenreich (antígeno-TF), antígeno associado um tumor L6 (TAL6), glicoproteína trofoblástica (5T4), Trop-2, Wue-1, VEGFR1, VEGFR2 e proteína de tumor de Wilms (WT1). Em outra modalidade do citado anteriormente, a citocina testada é IL-2. Em outra modalidade do citado anteriormente, a citocina testada é TNF-alfa. Em outra modalidade do citado anteriormente, a citocina testada é IFN-gama. Em outra modalidade, uma AAC não clivada, intacta, administrada a um indivíduo que possui um tumor com marcador de célula-alvo que pode ser ligado pela porção de ligação liberada da AAC exibe potencial pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 6 vezes, pelo menos 7 vezes, pelo menos 8 vezes, pelo menos 9 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 30 vezes, pelo menos 50 vezes, pelo menos 100 vezes, ou pelo menos

1.000 vezes reduzido para resultar na produção sistêmica de citocinas Th1 e/ou pró-inflamatórias no indivíduo, comparados com os níveis de citocina produzidos pelas porções de ligação correspondentes liberadas de uma AAC tratada com protease em um indivíduo comparável com um tumor dosado com uma concentração molar equivalente. Na modalidade apresentada anteriormente, as citocinas podem ser avaliadas de uma amostra de sangue, fluido ou tecido removida do indivíduo. Na modalidade apresentada anteriormente, o indivíduo pode ser um camundongo, rato, macaco e humano. Em uma vantagem das AACs em questão, no entanto, foi descoberto que as propriedades citolíticas das composições não necessitam de pré-estimulação por citocinas; que a formação da sinapse imunológica da célula efetora ligada à célula- alvo pelas porções de ligação é suficiente para efetuar citólise ou apoptose na célula-alvo. Todavia, a produção de citocinas pró-inflamatórias são marcadores úteis para avaliar a potência ou os efeitos das AACs em questão; seja por ensaio in vitro ou no monitoramento do tratamento de um indivíduo com um tumor.

[242] De acordo com as modalidades de porção de ligação citadas acima, é vantajoso se o sítio de ligação que reconhece o antígeno de marcador de célula-alvo possuir uma afinidade de ligação elevada a fim de capturar como células- alvo a serem destruídas com alta eficiência. As AACs da revelação possuem a vantagem de que podem ser usadas várias vezes para morte de células tumorais na medida em que, em modalidades preferidas, a porção de ligação à célula-alvo da porção de ligação à célula-alvo liberada possui uma afinidade com um valor Kd na faixa de 10-7 a 10−10 M, como determinado em um ensaio de ligação in vitro. Se a afinidade de uma porção de ligação biespecífica para ligação de um marcador de célula-alvo é muito alta, a composição se liga à célula- alvo expressora e permanece em sua superfície, tornando-a inadequada para liberar e se ligar a outra célula. Em uma modalidade, a porção de ligação da célula efetora liberada de uma AAC em questão possui uma constante de ligação entre 10-5 e 10-8 M, como determinado em um ensaio de ligação in vitro, cujos exemplos detalhados são descritos nos Exemplos, abaixo. Em outra modalidade, a porção de ligação da célula efetora liberada (FBM) de uma AAC em questão possui uma afinidade de ligação menor para o ligante da célula efetora de pelo menos uma ordem de magnitude menor, comparada com a afinidade de ligação maior da SBM para o marcador de célula- alvo, como determinado como uma constante Kd em um ensaio in vitro.

[243] Em outro aspecto, é uma característica das composições projetadas que, quando o RS da AAC é clivado por uma protease de mamífero no ambiente da célula-alvo e é convertido da forma de pró-fármaco na forma ativada ou de apoproteína, mediante clivagem e liberação das porções de ligação biespecíficas e do XTEN da composição, as FBM e SBM fundidas se ligam e unem juntas uma célula efetora (por exemplo, uma célula T que abriga CD3) e uma célula tumoral ou de câncer que abriga o marcador de célula-alvo de uma célula-alvo visada pela SBM e, em conseqüência, a célula efetora é ativada. Em uma modalidade, na qual o RS da AAC é clivado e as porções de ligação são liberadas, a ligação concomitante subseqüente da célula efetora e da célula-alvo resulta em uma ativação de pelo menos 3 vezes, ou 10 vezes, ou 30 vezes, ou 100 vezes, ou 300 vezes, ou 1.000 vezes da célula efetora, em que a ativação é avaliada pela produção de citocinas, proteínas citolíticas, ou pela lise da célula- alvo, avaliada em um ensaio baseado em células in vitro. Em outra modalidade, a ligação concomitante de uma célula T que abriga o antígeno CD3 e uma célula tumoral que abriga o marcador de célula-alvo de uma célula-alvo pelas porções de ligação liberadas forma uma sinapse imunológica, em que a ligação resulta na liberação de moléculas efetoras derivadas de células T capazes de lisar a célula tumoral. Exemplos não limitantes do ensaio in vitro para medição de ativação e/ou citólise da célula efetora incluem um ensaio de integridade da membrana celular, ensaio de cultura de células mistas, ensaio de iodeto de propídio baseado em FACS, ensaio de influxo de Azul tripano, ensaio fotométrico de liberação de enzima, ELISA, ensaio radiométrico de liberação de 51Cr, ensaio fluorimétrico de liberação de európio, ensaio de liberação de Calceína-AM, ensaio fotométrico de MTT, ensaio de XTT, ensaio de WST-1, ensaio de Azul Alamar, ensaio radiométrico de incorporação de 3H-Thd, ensaio clonogênico que mede atividade de divisão celular, fluorimétrico ensaio de Rodamina-123 que mede o gradiente transmembrana mitocondrial, ensaio de apoptose monitorado por exposição à fosfatidilserina baseado em FACS, ensaio de teste de TUNEL baseado em ELISA, ensaio de atividade de caspase e ensaio de morfologia celular, ou outros ensaios conhecidos na técnica para a avaliação de citocinas, proteínas citolíticas, ou lise de células, ou os métodos dos Exemplos, abaixo.

[244] Será observado por aqueles habilitados na técnica que, no contexto de tratamento de um indivíduo com o uso das composições em questão, as AACs estão presentes em uma forma de pró-fármaco e são convertidas em uma forma mais ativa quando entram em certo ambiente celular pela ação de proteases colocalizadas com o tecido ou célula doente. Mediante liberação da composição pela ação da protease (ou proteases) no tecido-alvo, a primeira porção de ligação com especificidade de ligação para um antígeno da célula efetora e a segunda porção de ligação ligada com especificidade de ligação para um marcador tumor-específico ou um antígeno de uma célula-alvo readquirem sua capacidade plena para se ligar e unir em conjunto a célula efetora à célula-alvo, formando uma sinapse imunológica.

A formação da sinapse imunológica faz com que a célula efetora se torne ativada, com diversas vias de sinalização ligando nova transcrição gênica e a liberação, por exocitose, do conteúdo da molécula efetora de suas vesículas.

Dependendo do tipo de célula efetora, diferentes citocinas e linfocinas são liberadas; por exemplo, células T helper Tipo 1 (Th1) liberam citocinas como IFN-gama, IL-2 e TNF-alfa, enquanto células T helper Tipo 2 (Th2) liberam citocinas como IL-4, IL-5, IL-10 e IL- 13, que estimulam células B, e linfócitos T citotóxicos (CTLs) liberam moléculas citotóxicas como perforina e granzimas que matam o alvo (coletivamente, “moléculas efetoras”). É especificamente contemplado que, mediante a ligação concomitante e união em conjunto da célula efetora à célula tumoral-alvo pelas porções de ligação biespecíficas liberadas da AAC, em proporções de efetora para alvo (E:T) muito baixas, a célula tumoral é influenciada pelas moléculas efetoras liberadas pela célula efetora na sinapse imunológica entre as células, resultando em danos, lise mediada por perforina, morte celular e/ou apoptose induzida por granzima B da célula tumoral.

Dessa forma, em outro aspecto, é uma característica da composição projetada que, quando a composição de polipeptídeo recombinante ativável é administrada a um indivíduo com um tumor, a forma de pró- fármaco permanece no sistema circulatório em tecido normal,

mas é incapaz de extravasar para a vasculatura mais permeável do tumor, de modo que a forma de pró-fármaco da montagem é ativada pelas proteases colocalizadas com o tumor e que as porções de ligação liberadas se ligam em conjunto e unem uma célula efetora (por exemplo, uma célula T) e uma célula tumoral que expressa o marcador de célula-alvo visado pela SBM da composição e, conseqüentemente, a célula efetora é ativada e a lise da célula tumoral é efetuada. Em uma modalidade do citado anteriormente, a porção de ligação liberada no tumor do indivíduo ligada tanto a uma célula tumoral quanto a uma célula efetora exibe uma habilidade aumentada para ativar células efetoras de pelo menos 10 vezes, ou pelo menos 30 vezes, ou pelo menos 100 vezes, ou pelo menos 200 vezes, ou pelo menos 300 vezes, ou pelo menos 400 vezes, ou pelo menos 500 vezes, ou pelo menos 1.000 vezes, comparada com a AAC não clivada correspondente, intacta. Em outra modalidade do citado anteriormente, as porções de ligação liberadas no tumor do indivíduo ligadas tanto a uma célula tumoral quanto a uma célula efetora exibem uma habilidade aumentada para lisar a célula tumoral de pelo menos 10 vezes, ou pelo menos 30 vezes, ou pelo menos 100 vezes, ou pelo menos 200 vezes, ou pelo menos 300 vezes, ou pelo menos 400 vezes, ou pelo menos 500 vezes, ou pelo menos

1.000 vezes, comparadas com a AAC intacta correspondente que não foi clivada. Nas modalidades apresentadas anteriormente, a ativação da célula efetora e/ou a citotoxicidade podem ser avaliadas por métodos convencionais conhecidos na técnica, por exemplo, medição citométrica de células efetoras ativadas, ensaio de citocinas, medição do tamanho do tumor, ou por histopatologia. Nas modalidades apresentadas anteriormente, o indivíduo pode ser um camundongo, rato, cão, macaco e humano. Em particular, é especificamente contemplado que as composições em questão são projetadas de modo que tenham um índice terapêutico aumentado e toxicidade ou efeitos colaterais reduzidos, obtidos por uma combinação do efeito de blindagem e impedimento estérico de XTEN sobre a afinidade de ligação em relação às porções de ligação na forma de pró-fármaco, embora sejam capazes de liberar as porções de ligação biespecíficas (obtido por inclusão das seqüências de clivagem no RS) nas proximidades ou dentro de um tecido-alvo (por exemplo, um tumor) que produz uma protease para a qual o RS é um substrato.

[245] Em geral, XTENs com comprimentos cumulativos mais longos do que cerca de 400 resíduos incorporados nas composições resultam em raios hidrodinâmicos aumentados, peso molecular aparente aumentado e fator do peso molecular aparente aumentado de uma proteína recombinante, comparada com uma proteína não ligada a um XTEN. Por exemplo, a incorporação do XTEN pode aumentar eficazmente o raio hidrodinâmico das composições em questão além do tamanho de poro glomerular de aproximadamente 3-5 nm (que corresponde a um peso molecular aparente de cerca de 70 kDa) (Caliceti.

2003. “Pharmacokinetic and Biodistribution Properties of Poly(Ethylene Glycol)-Protein Conjugates”. Adv. Drug Deliv. Rev. 55: 1.261-1.277), resultando em depuração renal reduzida de proteínas circulantes com um aumento correspondente na meia-vida terminal. O raio hidrodinâmico aumentado transmitido por XTEN também reduz o extravasamento da forma de pró-fármaco intacta da AAC do sistema circulatório em áreas de tecido normal, saudável, com tamanhos de poro médios de 5-12 nm, mas permite a saída das moléculas da composição intacta em vasos sangüíneos que permeiam tumores, onde as junções da célula epitelial são mais porosas. Sabe-se há muito tempo que várias funções da vasculatura tumoral estão prejudicadas, por exemplo, uma permeabilidade vascular maior do que os vasos normais (Duran- Reynals, F. “Studies on the Localization of Dyes and Foreign Proteins in Normal and Malignant Tissue”. Am. J. Cancer 35: 98–107 (1939); Babson A.L., Winnick T. “Protein Transfer in Tumor-Bearing Rats”. Cancer Res14: 606–611 (1954)). Essas funções prejudicadas contribuem para a concentração maior de proteínas plasmáticas detectada em tecidos tumorais do que em tecidos normais; um fenômeno foi elucidado por Maeda e colaboradores (Matsumura Y., Maeda H. Cancer Res. 46: 6.387–

6.392 (1986); Maeda H., Matsumura Y. “Tumoritropic and Lymphotropic Principles of Macromolecular Drugs”. Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 6: 193–210 (1989), que o descreveram como a permeabilidade aumentada e efeito de retenção, que resultam de uma combinação da permeabilidade aumentada de vasos sangüíneos tumorais e da taxa de depuração diminuída de vasos linfáticos funcionais no tumor, com o resultado líquido de que as macromoléculas se acumulam em tumores. Sabe-se geralmente que o limite fisiológico superior do tamanho de poro nas paredes capilares da maior parte dos capilares sangüíneos não sinusoidais para a passagem de macromoléculas não endógenas varia entre 5 e 12 nm (Hemant Sarin. J. Angiogenes. Res. 2010; 2: 14), enquanto foi relatado que lacunas de células interendoteliais na barreira sangue-tumor tanto de tumores cerebrais quanto de tumores periféricos variam entre 40 nm e 200 nm ou mais de diâmetro

(Sarin, H. e cols. J. Translational Medicine 2009 7: 51). Em um objetivo da revelação, as AACs em questão foram projetadas para se beneficiarem do diferencial de tamanho de poro pela adição do XTEN, de modo que o extravasamento da AAC intacta no tecido normal seja reduzido, mas, no ambiente de permeabilidade aumentada da vasculatura tumoral ou outras áreas de inflamação, a montagem intacta pode extravasar e ser ativada pelas proteases no ambiente tumoral, liberando as porções de ligação às células efetoras e células-alvo. No caso do RS da AAC, o design se beneficia da circunstância de que, quando uma AAC está nas proximidades de tecidos doentes, por exemplo, um tumor, que elabora uma ou mais proteases, as seqüências de RS que são suscetíveis às (uma ou mais) proteases expressas pelo tumor são capazes de serem clivadas pelas proteases (descrito com mais detalhes, acima). A ação da protease cliva o segmento de liberação (RS) da composição, separando as porções de ligação do XTEN, resultando em componentes com peso molecular e raios hidrodinâmicos reduzidos, particularmente para as porções de ligação liberadas. Como será observado, a diminuição no peso molecular e no raio hidrodinâmico da composição também confere as propriedade de que as porções de ligação liberadas são capazes de se mover mais livremente em solução, se mover através de espaços com poros menores em tecidos e tumores, e extravasam mais prontamente dos poros maiores da vasculatura tumoral e penetram mais prontamente no tumor, resultando em uma habilidade aumentada para aderir e unir em conjunto a célula efetora e a célula tumoral. Essa propriedade pode ser medida por diferentes ensaios.

[246] Em uma modalidade, na qual o RS da AAC é clivado por uma protease de mamífero, mediante clivagem e liberação das porções de ligação biespecíficas e do XTEN da AAC, as porções de ligação possuem um coeficiente de difusão em solução salina tamponada com fosfato que é pelo menos 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes ou 100 vezes maior, comparada com a composição AAC intacta.

Em outra modalidade, o peso molecular aparente da composição AAC intacta é pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, ou pelo menos 5 vezes, ou pelo menos 10 vezes maior do que as porções de ligação liberadas por clivagem do RS por uma protease de mamífero, quando o peso molecular aparente é determinado por cromatografia por exclusão de tamanho (SEC). Em outra modalidade, o raio hidrodinâmico da composição AAC intacta é pelo menos 2 vezes, ou pelo menos 3 vezes, ou pelo menos 4 vezes, ou pelo menos 5 vezes, ou pelo menos 10 vezes maior do que as porções de ligação liberadas por clivagem do RS por uma protease de mamífero, quando o raio hidrodinâmico é determinado por cromatografia por exclusão de tamanho (SEC). Em outra modalidade, a revelação fornece uma AAC, em que, mediante clivagem do RS para liberar as porções de ligação e o XTEN da AAC, o raio hidrodinâmico das porções de ligação liberadas é menor do que cerca de 30%, ou de menos do que cerca de 40%, ou de menos do que cerca de 50% do raio hidrodinâmico da AAC intacta, quando o raio hidrodinâmico é avaliado por cromatografia por exclusão de tamanho.

Em outra modalidade, a revelação fornece uma AAC, em que, mediante clivagem do RS para liberar as porções de ligação e o XTEN da AAC, o raio hidrodinâmico das porções de ligação liberadas é menor do que cerca de 5 nm, ou de menos do que cerca de 4 nm, ou de menos do que cerca de 3 nm quando o raio hidrodinâmico é determinado por cromatografia por exclusão de tamanho. Em outra modalidade, a revelação fornece uma AAC, em que, mediante clivagem do RS para liberar as porções de ligação e o XTEN da AAC, as porções de ligação liberadas que possuem um raio hidrodinâmico de menos do que cerca de 5 nm, ou de menos do que cerca de 4 nm, ou de menos do que cerca de 3 nm, quando o raio hidrodinâmico é determinado por cromatografia por exclusão de tamanho, possui habilidade maior para penetrar em um tecido tumoral, comparada com uma AAC intacta. Em outra modalidade, a revelação fornece uma AAC, em que o raio hidrodinâmico da AAC não clivada, intacta, é maior do que cerca de 8 nm, ou maior do que cerca de 9 nm, ou maior do que cerca de 10 nm, ou maior do que cerca de 12 mm, quando o raio hidrodinâmico é determinado por cromatografia por exclusão de tamanho.

[247] É contemplado que as composições em questão terão, por seu design e ligação ao XTEN, propriedades farmacocinéticas aprimoradas quando administradas a um indivíduo, comparadas com as porções de ligação correspondentes não ligadas ao XTEN. Em uma modalidade, uma composição AAC administrada a um indivíduo usando uma dose terapeuticamente eficaz exibe uma meia-vida terminal em um indivíduo que está aumentada, mediante ou após administração a um indivíduo, em comparação com as porções de ligação correspondentes não ligadas à composição, por pelo menos cerca de 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes ou 100 vezes maior. Em outra modalidade, uma composição AAC administrada a um indivíduo usando uma dose terapeuticamente eficaz exibe área sob a curva (AUC) aumentada, mediante ou após administração a um indivíduo, em comparação com as porções de ligação correspondentes não ligadas à composição, de pelo menos 25%, 50%, 100%, 200%, ou pelo menos 300% ou mais.

Em outra modalidade, uma composição AAC administrada a um indivíduo usando uma dose terapeuticamente eficaz exibe um volume de distribuição menor, mediante ou após administração a um indivíduo, em comparação com as porções de ligação correspondentes não ligadas à composição, de pelo menos 25% menor, ou 50%, ou 100%, ou 200%, ou pelo menos 300% menor.

Em uma modalidade, uma composição AAC administrada a um indivíduo usando uma dose terapeuticamente eficaz exibe uma meia-vida terminal de pelo menos cerca de 20 h, ou pelo menos cerca de 30 h, ou pelo menos cerca de 32 h, ou pelo menos cerca de 48 h, ou pelo menos cerca de 72 h, ou pelo menos cerca de 96 h, ou pelo menos cerca de 120 h, ou pelo menos cerca de 144 h, ou pelo menos cerca de 7 dias, ou pelo menos cerca de 10 dias, ou pelo menos cerca de 14 dias após administração a um indivíduo.

Em outro aspecto, é especificamente contemplado que, por causa do design das AACs em questão que são preferencialmente ativadas por protease (ou proteases) em associação com um tecido doente como, por exemplo, sem limitação, um tumor, a concentração das porções de ligação liberadas na circulação de um indivíduo será baixa contribuindo, dessa forma, para o perfil de segurança aprimorado e menor incidência de efeitos colaterais, comparadas com composições biespecíficas que não possuem o XTEN de proteção e o segmento de liberação.

Em uma modalidade, a revelação fornece uma AAC, em que a concentração plasmática Cmax das porções de ligação liberadas da AAC por clivagem do RS por uma protease capaz de clivar o RS da composição mediante ou após uma única administração da composição de polipeptídeo quimérico a um indivíduo não excede cerca de 0,01 ng/ml, ou cerca de 0,03 ng/ml, ou cerca de 0,1 ng/ml, ou cerca de 0,3 ng/ml, ou cerca de 1 ng/ml, ou cerca de 10 ng/ml, ou cerca de 100 ng/ml. Em outra modalidade, a revelação fornece uma AAC, em que a concentração plasmática Cmax das porções de ligação liberadas da AAC após uma única administração da composição de polipeptídeo quimérico a um indivíduo na qual o RS foi clivado por uma protease capaz de clivar o RS da composição é pelo menos 10 vezes menor, ou pelo menos 30 vezes menor, ou pelo menos 100 vezes, ou pelo menos 1.000 vezes menor do que os níveis plasmáticos da AAC intacta no mesmo indivíduo. Nas modalidades apresentadas anteriormente do parágrafo, o indivíduo é um camundongo, ou um rato, ou um cão, ou um macaco, ou um humano.

[248] As construções de AAC descritas nesse relatório descritivo conferem múltiplas vantagens terapêuticas em relação aos anticorpos monoclonais tradicionais e a outras moléculas biespecíficas menores. É de particular importância a ativação condicional da AAC da presente revelação. As construções possuem uma habilidade reduzida para se ligar aos seus marcadores de célula-alvo visados em função do efeito de blindagem do XTEN não estruturado, volumoso, amarrado à AAC pelo segmento de liberação. Dessa forma, a atividade específica para tecido normal, não doente, das composições da revelação exemplares é significantemente reduzida, quando comparada com aquela de anticorpos e fragmentos de anticorpo análogos. A habilidade dos polipeptídeos para ativar em seu local de ação desejado (por exemplo, nas proximidades de um tecido doente como, por exemplo, uma célula tumoral ou de câncer), enquanto permanece basicamente inativo durante seu progresso até esse local, é um avanço no campo da terapêutica imuno-oncológica, oferecendo a promessa de produtos terapêuticos potentes e específicos com índice terapêutico aumentado, bem como um prontamente projetável e fabricável. VII. MÉTODOS E USOS DE COMPOSIÇÕES DE POLIPEPTÍDEO

RECOMBINANTE

[249] Em outro aspecto, a presente revelação fornece composições de polipeptídeo recombinante clivável e composições de anticorpo ativável e composições farmacêuticas que compreendem um polipeptídeo recombinante ou um anticorpo ativável que são particularmente úteis em cenários médicos; por exemplo, na prevenção, tratamento e/ou na melhora de certos cânceres, tumores ou doenças inflamatórias.

[250] Diversas estratégias terapêuticas foram usadas para o design das composições de polipeptídeo recombinante para uso em métodos de tratamento de um indivíduo com uma doença cancerosa, incluindo a modulação de respostas de células T direcionada à sinalização de TcR, particularmente usando porções VL e VH de anticorpos monoclonais anti-CD3 humano que são amplamente usados clinicamente em regimes imunossupressores. O monoclonal CD3-específico OKT3 foi o primeiro desses monoclonais aprovado para uso em humanos (Sgro, Toxicology 105 (1995), 23-29) e é amplamente usado clinicamente como um agente imunossupressor em transplante

(Chatenoud L., “Immunologic Monitoring During OKT3 Therapy”. Clin.

Transplant. 7: 422–430, 1993). Além disso, monoclonais anti-CD3 podem induzir sinalização parcial de célula T e anergia clonal (Smith, J.

Exp.

Med. 185 (1997), 1.413-1.422). O OKT3 reage com e bloqueia a função do complexo CD3 na membrana de células T; o complexo CD3 estando associado à estrutura de reconhecimento de antígeno de células T (TCR), que é essencial para transdução de sinal.

Esses e outros anticorpos específicos para CD3 desse tipo são capazes de induzir várias respostas de células T, incluindo produção de citocina (Von Wussow, “Human Gamma Interferon Production by Leukocytes Induced with Monoclonal Antibodies Recognizing T Cells”. J.

Immunol. 127: 1.197-1.200 (1981)), proliferação e indução de célula T supressora.

No câncer, foram feitas tentativas para utilizar células T citotóxicas para lisar células de câncer.

Sem se prender a uma teoria em particular, para efetuar a lise da célula-alvo, acredita-se que células T citotóxicas necessitem de um contato célula-a-célula direto; o TCR na célula T citotóxica deve reconhecer e engajar o antígeno apropriado na célula-alvo.

Isso cria a sinapse imunológica que, por sua vez, inicia uma cascata de sinalização dentro da célula T citotóxica, causando ativação de célula T e a produção de diversas citocinas e moléculas efetoras citotóxicas.

Perforina e granzimas são moléculas altamente tóxicas que são armazenadas em grânulos pré- formados que residem em células T citotóxicas ativadas.

Após reconhecimento da célula-alvo, os grânulos citoplasmáticos das células T citotóxicas recrutadas migram em direção à membrana da célula T citotóxica e, por fim, se fundem a ela e liberam seu conteúdo de forma direta na sinapse imunológica para formar um poro dentro da membrana da célula-alvo, rompendo a membrana plasmática da célula tumoral.

O poro criado age como um ponto de entrada para granzimas; uma família de serina-proteases que induzem apoptose das células tumorais.

A revelação contempla métodos de uso de AACs que são modificadas geneticamente para visar uma gama de células malignas, por exemplo, tumores, além ds células efetoras, a fim de iniciar a lise da célula-alvo e para efetuar um desfecho terapêutico benéfico, já que as AACs são projetadas de tal modo que um porção de ligação se liga e engaja CD3 para ativar a célula T citotóxica, enquanto a segunda porção de ligação pode ser projetada para visar diversos marcadores de célula-alvo diferentes que são característicos de malignidades específicas; unindo-os para a criação da sinapse imunológica.

Em uma vantagem particular do design, a ligação física da célula efetora citotóxica e da célula de câncer elimina a necessidade de processamento de antígeno, MHCI/ß2-microglobulina, bem como moléculas coestimulatórias.

Exemplos de marcadores de célula tumoral importantes incluem, sem limitação, os marcadores da Tabela 5. Por causa da diversidade de marcadores tumor-específicos (mais amplamente descritos, acima) que podem ser modificados geneticamente nas várias modalidades das composições AAC em questão, será observado que as composições resultantes terão utilidade contra diversos cânceres, incluindo tumores sólidos e hematológicos.

Em uma modalidade, a revelação fornece um método de tratamento de um indivíduo com um tumor.

O tumor que está sendo tratado pode compreender células tumorais que surgem de uma célula selecionada do grupo que consiste em célula estromal, fibroblastos, miofibroblastos,

células gliais, células epiteliais, células de gordura, células linfocíticas, células vasculares, células de músculo liso, células mesenquimais, células de tecido mamário, células da próstata, células do rim, células cerebrais, células do cólon, células ovarianas, células uterinas, células da bexiga, células cutâneas, células do estômago, células do trato geniturinário, células do cérvice, células uterinas, células do intestino delgado, células hepáticas, células pancreáticas, células da vesícula biliar, células do ducto biliar, células esofágicas, células da glândula salivar, células do pulmão e células da tireóide. Em uma vantagem adicional das composições, como as células efetoras citotóxicas não são consumidas durante o dano/destruição da célula-alvo de câncer em forma de ponte, após causar a lise de uma célula-alvo, uma célula efetora ativada pode liberar e se mover através do tecido local para outras células-alvo de câncer, se ligar ao antígeno-alvo, e iniciar lise celular adicional. Além disso, é contemplado que, em um ambiente localizado como um tumor sólido, a liberação de moléculas da célula efetora como, por exemplo, perforina e granzimas, resultará em danificação das células tumorais que estão adjacentes, mas não ligadas por certa molécula dos domínios de ligação biespecíficos, resultando em estase do crescimento ou regressão do tumor.

[251] Conseqüentemente, a utilidade da revelação será compreendida; que após administração de uma dose terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica que compreende uma AAC descrita nesse relatório descritivo a um indivíduo com um câncer ou tumor que possui o marcador de célula-alvo, a composição pode ser acionada por proteases em associação com ou colocalizadas com as células de câncer ou tumorais, liberando as FBM e SBM fundidas, de modo que uma sinapse imunológica possa ser criada pela união da célula- alvo e uma célula efetora, com o resultado de que moléculas efetoras derivadas da célula efetora capazes de lisar a célula-alvo são liberadas na sinapse, levando à apoptose, citólise, ou morte da câncer ou célula tumoral-alvo. Além disso, será observado por aqueles habilitados na técnica que o uso da AAC pode resultar em um efeito terapêutico benéfico sustentado e mais generalizado do que uma “morte simples” após a sinapse imunológica ser formada pela ligação dos domínios de ligação liberados para a célula efetora e célula- alvo de câncer.

[252] Em um aspecto, a revelação está relacionada aos métodos de tratamento de uma doença em um indivíduo, por exemplo, um câncer ou um distúrbio inflamatório. Em algumas modalidades, a revelação fornece um método de tratamento de uma doença em um indivíduo, que compreende a administração ao indivíduo necessitado de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica que compreende um polipeptídeo recombinante ou AAC descrita nesse relatório descritivo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica pode variar de acordo com fatores como, por exemplo, o estado de doença, idade, sexo e peso do indivíduo, e a habilidade do anticorpo ou porção do anticorpo para provocar uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz também é aquela na qual quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais das composições em questão são superados pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Uma quantidade profilaticamente eficaz se refere a uma quantidade de composição farmacêutica necessária para o período de tempo necessário para obter o resultado profilático desejado.

[253] Em uma modalidade do método de tratamento de uma doença em um indivíduo, a doença para o tratamento pode ser carcinomas, linfoma de Hodgkin, linfoma não-Hodgkin, linfoma de célula B, linfoma de célula T, linfoma folicular, linfoma de célula do manto, blastoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer de próstata, câncer de cabeça e pescoço, qualquer forma de câncer de pele, melanoma, câncer do trato geniturinário, câncer ovariano, câncer ovariano com ascite maligna, carcinomatose peritoneal, carcinoma seroso uterino, câncer endometrial, câncer cervical, câncer cólon-retal, uma malignidade intraperitoneal dos epitélios com ascite maligna, câncer uterino, mesotelioma no peritônio, cânceres renais, câncer de pulmão, câncer de pulmão de pequena célula, câncer de pulmão de célula não-pequena, câncer gástrico, câncer esofágico, câncer do estômago, câncer do intestino delgado, câncer do fígado, hepatocarcinoma, hepatoblastoma, lipossarcoma, câncer pancreático, câncer da vesícula biliar, cânceres do ducto biliar, carcinoma da glândula salivar, câncer da tireóide, câncer epitelial, adenocarcinoma, sarcomas de qualquer origem, malignidades hematológicas primárias, incluindo leucemias linfocíticas agudas ou crônicas, leucemias mielógenas agudas ou crônicas, distúrbios neoplásicos mieloproliferativos, ou distúrbios mielodisplásicos, miastenia grave, doença de Graves, tireoidite de Hashimoto ou síndrome de Goodpasture. A quantidade terapeuticamente eficaz pode produzir um efeito benéfico no auxílio para tratar (por exemplo, curar ou reduzir a severidade) ou evitar (por exemplo, reduzir a probabilidade de recorrência) de um câncer ou um tumor.

Em outra modalidade do método de tratamento da doença em um indivíduo, a composição farmacêutica é administrada ao indivíduo como duas ou mais doses terapeuticamente eficazes administradas duas vezes por semana, uma vez por semana, a cada duas semanas, a cada três semanas ou mensalmente.

Em outra modalidade do método, a composição farmacêutica é administrada ao indivíduo como duas ou mais doses terapeuticamente eficazes ao longo de um período de pelo menos duas semanas, ou pelo menos um mês, ou pelo menos dois meses, ou pelo menos três meses, ou pelo menos quatro meses, ou pelo menos cinco meses, ou pelo menos seis meses.

Em outra modalidade do método, uma primeira dose de sensibilização baixa é administrada ao indivíduo, seguida por uma ou mais doses de manutenção maiores ao longo da posologia de dosagem de pelo menos duas semanas, ou pelo menos um mês, ou pelo menos dois meses, ou pelo menos três meses, ou pelo menos quatro meses, ou pelo menos cinco meses, ou pelo menos seis meses.

A dose de sensibilização inicial administrada é selecionada do grupo que consiste em pelo menos cerca de 0,005 mg/kg, pelo menos cerca de 0,01 mg/kg, pelo menos cerca de 0,02 mg/kg, pelo menos cerca de 0,04 mg/kg, pelo menos cerca de 0,08 mg/kg, pelo menos cerca de 0,1 mg/kg, e uma ou mais doses de manutenção subseqüentes administradas são selecionadas do grupo que consiste em pelo menos cerca de 0,02 mg/kg, pelo menos cerca de 0,05 mg/kg, pelo menos cerca de 0,1 mg/kg, pelo menos cerca de 0,16 mg/kg, pelo menos cerca de 0,18 mg/kg, pelo menos cerca de 0,20 mg/kg, pelo menos cerca de 0,22 mg/kg, pelo menos cerca de 0,24 mg/kg,

pelo menos cerca de 0,26 mg/kg, pelo menos cerca de 0,27 mg/kg, pelo menos cerca de 0,28 mg/kg, pelo menos 0,3 mg/kg, pelo menos 0,4. mg/kg, pelo menos cerca de 0,5 mg/kg, pelo menos cerca de 0,6 mg/kg, pelo menos cerca de 0,7 mg/kg, pelo menos cerca de 0,8 mg/kg, pelo menos cerca de 0,9 mg/kg, pelo menos cerca de 1,0 mg/kg, pelo menos cerca de 1,5 mg/kg, ou pelo menos cerca de 2,0 mg/kg.

Em outra modalidade do método, a composição farmacêutica é administrada ao indivíduo por via intradérmica, subcutânea, intravenosa, intra-arterial, intra-abdominal, intraperitoneal, intratecal ou intramuscular.

Em outra modalidade do método, a composição farmacêutica é administrada ao indivíduo como uma ou mais doses terapeuticamente eficazes em bolo ou por infusão de 5 minutos a 96 horas, como tolerada para segurança e eficácia máximas.

Em outra modalidade do método, a composição farmacêutica é administrada ao indivíduo como uma ou mais doses terapeuticamente eficazes em bolo ou por infusão de 5 minutos a 96 horas, em que a dose é selecionada do grupo que consiste em pelo menos cerca de 0,005 mg/kg, pelo menos cerca de 0,01 mg/kg, pelo menos cerca de 0,02 mg/kg, pelo menos cerca de 0,04 mg/kg, pelo menos cerca de 0,08 mg/kg, pelo menos cerca de 0,1 mg/kg, pelo menos cerca de 0,12 mg/kg, pelo menos cerca de 0,14 mg/kg, pelo menos cerca de 0,16 mg/kg, pelo menos cerca de 0,18 mg/kg, pelo menos cerca de 0,20 mg/kg, pelo menos cerca de 0,22 mg/kg, pelo menos cerca de 0,24 mg/kg, pelo menos cerca de 0,26 mg/kg, pelo menos cerca de 0,27 mg/kg, pelo menos cerca de 0,28 mg/kg, pelo menos 0,3 mg/kg, pelo menos 0,4. mg/kg, pelo menos cerca de 0,5 mg/kg, pelo menos cerca de 0,6 mg/kg, pelo menos cerca de 0,7 mg/kg, pelo menos cerca de 0,8 mg/kg,

pelo menos cerca de 0,9 mg/kg, pelo menos cerca de 1,0 mg/kg, pelo menos cerca de 1,5 mg/kg, ou pelo menos cerca de 2,0 mg/kg.

Em outra modalidade do método, a composição farmacêutica é administrada ao indivíduo como uma ou mais doses terapeuticamente eficazes em bolo ou por infusão ao longo de um período de 5 minutos a 96 horas, em que a administração ao indivíduo resulta em uma concentração plasmática Cmax da AAC não clivada, intacta, de pelo menos cerca de 0,1 ng/ml até pelo menos cerca de 2 μg/ml ou mais no indivíduo que é mantida por pelo menos cerca de 3 dias, pelo menos cerca de 7 dias, pelo menos cerca de 10 dias, pelo menos cerca de 14 dias, ou pelo menos cerca de 21 dias.

A dose terapeuticamente eficaz é pelo menos cerca de 0,005 mg/kg, pelo menos cerca de 0,01 mg/kg, pelo menos cerca de 0,02 mg/kg, pelo menos cerca de 0,04 mg/kg, pelo menos cerca de 0,08 mg/kg, pelo menos cerca de 0,1 mg/kg, pelo menos cerca de 0,12 mg/kg, pelo menos cerca de 0,14 mg/kg, pelo menos cerca de 0,16 mg/kg, pelo menos cerca de 0,18 mg/kg, pelo menos cerca de 0,20 mg/kg, pelo menos cerca de 0,22 mg/kg, pelo menos cerca de 0,24 mg/kg, pelo menos cerca de 0,26 mg/kg, pelo menos cerca de 0,27 mg/kg, pelo menos cerca de 0,28 mg/kg, pelo menos 0,3 mg/kg, pelo menos 0,4 mg/kg, pelo menos cerca de 0,5 mg/kg, pelo menos cerca de 0,6 mg/kg, pelo menos cerca de 0,7 mg/kg, pelo menos cerca de 0,8 mg/kg, pelo menos cerca de 0,9 mg/kg, pelo menos cerca de 1,0 mg/kg, pelo menos cerca de 1,5 mg/kg, ou pelo menos cerca de 2,0 mg/kg.

Em uma modalidade, uma dose inicial é selecionada do grupo que consiste em pelo menos cerca de 0,005 mg/kg, pelo menos cerca de 0,01 mg/kg, pelo menos cerca de 0,02 mg/kg, pelo menos cerca de 0,04 mg/kg, pelo menos cerca de 0,08 mg/kg, pelo menos cerca de 0,1 mg/kg, e uma dose subseqüente é selecionada do grupo que consiste em pelo menos cerca de 0,1 mg/kg, pelo menos cerca de 0,12 mg/kg, pelo menos cerca de 0,14 mg/kg, pelo menos cerca de 0,16 mg/kg, pelo menos cerca de 0,18 mg/kg, pelo menos cerca de 0,20 mg/kg, pelo menos cerca de 0,22 mg/kg, pelo menos cerca de 0,24 mg/kg, pelo menos cerca de 0,26 mg/kg, pelo menos cerca de 0,27 mg/kg, pelo menos cerca de 0,28 mg/kg, pelo menos 0,3 mg/kg, pelo menos 0,4. mg/kg, pelo menos cerca de 0,5 mg/kg, pelo menos cerca de 0,6 mg/kg, pelo menos cerca de 0,7 mg/kg, pelo menos cerca de 0,8 mg/kg, pelo menos cerca de 0,9 mg/kg, pelo menos cerca de 1,0 mg/kg, pelo menos cerca de 1,5 mg/kg, ou pelo menos cerca de 2,0 mg/kg. Nas modalidades apresentadas anteriormente, a administração ao indivíduo resulta em uma concentração plasmática do polipeptídeo recombinante de pelo menos cerca de 0,1 ng/ml até pelo menos cerca de 2 ng/ml ou mais no indivíduo por pelo menos cerca de 3 dias, pelo menos cerca de 7 dias, pelo menos cerca de 10 dias, pelo menos cerca de 14 dias, ou pelo menos cerca de 21 dias. Nas modalidades apresentadas anteriormente do método, o indivíduo pode ser um camundongo, rato, macaco e humano.

[254] Em particular, as composições farmacêuticas podem ser usadas para o tratamento de câncer epitelial, preferivelmente adenocarcinomas, ou doença residual mínima, mais preferivelmente tumor sólido inicial, tumor sólido avançado ou tumor sólido metastático. Além disso, as composições farmacêuticas fornecidas nessa revelação são úteis no tratamento de sarcomas. Além disso, as composições farmacêuticas que compreendem um polipeptídeo recombinante fornecidas nessa revelação são úteis no tratamento de linfomas e leucemias, incluindo malignidades hematológicas primárias, incluindo leucemias linfocíticas agudas ou crônicas, leucemias mielógenas agudas ou crônicas, distúrbios neoplásicos mieloproliferativos, ou distúrbios mielodisplásicos, distúrbios de célula B como, por exemplo, linfoma de célula B, linfoma de Hodgkin e linfoma não- Hodgkin, linfoma difuso de grandes células B, linfoma folicular, linfoma de célula do manto, blastoma, leucemia linfática crônica derivada de células B (B-CLL) e/ou que possui uma doença autoimune relacionada às células B como, por exemplo, miastenia grave, doença de Graves, tireoidite de Hashimoto ou síndrome de Goodpasture. Além disso, as composições farmacêuticas que compreendem um polipeptídeo recombinante fornecidas nessa revelação são úteis no tratamento de cânceres que levam à ascite, incluindo câncer do trato geniturinário, câncer ovariano, câncer ovariano com ascite maligna, carcinomatose peritoneal, carcinoma seroso uterino, câncer endometrial, câncer cervical, câncer cólon- retal, câncer uterino, mesotelioma no peritônio, câncer pancreático, câncer de cólon, câncer de cólon com ascite maligna, e câncer gástrico.

[255] Em um aspecto, a revelação fornece um método para obtenção de um efeito benéfico em um câncer ou tumor mediado por administração de composições farmacêuticas que compreendem polipeptídeo recombinante ou composições AAC. Em uma modalidade do método, a revelação fornece o uso de uma composição farmacêutica em um método de tratamento de um câncer ou tumor em um indivíduo necessitado por administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica na qual um porção de ligação da composição é derivada de um anticorpo parental que se liga a um antígeno CD3 da célula efetora e um segundo domínio de ligação é derivado de um anticorpo parental que se liga a um antígeno de marcador de célula-alvo selecionado do grupo que consiste em antígeno A33, alfa-fetoproteína (AFP), integrina alfa 4, Ang2, B7-H3, B7-H6, antígeno de maturação de célula B (BCMA), antígeno de câncer 19-9 (CA19-9), antígeno de câncer 125 (CA-125), Anidrase Carbônica 6 (CA6), anidrase carbônica IX (CAIX), CEACAM5, cMET, CTLA4, Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 1 (CCR1), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 2 (CCR2), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 3 (CCR3), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 4 (CCR4), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 5 (CCR5), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 6 (CCR6), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 7 (CCR7), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 8 (CCR8), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 9 (CCR9), Agrupamento de Diferenciação 7 (CD7), CD22, CD70, CD79a, CD79b, CD19, CCR8, CEA, βhCG, Lewis-Y, CA19-9, CA-125, CD20, CD22, CD25, CD33, CD38, CD30, CD44v6, CD47, CD56 (NCAM), CD63, CD79b, CD123, CD133, CD138, CD166, claudina-1, claudina 18.2, molécula do tipo lectina do tipo-C-1 (CLL-1), família do domínio de lectina do tipo-C 12 (CLEC12), antígeno Cora, ligante Notch canônico do tipo delta 3 (DDL3), desmogleína 4, ligante Notch não canônico do tipo delta 1 (DLK1), Ectonucleotídeo Pirofosfatase/ Fosfodiesterase 3 (ENPP3), EGFR, EGFRvIII, EpCAM, endosialina (CD248), variante do receptor do fator de crescimento epidérmico III (EGFRvIII), EphA2, antígeno F19, receptor de acetilcolina fetal (fnAChR), antígeno de ativação de fibroblasto (FAP),

antígeno relacionado ao Fos 1 (FRA1), Receptor de Folato 1 (FOLR1), fucosil GM1, G250, gangliosídeo GD3, glipicano-3 (GPC3), 9-O-Acetil-GD3, GM2, Receptor de TNF induzido por glicocorticóide (GITR), globohexaosilceramida (globo-H), GD2, Glipicano 3 (GPC3), guanilil ciclase C (GCC), HER2, HER2 neu, HER3, HER4, HER1, IL13Rα2, receptor do fator de crescimento do tipo insulina I (IGF-IR ), Proteína Lisossomal Associada à Membrana 1 (LAMP1), Molécula de Adesão Celular L1 (L1CAM), antígeno de linfócito 6 (Ly-6), proteoglicano de sulfato de condroitina do melanoma (MCSP), Metaloproteinase do tipo membrana (MT-MMP), mesotelina, mucina 1 (MUC1), MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC7, MUC16, receptor de substância inibidora muelleriana tipo II (MISIIR), molécula de adesão celular de nectina 4 (Nectina-4), antígeno epitelial transmembrana da próstata-6 (STEAP), antígeno de célula plasmática 1, antígeno de célula-tronco da próstata (PSCA), Morte Celular Programada 1 (PD1), Ligante de morte programada 1 (PD-L1), PSMA, Receptor Órfão do Tipo Receptor Tirosina-Quinase 1 (ROR1), antígeno Tn sialilado (s TN), proteína de transporte de fosfato sódio-dependente 2b (NaPi2b), Sonic Hedgehog (Shh), SAS, Membro 7 da Família SLAM (SLAM7), Receptor de Somatostatina 2 (SSTR2), Proteína Autoantigênica Espermática 17 (SP17), TAG72, Antígeno de Thomsen-Friedenreich (antígeno-TF), antígeno associado um tumor L6 (TAL6), glicoproteína trofoblástica (5T4), Trop-2, Wue-1, VEGFR1, VEGFR2 e proteína de tumor de Wilms (WT1). Em uma modalidade do método, a administração da quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica leva à erradicação ou melhora do câncer ou distúrbio tumoral subjacente, de modo que é observada uma melhora no indivíduo,

apesar de o indivíduo ainda sofrer do distúrbio subjacente.

[256] Em outra modalidade, a revelação fornece o uso de uma composição farmacêutica que compreende uma AAC em um método de tratamento de um câncer ou tumor em um indivíduo por administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica na qual um porção de ligação da composição é derivada de um anticorpo parental dirigido a uma célula efetora selecionado do grupo que consiste nos anticorpos da Tabela 4 e uma segunda porção de ligação é derivada de um anticorpo parental que se liga a um antígeno- alvo da célula-alvo selecionado do grupo que consiste nos anticorpos da Tabela 5 e que ainda compreende um ou mais RSs da Tabela 1 ou Tabela 2 e um ou mais XTENs da Tabela 8 ou Tabela 10, a AAC que possui uma configuração como descrita nesse relatório descritivo. Em uma modalidade, as doses da composição farmacêutica do método são administradas como uma dose em bolo. Em outra modalidade, as doses da composição farmacêutica do método são administradas, cada uma, por infusão intravenosa. Em outra modalidade, as doses da composição farmacêutica do método são administradas, cada uma, por infusão intra-abdominal. Em outra modalidade, as doses da composição farmacêutica do método são administradas, cada uma, por infusão intra-arterial. Em outra modalidade, as doses da composição farmacêutica do método são administradas, cada uma, por injeção subcutânea. Em outra modalidade, as doses da composição farmacêutica do método são administradas, cada uma, por injeção intramuscular. Nas modalidades apresentadas anteriormente desse parágrafo, o indivíduo é selecionado do grupo que consiste em camundongo, rato, cão, macaco e humano.

[257] Em outro aspecto, a revelação está relacionada a um método de tratamento de um câncer ou um tumor em um indivíduo de acordo com um regime de tratamento.

Em uma modalidade, a revelação fornece um método de tratamento de um câncer ou um tumor em um indivíduo que compreende a administração ao indivíduo com a doença de acordo com um regime de tratamento que compreende duas ou mais doses consecutivas de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica que compreende um polipeptídeo recombinante ou composição AAC revelada nesse relatório descritivo.

A revelação fornece um método de tratamento de um câncer ou um tumor em um indivíduo que compreende a administração ao indivíduo com a doença de acordo com um regime de tratamento que compreende duas ou mais doses consecutivas de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica, em que a administração da quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica ao indivíduo obtém um efeito terapêutico benéfico.

Em outra modalidade, a revelação fornece um método de tratamento de um câncer ou um tumor em um indivíduo que compreende a administração ao indivíduo com a doença de acordo com um regime de tratamento que compreende duas ou mais doses consecutivas de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica revelada nesse relatório descritivo, em que o regime de tratamento resulta na melhora de um parâmetro ou desfecho clínico associado com a doença no indivíduo.

No citado anteriormente, o parâmetro ou desfecho clínico é selecionado de um ou qualquer combinação do grupo que consiste em redução da massa tumoral como uma resposta completa, parcial ou incompleta; tempo até progressão; tempo até fracasso do tratamento; resposta de biomarcador; sobrevida livre de progressão; sobrevida livre de doença; tempo até recorrência; tempo até metástase; tempo de sobrevida global; melhora da qualidade de vida; e melhora de sintomas.

[258] Em outro aspecto, a revelação está relacionada a um método de uso no qual o regime de tratamento é parte de um ciclo de tratamento especificado. Em uma modalidade do método, o ciclo de tratamento especificado do regime de tratamento compreende a administração de uma composição farmacêutica que compreende um polipeptídeo recombinante ou AAC revelada nesse relatório descritivo duas vezes por semana, a cada semana, a cada 10 dias, a cada duas semanas, a cada três semanas, ou a cada mês por cada ciclo de tratamento. Em outra modalidade do método, o regime de tratamento é usado no tratamento de uma doença, em que a doença é selecionada do grupo que consiste em carcinomas, linfoma de Hodgkin, linfoma não-Hodgkin, linfoma de célula B, linfoma de célula T, linfoma folicular, linfoma de célula do manto, blastoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer de próstata, câncer de cabeça e pescoço, qualquer forma de câncer de pele, melanoma, câncer do trato geniturinário, câncer ovariano, câncer ovariano com ascite maligna, carcinomatose peritoneal, carcinoma seroso uterino, câncer endometrial, câncer cervical, câncer cólon-retal, uma malignidade intraperitoneal dos epitélios com ascite maligna, câncer uterino, mesotelioma no peritônio, cânceres renais, câncer de pulmão, câncer de pulmão de pequena célula, câncer de pulmão de célula não-pequena, câncer gástrico, câncer esofágico, câncer do estômago, câncer do intestino delgado, câncer do fígado, hepatocarcinoma, hepatoblastoma, lipossarcoma, câncer pancreático, câncer da vesícula biliar, cânceres do ducto biliar, carcinoma da glândula salivar, câncer da tireóide, câncer epitelial, adenocarcinoma, sarcomas de qualquer origem, malignidades hematológicas primárias, incluindo leucemias linfocíticas agudas ou crônicas, leucemias mielógenas agudas ou crônicas, distúrbios neoplásicos mieloproliferativos, ou distúrbios mielodisplásicos, miastenia grave, doença de Graves, tireoidite de Hashimoto ou síndrome de Goodpasture.

[259] Em outro aspecto, a revelação está relacionada a métodos aprimorados de indução de morte de uma célula- alvo, por exemplo, uma célula de câncer, utilizando o polipeptídeo recombinante ou as composições AAC em questão reveladas nesse relatório descritivo, em que o método efetua morte ou induz apoptose na célula- ou tecido-alvo, mas com toxicidade e efeitos colaterais reduzidos. Em uma vantagem particular dos métodos da invenção, as propriedades aprimoradas das composições permitem formulações farmacêuticas de menor dose ou métodos de tratamento que utilizam uma dosagem reduzida, freqüência de dosagem reduzida e um regime de dose superior, ambos por causa da liberação direcionada aos tecidos e células e por causa das propriedades farmacocinéticas aprimoradas, resultando em um índice terapêutico superior; ou seja, eficácia aumentada com toxicidade reduzida. Conseqüentemente, as composições em questão podem ter eficácia e segurança superiores, comparadas com as porções de ligação correspondentes não ligadas aos polipeptídeos recombinantes ou AAC por causa da habilidade da porção volumosa anexada para reduzir a ligação não específica a tecidos saudáveis e para evitar o extravasamento do sistema circulatório no tecido saudável permitindo, ao mesmo tempo, penetração e ligação aumentadas no câncer ou tecido tumoral mediante a clivagem do RS e liberação das porções de ligação; resultando, dessa forma, em uma compartimentalização diferencial da forma de pró- fármaco versus as porções de ligação liberadas mediante clivagem da composição. Em uma modalidade, a revelação fornece um método de indução de morte de uma célula-alvo, o método compreendendo o contato da célula-alvo e uma célula efetora com uma AAC descrita nesse relatório descritivo, em que o contato resulta em um efeito na célula-alvo selecionado do grupo que consiste em perda de integridade da membrana, picnose, cariorréxis, indução da via intrínseca de apoptose, indução da via extrínseca de apoptose, apoptose, lise celular e morte celular. O efeito pode ser determinado em um ensaio in vitro baseado em células que compreende uma população mista das células-alvo e as células efetoras, e uma quantidade eficaz do polipeptídeo recombinante que possui afinidade de ligação para o marcador de célula-alvo e da célula efetora.

[260] Em outras modalidades, a revelação fornece métodos de indução de morte de uma célula-alvo em um indivíduo que possui um câncer que compreende uma população da célula-alvo. Em uma modalidade do método, o método compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica que compreende o polipeptídeo recombinante ou AAC ao indivíduo. Em outra modalidade do método, o método compreende a administração da composição farmacêutica como uma ou mais doses terapeuticamente eficazes administradas consecutivamente.

Em outra modalidade do método, o método compreende a determinação da quantidade de uma composição farmacêutica necessária para obter um efeito terapêutico no indivíduo que possui o câncer e administração da quantidade como duas ou mais doses consecutivas ao indivíduo.

Nos métodos citados anteriormente, o câncer é selecionado do grupo que consiste em carcinoma, linfoma de Hodgkin e linfoma não-Hodgkin, linfoma difuso de grandes células B, linfoma folicular, linfoma de célula do manto, blastoma, câncer de mama, câncer de mama ER/PR+, câncer de mama Her2+, câncer de mama triplo-negativo, câncer de cólon, câncer de cólon com ascite maligna, tumores mucinosos, câncer de próstata, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pele, melanoma, câncer do trato geniturinário, câncer ovariano, câncer ovariano com ascite maligna, carcinomatose peritoneal, carcinoma seroso uterino, câncer endometrial, câncer cervical, câncer cólon- retal, câncer uterino, mesotelioma no peritônio, câncer renal, tumor de Wilm, câncer de pulmão, câncer de pulmão de pequena célula, câncer de pulmão de célula não-pequena, câncer gástrico, câncer do estômago, câncer do intestino delgado, câncer do fígado, hepatocarcinoma, hepatoblastoma, lipossarcoma, câncer pancreático, câncer da vesícula biliar, cânceres do ducto biliar, câncer esofágico, carcinoma da glândula salivar, câncer da tireóide, câncer epitelial, arrenoblastoma, adenocarcinoma, sarcoma e leucemia linfática crônica derivada de células B.

Em outra modalidade do método, o método compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica ao indivíduo, em que o método resulta em uma melhora de um parâmetro ou desfecho clínico. Parâmetros ou desfechos clínicos exemplares podem ser sobrevida global, desfechos de sintomas, sobrevida livre de doença, taxa de resposta objetiva, resposta completa, duração da resposta, sobrevida livre de progressão, tempo até progressão, tempo até fracasso do tratamento, medição do tumor, tamanho do tumor, taxa de resposta do tumor, tempo até metástase e concentração de biomarcador. Em outra modalidade do método, o método compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica ao indivíduo, em que o método resulta em uma redução na freqüência, duração ou severidade em efeitos colaterais associados de forma diagnóstica no indivíduo, comparada com a administração de uma dose comparável, em mmoles/kg, a um indivíduo comparável de uma composição que compreende as FBM e SBM da AAC, em que os efeitos colaterais são selecionados do grupo que consiste em níveis plasmáticos aumentados de IL-2, níveis plasmáticos aumentados de TNF-alfa, níveis plasmáticos aumentados de IFN-gama, sépsis, neutropenia febril, neurotoxicidade, convulsões, encefalopatia, síndrome de liberação de citocinas, transtorno da fala, transtorno do equilíbrio, febre, dor de cabeça, confusão, hipotensão, neutropenia, náuseas, alteração da consciência, desorientação e enzimas hepáticas aumentadas.

[261] Os métodos da revelação podem incluir a administração de doses consecutivas de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica por um período de tempo suficiente para obter e/ou manter o parâmetro ou efeito clínico desejado, e essas doses consecutivas de uma quantidade terapeuticamente eficaz estabelece o regime da dose terapeuticamente eficaz para a composição farmacêutica; ou seja, a posologia para doses administradas consecutivamente, em que as doses são dadas em quantidades terapeuticamente eficazes para resultar em um efeito benéfico sustentado on qualquer sinal ou sintoma clínico, aspecto, parâmetro medido ou característica de um estado de câncer ou condição de doença incluindo, sem limitação, aqueles cânceres e tumores descritos nesse relatório descritivo.

[262] Para os métodos da invenção, polipeptídeo recombinante de composições AAC de ação mais longa são preferidos, de modo a aumentar a conveniência para o paciente, para aumentar o intervalo entre doses e para reduzir a quantidade de fármaco necessária para obter um efeito sustentado. Em uma modalidade, um método de tratamento compreende a administração de uma dose terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica que compreende o polipeptídeo recombinante ou AAC a um indivíduo necessitado que resulta em um ganho no tempo gasto dentro de uma janela terapêutica estabelecida para os componentes de porção de ligação da composição farmacêutica, comparados com os componentes de porção de ligação correspondentes não ligados à proteína de fusão e administrados em uma dose molar comparável a um indivíduo. Em alguns casos, o ganho no tempo gasto dentro da janela terapêutica é pelo menos cerca de três vezes, ou pelo menos cerca de quatro vezes, ou pelo menos cerca de cinco vezes, ou pelo menos cerca de seis vezes, ou pelo menos cerca de oito vezes, ou pelo menos cerca de 10 vezes, ou pelo menos cerca de 20 vezes, ou pelo menos cerca de 40 vezes, ou pelo menos cerca de 50 vezes, ou pelo menos cerca de 100 vezes maior, comparados com os componentes de porção de ligação correspondentes não ligados à proteína recombinante ou AAC e administrados em uma dose molar comparável a um indivíduo.

Os métodos ainda fornecem que a administração de várias doses consecutivas de uma composição farmacêutica administradas com o uso de uma regime da dose terapeuticamente eficaz a um indivíduo necessitado pode resultar em um ganho no tempo entre picos de Cmax e/ou níveis mínimos de Cmin consecutivos para os níveis sangüíneos da composição, comparados com os componentes de porção de ligação correspondentes não ligados à proteína de fusão.

Na modalidade apresentada anteriormente, o ganho no tempo gasto entre picos de Cmax e/ou níveis mínimos de Cmin consecutivos pode ser de pelo menos cerca de três vezes, ou pelo menos cerca de quatro vezes, ou pelo menos cerca de cinco vezes, ou pelo menos cerca de seis vezes, ou pelo menos cerca de oito vezes, ou pelo menos cerca de 10 vezes, ou pelo menos cerca de 20 vezes, ou pelo menos cerca de 40 vezes, ou pelo menos cerca de 50 vezes, ou pelo menos cerca de 100 vezes mais longo, comparado com o componente (ou componentes) de porção de ligação correspondente não ligado à proteína de fusão e administrado usando um regime de dose molar comparável estabelecido para os componentes de direcionamento.

Nas modalidades nesse relatório descritivo descritas acima nesse parágrafo, a administração da composição farmacêutica pode resultar em uma melhora em pelo menos um parâmetro sabidamente útil para avaliação do câncer ou tumor do indivíduo usando uma dose unitária menor em moles de polipeptídeo recombinante ou AAC, comparados com os componentes de porção de ligação correspondentes não ligados ao polipeptídeo recombinante ou AAC e administrados em uma dose molar ou regime de dose comparável a um indivíduo.

[263] Em outro aspecto, a revelação fornece métodos de fabricação de uma AAC. Em uma modalidade, o método compreende o cultivo de uma célula hospedeira que compreende uma construção de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo recombinante ativável sob condições que levam à expressão do polipeptídeo recombinante ativável, em que o polipeptídeo recombinante ativável compreende um RS1, RS2, FBM, SBM, XTEN1 e XTEN2, em que: i) o RS1 e RS2, em que o RS1 e RS2 são, cada um, substratos para clivagem por uma protease de mamífero e cada um compreende uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos 88% ou pelo menos 94%, ou 100% de identidade de seqüência para uma seqüência selecionada das seqüências da Tabela 1; ii) a FBM é um fragmento de anticorpo que compreende uma VL e uma VH derivadas de um anticorpo monoclonal que possui especificidade de ligação para CD3; iii) a SBM é um fragmento de anticorpo que compreende uma VL e uma VH derivadas de um anticorpo monoclonal que possui afinidade de ligação para o marcador de célula-alvo selecionado de antígeno A33, alfa-fetoproteína (AFP), integrina alfa 4, Ang2, B7-H3, B7-H6, antígeno de maturação de célula B (BCMA), antígeno de câncer 19-9 (CA19-9), antígeno de câncer 125 (CA-125), Anidrase Carbônica 6 (CA6), anidrase carbônica IX (CAIX), CEACAM5, cMET, CTLA4, Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 1 (CCR1), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 2 (CCR2), Receptor de Quimiocina de Motivo C- C 3 (CCR3), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 4 (CCR4), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 5 (CCR5), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 6 (CCR6), Receptor de Quimiocina de

Motivo C-C 7 (CCR7), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 8 (CCR8), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 9 (CCR9), Agrupamento de Diferenciação 7 (CD7), CD22, CD70, CD79a, CD79b, CD19, CCR8, CEA, βhCG, Lewis-Y, CA19-9, CA-125, CD20, CD22, CD25, CD33, CD38, CD30, CD44v6, CD47, CD56 (NCAM), CD63, CD79b, CD123, CD133, CD138, CD166, claudina-1, claudina 18.2, molécula do tipo lectina do tipo-C-1 (CLL-1), família do domínio de lectina do tipo-C 12 (CLEC12), antígeno Cora, ligante Notch canônico do tipo delta 3 (DDL3), desmogleína 4, ligante Notch não canônico do tipo delta 1 (DLK1), Ectonucleotídeo Pirofosfatase/ Fosfodiesterase 3 (ENPP3), EGFR, EGFRvIII, EpCAM, endosialina (CD248), variante do receptor do fator de crescimento epidérmico III (EGFRvIII), EphA2, antígeno F19, receptor de acetilcolina fetal (fnAChR), antígeno de ativação de fibroblasto (FAP), antígeno relacionado ao Fos 1 (FRA1), Receptor de Folato 1 (FOLR1), fucosil GM1, G250, gangliosídeo GD3, glipicano-3 (GPC3), 9-O-Acetil-GD3, GM2, Receptor de TNF induzido por glicocorticóide (GITR), globohexaosilceramida (globo-H), GD2, Glipicano 3 (GPC3), guanilil ciclase C (GCC), HER2, HER2 neu, HER3, HER4, HER1, IL13Rα2, receptor do fator de crescimento do tipo insulina I (IGF-IR ), Proteína Lisossomal Associada à Membrana 1 (LAMP1), Molécula de Adesão Celular L1 (L1CAM), antígeno de linfócito 6 (Ly-6), proteoglicano de sulfato de condroitina do melanoma (MCSP), Metaloproteinase do tipo membrana (MT-MMP), mesotelina, mucina 1 (MUC1), MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC7, MUC16, receptor de substância inibidora muelleriana tipo II (MISIIR), molécula de adesão celular de nectina 4 (Nectina-4), antígeno epitelial transmembrana da próstata-6 (STEAP), antígeno de célula plasmática 1, antígeno de célula-tronco da próstata (PSCA), Morte Celular Programada 1 (PD1), Ligante de morte programada 1 (PD-L1), PSMA, Receptor Órfão do Tipo Receptor Tirosina-Quinase 1 (ROR1), antígeno Tn sialilado (s TN), proteína de transporte de fosfato sódio-dependente 2b (NaPi2b), Sonic Hedgehog (Shh), SAS, Membro 7 da Família SLAM (SLAM7), Receptor de Somatostatina 2 (SSTR2), Proteína Autoantigênica Espermática 17 (SP17), TAG72, Antígeno de Thomsen-Friedenreich (antígeno-TF), antígeno associado um tumor L6 (TAL6), glicoproteína trofoblástica (5T4), Trop-2, Wue-1, VEGFR1, VEGFR2 e proteína de tumor de Wilms (WT1); iv) o XTEN1 e XTEN2, cada um, compreendem uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de seqüência para uma seqüência selecionada do grupo de seqüências apresentadas na Tabela 8; v) o polipeptídeo recombinante possui um arranjo estrutural do terminal-N para o terminal-C do seguinte modo: XTEN1-RS1-SBM-FBM-RS2-XTEN2, XTEN1-RS1-FBM-SBM-RS2-XTEN2, XTEN2-RS2-SBM-FBM-RS1-XTEN1, XTEN2-RS2-FBM-SBM-RS1-XTEN1, XTEN2-RS2-diabody-RS1-XTEN1, em que o diabody compreende VL e VH das FBM e SBM; e recuperação da composição de polipeptídeo ativável.

No método citado anteriormente, o polipeptídeo recombinante ativável é ativado por clivagem do RS1 e RS2 por uma ou mais proteases capazes de clivar o RS1 e RS2, resultando na liberação das FBM e SBM da composição, em que as FBM e SBM permanecem fundidas e o XTEN1 e XTEN2 do polipeptídeo recombinante ativável em um estado não clivado interferem com a ligação específica da FBM ao CD3 e da SBM ao marcador de célula-alvo, de modo que a constante de dissociação (Kd)

da FBM do polipeptídeo recombinante ativável em um estado não clivado para CD3 ou da SBM para o marcador de célula- alvo é pelo menos 100 vezes maior, comparada com a FBM ou com a SBM liberadas do polipeptídeo recombinante ativável por clivagem do RS1 e RS2, quando medida em ensaios in vitro que compreendem o marcador de célula-alvo sob condições comparáveis, por exemplo, concentrações molares equivalentes.

[264] VIII. Seqüências de ácidos nucleicos

[265] Em outro aspecto, a presente revelação está relacionada às seqüências de polinucleotídeos isoladas que codificam o polipeptídeo recombinante ou composições AAC e seqüências complementares às moléculas de polinucleotídeo que codificam o polipeptídeo recombinante ou composições AAC.

[266] Em algumas modalidades, a revelação fornece polinucleotídeos que codificam as modalidades de polipeptídeo recombinante ou composições AAC descritas nesse relatório descritivo, ou o complemento da seqüência de polinucleotídeos. Em uma modalidade, a revelação fornece uma seqüência de polinucleotídeos isolada que codifica um polipeptídeo recombinante que consiste em uma seqüência de aminoácidos com pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de seqüência para uma seqüência de aminoácidos apresentada na Tabela 11, Tabelas 14-16 ou Tabela 18, ou o complemento da seqüência de polinucleotídeos. Em uma modalidade, a revelação fornece uma seqüência de polinucleotídeos isolada que codifica uma composição AAC, em que a seqüência de polinucleotídeos possui pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%

ou 100% de identidade de seqüência para uma seqüência de polinucleotídeos apresentada na Tabela 11, Tabela 16 ou Tabela 18.

[267] Em outro aspecto, a revelação está relacionada aos métodos para a produção de seqüências de polinucleotídeos que codificam as modalidades de composição de polipeptídeo recombinante ou AAC, ou seqüências complementares às seqüências de polinucleotídeos, incluindo variantes homólogas destas, bem como métodos para expressar as proteínas expressas pelas seqüências de polinucleotídeos. Em geral, os métodos incluem a produção de uma seqüência de polinucleotídeos que codifica o polipeptídeo proteináceo recombinante ou composição AAC e que incorpora o gene codificador em um vetor de expressão apropriado para uma célula hospedeira. Para a produção de o polipeptídeo recombinante ou AAC codificado, o método inclui a transformação de uma célula hospedeira apropriada com o vetor de expressão, e cultivo da célula hospedeira sob condições que causam ou permitem que o polipeptídeo recombinante ou AAC resultante seja expresso na célula hospedeira transformada produzindo, dessa forma, o polipeptídeo recombinante ou AAC, que é recuperado por métodos descritos nesse relatório descritivo ou por métodos padronizados de purificação de proteína conhecidos na técnica. Técnicas recombinantes padronizadas em biologia molecular são usadas para fazer os polinucleotídeos e vetores de expressão da presente revelação.

[268] De acordo com a revelação, seqüências de ácidos nucleicos que codificam composições de polipeptídeo recombinante (ou seu complemento) são usadas para gerar moléculas de DNA recombinante que dirigem a expressão em células hospedeiras apropriadas. Várias estratégias de clonagem são adequadas para realização da presente revelação, muitas das quais são usadas para gerar uma construção que compreende um gene que codifica uma composição da presente revelação, ou seu complemento. Em uma modalidade, a estratégia de clonagem é usada para criar um gene que codifica uma construção de polipeptídeo recombinante que compreende nucleotídeos que codificam o polipeptídeo recombinante que é usado para transformar uma célula hospedeira para expressão da composição. Nas modalidades apresentadas anteriormente nesse relatório descritivo acima descritas nesse parágrafo, os genes podem compreender nucleotídeos que codificam as porções de ligação, segmentos de liberação e as porções volumosas nas configurações reveladas nesse relatório descritivo.

[269] Em uma abordagem, primeiro é preparada uma construção contendo a seqüência de DNA que corresponde à construção de polipeptídeo recombinante. Métodos exemplares para a preparação dessas construções são descritos nos Exemplos. A construção é então usada para criar um vetor de expressão adequado para a transformação de uma célula hospedeira, por exemplo, uma célula hospedeira procariótica, para a expressão e recuperação da construção de polipeptídeo recombinante. Quando desejado, a célula hospedeira é uma E. coli. Métodos exemplares para a criação de vetores de expressão, para a transformação de células hospedeiras e para a expressão e recuperação de XTENs são descritos nos Exemplos.

[270] O gene que codifica a construção de polipeptídeo recombinante pode ser feito em uma ou mais etapas, de forma totalmente sintética ou por síntese combinada com processos enzimáticos, por exemplo, clonagem mediada por enzima de restrição, PCR e sobreposição da extensão, incluindo métodos descritos com mais detalhes nos Exemplos. Os métodos revelados nesse relatório descritivo podem ser usados, por exemplo, para ligar seqüências de polinucleotídeos curtas que codificam os genes de vários componentes (por exemplo, domínios de ligação, ligantes, segmentos de liberação e XTEN) genes de um comprimento e seqüência desejados. Genes que codificam composições de polipeptídeo recombinante são montados a partir de oligonucleotídeos com o uso de técnicas padronizadas de síntese de genes. O design do gene pode ser feito usando algoritmos que otimizam o uso de códons e a composição de aminoácidos apropriada para a célula hospedeira de E. coli utilizada na produção do polipeptídeo recombinante. Em um método da revelação, uma biblioteca de polinucleotídeos que codificam os componentes das construções é criada e então montada, como descrito acima. Os genes resultantes são então montados e os genes resultantes usados para transformar uma célula hospedeira e produzir e recuperar as composições de polipeptídeo recombinante para avaliação de suas propriedades, como descrito nesse relatório descritivo.

[271] Os polinucleotídeos resultantes que codificam as seqüências de polipeptídeos recombinantes podem então ser individualmente clonados em um vetor de expressão. A seqüência de ácidos nucleicos é inserida no vetor por diversos procedimentos. Em geral, DNA é inserido em um sítio (ou sítios) de endonuclease de restrição apropriado usando metodologias conhecidas na técnica. Os componentes do vetor geralmente incluem, sem limitação, um ou mais de uma seqüência sinalizadora, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento intensificador, um promotor e uma seqüência de terminação da transcrição. A construção de vetores adequados contendo um ou mais desses componentes emprega técnicas de ligação padronizadas que são conhecidas por aqueles habilitados na técnica. Essas metodologias são bem conhecidas na técnica e são bem descritas na literatura científica e de patentes. Diversos vetores estão disponíveis publicamente. O vetor pode, por exemplo, estar na forma de um plasmídeo, cosmídeo, partícula viral ou fago que pode ser convenientemente submetido a procedimentos de DNA recombinante, e a escolha do vetor freqüentemente dependerá da célula hospedeira na qual ele será introduzido. Dessa forma, o vetor pode ser um vetor que se replica autonomamente, ou seja, um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, cuja replicação é independente de replicação cromossômica, por exemplo, um plasmídeo. Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido em uma célula hospedeira, é integrado no genoma da célula hospedeira e replicado junto com o cromossomo (ou cromossomos) no qual foi integrado.

[272] A revelação fornece o uso de vetores de expressão de plasmídeo que contêm seqüências de replicação e de controle que são compatíveis e reconhecidas pela célula hospedeira, e estão ligadas operativamente ao gene que codifica o polipeptídeo para expressão controlada do polipeptídeo. O vetor normalmente carrega um sítio de replicação, bem como seqüências que codificam proteínas que são capazes de fornecer seleção fenotípica em células transformadas. Essas seqüências de vetor são bem conhecidas para diversas bactérias, leveduras e vírus. Vetores de expressão úteis que podem ser usados incluem, por exemplo, segmentos de seqüências de DNA cromossômico, não cromossômico e sintético. O termo “vetor de expressão” se refere a uma construção de DNA que contém uma seqüência de DNA que está ligada operativamente a uma seqüência de controle adequada capaz de efetuar a expressão do DNA que codifica o polipeptídeo em um hospedeiro adequado. O requisito é que os vetores sejam replicáveis e viáveis na célula hospedeira de escolha. Vetores com número de cópia baixo ou alto podem ser usados, como desejado.

[273] Vetores adequados incluem, sem limitação, derivados de SV40 e pcDNA e plasmídeos bacterianos conhecidos como, por exemplo, col EI, pCR1, pBR322, pMal-C2, pET, pGEX, como descrito por Smith, e cols., Gene 57: 31-40 (1988), pMB9 e derivados deste, plasmídeos como, por exemplo, RP4, DNAs de fago como, por exemplo, os numerosos derivados de fago I como, por exemplo, NM98 9, além de outros DNAs de fago como, por exemplo, M13 e DNA de fago filamentoso de fita simples; plasmídeos de levedura como, por exemplo, o plasmídeo de 2 mícrons ou derivados do plasmídeo 2m, bem como vetores shuttle centroméricos e integrativos de levedura; vetores úteis em células eucarióticas como, por exemplo, vetores úteis em células de insetos ou de mamíferos; vetores derivados de combinações de plasmídeos e DNAs de fago, por exemplo, plasmídeos que foram modificados para empregar DNA de fago ou as seqüências de controle de expressão; e semelhantes. Sistemas de expressão de levedura que também podem ser usados na presente revelação incluem, sem limitação, o vetor não-fusão pYES2 (Invitrogen), os vetores de fusão pYESHisA, B, C (Invitrogen), pRS e semelhantes. As seqüências de controle do vetor incluem um promotor para efetuar a transcrição, uma seqüência operadora opcional para controlar essa transcrição, uma seqüência que codifica sítios de ligação de ribossomo de mRNA adequados, e seqüências que controlam a terminação da transcrição e tradução. O promotor pode ser qualquer seqüência de DNA que exiba atividade de transcrição na célula hospedeira de escolha, e pode ser derivado de genes que codificam proteínas homólogas ou heterólogas para a célula hospedeira. Promotores adequados para uso em vetores de expressão com hospedeiros procarióticos incluem os sistemas promotores de β-lactamase e lactose [Chang e cols., Nature, 275: 615 (1978); Goeddel e cols., Nature, 281: 544 (1979)], fosfatase alcalina, um sistema promotor de triptofano (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8: 4.057 (1980); EP 36.776], e promotores híbridos como, por exemplo, o promotor tac [deBoer e cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21-25 (1983)], todos ligados operativamente ao DNA que codifica polipeptídeos de CFXTEN. Promotores para uso em sistemas bacterianos também podem conter uma seqüência de Shine-Dalgarno (S.D.), ligada operativamente ao DNA que codifica o polipeptídeo recombinante polipeptídeos. IX. Métodos de produção do polipeptídeo recombinante e das composições AAC

[274] Em outro aspecto, a revelação está relacionada aos métodos de produção das composições de polipeptídeo recombinante em níveis elevados de expressão e fermentação de proteína funcional usando uma célula hospedeira de E. coli, bem como fornecimento de vetores de expressão que codificam as construções úteis em métodos para a produção das composições da construção de polipeptídeo citotoxicamente ativo em níveis de expressão elevados.

[275] Em uma modalidade, o método compreende as etapas de: 1) preparação do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo recombinante ou AAC de qualquer uma das modalidades reveladas nesse relatório descritivo, 2) clonagem do polinucleotídeo em um vetor de expressão, que pode ser um plasmídeo ou outro vetor sob controle de seqüências de transcrição e tradução apropriadas para expressão de proteína em nível elevado em um sistema biológico, 3) transformação de uma célula hospedeira de E. coli apropriada com o vetor de expressão, e 4) cultivo da célula hospedeira em meios nutrientes convencionais sob condições adequadas para a expressão da composição de polipeptídeo recombinante. Quando desejado, a célula hospedeira de E. coli é BL21 Gold. Pelo método, a expressão do polipeptídeo recombinante ou AAC resulta em titulações de fermentação de pelo menos 0,1 g/l, ou pelo menos 0,2 g/l, ou pelo menos 0,3 g/l, ou pelo menos 0,5 g/l, ou pelo menos 0,6 g/l, ou pelo menos 0,7 g/l, ou pelo menos 0,8 g/l, ou pelo menos 0,9 g/l, ou pelo menos 1 g/l do produto de expressão da célula hospedeira e em que pelo menos 70%, ou pelo menos 80%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 95%, ou pelo menos 97%, ou pelo menos 99% da proteína expressa são enovelados corretamente. Como usado nesse relatório descritivo, o termo “enovelados corretamente” significa que o componente de porção de ligação da composição possui a habilidade para se ligar especificamente ao seu ligante-alvo.

Em outra modalidade, a revelação fornece um método para a produção de um polipeptídeo recombinante ou composição AAC, o método compreendendo o cultivo em uma reação de fermentação de uma célula hospedeira que compreende um vetor que codifica um polipeptídeo que compreende o polipeptídeo recombinante ou composição AAC sob condições eficazes para expressar o produto polipeptídico em uma concentração de mais do que cerca de 10 miligramas/grama de peso seco de célula hospedeira (mg/g), ou pelo menos cerca de 250 mg/g, ou cerca de 300 mg/g, ou cerca de 350 mg/g, ou cerca de 400 mg/g, ou cerca de 450 mg/g, ou cerca de 500 mg/g do referido polipeptídeo quando a reação de fermentação alcança uma densidade óptica de pelo menos 130 em um comprimento de onda de 600 nm, e em que as porções de ligação da proteína expressa estão enoveladas corretamente.

Em outra modalidade, a revelação fornece um método para a produção de uma composição de polipeptídeo recombinante ou AAC, o método compreendendo o cultivo em uma reação de fermentação de uma célula hospedeira que compreende um vetor que codifica um polipeptídeo que compreende o polipeptídeo recombinante ou composição AAC sob condições eficazes para expressar o produto polipeptídico em uma concentração de mais do que cerca de 10 miligramas/grama de peso seco de célula hospedeira (mg/g), ou pelo menos cerca de 250 mg/g, ou cerca de 300 mg/g, ou cerca de 350 mg/g, ou cerca de 400 mg/g, ou cerca de 450 mg/g, ou cerca de 500 mg/g do referido polipeptídeo quando a reação de fermentação alcança uma densidade óptica de pelo menos 130 em um comprimento de onda de 600 nm, e em que o produto polipeptídico expresso é solúvel.

[276] A seguir serão apresentados exemplos de composições e avaliações de composições da revelação. Subentende-se que que várias outras modalidades podem ser praticadas, considerando a descrição geral fornecida acima.

EXEMPLOS Exemplo 1: Construção de construção de ProTIA com anti- EpCAM-anti-CD3-XTEN com segmento de liberação e XTEN

[277] O gene que codifica scFv anti-EpCAM/anti-CD3 em tandem, seguido com uma das seqüências do segmento de liberação multiespecífico (BSRS-1, seqüência de aminoácidos LSGRSDNHSPLGLAGS) foi sintetizado em Genescript, que introduziu sítios de restrição NdeI e BsaI que são compatíveis com os sítios NdeI e BsaI no vetor de destinação pBR322-XTEN864. Fragmentos gênicos digeridos por restrição contendo scFv anti-EpCAM/anti-CD3 em tandem e a BSRS-1 foram ligados no vetor pBR322-XTEN864 usando T4 DNA ligase e transformado em células BL21 Gold (New England Biolabs). Os transformantes foram avaliados por DNA Miniprep e a construção desejada foi confirmada por seqüenciamento de DNA. O vetor final codifica a molécula de ProTIA com os componentes (no terminal-N para o terminal-C) de scFv biespecífico anti-EpCAM-anti-CD3 em tandem com BSRS-1 como segmento de liberação fundido ao gene de XTEN_864 sob o controle de um promotor de PhoA e líder de secreção STII. A construção resultante é AC1278, com a seqüência de DNA e seqüência de aminoácidos codificada fornecidas na Tabela 11.

[278] Outro anti-EpCAM anti-CD3-XTEN com segmento de liberação, designado AC1476 e com a seqüência de DNA e seqüência de aminoácidos codificadas também fornecidas na

Tabela 11, foi construído de forma similar no vetor de base pYS0044-XTEN864-H6. A seqüência ressaltada representa peptídeo sinalizador, que é retirado por clivagem durante secreção e está ausente na proteína madura final.

[279] Variantes de ProTIA adicionais foram construídas usando o mesmo procedimento e suas seqüências de aminoácidos estão listadas na Tabela 14. Tabela 11: Seqüência de DNA e de aminoácidos de AC1278 e AC1476 anti-EpCAM-anti-CD3-XTEN com segmento de liberação. Nome da Seqüência de DNA Seqüência de aminoácidos* construção

ATGAAGAAAAACATCGCTTTTCTTCTTGCATCT MKKNIAFLLASMFVFSIATNAYAHH ATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAACGCGTAC HHHHHHELVMTQSPSSLTVTAGEKV GCTCATCACCACCATCATCACCATCACGAACTG TMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQ GTTATGACCCAAAGCCCGAGCAGCCTGACCGTT KPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFT ACCGCGGGCGAAAAGGTTACCATGAGCTGCAAA GSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYC AGCAGCCAAAGCCTGCTGAACAGCGGCAACCAA QNDYSYPLTFGAGTKLEIKGGGGSG AAGAACTACCTGACCTGGTACCAACAGAAGCCG GGGSGGGGSEVQLLEQSGAELVRPG GGTCAGCCGCCGAAACTGCTGATCTACTGGGCG TSVKISCKASGYAFTNYWLGWVKQR

AGCACCCGTGAGAGCGGCGTTCCGGACCGTTTT PGHGLEWIGDIFPGSGNIHYNEKFK AC1278 ACCGGCAGCGGCAGCGGTACCGACTTTACCCTG GKATLTADKSSSTAYMQLSSLTFED

ACCATTAGCAGCGTGCAGGCGGAAGATCTGGCG SAVYFCARLRNWDEPMDYWGQGTTV GTGTACTATTGCCAAAACGACTACAGCTACCCG TVSSGGGGSDVQLVQSGAEVKKPGA CTGACCTTTGGTGCGGGCACCAAACTGGAGATC SVKVSCKASGYTFTRYTMHWVRQAP AAGGGTGGCGGTGGCAGCGGCGGTGGTGGCAGC GQGLEWIGYINPSRGYTNYADSVKG GGCGGCGGTGGCAGCGAGGTTCAGCTGCTGGAA RFTITTDKSTSTAYMELSSLRSEDT CAGAGCGGCGCGGAGCTGGTGCGTCCGGGTACC ATYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTVT AGCGTTAAGATCAGCTGCAAGGCGAGCGGTTAT VSSGEGTSTGSGGSGGSGGADDIVL GCGTTCACCAACTACTGGCTGGGTTGGGTGAAG TQSPATLSLSPGERATLSCRASQSV CAACGTCCGGGTCACGGTCTGGAGTGGATCGGC SYMNWYQQKPGKAPKRWIYDTSKVA

Nome da Seqüência de DNA Seqüência de aminoácidos* construção

GACATTTTCCCGGGCAGCGGTAACATCCACTAC SGVPARFSGSGSGTDYSLTINSLEA AACGAGAAATTCAAGGGTAAAGCGACCCTGACC EDAATYYCQQWSSNPLTFGGGTKVE GCGGATAAAAGCAGCAGCACCGCGTATATGCAG IKGTAEAASASGLSGRSDNHSPLGL CTGAGCAGCCTGACCTTCGAAGATAGCGCGGTT AGSPGSPAGSPTSTEEGTSESATPE TACTTCTGCGCGCGTCTGCGTAACTGGGATGAA SGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTST CCGATGGATTACTGGGGTCAGGGCACCACCGTG EEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSA ACCGTTAGCAGCGGTGGTGGCGGCAGCGATGTT PGTSESATPESGPGSEPATSGSETP CAGCTGGTGCAAAGCGGTGCGGAAGTGAAAAAG GSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEG CCGGGTGCGAGCGTGAAAGTTAGCTGCAAAGCG TSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGT AGCGGCTATACCTTCACCCGTTACACCATGCAC STEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTS TGGGTTCGTCAGGCGCCGGGTCAGGGCCTGGAA TEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSE TGGATCGGCTACATCAACCCGAGCCGTGGCTAT SATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSES ACCAACTACGCGGATAGCGTGAAAGGTCGTTTC ATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEP ACCATTACCACCGACAAAAGCACCAGCACCGCG SEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESAT TACATGGAACTGAGCAGCCTGCGTAGCGAGGAT PESGPGTSESATPESGPGSPAGSPT ACCGCGACCTACTATTGCGCGCGTTACTATGAT STEEGTSESATPESGPGSEPATSGS GACCACTACTGCCTGGACTATTGGGGCCAAGGT ETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGS ACCACCGTTACCGTGAGCAGCGGTGAAGGCACC APGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSA AGCACCGGCAGCGGTGGTAGCGGTGGTAGCGGC PGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAP GGTGCGGATGACATCGTTCTGACCCAAAGCCCG GTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEG GCGACCCTGAGCCTGAGCCCGGGCGAGCGTGCG TSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGS ACCCTGAGCTGCCGTGCGAGCCAGAGCGTTAGC EPATSGSETPGTSESATPESGPGSE TACATGAACTGGTACCAGCAAAAGCCGGGCAAA PATSGSETPGTSESATPESGPGTST GCGCCGAAGCGTTGGATTTATGATACCAGCAAG EPSEGSAPGTSESATPESGPGSPAG GTTGCGAGCGGTGTTCCGGCGCGTTTCAGCGGT SPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGS AGCGGTAGCGGCACCGATTATAGCCTGACCATT PTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPS AACAGCCTGGAGGCGGAAGATGCGGCGACCTAC EGSAPGTSESATPESGPGSEPATSG TACTGCCAACAATGGAGCAGCAATCCGCTGACC SETPGTSESATPESGPGSEPATSGS

Nome da Seqüência de DNA Seqüência de aminoácidos* construção

TTCGGTGGTGGTACCAAAGTTGAAATTAAGGGC ETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGS ACCGCCGAAGCAGCTAGCGCCTCTGGCCTGTCA APGSPAGSPTSTEEGTSESATPESG GGTCGTTCTGATAACCATTCCCCACTGGGTCTG PGSEPATSGSETPGTSESATPESGP GCTGGGTCTCCAGGTAGCCCAGCTGGTAGCCCA GSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEG ACCTCTACCGAAGAAGGTACCTCTGAATCCGCT TSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGT ACTCCAGAATCCGGTCCTGGTACTAGCACTGAG SESATPESGPGTSESATPESGPGSE CCAAGCGAAGGTTCTGCTCCAGGCTCCCCGGCA PATSGSETPGSEPATSGSETPGSPA GGTAGCCCTACCTCTACCGAAGAGGGCACTAGC GSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTE ACCGAACCATCTGAGGGTTCCGCTCCTGGCACC PSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESA TCCACTGAACCGTCCGAAGGCAGTGCTCCGGGT TPESGPGTSTEPSEGSAPG ACTTCCGAAAGCGCAACTCCGGAATCCGGCCCT GGTTCTGAGCCTGCTACTTCCGGCTCTGAAACT CCAGGTAGCGAGCCAGCGACTTCTGGTTCTGAA ACTCCAGGTTCACCGGCGGGTAGCCCGACGAGC ACGGAGGAAGGTACCTCTGAGTCGGCCACTCCT GAGTCCGGTCCGGGCACGAGCACCGAGCCGAGC GAGGGTTCAGCCCCGGGTACCAGCACGGAGCCG TCCGAGGGTAGCGCACCGGGTTCTCCGGCGGGC TCCCCTACGTCTACGGAAGAGGGTACGTCCACT GAACCTAGCGAGGGCAGCGCGCCAGGCACCAGC ACTGAACCGAGCGAAGGCAGCGCACCTGGCACT AGCGAGTCTGCGACTCCGGAGAGCGGTCCGGGT ACGAGCACGGAACCAAGCGAAGGCAGCGCCCCA GGTACCTCTGAATCTGCTACCCCAGAATCTGGC CCGGGTTCCGAGCCAGCTACCTCTGGTTCTGAA ACCCCAGGTACTTCCACTGAACCAAGCGAAGGT AGCGCTCCTGGCACTTCTACTGAACCATCCGAA GGTTCCGCTCCTGGTACGTCTGAAAGCGCTACC

Nome da Seqüência de DNA Seqüência de aminoácidos* construção

CCTGAAAGCGGCCCAGGCACCTCTGAAAGCGCT ACTCCTGAGAGCGGTCCAGGCTCTCCAGCAGGT TCTCCAACCTCCACTGAAGAAGGCACCTCTGAG TCTGCTACCCCTGAATCTGGTCCTGGCTCCGAA CCTGCTACCTCTGGTTCCGAAACTCCAGGTACC TCGGAATCTGCGACTCCGGAATCTGGCCCGGGC ACGAGCACGGAGCCGTCTGAGGGTAGCGCACCA GGTACCAGCACTGAGCCTTCTGAGGGCTCTGCA CCGGGTACCTCCACGGAACCTTCGGAAGGTTCT GCGCCGGGTACCTCCACTGAGCCATCCGAGGGT TCAGCACCAGGTACTAGCACGGAACCGTCCGAG GGCTCTGCACCAGGTACGAGCACCGAACCGTCG GAGGGTAGCGCTCCAGGTAGCCCAGCGGGCTCT CCGACAAGCACCGAAGAAGGCACCAGCACCGAG CCGTCCGAAGGTTCCGCACCAGGTACAAGCGAG AGCGCGACTCCTGAATCTGGTCCGGGTAGCGAG CCTGCAACCAGCGGTTCTGAGACGCCGGGCACT TCCGAATCTGCGACCCCGGAGTCCGGTCCAGGT TCAGAGCCGGCGACGAGCGGTTCGGAAACGCCG GGTACGTCTGAATCAGCCACGCCGGAGTCTGGT CCGGGTACCTCGACCGAACCAAGCGAAGGTTCG GCACCGGGTACTAGCGAGAGCGCAACCCCTGAA AGCGGTCCGGGCAGCCCGGCAGGTTCTCCAACC AGCACCGAAGAAGGTTCCCCTGCTGGTAGCCCG ACCTCTACGGAGGAAGGTAGCCCTGCAGGTTCC CCAACTTCTACTGAGGAAGGTACTTCTGAGTCC GCTACCCCAGAAAGCGGTCCTGGTACCTCCACT GAACCGTCTGAAGGCTCTGCACCAGGCACTTCT

Nome da Seqüência de DNA Seqüência de aminoácidos* construção

GAGTCTGCTACTCCAGAAAGCGGCCCAGGTTCT GAACCAGCAACTTCTGGCTCTGAGACTCCAGGC ACTTCTGAGTCCGCAACGCCTGAATCCGGTCCT GGTTCTGAACCAGCTACTTCCGGCAGCGAAACC CCAGGTACCTCTGAGTCTGCGACTCCAGAGTCT GGTCCTGGTACTTCCACTGAGCCTAGCGAGGGT TCCGCACCAGGTTCTCCGGCTGGTAGCCCGACC AGCACGGAGGAGGGTACGTCTGAATCTGCAACG CCGGAATCGGGCCCAGGTTCGGAGCCTGCAACG TCTGGCAGCGAAACCCCGGGTACCTCCGAATCT GCTACACCGGAAAGCGGTCCTGGCAGCCCTGCT GGTTCTCCAACCTCTACCGAGGAGGGTTCACCG GCAGGTAGCCCGACTAGCACTGAAGAAGGTACT AGCACGGAGCCGAGCGAGGGTAGTGCTCCGGGT ACGAGCGAGAGCGCAACGCCAGAGAGCGGTCCA GGCACCAGCGAATCGGCCACCCCTGAGAGCGGC CCAGGTACTTCTGAGAGCGCCACTCCTGAATCC GGCCCTGGTAGCGAGCCGGCAACCTCCGGCTCA GAAACTCCTGGTTCGGAACCAGCGACCAGCGGT TCTGAAACTCCGGGTAGCCCGGCAGGCAGCCCA ACGAGCACCGAAGAGGGTACCAGCACGGAACCG AGCGAGGGTTCTGCCCCGGGTACTTCCACCGAA CCATCGGAGGGCTCTGCACCTGGTAGCGAACCT GCGACGTCTGGTTCTGAAACGCCGGGTACCAGC GAAAGCGCTACCCCAGAATCCGGTCCGGGCACT AGCACCGAGCCATCGGAGGGCTCCGCACCAGGT

ATGAAGAAAAACATCGCTTTTCTTCTTGCATCT MKKNIAFLLASMFVFSIATNAYADI AC1476

ATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAACGCGTAC QMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSTK

Nome da Seqüência de DNA Seqüência de aminoácidos* construção

GCTGATATTCAGATGACCCAATCGCCGTCGTCC SLLHSNGITYLYWYQQKPGKAPKLL CTGTCAGCTTCAGTCGGTGATCGTGTTACCATT IYQMSNLASGVPSRFSSSGSGTDFT ACCTGTCGCTCAACGAAATCCCTGCTGCATTCA LTISSLQPEDFATYYCAQNLEIPRT AACGGTATTACCTATCTGTACTGGTATCAGCAA FGQGTKVEIKGATPPETGAETESPG AAACCGGGCAAAGCGCCGAAACTGCTGATCTAC ETTGGSAESEPPGEGQVQLVQSGPG CAGATGTCGAATCTGGCCAGCGGTGTTCCGTCT LVQPGGSVRISCAASGYTFTNYGMN CGTTTTAGCTCTAGTGGTTCTGGCACCGATTTC WVKQAPGKGLEWMGWINTYTGESTY ACCCTGACGATTTCCTCACTGCAACCGGAAGAC ADSFKGRFTFSLDTSASAAYLQINS TTTGCAACGTATTACTGCGCTCAGAACCTGGAA LRAEDTAVYYCARFAIKGDYWGQGT ATCCCGCGTACCTTCGGTCAAGGCACGAAAGTC LLTVSSGGGGSDIQMTQSPSSLSAS GAAATTAAAGGTGCAACGCCTCCGGAGACTGGT VGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQK GCTGAAACTGAGTCCCCGGGCGAGACGACCGGT PGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSG GGCTCTGCTGAATCCGAACCACCGGGCGAAGGC SGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQ CAAGTGCAACTGGTTCAGAGCGGTCCGGGTCTG QGNTLPWTFGQGTKVEIKGATPPET GTCCAACCGGGTGGCAGTGTGCGTATTTCCTGC GAETESPGETTGGSAESEPPGEGEV GCGGCCTCAGGTTACACCTTTACGAACTATGGC QLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGY ATGAATTGGGTGAAACAGGCCCCGGGTAAAGGC SFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALIN CTGGAATGGATGGGTTGGATCAACACCTACACG PYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKN GGCGAATCTACCTATGCAGATAGTTTCAAAGGC TAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYY CGCTTTACCTTCAGCCTGGACACGTCTGCTAGT GDSDWYFDVWGQGTLVTVSSGTAEA GCAGCTTATCTGCAGATTAATAGCCTGCGTGCG ASASGLSGRSDNHSPLGLAGSPGSP GAAGATACGGCCGTTTATTACTGTGCGCGCTTT AGSPTSTEEGTSESATPESGPGTST GCAATCAAAGGCGACTACTGGGGCCAAGGCACC EPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTE CTGCTGACCGTGTCCTCCGGTGGTGGCGGCAGC PSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESA GACATCCAAATGACCCAGAGCCCGAGCAGCCTG TPESGPGSEPATSGSETPGSEPATS AGCGCGAGCGTGGGCGACCGTGTTACCATCACC GSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATP TGCCGTGCGAGCCAAGACATCCGTAACTACCTG ESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEG AACTGGTATCAGCAAAAGCCGGGTAAAGCGCCG SAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGS

Nome da Seqüência de DNA Seqüência de aminoácidos* construção

AAGCTGCTGATCTACTATACCAGCCGTCTGGAG APGTSTEPSEGSAPGTSESATPESG AGCGGCGTGCCGAGCCGTTTCAGCGGTAGCGGT PGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGP AGCGGTACCGACTACACCCTGACCATTAGCAGC GSEPATSGSETPGTSTEPSEGSAPG CTGCAGCCGGAAGATTTCGCGACCTACTATTGC TSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGT CAGCAGGGTAACACCCTGCCGTGGACCTTTGGT SESATPESGPGSPAGSPTSTEEGTS CAAGGCACCAAAGTTGAGATTAAAGGCGCCACG ESATPESGPGSEPATSGSETPGTSE CCTCCGGAAACTGGTGCTGAGACGGAATCCCCT SATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTE GGTGAAACCACTGGCGGTTCTGCCGAATCTGAA PSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEP CCGCCTGGTGAAGGCGAGGTGCAGCTGGTTGAA SEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPS AGCGGTGGCGGTCTGGTGCAACCAGGCGGTAGC EGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSE CTGCGTCTGAGCTGCGCGGCGAGCGGTTACAGC GSAPGTSESATPESGPGSEPATSGS TTTACCGGTTATACCATGAACTGGGTTCGTCAA ETPGTSESATPESGPGSEPATSGSE GCGCCAGGTAAAGGTCTGGAGTGGGTGGCGCTG TPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSA ATCAACCCGTACAAGGGTGTTAGCACCTATAAC PGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEE CAGAAGTTCAAAGACCGTTTTACCATTAGCGTG GSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEG GATAAGAGCAAAAACACCGCGTACCTGCAAATG TSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGT AACAGCCTGCGTGCGGAGGACACCGCTGTGTAC SESATPESGPGSEPATSGSETPGTS TATTGCGCGCGTAGCGGTTACTATGGCGACAGC ESATPESGPGSEPATSGSETPGTSE GACTGGTATTTTGATGTGTGGGGCCAAGGCACC SATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAG CTGGTTACCGTGAGCTCCGGCACCGCCGAAGCA SPTSTEEGTSESATPESGPGSEPAT GCTAGCGCCTCTGGCCTGTCAGGTCGTTCTGAT SGSETPGTSESATPESGPGSPAGSP AACCATTCCCCACTGGGTCTGGCTGGGTCTCCA TSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSE GGTAGCCCAGCTGGTAGCCCAACCTCTACCGAA GSAPGTSESATPESGPGTSESATPE GAAGGTACCTCTGAATCCGCTACTCCAGAATCC SGPGTSESATPESGPGSEPATSGSE GGTCCTGGTACTAGCACTGAGCCAAGCGAAGGT TPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTE TCTGCTCCAGGCTCCCCGGCAGGTAGCCCTACC EGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAP TCTACCGAAGAGGGCACTAGCACCGAACCATCT GSEPATSGSETPGTSESATPESGPG GAGGGTTCCGCTCCTGGCACCTCCACTGAACCG TSTEPSEGSAPGHHHHHH

Nome da Seqüência de DNA Seqüência de aminoácidos* construção

TCCGAAGGCAGTGCTCCGGGTACTTCCGAAAGC GCAACTCCGGAATCCGGCCCTGGTTCTGAGCCT GCTACTTCCGGCTCTGAAACTCCAGGTAGCGAG CCAGCGACTTCTGGTTCTGAAACTCCAGGTTCA CCGGCGGGTAGCCCGACGAGCACGGAGGAAGGT ACCTCTGAGTCGGCCACTCCTGAGTCCGGTCCG GGCACGAGCACCGAGCCGAGCGAGGGTTCAGCC CCGGGTACCAGCACGGAGCCGTCCGAGGGTAGC GCACCGGGTTCTCCGGCGGGCTCCCCTACGTCT ACGGAAGAGGGTACGTCCACTGAACCTAGCGAG GGCAGCGCGCCAGGCACCAGCACTGAACCGAGC GAAGGCAGCGCACCTGGCACTAGCGAGTCTGCG ACTCCGGAGAGCGGTCCGGGTACGAGCACGGAA CCAAGCGAAGGCAGCGCCCCAGGTACCTCTGAA TCTGCTACCCCAGAATCTGGCCCGGGTTCCGAG CCAGCTACCTCTGGTTCTGAAACCCCAGGTACT TCCACTGAACCAAGCGAAGGTAGCGCTCCTGGC ACTTCTACTGAACCATCCGAAGGTTCCGCTCCT GGTACGTCTGAAAGCGCTACCCCTGAAAGCGGC CCAGGCACCTCTGAAAGCGCTACTCCTGAGAGC GGTCCAGGCTCTCCAGCAGGTTCTCCAACCTCC ACTGAAGAAGGCACCTCTGAGTCTGCTACCCCT GAATCTGGTCCTGGCTCCGAACCTGCTACCTCT GGTTCCGAAACTCCAGGTACCTCGGAATCTGCG ACTCCGGAATCTGGCCCGGGCACGAGCACGGAG CCGTCTGAGGGTAGCGCACCAGGTACCAGCACT GAGCCTTCTGAGGGCTCTGCACCGGGTACCTCC ACGGAACCTTCGGAAGGTTCTGCGCCGGGTACC

Nome da Seqüência de DNA Seqüência de aminoácidos* construção

TCCACTGAGCCATCCGAGGGTTCAGCACCAGGT ACTAGCACGGAACCGTCCGAGGGCTCTGCACCA GGTACGAGCACCGAACCGTCGGAGGGTAGCGCT CCAGGTAGCCCAGCGGGCTCTCCGACAAGCACC GAAGAAGGCACCAGCACCGAGCCGTCCGAAGGT TCCGCACCAGGTACAAGCGAGAGCGCGACTCCT GAATCTGGTCCGGGTAGCGAGCCTGCAACCAGC GGTTCTGAGACGCCGGGCACTTCCGAATCTGCG ACCCCGGAGTCCGGTCCAGGTTCAGAGCCGGCG ACGAGCGGTTCGGAAACGCCGGGTACGTCTGAA TCAGCCACGCCGGAGTCTGGTCCGGGTACCTCG ACCGAACCAAGCGAAGGTTCGGCACCGGGTACT AGCGAGAGCGCAACCCCTGAAAGCGGTCCGGGC AGCCCGGCAGGTTCTCCAACCAGCACCGAAGAA GGTTCCCCTGCTGGTAGCCCGACCTCTACGGAG GAAGGTAGCCCTGCAGGTTCCCCAACTTCTACT GAGGAAGGTACTTCTGAGTCCGCTACCCCAGAA AGCGGTCCTGGTACCTCCACTGAACCGTCTGAA GGCTCTGCACCAGGCACTTCTGAGTCTGCTACT CCAGAAAGCGGCCCAGGTTCTGAACCAGCAACT TCTGGCTCTGAGACTCCAGGCACTTCTGAGTCC GCAACGCCTGAATCCGGTCCTGGTTCTGAACCA GCTACTTCCGGCAGCGAAACCCCAGGTACCTCT GAGTCTGCGACTCCAGAGTCTGGTCCTGGTACT TCCACTGAGCCTAGCGAGGGTTCCGCACCAGGT TCTCCGGCTGGTAGCCCGACCAGCACGGAGGAG GGTACGTCTGAATCTGCAACGCCGGAATCGGGC CCAGGTTCGGAGCCTGCAACGTCTGGCAGCGAA

Nome da Seqüência de DNA Seqüência de aminoácidos* construção

ACCCCGGGTACCTCCGAATCTGCTACACCGGAA AGCGGTCCTGGCAGCCCTGCTGGTTCTCCAACC TCTACCGAGGAGGGTTCACCGGCAGGTAGCCCG ACTAGCACTGAAGAAGGTACTAGCACGGAGCCG AGCGAGGGTAGTGCTCCGGGTACGAGCGAGAGC GCAACGCCAGAGAGCGGTCCAGGCACCAGCGAA TCGGCCACCCCTGAGAGCGGCCCAGGTACTTCT GAGAGCGCCACTCCTGAATCCGGCCCTGGTAGC GAGCCGGCAACCTCCGGCTCAGAAACTCCTGGT TCGGAACCAGCGACCAGCGGTTCTGAAACTCCG GGTAGCCCGGCAGGCAGCCCAACGAGCACCGAA GAGGGTACCAGCACGGAACCGAGCGAGGGTTCT GCCCCGGGTACTTCCACCGAACCATCGGAGGGC TCTGCACCTGGTAGCGAACCTGCGACGTCTGGT TCTGAAACGCCGGGTACCAGCGAAAGCGCTACC CCAGAATCCGGTCCGGGCACTAGCACCGAGCCA TCGGAGGGCTCCGCACCAGGTCACCATCATCAC

CATCAC * peptídeo sublinhado representa o peptídeo sinalizador Exemplo 2: Produção de His8-aEpCAM-aCD3-BSRS1-XTEN864 não clivado e clivado de cultura de fermentação de E. coli 1) Expressão e purificação de His(8)-aEpCAM-aCD3-BSRS1- XTEN_AE864 de cultura de fermentação de E. coli

[280] A proteína de fusão AC1278 (MKKNIAFLLASMFVFSIATNAYA-His(8)-aEpCAM-aCD3-BSRS1- XTEN_AE864) foi expressa em uma cepa proprietária de E. coli AmE098. Uma cultura de fermentação de 10 litros foi desenvolvida a 37°C e a temperatura mudada para 26°C após depleção da alimentação de sal. Durante a colheita, o caldo de fermentação inteiro foi centrifugado para peletizar as células. O sobrenadante foi coletado, e floculação ácida foi então usada para reduzir contaminação por endotoxina e proteína da célula hospedeira. Com o uso de 1 M de ácido acético, o pH do sobrenadante foi gradualmente reduzido até pH 4,5 e deixado para incubar em temperatura ambiente por 30 minutos. O pH foi então elevado de volta até pH 7,5 usando 2 M de NaOH e mantido de um dia para o outro a 4°C. No dia seguinte, o sobrenadante foi filtrado em 0,20 µm usando uma cápsula de filtro de 3 M LifeAssure.

[281] Para assegurar a integridade do terminal-N no tag de afinidade His, cromatografia por afinidade imobilizada em metal foi usada como a primeira etapa de captura. Cinco invólucros de coluna de 10 ml RedisepRf 25G (Teledyne Isco) foram recheadas com 10 ml de resina ToyoPearl-AF-Chelate 650M (TOSOH Biosciences). As colunas foram higienizadas com 0,5 M de NaOH, cuidadosamente enxaguadas com água destilada, e depois carregadas com 0,1 M de Ni2SO4, e equilibradas com 5 volumes de coluna (CVs) de tampão de equilíbrio (20 mM de Tris, 250 mM de NaCl, pH 7,5). Em função do ponto de nuvem do Triton X-114 de 23°C, Tampão de lavagem Triton (20 mM de Tris, 100 mM de NaCl, Triton X- 114 0,1%, pH 7,5) e Tampão de lavagem 2 (20 mM de Tris, 100 mM de NaCl, pH 7,5) foram preparados antecipadamente, armazenados a 4°C, e mantidos no gelo durante o uso. Após equilíbrio da coluna, o sobrenadante foi carregado na coluna. Após 3 CVs de tampão de equilíbrio como filete, a coluna foi lavada com 10 CVs de Tampão de lavagem Triton gelado para reduzir endotoxina, seguidos por 10 CVs de Tampão de lavagem

2 gelado para remover Triton X-114. Proteína foi então eluída da coluna com 3 CVs de tampão de eluição (20 mM de Tris, 100 mM de NaCl, 150 mM de imidazol, pH 7,5), e frações de 1 CV (10 ml) foram coletadas. Para oxidação reduzida de proteína, 5 mM de EDTA foram adicionados a cada eluição. O carregamento, fluxo passante e eluições foram analisados por SDS-PAGE não redutora com Bis-Tris 4-12% e coloração Coomassie. Com base no gel, CV1 e CV2 da eluição foram salvos para processamento adicional. (FIG. 14A)

[282] Cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) foi escolhida como a etapa de polimento subseqüente. Dois invólucros de coluna de 20 ml RedisepRf 25G (Teledyne Isco) foram recheados com 20 ml de resina Toyopearl-Phenyl-650M (TOSOH Biosciences). As colunas foram higienizadas com 0,5 M de NaOH, cuidadosamente enxaguadas com água destilada, e equilibradas com 5 CVs de Tampão A (20 mM de Tris, 1 M de (NH4)2SO4, pH 7,5). Tampões de eluição a 75% de Tampão A, 50% de Tampão A e 25% de Tampão A foram preparados antecipadamente por misturação de volumes apropriados de Tampão A e Tampão B (20 mM de Tris, pH 7,5). Eluições de IMAC CV1 e 2 foram reunidas em pool juntas da etapa de coluna prévia, e sulfato de amônio foi adicionado até uma concentração final de 1 M antes de carregamento nas colunas Phenyl pré-equilibradas. Após carregamento e cinzelamento com 3 CVs de Tampão A, a coluna foi eluída com 3 CVs de cada um de 75% de Tampão A, 50% de Tampão A, 25% de Tampão A e 0% de Tampão A. O carregamento, fluxo passante e eluições foram analisados por SDS-PAGE não redutora com Bis-Tris 4-12% e coloração Coomassie. Com base no gel, CV1-2 da lavagem e eluições a 750 mM (NH4)2SO4 (em caixas) foram reunidos em pool para processamento adicional (FIG. 14B).

[283] Para assegurar integridade do terminal-C de XTEN e para reduzir ainda mais endotoxina, cromatografia por troca de ânions foi escolhida como a etapa de polimento final. Um invólucro de coluna XK16 em um purificador AKTA foi recheado com 5 ml de resina Capto Q Impress (GE Healthcare), higienizado com 0,5 M de NaOH, cuidadosamente enxaguado com água destilada, esvaziado com 2 CVs de Tampão B (20 mM de Tris, 500 mM de NaCl, pH 7,5), e equilibrado com 5 CVs de Tampão A (20 mM de Tris pH 7,5). O pool de eluição por HIC foi diluído 4 vezes antes do carregamento nas coluna. A coluna foi então lavada com 3 CVs de 30% de Tampão B e eluída em um gradiente de 30% a 70% de Tampão B ao longo de 15 CVs. As eluições foram coletadas em frações de ½ CV (2,5 ml). O carregamento, fluxo passante e eluições foram então analisados por SDS-PAGE não redutora e coloração Coomassie para determinar frações para pool para formulação (FIG. 14C). 2) Formulação e caracterização

[284] Frações de eluição desejadas (em caixas na FIG. 14C) foram concentradas e o tampão trocado para 50 mM de Tris, 150 mM de NaCl, pH 7,5. O produto formulado foi filtrado de forma estéril a 0,2 µm. A liberação de lote para determinar a qualidade do produto envolveu análise por cromatografia por exclusão de tamanho e análise por SDS- PAGE. Para análise por SEC, 10 µg de produto formulado foram injetados em uma coluna de SEC analítica, confirmando >95% de produto monomérico. (FIG. 15A). Análise por SDS-PAGE foi realizada por carregamento de 5 µg de produto formulado a um gel de Bis-Tris 4-12% e coloração com Azul Coomassie. A pureza do produto foi >90% (FIG. 15B).

3) Ativação enzimática e armazenamento

[285] MMP-9 de camundongo recombinante foi fornecida como zimogênio de R&D Systems e necessitava de ativação por acetato 4-aminofenilmercúrico (APMA). APMA primeiro foi dissolvido em 0,1 M de NaOH até uma concentração final de 10 mM antes do pH ter sido reajustado até neutro usando 0,1 N HCl. Diluição adicional do estoque de APMA até 2,5 mM foi feita em 50 mM de Tris, 150 mM de NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,5. Para ativar pró-MMP, 1 mM de APMA e 100 µg/ml de pró-MMP-9 foram incubados a 37°C por 3 horas. Enzima ativada adicionada até uma concentração final de glicerol 50% podia então ser armazenada a -20°C por várias semanas. 4) Digestão com MMP-9 de His(8)-aEpCAM-aCD3-BSRS1- XTEN864

[286] Para produzir aEpCAM-aCD3 ProTIA-A clivado, 9,12 mg de His(8)-aEpCAM-aCD3-BSRS1-XTEN864 (ProTIA-X) formulado foram incubados por 2 horas a 37°C em uma mistura de reação contendo 10 mM de CaCl2 e uma proporção molar de enzima-para- substrato de 1:2.237 de MMP-9 de camundongo recombinante ativa (R&D Systems). Para confirmar digestão específica em BSRS1, 5 µg de produtos não digeridos e digeridos com MMP-9 foram processados em SDS-PAGE com Bis-Tris 4-12%, seguido por coloração por Azul Coomassie. O uso de coloração com Azul Coomassie permitiu a visualização do His8-aEpCAM-aCD3- BSRS1-XTEN864 (ProTIA-X) de comprimento total antes da digestão com MMP-9 e o fragmento de His8-aEpCAM-aCD3 clivado (ProTIA-A) após digestão com MMP-9 (FIG. 16A). 5) Purificação de His(8)-aEpCAM-aCD3 ProTIA-A clivado após digestão com MMP-9

[287] Após confirmação da digestão com MMP-9 em BSRS1,

cromatografia por afinidade imobilizada em metal foi usada para remover MMP-9. Um invólucro de coluna de 5 ml de propileno (ThermoScientific) foi recheado com 2 ml de resina ToyoPearl-AF-Chelate 650M (TOSOH Biosciences). A coluna foi equilibrada com 5 CVs de tampão de equilíbrio (20 mM de Tris, 250 mM de NaCl, pH 7,5). A mistura da digestão foi então carregada na coluna. Após carregamento e cinzelamento com 1 CV de tampão de equilíbrio, a coluna foi lavada com 3 CVs de tampão de equilíbrio. Proteína foi eluída da coluna com 3 CVs de tampão de eluição (20 mM de Tris, 100 mM de NaCl, 150 mM de imidazol, pH 7,5), e frações de 1 CV (2 ml) foram coletadas. O carregamento, fluxo passante e eluições foram analisados por SDS-PAGE não redutora com Bis-Tris 4-12% e coloração com Coomassie para determinar eluições contendo ProTIA-A (FIG. 16B). 6) Formulação e caracterização de His(8)-aEpCAM-aCD3 clivado

[288] Eluições desejadas (em caixas na FIG. 16B) foram concentradas e o tampão trocado para 50 mM de Tris, 150 mM de NaCl, pH 7,5. A liberação de lote para determinar a qualidade do produto envolveu análise por cromatografia por exclusão de tamanho e análise por SDS-PAGE. Para análise por SEC, 10 µg de produto foram injetados em uma coluna de SEC analítica, confirmando >95% de produto monomérico (FIG. 17A). Para análise por SDS-PAGE, 5 µg de produto foram carregados em um gel de Bis-Tris 4-12%, confirmando >90% de pureza do produto (FIG. 17B). Exemplo 3: Produção de aEpCAM-aCD3-BSRS1-XTEN_AE864- His(6) AC1476 não clivado e clivado da cultura de fermentação de E. coli

1) Expressão e purificação de AC1476 aEpCAM-aCD3-BSRS1- XTEN_AE864-His(6) de cultura de fermentação de E. coli

[289] A proteína de fusão AC1476 (MKKNIAFLLASMFVFSIATNAYA-aEpCAM-aCD3-BSRS1-XTEN_AE864- His(6)) foi expressa em uma cepa de E. coli proprietária AmE097. A cultura de fermentação de 10 litros foi desenvolvida a 37°C e a temperatura mudada para 28°C após depleção da alimentação de sal. Durante a colheita, o caldo de fermentação inteiro foi centrifugado para peletizar as células. O sobrenadante foi filtrado em 0,20 µm usando uma cápsula de filtro de 3 M LifeAssure. Uma coluna de invólucro XK50 foi recheada com 100 ml de resina Toyopearl-AF-Chelate- 650M (TOSOH Biosciences) e conectada a uma bomba peristáltica a 4°C. A coluna foi higienizada com 0,5 M de NaOH, cuidadosamente enxaguada com água destilada, carregada com 0,1 M de NiSO4, e equilibrada com 5 CVs de tampão de equilíbrio (20 mM de Tris, 250 mM de NaCl, pH 7,5). Após equilíbrio da coluna, o sobrenadante foi carregado na coluna, seguido por Lavagem Triton, Lavagem 2, e eluição similar ao processo descrito acima no Exemplo 2-1. As eluições foram coletadas frações de em ¼ CV (25 ml) e EDTA foi adicionado até uma concentração final de 5 mM para fazer a quelação de níquel livre. O carregamento, fluxo passante e eluições foram analisados por SDS-PAGE não redutora com Bis-Tris 4-12% e coloração Coomassie. Com base no gel, eluições 2-5 (em caixas) foram salvas para processamento adicional. (FIG. 18A)

[290] Cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) foi escolhida como a etapa de polimento subseqüente. Uma coluna de invólucro XK24 em um purificador AKTA foi recheada com 50 ml de resina Toyopearl-Phenyl-650M (TOSOH Biosciences). A coluna foi higienizada com 0,5 M de NaOH, cuidadosamente enxaguada com água destilada, e equilibrada com 5 CVs de Tampão A (20 mM de Tris, 1 M de (NH4)2SO4, pH 7,5). Eluições de IMAC desejadas foram reunidas em pool juntas da etapa de coluna prévia, e sulfato de amônio foi adicionado até uma concentração final de 1 M antes de carregamento nas coluna. As eluições foram coletadas em ½ CV (25 ml) frações em um gradiente de 100% a 50% de Tampão A ao longo de 10 CVs. O carregamento, fluxo passante e eluições foram analisados por SDS-PAGE não redutora com Bis-Tris 4-12% e coloração Coomassie. Com base no gel, eluições em caixas foram reunidas em pool para processamento adicional (FIG. 18B).

[291] Cromatografia por troca aniônica foi escolhida como a etapa de polimento final. Uma coluna de invólucro XK24 foi recheada com 30 ml de resina Capto Q Impress (GE Healthcare), higienizada com 0,5 M de NaOH, cuidadosamente enxaguada com água destilada, esvaziada com 2 CVs de Tampão B (20 mM de Tris, 500 mM de NaCl, pH 7,5), e equilibrada com 5 CVs de Tampão A (20 mM de Tris, pH 7,5). O pool da eluição teve o tampão trocado através de um módulo de Ultrafiltração Pellicon XL Biomax de 10 kDa em 20 mM de Tris pH 7,5 até que o permeado tivesse uma condutividade de 8 ms/cm. O permeado foi carregado na coluna Capto Q Impress, e a coluna foi então lavada com 3 CVs de 10% e 20% de Tampão B. As eluições foram coletadas em frações de ¼ CV (7,5 ml) em um gradiente de 20% a 70% de Tampão B ao longo de 10 CVs. O carregamento, fluxo passante e eluições foram analisados por SDS-PAGE não redutora com Bis-Tris 4-12% e coloração Coomassie. Com base no gel, eluições selecionadas (em caixas) foram reunidas em pool para formulação (FIG. 18C). 2) Formulação e caracterização de aEpCAM-aCD3-BSRS1- XTEN864-His(6)

[292] Eluições desejadas foram concentradas e o tampão trocado para 50 mM de Tris, 150 mM de NaCl, pH 7,5. A liberação de lote para determinar a qualidade do produto foi realizada segundo o protocolo estabelecido no Exemplo 2 para análise por SEC (FIG. 19A) e SDS-PAGE (FIG. 19B). Adicionalmente, 2 µg foram carregados a um gel de SDS-PAGE não redutora com Bis-Tris 4-12%, com coloração com prata subseqüente (FIG. 19C). Os resultados de SEC também foram usados para determinar o peso molecular aparente e o fator do peso molecular aparente (em relação ao peso molecular real) e o raio hidrodinâmico do aEpCAM-aCD3-BSRS1-XTEN864- His(6). O peso molecular aparente determinado foi de 1,7 MDa, que resultaria em um fator do peso molecular aparente de 12,3 e um raio hidrodinâmico calculado de 10,8 nm.

[293] Para provar ainda mais a identidade da molécula, espectrometria de massa com ionização por eletrospray (ESI- MS) foi realizada e a massa experimental foi determinada como sendo de 138,652 Da, com Massa de +1 Da, quando comparado com o peso molecular teórico de 138,651 Da (FIG. 20A). Para cromatografia por troca de cátions analítica, 10 µg de amostra foram carregados em Agilent Bio SCX NP3 com fase móvel A 20 mM de acetato de sódio, pH 4,5 e fase móvel B 20 mM de acetato de sódio, 1 M de cloreto de sódio, pH 4,5. Um gradiente linear de 0-100% de B foi aplicado durante o período de 20 minutos e somente um único pico importante foi detectado (FIG. 20B). 4) Digestão com MMP-9 de aEpCAM-aCD3-BSRS1-XTEN864-

His(6)

[294] Após ativação e digestão de MMP-9 pelo protocolo descrito no Exemplo 2, 20 mg de aEpCAM-aCD3-BSRS1-XTEN864- His(6) (ProTIA-X) foram digeridos, no entanto, usando uma proporção molar de enzima-para-substrato de apenas 1:6.000 de MMP-9 de camundongo recombinante ativa. Produtos não digeridos e digeridos foram analisados por SDS-PAGE (FIG. 21A). 5) Purificação de clivado aEpCAM-aCD3-BSRS1-XTEN864- His(6) após digestão com MMP-9

[295] Após confirmação da digestão com MMP-9 em BSRS1, cromatografia por troca de ânions foi usada para remover XTEN clivado livre e ProTIA-X não clivado. Dois invólucros de coluna de 5 ml de propileno (ThermoScientific) foram recheados com 3 ml cada um de resina MacroCap Q (GE Healthcare), higienizados com CIP (0,5 M de NaOH, 1 M de NaCl), cuidadosamente enxaguados com água destilada, esvaziados com 2 CVs de Tampão B (20 mM de Tris, 500 mM de NaCl, PH 7,5), e equilibrados com 5 CVs de Tampão A (20 mM de Tris, pH 7,5). A mistura da digestão foi carregada na coluna. Após carregamento e cinzelamento com 1 CV de Tampão A, a coluna foi eluída com 2 CVs de cada um de 150 mM, 200 mM, 250 mM, 300 mM e 500 mM de NaCl. O carregamento, fluxo passante e eluições foram analisados por SDS-PAGE com Bis- Tris 4-12% e coloração com Coomassie para determinar frações contendo ProTIA-A (FIG. 21B). 6) Formulação e caracterização de aEpCAM-aCD3 clivado

[296] Frações de ProTIA-A desejadas foram concentradas e o tampão trocado para 50 mM de Tris, 150 mM de NaCl, pH 7,5. A liberação de lote para determinar qualidade do produto foi realizada segundo o protocolo estabelecido no Exemplo 2 para análise por SEC (FIG. 22A) e SDS-PAGE (FIG. 22B). Adicionalmente, 2 µg foram carregados a um gel de SDS-PAGE não redutora com Bis-Tris 4-12%, com coloração com prata subseqüente (FIG. 22C). Os resultados de SEC também foram usados para determinar o peso molecular aparente e o fator do peso molecular aparente (em relação ao peso molecular real) e o raio hidrodinâmico calculado do aEpCAM-aCD3. O peso molecular aparente determinado foi de 39,8 kDa (o último sendo cerca de 23 vezes menor do que da construção intacta, acima), o que geraria um fator do peso molecular aparente de 0,7 (o último sendo cerca de 17 vezes menor do que da construção intacta, acima) e um raio hidrodinâmico de 2,3 nm (o último sendo cerca de 5 vezes menor do que da construção intacta, acima).

[297] Para provar ainda mais a identidade da molécula, espectrometria de massa com ionização por eletrospray (ESI- MS) foi realizada e a massa experimental foi determinada como sendo de 58,071 Da, com Massa de +4 Da, quando comparado com o peso molecular teórico de 58,067 Da (FIG. 23A). Cromatografia por troca de cátions analítica (FIG. 23B) usando um protocolo descrito previamente em 2) também confirmou a homogeneidade da amostra. Exemplo 4: Ensaios de ligação de EpCAM da composição de ativador imune desencadeado por protease anti-EpCAM x anti- CD3 (ProTIA)

[298] A capacidade de ligação da composição de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 foi verificada com um ELISA em sanduíche de EpCAM/proteína-L conjugada à peroxidase. No ensaio de ligação por ELISA, EpCAM humana recombinante

(rhEpCAM) (Sino Biological R&D Systems Nº de Catálogo 10694- H08H960-EP-50) foi revestida em uma placa de 96 poços, de fundo plano, em uma concentração de 0,1 µg/100 µl.

Após incubação de um dia para o outro a 4°C, a placa do ensaio foi lavada e bloqueada com albumina sérica bovina 3% (BSA) por 1 h em temperatura ambiente.

A placa foi lavada novamente, seguida pela introdução de uma faixa de doses de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não-clivável (ou seja, um ProTIA sem a seqüência do segmento de liberação de clivagem e AC1484, uma composição de montagem de polipeptídeo ProTIA quimérico) e ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease e não tratado com protease (AC1476). A faixa de doses utilizada para ProTIA não-clivável e tratado e não tratado com protease foi de 0,0006 a 5 nM, obtida com um esquema de diluição serial de 1:6 vezes a partir de uma concentração de partida de 5 nM.

A placa foi incubada com agitação por 1 h em temperatura ambiente para permitir que o ProTIA não-clivável, clivado e não clivado com protease se ligue à rhEpCAM revestida na placa.

Os componentes não ligados foram removidos com uma etapa de lavagem e uma proteína-L conjugada à peroxidase (Pierce Thermo Fisher Scientific Nº de Catálogo 32420) foi adicionada.

Após um período de incubação apropriado que permitiu que proteína-L se ligasse à cadeia leve kappa do scFvs, qualquer reagente não ligado foi removido por uma etapa de lavagem, seguida pela adição de substrato de tetrametilbenzidina (TMB) a cada poço.

TMB é um substrato cromogênico de peroxidase.

Após a intensidade de cor desejada ter sido alcançada, ácido sulfúrico 0,2 N foi adicionado para interromper a reação e a absorbância (OD) foi medida a 450 nm usando um espectrofotômetro. A intensidade da cor é proporcional à concentração de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não-clivável, tratado e não tratado com protease, capturado pelo ELISA em sanduíche de rhEpCAM/proteína-L. A intensidade da cor produzida (OD medida) foi plotada contra a concentração de proteína; e a concentração de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não-clivável, clivado e não clivado com protease que gerou metade da resposta máxima (EC50) foi derivada com uma equação de regressão logística de 4 parâmetros usando o software GraphPad Prism.

[299] Como mostrado na FIG. 24, o ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não-clivável possui uma atividade de ligação similar àquela de cada molécula de ProTIA biespecífica anti- EpCAM x anti-CD3 não tratada com protease que possui uma EC50 de 320 pM e 280 pM, respectivamente. O ProTIA tratado com protease possui a atividade de ligação mais forte na EC50 de 120 pM para o ligante de rhEpCAM, comparado com a molécula biespecífica intacta não tratada com protease ou com a molécula de ProTIA não-clivável. Os dados sugerem que a presença de XTEN864 impediu a ligação da porção anti-EpCAM para seu ligante por pelo menos 2,3 vezes. Exemplo 5: Ligação à célula avaliada por citometria de fluxo

[300] A ligação biespecífica da composição de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 também é avaliada por ensaios baseados em separação de células ativada por fluorescência (FACS) utilizando células Jurkat humanas CD3-positivas e células humanas EpCAM-positivas selecionadas de SW480, HCT-116, Kato III, MDA-MB-453, MCF-7, MT3, SK-Br-3, SK-OV-3, OVCAR-3, BT- 474, HPAF-II, JIMT-1, MDA-MB-436, NCI-H322, NCI-H660, NCI-

H69 e PC3. Células CD3+ e EpCAM+ são incubadas com uma faixa de doses de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado, ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease, e controles scFv anti-CD3 e scFv anti-EpCAM positivos por 30 min a 4°C em tampão de FACS contendo PBS com BSA 1% e azida de sódio 0,05%. Após várias lavagens em tampão de FACS para remover material de teste não ligado, as células são incubadas com conjugado à FITC anti-His tag anticorpo (Abcam Nº de Catálogo ab1206) por 30 min a 4°C. Anticorpo conjugado à FITC não ligado é removido por várias lavagens com tampão de FACS e as células ressuspensas em tampão de FACS para aquisição em um citômetro de fluxo de FACS Calibur (Becton Dickerson) ou instrumento equivalente. Todos os dados de citometria de fluxo são analisados com o software FlowJo (FlowJo LLC) ou equivalente.

[301] Tendo em vista que não se espera que scFv anti- EpCAM se ligue às células Jurkat, espera-se que scFv anti- CD3, ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado e ProTIA anti- EpCAM x anti-CD3 tratado com protease se liguem, todos, às células Jurkat, como indicado por um aumento na intensidade de fluorescência, quando comparadas com células Jurkat incubadas com anticorpo anti-His tag conjugado à FITC isoladamente. Similarmente, espera-se que scFv anti-EpCAM, ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado e não tratado com protease se liguem, todos, às células EpCAM-positivas, enquanto não se espera que scFv anti-CD3 se ligue às células EpCAM-positivas. Espera-se que esses dados refletirão a habilidade de ligação biespecífica da composição de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 para reconhecer tanto o antígeno de CD3 quanto o antígeno de EpCAM expressos, respectivamente,

em Jurkat e no painel de linhagens de células humanas que expressam EpCAM. Além disso, como o polímero de XTEN causa alguma interferência na ligação de superfície, espera-se que o ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado se ligue em uma afinidade menor do que ProTIA tratado com protease tanto aos antígenos de CD3 quanto aos de EpCAM. Exemplo 6: Ensaios de citotoxicidade da composição de ativador imune desencadeado por protease anti-EpCAM x anti- CD3 (ProTIA)

[302] A citotoxicidade celular redirecionada de composições de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 foi avaliada por utilização de células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC) como efetores e células de carcinoma humano EpCAM-positivas como, por exemplo, células de cólon SW480 (ou selecionadas de HCT-116, Kato III, NCI-N87, MKN45, MDA- MB-231, MDA-MB-453, MCF-7, MT3, SK-Br-3, SK-OV-3, OVCAR3, BT-474, HPAF-II, JIMT-1, MDA-MB-436, NCI-H322, NCI-H660, NCI-H69 e PC3) como alvos. As PBMCs foram isoladas de doadores saudáveis selecionados por centrifugação em gradiente de densidade de Ficoll de sangue total ou de preparações de capa de leucócitos enriquecida em linfócito de bancos de sangue locais ou Bioreclamation IVT. As PBMCs foram ressuspensas e cultivadas em densidade de células apropriada, como discutido abaixo, em RPMI-1640/FCS 10%/25 mmol/ml de HEPES a 37°C em uma incubadora umidificada com CO2 5% até o uso. Três tipos diferentes de ensaios de citotoxicidade são usados para a determinação da atividade citolítica da composição anti-EpCAM x anti-CD3 não-clivável (AC1484), composições de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado e não tratado com protease clivável (AC1278 e

AC1476), especificamente ensaio de liberação de lactato desidrogenase (LDH), ensaio de caspase 3/7 e análise baseada em FACS.

[303] Como uma alternativa não radioativa ao ensaio de citotoxicidade de liberação de 51Cr, o ensaio de liberação de LDH mede quantitativamente a enzima LDH citosólica estável que é liberada mediante lise celular basicamente da mesma forma que 51Cr é liberado em ensaios radioativos. A LDH liberada em sobrenadantes de cultura é medida por um ensaio enzimático que converte um sal de tetrazólio em um produto de formazan vermelho; a quantidade de cor formada sendo proporcional ao número de células lisada.

[304] O desempenho citotóxico das composições de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado e não tratado com protease em SW480 foi, dessa forma, analisado do seguinte modo: a densidade de células de SW480 e PBMC primeiro foi ajustada até 2,5 x 105 células/ml e 1 x 106 células/ml, respectivamente, em meio de ensaio formado por RPMI livre de Vermelho Fenol e FCS 5%. (meio livre de Vermelho Fenol e FCS 5% foram usados para minimizar a absorbância de fundo com o uso do kit “Promega CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicidade Assay” (Nº de Catálogo G1780)). Para obter uma proporção de célula efetora para célula-alvo de 5:1, alíquotas de 100 µl de PBMCs foram cocultivadas com alíquotas de 80 µl de células SW480 por poço de ensaio em uma placa de 96 poços de fundo redondo. Amostras da composição de anti- EpCAM x anti-CD3 tratado e não tratado com protease foram diluídas em meio de ensaio até a concentração de dose desejada e adicionadas em 20 µl aos respectivos poços experimentais levando o volume total do ensaio a 200 µl. O

ProTIA clivado com protease foi avaliado como uma concentração de dose serial diluída 5x, de 12 pontos, começando em 440 nM para obter uma faixa de dose final de 0,000005 a 44 nM.

A composição de ProTIA não tratado, não clivado, foi analisada como uma concentração de dose serial diluída 5x, de 12 pontos, começando em 184 nM para derivar em uma faixa de dose final de 0,000002 a 18,4 nM.

Controles do ensaio que incluíram LDH espontânea liberada por células efetoras e células-alvo; LDH máxima liberada pela célula- alvo; controle de correção de volume em função da adição de solução de lise e meio de cultura de base também foram configurados nesse momento.

Para LDH espontânea liberada por células-alvo, células SW480 foram incubadas em 200 µl de meio de ensaio na ausência de qualquer composição tratada ou não tratada com protease.

Para LDH espontânea liberada por célula efetora, PBMC foram incubadas em 200 µl de meio de ensaio na ausência de qualquer composição tratada ou não tratada com protease.

A LDH máxima liberada pela célula-alvo foi determinada pela adição de 20 µl de solução de lise 10x às células SW480 (220 µl de volume total) e incubação das células-alvo na presença de solução de lise por 45 min antes da coleta do sobrenadante para medição de LDH.

O controle de correção de volume foi obtido por adição de 20 µl de solução de lise 10x a 200 µl de meios de ensaio, enquanto meio de cultura de base foi obtido por incubação de 200 µl de meio de ensaio.

A placa contendo poços experimentais de composições de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado e não tratado com protease e todos os respectivos controles do ensaio, todos testados em duplicatas, foi então incubada de um dia para o outro em uma incubadora umidificada com CO2 5%

a 37°C.

[305] A quantidade de LDH liberada no sobrenadante como resultado de lise celular foi medida usando o kit “Promega CytoTox Assay” e seguindo as instruções do fabricante. Resumidamente, 50 µl do sobrenadante de cada poço da placa do ensaio foram transferidos para o poço correspondente de uma placa enzimática de fundo plano. A cada poço na placa enzimática, 50 µl do substrato reconstituído foram adicionados. A placa foi então coberta, protegida da luz e incubada em temperatura ambiente por 30 min. Após o período de incubação desejado, 50 µl de solução de interrupção foram adicionados a cada poço e a absorbância registrada a 490 nm.

[306] A análise de dados foi então realizada da seguinte forma:

[307] 1. Experimental, proporção E:T de 5:1 (média) – meio de cultura de base (média) espontânea por célula-alvo SW480 (média) – meio de cultura de base (média) espontânea por célula efetora PBMC (média) – meio de cultura de base (média)

[308] 2. máxima por célula-alvo SW480 (média) – controle de correção de volume (média)

[309] 3. % de lise específica = [(Experimental – espontânea por célula-alvo SW480 – espontânea por célula efetora PBMC) / (máxima por célula-alvo SW480 – espontânea por célula-alvo SW480)] x 100

[310] 4. Concentração de dose de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado e não tratado com protease foi então plotada contra % de lise específica; e a concentração de proteína que gerou metade da resposta máxima (EC50) foi derivada com uma equação de regressão logística de 4 parâmetros usando o software GraphPad Prism.

[311] Como mostrado na FIG. 25, a exposição de células SW480 às composições de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado e não tratado com protease na presença de PBMC gerou curvas de dose citotóxica concentração-dependente; com o ProTIA tratado com protease sendo 48 vezes mais ativo do que o ProTIA não tratado, intacto (EC50 de 2,5 pM vs. 120 pM, respectivamente).

[312] A especificidade do ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 foi adicionalmente avaliada por comparação da atividade citotóxica de ProTIA tratado com protease e não tratado com protease com aquela de scFv anti-EpCAM monoespecífico não conjugado e scFv anti-CD3 monoespecífico no ensaio de LDH. Resumidamente, PBMCs e células SW480 foram cocultivadas em uma proporção de célula-efetora para célula-alvo de 5:1 em meio de ensaio em uma placa de 96 poços de fundo redondo, como descrito acima. Amostras de ProTIA anti-EpCAM x anti- CD3 tratado com protease, ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease e scFv anti-EpCAM monoespecífico não conjugado mais scFv anti-CD3 monoespecífico foram, todas, avaliadas como uma diluição serial 5x de 12 pontos de uma faixa de dose final de 0,00005 a 45 nM em um volume total do ensaio até 200 µl. Juto com poços experimentais, todos os controles de ensaio relevantes como descritos acima também foram incluídos no placa do ensaio e a placa foi incubada de um dia para o outro e uma incubadora umidificada com CO2 5% a 37°C.

[313] A quantidade de LDH liberada no sobrenadante como resultado de lise celular foi medida usando o kit “Promega CytoTox Assay” e os resultados analisados como descrito acima.

[314] Como esperado, a exposição de células SW480 ao ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease na presença de PBMC mostrou citotoxicidade aumentada, quando comparado com ProTIA não tratado. Significantemente, a combinação de scFv anti-EpCAM monoespecífico e scFv anti-CD3 monoespecífico na presença de células SW480-alvo e PBMC não resultou em nenhuma atividade citotóxica (FIG. 26). Os dados indicam que a união da porção de direcionamento de aEpCAM à porção efetora de aCD3 na forma de uma molécula biespecífica é necessária para o recrutamento ativo de células CD3- positivas para as vizinhanças das células-alvo para citotoxicidade induzida.

[315] Também formulamos a hipótese de que a seqüência do segmento de liberação de clivagem presente no ProTIA anti- EpCAM x anti-CD3 pode, ela própria, ser suscetível à clivagem por proteases liberadas pelas células tumorais ou por células T CD3-positivas ativadas (por exemplo, granzimas). Para abordar essa hipótese, um ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não- clivável sem o segmento de liberação (AC1357) foi construído e avaliado em conjugação com o ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado e não tratado com protease (AC1278). Todos os três ProTIAs foram analisados no ensaio de LDH usando uma proporção de PBMC para SW480 de 5:1 e testados em uma faixa de concentração de dose de 12 pontos de 0,00005 a 45 nM obtida com uma esquema de diluição serial 5x.

[316] Como mostrado na FIG. 27, ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado é 32 vezes menos ativo do que ProTIA tratado com protease (EC50 de 288 pM vs. 8,9 pM). Curiosamente, o ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não-clivável (ou seja, ProTIA sem a seqüência do segmento de liberação de clivagem) é 371 vezes menos ativo do que o ProTIA clivado com protease (EC50 de 3300 pM vs. 8,9 pM). Os resultados sugerem que o segmento de liberação contido dentro da molécula de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 clivável é suscetível a alguma clivagem por proteases provavelmente liberadas pelas células tumorais e/ou células T CD3- positivas ativadas.

[317] O ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não-clivável sem o segmento de liberação (AC1484) e o ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado e não tratado com protease (AC1476) também foram avaliados na linhagem de célula humana de origem ovariana. Nesse experimento, PBMCs foram misturadas com células ovarianas SK-OV-3 em uma proporção de 5:1 e todas as três moléculas de ProTIA foram testadas como uma curva de dose de diluição serial 5x de 12 pontos no ensaio de LDH como descrito acima. Como esperado, foi verificado que a tendência de atividade das três moléculas de ProTIA perfiladas em linhagem de células ovarianas SK-OV-3 é similar àquela observada na linhagem de célula de câncer cólon-retal SW480. Em células SK-OV-3, ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado foi 45 vezes menos ativo do que ProTIA tratado com protease (EC50 de 136 pM vs. 3 pM); e o ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não-clivável foi 600 vezes menos ativo do que o ProTIA clivado com protease (EC50 de 1793 pM vs. 3 pM) (FIG. 30). Exemplo 7: Lise de células avaliada por citometria de fluxo

[318] Para análise de lise celular após 24 h por citômetro de fluxo, células-alvo EpCAM-positivas SK-OV-3 (ou células-alvo selecionadas de linhagens de células HCT-116, Kato III, MDA-MB-453, MCF-7, MKN45, MT3, NCI-N87, SK-Br-3, SW480, OVCAR3, BT-474, HPAF-II, JIMT-1, MDA-MB-436, NCI- H322, NCI-H660, NCI-H69 e PC3) são marcadas com o corante de membrana fluorescente corante CellVue Maroon (Affymetrix/eBioscience, Nº de Catálogo 88-0870-16) de acordo com instruções do fabricante.

Alternativamente, PKH26 (Sigma, Nº de Catálogo MINI26 e PKH26GL) também pode ser usado.

Resumidamente, células SK-OV-3 são lavadas duas vezes com PBS, seguido por ressuspensão de 2 x 106 células em 0,1 ml de diluente C fornecido com o kit de marcação CellVue Maroon.

Em um tubo separado, 2 microlitros de corante CellVue Maroon são misturados com 0,5 ml de diluente C, e depois 0,1 ml adicionado à suspensão de células SK-OV-3. A suspensão de células e o corante CellVue Maroon são misturados e incubados por 2 min em temperatura ambiente.

A reação de marcação é então extinta pela adição de 0,2 ml de FCS.

As células marcadas são lavadas duas vezes com meio completo de cultura de célula (RPMI-1640 contendo FCS 10%) e o número total de células viáveis determinado por exclusão de Azul tripano.

Para uma proporção de célula-efetora para célula-alvo de 5:1 em um volume total de 200 µl por poço, 1 x 105 PBMCs são cocultivadas com 2 x 104 células SK-OV-3 marcadas com CellVue Maroon por poço em uma placa de 96 poços de fundo redondo na ausência ou presença da concentração de faixa de dose indicada de amostras de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado e não tratado com protease.

Após 24 h, as células são colhidas com Accutase (Innovative Cell Technologies, Nº de

Catálogo AT104) e lavadas com FCS 2%/PBS. Antes da aquisição de células em um citômetro de fluxo Guava EasyCyte (Millipore), as células são ressuspensas em 100 µl de FCS 2%/PBS suplementado com 2,5 microgramas/ml de 7-AAD (Affymetrix/eBioscience, Nº de Catálogo 00-6993-50) para discriminar entre células vivas (7-AAD-negativas) e mortas (7-AAD-positivas). Os dados de FACS são analisados com o software guavaSoft (Millipore); e a percentagem de células- alvo mortas é calculada pelo número de células 7-AAD- positivas/CellVue Maroon-positivas dividido pelo número total de células CellVue Maroon-positivas.

[319] Curvas de dose-resposta de morte de citotoxicidade percentual contra concentração de ProTIA são analisadas por equação de regressão logística de 4 parâmetros usando GraphPad Prism; e a concentração de ProTIA que induziu metade da citotoxicidade celular percentual máxima é, dessa forma, determinada.

[320] Espera-se que os resultados de citotoxicidade utilizando citometria de fluxo estejam de acordo com os resultados obtidos com o ensaio de LDH. Espera-se que a exposição de células SK-OV-3 às composições de ProTIA anti- EpCAM x anti-CD3 clivado e não clivado com protease na ausência de PBMC não tenha nenhum efeito. Similarmente, não se espera que PBMCs sejam ativadas na presença de ProTIA sem células-alvo. Espera-se que esses resultados indiquem que composições de ProTIA precisam ser agrupadas na superfície de células-alvo a fim de estimular PBMCs para atividade de citotoxicidade. Na presença de PBMC e células-alvo, haveria um efeito citotóxico concentração-dependente em função do ProTIA pré-tratado ou não tratado com protease. Além disso,

espera-se que os resultados mostrem que a exposição de células SK-OV-3 ao ProTIA não tratado (sem protease) na presença de PBMC exibiria citotoxicidade reduzida, comparado com a composição de ProTIA clivado com protease.

[321] O conjunto de experimentos de citotoxicidade acima é realizado para outras composições biespecíficas de ProTIA como, por exemplo, composição de ProTIA anti-CD19 x anti-CD3 e composição de ProTIA anti-HER2 x anti-CD3. Nesses casos, células-alvo CD19 e HER2-positivas serão usadas ao invés de células EpCAM-positivas. Linhagens de células exemplares para células que expressam CD19 incluirão, sem limitação, NAML-6, Blin-1, SKW6.4, Raji, Daudi e BJAB. Para direcionamento anti-HER2, linhagens de células HER2- positivas como, por exemplo, SK-BR-3, BT474, HCC-1954, MDA- MB-453, SK-OV-3, NCI-N87, JIMT-1, HCT-116, serão usadas. Exemplo 8: Ensaios de marcador de ativação de célula T da composição de ativador imune desencadeado por protease anti-EpCAM x anti-CD3 (ProTIA)

[322] Para medir os marcadores de ativação induzida por ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 (CD69 e CD25), 1 x 105 PBMCs ou células CD3+ purificadas foram cocultivadas em RPMI-1640 contendo FCS 10% com 2 x 104 células SK-OV-3 ou OVCAR3 por poço de ensaio (ou seja, proporção de célula-efetora para célula-alvo de 5:1) na presença de ProTIA anti-EpCAM x anti- CD3 (AC1476) em uma placa de 96 poços de fundo redondo com volume total final de 200 µl. Após incubação por 20 h em uma incubadora umidificada com CO2 5% a 37°C, as células foram coradas com anti-CD4 conjugado a PECy5, anti-CD8 conjugado a APC, anti-CD25 conjugado à PE e anti-CD69 conjugado à FITC (todos anticorpos de BioLegend) em tampão de FACS (BSA

1%/PBS) a 4°C, lavadas duas vezes com tampão de FACS, e depois ressuspensas em tampão de FACS para aquisição em um citômetro de fluxo Guava EasyCyte (Millipore).

[323] Como esperado, foi verificado que a tendência da expressão de marcador de ativação de célula T das três moléculas de ProTIA perfiladas em linhagem de células ovarianas SK-OV-3 era similar àquela observada pelo ensaio de citotoxicidade de LDH. Com o uso de células SK-OV-3, a ativação de CD69 em populações CD8 e CD4 de PBMCs por ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado (AC1476) foi aproximadamente 70 vezes menos ativo do que ProTIA tratado com protease AC1476 (EC50 de 540 pM vs. 6,7 pM para CD8+, EC50 de 430 pM vs. 6,3 pM para CD4+); e o ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não-clivável (AC1484) foi aproximadamente 1.000 vezes menos ativo do que o ProTIA clivado com protease (EC50 de 8.700 pM vs. 6,7 pM para CD8+, EC50 de 6.000 pM vs. 6,3 pM para CD4+) (FIG. 42).

[324] Similarmente, a ativação tanto de CD69 quanto de CD25 em populações CD8 e CD4 de células PBMCs por ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado (AC1476) foi aproximadamente 60 vezes menos ativo do que ProTIA tratado com protease (AC1476 tratado com MMP-9), e o ProTIA anti- EpCAM x anti-CD3 não-clivável (AC1484) foi aproximadamente

1.300 vezes menos ativo do que o ProTIA clivado com protease (FIG. 43).

[325] Para confirmar que o mecanismo de ação é por meio de células CD3+, células SK-OV-3 foram usadas como células-alvo, e a ativação de CD69 em populações CD8 e CD4 de células CD3+ purificadas por ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado (AC1476) foi aproximadamente 100 vezes menos ativo do que ProTIA tratado com protease (EC50 de 260 pM vs. 2,4 pM para CD8+, EC50 de 240 pM vs. 2,2 pM para CD4+); e o ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não-clivável (AC1484) foi aproximadamente 2.000 vezes menos ativo do que o ProTIA clivado com protease (EC50 de 5.000 pM vs. 2,4 pM para CD8+, EC50 de 5.000 pM vs. 2,2 pM para CD4+) (FIG. 44). A ativação tanto de CD69 quanto de CD25 em populações CD8 e CD4 de células CD3+ purificadas por ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado (AC1476) foi aproximadamente 100 vezes menos ativo do que ProTIA tratado com protease (AC1476 tratado com MMP-9), e o ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não-clivável (AC1484) foi aproximadamente 2.000 vezes menos ativo do que o ProTIA clivado com protease (FIG. 45).

[326] Com o uso de células OVCAR3, a ativação de CD69 em populações CD8 e CD4 de células CD3+ purificadas por ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado (AC1476) foi aproximadamente 10 vezes menos ativo do que ProTIA tratado com protease (EC50 de 14 pM vs. 1,8 pM para CD8+, EC50 de 16 pM vs. 1,9 pM para CD4+); e o ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não-clivável (AC1484) foi aproximadamente 1.000 vezes menos ativo do que o ProTIA clivado com protease (EC50 de 2.000 pM vs. 1,8 pM para CD8+, EC50 de 1.500 pM vs. 1,9 pM para CD4+) (FIG. 46). A ativação tanto de CD69 quanto de CD25 em populações CD8 e CD4 de células CD3+ purificadas por ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado (AC1476) também foi aproximadamente 10 vezes menos ativo do que ProTIA tratado com protease (AC1476 tratado com MMP-9), e o ProTIA anti- EpCAM x anti-CD3 não-clivável (AC1484) também foi aproximadamente 1.000 vezes menos ativo do que o ProTIA clivado com protease (AC1476 tratado com MMP-9). Esses resultados sugerem que o ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado foi clivado durante o ensaio em uma extensão maior na presença de células OVCAR3, comparadas com células SK-OV- 3 (FIG. 47).

[327] Como evidência adicional da ativação de células T por ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 na presença de células- alvo, a indução de CD69 e granzima B foi medida. PBMCs (1 x 105) foram cocultivadas com 2 x 104 células OVCAR3 por poço de ensaio (ou seja, proporção de célula-efetora para célula- alvo de 5:1) na presença de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 em uma placa de 96 poços de fundo redondo com volume total final de 200 µl. Após incubação por 20 h em uma incubadora umidificada com CO2 5% a 37°C, as células foram coradas com anti-CD4 conjugado a PECy5, anti-CD8 conjugado a APC e anti- CD69 conjugado à FITC (todos anticorpos de BioLegend) em tampão de FACS (BSA 1%/PBS) a 4°C. As células foram então fixadas e permeabilizadas com Triton X-100 0,1%/PBS antes da coloração com conjugado à PE anti-granzima B (ThermoFisher, Nº de Catálogo MHGB04) em tampão de FACS. As células foram lavadas com tampão de FACS e depois ressuspensas em tampão de FACS para aquisição em um citômetro de fluxo Guava EasyCyte.

[328] Como esperado, tanto CD69 quanto granzima B são expressos em células T ativadas por ProTIA na presença de células OVCAR3. Adicionalmente, uma fração maior de células CD8+ expressa granzima B, comparadas com células CD4+ (FIGS. 48 e 49). Exemplo 9: Propriedades farmacocinéticas da composição de ativador imune desencadeado por protease anti-EpCAM x anti-CD3 (ProTIA)

[329] As propriedades farmacocinéticas de ProTIA anti- EpCAM x anti-CD3 foram analisadas em camundongos C57BL/6. Três camundongos no grupo 1 foram injetados por via intravenosa com 4 mg/kg de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease (AC1278), e 3 camundongos no grupo 2 foram injetados por via intravenosa com ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado (AC1278). Em pontos do tempo apropriados, sangue foi coletado em tubos heparinizados com lítio e processado em plasma. Para os animais tratados com o ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease, os pontos do tempo de coleta de plasma foram pré-dose, 2 min, 15 min, 30 min, 2 h, 4 h, 8 h e 24 h. Para os camundongos não tratados com ProTIA, os pontos do tempo de coleta de plasma foram pré-dose, 4 h, 8 h, 24 h, 2 d, 4 d, 6 d e 7 d. A concentração plasmática de ProTIA tratado com protease foi quantificada por um ELISA em sanduíche de rhEpCAM/biotinilado-anti-His tag com o ProTIA clivado com protease como padrão; enquanto a concentração plasmática de ProTIA não tratado foi quantificada por a ELISA em sanduíche de rhEpCAM/biotinilado-anti-XTEN com o ProTIA não clivado como padrão.

[330] Resumidamente, uma placa de ELISA (Nunc Maxisorp Nº de Catálogo 442404) foi revestida com 0,1 micrograma/100 µl por poço de rhEpCAM (R&D Systems, Nº de Catálogo EHH104111). Após incubação de um dia para o outro a 4°C, a placa de ELISA foi lavada e bloqueada com BSA 3% por 1 h em temperatura ambiente. A placa foi lavada novamente, seguida pela adição de uma faixa de dose apropriada de padrões de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado e não tratado com protease, controles de qualidade apropriados e amostras de plasma de teste.

A placa foi incubada com agitação por 1 h em temperatura ambiente para permitir que os padrões de ProTIA, controles de qualidade e as amostras de teste se liguem à rhEpCAM revestida na placa.

Os componentes não ligados foram removidos com várias lavagens.

Para a detecção de ProTIA clivado com protease, anticorpo anti-His tag biotinilado (R&D Systems, Nº de Catálogo BAM050) foi adicionado a 0,2 µg/100 µl e a placa foi incubada em temperatura ambiente por 1 h.

Para a detecção do ProTIA não tratado com protease, anticorpo anti-XTEN biotinilado (um anticorpo proprietário) foi adicionado a 0,1 µg/100 µl e a placa foi incubada em temperatura ambiente por 1 h.

Após remoção por lavagem de reagente biotinilado não ligado, estreptavidina-HRP (Thermo Scientific Nº de Catálogo 21130) foi adicionada na diluição de 1:30.000 e a placa incubada em temperatura ambiente por 1 h.

Após várias lavagens, substrato de TMB foi adicionado a cada poço.

Após ter sido alcançada a intensidade de cor desejada, ácido sulfúrico 0,2 N foi adicionado para interromper a reação e a absorbância (OD) foi medida a 450 nm usando um espectrofotômetro.

A intensidade da cor é proporcional à concentração de ProTIA tratado e não tratado com protease capturado pelo respectivo ELISA em sanduíche de rhEpCAM/biotinilado-anti-His tag e de rhEpCAM/biotinilado-anti-XTEN.

A concentração de ProTIA presente nas amostras de plasma foi determinada contra a curva do padrão de ProTIA tratado ou não tratado com protease apropriado usando o software SoftMax Pro.

Cálculos farmacocinéticos de meia-vida terminal (T1/2) do ProTIA anti- EpCAM x anti-CD3 clivado e não clivado com protease foram realizados com GraphPad Prism.

[331] Em concordância com o esperado, o ProTIA anti- EpCAM x anti-CD3 tratado com protease possui uma terminal meia-vida de eliminação (T1/2) curta de cerca de 3,5 h, enquanto o ProTIA não tratado com protease (com XTEN anexado) possui uma T1/2 estendida de 32 h (FIG. 28), confirmando que a molécula de ProTIA intacta possui meia-vida significantemente mais longa (pelo menos 9 vezes mais longa) do que a molécula clivada. Exemplo 10: Propriedades antitumorais da composição de ativador imune desencadeado por protease anti-EpCAM x anti- CD3 (ProTIA) no modelo de tratamento precoce de SW480

[332] Um experimento de eficácia in vivo foi realizado em camundongos imunodeficientes NOD/SCID, caracterizados pela deficiência de células T e B, e células natural killer defeituosas. Os camundongos foram mantidos em condições ambientais padronizadas, estéreis, e o experimento realizado de acordo com as diretrizes do “US Institutional Animal Care Association for Assessment and Use Committee” (IACUC) - “Accreditation of Laboratory Animal Care” (AAALAC). A eficácia de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease e não tratado com protease (AC1278) foi avaliada usando o modelo de xenoenxerto de carcinoma humano SW480. Resumidamente, no dia 0, seis coortes de 5 camundongos NOD/SCID por grupo foram injetados por via subcutânea no flanco direito com 1 x 107 PBMCs humanas misturadas com 1 x 107 células SW480. Uma hora após inoculação de SW480/PBMC, o coorte 1 foi injetado com veículo (PBS + Tween 80 0,05%), os coortes 2 e 3 com 0,04 mg/kg e 0,4 mg/kg de ProTIA anti- EpCAM x anti-CD3 tratado com protease, respectivamente, os coortes 4 e 5 com 0,1 mg/kg e 1 mg/kg de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease e o coorte 6 com 1 mg/kg de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease. Os coortes 1 a 5, mas não o coorte 6, foram adicionalmente submetidos a quatro doses adicionais administradas diariamente do dia 1 ao dia 4.

[333] Os tumores foram medidos duas vezes por semana por uma projeção de 35 dias com um compasso de calibre em duas dimensões perpendiculares e os volumes tumorais foram calculados por aplicação da fórmula (largura2 X comprimento) / 2. Peso corporal, aparência geral e observações clínicas como, por exemplo, convulsões, tremores, letargia, hiperreatividade, piloereção, respiração difícil/rápida, coloração e ulceração do tumor e morte, também foram intimamente monitorados como uma indicação de toxicidade relacionada ao tratamento. O desfecho do estudo foi definido como um volume tumoral de 2.000 mm3 ou sobrevida até 36 dias, o que acontecer primeiro. O índice percentual de inibição do crescimento tumoral (%TGI) foi calculado para cada um dos grupos de tratamento por aplicação da fórmula: ((Volume tumoral médio de controle de veículo-PBS – Volume tumoral médio do tratamento com ProTIA)/volume tumoral médio de controle de veículo-PBS) x 100. Um grupo de tratamento com %TGI ≥60% é considerado terapeuticamente ativo.

[334] No dia 36, os camundongos do coorte 1 tratados com veículo de PBS na presença de células efetoras humanas não exibiram progressão do tumor, demonstrando que células efetoras humanas isoladamente como tal não podiam provocar um efeito antitumoral. O tratamento com o ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease a 0,04 mg/kg e 0,4 mg/kg (coortes 2 e 3, respectivamente) na presença de células efetoras humanas exibiu resposta dose-dependente nítida para supressão do crescimento tumoral com o grupo de dose de 0,4 mg/kg fornecendo mais proteção (%TGI = 84%) do que o grupo de dose 0,04 mg/kg (%TGI = 78%). Significantemente, o tratamento com ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 a 1 mg/kg (coorte 5) na presença de células efetoras humanas também inibiu o crescimento tumoral (%TGI = 83%) até quase a mesma extensão como equivalente molar a 0,4 mg/kg de ProTIA tratado com protease (coorte 3). Os dados sugerem que, a 1 mg/kg, ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 suficiente era eficazmente clivado por proteases no ambiente tumoral in vivo na porção anti-EpCAM x anti-CD3 não-XTENilada, mais ativa, para gerar a eficácia observada. A ausência de regressão tumoral no coorte 4 de 0,1 mg/kg de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease (%TGI = 8%) sugeria que, nessa dose, uma porção anti-EpCAM x anti-CD3 não-XTENilada insuficiente era liberada para induzir regressão tumoral perceptível. O coorte 6, submetido a uma única dose de 1 mg/kg de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3, não atingiu o limiar para atividade terapêutica (%TGI = 52%), apesar de exibir crescimento tumoral suprimido, quando comparado com o grupo de controle (FIG. 31). Os resultados sugerem que ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 pode ser clivado eficazmente no ambiente do tumor de SW480 para inibir a progressão do tumor, e a concentração de fármaco mais exposição são fatores importantes na determinação de eficácia do fármaco.

[335] É digno de nota que nenhuma perda de peso corporal significante foi observada em todos os grupos de tratamento com ProTIA e com controle de veículo, indicando que todos os tratamentos foram bem tolerados (FIG. 32).

[336] A especificidade da atividade antitumoral de variantes de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease é realizada em camundongos NOD/SCID inoculados com SW480/PBMC, semelhante ao estudo descrito acima, mas com oitos camundongos por grupo de tratamento. Nesse estudo, o tratamento precoce com controle de veículo-PBS, ProTIA anti- EpCAM x anti-CD3 não-clivável (AC1357 ou AC1484), um ProTIA biespecífico de controle negativo (que possui a atividade de ligação para CD3, mas não para EpCAM), ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease (por exemplo, AC1278, AC1476, AC1684, AC1685, AC1686, AC1693, AC1695, AC1714, AC1715) ou ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease é iniciado uma hora após inoculação de SW480/PBMC. A concentração de dose de 1 mg/kg de ProTIA anti-EpCAM x anti- CD3 não tratado com protease como determinado no estudo acima é usada nesse estudo e os artigos de teste de ProTIA biespecífico de controle negativo, não-clivável e ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease são todos administrados por via intravenosa em concentração eqüimolar. O volume do tumor, peso corporal e observações clínicas são monitorados duas vezes por semana por 35 dias.

[337] Não é esperado que o tratamento com veículo de PBS e com o ProTIA biespecífico de controle na presença de células efetoras humanas induza efeitos antitumorais, demonstrando que nem células efetoras humanas isoladamente nem uma porção de direcionamento não-EpCAM podiam provocar um efeito antitumoral. Espera-se que os camundongos em ambos esses grupos de tratamento atendam ao desfecho do estudo (dia 35 ou volume tumoral de 2.000 mm3). São necessárias cinco doses diárias de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado e não tratado com protease, na presença de efetor humano, para induzir supressão de crescimento tumoral. Espera-se que o tratamento com concentração eqüimolar do ProTIA não- clivável retarde o crescimento tumoral, na medida em que ele não contém o substrato para clivagem por protease. Exemplo 11: Propriedades antitumorais da composição de ativador imune desencadeado por protease anti-EpCAM x anti- CD3 (ProTIA) no modelo de tumor cólon-retal estabelecido

[338] No modelo de tumor cólon-retal estabelecido, células tumorais SW480 ou HCT-116 são implantadas independentemente em camundongos NOG (NOD/Shi-scid/IL- 2Rgnull) ou NSG (NOD.Cg-Prkdcscid.IL2rgtm1Wjl/SzJ) no dia 0. (os camundongos NOG ou NSG são camundongos NOD/SCID que abrigam a mutação IL-2Rg resultando em camundongos desprovidos de células T, B e NK, macrófagos disfuncionais, células dendríticas disfuncionais e atividade de complemento reduzida). PBMCs humanas são então introduzidas por via intravenosa ou por via intraperitoneal aproximadamente entre os dias 3 a 10. Quando o tumor de SW480 e HCT-116 alcançou um volume de 150 mm3, o tratamento com ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease, ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease intacto e uma forma de ProTIA anti- EpCAM x anti-CD3 não-clivável é iniciado como três doses por semana por três a quatro semanas. Espera-se que ProTIA tanto clivado por protease quanto não tratado com protease (por exemplo, AC1684, AC1685, AC1686, AC1693, AC1695, AC1714 e AC1715) levarão à redução ou erradicação de tumores de SW480 e HCT-116 estabelecidos, com o ProTIA não tratado com protease tendo o potencial para transmitir melhor exposição terapêutica ao longo do tempo, resultando em um efeito antitumoral mais eficaz e melhor perfil de segurança do que ProTIA tratado com protease. Postula-se também que diferenças em Segmentos de liberação provavelmente participam no perfil de eficácia entre os ProTIAs não tratados com proteases.

[339] Espera-se que o ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não-clivável (por exemplo, AC1484) retarde minimamente o crescimento tumoral, na medida em que não contém a seqüência do substrato para clivagem por protease dentro do ambiente tumoral. Exemplo 12: Análise por arranjo citométrico de microesferas para citocinas Th1/Th2 humanas usando PBMCs humanas saudáveis normais estimuladas e ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 intacto e tratado com protease

[340] Como uma avaliação de segurança da habilidade de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 intacto versus clivado para estimular a liberação de citocinas relacionadas às células T em um ensaio baseado em células in vitro, um painel de citocinas, incluindo IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-alfa, IFN- gama, foi analisado usando o arranjo citométrico de microesferas (CBA) em sobrenadantes de PBMCs humanas cultivadas estimuladas com amostras de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado e não tratado com protease. O anticorpo anti-CD3 humano, OKT3, foi usado como controle positivo e poços não tratados serviram como controle negativo.

[341] Resumidamente, OKT3 (0, 10 nM, 100 nM e 1000 nM) e ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado e não tratado com protease (AC1278 a 10 nM, 100 nM, 1000 nM e 2000 nM) foram revestidos a seco sobre uma placa de 96 poços de fundo plano permitindo-se que os poços evaporem de um dia para o outro no exaustor de biossegurança. Os poços foram então lavados uma vez gentilmente com PBS e 1 x 106 PBMCs em 200 µl foram adicionadas a cada poço. A placa foi então incubada a 37°C, CO2 5% por 24 h, e depois o sobrenadante da cultura de tecido foi coletado de cada poço e analisado para citocina liberada usando o kit de CBA comercial validado (“BD CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit”, Nº de Catálogo 551809) por citometria de fluxo seguindo as instruções do fabricante.

[342] Resultados:

[343] Os dados brutos para os níveis detectados de citocinas são apresentados na Tabela 12, e são retratados graficamente nas FIGS. 33-35. Tabela 12: Níveis de citocina em resposta ao composto de teste. Composto Citocina detectada (pg/ml) Citocina (nM) Não tratado OKT3 ProTIA-X ProTIA-A IL-2 7,8 IL-4 6,1 IL-6 33,4 0 IL-10 20,7 TNFa 2,1 IFNg 0,0 IL-2 12,8 9,0 7,5 IL-4 9,5 4,1 11,2 IL-6 130,2 26,3 25,2 10 IL-10 23,8 20,8 16,8 TNFa 6,1 4,8 2,1 IFNg 47,4 1,5 1,1 IL-2 250,6 9,4 13,1 100 IL-4 32,7 7,7 9,2

Composto Citocina detectada (pg/ml) Citocina (nM) Não tratado OKT3 ProTIA-X ProTIA-A IL-6 6658,1 22,9 56,4 IL-10 486,3 18,3 20,7 TNFa 6120,1 2,8 10,0 IFNg 15512,9 3,5 106,5 IL-2 156,0 8,1 23,8 IL-4 33,5 7,7 5,8 IL-6 7962,1 32,7 3683,7 1000 IL-10 206,0 16,4 88,0 TNFa 10118,1 4,6 91,5 IFNg 14060,9 0,0 1371,5 IL-2 9,2 28,5 IL-4 9,8 9,7 IL-6 35,2 589,3 2000 IL-10 16,9 163,9 TNFa 3,1 250,4 IFNg 0,4 3330,0

[344] Como esperado, OKT3, mas não poços não tratados, induziram secreção robusta de todas as citocinas (IL-2, IL- 4, IL-6, IL-10, TNF-alfa, IFN-gama) avaliadas confirmando, dessa forma, o desempenho do ensaio de citocina por CBA. A estimulação com ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease desencadeou expressão significante de citocina, especialmente em concentrações maiores do que 100 nM para todas as citocinas testadas. Em contraste, os níveis basais de IL-2, IL-6, IL-10, TNF-alfa e IFN-gama foram detectados quando a molécula de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não clivado intacto era o estimulante em uma faixa de concentração de 10 a 2.000 nM. Tendo em vista que um nível apreciável de IL-4 era detectado quando induzido com o ProTIA não tratado com protease, o nível de IL-4, no entanto, não era maior do que que o observado com o ProTIA tratado com protease (FIGS. 33- 35). Esses dados sugerem que o polímero de XTEN da composição de ProTIA intacto fornece efeito de blindagem considerável e impede respostas de citocina estimuladas por PBMCs, comparado com o ProTIA tratado com protease no qual a porção de EpCAM x anti-CD3 é liberada da composição. Exemplo 13: Propriedades antitumorais da composição de ativador imune desencadeado por protease anti-EpCAM x anti- CD3 (ProTIA) no tratamento precoce do modelo de HCT-116.

[345] Um experimento de eficácia in vivo foi realizado em camundongos imunodeficientes NOD/SCID, caracterizados pela deficiência de células T e B, e células natural killer defeituosas. Os camundongos foram mantidos em condições ambientais padronizadas, estéreis, e o experimento realizado de acordo com as diretrizes da “Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care” (AAALAC). A eficácia de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease e não tratado com protease (AC1476) junto com ProTIA anti- EpCAM x anti-CD3 não-clivável (ou seja, ProTIA sem a seqüência do segmento de liberação de clivagem e cujo exemplo é AC1484) foi avaliado usando o modelo de xenoenxerto de carcinoma cólon-retal humano HCT-116. Resumidamente, no dia 0, quatro coortes de 5 camundongos NOD/SCID por grupo foram injetados por via subcutânea no flanco direito com 5 x 106 PBMCs humanas misturadas com 5 x 106 células HCT-116. Uma hora após a inoculação de HCT-116/PBMC e com base em dosagem eqüimolar, o coorte 1 foi injetado com veículo (PBS + Tween 80 0,05%), o coorte 2 com 0,21 mg/kg de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease, o coorte 3 com 0,5 mg/kg de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease e o coorte 4 com 0,49 mg/kg de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não- clivável. Os coortes 1 a 4 foram todos submetidos a quatro doses adicionais administradas diariamente do dia 1 ao 4.

[346] Os tumores foram medidos duas vezes por semana por uma projeção de 35 dias com um compasso de calibre em duas dimensões perpendiculares e os volumes tumorais foram calculados por aplicação da fórmula (largura2 X comprimento) / 2. Peso corporal, aparência geral e observações clínicas como, por exemplo, convulsões, tremores, letargia, hiperreatividade, piloereção, respiração difícil/rápida, coloração e ulceração do tumor e morte, também foram intimamente monitorados como uma indicação de toxicidade relacionada ao tratamento. O desfecho do estudo foi definido como um volume tumoral de 1.200-2.000 mm3 ou sobrevida até 35 dias, o que acontecer primeiro. O índice percentual de inibição do crescimento tumoral (%TGI) foi calculado para cada um dos grupos de tratamento por aplicação da fórmula: ((Volume tumoral médio de PBS control – Volume tumoral médio do tratamento com ProTIA)/volume tumoral médio de PBS control) x 100. Um grupo de tratamento com %TGI ≥60% é considerado terapeuticamente ativo.

[347] No dia 35, os camundongos do coorte 1 tratados com veículo na presença de células efetoras humanas não exibiram progressão do tumor e saíram do estudo com um volume tumoral médio do grupo de 1.654 ± 87 mm3, demonstrando que células efetoras humanas isoladamente como tal não podiam provocar um efeito antitumoral. O tratamento com o ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease a 0,21 mg/kg

(coorte 2) na presença de células efetoras humanas exibiu supressão robusta do crescimento tumoral, com 2/5 camundongos exibindo regressão tumoral completa por exibição de ausência de volume tumoral mensurável no dia 18. No entanto, recrescimento e progressão do tumor foram observados do dia 25 em diante nesse coorte resultando na saída de todos os 5 camundongos que abrigam um carga tumoral do estudo com um volume tumoral médio de 296 ± 33 mm3 no dia

35. Significantemente, o tratamento com ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 intacto a 0,5 mg/kg (coorte 3) na presença de células efetoras humanas também transmitiu forte inibição do crescimento tumoral. Na verdade, 4/5 dos camundongos no coorte 3 exibiram regressão tumoral completa por volta do dia 18. Com 2 camundongos ainda retendo regressão completa no dia 35, esse coorte saiu do estudo com volume tumoral médio de 48 ± 67 mm3. Com destaque, o Coorte 4 submetido à dose de 0,49 mg/kg de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não- clivável, não exibiu qualquer inibição sustentada da progressão do tumor tão eficazmente quanto os coortes 2 e 3, deixando 5/5 dos camundongos nesse coorte com carga tumoral significante. O Coorte 4 saiu do estudo no dia 35 com um volume tumoral médio do grupo de 748 ± 272 mm3. Tanto ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease a 0,21 mg/kg (coorte 2) quanto ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 intacto a 0,5 mg/kg (coorte 3) são considerados terapeuticamente ativos, com um TGI de 82% e 97%, respectivamente. Com um TGI de 55%, o ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não-clivável é considerado terapeuticamente inativo. Como esperado, foi verificado que o volume tumoral médio do grupo de ProTIA anti-EpCAM x anti- CD3 intacto é significantemente diferente daquele que do coorte de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não-clivável (teste- T de Student, p=0,0016). Consideravelmente, também foi verificado que o volume tumoral médio do grupo do coorte de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 intacto é significantemente diferente daquele do coorte de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease (p=0,002). Os resultados sugerem que, a 0,5 mg/kg, uma quantidade significante de ProTIA anti- EpCAM x anti-CD3 era eficazmente clivada por proteases presentes no ambiente tumoral de HCT-116 in vivo na porção anti-EpCAM x anti-CD3 não-XTENilada, altamente ativa, para transmitir a regressão tumoral marcante observada. Essa hipótese é fortemente apoiada pela molécula de ProTIA anti- EpCAM x anti-CD3 não-clivável desprovida do segmento de liberação substrato que resultou na ausência da propriedade de regressão tumoral sustentada (FIG. 38). Com destaque, os dados também sugerem que o ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 desencadeou melhor exposição terapêutica do que ProTIA anti- EpCAM x anti-CD3 tratado com protease registrando, portanto, um efeito de regressão tumoral mais sustentado.

[348] É digno de nota que nenhuma perda de peso corporal significante foi observada em todos os grupos de tratamento com ProTIA e controle de veículo, indicando que todos os tratamentos foram geralmente bem tolerados (FIG. 39). Exemplo 14: Ensaios de citotoxicidade da composição de ativador imune desencadeado por protease anti-EpCAM x anti- CD3 (ProTIA) na presença de células T CD3-positivas purificadas

[349] Para demonstrar que a atividade citotóxica de moléculas de ProTIA é mediada por células T CD3-positivas,

ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não-clivável sem o segmento de liberação (AC1484) e ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado e não tratado com protease (AC1476) foram ainda avaliados em linhagens de células ovarianas humanas SK-OV-3 e OVCAR-3 na presença de células T humanas CD3-positivas purificadas.

Células T humanas CD3-positivas purificadas foram adquiridas de BioreclamationIVT e isoladas por seleção negativa usando o “MagCellect Human CD3+ T Cell Isolation Kit” de sangue total de doadores saudáveis.

Nesse experimento, células T humanas CD3-positivas purificadas foram misturadas com células ovarianas SK-OV-3 ou OVAR-3 em uma proporção de 5:1 e todas as três moléculas de ProTIA foram testadas como uma curva de dose de diluição serial 5x de 12 pontos no ensaio de LDH como descrito acima.

Como esperado, foi verificado que a tendência de atividade das três moléculas de ProTIA perfiladas em SK-OV-3 é similar àquela observada na SK-OV-3 com análise de PBMC (FIG. 30). Na morte citotóxica de células ovarianas SK-OV-3 por células T humanas CD3-positivas, ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado é 56 vezes menos ativo do que ProTIA tratado com protease (EC50 de 134 pM vs. 2,4 pM); e o ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não-clivável é >1.000 vezes menos ativo do que o ProTIA clivado com protease (EC50 de 2.660 pM vs. 2,4 pM) (FIG. 40). Na morte citotóxica de células ovarianas OVCAR-3 por células T humanas CD3- positivas, ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado é somente 2 vezes menos ativo do que ProTIA tratado com protease (EC50 de 0,7 pM vs. 0,3 pM); e o ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não- clivável é 287 vezes menos ativo do que o ProTIA clivado com protease (EC50 de 86 pM vs. 0,3 pM) (FIG. 41). Os resultados demonstraram que a atividade citotóxica de moléculas de

ProTIA é, na verdade, mediada por células T CD3-positivas; e que a suscetibilidade do segmento de liberação contido dentro da molécula de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 clivável às proteases postulada como sendo liberada das células tumorais e/ou células T CD3-positivas ativadas na mistura do ensaio provavelmente difere entre linhagens de células. Exemplo 15: Ensaios de marcador de ativação de célula T e liberação de citocinas da composição de ativador imune desencadeado por protease anti-EpCAM x anti-CD3 (ProTIA)

[350] Para medir a expressão de citocinas induzida por ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3, 1 x 105 células CD3+ purificadas foram cocultivadas com 2 x 104 células SK-OV-3 por poço de ensaio (ou seja, proporção de célula-efetora para célula-alvo de 5:1) na presença de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 (AC1476) em uma placa de 96 poços de fundo redondo com volume total final de 200 µl. Após incubação por 20 h em uma incubadora umidificada com CO2 5% a 37°C, o sobrenadante celular foi colhido para medições de citocina. Esse ensaio também pode ser realizado com outras células-alvo selecionadas de linhagens de células HCT-116, Kato III, MDA- MB-453, MCF-7, MKN45, MT3, NCI-N87, SK-Br-3, SW480, OVCAR3 e PC3, bem como PBMCs no lugar de células CD3+ purificadas.

[351] A análise de citocina de interleucina (IL)-2, IL-4, IL-6, IL-10, fator de necrose tumoral (TNF)-alfa e interferon (IFN)-gama secretadas no sobrenadante da cultura de células foi quantificada usando o kit “Human Th1/Th2 Cytokine Cytometric Bead Array” (CBA) (BD Biosciences Nº de Catálogo 550749) seguindo as instruções do fabricante. Na ausência de ProTIA, nenhuma secreção de citocina acima do nível de fundo é esperada pelas células CD3+ purificadas.

Espera-se que ProTIA na presença de células-alvo EpCAM- positivas e células CD3+ purificadas ative células T e secrete um padrão de citocinas de célula T com uma proporção elevada de citocinas Th1 como, por exemplo, IFN-gama e TNF- alfa.

[352] Como esperado, ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 induziu secreção robusta de todas as citocinas (IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-alfa, IFN-gama) avaliadas (veja as FIGS. 50-52). A estimulação de células CD3+ purificadas com células SK-OV-3 e ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease (AC1476 tratado com MMP-9) desencadeou expressão significante de citocina, especialmente em concentrações maiores do que 20 pM para todas as citocinas testadas. Em contraste, os níveis basais de IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF- alfa e IFN-gama foram detectados quando a molécula de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não clivado intacto (AC1476) foi usada em uma faixa de concentração de 8 a 200 pM (EC50 de 4,3 nM). Adicionalmente, os níveis basais de todas as citocinas testadas foram detectados quando a molécula de ProTIA anti- EpCAM x anti-CD3 não-clivável (AC1484) foi usada em uma faixa de concentração de 40 pM a 1 nM. Esses dados sugerem que o polímero de XTEN da composição de ProTIA intacto fornece efeito de blindagem considerável e impede respostas de citocina estimuladas por célula T CD3+, comparado com o ProTIA tratado com protease, no qual a porção de EpCAM x anti-CD3 é liberada da composição. Exemplo 16: Especificidade de ligação ao CD3 da composição de ativador imune desencadeado por protease anti- EpCAM x anti-CD3 (ProTIA)

[353] Na medida em que ProTIA é uma composição de direcionamento biespecífica, a capacidade de ligação da composição de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 também foi avaliada quanto à afinidade de ligação para CD3 humano.

Isso foi determinado com a ELISA em sanduíche de proteína-L conjugada a CD3ε e δ/peroxidase.

Nesse ELISA, CD3 humano recombinante (rhCD3ε e δ) (Creative BioMart Nº de Catálogo CD3E&CD3D-219H) foi revestido em uma placa de 96 poços, de fundo plano, em uma concentração de 0,025 µg/100 µl.

A placa foi lavada novamente, seguida pela introdução de faixas de doses de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não-clivável (AC1484), ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease e não tratado com protease (AC1476). A faixa de doses utilizada para todas as três versões de ProTIA foi 0,002 a 100 nM, obtidas com um esquema de diluição serial de 1:6 vezes a partir de uma concentração de partida de 100 nM.

A placa foi incubada com agitação por 1 h em temperatura ambiente para permitir que o ProTIA clivado por protease e não tratado com protease, não-clivável, se ligue ao rhCD3ε e δ revestido na placa.

Os componentes não ligados foram removidos com uma etapa de lavagem e uma proteína-L conjugada à peroxidase (ThermoFisher Scientific Nº de Catálogo 32420) a 0,05 µg/100 µl foi adicionada.

Após um período de incubação apropriado, qualquer reagente não ligado foi removido por uma etapa de lavagem, seguida pela adição de substrato de tetrametilbenzidina (TMB) a cada poço.

Após a intensidade de cor desejada ter sido alcançada, ácido sulfúrico 0,2 N foi adicionado para interromper a reação e a absorbância (OD)

foi medida a 450 nm usando um espectrofotômetro. A intensidade da cor é proporcional à concentração de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não-clivável, tratado e não tratado com protease, capturado pelo ELISA em sanduíche de rhCD3ε e δ/proteína-L. A intensidade da cor produzida (OD medida) foi plotada contra a concentração de proteína; e a concentração de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não-clivável, clivado e não clivado com protease que gerou metade da resposta máxima (EC50) foi derivada com uma equação de regressão logística de 4 parâmetros usando o software GraphPad Prism.

[354] Resultados: Como mostrado na FIG. 53, o ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease teve uma atividade de ligação similar àquela da molécula de cada ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não-clivável biespecífico, com uma EC50 de 1.800 pM e 2.200 pM, respectivamente. O ProTIA tratado com protease teve uma atividade de ligação mais forte na EC50 de 310 pM para o ligante de rhCD3ε e δ, comparado com a molécula biespecífica intacta não tratada com protease ou com a molécula de ProTIA não-clivável. Na medida em que a porção de bloqueio XTEN864 está localizada logo após a porção anti-CD3scFv, o XTEN864 resulta em impedimento na ligação da entidade de anti-CD3 não clivada ao seu ligante por aproximadamente 5,8 vezes, comparada com a porção anti- CD3scFv clivada e liberada do ProTIA que se liga ao ligante de CD3. Exemplo 17: Especificidade de ligação da composição de ativador imune desencadeado por protease anti-EpCAM x anti- CD3 (ProTIA)

[355] A especificidade de ligação de um ProTIA anti- EpCAM x anti-CD3 (AC1476) foi avaliada em conjunto com as composições de controle de ProTIA - ProTIA anti-CEA x anti- CD3 (AC1432) e ProTIA anti-HER2 x anti-CD3 (AC1408), em um ELISA em sanduíche de marcador de célula-alvo/proteína-L conjugada à biotina.

Tanto o ProTIA anti-CEA x anti-CD3 (AC1432) quanto o ProTIA anti-HER2 x anti-CD3 (AC1408) abrigam o mesmo componente de scFv anti-CD3 que o ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 (AC1476), embora com componente de direcionamento diferente.

No ensaio de ligação por ELISA, EpCAM humana recombinante (rhEpCAM) (R&D Systems Nº de Catálogo 960-EP-50), CEA humano recombinante (Abcam Nº de Catálogo ab742) e HER2 humana recombinante (AcroBiosystems Nº de Catálogo HE2-H525) foram revestidos em uma placa de 96 poços, de fundo plano, em uma concentração de 0,1 µg/100 µl.

A placa foi lavada novamente, seguida pela introdução de uma faixa de doses (0,0007 a 0,5 nM, obtida com um esquema de diluição serial de 1:3 vezes a partir de uma concentração de partida de 0,5 nM) de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease (AC1476) em poços revestidos com EpCAM, poços revestidos com CEA e poços revestidos com HER2. Servindo como controles, ProTIA anti-CEA x anti-CD3 (AC1432) tratado com protease foi introduzido em uma faixa de doses similar em poços revestidos com CEA, e ProTIA anti-HER2 x anti-CD3 (AC1408) tratado com protease também foi introduzido em uma faixa de doses similar em poços revestidos com HER2. A placa foi incubada com agitação por 1 h em temperatura ambiente para permitir que os vários ProTIAs clivados com protease se liguem ao respectivo antígeno revestido na placa.

Os componentes não ligados foram removidos com uma etapa de lavagem e uma proteína L conjugada à biotina (ThermoFisher Scientific Nº de Catálogo 29997) foi adicionada a 0,05 µg/100 µl. Após um período de incubação apropriado, qualquer reagente não ligado foi removido por uma etapa de lavagem, seguida pela adição de substrato de tetrametilbenzidina (TMB) a cada poço. Após a intensidade de cor desejada ter sido alcançada, ácido sulfúrico 0,2 N foi adicionado para interromper a reação e a absorbância (OD) foi medida a 450 nm usando um espectrofotômetro. A intensidade da cor é proporcional à concentração dos respectivos ProTIAs tratados com protease capturados pelo antígeno apropriado revestido na placa. A intensidade da cor produzida (OD medida) foi plotada contra concentração de ProTIA; e a respectiva curva de dose derivada com uma equação de regressão logística de 4 parâmetros usando o software GraphPad Prism.

[356] Resultados: Como mostrado na FIG. 54 (e comparável com os resultados da FIG. 24), ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease se liga à rhEpCAM revestida na placa de uma forma dose-dependente para gerar uma EC50 de 110 pM. Similarmente, ProTIA anti-CEA x anti-CD3 tratado com protease se liga ao antígeno de CEA revestido na placa de uma forma dose-dependente para gerar uma EC50 de 70 pM; e ProTIA anti-HER2 x anti-CD3 tratado com protease se liga ao HER2 antígeno revestido na placa de uma forma dose-dependente para gerar uma EC50 de 47 pM. Significantemente, nenhuma ligação dose-dependente foi observada para ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease que se liga tanto ao antígeno de CEA quanto ao antígeno de HER2 revestidos na placa, indicando que ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease se liga especificamente à EpCAM, mas não ao antígeno de CEA ou HER2. Dessa forma, as composições exibiram afinidade de ligação específica para seus ligantes-alvo e nenhuma ligação não específica. Exemplo 18: Propriedades antitumorais de ProTIA anti- EpCAM x anti-CD3 intacto versus ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não-clivável no modelo de tratamento precoce de SW480

[357] A suscetibilidade à protease do Segmento de liberação (RS) como modificado geneticamente na molécula de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 (AC1476) no ambiente tumoral também foi avaliada in vivo junto com ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não-clivável (AC1484), ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease e não tratado com protease (AC1476) no modelo de xenoenxerto em NOD/SCID inoculado com SW480/PBMC. De forma muito semelhante ao estudo descrito nos Exemplos 10 e 13, uma hora após inoculação de SW480/PBMC (representado como dia 0), os camundongos do coorte 1 foram injetados com veículo (PBS-Tween 80 0,05%), do coorte 2 com 0,21 mg/kg de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease, do coorte 3 com 0,5 mg/kg de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 intacto e do coorte 4 com 0,49 mg/kg de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não- clivável. Todos os coortes (ou seja, 1 a 4) foram adicionalmente tratados com quatro doses adicionais administradas diariamente do dia 1 ao dia 4. O volume do tumor, peso corporal e observações clínicas são monitorados duas vezes por semana por um período visado de 35 dias.

[358] Como mostrado na FIG. 55, ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease a 0,21 mg/kg (coorte 2), ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 intacto a 0,5 mg/kg (coorte 3) e ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não-clivável a 0,49 mg/kg (coorte 4),

são, todos, determinados como sendo terapeuticamente ativos, com um índice de inibição do crescimento tumoral (%TGI) de 93%, 95% e 80%, respectivamente. Dessa forma, dosado em concentração eqüimolar, ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 intacto é clivado eficazmente por proteases enriquecidas no tumor no anti-EpCAM x anti-CD3 liberado, altamente ativo (não ligado à porção de XTEN) para exibir eficácia de regressão tumoral equivalente ao ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease. Como esperado, embora eficaz na inibição da progressão do tumor, o ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não- clivável é menos eficaz do que ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 intacto, indicando que a presença do segmento de liberação aumentava a eficácia terapêutica da composição ao permitir a liberação dos domínios de ligação anti-EpCAM x anti-CD3.

[359] Como mostrado na FIG. 56, alguma perda de peso corporal foi observada nos coortes 2 e 3 no modelo de xenoenxerto de SW480, sugerindo alguma possível toxicidade. Experimentos adicionais que avaliam dose mínima eficaz, número reduzido de dosagens e avaliação em um modelo de tumor estabelecido trarão mais luz a essa observação inicial. Exemplo 19: Propriedades antitumorais da composição de ativador imune desencadeado por protease anti-EpCAM x anti- CD3 (ProTIA) no modelo ovariano de OVCAR-3.

[360] A eficácia in vivo de ProTIA anti-EpCAM x anti- CD3 também é avaliada usando a linhagem de célula ovariana humana OVCAR-3 implantada por via intraperitoneal nos camundongos severamente imunodeficiente NSG (NOD.Cg- Prkdcscid.IL2rgtm1Wjl/SzJ) ou NOG (NOD/Shi-scid/IL-2Rgnull). Camundongos NOG e NSG são caracterizados pela deficiência de células T, B e NK, bem como pela disfunção de macrófagos,

células dendríticas e sistema complemento. Resumidamente, no dia 0, sete coortes de 5 camundongos NOG ou NSG por grupo são implantados por via intraperitoneal com 5-10 x 106 células OVCAR-3, seguido pela introdução intravenosa de 5- 10 x 106 PBMCs no dia 14. No dia 16, o tratamento é iniciado com coorte 1 injetado com veículo (PBS + Tween 80 0,05%) diariamente por 5 doses (qdx5), o coorte 2 com 0,21 mg/kg de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease qdx5, o coorte 3 com 1,05 mg/kg de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease uma vez por semana (qw), o coorte 4 com 0,5 mg/kg de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease qdx5, o coorte 5 com 2,5 mg/kg de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease qw, o coorte 6 com 0,49 mg/kg de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não-clivável qdx5 e o coorte 7 com 2,45 mg/kg de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não- clivável qw. Todos os coortes são submetidos a outro ciclo de tratamento na semana seguinte. Os camundongos são monitorados diariamente quanto ao comportamento e sobrevida, e duas vezes por semana quanto ao peso corporal e distensão abdominal. Coletas de sangue são feitas no dia 30, dia 40, dia 50 e dia 60 para determinação de CA125 como um sinal de desenvolvimento do tumor. Quando o peso dos animais aumentava por 30% a partir do dia 0, o animal era definido como tendo atingido o desfecho do estudo e era sacrificado e autopsiado.

[361] O crescimento do tumor de OVCAR-3 é evidenciado pelo desenvolvimento de ascite intraperitoneal, como monitorado por aumento no peso corporal, aumento no diâmetro abdominal e um aumento nos níveis de CA125 circulante. Espera-se que ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tanto clivado por protease quanto não tratado com protease (por exemplo,

AC1684, AC1685, AC1686, AC1693, AC1695, AC1714 e AC1715) levarão a um aumento da sobrevida e a uma ausência ou a um retardo da formação de ascite. Espera-se também que o ProTIA não tratado com protease terá uma exposição terapêutica melhor levando a um efeito antitumoral mais eficaz e melhor perfil de segurança do que ProTIA tratado com protease. Espera-se também que o ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não- clivável retarde o crescimento tumoral, mas em um grau bem menor do que o demonstrado pelo segmento de liberação que abriga o ProTIA não tratado com protease e o ProTIA tratado com protease. Exemplo 20: Propriedades PK da composição de ativador imune desencadeado por protease anti-EpCAM x anti-CD3 (ProTIA) no modelo ovariano de OVCAR-3.

[362] O perfil PK e de biodistribuição de ProTIAs anti- EpCAM x anti-CD3 clivados por protease, não tratados com protease e não-cliváveis é avaliado como uma mistura de moléculas marcadas independentemente com metal nos camundongos BALB/c nude com tumor de OVCAR-3. A cada um dos camundongos BALB/c nude irradiados, dez milhões de células OVCAR-3 são injetadas por via intraperitoneal no dia 0. O tratamento é iniciado quando distensão abdominal é visivelmente observada e/ou quando o peso corporal do animal tiver aumentado por 10-15% em relação ao dia 0. Dos vinte camundongos com tumor de OVCAR-3, 18 são selecionados e randomizados de acordo com seu peso corporal individual em 2 grupos de 9 animais por grupo. Um grupo de 9 camundongos é injetado por via intravenosa com 1,5 mg/kg da mistura que compreende uma concentração eqüimolar de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 clivado com protease marcado com metal 1, ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease marcado com metal 2 e ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não-clivável marcado com metal 3. O outro grupo de 9 animais é administrado por via intraperitoneal com 1,5 mg/kg da mesma mistura de ProTIA.

[363] Por alternância se entre animais no mesmo grupo (ou seja, grupos administrados por via intravenosa e intraperitoneal), sangue é coletado por punção da veia jugular/mandibular em tubos com heparina-lítio em 0,5 h, 4 h, 8 h, 24 h, 48 h, 3 dias, 5 dias e 7 dias pós-administração de artigo de teste. O sangue é processado em plasma por centrifugação a 1.300 g por 10 minutos a 4°C e armazenado a -80°C até análise.

[364] Ascite é coletada de ambos os grupos administrados por via intravenosa e intraperitoneal em 4 h, 8 h, 24 h, 48 h, 3 dias, 5 dias e 7 dias pós-administrações de artigo de teste por alternância entre animais no mesmo grupo. Amostras de ascite são imediatamente centrifugadas a 300 g por 10 minutos a 4°C e o componente líquido congelado a -80°C até análise.

[365] Três camundongos de cada grupo serão terminados no dia 3, dia 5 e dia 7. Órgãos (cérebro, coração, fígado, pulmão, baço e pâncreas) e nódulos tumorais na cavidade peritoneal são colhidos, pesados, congelados instantaneamente e armazenados a -80°C até realização da análise.

[366] Todas as amostras (sangue, ascite, órgãos normais e tecidos tumorais) são analisadas por ICP-MS (espectrometria de massa com plasma indutivamente acoplado). No braço intravenoso, espera-se que seja detectada uma quantidade baixa de todos os 3 ProTIAs na ascite. No componente de plasma, espera-se que ProTIA anti-EpCAM x anti- CD3 não tratado com protease marcado com metal 2 e ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não-clivável marcado com metal 3 demonstrem uma meia-vida sistêmica mais longa do que ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 clivado com protease marcado com metal

1. No braço intraperitoneal, espera-se que todas as 3 versões de ProTIA sejam detectáveis na ascite. Em função da presença de tumor no espaço intraperitoneal, não se sabe se ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease marcado com metal 2 e ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não-clivável marcado com metal 3 terão um tempo de retenção um mais longo na cavidade peritoneal, comparados com ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 clivado com protease marcado com metal 1. Espera- se que todas as 3 versões de ProTIA sejam detectadas no plasma em um tempo retardado e em uma concentração menor, comparada com a via intravenosa. Espera-se que todas as 3 versões de ProTIA estejam presentes em uma concentração maior em nódulos tumorais extraídos da cavidade peritoneal, mas minimamente ou ausentes em órgãos normais. Exemplo 21: Propriedades antitumorais da composição de ativador imune desencadeado por protease anti-EpCAM x anti- CD3 (ProTIA) em SK-OV-3 modelo ovariano.

[367] A eficácia in vivo de ProTIA anti-EpCAM x anti- CD3 também é avaliada usando a linhagem de célula ovariana humana SK-OV-3 implantada por via intraperitoneal nos camundongos severamente imunodeficiente NSG (NOD.Cg- Prkdcscid.IL2rgtm1Wjl/SzJ) ou NOG (NOD/Shi-scid/IL-2Rgnull). Camundongos NOG e NSG são caracterizados pela deficiência de células T, B e NK, bem como pela disfunção de macrófagos, células dendríticas e sistema complemento. Resumidamente, no dia 0, sete coortes de 5 camundongos NOG ou NSG por grupo são implantados por via intraperitoneal com 5-10 x 106 células SK-OV-3, seguido pela introdução intraperitoneal de 5-10 x 106 PBMCs no dia 5. No dia 7, o tratamento é iniciado com o coorte 1 injetado com veículo (PBS + Tween 80 0,05%) diariamente por 5 doses (qdx5), o coorte 2 com 0,21 mg/kg de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease qdx5, o coorte 3 com 1,05 mg/kg de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease uma vez por semana (qw), o coorte 4 com 0,5 mg/kg de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease qdx5, o coorte 5 com 2,5 mg/kg de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease qw, o coorte 6 com 0,49 mg/kg de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não-clivável qdx5 e o coorte 7 com 2,45 mg/kg de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não- clivável qw. Os camundongos são monitorados diariamente quanto ao comportamento e sobrevida, e duas vezes por semana quanto ao peso corporal e distensão abdominal. Quando o peso dos animais aumentava por 30% a partir do dia 0, os animais eram definidos como tendo atingido o desfecho do estudo e eram sacrificados e autopsiados.

[368] O crescimento de SK-OV-3 é evidenciado pelo desenvolvimento de ascite intraperitoneal monitorado por aumento no peso corporal e aumento no diâmetro abdominal. Espera-se que ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tanto clivado por protease quanto não tratado com protease (por exemplo, AC1684, AC1685, AC1686, AC1693, AC1695, AC1714 e AC1715) levarão a um aumento da sobrevida e ausência ou retardo da formação de ascite. Espera-se também que o ProTIA não tratado com protease transmitirá uma exposição terapêutica melhor, um efeito antitumoral mais eficaz e melhor perfil de segurança do que ProTIA tratado com protease. Espera-se também que o ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não-clivável retarde o crescimento tumoral, mas em uma magnitude bem menor do que aquela exibida pelo segmento de liberação que abriga ProTIA o ProTIA não tratado com protease e o ProTIA tratado com protease. Exemplo 22: Desempenho da composição de ativador imune desencadeado por protease anti-EpCAM x anti-CD3 (ProTIA) em amostras de ascite humana maligna.

[369] Amostras de ascite humana maligna são coletadas de pacientes com malignidades epiteliais intraperitoneais primárias EpCAM-positivas que incluem, sem limitação, pacientes com carcinoma avançado, recidivado e refratário ovariano (adenocarcinoma e mucinoso), cólon-retal, gástrico, do ducto biliar/colangiocarcinoma, da Ampola de Vater, pancreático e célula renal não-clara. Pacientes que estão recebendo quimioterapia, terapia imunológica, produtos biológicos e/ou terapia com corticosteróide dentro dos últimos 30 dias antes da coleta da amostra são excluídos. As ascites malignas são centrifugadas a 300-400 g por 10 min em temperatura ambiente e o componente líquido e peletizado colhidos. A concentração de proteases humanas incluindo, sem limitação, MMP-9, MMP-2, matriptase e uPA, é quantificada no componente líquido usando kits de ELISA comercialmente disponíveis (MMP-9 humana, Invitrogen Nº de Catálogo KHC3061 ou equivalente; MMP-2 humana, Invitrogen Nº de Catálogo KHC3081 ou equivalente; matriptase humana, Enzo Nº de Catálogo ADI-900-221; e uPA humano, Abcam Nº de Catálogo 119611) seguindo as instruções do fabricante. A taxa de clivagem de anti-EpCAM x anti-CD3 intacto (por exemplo,

AC1684, AC1685, AC1686, AC1693, AC1695, AC1714 e AC1715) por protease encontrada no líquido ascítico é determinada por inoculação de uma concentração conhecida do ProTIA no componente de líquido ascítico e incubação da mistura a 37°C, com uma alíquota retirada nos pontos do tempo indicados de 0,5 h, 2h, 4 h, 8 h, 24 h, 48 h, 3 dias, 4 dias, 5 dias e 7 dias. As quantidades de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 intacto presente nos respectivos pontos do tempo são então analisadas em um ELISA em sanduíche de rhEpCAM/biotinilado-anti-XTEN com o anti-EpCAM x anti-CD3 intacto correspondente como padrão.

[370] Resumidamente, uma placa de ELISA (Nunc Maxisorp Nº de Catálogo 442404) é revestida com 0,1 micrograma/100 µl por poço de rhEpCAM (R&D Systems, Nº de Catálogo EHH104111). Após incubação de um dia para o outro a 4°C, a placa de ELISA é lavada e bloqueada com BSA 3% por 1 h em temperatura ambiente. A placa é lavada novamente, seguido pela adição apropriada de uma faixa de doses de padrões de ProTIA anti- EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease intacto, controles de qualidade apropriados e amostras de teste de ascite inoculadas com ProTIA. A placa é incubada com agitação por 1 h em temperatura ambiente para permitir que os padrões de ProTIA, controles de qualidade e as amostras de teste se liguem à rhEpCAM revestida na placa. Os componentes não ligados são removidos com várias lavagens. Anticorpo anti- XTEN biotinilado (um anticorpo proprietário) é adicionado a 0,1 µg/100 µl e a placa incubada em temperatura ambiente por 1 h. Após remoção por lavagem de reagente biotinilado não ligado, estreptavidina-HRP (ThermoFisher Scientific Nº de Catálogo 21130) é adicionada em uma diluição de 1:30.000 e a placa incubada em temperatura ambiente por 1 h. Após várias lavagens, substrato de TMB é adicionado a cada poço. Após ser alcançada a intensidade de cor desejada, ácido sulfúrico 0,2 N é adicionado para interromper a reação e a absorbância (OD) é medida a 450 nm usando um espectrofotômetro. A intensidade da cor é proporcional à concentração de ProTIA intacto capturado pelo ELISA em sanduíche de rhEpCAM/biotinilado-anti-XTEN. A concentração de ProTIA intacto presente nas amostras de teste de ascite é determinada contra a curva-padrão de ProTIA intacto usando o software SoftMax Pro. A taxa de diminuição de ProTIA intacto como detectado no ELISA em sanduíche de rhEpCAM/biotinilado-anti-XTEN (ou seja, meia-vida) é determinada usando GraphPad Prism. Postula-se que diferenças em Segmentos de liberação provavelmente participam na taxa metabolismo entre os ProTIAs não tratados com protease.

[371] O pélete de ascite é fenotipado quanto à expressão de EpCAM, CD3, CD4, CD8, CA125 e CD56. Amostras de ascite maligna testadas positivas para EpCAM e CD3 são usadas para análise citotóxica com ProTIA tratado com protease e não tratado com protease. Resumidamente, 1 x 105 células de ascite são reconstituídas com uma quantidade apropriada de líquido ascítico e permite-se que possam aderir em uma placa de 24 poços por 24 h em triplicata. As células são tratadas com concentrações de doses de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease e intacto por 48 h, seguido por quantificação de caspase 3/7 usando um substrato luminogênico de caspase 3/7 de acordo com as instruções do fabricante (Promega Caspase-Glo 3/7 Nº de Catálogo G8091). Com o sinal de luminescência sendo proporcional à atividade de caspase-3/7, a concentração de dose de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado e não tratado com protease é então plotada contra o sinal de luminescência e a concentração de proteína que gera metade da resposta máxima (EC50) é derivada com uma equação de regressão logística de 4 parâmetros usando o software GraphPad Prism. Espera-se que a ascite humana maligna derivada de pacientes com câncer EpCAM-positivo avançado, recidivado e refratário conterá todos os componentes necessários para a clivagem e ativação subseqüente de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 intacto na porção anti-EpCAM x anti-CD3 não-XTENilada que exerce forte atividade citotóxica. Uma diminuição no número de células EpCAM-positivas como um sinal de eliminação do tumor; e um aumento nos marcadores de ativação de célula T como, por exemplo, CD69 e granzimas, como um reflexo da ativação de célula T, também são esperados. Exemplo 23: Ensaio de caspase 3/7 da composição de ativador imune desencadeado por protease anti-EpCAM x anti- CD3 (ProTIA)

[372] A citotoxicidade celular redirecionada de composições de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 também foi avaliada por meio de atividades de caspase 3/7 de células apoptóticas. Similar ao ensaio de citotoxicidade de LDH descrito acima, PBMC ou células T CD3-positivas purificadas foram misturadas com células tumorais-alvo EpCAM-positivas como, por exemplo, células SW480, SK-OV-3 e OVAR-3, em uma proporção de 5 células efetoras para 1 célula-alvo, HCT-116 em uma proporção de 10:1; e todas as três versões de ProTIA foram testadas como concentrações de doses de uma diluição serial 5x de 12 pontos como no ensaio de LDH descrito acima.

[373] Mediante lise celular, caspase 3/7 liberada em sobrenadantes de cultura foi medida pela quantidade de clivagem de substrato luminogênico de caspase 3/7 por caspase 3/7 para gerar o sinal luminescente do tipo “glow” (Promega Caspase-Glo 3/7 Nº de Catálogo G8091). A quantidade de luminescência é proporcional à quantidade de atividades de caspase.

[374] Como esperado, foi verificado que a tendência de atividade do ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease, não tratado com protease e não-clivável perfilada em linhagens tumorais de células SK-OV-3, OVCAR-3, HCT-116 e SW480 está em concordância com as atividades observadas na análise do ensaio de LDH. Na morte citotóxica de células ovarianas SK-OV-3 por PBMCs humanas, ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado é 12 vezes menos ativo do que ProTIA tratado com protease (EC50 de 140 pM vs. 12 pM); e o ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não-clivável é 390 vezes menos ativo do que o ProTIA clivado com protease (EC50 de 4.700 pM vs. 12 pM) (FIG. 57). Na morte citotóxica de células ovarianas OVCAR-3 por PBMC, ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não clivado por protease é 4 vezes menos ativo do que ProTIA tratado com protease (EC50 de 9,8 pM vs. 2,5 pM); e o ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não-clivável é 420 vezes menos ativo do que o ProTIA clivado com protease (EC50 de 1043 pM vs. 2,5 pM) (FIG. 58). Na morte citotóxica de células cólon-retais HCT- 116 por PBMC, ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease e não tratado com protease intacto possuem atividade quase similar (EC50 de 1,8 pM vs. 3,6 pM); e o ProTIA anti- EpCAM x anti-CD3 não-clivável é 130 vezes menos ativo do que o ProTIA clivado com protease (EC50 de 240 pM vs. 1,8 pM)

(FIG. 59). Na morte citotóxica de células cólon-retais SW480 por PBMCs, ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease e não clivado por protease também demonstraram atividade similar (EC50 de 2 pM vs. 1 pM); e o ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não-clivável é 70 vezes menos ativo do que o ProTIA clivado com protease (EC50 de 148 pM vs. 2 pM) (FIG. 60). Os resultados demonstraram que ProTIA não-clivável é consistentemente menos ativo do que a porção anti-EpCAM x anti-CD3 não-XTENilada. Dependendo das linhagens de células usadas, a atividade de ProTIA intacto, não tratado com protease, variou de similar a 12 vezes menos ativo, comparado com ProTIA clivado com protease, sugerindo uma diferença no grau de suscetibilidade do segmento de liberação às proteases postuladas como sendo liberadas das células tumorais e/ou células T CD3-positivas ativadas na mistura do ensaio. Exemplo 24: Clivagem proteolítica de AC1476 aEpCAM- aCD3-BSRS1-XTEN_AE864-His(6) usando várias proteases

[375] O experimento foi realizado para demonstrar que o aEpCAM-aCD3-BSRS1-XTEN_AE864-His(6) AC1476, descrito previamente no Exemplo 3, pode ser clivado in vitro por várias proteases associadas a tumores, incluindo MMP-2, MMP- 9, e elastase de neutrófilo.

1. Ativação enzimática

[376] Todas as enzimas usadas foram obtidas de R&D Systems. Elastase de neutrófilo recombinante e matriptase humana recombinante foram fornecidas como enzimas ativadas e armazenadas a -80°C até o uso. MMP-2 de camundongo recombinante e MMP-9 de camundongo recombinante foram fornecidas como zimogênios e necessitavam de ativação por acetato 4-aminofenilmercúrico (APMA). APMA primeiro foi dissolvido em 0,1 M de NaOH até uma concentração final de 10 mM antes do pH ter sido reajustado até neutro usando 0,1 N HCl. Diluição adicional do estoque de APMA até 2,5 mM foi feita em 50 mM de Tris, 150 mM de NaCl, 10 mM de CaCl2, pH 7,5. Para ativar pró-MMP, 1 mM de APMA e 100 µg/ml de pró- MMP foram incubadas a 37°C por 1 hora (MMP-2) ou 3 horas (MMP-9). Glicerol foi adicionado às enzimas ativadas até uma concentração final de 50% e depois cada uma foi armazenada a -20°C.

2. Digestão enzimática

[377] Um painel de enzimas foi usado para digerir a composição de ProTIA aEpCAM-aCD3-BSRS1-XTEN_AE864-His(6) AC1476. Dez µM da composição de substrato foram incubados individualmente com cada enzima nas seguintes proporções molares de enzima-para-substrato: MMP-2 (1:200), MMP-9 (1:2.000), matriptase (1:12,5) e elastase de neutrófilo (1:1.000). As reações foram incubadas a 37°C por duas horas antes da interrupção da digestão por corante de carregamento em gel e aquecimento a 80°C.

3. Análise de clivagem.

[378] A análise das amostras foi realizada por carregamento de 5 µg de material não digerido e digerido em SDS-PAGE e coloração com Azul Coomassie. Mediante tratamento por cada protease no segmento de liberação BSRS-1, o substrato gerou dois fragmentos detectáveis no gel de SDS- PAGE, com o fragmento pequeno contendo aEpCAM-aCD3 (a forma ativada da primeira porção com os domínios de ligação) e o outro contendo XTEN liberado, que migra em um peso molecular aparente ligeiramente menor em SDS-PAGE do que a forma intacta. Para elastase de neutrófilo, que também digere XTEN liberado, a forma ativada foi observada no gel, bem como outros fragmentos menores; esses últimos em função da clivagem de XTEN em várias localizações ao longo da seqüência. Os resultados confirmam que todas as proteases testadas clivaram a construção como desejado, com a liberação dos domínios de ligação. Exemplo 25: Propriedades antitumorais da composição de ativador imune desencadeado por protease anti-EpCAM x anti- CD3 (ProTIA) no modelo de tumor cólon-retal estabelecido

[379] No modelo de tumor cólon-retal estabelecido, células tumorais HCT-116 foram implantadas independentemente em camundongos NOG (NOD/Shi-scid/IL-2Rgnull) no dia 0 (os camundongos NOG são camundongos NOD/SCID que abrigam mutação IL-2Rg que faz com que os camundongos não tenham de células T, B e NK, tenham macrófagos disfuncionais, células dendríticas disfuncionais e atividade de complemento reduzida). PBMCs humanas foram então introduzidas por via intravenosa no dia 4. Quando o tumor de HCT-116 alcançava um volume de 100-150 mm3, os tratamentos com ProTIAs anti-EpCAM x anti-CD3 foram iniciados 3x por semana por 4 semanas em concentração eqüimolar de 21,6 nmol/kg. Isso é equivalente a 1,26 mg/kg de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 clivado por protease e 3,0 mg/kg de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease e não-clivável.

[380] ProTIA tanto clivado por protease quanto não tratado com protease (por exemplo, AC1476) levaram a uma redução significante de tumores de HCT-116 estabelecidos, quando comparado com grupo de controle tratado com veículo (p = 0,004 e p = 0,001, respectivamente). O ProTIA anti- EpCAM x anti-CD3 não-clivável (por exemplo, AC1484) não retardou o crescimento tumoral, como esperado, na medida em que ele não contém a seqüência do substrato para clivagem por protease dentro do ambiente tumoral (p = 0,198) (FIG. 61). Exemplo 26: Propriedades antitumorais da composição de ativador imune desencadeado por protease anti-EpCAM x anti- CD3 (ProTIA) no modelo ovariano de OVCAR-3.

[381] A eficácia in vivo de ProTIA anti-EpCAM x anti- CD3 também foi avaliada usando a linhagem de células ovarianas humanas OVCAR-3 resistentes à platina implantadas por via intraperitoneal nos camundongos severamente imunodeficiente NOG (NOD/Shi-scid/IL-2Rgnull). Os camundongos NOG são caracterizados pela deficiência de células T, B e NK, bem como pela disfunção de macrófagos, células dendríticas e sistema complemento. No dia 0, oito coortes (Grupos 1-7 com 6 camundongos NOG por grupo; e Grupo 9 com 8 camundongos NOG) foram implantados por via intraperitoneal com 10 x 106 células OVCAR-3. O Grupo 8, que consiste em 5 camundongos NOG, também foi configurado no dia 0 sem inoculação de OVCAR-3. Quando era observado que as células tumorais tinham progredido como refletido por um aumento no nível de CA125 humano em relação ao nível de base (abaixo do limite de detecção) até 300-400 U/ml no dia 20, 10 x 106 PBMCs foram introduzidas por via intraperitoneal nos Grupos 1-8. O Grupo 9 não recebeu nenhuma PBMC. Os tratamentos foram iniciados no dia da inoculação de PBMCs, com Grupos 1, 8 e 9 injetados com veículo (PBS + Tween 80 0,05%), Grupo 2 com 0,21 mg/kg de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease, Grupo 3 com 1,05 mg/kg de ProTIA anti-EpCAM x anti- CD3 tratado com protease, Grupo 4 com 0,5 mg/kg de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease, Grupo 5 com 2,5 mg/kg de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease, Grupo 6 com 0,49 mg/kg de ProTIA anti-EpCAM x anti- CD3 não-clivável, e Grupo 7 com 2,46 mg/kg de ProTIA anti- EpCAM x anti-CD3 não-clivável. Todos os coortes foram tratados duas vezes por semana por 4 semanas. Os camundongos foram monitorados diariamente quanto ao comportamento e sobrevida, e duas vezes por semana quanto ao peso corporal e distensão abdominal. Amostras de sangue foram coletadas no dia 28, dia 42 e dia 48 para determinação de CA125 como um sinal de desenvolvimento do tumor.

[382] O crescimento do tumor de OVCAR-3 era mais nitidamente evidenciado por um aumento nos níveis de CA125 humano circulante. Como mostrado na FIG. 62, o nível de CA125 no Grupo 1 (OVCAR3 + PBMC) aumentou de 378 ± 187 U/ml no dia 20 para 6.506 ± 7.911 U/ml no dia 48; e no Grupo 9 (somente OVCAR-3) de 379 ± 111 U/ml no dia 20 para 1.072 ± 236 U/ml no dia 48. O Grupo 8, que abriga somente PBMCs, sem células OVCAR-3, teve nível de CA125 abaixo do limite de detecção ao longo de todo o estudo.

[383] Como esperado, ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tanto clivado por protease quanto não tratado com protease (por exemplo, AC1476) levaram a um nível diminuído de CA125 circulante ao longo do tempo. Isso foi demonstrado para ambos os níveis de dose. Como mostrado na FIG. 63 (dose baixa) e FIG. 64 (dose alta), o nível de CA125 no Grupo 2 (0,21 mg/kg de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease) diminuiu de 352 ± 132 U/ml no dia 20 para 20,4 ± 39 U/ml no dia 48; Grupo 3 (1,05 mg/kg de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 tratado com protease) diminuiu de 354 ± 125 U/ml no dia 20 para 50 ± 103 U/ml no dia 48; Grupo 4 (0,5 mg/kg de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease) diminuiu de 351 ± 126 U/ml no dia 20 para 96 ± 45 U/ml no dia 48; e Grupo 5 (2,5 mg/kg de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease) diminuiu de 348 ± 120 U/ml no dia 20 para 7 ± 10 U/ml no dia 48.

[384] Os grupos tratados com ProTIA anti-EpCAM x anti- CD3 não-clivável demonstraram um aumento nos níveis de CA125 ao longo do tempo. O Grupo 6 (0,49 mg/kg de ProTIA anti- EpCAM x anti-CD3 não-clivável) um aumento em CA125 de 344 ± 118 U/ml no dia 20 para 3.426 ± 4.170 U/ml no dia 48; e o Grupo 7 (2,46 mg/kg de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não- clivável) demonstrou um aumento em CA125 de 351 ± 113 U/ml no dia 20 para 1.905 ± 2.534 U/ml no dia 48. Exemplo 27: Propriedades antitumorais da composição de ativador imune desencadeado por protease anti-EpCAM x anti- CD3 (ProTIA) no modelo ovariano de OVCAR-3 versus padrão de atendimento.

[385] A eficácia in vivo de ProTIA anti-EpCAM x anti- CD3 não tratado com protease (de modo que o ProTIA permanecesse intacto) administrado por via intraperitoneal versus por via intravenosa, bem como contra bevacizumab, foi avaliada usando a linhagem de células ovarianas humanas OVCAR-3 resistentes à platina implantadas por via intraperitoneal nos camundongos severamente imunodeficiente NOG (NOD/Shi-scid/IL-2Rgnull). Os camundongos NOG são caracterizados pela deficiência de células T, B e NK, bem como pela disfunção de macrófagos, células dendríticas e sistema complemento. No dia 0, oito coortes (Grupos 1-7 e Grupo 9) de 6 camundongos NOG por grupo foram implantados por via intraperitoneal com 10 x 106 células OVCAR-3. O Grupo 8, que consiste em 6 camundongos NOG, também foi configurado no dia 0 sem inoculação de OVCAR-3. Quando era observado que as células tumorais tinham progredido como refletido por um aumento no nível de CA125 humano em relação ao nível de base (abaixo do limite de detecção) até aproximadamente 650 U/ml no dia 21, 10106 PBMCs foram introduzidas por via intravenosa aos Grupos 1-8. O Grupo 9 não recebeu nenhuma PBMC. Os tratamentos foram iniciados no dia da inoculação de PBMCs com os Grupos 1, 8 e 9 injetados por via intravenosa com veículo (PBS + Tween 80 0,05%), Grupo 2 administrado por via intraperitoneal com 0,5 mg/kg de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease, Grupo 3 administrado por via intraperitoneal com 2,5 mg/kg de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease, Grupo 4 administrado por via intravenosa com 0,5 mg/kg de ProTIA anti-EpCAM x anti- CD3 não tratado com protease, Grupo 5 administrado por via intravenosa com 2,5 mg/kg de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease, Grupo 6 administrado por via intravenosa com 2 mg/kg de bevacizumab, e Grupo 7 administrado por via intravenosa com 5 mg/kg de bevacizumab. Todos os coortes foram tratados duas vezes por semana por 4 semanas. Os camundongos foram monitorados diariamente quanto ao comportamento e sobrevida, e duas vezes por semana quanto ao peso corporal e distensão abdominal. Amostras de sangue foram coletadas no dia 27, dia 34, dia 41, dia 48 e no sacrifício para determinação de CA125 como um sinal de desenvolvimento do tumor.

[386] O crescimento do tumor de OVCAR-3 era mais nitidamente evidenciado por um aumento nos níveis de CA125 humano circulante. O nível de CA125 no Grupo 1 (OVCAR3 + PBMC) aumentou de 682 ± 259 U/ml no dia 21 para 1.727 ± 749 U/ml no sacrifício; e no Grupo 9 (somente OVCAR-3) de 671 ± 212 U/ml no dia 21 para 3.554 ± 2908 U/ml no sacrifício. O Grupo 8, que abriga somente PBMCs, sem células OVCAR-3, teve um nível de CA125 abaixo do limite de detecção ao longo de todo o estudo.

[387] Como monitorado por CA125, ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease (por exemplo, AC1476) administrado por via intravenosa foi tão eficaz quanto foi a administração intraperitoneal (FIG. 65). O nível de CA125 no Grupo 2 (0,5 mg/kg de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease, IP) aumentou ligeiramente de 679 ± 242 U/ml no dia 21 para 891 ± 897 U/ml no sacrifício; o Grupo 3 (2,5 mg/kg de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease, IP) diminuiu de 677 ± 241 U/ml no dia 21 para 228 ± 269 U/ml no sacrifício; o Grupo 4 (0,5 mg/kg de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease, IV) permaneceu relativamente inalterado de 661 ± 216 U/ml no dia 21 para 661 ± 861 U/ml no sacrifício; e o Grupo 5 (2,5 mg/kg de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease, IV) diminuiu de 658 ± 200 U/ml no dia 21 para 180 ± 348 U/ml no sacrifício.

[388] Quando monitorado por volume tumoral total no sacrifício de todos os animais, ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease administrado por via intravenosa superou a administração por meio da via intraperitoneal, especialmente entre os grupos de doses maiores. O volume tumoral total para todos os animais no sacrifício para o Grupo 3 (2,5 mg/kg de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease, IP) foi de 2.600 mm3; e foi de 460 mm3 para o Grupo 5 (2,5 mg/kg de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease, IV) (FIG. 66).

[389] Quando monitorado por volume tumoral total no sacrifício de todos os animais, 2,5 mg/kg administrados por via intravenosa de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease (Grupo 5) superaram os coortes tratados com 2 mg/kg e 5 mg/kg de bevacizumab, com volume tumoral total menor. O volume tumoral total para todos os animais no sacrifício para o Grupo 5 (2,5 mg/kg de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease, IV) foi de 460 mm3, comparado com 2.900 mm3 para o Grupo 6 (2 mg/kg de bevacizumab, IV) e 4.630 mm3 para o Grupo 7 (5 mg/kg de bevacizumab, IV) (FIG. 67). Exemplo 28: Ensaio de ligação ao CD3 da composição de ativador imune desencadeado por protease anti-EpCAM x anti- CD3 (ProTIA)

[390] A capacidade de ligação da composição de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 foi verificada com um ELISA em sanduíche de CD3-épsilon-delta/anti-XTEN. No ensaio de ligação por ELISA, CD3 humano recombinante (rhCD3) (Creative Biomart Nº de Catálogo CD3E&CD3D-219H) foi revestido em uma placa de 96 poços, de fundo plano, em uma concentração de 0,25 µg/100 µl. Após incubação de um dia para o outro a 4°C, a placa do ensaio foi lavada e bloqueada com albumina sérica bovina 3% (BSA) por 1 h em temperatura ambiente. A placa foi lavada novamente, seguida pela introdução de uma faixa de doses de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não-clivável (ou seja, um ProTIA sem a seqüência do segmento de liberação de clivagem e AC1484, uma composição de montagem de polipeptídeo

ProTIA quimérico) e ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease (por exemplo, AC1684, AC1685, AC1686, AC1693, AC1695, AC1714, AC1715). A faixa de doses utilizada para ProTIA não-clivável e não tratado com protease foi de 3.600 a 0,077 ng/ml, obtida com um esquema de diluição serial de 1:6 vezes a partir de uma concentração de partida de 3.600 ng/ml.

A placa foi incubada com agitação por 1 h em temperatura ambiente para permitir que o ProTIA não clivado com protease, não-clivável, se ligue ao rhCD3ε e δ revestido na placa.

Os componentes não ligados foram removidos com uma etapa de lavagem e um anticorpo proprietário anti-XTEN biotinilado monoclonal foi adicionado.

Após um período de incubação apropriado que permitiu que o anticorpo anti-XTEN se ligasse ao polipeptídeo XTEN nos ProTIAs, qualquer reagente não ligado foi removido por uma etapa de lavagem, seguida pela adição de substrato de tetrametilbenzidina (TMB) a cada poço.

TMB é um substrato cromogênico de peroxidase.

Após a intensidade de cor desejada ter sido alcançada, ácido sulfúrico 0,2 N foi adicionado para interromper a reação e a absorbância (OD) foi medida a 450 nm usando um espectrofotômetro.

A intensidade da cor é proporcional à concentração de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease, não-clivável, capturado pelo ELISA em sanduíche de rhCD3ε e δ/anti-XTEN.

A intensidade da cor produzida (OD medida) foi plotada contra a concentração de proteína; e a concentração de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não-clivável e não clivado por protease que gerou metade da resposta máxima (EC50) foi derivada com uma equação de regressão logística de 4 parâmetros usando o software GraphPad Prism.

[391] Como mostrado na FIG. 68, todos os ProTIA anti- EpCAM x anti-CD3 não tratados com protease, exceto para AC1693, possuem uma atividade de ligação similar àquela de molécula de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não-clivável biespecífica AC1484 (EC50 de 27 ng/ml). A EC50 de AC1684 é 31 ng/ml, de AC1685 é 29 ng/ml, de AC1686 é 26 ng/ml, de AC1695 é 28 ng/ml, de AC1714 é 30 ng/ml e de AC1715 é 34 ng/ml. Somente AC1693 com uma EC50 de 9 ng/ml possui uma ligação 3 vezes mais ativa do que AC1484 não-clivável para o ligante de rhCD3ε e δ. Os dados sugerem que diferenças na composição do Segmento de liberação podem influenciar a ligação de ProTIA ao antígeno CD3 encontrado em células T. Exemplo 29: Propriedades farmacocinéticas da composição de ativador imune desencadeado por protease anti-EpCAM x anti-CD3 (ProTIA)

[392] As propriedades farmacocinéticas de variantes de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease (por exemplo, AC1684, AC1685, AC1686, AC1693, AC1695, AC1714 e AC1715) seriam analisadas em conjunto com ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não-clivável (por exemplo, AC1484) em camundongos C57BL/6. Cada ProTIA seria avaliado com três camundongos por grupo em uma dose intravenosa de 4 mg/kg. Nos pontos do tempo apropriados de pré-dose, 4 h, 8 h, 24 h, 2 d, 4 d, 6 d e 7 d, sangue seria coletado em tubos heparinizados com lítio e processado em plasma. A concentração plasmática de ProTIAs seria quantificada por ELISA em sanduíche de rhEpCAM/biotinilado-anti-XTEN com o ProTIA não tratado com protease como padrão.

[393] Resumidamente, uma placa de ELISA (Nunc Maxisorp Nº de Catálogo 442404) seria revestida com 0,1 micrograma/100 µl por poço de rhEpCAM (R&D Systems, Nº de Catálogo EHH104111). Após incubação de um dia para o outro a 4°C, a placa de ELISA seria lavada e bloqueada com BSA 3% por 1 h em temperatura ambiente.

A placa seria então lavada novamente, seguido pela adição apropriada de uma faixa de doses de padrões de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease e não-clivável, controles de qualidade apropriados e amostras de plasma de teste.

A placa seria incubada com agitação por 1 h em temperatura ambiente para permitir que os padrões de ProTIA, controles de qualidade e as amostras de teste se liguem à rhEpCAM revestida na placa.

Os componentes não ligados seriam removidos com várias lavagens.

Para detecção, anticorpo anti-XTEN biotinilado seria adicionado a 0,1 µg/100 µl e a placa seria incubada em temperatura ambiente por 1 h.

Após remoção por lavagem de reagente biotinilado não ligado, estreptavidina-HRP (Thermo Scientific Nº de Catálogo 21130) seria adicionada em uma diluição de 1:30.000 e a placa incubada em temperatura ambiente por 1 h.

Após várias lavagens, substrato de TMB seria adicionado a cada poço.

Após ser alcançada a intensidade de cor desejada, ácido sulfúrico 0,2 N é adicionado para interromper a reação e a absorbância (OD) medida a 450 nm usando um espectrofotômetro.

A intensidade da cor é proporcional à concentração de ProTIA não tratado com protease e não-clivável capturado pelo ELISA em sanduíche de rhEpCAM/biotinilado-anti-XTEN.

A concentração de ProTIA presente nas amostras de plasma é determinada contra a curva apropriada do padrão de ProTIA não tratado com protease ou não-clivável usando o software SoftMax Pro.

Cálculos farmacocinéticos de meia-vida terminal (T1/2) do ProTIA anti-

EpCAM x anti-CD3 não clivado por protease e não-clivável seriam realizados com GraphPad Prism.

[394] Espera-se que os resultados não mostrariam nenhuma diferença na meia-vida de eliminação (T1/2) entre as diferentes variantes de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease, e também contra o ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não-clivável. Exemplo 30: Propriedades PK da composição de ativador imune desencadeado por protease anti-EpCAM x anti-CD3 (ProTIA) no modelo ovariano de OVCAR-3.

[395] O perfil PK de ProTIAs anti-EpCAM x anti-CD3 clivados por protease, não tratados com protease e não- cliváveis foi avaliado como uma mistura de moléculas marcadas independentemente com metal nos camundongos BALB/c nude com tumor de OVCAR-3. A cada um dos camundongos BALB/c nude irradiados, dez milhões de células OVCAR-3 são injetadas por via intraperitoneal no dia 0. O tratamento foi iniciado quando a distensão abdominal era visivelmente observada e/ou o quando peso corporal do animal tivesse aumentado por 10- 15% em relação ao dia 0. Dos vinte camundongos com tumor de OVCAR-3, 18 foram selecionados e randomizados de acordo com seu peso corporal individual em 2 grupos de 9 animais por grupo. Um grupo de 9 camundongos foi injetado por via intravenosa com 1,5 mg/kg da mistura que compreende uma concentração eqüimolar de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 clivado com protease marcado com Lutécio (Lu), ProTIA anti- EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease marcado com Hólmio (Ho) e ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não-clivável marcado com Térbio (Tb). O outro grupo de 9 animais é administrado por via intraperitoneal com 1,5 mg/kg da mesma mistura de ProTIA.

[396] Por alternância entre animais dentro do mesmo grupo (ou seja, grupos administrados por via intravenosa e intraperitoneal) em função de limitações no sangue retirado e manipulação do tratamento por camundongo, sangue foi coletado por punção da veia jugular/mandibular em tubos com heparina-lítio em 0,5 h, 4 h, 8 h, 24 h, 48 h, 3 dias, 5 dias e 7 dias pós-administração de artigo de teste. O sangue foi processado em plasma por centrifugação a 1.300 g por 10 minutos a 4°C e armazenado a -80°C até análise.

[397] Ascite foi coletada de ambos os grupos administrados por via intravenosa e intraperitoneal em 4 h, 8 h, 24 h, 48 h, 3 dias, 5 dias e 7 dias pós-administrações de artigo de teste por alternância entre animais dentro do mesmo grupo. Amostras de ascite foram imediatamente centrifugadas a 300 g por 10 minutos a 4°C e o componente líquido congelado a -80°C até análise. Todas as amostras (sangue e ascite) foram analisadas por ICP-MS (espectrometria de massa com plasma indutivamente acoplado).

[398] No compartimento plasmático do braço administrado por via intravenosa, ProTIA anti-EpCAM x anti- CD3 não tratado com protease marcado com Ho e ProTIA anti- EpCAM x anti-CD3 não-clivável marcado com Tb demonstraram meia-vida similar de 19,5 h. Como esperado, ProTIA anti- EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease marcado com Ho teve uma meia-vida sistêmica mais longa, comparado com o ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 clivado com protease marcado com Lu (19,5 h vs. 2 h) (FIG 69A). No compartimento de ascite, todos os 3 ProTIAs eram detectáveis, em quantidade equivalente baixia de aproximadamente 4% da dose injetada (ID)/g na Tmax de 48 h. Apesar da quantidade baixa, todos os

3 ProTIAs exibiram uma exposição longa dentro da cavidade peritoneal, como refletido por AUC4-168 de aproximadamente 400% de ID/gxh (FIG 69B).

[399] No compartimento plasmático do braço administrado por via intraperitoneal, ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease marcado com Ho e ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não-clivável marcado com Tb alcançaram Cmax em aproximadamente 8 h, e demonstraram meia-vida equivalente de 21,4 e 22,9 h, respectivamente. O ProTIA anti- EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease marcado com Ho exibiu uma meia-vida sistêmica mais longa, comparado com o ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 clivado com protease marcado com Lu (21,4 h vs. 6,5 h) (FIG. 70A). No compartimento de ascite, ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease marcado com Ho e ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não-clivável marcado com Tb foram detectados em aproximadamente 10% de ID/g na Cmax de 4 h; enquanto ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 clivado com protease marcado com Lu foi detectado em aproximadamente 16% de ID/g na Cmax de 48 h. As exposições de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease marcado com Ho e ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não-clivável marcado com Tb foram aproximadamente equivalentes (AUC4-168 684 %ID/gxh), enquanto a exposição de ProTIA anti-EpCAM x anti- CD3 clivado com protease marcado com Lu pareceu ser 2 vezes maior com AUC4-168 de 1.458 de %ID/gxh (FIG. 70B). Isso foi um pouco inesperado, mas, no entanto, concebível, considerando que ProTIA tratado com protease não foi metabolizado por proteases associadas a tumores e teve acesso imediato ao alvo tumoral e, dessa forma, uma melhor retenção no ambiente tumoral intraperitoneal, comparado com o ProTIAs não tratados com protease e não-cliváveis.

[400] Os resultados demonstraram que ProTIA não tratado com protease é estável na circulação sistêmica em camundongos doentes com tumor de OVCAR-3; e possui uma meia- vida aumentada 10 vezes, comparado com ProTIA tratado com protease. Na cavidade peritoneal, todos os 3 ProTIAs (ou seja, tratados com protease, não tratados com protease e não-cliváveis) tiveram exposição longa, provavelmente em função da interação com o alvo tumoral. Exemplo 31: Ensaio de caspase 3/7 da composição de ativador imune desencadeado por protease anti-EpCAM x anti- CD3 (ProTIA)

[401] A citotoxicidade celular redirecionada de composições de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease (por exemplo, AC1684, AC1685, AC1686, AC1693, AC1695, AC1714 e AC1715) contra ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não-clivável (por exemplo, AC1484) também foi avaliada por meio de atividades de caspase 3/7 de células apoptóticas. Similar ao ensaio de citotoxicidade de caspase descrito acima, PBMCs foram misturadas com células tumorais-alvo EpCAM-positivas como, por exemplo, HPAF-II (linhagem tumoral de célula pancreática humana), HCT-116 (linhagem tumoral de célula cólon-retal humana) e MDA-MB-231 (linhagem de célula de câncer de negativo triplo- mama humano) em uma proporção de 10 células efetoras para 1 célula-alvo; e todas as variantes de ProTIA foram testadas como concentrações de doses de diluição serial 5x de 8 pontos ou de 12 pontos como no ensaio de caspase descrito acima. As três linhagens de células foram selecionadas para representar células que expressam antígeno de EpCAM em nível alto, médio e baixo com células HPAF-II que expressam 1,1 milhão de antígenos de EpCAM por célula, HCT-116 500.000 por célula e MDA-MB-231

13.000 por célula.

[402] Mediante lise celular, caspase 3/7 liberada em sobrenadantes de cultura foi medida pela quantidade de clivagem de substrato luminogênico de caspase 3/7 por caspase 3/7 para gerar o sinal luminescente do tipo “glow” (Promega Caspase-Glo 3/7 Nº de Catálogo G8091). A quantidade de luminescência é proporcional à quantidade de atividades de caspase.

[403] Quando avaliada em linhagem de célula HPAF-II que expressam EpCAM em nível elevado, a atividade entre as variantes de ProTIA não tratado com protease variou de similar (AC1684, AC1685, AC1693, AC1695, AC1714 e AC1715) até aproximadamente 6 vezes menos ativo (AC1686) (Tabela 13).

[404] Quando avaliada em linhagem de célula HCT-116 com expressão média de EpCAM, a atividade entre as variantes de ProTIA não tratado com protease variou de similar (AC1684, AC1685, AC1693, AC1695, AC1714 e AC1715) até aproximadamente 7 vezes menos ativo (AC1686) (Tabela 13).

[405] Quando avaliada em linhagem de célula MDA-MB-231 com expressão baixa de EpCAM, todos os ProTIAs (não tratados com protease e não-cliváveis) exibiram atividade bem menor do que a que foi observada nas linhagens de células com expressão alta e média de EpCAM. A atividade entre as variantes de ProTIA não tratado com protease variou de similar (AC1685, AC1686, AC1693, AC1695, AC1714 e AC1715) até 4 vezes menos ativo (AC1684) (Tabela 13).

[406] Em concordância com a tendência de atividade do

ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease versus não-clivável perfilada nos exemplos acima, a atividade do ProTIA não-clivável (por exemplo, AC1484) é consistentemente mais pobre, comparado com todos os ProTIAs não tratados com protease (AC1684, AC1685, AC1686, AC1693, AC1695, AC1714 e AC1715) em todas as três linhagens de células com expressão alta, média e baixa de EpCAM testadas (a única exceção sendo AC1684 e AC1484, que possuem atividade equivalente na linhagem de célula MDA-MB-231). A razão de variação da diferença na atividade entre não tratado com protease versus não-clivável na HPAF-II com expressão alta de EpCAM é de aproximadamente 60 vezes, em HCT-116 cerca de 37 vezes e em MDA-MB-231 cerca de 3,6 vezes.

[407] Os resultados demonstraram que a expressão de EpCAM de aproximadamente ≥500.000 por célula-alvo é suficiente para fornecer forte atividade citotóxica, enquanto a expressão de EpCAM de aproximadamente ≤13.000 por célula-alvo induzirá uma atividade citotóxica bem mais pobre. Diferenças na composição do Segmento de liberação de ProTIA como representadas por AC1684, AC1685, AC1686, AC1693, AC1695, AC1714 e AC1715 podem influenciar a atividade citotóxica de ProTIAs para matar uma célula-alvo específica na presença de PBMCs efetoras. Os resultados também demonstraram que ProTIA não-clivável é consistentemente menos ativo do que as variantes de anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease em todas as três linhagens de células com expressão alta, média e baixa de EpCAM avaliadas. Tabela 13: Atividade de citotoxicidade in vitro de variantes de anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease em linhagens de células humanas HPAF-II, HCT-116 e MDA-MB-231

ProTIA EC50 (pM) HPAF-II HCT-116 MDA-MB-231 AC1684 24 32 12200 AC1685 29 27 4340 AC1686 118 240 2680 AC1693 12 21 3480 AC1695 18 53 3750 AC1714 20 52 1740 AC1715 14 20 1190 AC1484 1170 1269 10200 Exemplo 32: Propriedades antitumorais da composição de ativador imune desencadeado por protease anti-EpCAM x anti- CD3 (ProTIA) no modelo ovariano de OVCAR-3 versus padrão de atendimento.

[408] A eficácia in vivo entre variantes de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease, bem como contra bevacizumab, seria avaliada usando a linhagem de células ovarianas humanas OVCAR-3 resistentes à platina implantadas por via intraperitoneal nos camundongos severamente imunodeficiente NOG (NOD/Shi-scid/IL-2Rgnull). Os camundongos NOG são caracterizados pela deficiência de células T, B e NK, bem como pela disfunção de macrófagos, células dendríticas e sistema complemento. No dia 0, nove coortes (Grupos 1-9) de 6 camundongos NOG por grupo seriam implantados por via intraperitoneal com 10  106 células OVCAR-3. Quando é observado que as células tumorais progrediram, como monitorado por um aumento no nível de CA125 humano em relação ao nível de base (abaixo do limite de detecção) até aproximadamente 650 U/ml (aproximadamente dia 21), 10 x 106 PBMCs seriam introduzidas por via intravenosa aos Grupos 1-9. Os tratamentos seriam iniciados no dia da inoculação de PBMCs com o Grupo 1 injetado por via intravenosa com veículo (PBS + Tween 80 0,05%); Grupos 2-8, cada um administrado por via intravenosa com uma das variantes de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease (por exemplo, AC1684, AC1685, AC1686, AC1693, AC1695, AC1714 e AC1715) a 0,5 mg/kg; e Grupo 9 administrado por via intravenosa com 2 mg/kg de bevacizumab. Todos os coortes seriam tratados duas vezes por semana por 4 semanas. Os camundongos serão monitorados diariamente quanto ao comportamento e sobrevida, e duas vezes por semana quanto ao peso corporal e distensão abdominal. Sangue seria coletado no dia 27, dia 34, dia 41, e dia 48 e no sacrifício para determinação de CA125 como um sinal de desenvolvimento do tumor. All camundongos serão sacrificados no dia 55 desfecho do estudo, quando então o volume de ascite será medido e o número total e massa de todos os nódulos tumorais encontrados na cavidade peritoneal contados.

[409] O crescimento do tumor de OVCAR-3 seria evidenciado nitidamente por um aumento nos níveis de CA125 humano circulante. Espera-se que o nível de CA125 no Grupo 1 de veículo aumente significantemente ao longo do tempo. Também se espera que o nível de CA125 no Grupo 9 de bevacizumab aumente ao longo do tempo, mas em um grau menor do que aquele observado no Grupo 1 de veículo. Espera-se que os níveis de CA125 nos Grupos 2-7 diminuam ao longo do tempo em função da eficácia transmitida pelos vários ProTIAs anti- EpCAM x anti-CD3 não tratados com protease (por exemplo, AC1684, AC1685, AC1686, AC1693, AC1695, AC1714 e AC1715). Como essas variantes abrigam segmentos de liberação diferentes, há uma boa probabilidade de que que as diferenças no grau de eficácia (ou seja, magnitude da diminuição de CA125) sejam observadas entre as variantes não tratadas com protease.

[410] Quando monitorados por volume de ascite e volume tumoral total no sacrifício de todos os animais, espera-se que ProTIAs anti-EpCAM x anti-CD3 não tratados com protease administrados por via intravenosa superem os Grupos 1 e 9. Espera-se que os Grupos 1 e 9 abriguem volume de ascite no sacrifício em função do crescimento tumoral. São esperados líquido ascítico e nódulos tumorais mínimos nos Grupos 2 a 8 em função da eficácia transmitida pelos vários ProTIAs anti-EpCAM x anti-CD3 não tratados com protease. Como essas variantes abrigam segmentos de liberação diferentes, há uma boa probabilidade de que as diferenças no grau de eficácia fossem observadas entre as variantes não tratadas com protease. Exemplo 33: Avaliação de toxicidade in vivo de ProTIA vs. equivalente BiTE.

[411] A toxicidade de ProTIA foi avaliada por utilização de moléculas substitutas que se ligam às proteínas EpCAM de camundongo e CD3ε de camundongo. A toxicidade principal atribuída a essa molécula é a síndrome de liberação de citocinas em função da expressão de células EpCAM- positivas nos linfócitos de camundongos. Os artigos de teste foram AC1553X, AC1553A e AC1476A. AC1553X é uma molécula recombinante de 138 kDa que consiste em scFv anti-EpCAM de camundongo fundido a um scFv anti-CD3 de camundongo ligado a uma proteína XTEN de 864 aminoácidos (AE864), descrito com mais detalhes no Exemplo 24. Um sítio de clivagem sensível a proteases associadas a tumores foi modificado geneticamente entre o scFv de aCD3 e o XTEN associado. A inserção do sítio de clivagem por protease único permite a clivagem seletiva de AC1553X por proteases associadas a tumores como, por exemplo, MMP-9, MMP-2 e matriptase, para liberar a porção citotóxica de scFv anti-EpCAM de camundongo e scFv anti-CD3 de camundongo fundidos. AC1553A está configurado em um formato equivalente a uma molécula de BiTE que pode ser gerada por clivagem do AC1553X pelas proteases associadas a tumores, e ele reconhece EpCAM de camundongo e receptores de CD3δ/ε de camundongo. AC1476A é uma molécula biespecífica que reconhece EpCAM humana e receptor de CD3δ/ε humano, e é usado como um controle negativo na avaliação de toxicidade, pois não reconhece a EpCAM de camundongo nem moléculas de CD3 de camundongo.

[412] Camundongos BALB/c normais foram dosados com 500 μg de equivalente BiTE sem ligação de controle (AC1476A), quantidade variável de equivalente BiTE (50, 150 e 500 μg/kg; AC1553A), e quantidades molares compatíveis de ProTIA (120, 360 e 1.200 μg/kg; AC1553X). Sangue foi coletado em 0, 2, 4, 6, 8, 10, 24, e 48 horas pós-dosagem, e os níveis de citocina para IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-a e INF-g foram determinados pelo ensaio Luminex usando kits de análise de citocina Milliplex (Nº de Catálogo MHSTCMAG-70K).

[413] Resultados: Exceto para interferon-gama (IFN-g; FIG. 71E), todas as citocinas para AC1553A estavam significantemente maiores do aquelas de AC1553X na dose correspondente (veja os resultados, FIG. 71). A indução de citocina máxima para IL-2, IL-4, IL-6 e TNF-a para AC1553A foi em aproximadamente 4 h pós-dosagem, e para IL-10 e INF-

g foi em aproximadamente 10 h pós-dosagem. A indução de citocinas para AC1553X em geral foi retardada até aproximadamente 6 – 10 h pós-dosagem, e a magnitude de indução foi bem menor do que aquela de AC1553A. Houve uma indução de citocinas muito pequena ou indetectável pelo tratamento com AC1476A de controle. Os resultados de camundongos tratados com AC1476A de controle estão em círculo claro, com 50 µg/kg de AC1553A estão em linha pontilhada de diamante aberto, com 150 µg/kg de AC1553A estão em linha tracejada de diamante aberto, e com 500 µg/kg de AC1553A estão em linha sólida de diamante aberto. Os resultados de camundongos tratados com 120 µg/kg de AC1553X estão em linha pontilhada de triângulo preto, com 360 µg/kg de AC1553X estão em linha tracejada de triângulo preto, e com 1.200 μg/kg de AC1553X estão em linha sólida de triângulo preto. As concentrações de citocina são mostradas em picograma por ml de soro plotadas contra tempo de coleta de sangue.

[414] Conclusões: A indução de citocina é bem maior para o tratamento com AC1553A do que aquela com AC1553X, indicando uma síndrome de liberação de citocinas (CRS) bem maior em camundongos tratados com AC1553A vs. camundongos tratados com AC1553X. Esse foi particularmente o caso para IL-6 (FIG. 71C), que é um parâmetro clínico relevante e um alvo crucial para o tratamento de CRS. Para IL-6, a maior dose de AC1553A produziu níveis de IL-6 similares àqueles da menor dose de tratamento com AC1553X e, considerando que a diferença de dosagem é de 10 vezes, isso sugere que AC1553X possui um aumento de segurança de 10 vezes para causar CRS em relação àquele de AC1553A. Exemplo 34: Determinação da dose máxima tolerada de

ProTIA em camundongos C57BL/6.

[415] A toxicidade de ProTIA foi avaliada por utilização de uma molécula substituta que se liga às proteínas EpCAM de camundongo e CD3ε de camundongo. A toxicidade principal atribuída a essa molécula é a síndrome de liberação de citocinas em função da expressão de células EpCAM-positivas nos linfócitos de camundongos. Os artigos de teste foram AC1553X e AC1553A, descritos no Exemplo 24. Camundongos C57BL/6 normais foram dosados com uma quantidade variável de AC1553A (50, 150 e 500 μg/kg), e quantidades molares compatíveis de AC1553X (120, 360 e 1.200 μg/kg), e a saúde e o peso corporal dos camundongos foram monitorados por 14 dias pós-dosagem.

[416] Todos os camundongos que foram tratados com a dose alta de AC1553A (500 μg/kg) morreram por volta do terceiro dia pós-tratamento (5 de 5 camundongos), e camundongos tratados com a dose média de AC1553A (150 μg/kg) resultaram em morte de 3 dos 5 camundongos durante o estudo (FIG. 72). A dose baixa de AC1553A não resultou na morte de nenhum camundongo. Isso está em contraste com o tratamento com AC1553X, no qual todos os camundongos estavam vivos após uma quantidade molar compatível equivalente de AC1553A. A FIG. 72 retrata uma curva de Kaplan-Meier do tratamento com AC1553X e AC1553A de camundongos C57BL/6. Cinco camundongos por grupo foram tratados com 120 μg/kg de AC1553X (linha pontilhada de triângulo preto), 360 μg/kg de AC1553X (linha tracejada de triângulo preto) e 1.200 μg/kg de AC1553X (linha sólida de triângulo preto), e quantidades molares compatíveis de AC1553A. Cinqüenta μg/kg de AC1553A mostrado em uma linha pontilhada de diamante aberto, 150 μg/kg de

AC1553A mostrado em uma linha tracejada de diamante aberto, e 500 μg/kg de AC1553A em uma linha sólida de diamante aberto (a percentagem de camundongos sobreviventes foi plotada contra vários pontos do tempo).

[417] Resultados: Os camundongos que foram tratados com dose alta de AC1553A (500 μg/kg) exibiram uma perda de peso corporal maior do que 10% após 2 dias de tratamento, e todos os camundongos morreram dentro de 3 dias (FIG. 73A). Os camundongos que foram tratados com dose média de AC1553A (150 μg/kg) exibiram 10 – 20% de perda de peso corporal dentro de 2-4 dias pós-dosagem, e 3 camundongos morreram, enquanto o peso corporal dos dois camundongos restantes se recuperou aos níveis do peso corporal pré-dosagem (FIG. 73B). Os camundongos tratados com dose baixa de AC1553A (50 μg/kg) exibiram uma perda de peso temporária dentro de 10% em 2 dias após tratamento, e todos os pesos corporais dos camundongos se recuperaram até níveis iguais ou acima dos níveis pré-dosagem (FIG 73C). Para AC1553X, os camundongos em dose alta (1.200 μg/kg) exibiram perda de peso corporal maior do que 10% após 2 -3 dias pós-dosagem, mas todos os pesos corporais se recuperaram até os níveis normais (FIG. 73F). Para a dosagem média e baixa de AC1553X, a perda de peso corporal é insignificante (FIG. 73D, E). A alteração percentual do peso é plotada contra o tempo pós-dosagem de fármaco. O peso percentual é calculado tomando-se o peso dos camundongos nos tempos pós-dosagem de fármaco dividido pelo peso original pré-dosagem de fármaco e multiplicando por 100 [(peso pós-dose de fármaco /peso pré-dose de fármaco) x 100]. Cinco camundongos por grupo foram tratados com 120 μg/kg de AC1553X (linhas pontilhadas de triângulo preto), 360 μg/kg de AC1553X (linhas tracejadas de triângulo preto), 1.200 μg/kg de AC1553X (triângulo preto linhas sólidas), e quantidades molares compatíveis de AC1553A. Cinqüenta μg/kg de AC1553A mostrados em linhas pontilhadas de diamante aberto, 150 μg/kg de AC1553A mostrados em linhas tracejadas de diamante aberto, e 500 μg/kg de AC1553A em linhas sólidas de diamante aberto. Cada linha representa alterações de peso de um camundongo.

[418] Conclusões: O fato de que 3 de 5 camundongos terem morrido quando tratados com dose média de AC1553A e todos os camundongos (5 de 5) terem morrido com dose alta sugere que a dose máxima tolerável de AC1553A em camundongos é entre 50 a 150 μg/kg. Na medida em que todos os camundongos tratados com AC1553X em várias quantidades de fármaco estão vivos, os resultados sugerem que a dose máxima tolerável para AC1553X em camundongos é maior do que 1.200 μg/kg. Exemplo 35: Afinidade de ligação da composição de ativador imune desencadeado por protease anti-EpCAM x anti- CD3 (ProTIA).

[419] A afinidade de ligação de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 (por exemplo, AC1476) à EpCAM humana e ao CD3 humano foi medida por dois métodos: 1) usando ressonância de plásmon de superfície com antígenos de EpCAM e CD3 recombinantes e 2) usando citometria de fluxo com células que expressam EpCAM e CD3. Observe que AC1516 é a versão códon-otimizada de AC1476 e eles compartilham a mesma seqüência de aminoácidos.

[420] Experimentos de ligação por ressonância de plásmon de superfície (SPR) foram realizados em um Biacore

3000. Para avaliar a ligação de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 à EpCAM humana, Fc-tagged EpCAM (R&D Systems, Nº de Catálogo

960-EP-050) foi capturado em um chip de dextrana carbóxi- metilada usando 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) e N-hidroxisuccinimida (NHS). A seguir, a ligação de cada uma das três moléculas de ProTIA [anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado (por exemplo, AC1516), tratado com protease (por exemplo, tratado com MMP-9 AC1516) e não-clivável (por exemplo, AC1484)] ao chip de EpCAM foi realizada em concentrações de diferença de 5-6 para análise cinética total e determinação da Kd. A Kd para a ligação à EpCAM humana foi determinada como sendo de 11,4 nM para ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado, 1,15 nM para ProTIA tratado com protease e 10,0 nM para ProTIA não-clivável.

[421] Para avaliar a ligação de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 ao CD3 humano, His-tagged CD3εδ (Creative Biomart, Nº de Catálogo CD3E&CD3D-219H) foi capturado em um chip de dextrana carbóxi-metilada usando EDC e NHS. A seguir, a ligação de cada uma das três moléculas de ProTIA [anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado (por exemplo, AC1516), tratado com protease (por exemplo, tratado com MMP-9 AC1516) e não- clivável (por exemplo, AC1484)] ao CD3 chip foi realizada em concentrações de diferença de 5-6 para análise cinética total e determinação da Kd. A Kd para ligação ao CD3 humano foi determinada como sendo de 15,3 nM para ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado, 2,22 nM para ProTIA tratado com protease e 27,8 nM para ProTIA não-clivável.

[422] As constantes de ligação para ligação de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 às células que expressam EpCAM e que expressam CD3 foram determinadas por ligação por competição com um ProTIA tratado com protease marcado de forma fluorescente. O ProTIA tratado com protease marcado de forma fluorescente foi feito por conjugação de Alexa Flúor 647 C2 maleimida (Thermo Fisher, Nº de Catálogo A20347) a um mutante de ProTIA tratado com protease contendo cisteína (tratado com MMP-9 AC1531). Os experimentos de ligação foram realizados em 10.000 células a 4°C por 1 hora em um volume total de 100 µl de tampão de ligação (albumina sérica bovina 1% em solução salina tamponada com fosfato). As células foram lavadas uma vez com tampão de ligação gelado, e depois ressuspensas em formaldeído 2% em solução salina tamponada com fosfato e imediatamente analisadas em um citômetro de fluxo Guava EasyCyte de Millipore. A ligação do ProTIA tratado com protease marcado de forma fluorescente revelou uma Kd aparente de 0,85 nM às células CHO transfectadas estavelmente com EpCAM humana (EpCAM-CHO) e 2,6 nM às células Jurkat CD3+. A ligação por competição do ProTIA tratado com protease marcado de forma fluorescente às células EpCAM-CHO resultou em constantes de ligação aparente de 2,9 nM para ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado (por exemplo, AC1476) e 0,29 nM para ProTIA tratado com protease (por exemplo, AC1476 tratado com MMP-9). A ligação por competição do ProTIA tratado com protease marcado de forma fluorescente às células Jurkat CD3+ resultou em constantes de ligação aparente de 31 nM para ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado (por exemplo, AC1476) e 1,1 nM para ProTIA tratado com protease (por exemplo, AC1476 tratado com MMP-9).

[423] A afinidade de ligação à EpCAM para o ProTIA tratado com protease foi cerca de 10 vezes mais forte do que ProTIA não tratado e não-clivável tanto por SPR quanto por citometria de fluxo. A afinidade de ligação ao CD3 para o ProTIA tratado com protease foi mais forte do que para o

ProTIA não tratado e não-clivável: cerca de 10 vezes por SPR e cerca de 30 vezes por citometria de fluxo. Esses dados dão suporte à conclusão de que XTEN reduz a afinidade de ligação da forma de pró-fármaco de ProTIA não tratado, intacto, comparado com o ProTIA tratado com protease ativado. A redução na afinidade de ligação tanto para EpCAM quanto para CD3 faz com que o ProTIA não tratado tenha menos probabilidade de se ligar aos seus alvos na circulação ou tecidos saudáveis. Exemplo 36: Ensaios de marcador de ativação de célula T da composição de ativador imune desencadeado por protease anti-EpCAM x anti-CD3 (ProTIA).

[424] Para medir os marcadores de ativação induzida por ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 (CD69 e CD25), 1 x 105 PBMCs ou células CD3+ purificadas seriam cocultivadas em RPMI-1640 contendo FCS 10% com 2 x 104 células SK-OV-3 ou OVCAR3 por poço de ensaio (ou seja, proporção de célula-efetora para célula-alvo de 5:1) na presença de ProTIA anti-EpCAM x anti- CD3 (por exemplo, AC1695) em uma placa de 96 poços de fundo redondo com volume total final de 200 µl. Após incubação por 20 h em uma incubadora umidificada com CO2 5% a 37°C, as células seriam coradas com anti-CD4 conjugado a PECy5, anti- CD8 conjugado a APC, anti-CD25 conjugado à PE e anti-CD69 conjugado à FITC (todos anticorpos de BioLegend) em tampão de FACS (BSA 1%/PBS) a 4°C, lavadas duas vezes com tampão de FACS, e depois ressuspensas em tampão de FACS para aquisição em um citômetro de fluxo Guava EasyCyte (Millipore).

[425] Espera-se que a expressão de marcador de ativação de célula T tenha uma tendência similar para as três moléculas de ProTIA [não tratado (por exemplo, AC1695),

tratado com protease (por exemplo, tratado com MMP-9 AC1695), e não-clivável (por exemplo, AC1484) anti-EpCAM x anti-CD3], como foi observado pelo ensaio de citotoxicidade de caspase 3/7. Com o uso de células SK-OV-3, espera-se que a ativação de CD69 em populações CD8 e CD4 de PBMCs por ProTIA anti- EpCAM x anti-CD3 não tratado (por exemplo, AC1695) seja aproximadamente 50-100 vezes menos ativa do que ProTIA tratado com protease (por exemplo, tratado com MMP-9 AC1695); e espera-se que o ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não-clivável (por exemplo, AC1484) seja aproximadamente 1.000 vezes menos ativo do que o ProTIA clivado com protease (por exemplo, tratado com MMP-9 AC1695). Exemplo 37: Ensaios de liberação de citocina da composição de ativador imune desencadeado por protease anti- EpCAM x anti-CD3 (ProTIA).

[426] Para medir a expressão de citocinas induzida por ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3, 1 x 105 células CD3+ purificadas seriam cocultivadas com 2 x 104 células SK-OV-3 por poço de ensaio (ou seja, proporção de célula-efetora para célula-alvo de 5:1) na presença de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 (por exemplo, AC1695) em uma placa de 96 poços de fundo redondo com volume total final de 200 µl. Após incubação por 20 h em uma incubadora umidificada com CO2 5% a 37°C, o sobrenadante celular seria colhido para medições de citocina. Esse ensaio também pode ser realizado com outras células-alvo selecionadas de linhagens de células HCT-116, Kato III, MDA-MB-453, MCF-7, MKN45, MT3, NCI-N87, SK-Br-3, SW480, OVCAR3 e PC3, bem como PBMCs no lugar de células CD3+ purificadas.

[427] A análise de citocina de interleucina (IL)-2,

IL-4, IL-6, IL-10, fator de necrose tumoral (TNF)-alfa e interferon (IFN)-gama secretadas no sobrenadante da cultura de células seria quantificada usando o kit “Human Th1/Th2 Cytokine Cytometric Bead Array” (CBA) (BD Biosciences Nº de Catálogo 550749) seguindo as instruções do fabricante. Na ausência de ProTIA, nenhuma secreção de citocina acima do nível de fundo é esperada pelas células CD3+ purificadas. Espera-se que ProTIA na presença de células-alvo EpCAM- positivas e células CD3+ purificadas ative células T e secrete um padrão de citocinas de célula T com uma proporção elevada de citocinas Th1 como, por exemplo, IFN-gama e TNF- alfa.

[428] Espera-se que anti-EpCAM x anti-CD3 ProTIA induza secreção robusta de todas as citocinas (IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-alfa, IFN-gama) que seriam avaliadas (veja as FIGS. 50-52). Espera-se que a estimulação de células CD3+ purificadas com células SK-OV-3 e ProTIA anti-EpCAM x anti- CD3 tratado com protease (por exemplo, tratado com MMP-9 AC1695) desencadeie a expressão significante de citocinas, especialmente em concentrações maiores do que 20 pM para todas as citocinas que seriam testadas. Em contraste, são esperados níveis basais de IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-alfa e IFN-gama quando a molécula de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não clivado intacto (por exemplo, AC1695) é usada em uma concentração de até cerca de 100 pM. Adicionalmente, são esperados níveis basais de todas as citocinas que seriam testadas para a molécula de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não-clivável (por exemplo, AC1484) em concentrações de até cerca de 1 nM. Exemplo 38: Afinidade de ligação da composição de ativador imune desencadeado por protease anti-EpCAM x anti- CD3 (ProTIA).

[429] A afinidade de ligação de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 (por exemplo, AC1695) à EpCAM humana e CD3 humano seria medida usando citometria de fluxo com células que expressam EpCAM e CD3.

[430] As constantes de ligação para ligação de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 às células que expressam EpCAM e que expressam CD3 seriam medidas por ligação por competição com um ProTIA tratado com protease marcado de forma fluorescente. O ProTIA tratado com protease marcado de forma fluorescente foi feito por conjugação de Alexa Flúor 647 C2 maleimida (Thermo Fisher, Nº de Catálogo A20347) a um mutante de ProTIA tratado com protease contendo cisteína (tratado com MMP-9 AC1531). Os experimentos de ligação seriam realizados em

10.000 células a 4°C por 1 hora em um volume total de 100 µl de tampão de ligação (albumina sérica bovina 1% em solução salina tamponada com fosfato). As células seriam lavadas uma vez com tampão de ligação gelado, e depois ressuspensas em formaldeído 2% em solução salina tamponada com fosfato e imediatamente analisadas em um citômetro de fluxo Guava EasyCyte de Millipore. Seria esperado que a ligação do ProTIA tratado com protease marcado de forma fluorescente tivesse um valor de Kd aparente de aproximadamente 1 nM às células CHO transfectadas estavelmente com EpCAM humana (EpCAM-CHO) e aproximadamente 3 nM às células Jurkat CD3+. Espera-se que a ligação por competição do ProTIA tratado com protease marcado de forma fluorescente às células EpCAM-CHO resulte em constantes de ligação aparente de um dígito nM para ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado (por exemplo, AC1695) e subnanomolar para ProTIA tratado com protease (por exemplo, tratado com MMP-9 AC1695). Espera-se que a ligação por competição do ProTIA tratado com protease marcado de forma fluorescente às células Jurkat CD3+ resulte em constantes de ligação aparente de dois dígitos nM para ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado (por exemplo, AC1695) e nM de aproximadamente um dígito para ProTIA tratado com protease (por exemplo, tratado com MMP-9 AC1695). Tabela 14: Seqüências de aminoácidos de construções de ProTIA. ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

HHHHHHHHDIQLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPG QPPKLLIYDASNLVSGIPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTED PWTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKAS GYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKATLTADESSST AYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTTVTVSSGGGGSDI KLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSR GYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDY WGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCR

ASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSM AC1277 CD19 EAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKGTAEAASASGLSGRSDNHSPLGLA

GSPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGT STEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATS GSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAP GSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTE PSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGS APGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSE PATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSE GSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEG TSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPAT

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

SGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTE EGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSE SATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPE SGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGT SESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESAT PESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETP GSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSES ATPESGPGTSTEPSEGSAPG HHHHHHHHELVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQK PGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDY SYPLTFGAGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLEQSGAELVRPGTSVKISC KASGYAFTNYWLGWVKQRPGHGLEWIGDIFPGSGNIHYNEKFKGKATLTADKS SSTAYMQLSSLTFEDSAVYFCARLRNWDEPMDYWGQGTTVTVSSGGGGSDVQL VQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGQGLEWIGYINPSRGY TNYADSVKGRFTITTDKSTSTAYMELSSLRSEDTATYYCARYYDDHYCLDYWG QGTTVTVSSGEGTSTGSGGSGGSGGADDIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRAS QSVSYMNWYQQKPGKAPKRWIYDTSKVASGVPARFSGSGSGTDYSLTINSLEA

EDAATYYCQQWSSNPLTFGGGTKVEIKGTAEAASASGLSGRSDNHSPLGLAGS AC1278 EpCAM

PGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTST EPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGS ETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGS PAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPS EGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAP GTSESATPESGPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPA TSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGS APGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTS TEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSG SETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEG

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

SPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESA TPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESG PGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSE SATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPE SGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGS PAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESAT PESGPGTSTEPSEGSAPG HHHHHHHHEVQLLEQSGAELVRPGTSVKISCKASGYAFTNYWLGWVKQRPGHG LEWIGDIFPGSGNIHYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTFEDSAVYFCA RLRNWDEPMDYWGQGTTVTVSSGGGGSDVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASG YTFTRYTMHWVRQAPGQGLEWIGYINPSRGYTNYADSVKGRFTITTDKSTSTA YMELSSLRSEDTATYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTVTVSSGEGTSTGSGGSGG SGGADDIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSYMNWYQQKPGKAPKRWIY DTSKVASGVPARFSGSGSGTDYSLTINSLEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGGGT KVEIKGGGGSELVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQ QKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQN

DYSYPLTFGAGTKLEIKGTAEAASASGLSGRSDNHSPLGLAGSPGSPAGSPTS AC1345 EpCAM TEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGT

STEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSP TSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEE GTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSES ATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPES GPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTS ESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSE GSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPG TSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESA TPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTE EGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEP

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

ATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG SAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGS PAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESAT PESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEE GTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTE PSEGSAPG HHHHHHHHDVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGQGL EWIGYINPSRGYTNYADSVKGRFTITTDKSTSTAYMELSSLRSEDTATYYCAR YYDDHYCLDYWGQGTTVTVSSGGSELVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSL LNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTIS SVQAEDLAVYYCQNDYSYPLTFGAGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLEQ SGAELVRPGTSVKISCKASGYAFTNYWLGWVKQRPGHGLEWIGDIFPGSGNIH YNEKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTFEDSAVYFCARLRNWDEPMDYWGQG TTVTVSSGGGSDIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSYMNWYQQKPGKA PKRWIYDTSKVASGVPARFSGSGSGTDYSLTINSLEAEDAATYYCQQWSSNPL TFGGGTKVEIKGTAEAASASGLSGRSDNHSPLGLAGSPGSPAGSPTSTEEGTS

ESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSE AC1346 EpCAM

GSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEG TSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEP SEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESG PGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSE SATPESGPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPE SGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGT STEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESAT PESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGP GTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAG SPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSE TPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSP

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

AGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPT STEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPG TSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEP SEGSAPGTSTEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSA PG HHHHHHHHELVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQK PGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDY SYPLTFGAGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLEQSGAELVRPGTSVKISC KASGYAFTNYWLGWVKQRPGHGLEWIGDIFPGSGNIHYNEKFKGKATLTADKS SSTAYMQLSSLTFEDSAVYFCARLRNWDEPMDYWGQGTTVTVSSGGGGSDVQL VQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGQGLEWIGYINPSRGY TNYADSVKGRFTITTDKSTSTAYMELSSLRSEDTATYYCARYYDDHYCLDYWG QGTTVTVSSGEGTSTGSGGSGGSGGADDIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRAS QSVSYMNWYQQKPGKAPKRWIYDTSKVASGVPARFSGSGSGTDYSLTINSLEA EDAATYYCQQWSSNPLTFGGGTKVEIKGSPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESG

PGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSE AC1357 EpCAM SATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPE

SGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGT STEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATS GSETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGP GSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTE PSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGS APGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSE PATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSE GSAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEG TSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESA TPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTE EGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPA

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

GSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPE SGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGT STEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPG HHHHHHHHELVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQK PGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDY SYPLTFGAGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLEQSGAELVRPGTSVKISC KASGYAFTNYWLGWVKQRPGHGLEWIGDIFPGSGNIHYNEKFKGKATLTADKS SSTAYMQLSSLTFEDSAVYFCARLRNWDEPMDYWGQGTTVTVSSGGGGSDIQM TQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESG VPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKRTS GPGDGGKGGPGKGPGGEGTKGTGPGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGY SFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAY LQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSGTAEAASASGL SGRSDNHSPLGLAGSPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPG

SPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPAT AC1358 EpCAM SGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSA

PGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSE SATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSEG SAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGT SESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPS EGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAP GSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSES ATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPES GPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTS TEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSG SETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPG SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEP SEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSET

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

PGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSEP ATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPG HHHHHHHHELVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQK PGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDY SYPLTFGAGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLEQSGAELVRPGTSVKISC KASGYAFTNYWLGWVKQRPGHGLEWIGDIFPGSGNIHYNEKFKGKATLTADKS SSTAYMQLSSLTFEDSAVYFCARLRNWDEPMDYWGQGTTVTVSSGGGGSEVQL VESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGV STYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFD VWGQGTLVTVSSRTSGPGDGGKGGPGKGPGGEGTKGTGPGGDIQMTQSPSSLS ASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGS GSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKGTAEAASASGL SGRSDNHSPLGLAGSPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPG SPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPAT

SGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSA AC1359 EpCAM

PGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSE SATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSEG SAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGT SESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPS EGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAP GSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSES ATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPES GPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTS TEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSG SETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPG SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEP SEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSET PGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSEP

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

ATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPG HHHHHHHHGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGS ETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGS EPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPS EGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETP GSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSEPA TSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGLSGRSDNHSPLGLAGSGTAEA ASASGELVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQ PPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYP LTFGAGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLEQSGAELVRPGTSVKISCKAS GYAFTNYWLGWVKQRPGHGLEWIGDIFPGSGNIHYNEKFKGKATLTADKSSST AYMQLSSLTFEDSAVYFCARLRNWDEPMDYWGQGTTVTVSSGGGGSDVQLVQS GAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGQGLEWIGYINPSRGYTNY

ADSVKGRFTITTDKSTSTAYMELSSLRSEDTATYYCARYYDDHYCLDYWGQGT AC1409 EpCAM TVTVSSGEGTSTGSGGSGGSGGADDIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSV

SYMNWYQQKPGKAPKRWIYDTSKVASGVPARFSGSGSGTDYSLTINSLEAEDA ATYYCQQWSSNPLTFGGGTKVEIKGTAEAASASGLSGRSDNHSPLGLAGSPGS PAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPS EGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETP GSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAG SPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGS APGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTS ESATPESGPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSG SETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPG TSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEP SEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSET PGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPA GSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPG

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

GSPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGT STEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATS GSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAP GSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTE PSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGS APGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSE PATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSE GSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEG TSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPAT SGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTE EGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSE SATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPE

SGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGT AC1410 EpCAM SESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESAT

PESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETP GSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSES ATPESGPGTSTEPSEGSAPGLSGRSDNHSPLGLAGSGTAEAASASGELVMTQS PSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTR ESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPLTFGAGTKLEIK GGGGSGGGGSGGGGSEVQLLEQSGAELVRPGTSVKISCKASGYAFTNYWLGWV KQRPGHGLEWIGDIFPGSGNIHYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTFED SAVYFCARLRNWDEPMDYWGQGTTVTVSSGGGGSDVQLVQSGAEVKKPGASVK VSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGQGLEWIGYINPSRGYTNYADSVKGRFTITT DKSTSTAYMELSSLRSEDTATYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTVTVSSGEGTST GSGGSGGSGGADDIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSYMNWYQQKPGK APKRWIYDTSKVASGVPARFSGSGSGTDYSLTINSLEAEDAATYYCQQWSSNP

LTFGGGTKVEIKHHHHHHHH AC1411 EpCAM HHHHHHHHELVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQK

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

PGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDY SYPLTFGAGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLEQSGAELVRPGTSVKISC KASGYAFTNYWLGWVKQRPGHGLEWIGDIFPGSGNIHYNEKFKGKATLTADKS SSTAYMQLSSLTFEDSAVYFCARLRNWDEPMDYWGQGTTVTVSSGGGGSDIVL TQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSYMNWYQQKPGKAPKRWIYDTSKVASGV PARFSGSGSGTDYSLTINSLEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGGGTKVEIKGEGT STGSGGSGGSGGADDVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYTMHWVRQ APGQGLEWIGYINPSRGYTNYADSVKGRFTITTDKSTSTAYMELSSLRSEDTA TYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTVTVSSGTAEAASASGLSGRSDNHSPLGLAGS PGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTST EPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGS ETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGS PAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPS EGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAP GTSESATPESGPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPA TSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGS APGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTS TEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSG SETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEG SPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESA TPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESG PGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSE SATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPE SGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGS PAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESAT PESGPGTSTEPSEGSAPG

HHHHHHHHEVQLLEQSGAELVRPGTSVKISCKASGYAFTNYWLGWVKQRPGHG AC1412 EpCAM

LEWIGDIFPGSGNIHYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTFEDSAVYFCA

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

RLRNWDEPMDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSELVMTQSPSSLTVTAG EKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFT GSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPLTFGAGTKLEIKGGGGSDVQL VQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGQGLEWIGYINPSRGY TNYADSVKGRFTITTDKSTSTAYMELSSLRSEDTATYYCARYYDDHYCLDYWG QGTTVTVSSGEGTSTGSGGSGGSGGADDIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRAS QSVSYMNWYQQKPGKAPKRWIYDTSKVASGVPARFSGSGSGTDYSLTINSLEA EDAATYYCQQWSSNPLTFGGGTKVEIKGTAEAASASGLSGRSDNHSPLGLAGS PGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTST EPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGS ETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGS PAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPS EGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAP GTSESATPESGPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPA TSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGS APGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTS TEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSG SETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEG SPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESA TPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESG PGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSE SATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPE SGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGS PAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESAT PESGPGTSTEPSEGSAPG

HHHHHHHHDVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGQGL AC1413 EpCAM EWIGYINPSRGYTNYADSVKGRFTITTDKSTSTAYMELSSLRSEDTATYYCAR

YYDDHYCLDYWGQGTTVTVSSGEGTSTGSGGSGGSGGADDIVLTQSPATLSLS

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

PGERATLSCRASQSVSYMNWYQQKPGKAPKRWIYDTSKVASGVPARFSGSGSG TDYSLTINSLEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGGGTKVEIKGGGGSELVMTQSPS SLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRES GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPLTFGAGTKLEIKGG GGSGGGGSGGGGSEVQLLEQSGAELVRPGTSVKISCKASGYAFTNYWLGWVKQ RPGHGLEWIGDIFPGSGNIHYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTFEDSA VYFCARLRNWDEPMDYWGQGTTVTVSSGTAEAASASGLSGRSDNHSPLGLAGS PGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTST EPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGS ETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGS PAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPS EGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAP GTSESATPESGPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPA TSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGS APGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTS TEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSG SETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEG SPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESA TPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESG PGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSE SATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPE SGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGS PAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESAT PESGPGTSTEPSEGSAPG HHHHHHHHDIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSYMNWYQQKPGKAPKR

WIYDTSKVASGVPARFSGSGSGTDYSLTINSLEAEDAATYYCQQWSSNPLTFG AC1414 EpCAM

GGTKVEIKGEGTSTGSGGSGGSGGADDVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGY TFTRYTMHWVRQAPGQGLEWIGYINPSRGYTNYADSVKGRFTITTDKSTSTAY

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

MELSSLRSEDTATYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTVTVSSGGGGSELVMTQSPS SLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRES GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPLTFGAGTKLEIKGG GGSGGGGSGGGGSEVQLLEQSGAELVRPGTSVKISCKASGYAFTNYWLGWVKQ RPGHGLEWIGDIFPGSGNIHYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTFEDSA VYFCARLRNWDEPMDYWGQGTTVTVSSGTAEAASASGLSGRSDNHSPLGLAGS PGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTST EPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGS ETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGS PAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPS EGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAP GTSESATPESGPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPA TSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGS APGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTS TEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSG SETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEG SPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESA TPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESG PGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSE SATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPE SGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGS PAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESAT PESGPGTSTEPSEGSAPG DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSTKSLLHSNGITYLYWYQQKPGKAPKLLI

YQMSNLASGVPSRFSSSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQNLEIPRTFGQG AC1476 EpCAM TKVEIKGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGQVQLVQSGPGLVQPGGS

VRISCAASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLEWMGWINTYTGESTYADSFKGRFTF SLDTSASAAYLQINSLRAEDTAVYYCARFAIKGDYWGQGTLLTVSSGGGGSDI

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

QMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLE SGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKG ATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA SGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKN TAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSGTAEAASA SGLSGRSDNHSPLGLAGSPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGS APGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSE PATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSE GSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPG TSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEP SEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTE EGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTST EPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEG SAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGT SESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESAT PESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGP GTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPA TSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPES GPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTS TEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSG SETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPG SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGHHHHHH DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSTKSLLHSNGITYLYWYQQKPGKAPKLLI YQMSNLASGVPSRFSSSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQNLEIPRTFGQG

TKVEIKGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGQVQLVQSGPGLVQPGGS AC1484 EpCAM

VRISCAASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLEWMGWINTYTGESTYADSFKGRFTF SLDTSASAAYLQINSLRAEDTAVYYCARFAIKGDYWGQGTLLTVSSGGGGSDI QMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLE

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

SGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKG ATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA SGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKN TAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSGSPGSPAG SPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGS APGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSP AGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPT STEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPG TSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESA TPESGPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSET PGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTST EPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEG SAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGT SESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSP TSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGP GSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTE PSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPES GPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTS ESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPT STEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPG TSTEPSEGSAPGHHHHHH DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKNLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLI YQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLEIPRTFGQG

TKVEIKGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGQVQLVQSGPEVKKPGAS AC1489 EpCAM VKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTYTGEPTYGEDFKGRFAF

SLDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFCARFGNYVDYWGQGSLVTVSSGGGGSEL VVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNK RAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTV

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

LGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLLESGGGLVQPGGSLKLSC AASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRD DSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGTA EAASASGLSGRSDNHSPLGLAGSPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTE PSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPES GPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTS TEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSE GSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPG TSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSPAGS PTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSA PGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTST EPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGS ETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGT SESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESAT PESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGP GSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSES ATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTST EEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSE PATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSE GSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGHHHHHH DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKNLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLI YQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLEIPRTFGQG TKVEIKGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGQVQLVQSGPEVKKPGAS

VKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTYTGEPTYGEDFKGRFAF AC1490 EpCAM

SLDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFCARFGNYVDYWGQGSLVTVSSGGGGSEL VVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNK RAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTV LGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLLESGGGLVQPGGSLKLSC

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

AASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRD DSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGSP GSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTE PSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSE TPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSP AGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSE GSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPG TSESATPESGPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPAT SGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSA PGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTST EPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGS ETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGS PAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESAT PESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGP GTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSES ATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPES GPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSP AGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATP ESGPGTSTEPSEGSAPGHHHHHH HHHHHHGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTST EEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSE PATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSE

GSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPG AC1507 EpCAM TSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSAPGTSTEP

SEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESG PGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTST EPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTS TEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGS

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

EPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSPAGSP TSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAP GTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSES ATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSE TPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTS ESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSG SETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSEPATSGSETPG TSESATPESGPGTSTEPSEGSAPLSGRSDNHSPLGLAGSGTAEAASASGDIQM TQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESG VPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKGAT PPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG YSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTA YLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSGGGGSDIQMT QSPSSLSASVGDRVTITCRSTKSLLHSNGITYLYWYQQKPGKAPKLLIYQMSN LASGVPSRFSSSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQNLEIPRTFGQGTKVEI KGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGQVQLVQSGPGLVQPGGSVRISC AASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLEWMGWINTYTGESTYADSFKGRFTFSLDTS ASAAYLQINSLRAEDTAVYYCARFAIKGDYWGQGTLLTVSS HHHHHHGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTST EEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSE PATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSE GSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPG

TSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSAPGTSTEP AC1510 EpCAM

SEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESG PGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTST EPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTS TEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGS EPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSPAGSP

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

TSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAP GTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSES ATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSE TPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTS ESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSG SETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSEPATSGSETPG TSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQ DIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQP EDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKGATPPETGAETESPGETTGGSAESEP PGEGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVA LINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYY GDSDWYFDVWGQGTLVTVSSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSTKS LLHSNGITYLYWYQQKPGKAPKLLIYQMSNLASGVPSRFSSSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCAQNLEIPRTFGQGTKVEIKGATPPETGAETESPGETTGGSA ESEPPGEGQVQLVQSGPGLVQPGGSVRISCAASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGL EWMGWINTYTGESTYADSFKGRFTFSLDTSASAAYLQINSLRAEDTAVYYCAR FAIKGDYWGQGTLLTVSS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASF LYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEI KGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC AASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTS

KNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSDIQ AC1501 HER2 MTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLES

GVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKGA TPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNT AYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSGTAEAASAS GLSGRSDNHSPLGLAGSPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSA

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

PGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEP ATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEG SAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGT SESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPS EGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEE GTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTE PSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGS APGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTS ESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATP ESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPG TSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPAT SGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESG PGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTST EPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGS ETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGS EPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGHHHHHH DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASF LYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEI KGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC AASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTS KNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSDIQ

MTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLES AC1502 HER2

GVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKGA TPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNT AYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSGSPGSPAGS PTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSA PGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPA

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

GSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTS TEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGT SESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESAT PESGPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETP GTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTE PSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGS APGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTS ESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPT STEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPG SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEP SEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESG PGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSE SATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTS TEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGT STEPSEGSAPGHHHHHH DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASF LYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEI KGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC AASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTS KNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSELV

VTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKR AC1503 HER2 APGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL

GATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLLESGGGLVQPGGSLKLSCA ASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDD SKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGTAE AASASGLSGRSDNHSPLGLAGSPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEP SEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESG PGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTST

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

EPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEG SAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGT STEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSPAGSP TSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAP GTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTE PSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSE TPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTS ESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATP ESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPG SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESA TPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTE EGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEP ATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEG SAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGHHHHHH DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASF LYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEI KGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC AASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTS KNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSELV VTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKR

APGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL AC1504 HER2

GATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLLESGGGLVQPGGSLKLSCA ASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDD SKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGSPG SPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEP SEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSET PGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPA GSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEG

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

SAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGT SESATPESGPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATS GSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAP GTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTE PSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSE TPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSP AGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATP ESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPG TSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESA TPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESG PGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPA GSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPE SGPGTSTEPSEGSAPGHHHHHH DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASY RYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEI KGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC AASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRS KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSDIQM TQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESG

VPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKGAT AC1505 HER2 PPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG

YSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTA YLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSGTAEAASASG LSGRSDNHSPLGLAGSPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAP GSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPA TSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGS APGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTS ESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSE

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

GSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEG TSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEP SEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSA PGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSE SATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPE SGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGT STEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATS GSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGP GSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTE PSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSE TPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSE PATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGHHHHHH DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASY RYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEI KGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC AASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRS KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSDIQM TQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESG VPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKGAT

PPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG AC1506 HER2

YSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTA YLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSGSPGSPAGSP TSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAP GTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAG SPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTST EEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTS ESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATP ESGPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPG

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

TSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEP SEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSA PGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSE SATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTS TEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGS EPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPS EGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGP GSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSES ATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTST EEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTS TEPSEGSAPGHHHHHH DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASY RYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEI KGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC AASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRS KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSELVV TQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRA PGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLG

ATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLLESGGGLVQPGGSLKLSCAA AC1518 HER2 SGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDS

KNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGTAEA ASASGLSGRSDNHSPLGLAGSPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPS EGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGP GSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTE PSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGS APGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTS TEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSPAGSPT STEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPG

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

TSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEP SEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSET PGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSE SATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPE SGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGS EPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESAT PESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEE GTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPA TSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGS APGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGHHHHHH DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASY RYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEI KGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC AASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRS KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSELVV TQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRA PGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLG ATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLLESGGGLVQPGGSLKLSCAA

SGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDS AC1519 HER2

KNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGSPGS PAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPS EGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETP GSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAG SPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGS APGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTS ESATPESGPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSG SETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPG TSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEP

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

SEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSET PGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPA GSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPE SGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGT STEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESAT PESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGP GTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAG SPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPES GPGTSTEPSEGSAPGHHHHHH DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVGTSVAWYQQKPGKAPKLLIYWTST RHTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYSLYRSFGQGTKVEIK GATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCS ASGFDFTTYWMSWVRQAPGKGLEWIGEIHPDSSTINYAPSLKDRFTISRDNAK NTLFLQMDSLRPEDTGVYFCASLYFGFPWFAYWGQGTPVTVSSGGGGSDIQMT QSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGV PSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKGATP PETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGY

SFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAY AC1521 CEA LQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSGTAEAASASGL

SGRSDNHSPLGLAGSPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPG SPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPAT SGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSA PGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSE SATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSEG SAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGT SESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPS EGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAP GSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSES

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

ATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPES GPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTS TEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSG SETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPG SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEP SEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSET PGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSEP ATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGHHHHHH DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVGTSVAWYQQKPGKAPKLLIYWTST RHTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYSLYRSFGQGTKVEIK GATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCS ASGFDFTTYWMSWVRQAPGKGLEWIGEIHPDSSTINYAPSLKDRFTISRDNAK NTLFLQMDSLRPEDTGVYFCASLYFGFPWFAYWGQGTPVTVSSGGGGSDIQMT QSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGV PSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKGATP PETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGY SFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAY

LQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSGSPGSPAGSPT AC1523 CEA

STEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPG TSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGS PTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTE EGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSE SATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPE SGPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGT SESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPS EGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAP GTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSES ATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTST

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

EEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSE PATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSE GSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPG SPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESA TPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTE EGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTST EPSEGSAPGHHHHHH DIQMTQSPSSLSTSVGDRVTLTCKASQDVGTAVDWYQQKPGPSPKLLIYWAST RHTGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFADYYCQQYNSYPLTFGPGTKVDI KGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLVQSGPEVKKPGATVKISC KTSGYTFTEYTIHWVKQAPGKGLEWIGNINPNNGGTTYNQKFEDKATLTVDKS TDTAYMELSSLRSEDTAVYYCAAGWNFDYWGQGTLLTVSSGGGGSDIQMTQSP SSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSR FSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKGATPPET GAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFT GYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQM

NSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSGTAEAASASGLSGR AC1522 PSMA SDNHSPLGLAGSPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPA

GSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGS ETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGT STEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESAT PESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSAP GTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGTSES ATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGS APGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSP AGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATP ESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPG SPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEP

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

SEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSET PGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEP ATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEG SAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGS EPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSEPATS GSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGHHHHHH DIQMTQSPSSLSTSVGDRVTLTCKASQDVGTAVDWYQQKPGPSPKLLIYWAST RHTGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFADYYCQQYNSYPLTFGPGTKVDI KGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLVQSGPEVKKPGATVKISC KTSGYTFTEYTIHWVKQAPGKGLEWIGNINPNNGGTTYNQKFEDKATLTVDKS TDTAYMELSSLRSEDTAVYYCAAGWNFDYWGQGTLLTVSSGGGGSDIQMTQSP SSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSR FSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKGATPPET GAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFT GYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQM NSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSGSPGSPAGSPTSTE

EGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTST AC1524 PSMA

EPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTS TEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGT STEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESAT PESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGP GTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSES ATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGS APGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTS ESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATP ESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEG SPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPAT SGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSA

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

PGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPA GSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPE SGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGT STEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPS EGSAPGHHHHHH DIQMTQSPASLSASLGETVSIECLASEGISNDLAWYQQKSGKSPQLLIYATSR LQDGVPSRFSGSGSGTRYSLKISGMQPEDEADYFCQQSYKYPWTFGGGTKLEL KGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLAESGGGLVQPGRSMKLSC AASGFTFSNFPMAWVRQAPTKGLEWVATISTSGGSTYYRDSVKGRFTISRDNA KSTLYLQMNSLRSEDTATYYCTRTLYILRVFYFDYWGQGVMVTVSSGGGGSDI QMTQSPSSLPASLGDRVTINCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTNKLA DGVPSRFSGSGSGRDSSFTISSLESEDIGSYYCQQYYNYPWTFGPGTKLEIKG ATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLVESGGGLVQPGKSLKLSCEA SGFTFSGYGMHWVRQAPGRGLESVAYITSSSINIKYADAVKGRFTVSRDNAKN

LLFLQMNILKSEDTAMYYCARFDWDKNYWGQGTMVTVSSGTAEAASASGLSGR EpCAM de SDNHSPLGLAGSPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPA AC1553X camundon GSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGS go ETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGT

STEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESAT PESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSAP GTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGTSES ATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGS APGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSP AGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATP ESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPG SPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEP SEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSET PGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEP

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

ATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEG SAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGS EPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSEPATS GSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGHHHHHH DIQMTQSPASLSASLGETVSIECLASEGISNDLAWYQQKSGKSPQLLIYATSR LQDGVPSRFSGSGSGTRYSLKISGMQPEDEADYFCQQSYKYPWTFGGGTKLEL KGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLAESGGGLVQPGRSMKLSC

AASGFTFSNFPMAWVRQAPTKGLEWVATISTSGGSTYYRDSVKGRFTISRDNA EpCAM de KSTLYLQMNSLRSEDTATYYCTRTLYILRVFYFDYWGQGVMVTVSSGGGGSDI AC1553A camundo- QMTQSPSSLPASLGDRVTINCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTNKLA ngo DGVPSRFSGSGSGRDSSFTISSLESEDIGSYYCQQYYNYPWTFGPGTKLEIKG

ATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLVESGGGLVQPGKSLKLSCEA SGFTFSGYGMHWVRQAPGRGLESVAYITSSSINIKYADAVKGRFTVSRDNAKN LLFLQMNILKSEDTAMYYCARFDWDKNYWGQGTMVTVSSGTAEAASASGLSGR SDNHSPLG DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSTKSLLHSNGITYLYWYQQKPGKAPKLLI YQMSNLASGVPSRFSSSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQNLEIPRTFGQG TKVEIKGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGQVQLVQSGPGLVQPGGS VRISCAASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLEWMGWINTYTGESTYADSFKGRFTF SLDTSASAAYLQINSLRAEDTAVYYCARFAIKGDYWGQGTLLTVSSGGGGSDI

QMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLE AC1684 EpCAM SGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKG

ATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA SGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKN TAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSGTAEAASA SGESGRAANTEPPELGAGPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGS APGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSE PATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSE

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

GSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPG TSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEP SEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTE EGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTST EPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEG SAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGT SESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESAT PESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGP GTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPA TSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPES GPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTS TEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSG SETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPG SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGHHHHHH DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSTKSLLHSNGITYLYWYQQKPGKAPKLLI YQMSNLASGVPSRFSSSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQNLEIPRTFGQG TKVEIKGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGQVQLVQSGPGLVQPGGS VRISCAASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLEWMGWINTYTGESTYADSFKGRFTF SLDTSASAAYLQINSLRAEDTAVYYCARFAIKGDYWGQGTLLTVSSGGGGSDI QMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLE

SGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKG AC1685 EpCAM

ATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA SGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKN TAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSGTAEAASA SGESGRAANTAPEGLTGPPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGS APGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSE PATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSE GSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPG

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

TSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEP SEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTE EGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTST EPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEG SAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGT SESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESAT PESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGP GTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPA TSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPES GPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTS TEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSG SETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPG SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGHHHHHH DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSTKSLLHSNGITYLYWYQQKPGKAPKLLI YQMSNLASGVPSRFSSSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQNLEIPRTFGQG TKVEIKGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGQVQLVQSGPGLVQPGGS VRISCAASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLEWMGWINTYTGESTYADSFKGRFTF SLDTSASAAYLQINSLRAEDTAVYYCARFAIKGDYWGQGTLLTVSSGGGGSDI QMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLE

SGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKG AC1686 EpCAM ATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA

SGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKN TAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSGTAEAASA SGEPGRAANHEPSGLTEGPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGS APGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSE PATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSE GSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPG TSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEP

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

SEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTE EGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTST EPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEG SAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGT SESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESAT PESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGP GTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPA TSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPES GPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTS TEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSG SETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPG SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGHHHHHH DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSTKSLLHSNGITYLYWYQQKPGKAPKLLI YQMSNLASGVPSRFSSSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQNLEIPRTFGQG TKVEIKGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGQVQLVQSGPGLVQPGGS VRISCAASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLEWMGWINTYTGESTYADSFKGRFTF SLDTSASAAYLQINSLRAEDTAVYYCARFAIKGDYWGQGTLLTVSSGGGGSDI QMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLE SGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKG

ATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA AC1693 EpCAM

SGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKN TAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSGTAEAASA SGESGRAANHTGAPPGGLTGPPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPS EGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGP GSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTE PSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGS APGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTS TEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSPAGSPT

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

STEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPG TSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEP SEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSET PGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSE SATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPE SGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGS EPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESAT PESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEE GTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPA TSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGS APGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGHHHHHH DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSTKSLLHSNGITYLYWYQQKPGKAPKLLI YQMSNLASGVPSRFSSSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQNLEIPRTFGQG TKVEIKGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGQVQLVQSGPGLVQPGGS VRISCAASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLEWMGWINTYTGESTYADSFKGRFTF SLDTSASAAYLQINSLRAEDTAVYYCARFAIKGDYWGQGTLLTVSSGGGGSDI QMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLE SGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKG

ATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA AC1695 EpCAM SGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKN

TAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSGTAEAASA SGTTGRAGEAANLTPAGLTGPPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPS EGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGP GSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTE PSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGS APGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTS TEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSPAGSPT STEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPG

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

TSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEP SEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSET PGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSE SATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPE SGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGS EPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESAT PESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEE GTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPA TSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGS APGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGHHHHHH DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSTKSLLHSNGITYLYWYQQKPGKAPKLLI YQMSNLASGVPSRFSSSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQNLEIPRTFGQG TKVEIKGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGQVQLVQSGPGLVQPGGS VRISCAASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLEWMGWINTYTGESTYADSFKGRFTF SLDTSASAAYLQINSLRAEDTAVYYCARFAIKGDYWGQGTLLTVSSGGGGSDI QMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLE SGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKG ATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA

SGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKN AC1714 EpCAM

TAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSGTAEAASA SGEAGRSANHTPAGLTGPPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGS APGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSE PATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSE GSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPG TSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEP SEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTE EGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTST EPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEG

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

SAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGT SESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESAT PESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGP GTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPA TSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPES GPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTS TEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSG SETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPG SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGHHHHHH DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSTKSLLHSNGITYLYWYQQKPGKAPKLLI YQMSNLASGVPSRFSSSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQNLEIPRTFGQG TKVEIKGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGQVQLVQSGPGLVQPGGS VRISCAASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLEWMGWINTYTGESTYADSFKGRFTF SLDTSASAAYLQINSLRAEDTAVYYCARFAIKGDYWGQGTLLTVSSGGGGSDI QMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLE SGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKG ATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAA

SGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKN AC1715 EpCAM TAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSGTAEAASA

SGESGRAANTTPAGLTGPPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGS APGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSE PATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSE GSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPG TSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEP SEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTE EGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTST EPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEG SAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGT

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

SESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESAT PESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGP GTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPA TSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPES GPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTS TEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSG SETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPG

SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGHHHHHH Tabela 15: Seqüências de aminoácidos de construções de ProTIA. ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais AC1949 EpCAM SPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPAT

SGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSA PGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPA GSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPE SGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGT STEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGGSAPTTGEAGEAAGATSAGATGPATSGSET PGTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSTKSLLHSNGITYLYWYQQKPGKAPK LLIYQMSNLASGVPSRFSSSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQNLEIPRTF GQGTKVEIKGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGQVQLVQSGPGLVQP GGSVRISCAASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLEWMGWINTYTGESTYADSFKGR FTFSLDTSASAAYLQINSLRAEDTAVYYCARFAIKGDYWGQGTLLTVSSGGGG SDIQMTQSPSSLPASLGDRVTINCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTN KLADGVPSRFSGSGSGRDSSFTISSLESEDIGSYYCQQYYNYPWTFGPGTKLE IKGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLVESGGGLVQPGKSLKLS CEASGFTFSGYGMHWVRQAPGRGLESVAYITSSSINIKYADAVKGRFTVSRDN AKNLLFLQMNILKSEDTAMYYCARFDWDKNYWGQGTMVTVSSGTAEAASASGT TGEAGEAAGATSAGATGPPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGS

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

APGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSE PATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSE GSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPG TSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSTEP SEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTE EGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTST EPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEG SAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGT SESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESAT PESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGP GTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPA TSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPES GPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTS TEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSG SETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPG

SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGHHHHHH AC1991 EGFR HHHHHHSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGP

GSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTE PSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPES GPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTS ESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPT STEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGGSAPTTGEAGEAAGATSAGATGPA TSGSETPGTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAP KLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYFCQHFDHLPLA FGGGTKVEIKGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGQVQLQESGPGLVK PSETLSLTCTVSGGSVSSGDYYWTWIRQSPGKGLEWIGHIYYSGNTNYNPSLK SRLTISIDTSKTQFSLKLSSVTAADTAIYYCVRDRVTGAFDIWGQGTMVTVSS GGGGSELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRG

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

LIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFG GGTKLTVLGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLLESGGGLVQPG GSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKD RFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLV TVSSGTAEAASASGTTGEAGEAAGATSAGATGPPGSPAGSPTSTEEGTSESAT PESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAP GTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSES ATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGS APGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSE PATSGSETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATP ESGPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPG TSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEP SEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESG PGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTST EPSEGSAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTS TEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGT SESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSP TSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEE GSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSES ATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGS APGTSTEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGEP

EA AC2011 Her2 HHHHHHSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGP

GSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTE PSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPES GPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTS ESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPT

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

STEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGGSAPTTGEAGEAAGATSAGATGPA TSGSETPGTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAP KLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPT FGQGTKVEIKGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLVESGGGLVQ PGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKG RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVS SGGGGSELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPR GLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVF GGGTKLTVLGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLLESGGGLVQP GGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVK DRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTL VTVSSGTAEAASASGTTGEAGEAAGATSAGATGPPGSPAGSPTSTEEGTSESA TPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSA PGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSE SATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEG SAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGS EPATSGSETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESAT PESGPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGP GTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTE PSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPES GPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTS TEPSEGSAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPT STEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPG TSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGS PTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTE EGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSE SATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEG SAPGTSTEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGAAEPE

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

A AC2091 Her2 HHHHHHSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGP

GSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTE PSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPES GPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTS ESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPT STEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGGSAPEAGRSAEATSAGATGPATSG SETPGTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLL IYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQ GTKVEIKGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLVESGGGLVQPGG SLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFT ISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGG GGSELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLI GGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGG TKLTVLGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLLESGGGLVQPGGS LKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRF TISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTV SSGTAEAASASGEAGRSAEATSAGATGPPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGP GTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSES ATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPES GPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTS TEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSG SETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPG SPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEP SEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSA PGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEP ATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG SAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGT

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

SESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESAT PESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEE GTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAG SPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPES GPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTS

TEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGAAEPEA AC2092 Her2 HHHHHHSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGP

GSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTE PSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPES GPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTS ESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPT STEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGGSAPEAGESANATSAGATGPATSG SETPGTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLL IYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQ GTKVEIKGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLVESGGGLVQPGG SLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFT ISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGG GGSELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLI GGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGG TKLTVLGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLLESGGGLVQPGGS LKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRF TISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTV SSGTAEAASASGEAGESANATSAGATGPPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGP GTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSES ATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPES GPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTS TEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSG SETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPG

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

SPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEP SEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSA PGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEP ATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG SAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGT SESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESAT PESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEE GTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAG SPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPES GPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTS

TEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGAAEPEA AC2093 Her2 HHHHHHSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGP

GSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTE PSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPES GPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTS ESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPT STEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGGSAPEAGESAGATPAGLTGPATSG SETPGTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLL IYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQ GTKVEIKGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLVESGGGLVQPGG SLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFT ISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGG GGSELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLI GGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGG TKLTVLGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLLESGGGLVQPGGS LKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRF TISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTV SSGTAEAASASGEAGESAGATPAGLTGPPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGP

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

GTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSES ATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPES GPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTS TEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSG SETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPG SPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEP SEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSA PGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEP ATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG SAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGT SESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESAT PESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEE GTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAG SPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPES GPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTS

TEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGAAEPEA AC2094 Her2 HHHHHHSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGP

GSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTE PSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPES GPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTS ESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPT STEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGGSAPSASGTYSRGESGPGSPATSG SETPGTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLL IYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQ GTKVEIKGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLVESGGGLVQPGG SLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFT ISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGG GGSELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLI

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

GGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGG TKLTVLGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLLESGGGLVQPGGS LKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRF TISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTV SSGTAEAASASGSASGTYSRGESGPGSPPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGP GTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSES ATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPES GPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTS TEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSG SETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPG SPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEP SEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSA PGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEP ATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG SAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGT SESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESAT PESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEE GTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAG SPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPES GPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTS

TEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGAAEPEA AC2095 Her2 HHHHHHSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGP

GSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTE PSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPES GPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTS ESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPT STEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGGSAPSASGAEGRTDTHPGSPATSG SETPGTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLL

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

IYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQ GTKVEIKGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLVESGGGLVQPGG SLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFT ISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGG GGSELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLI GGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGG TKLTVLGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLLESGGGLVQPGGS LKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRF TISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTV SSGTAEAASASGSASGAEGRTDTHPGSPPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGP GTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSES ATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPES GPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTS TEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSG SETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPG SPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEP SEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSA PGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEP ATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG SAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGT SESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESAT PESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEE GTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAG SPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPES GPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTS

TEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGAAEPEA AC2096 Her2 HHHHHHSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGP

GSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTE

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

PSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPES GPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTS ESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPT STEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGGSAPSASGEPGRAAEHPGSPATSG SETPGTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLL IYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQ GTKVEIKGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLVESGGGLVQPGG SLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFT ISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGG GGSELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLI GGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGG TKLTVLGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLLESGGGLVQPGGS LKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRF TISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTV SSGTAEAASASGSASGEPGRAAEHPGSPPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGP GTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSES ATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPES GPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTS TEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSG SETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPG SPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEP SEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSA PGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEP ATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG SAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGT SESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESAT PESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEE GTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAG

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

SPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPES GPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTS

TEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGAAEPEA AC2097 Her2 HHHHHHSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGP

GSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTE PSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPES GPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTS ESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPT STEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGGSAPSPAGESSRGTTIAGSPATSG SETPGTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLL IYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQ GTKVEIKGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLVESGGGLVQPGG SLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFT ISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGG GGSELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLI GGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGG TKLTVLGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLLESGGGLVQPGGS LKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRF TISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTV SSGTAEAASASGSPAGESSRGTTIAGSPPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGP GTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSES ATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPES GPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTS TEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSG SETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPG SPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEP SEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSA PGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEP

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

ATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG SAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGT SESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESAT PESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEE GTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAG SPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPES GPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTS

TEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGAAEPEA AC2098 Her2 HHHHHHSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGP

GSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTE PSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPES GPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTS ESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPT STEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGGSAPSASGEPPELGAGPGSPATSG SETPGTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLL IYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQ GTKVEIKGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLVESGGGLVQPGG SLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFT ISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGG GGSELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLI GGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGG TKLTVLGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLLESGGGLVQPGGS LKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRF TISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTV SSGTAEAASASGSASGEPPELGAGPGSPPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGP GTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSES ATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPES GPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTS

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

TEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSG SETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPG SPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEP SEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSA PGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEP ATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG SAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGT SESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESAT PESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEE GTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAG SPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPES GPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTS

TEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGAAEPEA AC2099 Her2 HHHHHHSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGP

GSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTE PSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPES GPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTS ESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPT STEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGGSAPSASGPPPGLTGPPGSPATSG SETPGTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLL IYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQ GTKVEIKGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLVESGGGLVQPGG SLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFT ISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGG GGSELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLI GGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGG TKLTVLGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLLESGGGLVQPGGS LKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRF

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

TISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTV SSGTAEAASASGSASGPPPGLTGPPGSPPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGP GTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSES ATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPES GPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTS TEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSG SETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPG SPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEP SEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSA PGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEP ATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG SAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGT SESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESAT PESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEE GTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAG SPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPES GPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTS

TEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGAAEPEA AC2100 Her2 HHHHHHSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGP

GSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTE PSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPES GPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTS ESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPT STEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGGSAPSASGTPAPLGGEPGSPATSG SETPGTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLL IYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQ GTKVEIKGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLVESGGGLVQPGG SLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFT

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

ISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGG GGSELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLI GGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGG TKLTVLGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLLESGGGLVQPGGS LKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRF TISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTV SSGTAEAASASGSASGTPAPLGGEPGSPPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGP GTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSES ATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPES GPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTS TEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSG SETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPG SPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEP SEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSA PGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEP ATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG SAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGT SESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESAT PESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEE GTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAG SPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPES GPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTS

TEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGAAEPEA AC2101 Her2 HHHHHHSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGP

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

STEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGGSAPSPAGPPEGLETEAGSPATSG SETPGTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLL IYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQ GTKVEIKGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLVESGGGLVQPGG SLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFT ISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGG GGSELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLI GGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGG TKLTVLGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLLESGGGLVQPGGS LKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRF TISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTV SSGTAEAASASGSPAGPPEGLETEAGSPPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGP GTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSES ATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPES GPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTS TEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSG SETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPG SPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEP SEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSA PGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEP ATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG SAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGT SESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESAT PESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEE GTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAG SPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPES GPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTS TEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGAAEPEA

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais AC2102 Her2 HHHHHHSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGP

GSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTE PSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPES GPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTS ESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPT STEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGGSAPSPTSGRGGLTGPGSEPATSG SETPGTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLL IYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQ GTKVEIKGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLVESGGGLVQPGG SLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFT ISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGG GGSELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLI GGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGG TKLTVLGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLLESGGGLVQPGGS LKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRF TISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTV SSGTAEAASASGSPTSGRGGLTGPGSEPPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGP GTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSES ATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPES GPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTS TEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSG SETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPG SPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEP SEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSA PGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEP ATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG SAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGT SESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESAT

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

PESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEE GTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAG SPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPES GPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTS

TEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGAAEPEA AC2103 EGFR HHHHHHSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGP

GSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTE PSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPES GPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTS ESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPT STEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGGSAPEAGRSAEATSAGATGPATSG SETPGTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLL IYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYFCQHFDHLPLAFGG GTKVEIKGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGQVQLQESGPGLVKPSE TLSLTCTVSGGSVSSGDYYWTWIRQSPGKGLEWIGHIYYSGNTNYNPSLKSRL TISIDTSKTQFSLKLSSVTAADTAIYYCVRDRVTGAFDIWGQGTMVTVSSGGG GSELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIG GTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGT KLTVLGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLLESGGGLVQPGGSL KLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFT ISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVS SGTAEAASASGEAGRSAEATSAGATGPPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPG TSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESA TPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESG PGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTST EPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGS ETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGS PAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPS

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

EGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAP GTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPA TSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGS APGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTS ESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATP ESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEG TSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGS PTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESG PGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTST

EPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGAAEPEA AC2104 EGFR HHHHHHSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGP

GSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTE PSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPES GPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTS ESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPT STEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGGSAPEAGESANATSAGATGPATSG SETPGTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLL IYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYFCQHFDHLPLAFGG GTKVEIKGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGQVQLQESGPGLVKPSE TLSLTCTVSGGSVSSGDYYWTWIRQSPGKGLEWIGHIYYSGNTNYNPSLKSRL TISIDTSKTQFSLKLSSVTAADTAIYYCVRDRVTGAFDIWGQGTMVTVSSGGG GSELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIG GTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGT KLTVLGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLLESGGGLVQPGGSL KLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFT ISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVS SGTAEAASASGEAGESANATSAGATGPPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPG TSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESA

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

TPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESG PGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTST EPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGS ETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGS PAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPS EGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAP GTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPA TSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGS APGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTS ESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATP ESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEG TSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGS PTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESG PGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTST

EPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGAAEPEA AC2105 EGFR HHHHHHSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGP

GSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTE PSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPES GPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTS ESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPT STEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGGSAPEAGESAGATPAGLTGPATSG SETPGTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLL IYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYFCQHFDHLPLAFGG GTKVEIKGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGQVQLQESGPGLVKPSE TLSLTCTVSGGSVSSGDYYWTWIRQSPGKGLEWIGHIYYSGNTNYNPSLKSRL TISIDTSKTQFSLKLSSVTAADTAIYYCVRDRVTGAFDIWGQGTMVTVSSGGG GSELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIG GTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGT

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

KLTVLGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLLESGGGLVQPGGSL KLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFT ISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVS SGTAEAASASGEAGESAGATPAGLTGPPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPG TSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESA TPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESG PGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTST EPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGS ETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGS PAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPS EGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAP GTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPA TSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGS APGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTS ESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATP ESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEG TSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGS PTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESG PGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTST

EPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGAAEPEA AC2106 EGFR HHHHHHSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGP

GSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTE PSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPES GPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTS ESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPT STEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGGSAPSASGTYSRGESGPGSPATSG SETPGTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLL IYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYFCQHFDHLPLAFGG

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

GTKVEIKGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGQVQLQESGPGLVKPSE TLSLTCTVSGGSVSSGDYYWTWIRQSPGKGLEWIGHIYYSGNTNYNPSLKSRL TISIDTSKTQFSLKLSSVTAADTAIYYCVRDRVTGAFDIWGQGTMVTVSSGGG GSELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIG GTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGT KLTVLGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLLESGGGLVQPGGSL KLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFT ISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVS SGTAEAASASGSASGTYSRGESGPGSPPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPG TSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESA TPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESG PGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTST EPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGS ETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGS PAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPS EGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAP GTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPA TSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGS APGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTS ESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATP ESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEG TSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGS PTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESG PGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTST

EPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGAAEPEA AC2107 EGFR HHHHHHSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGP

GSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTE PSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPES

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

GPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTS ESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPT STEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGGSAPSASGAEGRTDTHPGSPATSG SETPGTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLL IYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYFCQHFDHLPLAFGG GTKVEIKGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGQVQLQESGPGLVKPSE TLSLTCTVSGGSVSSGDYYWTWIRQSPGKGLEWIGHIYYSGNTNYNPSLKSRL TISIDTSKTQFSLKLSSVTAADTAIYYCVRDRVTGAFDIWGQGTMVTVSSGGG GSELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIG GTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGT KLTVLGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLLESGGGLVQPGGSL KLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFT ISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVS SGTAEAASASGSASGAEGRTDTHPGSPPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPG TSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESA TPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESG PGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTST EPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGS ETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGS PAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPS EGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAP GTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPA TSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGS APGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTS ESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATP ESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEG TSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGS PTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESG

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

PGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTST

EPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGAAEPEA AC2108 EGFR HHHHHHSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGP

GSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTE PSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPES GPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTS ESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPT STEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGGSAPSASGEPGRAAEHPGSPATSG SETPGTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLL IYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYFCQHFDHLPLAFGG GTKVEIKGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGQVQLQESGPGLVKPSE TLSLTCTVSGGSVSSGDYYWTWIRQSPGKGLEWIGHIYYSGNTNYNPSLKSRL TISIDTSKTQFSLKLSSVTAADTAIYYCVRDRVTGAFDIWGQGTMVTVSSGGG GSELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIG GTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGT KLTVLGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLLESGGGLVQPGGSL KLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFT ISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVS SGTAEAASASGSASGEPGRAAEHPGSPPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPG TSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESA TPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESG PGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTST EPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGS ETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGS PAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPS EGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAP GTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPA TSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGS

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

APGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTS ESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATP ESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEG TSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGS PTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESG PGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTST

EPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGAAEPEA AC2109 EGFR HHHHHHSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGP

GSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTE PSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPES GPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTS ESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPT STEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGGSAPSPAGESSRGTTIAGSPATSG SETPGTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLL IYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYFCQHFDHLPLAFGG GTKVEIKGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGQVQLQESGPGLVKPSE TLSLTCTVSGGSVSSGDYYWTWIRQSPGKGLEWIGHIYYSGNTNYNPSLKSRL TISIDTSKTQFSLKLSSVTAADTAIYYCVRDRVTGAFDIWGQGTMVTVSSGGG GSELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIG GTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGT KLTVLGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLLESGGGLVQPGGSL KLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFT ISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVS SGTAEAASASGSPAGESSRGTTIAGSPPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPG TSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESA TPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESG PGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTST EPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGS

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

ETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGS PAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPS EGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAP GTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPA TSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGS APGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTS ESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATP ESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEG TSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGS PTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESG PGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTST

EPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGAAEPEA AC2110 EGFR HHHHHHSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGP

GSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTE PSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPES GPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTS ESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPT STEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGGSAPSASGEPPELGAGPGSPATSG SETPGTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLL IYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYFCQHFDHLPLAFGG GTKVEIKGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGQVQLQESGPGLVKPSE TLSLTCTVSGGSVSSGDYYWTWIRQSPGKGLEWIGHIYYSGNTNYNPSLKSRL TISIDTSKTQFSLKLSSVTAADTAIYYCVRDRVTGAFDIWGQGTMVTVSSGGG GSELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIG GTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGT KLTVLGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLLESGGGLVQPGGSL KLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFT ISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVS

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

SGTAEAASASGSASGEPPELGAGPGSPPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPG TSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESA TPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESG PGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTST EPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGS ETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGS PAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPS EGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAP GTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPA TSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGS APGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTS ESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATP ESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEG TSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGS PTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESG PGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTST

EPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGAAEPEA AC2111 EGFR HHHHHHSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGP

GSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTE PSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPES GPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTS ESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPT STEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGGSAPSASGPPPGLTGPPGSPATSG SETPGTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLL IYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYFCQHFDHLPLAFGG GTKVEIKGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGQVQLQESGPGLVKPSE TLSLTCTVSGGSVSSGDYYWTWIRQSPGKGLEWIGHIYYSGNTNYNPSLKSRL TISIDTSKTQFSLKLSSVTAADTAIYYCVRDRVTGAFDIWGQGTMVTVSSGGG

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

GSELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIG GTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGT KLTVLGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLLESGGGLVQPGGSL KLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFT ISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVS SGTAEAASASGSASGPPPGLTGPPGSPPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPG TSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESA TPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESG PGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTST EPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGS ETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGS PAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPS EGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAP GTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPA TSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGS APGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTS ESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATP ESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEG TSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGS PTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESG PGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTST

EPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGAAEPEA AC2112 EGFR HHHHHHSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGP

GSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTE PSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPES GPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTS ESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPT STEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGGSAPSASGTPAPLGGEPGSPATSG

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

SETPGTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLL IYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYFCQHFDHLPLAFGG GTKVEIKGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGQVQLQESGPGLVKPSE TLSLTCTVSGGSVSSGDYYWTWIRQSPGKGLEWIGHIYYSGNTNYNPSLKSRL TISIDTSKTQFSLKLSSVTAADTAIYYCVRDRVTGAFDIWGQGTMVTVSSGGG GSELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIG GTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGT KLTVLGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLLESGGGLVQPGGSL KLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFT ISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVS SGTAEAASASGSASGTPAPLGGEPGSPPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPG TSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESA TPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESG PGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTST EPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGS ETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGS PAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPS EGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAP GTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPA TSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGS APGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTS ESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATP ESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEG TSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGS PTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESG PGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTST

EPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGAAEPEA AC2113 EGFR HHHHHHSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGP

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

GSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTE PSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPES GPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTS ESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPT STEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGGSAPSPAGPPEGLETEAGSPATSG SETPGTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLL IYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYFCQHFDHLPLAFGG GTKVEIKGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGQVQLQESGPGLVKPSE TLSLTCTVSGGSVSSGDYYWTWIRQSPGKGLEWIGHIYYSGNTNYNPSLKSRL TISIDTSKTQFSLKLSSVTAADTAIYYCVRDRVTGAFDIWGQGTMVTVSSGGG GSELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIG GTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGT KLTVLGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLLESGGGLVQPGGSL KLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFT ISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVS SGTAEAASASGSPAGPPEGLETEAGSPPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPG TSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESA TPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESG PGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTST EPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGS ETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGS PAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPS EGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAP GTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPA TSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGS APGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTS ESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATP ESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEG

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

TSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGS PTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESG PGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTST

EPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGAAEPEA AC2114 EGFR HHHHHHSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGP

GSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTE PSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPES GPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTS ESATPESGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPT STEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGGSAPSPTSGRGGLTGPGSEPATSG SETPGTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLL IYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYFCQHFDHLPLAFGG GTKVEIKGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGQVQLQESGPGLVKPSE TLSLTCTVSGGSVSSGDYYWTWIRQSPGKGLEWIGHIYYSGNTNYNPSLKSRL TISIDTSKTQFSLKLSSVTAADTAIYYCVRDRVTGAFDIWGQGTMVTVSSGGG GSELVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIG GTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGT KLTVLGATPPETGAETESPGETTGGSAESEPPGEGEVQLLESGGGLVQPGGSL KLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFT ISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVS SGTAEAASASGSPTSGRGGLTGPGSEPPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPG TSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESA TPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESG PGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTST EPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGS ETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGS PAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPS EGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAP

ID da Alvos Seqüências de aminoácidos construção tumorais

GTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPA TSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGS APGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTS ESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATP ESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEG TSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGS PTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESG PGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTST

EPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGAAEPEA Exemplo 39: Construção de vetor de base de XTEN com segmento de liberação RSR-1517

[431] O vetor de base de XTEN AC1611 com segmento de liberação RSR-1517 (seqüência de aminoácidos EAGRSANHEPLGLVAT) foi construído a partir da modificação de pNL0356 por PCR para codificar a proteína de HD2-V5-XTEN144- RSR-1517-XTEN712-H8 sob o controle do promotor T7lac, em que a seqüência HD2 é MKNPEQAEEQAEEQREET e V5 é GKPIPNPLLGLDST. A seqüência codificadora do segmento de liberação RSR-1517 on AC1611 é flanqueada por sítios de restrição NheI e BsaI únicos para permitir a substituição com outros segmentos de liberação. Após reação de ligação, os transformantes foram avaliados por DNA miniprep e a construção desejada foi confirmada por seqüenciamento de DNA. A construção resultante é AC1611, com a seqüência de DNA e seqüência de aminoácidos codificada fornecidas na Tabela 16. Tabela 16: Seqüência de DNA e de aminoácidos de XTEN AC1611 com segmento de liberação.

Nome da Seqüência de Seqüência de DNA construção aminoácidos*

ATGAAAAACCCAGAGCAAGCAGAAGAACAAGCTGAAGAACA MKNPEQAEEQAEEQREETGK GCGCGAAGAAACAGGCAAACCGATTCCGAACCCGCTGCTGG PIPNPLLGLDSTEGTSTEPS GTCTGGATAGCACCGAAGGTACTAGCACGGAGCCGAGCGAG EGSAPGTSESATPESGPGTS GGTAGTGCTCCGGGTACGAGCGAGAGCGCAACGCCAGAGAG ESATPESGPGTSESATPESG CGGTCCAGGCACCAGCGAATCGGCCACCCCTGAGAGCGGCC PGSEPATSGSETPGSEPATS CAGGTACTTCTGAGAGCGCCACTCCTGAATCCGGCCCTGGT GSETPGSPAGSPTSTEEGTS AGCGAGCCGGCAACCTCCGGCTCAGAAACTCCTGGTTCGGA TEPSEGSAPGTSTEPSEGSA ACCAGCGACCAGCGGTTCTGAAACTCCGGGTAGCCCGGCAG PGSEPATSGSETPGTSESAT GCAGCCCAACGAGCACCGAAGAGGGTACCAGCACGGAACCG PESGPGTAEAASASGEAGRS AGCGAGGGTTCTGCCCCGGGTACTTCCACCGAACCATCGGA ANHEPLGLVATPGSPAGSPT GGGCTCTGCACCTGGTAGCGAACCTGCGACGTCTGGTTCTG STEEGTSESATPESGPGTST AAACGCCGGGTACCAGCGAAAGCGCTACCCCAGAATCCGGT EPSEGSAPGSPAGSPTSTEE CCGGGCACCGCCGAAGCAGCTAGCGCCTCTGGCGAGGCAGG GTSTEPSEGSAPGTSTEPSE

TCGTTCTGCTAACCATGAACCACTGGGTCTGGTTGCTACGC GSAPGTSESATPESGPGSEP AC1611

CAGGTAGCCCAGCTGGTAGCCCAACCTCTACCGAAGAAGGT ATSGSETPGSEPATSGSETP ACCTCTGAATCCGCTACTCCAGAATCCGGTCCTGGTACTAG GSPAGSPTSTEEGTSESATP CACTGAGCCAAGCGAAGGTTCTGCTCCAGGCTCCCCGGCAG ESGPGTSTEPSEGSAPGTST GTAGCCCTACCTCTACCGAAGAGGGCACTAGCACCGAACCA EPSEGSAPGSPAGSPTSTEE TCTGAGGGTTCCGCTCCTGGCACCTCCACTGAACCGTCCGA GTSTEPSEGSAPGTSTEPSE AGGCAGTGCTCCGGGTACTTCCGAAAGCGCAACTCCGGAAT GSAPGTSESATPESGPGTST CCGGCCCTGGTTCTGAGCCTGCTACTTCCGGCTCTGAAACT EPSEGSAPGTSESATPESGP CCAGGTAGCGAGCCAGCGACTTCTGGTTCTGAAACTCCAGG GSEPATSGSETPGTSTEPSE TTCACCGGCGGGTAGCCCGACGAGCACGGAGGAAGGTACCT GSAPGTSTEPSEGSAPGTSE CTGAGTCGGCCACTCCTGAGTCCGGTCCGGGCACGAGCACC SATPESGPGTSESATPESGP GAGCCGAGCGAGGGTTCAGCCCCGGGTACCAGCACGGAGCC GSPAGSPTSTEEGTSESATP GTCCGAGGGTAGCGCACCGGGTTCTCCGGCGGGCTCCCCTA ESGPGSEPATSGSETPGTSE CGTCTACGGAAGAGGGTACGTCCACTGAACCTAGCGAGGGC SATPESGPGTSTEPSEGSAP AGCGCGCCAGGCACCAGCACTGAACCGAGCGAAGGCAGCGC GTSTEPSEGSAPGTSTEPSE

Nome da Seqüência de Seqüência de DNA construção aminoácidos*

ACCTGGCACTAGCGAGTCTGCGACTCCGGAGAGCGGTCCGG GSAPGTSTEPSEGSAPGTST GTACGAGCACGGAACCAAGCGAAGGCAGCGCCCCAGGTACC EPSEGSAPGTSTEPSEGSAP TCTGAATCTGCTACCCCAGAATCTGGCCCGGGTTCCGAGCC GSPAGSPTSTEEGTSTEPSE AGCTACCTCTGGTTCTGAAACCCCAGGTACTTCCACTGAAC GSAPGTSESATPESGPGSEP CAAGCGAAGGTAGCGCTCCTGGCACTTCTACTGAACCATCC ATSGSETPGTSESATPESGP GAAGGTTCCGCTCCTGGTACGTCTGAAAGCGCTACCCCTGA GSEPATSGSETPGTSESATP AAGCGGCCCAGGCACCTCTGAAAGCGCTACTCCTGAGAGCG ESGPGTSTEPSEGSAPGTSE GTCCAGGCTCTCCAGCAGGTTCTCCAACCTCCACTGAAGAA SATPESGPGSPAGSPTSTEE GGCACCTCTGAGTCTGCTACCCCTGAATCTGGTCCTGGCTC GSPAGSPTSTEEGSPAGSPT CGAACCTGCTACCTCTGGTTCCGAAACTCCAGGTACCTCGG STEEGTSESATPESGPGTST AATCTGCGACTCCGGAATCTGGCCCGGGCACGAGCACGGAG EPSEGSAPGTSESATPESGP CCGTCTGAGGGTAGCGCACCAGGTACCAGCACTGAGCCTTC GSEPATSGSETPGTSESATP TGAGGGCTCTGCACCGGGTACCTCCACGGAACCTTCGGAAG ESGPGSEPATSGSETPGTSE GTTCTGCGCCGGGTACCTCCACTGAGCCATCCGAGGGTTCA SATPESGPGTSTEPSEGSAP GCACCAGGTACTAGCACGGAACCGTCCGAGGGCTCTGCACC GSPAGSPTSTEEGTSESATP AGGTACGAGCACCGAACCGTCGGAGGGTAGCGCTCCAGGTA ESGPGSEPATSGSETPGTSE GCCCAGCGGGCTCTCCGACAAGCACCGAAGAAGGCACCAGC SATPESGPGSPAGSPTSTEE ACCGAGCCGTCCGAAGGTTCCGCACCAGGTACAAGCGAGAG GSPAHHHHHHHH CGCGACTCCTGAATCTGGTCCGGGTAGCGAGCCTGCAACCA GCGGTTCTGAGACGCCGGGCACTTCCGAATCTGCGACCCCG GAGTCCGGTCCAGGTTCAGAGCCGGCGACGAGCGGTTCGGA AACGCCGGGTACGTCTGAATCAGCCACGCCGGAGTCTGGTC CGGGTACCTCGACCGAACCAAGCGAAGGTTCGGCACCGGGT ACTAGCGAGAGCGCAACCCCTGAAAGCGGTCCGGGCAGCCC GGCAGGTTCTCCAACCAGCACCGAAGAAGGTTCCCCTGCTG GTAGCCCGACCTCTACGGAGGAAGGTAGCCCTGCAGGTTCC CCAACTTCTACTGAGGAAGGTACTTCTGAGTCCGCTACCCC AGAAAGCGGTCCTGGTACCTCCACTGAACCGTCTGAAGGCT

Nome da Seqüência de Seqüência de DNA construção aminoácidos*

CTGCACCAGGCACTTCTGAGTCTGCTACTCCAGAAAGCGGC CCAGGTTCTGAACCAGCAACTTCTGGCTCTGAGACTCCAGG CACTTCTGAGTCCGCAACGCCTGAATCCGGTCCTGGTTCTG AACCAGCTACTTCCGGCAGCGAAACCCCAGGTACCTCTGAG TCTGCGACTCCAGAGTCTGGTCCTGGTACTTCCACTGAGCC TAGCGAGGGTTCCGCACCAGGTTCTCCGGCTGGTAGCCCGA CCAGCACGGAGGAGGGTACGTCTGAATCTGCAACGCCGGAA TCGGGCCCAGGTTCGGAGCCTGCAACGTCTGGCAGCGAAAC CCCGGGTACCTCCGAATCTGCTACACCGGAAAGCGGTCCTG GCAGCCCTGCTGGTTCTCCAACCTCTACCGAGGAGGGTTCA

CCGGCACATCACCATCACCACCATCATCAC Exemplo 40: Expressão em frasco agitado de variantes de segmento de liberação de XTEN

[432] As construções de variantes de segmento de liberação de XTEN foram transformadas em E. coli cepa BL21_DE3 (New England Biolabs) para serem expressas sob o controle de um promotor T7. Culturas de partida foram preparadas por inoculação de estoques em glicerol de E. coli BL21_DE3 que carrega os plasmídeos correspondentes em 6 ml de meios de Caldo LB contendo 50 μg/ml de canamicina e incubadas de um dia para o outro a 37°C a 200 min-1. Culturas de partida de um dia para o outro foram inoculadas a 1:50 em aproximadamente 250 ml de meios de auto-indução ZY e desenvolvidas a 26°C por 26 horas, a 200 min-1. As células foram então colhidas por centrifugação a 10.000 rpm por 30 min para uso imediato ou congeladas a -80°C até o uso.

[433] Os meios de auto-indução ZY foram feitos por misturação dos componentes do seguinte modo: 928 ml de meios

ZY (10 g de bacto-triptona, 5 g de extrato de levedura e 925 ml de água; autoclavado), 1 ml de 1 M MgSO4, 20 ml de solução 5052 50x (25 g de glicerol, 2,5 g de glicose (Fisher FLBP350- 1), 10 g de a-lactose (Sigma L3625) e 73 ml de água; filtrada de forma estéril), 50 ml de solução NPS 20x (para fazer 100 ml, dissolver 6,6 g de (NH4)2SO4, 13,6 g de KH2PO4, 14,2 g de Na2HPO4 em 90 ml de água; filtrada de forma estéril) e 1 ml de canamicina (50 mg/ml). Exemplo 41: Purificação de variantes de segmento de liberação de XTEN de culturas em frasco agitado de E. coli 1) Lise, clarificação e análise de titulação

[434] Os péletes de células foram ressuspensos 1:4 em 50 mM de citrato, pH 4,0. As células ressuspensas foram aquecidas até 80°C por 15 minutos, seguido por resfriamento no gelo imediato por 30 minutos. O lisado foi então clarificado por centrifugação a 4.000 rpm por 40 min a 4°C. O sobrenadante foi coletado e filtrado por 0,2 μm.

[435] A titulação de cada construção foi estimada por análise de 5 μl de lisado clarificado com uma SDS-PAGE não redutora regular usando gel NuPAGE de Bis-Tris 4-12% de Invitrogen de acordo com as especificações do fabricante com coloração Coomassie. A FIG. 74A é uma análise de titulação exemplar de 3 variantes de RS e a seta indica onde os produtos migram, com peso molecular aparente aproximadamente em torno do marcador de peso molecular de 160 kDa. 2) Purificação por IMAC em etapa única

[436] Cromatografia por afinidade imobilizada em metal (IMAC) foi usada como a etapa de captura. Para cada variante, uma coluna de propileno de 10 ml (Thermo Scientific) foi recheada com 5 ml de resina ToyoPearl-AF-Chelate 650M (TOSOH

Biosciences). A coluna foi equilibrada com 5 volumes de coluna (CVs) de tampão de equilíbrio (20 mM de Tris, 100 mM de NaCl, pH 7,5). O pH do lisados de células clarificado foi ajustado até 7,5 antes de carregamento nas colunas. Após o término do carregamento, a coluna é lavada com 3 CVs de tampão de equilíbrio antes de ser eluída com 3 CVs de 20 mM de Tris pH 7,5, 100 mM de NaCl, 100 mM de imidazol. Frações de 1 CV (5 ml) foram coletadas.

[437] O carregamento, fluxo passante e eluições foram analisados por SDS-PAGE não redutora com Bis-Tris 4-12% e coloração Coomassie para determinar frações com a proteína eluída e sua pureza, como mostrado na FIG. 74B (AC1602, AC1609 e AC1610), FIG. 74C (AC1604, AC1608, AC1611), e FIG. 74D (AC1612, AC1649, AC1650). 3) Quantificação por HPLC e liberação de lote

[438] As variantes purificadas por IMAC de etapa única mencionadas anteriormente foram analisados lado-a-lado em SDS-PAGE não redutora com Bis-Tris 4-12% (FIG. 74E). A pureza foi considerada suficiente para avaliação enzimática e a concentração de cada variante foi avaliada por execução de HPLC de fase reversa e quantificada com uma curva-padrão de um composto com concentração conhecida.

[439] Conclusões: Demonstramos que a expressão de várias construções de RS-XTEN em E. coli é factível e a purificação por IMAC em etapa única é suficiente para produzir essas variantes com quantidade e qualidade adequadas para avaliação enzimática ensaio subseqüente. Exemplo 42: Ativação enzimática, armazenamento e digestão de XTEN contendo RSR-1517 AC1611

[440] Esse exemplo demonstra que construções de XTEN contendo RSR-1517 AC1611 podem ser clivadas por várias proteases associadas a tumores, incluindo uPA humano recombinante, matriptase, legumaína, MMP-2, MMP-7, MMP-9 e MMP-14, em tubos de ensaio.

1. Ativação enzimática

[441] Todas as enzimas usadas foram obtidas de R&D Systems. u-ativador de plasminogênio humano recombinante (uPA) e matriptase humana recombinante foram fornecidas como enzimas ativadas e armazenadas a -80°C até o uso. MMP-2 de camundongo recombinante, MMP-7 humana recombinante e MMP-9 de camundongo recombinante foram fornecidas como zimogênios e necessitavam de ativação por acetato 4-aminofenilmercúrico (APMA). APMA primeiro foi dissolvido em 0,1 M de NaOH até uma concentração final de 10 mM antes do pH ter sido reajustado até neutro usando 0,1 M de HCl. Diluição adicional do estoque de APMA até 2,5 mM foi feita em 50 mM de Tris pH 7,5, 150 mM de NaCl, 10 mM de CaCl2. Para ativar pró-MMP, 1 mM de APMA e 100 µg/ml de pró-MMP em 50 mM de Tris pH 7,5, 150 mM de NaCl, 10 mM de CaCl2 foram incubados a 37°C por 1 hora (MMP-2, MMP-7) ou 24 horas (MMP-9). Para ativar MMP-14, 0,86 µg/ml de furina humana recombinante e 40 µg/ml de pró- MMP-14 em 50 mM de Tris pH 9, 1 mM de CaCl2 foram incubados a 37°C por 1,5 hora. Para ativar legumaína, 100 µg/ml de pró-legumaína em 50 mM de acetato de sódio pH 4, 100 mM de NaCl foram incubados a 37°C por 2 horas. 100% de glicerol ultrapuro foram adicionados a todas as enzimas ativadas (incluindo uPA e MTSP1) até uma concentração final de 50% de glicerol, e depois armazenados a -20°C por várias semanas.

2. Digestão enzimática

[442] Um painel de enzimas foi testado para determinar a eficiência de clivagem de cada enzima para AC1611. Seis µM do substrato foram incubados com cada enzima nas seguintes proporções molares de enzima-para-substrato e condições: uPA (1:25 em 50 mM de Tris pH 8,5), matriptase (1:25 em 50 mM de Tris pH 9, 50 mM de NaCl), legumaína (1:20 em 50 mM de MES pH 5, 250 mM de NaCl), MMP-2 (1:1.200 em 50 mM de Tris pH 7,5, 150 mM de NaCl, 10 mM de CaCl2), MMP-7 (1:1.200 em 50 mM de Tris pH 7,5, 150 mM de NaCl, 10 mM de CaCl2), MMP-9 (1:2.000 em 50 mM de Tris pH 7,5, 150 mM de NaCl, 10 mM de CaCl2) e MMP-14 (1:30 em 50 mM de Tris pH 8,5, 3 mM de CaCl2, 1 µM ZnCl2) em reações de 20 µl. As reações foram incubadas a 37°C por duas horas antes de serem interrompidas por adição de EDTA até 20 mM, no caso de reações de MMP, aquecimento a 85°C por 15 minutos, no caso de uPA, e reações de matriptase, e ajuste do pH até 8,5, no caso de legumaína.

3. Análise da eficiência de clivagem.

[443] A análise das amostras para determinar a percentagem de clivado produto foi realizada por carregamento de uma mistura de reação de 2 µl de substrato não digerido (a 12 µM) e 4 µl de digerido (a 6 µM) em SDS- PAGE e coloração com Stains-All (Sigma Aldrich), como mostrado na FIG. 75. O software ImageJ foi usado para analisar a intensidade de banda correspondente e determinar o percentual de clivagem. Mediante clivagem por várias proteases no Segmento de liberação, o XTEN contendo RSR-1517 do substrato geraria dois fragmentos, e o fragmento maior foi utilizado em cálculos de % de clivagem (quantidade de produto de reação dividida por substrato inicial total inserido na reação), enquanto a intensidade de banda do produto menor é muito pequena para quantificar. A percentagem de clivagem de AC1611 sob as condições experimentais-padrão atuais é de 31%, 14%, 16%, 40%, 51%, 38%, 30%, para uPA, matriptase, legumaína, MMP-2, MMP-7, MMP-9, MMP-14, respectivamente.

[444] Conclusões: Selecionamos um Segmento de liberação particular RSR-1517 (seqüência de aminoácidos EAGRSANHEPLGLVAT) e determinamos seu perfil de clivagem como definido pela percentagem de clivagem sob a condição experimental-padrão atual para todas as sete enzimas. Esse Segmento de liberação possui eficiência de clivagem intermediária para todas as enzimas, de modo que, durante avaliação, a clivagem de variantes mais rápidas ou mais lentas cairá dentro da janela de ensaio para permitir uma classificação precisa. Exemplo 43: Avaliação do segmento de liberação usando RSR-1517 (AC1611) como controle

[445] Aqui selecionamos uPA como o exemplo para mostrar como a avaliação do Segmento de liberação foi realizada. O mesmo procedimento foi aplicado a todas as sete proteases associadas a tumores para definir o perfil de clivagem relativo para cada substrato, que é um arranjo de número sete para descrever quão bem ele pode ser clivado para cada enzima, quando comparado com o substrato de controle RSR-1517.

1. Digestão enzimática

[446] Todas as variantes de XTEN contendo segmento de liberação e o AC1611 de controle foram diluídos até 12 µM em 50 mM de Tris pH 7,5, 150 mM de NaCl, 10 mM de CaCl2 em tubos de Eppendorf individuais. Uma mistura principal de uPA foi preparada, de modo que, após misturação de 1:1 com cada substrato, o volume de reação total é de 20 µl, a concentração inicial de substrato é de 6 µM, e a proporção de enzima-para-substrato foi variada entre 1:20 até 1:3.000, dependendo da enzima, a fim de ter produtos de reação e substrato não clivado que pudessem ser visualizados no desfecho. Todas as reações foram incubadas a 37°C por 2 horas antes de interrompidas por adição de EDTA até uma concentração final de 20 mM. Todos os produtos foram analisados por SDS-PAGE não redutora, seguida por Stains- All. Para cada gel, o produto de digestão de AC1611 foi sempre incluído como o controle de coloração para normalizar coloração diferencial entre géis diferentes (FIG. 76).

2. Cálculo da eficiência de clivagem relativa

[447] A percentagem de clivagem para um substrato individual foi analisada pelo software ImageJ e calculada como descrito anteriormente. Para cada variante, a eficiência de clivagem relativa é calculada do seguinte modo:

[448] Um valor de +1 na eficiência de clivagem relativa indica que o substrato gerou uma quantidade duas vezes maior de produto, quando comparado com o controle de AC1611, enquanto um valor de -1 na eficiência de clivagem relativa indica que o substrato gerou apenas 50% da quantidade do produto, quando comparado com o controle de AC1611, sob a condição experimental especificada acima.

[449] Nesse experimento, a percentagem de clivagem (% clivado) para AC1611 é de 20%, como quantificada por ImageJ. Os substratos que estão sendo avaliados nesse experimento demonstraram 21%, 39%, 1%, 58%, 24%, 6%, 15%, 1%, 1% e 25% de clivagem, em que 1% basicamente representa abaixo do limite de detecção e não indica valores precisos. As eficiências de clivagem relativas calculadas com base na fórmula acima foram de 0,08, 0,95, -4,34, 1,51, 0,26, -1,76, -0,47, -4,34, -4,34 e 0,32, respectivamente.

[450] Conclusões: Determinamos eficiências de clivagem relativas de 10 variantes de Segmento de liberação quando submetidas à uPA, quando comparadas com AC1611 no mesmo experimento. Após procedimentos similares, determinamos os perfis de clivagem de 134 Segmentos de liberação, cujos resultados estão listados na Tabela 17, usando RSR1517 (AC1611) como o controle de referência. Esses Segmentos de liberação cobrem uma ampla gama de eficiências de clivagem para enzimas individuais, bem como combinações. Por exemplo, RSR-1478 possui um valor de -2,00 para MMP-14, o que significa que esse substrato gerou apenas 25% de produto, comparado com o controle de referência RSR-1517 quando digerido com MMP-14. Certos Segmentos de liberação, por exemplo, RSR-1951, paracem ser um substrato melhor para todas as sete proteases testadas. Esses Segmentos de liberação mais rápidos podem se provar úteis na clínica se a toxicidade sistêmica for baixa/gerenciável, enquanto a eficácia (dependendo parcialmente de quão rapidamente ocorre a clivagem para tornar o ProTIA a forma ativada) necessita de aprimoramentos. Tabela 17: Perfis de clivagem do Segmento de liberação quando submetido a sete proteases humanas usando RSR-1517 como controle.

Matriptase ID.

DO RS

Legumaína Nº do AC

MMP-14 MMP-2

MMP-7

MMP-9 uPA Seqüência de AA

RSR-1517 AC1611 EAGRSANHEPLGLVAT 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

BSRS-4 AC1602 LAGRSDNHSPLGLAGS -0,99 1,69 0,48 0,09 -0,49 -0,04 -0,58

BSRS-5 AC1603 LAGRSDNHVPLSLSMG -1,40 1,76 0,56 -0,52 0,00 -0,75 -0,21

BSRS-6 AC1604 LAGRSDNHEPLELVAG -2,71 0,47 0,23 -1,26 0,00 -1,16 -2,79

BSRS-A1 AC1605 ASGRSTNAGPSGLAGP 1,43 2,77 0,09 -0,16 -2,18 0,03 -1,24

BSRS-A2 AC1606 ASGRSTNAGPQGLAGQ 1,36 2,77 -0,14 0,09 -2,64 0,03 -1,03

BSRS-A3 AC1607 ASGRSTNAGPPGLTGP 1,49 2,77 0,05 -1,07 -3,47 -1,82 -3,59

VP-1 AC1608 ASSRGTNAGPAGLTGP -2,19 1,16 0,90 0,09 -1,22 0,23 0,00

RSR-1752 AC1609 ASSRTTNTGPSTLTGP -0,55 0,70 0,29 -0,34 -1,29 -0,94 -5,38

RSR-1512 AC1610 AAGRSDNGTPLELVAP -2,96 1,51 0,56 -1,43 -0,45 -1,09 -3,91

RSR-1517 AC1611 EAGRSANHEPLGLVAT 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

VP-2 AC1612 ASGRGTNAGPAGLTGP -0,70 1,38 1,12 0,00 -0,58 0,23 -0,15

RSR-1018 AC1613 LFGRNDNHEPLELGGG -4,62 -0,53 1,36 -0,73 -0,43 -2,56 -1,79

RSR-1053 AC1614 TAGRSDNLEPLGLVFG -3,21 -0,12 -0,13 0,09 -0,03 0,25 -0,19

RSR-1059 AC1615 LDGRSDNFHPPELVAG -4,62 -0,89 0,56 -3,10 -2,62 -5,14 -6,49

RSR-1065 AC1616 LEGRSDNEEPENLVAG -4,62 -2,70 0,43 -1,84 -1,00 -3,14 -1,85

RSR-1167 AC1617 LKGRSDNNAPLALVAG -4,62 3,35 1,32 0,09 0,22 1,18 0,06

RSR-1201 AC1618 VYSRGTNAGPHGLTGR -3,02 2,35 1,25 0,09 -1,30 0,79 -0,30

RSR-1218 AC1619 ANSRGTNKGFAGLIGP -0,52 2,66 1,74 -0,30 0,00 -1,33 -1,60

RSR-1226 AC1620 ASSRLTNEAPAGLTIP -0,98 0,29 0,58 0,07 -0,43 -2,33 -0,42

RSR-1254 AC1621 DQSRGTNAGPEGLTDP -1,27 -1,17 1,00 -3,10 -2,32 -4,14 -2,92

RSR-1256 AC1622 ESSRGTNIGQGGLTGP -1,65 -0,58 0,27 -2,26 -3,32 -5,14 -5,51

RSR-1261 AC1623 SSSRGTNQDPAGLTIP -1,77 -0,36 0,62 -1,14 -1,25 -3,56 -0,98

RSR-1293 AC1624 ASSRGQNHSPMGLTGP -4,69 2,15 0,91 -0,70 -0,01 1,30 -0,67

RSR-1309 AC1625 AYSRGPNAGPAGLEGR -4,69 0,53 0,74 -0,70 -2,25 0,86 0,02

RSR-1326 AC1626 ASERGNNAGPANLTGF -0,27 1,27 1,64 -0,85 -0,74 0,28 -0,13

RSR-1345 AC1627 ASHRGTNPKPAILTGP 0,42 ND ND ND ND -0,50 ND

RSR-1354 AC1628 MSSRRTNANPAQLTGP 1,07 2,82 0,36 -0,77 -0,64 -1,82 -1,87

RSR-1426 AC1629 GAGRTDNHEPLELGAA -2,36 -0,65 -0,19 -2,82 -0,18 -0,11 -4,07

RSR-1478 AC1630 LAGRSENTAPLELTAG -2,06 1,18 0,54 -0,82 0,00 1,73 -2,00

RSR-1479 AC1631 LEGRPDNHEPLALVAS -3,47 -3,46 0,12 -0,74 0,00 2,05 0,02

RSR-1496 AC1632 LSGRSDNEEPLALPAG -3,48 -1,46 0,22 -2,81 -5,06 -3,20 -3,22

RSR-1508 AC1633 EAGRTDNHEPLELSAP -2,74 -1,46 -0,26 -1,48 0,00 0,56 -2,93

RSR-1513 AC1634 EGGRSDNHGPLELVSG -2,81 -1,87 0,27 -0,90 0,00 1,29 -3,81

RSR-1516 AC1635 LSGRSDNEAPLELEAG -3,71 -1,87 0,70 -1,69 -0,09 -1,39 -3,22

RSR-1524 AC1636 LGGRADNHEPPELGAG -0,84 1,12 0,95 -1,22 -2,84 -0,74 -2,57

RSR-1622 AC1637 PPSRGTNAEPAGLTGE -4,66 -3,46 0,62 -0,70 -1,09 0,93 -0,78

RSR-1629 AC1638 ASTRGENAGPAGLEAP -4,66 -1,14 1,09 -0,70 -1,74 0,19 -0,25

RSR-1664 AC1639 ESSRGTNGAPEGLTGP -4,66 -3,46 0,32 -1,18 -0,76 -0,76 -2,31

RSR-1667 AC1640 ASSRATNESPAGLTGE -3,05 2,00 0,46 -0,93 -1,25 -0,97 -0,83

RSR-1709 AC1641 ASSRGENPPPGGLTGP -2,64 0,77 -1,00 -0,93 -2,06 -0,76 -1,72

RSR-1712 AC1642 AASRGTNTGPAELTGS -4,07 -0,51 0,66 -0,93 -0,64 0,29 -0,19

RSR-1727 AC1643 AGSRTTNAGPGGLEGP -3,55 -0,51 0,32 -1,58 -4,84 -3,08 -1,78

RSR-1754 AC1644 APSRGENAGPATLTGA -4,68 -3,32 1,06 0,19 -1,40 -1,50 -0,17

RSR-1819 AC1645 ESGRAANTGPPTLTAP 1,20 0,79 -0,70 -3,41 -5,64 -4,67 -6,92

RSR-1832 AC1646 NPGRAANEGPPGLPGS -3,62 0,58 0,81 -4,39 -6,64 -4,67 -6,48

RSR-1855 AC1647 ESSRAANLTPPELTGP -0,08 -1,62 0,77 -3,07 -3,47 -4,67 -2,92

RSR-1911 AC1648 ASGRAANETPPGLTGA 0,99 2,20 0,56 -1,29 -3,84 -1,39 -3,11

RSR-1929 AC1649 NSGRGENLGAPGLTGT -1,68 ND ND ND ND -3,08 ND

RSR-1951 AC1650 TTGRAANLTPAGLTGP 1,94 2,57 0,39 0,09 -0,09 0,13 -0,42

RSR-2295 AC1761 EAGRSANHTPAGLTGP 0,40 1,48 0,01 1,20 0,35 0,13 0,97

RSR-2298 AC1762 ESGRAANTTPAGLTGP 1,01 0,86 0,55 1,24 0,24 0,07 1,03

RSR-2038 AC1679 TTGRATEAANLTPAGLTGP 4,75 1,00 0,81 0,86 0,10 0,15 0,27

RSR-2072 AC1680 TTGRAEEAANLTPAGLTGP 0,00 -0,49 1,00 0,86 0,11 -0,12 0,27

RSR-2089 AC1681 TTGRAGEAANLTPAGLTGP 3,91 2,05 0,32 0,85 0,02 -0,04 0,27

RSR-2302 AC1682 TTGRATEAANATPAGLTGP 4,73 0,65 0,00 0,74 -0,48 -0,35 0,10

RSR-3047 AC1697 TTGRAGEAEGATSAGATGP

RSR-3052 AC1698 TTGEAGEAANATSAGATGP

RSR-3043 AC1699 TTGEAGEAAGLTPAGLTGP

RSR-3041 AC1700 TTGAAGEAANATPAGLTGP

RSR-3044 AC1701 TTGRAGEAAGLTPAGLTGP

RSR-3057 AC1702 TTGRAGEAANATSAGATGP

RSR-3058 AC1703 TTGEAGEAAGATSAGATGP

RSR-2485 AC1763 ESGRAANTEPPELGAG 0,61 -0,90 0,15 -5,82 -6,27 -5,36 -5,64

RSR-2486 AC1764 ESGRAANTAPEGLTGP 1,03 0,24 0,95 0,30 0,37 -0,33 -0,74

RSR-2488 AC1688 EPGRAANHEPSGLTEG -3,27 -1,21 -1,30 -0,73 -0,91 -1,86 -0,88

RSR-2599 AC1706 ESGRAANHTGAPPGGLTGP 1,70 1,02 0,36 0,68 -1,49 -0,71 -2,04

RSR-2706 AC1716 TTGRTGEGANATPGGLTGP 0,07 0,83 1,17 -0,04 -2,25 -2,25 0,00

RSR-2707 AC1717 RTGRSGEAANETPEGLEGP 1,95 3,25 0,96 -1,96 -2,75 -5,00 -1,39

RSR-2708 AC1718 RTGRTGESANETPAGLGGP 1,24 3,25 0,88 -0,37 -3,55 -4,00 -0,49

RSR-2709 AC1719 STGRTGEPANETPAGLSGP -0,14 0,38 0,40 0,35 -1,03 -1,68 1,86

RSR-2710 AC1720 TTGRAGEPANATPTGLSGP -0,21 2,04 0,56 0,15 -3,23 -1,83 -0,07

RSR-2711 AC1721 RTGRPGEGANATPTGLPGP 0,58 3,22 1,45 -6,04 -5,55 -5,00 -4,39

RSR-2712 AC1722 RTGRGGEAANATPSGLGGP 0,86 3,15 1,21 -0,34 -3,97 -2,68 -1,58

RSR-2713 AC1723 STGRSGESANATPGGLGGP 0,96 2,22 0,78 -5,04 -5,25 -5,25 -3,32

RSR-2714 AC1724 RTGRTGEEANATPAGLPGP 0,83 3,23 0,96 -4,46 -5,55 -5,00 -4,39

RSR-2715 AC1725 ATGRPGEPANTTPEGLEGP -4,32 -3,17 0,46 -1,34 -1,93 -1,93 -1,32

RSR-2716 AC1726 STGRSGEPANATPGGLTGP 1,00 2,41 0,51 -0,46 -3,55 -2,68 -1,22

RSR-2717 AC1727 PTGRGGEGANTTPTGLPGP -0,21 1,54 1,28 -6,04 -5,55 -5,00 -4,39

RSR-2718 AC1728 PTGRSGEGANATPSGLTGP 1,54 3,40 1,29 1,30 -0,20 -0,20 1,63

RSR-2719 AC1729 TTGRASEGANSTPAPLTEP 0,26 1,15 1,30 -1,46 -0,16 -0,16 1,68

RSR-2720 AC1730 TYGRAAEAANTTPAGLTAP -1,65 2,14 1,21 0,56 0,45 0,21 2,25

RSR-2721 AC1731 TTGRATEGANATPAELTEP 0,77 -0,85 1,25 -2,44 0,00 -4,91 -3,75

RSR-2722 AC1732 TVGRASEEANTTPASLTGP -1,74 -1,17 0,39 1,08 1,00 1,00 2,14

RSR-2723 AC1733 TTGRAPEAANATPAPLTGP -0,42 -3,17 1,32 0,76 0,66 0,66 2,17

RSR-2724 AC1734 TWGRATEPANATPAPLTSP -4,32 1,00 0,55 0,81 0,42 0,42 2,58

RSR-2725 AC1735 TVGRASESANATPAELTSP -4,32 -0,17 0,86 -0,02 0,45 -1,74 -2,17

RSR-2726 AC1736 TVGRAPEGANSTPAGLTGP -4,32 -3,17 1,39 1,22 0,24 0,24 2,10

RSR-2727 AC1737 TWGRATEAPNLEPATLTTP -4,32 0,00 -0,30 -0,50 0,17 -3,91 -1,95

RSR-2728 AC1738 TTGRATEAPNLTPAPLTEP 0,32 0,83 -0,61 -0,80 0,45 0,45 2,00

RSR-2729 AC1739 TQGRATEAPNLSPAALTSP -4,52 1,73 0,37 1,75 0,93 0,93 2,85

RSR-2730 AC1740 TQGRAAEAPNLTPATLTAP -2,20 2,73 0,22 1,19 0,51 0,51 1,29

RSR-2731 AC1741 TSGRAPEATNLAPAPLTGP -1,72 -2,70 1,22 1,57 0,92 0,92 2,32

RSR-2732 AC1742 TQGRAAEAANLTPAGLTEP -2,52 2,49 1,44 0,32 -0,21 -0,21 2,29

RSR-2733 AC1743 TTGRAGSAPNLPPTGLTTP 1,09 2,91 0,32 0,48 -2,32 -2,32 -3,17

RSR-2734 AC1744 TTGRAGGAENLPPEGLTAP 0,83 2,00 0,66 0,55 0,55 0,55 1,83

RSR-2735 AC1745 TTSRAGTATNLTPEGLTAP 0,38 2,34 0,32 0,48 0,26 0,26 2,12

RSR-2736 AC1746 TTGRAGTATNLPPSGLTTP 1,03 2,91 0,17 1,34 -1,10 -1,10 1,42

RSR-2737 AC1747 TTARAGEAENLSPSGLTAP -0,20 0,30 0,37 1,57 -0,03 -0,03 2,35

RSR-2738 AC1748 TTGRAGGAGNLAPGGLTEP 1,68 3,37 1,03 -1,32 -1,65 -2,10 -1,05

RSR-2739 AC1749 TTGRAGTATNLPPEGLTGP 1,49 3,43 0,31 -0,12 0,71 -0,58 -0,67

RSR-2740 AC1750 TTGRAGGAANLAPTGLTEP 1,77 3,38 1,49 -1,02 -0,75 -1,32 -0,43

RSR-2741 AC1751 TTGRAGTAENLAPSGLTTP 0,68 3,10 0,56 0,58 -0,51 -0,91 0,42

RSR-2742 AC1752 TTGRAGSATNLGPGGLTGP 1,43 3,42 0,51 -0,27 -3,23 -2,32 -0,17

RSR-2743 AC1753 TTARAGGAENLTPAGLTEP 1,63 2,19 0,78 -0,50 -0,13 -2,58 1,18

RSR-2744 AC1754 TTARAGSAENLSPSGLTGP 1,04 2,32 0,65 0,59 0,00 -0,15 0,49

RSR-2745 AC1755 TTARAGGAGNLAPEGLTTP 1,12 2,77 0,40 -0,77 -0,58 -2,28 -1,00

RSR-2746 AC1756 TTSRAGAAENLTPTGLTGP -0,81 1,54 0,18 0,42 -0,85 -1,50 -0,26

RSR-2747 AC1757 TYGRTTTPGNEPPASLEAE -1,49 1,26 0,06 -0,20 -0,36 -2,77 -2,10

RSR-2748 AC1758 TYSRGESGPNEPPPGLTGP -4,81 -2,32 -0,76 -0,28 -2,68 -2,28 -2,91

RSR-2749 AC1759 AWGRTGASENETPAPLGGE -4,81 3,15 0,24 -1,28 -3,91 -5,09 -2,58

RSR-2750 AC1760 RWGRAETTPNTPPEGLETE -1,49 3,28 -0,29 -3,17 -3,91 -5,09 -4,91

RSR-2751 AC1765 ESGRAANHTGAEPPELGAG 1,04 0,37 0,40 -1,59 -5,67 -5,26 -4,93

RSR-2754 AC1801 TTGRAGEAANLTPAGLTES -0,15 -0,82 -3,61 0,45 RSR-2755 AC1802 TTGRAGEAANLTPAALTES 0,06 0,29 -2,91 0,62 RSR-2756 AC1803 TTGRAGEAANLTPAPLTES -0,58 -0,39 -2,58 0,49 RSR-2757 AC1804 TTGRAGEAANLTPEPLTES -1,59 -0,27 -1,89 -0,52 RSR-2758 AC1805 TTGRAGEAANLTPAGLTGA 0,70 -0,43 0,17 0,85 RSR-2759 AC1806 TTGRAGEAANLTPEGLTGA 0,04 -0,72 -1,06 -0,18 RSR-2760 AC1807 TTGRAGEAANLTPEPLTGA -0,06 -0,12 -1,90 -0,15 RSR-2761 AC1808 TTGRAGEAANLTPAGLTEA -0,06 -0,55 -3,71 0,69 RSR-2762 AC1809 TTGRAGEAANLTPEGLTEA -2,14 -0,69 -4,30 -0,59 RSR-2763 AC1810 TTGRAGEAANLTPAPLTEA -0,76 -0,31 -5,28 0,64 RSR-2764 AC1811 TTGRAGEAANLTPEPLTEA -2,18 -0,06 -5,28 -0,11 RSR-2765 AC1812 TTGRAGEAANLTPEPLTGP -0,31 0,07 -5,28 -5,63 RSR-2766 AC1813 TTGRAGEAANLTPAGLTGG 0,77 -0,61 -5,28 -5,63 RSR-2767 AC1814 TTGRAGEAANLTPEGLTGG -0,20 -0,85 -1,26 -0,25 RSR-2768 AC1815 TTGRAGEAANLTPEALTGG -0,50 0,13 -1,80 -0,43 RSR-2769 AC1816 TTGRAGEAANLTPEPLTGG -0,44 -0,26 -2,40 -0,39 RSR-2770 AC1817 TTGRAGEAANLTPAGLTEG -0,07 -0,47 -3,18 0,40 RSR-2771 AC1818 TTGRAGEAANLTPEGLTEG -3,05 -0,93 -5,28 -0,99 RSR-2772 AC1819 TTGRAGEAANLTPAPLTEG -0,53 -0,24 -2,19 0,39 RSR-2773 AC1820 TTGRAGEAANLTPEPLTEG -3,80 -0,42 -5,28 -0,81 BSRS-1 AC1601 LSGRSDNHSPLGLAGS 0,89 1,94 0,10 -0,67 -2,12 -0,50 -1,92 ND = Não determinado Exemplo 44: Digestão competitiva usando RSR-1517 as controle interno

[451] Esse ensaio competitivo é desenvolvido para minimizar qualquer variabilidade na concentração de enzima ou condição de reação entre reações em diferentes frascos dentro do mesmo experimento. A fim de resolver tanto o substrato de controle quanto o RS de interesse no mesmo exemplo, novos plasmídeos de controle são construídos.

1. Clonagem molecular de controle interno contendo RSR- 1517

[452] Dois plasmídeos de controle interno, AC1830 (HD2-V5-AE144-RSR-1517-XTEN288) e AC1840 (HD2-V5-AE144-RSR- 1517-XTEN432), são construídos de forma similar ao AC1611 descrito no Exemplo 39, com a única diferença mp comprimento do XTEN do terminal-C.

2. Digestão enzimática

[453] A solução de substrato 2x é preparada por misturação e diluição de AC1830 ou AC1840 purificados e do RS de interesse em tampão de ensaio, de modo que as concentrações finais de substratos individuais sejam de 6 µM. Uma mistura principal de enzima é preparada de modo que, após misturação 1:1 com solução de substrato 2x, o volume de reação total seja de 20 µl, a concentração final de substrato de cada componente seja 3 µM e a proporção de enzima-para- substrato seja como selecionada no desenvolvimento do ensaio. A reação é incubada a 37°C por 2 horas, antes de interrompida por procedimentos como descritos acima.

3. Cálculo da eficiência de clivagem relativa

[454] A mistura de reação é analisada por SDS-PAGE não redutora 4-12%. Como o controle interno e o substrato de interesse possuem pesos moleculares diferentes, uma vez clivados, quatro bandas devem ser visíveis na mesma raia da amostra. A percentagem de clivagem para ambos pode ser calculada e a eficiência de clivagem relativa pode ser derivada pela mesma fórmula no Exemplo 43:

[455] A única diferença agora é que ambos os valores são calculados da mistura de reação no mesmo frasco, enquanto previamente de duas reações que compartilham a mesma mistura de enzimas.

[456] Conclusões: Esperamos que esse ensaio de digestão competitiva com RSR-1517 como controle interno tenha menos variabilidade de ensaio-para-ensaio, quando comparamos com o ensaio descrito no Exemplo 43. Pretendemos adotar esse método para avaliação futura do Segmento de liberação. Exemplo 45: Construção de moléculas de ProTIA com dois sítios de liberação.

[457] A fim de gerar um ProTIA com um XTEN tanto no terminal-N quanto no terminal-C, o XTEN292 foi amplificado por PCR por um plasmídeo usando iniciadores que incluem uma região de homologia 5’ de 17-21 bp para o arcabouço DNA no terminal-N e para um sítio de liberação não-clivável (RSR3028, seqüência de aminoácidos TTGEAGEAAGATSAGATGP) no terminal-C. Um segundo conjunto de produtos de PCR que codificam a cadeia leve e parte da cadeia pesada do anticorpo anti-EpCAM 4D5MOCB foi amplificado usando iniciadores que incluíam uma região de homologia 5’ de 16-21 bp para RSR3058 no terminal-N e a cadeia pesada de 4D5MOCB no terminal-C. Esses fragmentos de PCR foram clonados em um vetor do arcabouço digerido com BsiWI-SacII que codifica o restante da cadeia pesada de 4D5MOCB/scFv anti-CD3 em tandem, uma segunda cópia do sítio de liberação não-clivável de RSR3058 e XTEN867 com um tag de afinidade 6xHIS usando o “In-Fusion Plasmid Assembly Kit” (Takara Bio). O vetor final codifica a molécula de ProTIA com os componentes (no terminal-N para o terminal-C) de XTEN292, o RSR3058 não-clivável, scFv biespecífico anti-EpCAM-anti-CD3 em tandem com RSR3058 fundido ao XTEN_867 com um tag de afinidade 6xHIS sob o controle de um promotor de PhoA e líder de secreção STII. A construção resultante é AC1886 com a seqüência de DNA e seqüência de aminoácidos codificada fornecidas na Tabela 18.

[458] AC1886 foi usado como um modelo para criar duas construções de ProTIA que codificam XTEN292, o segmento de liberação clivável RSR2295, scFv biespecífico anti-EpCAM- anti-CD3 em tandem com RSR2295 fundido ao XTEN_868. Ambos os plasmídeos utilizavam dois produtos de PCR comuns usando AC1886 como um modelo; o primeiro que codifica um tag de afinidade 6xHIS e XTEN292 com uma região de homologia 5’ para o arcabouço do vetor e a região de homologia 3’ que codifica o primeiro RSR2295, o segundo que codifica o scFv biespecífico anti-EpCAM-anti-CD3 em tandem com regiões de homologia 5’ e 3’ que codificam os segmentos 5’ e 3’ de RSR2295 dos scFvs em tandem. O terceiro fragmento é diferente entre as duas construções. O terceiro fragmento para AC1955 codificava XTEN868 e o tag de afinidade C-Tag (seqüência de aminoácidos EPEA) com uma região de homologia 5’ que codifica o segundo RSR2295 e uma região de homologia 3’ para o vetor do arcabouço. O terceiro fragmento para AC1954 codificava XTEN866 e um tag de afinidade 6xHIS com uma região de homologia 5’ que codifica o segundo RSR2295 e uma região de homologia 3’ para o vetor do arcabouço. Tanto para AC1955 quanto para AC1954, os três fragmentos de PCR foram clonados em AC1886 que havia sido digerido com BsiWI-NotI usando o “In-Fusion Plasmid Assembly Kit”. O vetor final AC1955 codifica a molécula de ProTIA com os componentes (no terminal-N para o terminal-C) de tag de afinidade 6xHIS, XTEN292, RSR2295, scFv biespecífico anti-EpCAM-anti-CD3 em tandem, RSR2295, XTEN868 e um tag de afinidade C-Tag sob o controle de um promotor de PhoA e líder de secreção STII com a seqüência de DNA e a seqüência de aminoácidos codificada fornecidas na Tabela 18. O vetor final AC1954 codifica a molécula de ProTIA com os componentes (no terminal-N para o terminal-C) de tag de afinidade 6xHIS, XTEN292, RSR2295, scFv biespecífico anti-EpCAM-anti-CD3 em tandem, RSR2295, XTEN866 e um tag de afinidade 6xHIS sob o controle de um promotor de PhoA e líder de secreção STII com a seqüência de DNA e seqüência de aminoácidos codificada fornecidas na Tabela 11. As construções de ProTIA com segmentos de liberação ou scFvs tumor-específicos diferentes foram clonadas por digestão de AC1954 ou AC1955 com DraIII-BtsI, seguido por clonagem mediada por “In-Fusion” de produtos de PCR contendo a estrutura sítio de liberação-scFv de tumor- scFv anti-CD3-sítio de liberação com regiões de homologia 5’ de 17-20 bp para o XTEN292 e regiões de homologia 3’ para o XTEN do terminal-C. AC1954 foi usado como um arcabouço para a produção das construções AC1948, AC1952 e AC1969. AC1955 foi usado como um arcabouço para a produção das construções AC1972, AC1976, AC2009, AC2078, AC2084 e as seqüências dessas construções são fornecidas na Tabela 12. Tabela 18: Seqüência de DNA e de aminoácidos de construções de ProTIA do Exemplo 45. Nome da Seqüência de Seqüência de DNA construção aminoácidos* AC1886 TTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGATAAGCTTTAATGCGGTAGTTTA SPAGSPTSTEEGTSES

TCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGGCACCGTGTATGAAATCTAACA ATPESGPGTSTEPSEG

Nome da Seqüência de Seqüência de DNA construção aminoácidos*

ATGCGCTCATCGTCATCCTCGGCACCGTCACCCTGGATGCTGTAGGCAT SAPGTSESATPESGPG AGGCTTGGTTATGCCGGTACTGCCGGGCCTCTTGCGGGATATCGTCCAT SEPATSGSETPGTSES TCCGACAGCATCGCCAGTCACTATGGCGTGCTGCTCGCGCTATATGCGT ATPESGPGSEPATSGS TGATGCAATTTCTATGCGCACCCGTTCTCGGAGCACTGTCCGACCGCTT ETPGTSESATPESGPG TGGCCGCCGCCCAGTCCTGCTCGCTTCGCTACTTGGAGCCACTATCGAC TSTEPSEGSAPGSPAG TACGCGATCATGGCGACCACACCCGTCCTGTGGATCCTCTACGCCGGAC SPTSTEEGTSESATPE GCATCGTGGCCGGCATCACCGGCGCCACAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTA SGPGSEPATSGSETPG TATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTC TSESATPESGPGSPAG ATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTGGCAGGCCCCGTGGCCGGGG SPTSTEEGSPAGSPTS GACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATGCACCATTCCTTGCGGCGGCGGT TEEGTSTEPSEGSAPG GCTCAACGGCCTCAACCTACTACTGGGCTGCTTCCTAATGCAGGAGTCG TSESATPESGPGTSES CATAAGGGAGAGCGTCGACCGATGCCCTTGAGAGCCTTCAACCCAGTCA ATPESGPGTSESATPE GCTCCTTCCGGTGGGCGCGGGGCATGACTATCGTCGCCGCACTTATGAC SGPGSEPATSGSETPG TGTCTTCTTTATCATGCAACTCGTAGGACAGGTGCCGGCAGCGCTCTGG SEPATSGSETPGSPAG GTCATTTTCGGCGAGGACCGCTTTCGCTGGAGCGCGACGATGATCGGCC SPTSTEEGTSTEPSEG TGTCGCTTGCGGTATTCGGAATCTTGCACGCCCTCGCTCAAGCCTTCGT SAPGTSTEPSEGSAPG CACTGGTCCCGCCACCAAACGTTTCGGCGAGAAGCAGGCCATTATCGCC GSAPTTGEAGEAAGAT GGCATGGCGGCCGACGCGCTGGGCTACGTCTTGCTGGCGTTCGCGACGC SAGATGPATSGSETPG GAGGCTGGATGGCCTTCCCCATTATGATTCTTCTCGCTTCCGGCGGCAT TDIQMTQSPSSLSASV CGGGATGCCCGCGTTGCAGGCCATGCTGTCCAGGCAGGTAGATGACGAC GDRVTITCRSTKSLLH CATCAGGGACAGCTTCAAGGATCGCTCGCGGCTCTTACCAGCCTAACTT SNGITYLYWYQQKPGK CGATCATTGGACCGCTGATCGTCACGGCGATTTATGCCGCCTCGGCGAG APKLLIYQMSNLASGV CACATGGAACGGGTTGGCATGGATTGTAGGCGCCGCCCTATACCTTGTC PSRFSSSGSGTDFTLT TGCCTCCCCGCGTTGCGTCGCGGTGCATGGAGCCGGGCCACCTCGACCT ISSLQPEDFATYYCAQ GAATGGAAGCCGGCGGCACCTCGCTAACGGATTCACCACTCCAAGAATT NLEIPRTFGQGTKVEI GGAGCCAATCAATTCTTGCGGAGAACTGTGAATGCGCAAACCAACCCTT KGATPPETGAETESPG GGCAGAACATATCCATCGCGTCCGCCATCTCCAGCAGCCGCACGCGGCG ETTGGSAESEPPGEGQ CATCTCGGGCAGCGTTGGGTCCTGGCCACGGGTGCGCATGATCGTGCTC VQLVQSGPGLVQPGGS

Nome da Seqüência de Seqüência de DNA construção aminoácidos*

CTGTCGTTGAGGACCCGGCTAGGCTGGCGGGGTTGCCTTACTGGTTAGC VRISCAASGYTFTNYG AGAATGAATCACCGATACGCGAGCGAACGTGAAGCGACTGCTGCTGCAA MNWVKQAPGKGLEWMG AACGTCTGCGACCTGAGCAACAACATGAATGGTCTTCGGTTTCCGTGTT WINTYTGESTYADSFK TCGTAAAGTCTGGAAACGCGGAAGTCAGCGCCCTGCACCATTATGTTCC GRFTFSLDTSASAAYL GGATCTGCATCGCAGGATGCTGCTGGCTACCCTGTGGAACACCTACATC QINSLRAEDTAVYYCA TGTATTAACGAAGCGCTGGCATTGACCCTGAGTGATTTTTCTCTGGTCC RFAIKGDYWGQGTLLT CGCCGCATCCATACCGCCAGTTGTTTACCCTCACAACGTTCCAGTAACC VSSGGGGSDIQMTQSP GGGCATGTTCATCATCAGTAACCCGTATCGTGAGCATCCTCTCTCGTTT SSLSASVGDRVTITCR CATCGGTATCATTACCCCCATGAACAGAAATCCCCCTTACACGGAGGCA ASQDIRNYLNWYQQKP TCAGTGACCAAACAGGAAAAAACCGCCCTTAACATGGCCCGCTTTATCA GKAPKLLIYYTSRLES GAAGCCAGACATTAACGCTTCTGGAGAAACTCAACGAGCTGGACGCGGA GVPSRFSGSGSGTDYT TGAACAGGCAGACATCTGTGAATCGCTTCACGACCACGCTGATGAGCTT LTISSLQPEDFATYYC TACCGCAGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGAC QQGNTLPWTFGQGTKV ACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGG EIKGATPPETGAETES GAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGG PGETTGGSAESEPPGE GGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATACTGGCT GEVQLVESGGGLVQPG TAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCACATGCGG GSLRLSCAASGYSFTG TGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCT YTMNWVRQAPGKGLEW CTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCG VALINPYKGVSTYNQK GCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAA FKDRFTISVDKSKNTA TCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGG YLQMNSLRAEDTAVYY CCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCG CARSGYYGDSDWYFDV CCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGA WGQGTLVTVSSGTAEA AACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCC ASASGTTGEAGEAAGA TCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGC TSAGATGPSPGSPAGS CTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGG PTSTEEGTSESATPES TATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACG GPGTSTEPSEGSAPGS AACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCT PAGSPTSTEEGTSTEP

Nome da Seqüência de Seqüência de DNA construção aminoácidos*

TGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACT SEGSAPGTSTEPSEGS GGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCT APGTSESATPESGPGS TGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTAT EPATSGSETPGSEPAT CTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCT SGSETPGSPAGSPTST TGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCA EEGTSESATPESGPGT AGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGAT STEPSEGSAPGTSTEP CTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGG SEGSAPGSPAGSPTST ATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAA EEGTSTEPSEGSAPGT ATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTG STEPSEGSAPGTSESA GTCTGACAGTTAATTAAGAAAGTTAATCTTTTCAACAGCTGTCATAAAG TPESGPGTSTEPSEGS TTGTCACGGCCGAGACTTATAGTCGCTTTGTTTTTATTTTTTAATGTAT APGTSESATPESGPGS TTGTAACTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTATCTAGACATATGAA EPATSGSETPGTSTEP GAAAAACATCGCTTTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCT SEGSAPGTSTEPSEGS ACAAACGCGTACGCTTCCCCAGCAGGCAGCCCGACCAGCACCGAGGAGG APGTSESATPESGPGT GTACGAGCGAGTCGGCTACTCCAGAGAGCGGTCCGGGTACCTCTACGGA SESATPESGPGSPAGS ACCGTCCGAAGGTAGCGCTCCAGGCACGTCTGAAAGCGCGACGCCGGAA PTSTEEGTSESATPES AGCGGTCCAGGCAGCGAGCCGGCGACCTCCGGTAGCGAAACGCCTGGTA GPGSEPATSGSETPGT CCTCGGAGTCAGCGACTCCGGAAAGCGGTCCGGGTAGCGAACCTGCAAC SESATPESGPGTSTEP GAGCGGTAGCGAGACTCCAGGCACTAGCGAATCCGCAACTCCGGAGTCG SEGSAPGTSTEPSEGS GGTCCGGGCACCTCTACGGAGCCTAGCGAGGGCTCAGCACCAGGTAGCC APGTSTEPSEGSAPGT CTGCAGGTTCCCCGACGTCAACCGAGGAAGGTACAAGCGAAAGCGCCAC STEPSEGSAPGTSTEP CCCTGAGTCGGGCCCTGGCAGCGAACCGGCAACTAGCGGCAGCGAGACT SEGSAPGTSTEPSEGS CCGGGTACCAGCGAGTCTGCTACGCCAGAGAGCGGCCCAGGTTCGCCAG APGSPAGSPTSTEEGT CGGGTTCGCCGACTAGCACGGAGGAGGGCAGCCCAGCGGGTAGCCCGAC STEPSEGSAPGTSESA CAGCACTGAGGAGGGTACGTCCACCGAACCGAGCGAAGGTAGCGCACCA TPESGPGSEPATSGSE GGTACCTCCGAGTCTGCCACCCCTGAATCCGGTCCAGGTACCAGCGAAT TPGTSESATPESGPGS CAGCCACCCCGGAGTCGGGTCCAGGTACGAGCGAATCTGCTACCCCGGA EPATSGSETPGTSESA ATCCGGCCCAGGCAGCGAACCTGCTACTAGCGGCAGCGAAACGCCGGGC TPESGPGTSTEPSEGS

Nome da Seqüência de Seqüência de DNA construção aminoácidos*

AGCGAACCTGCCACGTCAGGCAGCGAGACGCCGGGTTCCCCTGCAGGCT APGTSESATPESGPGS CCCCGACCAGCACTGAGGAGGGCACCTCCACCGAACCATCAGAAGGTAG PAGSPTSTEEGSPAGS CGCGCCTGGTACGTCAACCGAACCTTCCGAGGGCAGCGCACCGGGTGGC PTSTEEGSPAGSPTST TCAGCGCCTACTACAGGGGAGGCGGGGGAAGCAGCAGGGGCGACTTCTG EEGTSESATPESGPGT CTGGGGCTACCGGCCCCGCTACCTCAGGCTCCGAAACCCCGGGCACCGA STEPSEGSAPGTSESA TATCCAGATGACCCAGAGCCCTTCTTCCCTGTCCGCATCCGTCGGCGAT TPESGPGSEPATSGSE CGTGTCACGATTACCTGTCGCAGCACTAAGAGCCTGCTGCACTCAAACG TPGTSESATPESGPGS GTATCACGTACCTGTACTGGTACCAGCAGAAGCCGGGCAAAGCGCCGAA EPATSGSETPGTSESA GCTGCTGATTTATCAGATGAGCAACCTGGCATCGGGCGTGCCGAGCCGT TPESGPGTSTEPSEGS TTCAGCAGCAGCGGTAGCGGTACCGACTTCACGCTGACCATCAGCTCGT APGSPAGSPTSTEEGT TGCAGCCAGAGGACTTTGCGACGTACTATTGTGCGCAAAACTTGGAAAT SESATPESGPGSEPAT TCCGCGCACCTTCGGCCAGGGTACGAAAGTTGAGATTAAAGGTGCCACC SGSETPGTSESATPES CCACCGGAGACTGGTGCAGAAACCGAGTCTCCGGGCGAAACCACGGGCG GPGSPAGSPTSTEEGS GTAGCGCGGAGAGCGAACCGCCTGGTGAGGGTCAAGTTCAATTGGTTCA PAGSPTSTEEGTSTEP GAGCGGTCCGGGTCTGGTTCAACCGGGCGGCAGCGTGCGCATTTCTTGT SEGSAPGTSESATPES GCGGCCAGCGGTTACACCTTTACGAACTACGGTATGAATTGGGTGAAAC GPGTSESATPESGPGT AAGCTCCGGGCAAAGGTCTGGAGTGGATGGGTTGGATCAATACCTATAC SESATPESGPGSEPAT CGGTGAATCCACTTACGCGGATTCCTTTAAGGGCCGTTTCACCTTCAGC SGSETPGSEPATSGSE CTGGACACGAGCGCGAGCGCTGCATATCTGCAAATCAATAGCCTGCGTG TPGSPAGSPTSTEEGT CCGAAGATACCGCGGTGTACTATTGCGCGCGTTTTGCAATCAAGGGCGA STEPSEGSAPGTSTEP CTATTGGGGTCAAGGCACGCTGCTGACCGTGAGCAGCGGTGGTGGCGGC SEGSAPGSEPATSGSE AGCGATATCCAAATGACCCAATCCCCATCCTCCCTGTCTGCAAGCGTTG TPGTSESATPESGPGT GTGATCGTGTGACGATTACGTGCCGTGCCTCCCAAGATATCCGTAACTA STEPSEGSAPGHHHHH CCTGAATTGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAGGCTCCGAAATTGCTGATC H TACTACACCAGCCGCCTGGAGTCGGGTGTGCCTAGCCGCTTCAGCGGCA GCGGTTCGGGTACCGACTATACCTTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGA AGATTTCGCGACGTATTACTGCCAACAGGGTAACACGCTGCCGTGGACC TTTGGCCAAGGTACCAAAGTCGAGATTAAGGGTGCGACCCCGCCGGAAA

Nome da Seqüência de Seqüência de DNA construção aminoácidos*

CCGGTGCGGAAACCGAGAGCCCGGGTGAAACGACTGGCGGCTCTGCAGA GAGCGAGCCGCCAGGTGAGGGCGAAGTCCAACTGGTCGAGTCTGGTGGC GGCCTGGTGCAACCGGGTGGCAGCCTGCGTCTGAGCTGCGCTGCGAGCG GCTATAGCTTTACCGGTTATACCATGAACTGGGTTCGCCAGGCACCGGG TAAGGGTCTGGAATGGGTGGCGCTGATCAATCCGTACAAAGGTGTGAGC ACTTACAATCAGAAATTCAAAGACCGTTTCACCATTAGCGTTGACAAGA GCAAGAATACCGCGTATCTGCAGATGAACAGCTTGCGCGCCGAGGATAC GGCCGTTTACTACTGTGCACGTAGCGGCTATTACGGTGACAGCGACTGG TACTTTGACGTCTGGGGTCAGGGCACGCTGGTCACCGTTAGCAGCGGCA CCGCCGAAGCAGCTAGCGCCTCTGGCACGACTGGTGAAGCCGGAGAGGC AGCTGGCGCGACCTCAGCGGGGGCTACTGGGCCTTCTCCAGGTAGCCCA GCTGGTAGCCCAACCTCTACCGAAGAAGGTACCTCTGAATCCGCTACTC CAGAATCCGGTCCTGGTACTAGCACTGAGCCAAGCGAAGGTTCTGCTCC AGGCTCCCCGGCAGGTAGCCCTACCTCTACCGAAGAGGGCACTAGCACC GAACCATCTGAGGGTTCCGCTCCTGGCACCTCCACTGAACCGTCCGAAG GCAGTGCTCCGGGTACTTCCGAAAGCGCAACTCCGGAATCCGGCCCTGG TTCTGAGCCTGCTACTTCCGGCTCTGAAACTCCAGGTAGCGAGCCAGCG ACTTCTGGTTCTGAAACTCCAGGTTCACCGGCGGGTAGCCCGACGAGCA CGGAGGAAGGTACCTCTGAGTCGGCCACTCCTGAGTCCGGTCCGGGCAC GAGCACCGAGCCGAGCGAGGGTTCAGCCCCGGGTACCAGCACGGAGCCG TCCGAGGGTAGCGCACCGGGTTCTCCGGCGGGCTCCCCTACGTCTACGG AAGAGGGTACGTCCACTGAACCTAGCGAGGGCAGCGCGCCAGGCACCAG CACTGAACCGAGCGAAGGCAGCGCACCTGGCACTAGCGAGTCTGCGACT CCGGAGAGCGGTCCGGGTACGAGCACGGAACCAAGCGAAGGCAGCGCCC CAGGTACCTCTGAATCTGCTACCCCAGAATCTGGCCCGGGTTCCGAGCC AGCTACCTCTGGTTCTGAAACCCCAGGTACTTCCACTGAACCAAGCGAA GGTAGCGCTCCTGGCACTTCTACTGAACCATCCGAAGGTTCCGCTCCTG GTACGTCTGAAAGCGCTACCCCTGAAAGCGGCCCAGGCACCTCTGAAAG

Nome da Seqüência de Seqüência de DNA construção aminoácidos*

CGCTACTCCTGAGAGCGGTCCAGGCTCTCCAGCAGGTTCTCCAACCTCC ACTGAAGAAGGCACCTCTGAGTCTGCTACCCCTGAATCTGGTCCTGGCT CCGAACCTGCTACCTCTGGTTCCGAAACTCCAGGTACCTCGGAATCTGC GACTCCGGAATCTGGCCCGGGCACGAGCACGGAGCCGTCTGAGGGTAGC GCACCAGGTACCAGCACTGAGCCTTCTGAGGGCTCTGCACCGGGTACCT CCACGGAACCTTCGGAAGGTTCTGCGCCGGGTACCTCCACTGAGCCATC CGAGGGTTCAGCACCAGGTACTAGCACGGAACCGTCCGAGGGCTCTGCA CCAGGTACGAGCACCGAACCGTCGGAGGGTAGCGCTCCAGGTAGCCCAG CGGGCTCTCCGACAAGCACCGAAGAAGGCACCAGCACCGAGCCGTCCGA AGGTTCCGCACCAGGTACAAGCGAGAGCGCGACTCCTGAATCTGGTCCG GGTAGCGAGCCTGCAACCAGCGGTTCTGAGACGCCGGGCACTTCCGAAT CTGCGACCCCGGAGTCCGGTCCAGGTTCAGAGCCGGCGACGAGCGGTTC GGAAACGCCGGGTACGTCTGAATCAGCCACGCCGGAGTCTGGTCCGGGT ACCTCGACCGAACCAAGCGAAGGTTCGGCACCGGGTACTAGCGAGAGCG CAACCCCTGAAAGCGGTCCGGGCAGCCCGGCAGGTTCTCCAACCAGCAC CGAAGAAGGTTCCCCTGCTGGTAGCCCGACCTCTACGGAGGAAGGTAGC CCTGCAGGTTCCCCAACTTCTACTGAGGAAGGTACTTCTGAGTCCGCTA CCCCAGAAAGCGGTCCTGGTACCTCCACTGAACCGTCTGAAGGCTCTGC ACCAGGCACTTCTGAGTCTGCTACTCCAGAAAGCGGCCCAGGTTCTGAA CCAGCAACTTCTGGCTCTGAGACTCCAGGCACTTCTGAGTCCGCAACGC CTGAATCCGGTCCTGGTTCTGAACCAGCTACTTCCGGCAGCGAAACCCC AGGTACCTCTGAGTCTGCGACTCCAGAGTCTGGTCCTGGTACTTCCACT GAGCCTAGCGAGGGTTCCGCACCAGGTTCTCCGGCTGGTAGCCCGACCA GCACGGAGGAGGGTACGTCTGAATCTGCAACGCCGGAATCGGGCCCAGG TTCGGAGCCTGCAACGTCTGGCAGCGAAACCCCGGGTACCTCCGAATCT GCTACACCGGAAAGCGGTCCTGGCAGCCCTGCTGGTTCTCCAACCTCTA CCGAGGAGGGTTCACCGGCAGGTAGCCCGACTAGCACTGAAGAAGGTAC TAGCACGGAGCCGAGCGAGGGTAGTGCTCCGGGTACGAGCGAGAGCGCA

Nome da Seqüência de Seqüência de DNA construção aminoácidos*

ACGCCAGAGAGCGGTCCAGGCACCAGCGAATCGGCCACCCCTGAGAGCG GCCCAGGTACTTCTGAGAGCGCCACTCCTGAATCCGGCCCTGGTAGCGA GCCGGCAACCTCCGGCTCAGAAACTCCTGGTTCGGAACCAGCGACCAGC GGTTCTGAAACTCCGGGTAGCCCGGCAGGCAGCCCAACGAGCACCGAAG AGGGTACCAGCACGGAACCGAGCGAGGGTTCTGCCCCGGGTACTTCCAC CGAACCATCGGAGGGCTCTGCACCTGGTAGCGAACCTGCGACGTCTGGT TCTGAAACGCCGGGTACCAGCGAAAGCGCTACCCCAGAATCCGGTCCGG GCACTAGCACCGAGCCATCGGAGGGCTCCGCACCAGGTCACCATCATCA CCATCACTAAACTAGTTAAAAGCATGCGGCCGCCTAGCATAACCCCTTG GGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGTTGGCGCGCCGGAAATA CAGGAACGCACGCTGGATGGCCCTTCGCTGGGATGGTGAAACCATGAAA AATGGCAGCTTCAGTGGATTAAGTGGGGGTAATGTGGCCTGTACCCTCT GGTTGCATAGGTATTCATACGGTTAAAATTTATCAGGCGCGATCGCGGC AGTTTTTCGGGTGGTTTGTTGCCATTTTTACCTGTCTGCTGCCGTGATC GCGCTGAACGCGTTTTAGCGGTGCGTACAATTAAGGGATTATGGTAAAT

CCACTTACTGTCTGCCCTCGTAGCCATCGAA AC1955 ATGAAGAAAAACATCGCTTTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTA HHHHHHSPAGSPTSTE

TTGCTACAAACGCGTACGCTCACCATCATCACCATCACTCCCCAGCAGG EGTSESATPESGPGTS CAGCCCGACCAGCACCGAGGAGGGTACGAGCGAGTCGGCTACTCCAGAG TEPSEGSAPGTSESAT AGCGGTCCGGGTACCTCTACGGAACCGTCCGAAGGTAGCGCTCCAGGCA PESGPGSEPATSGSET CGTCTGAAAGCGCGACGCCGGAAAGCGGTCCAGGCAGCGAGCCGGCGAC PGTSESATPESGPGSE CTCCGGTAGCGAAACGCCTGGTACCTCGGAGTCAGCGACTCCGGAAAGC PATSGSETPGTSESAT GGTCCGGGTAGCGAACCTGCAACGAGCGGTAGCGAGACTCCAGGCACTA PESGPGTSTEPSEGSA GCGAATCCGCAACTCCGGAGTCGGGTCCGGGCACCTCTACGGAGCCTAG PGSPAGSPTSTEEGTS CGAGGGCTCAGCACCAGGTAGCCCTGCAGGTTCCCCGACGTCAACCGAG ESATPESGPGSEPATS GAAGGTACAAGCGAAAGCGCCACCCCTGAGTCGGGCCCTGGCAGCGAAC GSETPGTSESATPESG CGGCAACTAGCGGCAGCGAGACTCCGGGTACCAGCGAGTCTGCTACGCC PGSPAGSPTSTEEGSP AGAGAGCGGCCCAGGTTCGCCAGCGGGTTCGCCGACTAGCACGGAGGAG AGSPTSTEEGTSTEPS

Nome da Seqüência de Seqüência de DNA construção aminoácidos*

GGCAGCCCAGCGGGTAGCCCGACCAGCACTGAGGAGGGTACGTCCACCG EGSAPGTSESATPESG AACCGAGCGAAGGTAGCGCACCAGGTACCTCCGAGTCTGCCACCCCTGA PGTSESATPESGPGTS ATCCGGTCCAGGTACCAGCGAATCAGCCACCCCGGAGTCGGGTCCAGGT ESATPESGPGSEPATS ACGAGCGAATCTGCTACCCCGGAATCCGGCCCAGGCAGCGAACCTGCTA GSETPGSEPATSGSET CTAGCGGCAGCGAAACGCCGGGCAGCGAACCTGCCACGTCAGGCAGCGA PGSPAGSPTSTEEGTS GACGCCGGGTTCCCCTGCAGGCTCCCCGACCAGCACTGAGGAGGGCACC TEPSEGSAPGTSTEPS TCCACCGAACCATCAGAAGGTAGCGCGCCTGGTACGTCAACCGAACCTT EGSAPGGSAPEAGRSA CCGAGGGCAGCGCACCGGGTGGCTCAGCGCCTGAGGCAGGTCGTTCTGC NHTPAGLTGPATSGSE TAACCATACCCCAGCGGGGCTGACTGGGCCTGCTACCTCAGGCTCCGAA TPGTDIQMTQSPSSLS ACCCCGGGCACCGACATCCAAATGACCCAGAGCCCGAGCAGCCTGAGCG ASVGDRVTITCQASQD CGAGCGTGGGCGACCGTGTTACCATCACCTGCCAAGCGAGCCAAGACAT ISNYLNWYQQKPGKAP CAGCAACTACCTGAACTGGTATCAGCAAAAGCCGGGCAAAGCGCCGAAG KLLIYDASNLETGVPS CTGCTGATCTACGACGCGAGCAACCTGGAAACCGGTGTGCCGAGCCGTT RFSGSGSGTDFTFTIS TCAGCGGTAGCGGTAGCGGTACCGATTTCACCTTTACCATCAGCAGCCT SLQPEDIATYFCQHFD GCAACCGGAGGACATCGCGACCTATTTCTGCCAGCACTTTGATCACCTG HLPLAFGGGTKVEIKG CCGCTGGCGTTTGGTGGCGGTACCAAAGTTGAGATTAAAGGTGCAACGC ATPPETGAETESPGET CTCCGGAGACTGGTGCTGAAACTGAGTCCCCGGGCGAGACGACCGGTGG TGGSAESEPPGEGQVQ CTCTGCTGAATCCGAACCACCGGGCGAAGGCCAGGTGCAACTGCAGGAA LQESGPGLVKPSETLS AGCGGTCCGGGCCTGGTTAAACCGAGCGAAACCCTGAGCCTGACCTGCA LTCTVSGGSVSSGDYY CCGTGAGCGGCGGTAGCGTTAGCAGCGGTGACTACTATTGGACCTGGAT WTWIRQSPGKGLEWIG CCGTCAAAGCCCGGGTAAAGGCCTGGAGTGGATCGGTCACATTTACTAT HIYYSGNTNYNPSLKS AGCGGCAACACCAACTACAACCCGAGCCTGAAGAGCCGTCTGACCATCA RLTISIDTSKTQFSLK GCATTGACACCAGCAAAACCCAGTTCAGCCTGAAACTGAGCAGCGTGAC LSSVTAADTAIYYCVR CGCGGCGGATACCGCGATTTACTATTGCGTTCGTGATCGTGTTACCGGC DRVTGAFDIWGQGTMV GCGTTCGACATCTGGGGTCAGGGCACCATGGTTACCGTTAGCAGCGGTG TVSSGGGGSELVVTQE GTGGCGGCAGCGAGTTAGTTGTGACCCAAGAGCCGAGCCTGACCGTTAG PSLTVSPGGTVTLTCR CCCGGGTGGTACGGTCACCCTGACGTGCCGTAGCAGCACCGGTGCGGTC SSTGAVTTSNYANWVQ ACGACCAGCAACTATGCCAATTGGGTCCAGCAGAAACCGGGTCAAGCAC QKPGQAPRGLIGGTNK

Nome da Seqüência de Seqüência de DNA construção aminoácidos*

CGCGTGGCCTGATCGGCGGCACCAATAAACGTGCCCCGGGTACTCCTGC RAPGTPARFSGSLLGG GCGTTTCTCCGGTAGCCTGCTGGGCGGCAAAGCCGCTCTGACCCTGAGC KAALTLSGVQPEDEAE GGTGTCCAGCCGGAAGATGAAGCGGAGTACTACTGCGCGCTGTGGTATT YYCALWYSNLWVFGGG CCAATCTGTGGGTTTTTGGCGGCGGTACCAAGCTGACCGTATTGGGTGC TKLTVLGATPPETGAE TACGCCACCGGAGACTGGCGCAGAAACGGAAAGCCCGGGTGAGACTACG TESPGETTGGSAESEP GGTGGCTCTGCGGAGAGCGAACCTCCGGGTGAGGGTGAGGTCCAACTGC PGEGEVQLLESGGGLV TGGAGTCTGGTGGTGGCCTGGTTCAACCGGGTGGCTCGTTGAAGCTGAG QPGGSLKLSCAASGFT CTGTGCAGCTAGCGGCTTTACCTTCAACACCTATGCGATGAATTGGGTT FNTYAMNWVRQAPGKG CGTCAGGCACCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTGGCGCGTATCCGCTCCA LEWVARIRSKYNNYAT AGTACAACAACTACGCGACCTACTACGCGGATAGCGTTAAAGACCGCTT YYADSVKDRFTISRDD CACGATTAGCCGTGACGATTCCAAGAATACGGCATATCTGCAAATGAAC SKNTAYLQMNNLKTED AATCTGAAAACCGAAGATACCGCGGTGTATTACTGTGTGCGCCACGGCA TAVYYCVRHGNFGNSY ATTTCGGCAACAGCTACGTGAGCTGGTTTGCATATTGGGGTCAGGGCAC VSWFAYWGQGTLVTVS CCTGGTTACGGTGAGCTCCGGCACCGCCGAAGCAGCTAGCGCCTCTGGC SGTAEAASASGEAGRS GAGGCAGGTCGTTCTGCTAACCATACCCCAGCGGGGCTGACTGGGCCTC ANHTPAGLTGPPGSPA CAGGTAGCCCAGCTGGTAGCCCAACCTCTACCGAAGAAGGTACCTCTGA GSPTSTEEGTSESATP ATCCGCTACTCCAGAATCCGGTCCTGGTACTAGCACTGAGCCAAGCGAA ESGPGTSTEPSEGSAP GGTTCTGCTCCAGGCTCCCCGGCAGGTAGCCCTACCTCTACCGAAGAGG GSPAGSPTSTEEGTST GCACTAGCACCGAACCATCTGAGGGTTCCGCTCCTGGCACCTCCACTGA EPSEGSAPGTSTEPSE ACCGTCCGAAGGCAGTGCTCCGGGTACTTCCGAAAGCGCAACTCCGGAA GSAPGTSESATPESGP TCCGGCCCTGGTTCTGAGCCTGCTACTTCCGGCTCTGAAACTCCAGGTA GSEPATSGSETPGSEP GCGAGCCAGCGACTTCTGGTTCTGAAACTCCAGGTTCACCGGCGGGTAG ATSGSETPGSPAGSPT CCCGACGAGCACGGAGGAAGGTACCTCTGAGTCGGCCACTCCTGAGTCC STEEGTSESATPESGP GGTCCGGGCACGAGCACCGAGCCGAGCGAGGGTTCAGCCCCGGGTACCA GTSTEPSEGSAPGTST GCACGGAGCCGTCCGAGGGTAGCGCACCGGGTTCTCCGGCGGGCTCCCC EPSEGSAPGSPAGSPT TACGTCTACGGAAGAGGGTACGTCCACTGAACCTAGCGAGGGCAGCGCG STEEGTSTEPSEGSAP CCAGGCACCAGCACTGAACCGAGCGAAGGCAGCGCACCTGGCACTAGCG GTSTEPSEGSAPGTSE AGTCTGCGACTCCGGAGAGCGGTCCGGGTACGAGCACGGAACCAAGCGA SATPESGPGTSTEPSE

Nome da Seqüência de Seqüência de DNA construção aminoácidos*

AGGCAGCGCCCCAGGTACCTCTGAATCTGCTACCCCAGAATCTGGCCCG GSAPGTSESATPESGP GGTTCCGAGCCAGCTACCTCTGGTTCTGAAACCCCAGGTACTTCCACTG GSEPATSGSETPGTST AACCAAGCGAAGGTAGCGCTCCTGGCACTTCTACTGAACCATCCGAAGG EPSEGSAPGTSTEPSE TTCCGCTCCTGGTACGTCTGAAAGCGCTACCCCTGAAAGCGGCCCAGGC GSAPGTSESATPESGP ACCTCTGAAAGCGCTACTCCTGAGAGCGGTCCAGGCTCTCCAGCAGGTT GTSESATPESGPGSPA CTCCAACCTCCACTGAAGAAGGCACCTCTGAGTCTGCTACCCCTGAATC GSPTSTEEGTSESATP TGGTCCTGGCTCCGAACCTGCTACCTCTGGTTCCGAAACTCCAGGTACC ESGPGSEPATSGSETP TCGGAATCTGCGACTCCGGAATCTGGCCCGGGCACGAGCACGGAGCCGT GTSESATPESGPGTST CTGAGGGTAGCGCACCAGGTACCAGCACTGAGCCTTCTGAGGGCTCTGC EPSEGSAPGTSTEPSE ACCGGGTACCTCCACGGAACCTTCGGAAGGTTCTGCGCCGGGTACCTCC GSAPGTSTEPSEGSAP ACTGAGCCATCCGAGGGTTCAGCACCAGGTACTAGCACGGAACCGTCCG GTSTEPSEGSAPGTST AGGGCTCTGCACCAGGTACGAGCACCGAACCGTCGGAGGGTAGCGCTCC EPSEGSAPGTSTEPSE AGGTAGCCCAGCGGGCTCTCCGACAAGCACCGAAGAAGGCACCAGCACC GSAPGSPAGSPTSTEE GAGCCGTCCGAAGGTTCCGCACCAGGTACAAGCGAGAGCGCGACTCCTG GTSTEPSEGSAPGTSE AATCTGGTCCGGGTAGCGAGCCTGCAACCAGCGGTTCTGAGACGCCGGG SATPESGPGSEPATSG CACTTCCGAATCTGCGACCCCGGAGTCCGGTCCAGGTTCAGAGCCGGCG SETPGTSESATPESGP ACGAGCGGTTCGGAAACGCCGGGTACGTCTGAATCAGCCACGCCGGAGT GSEPATSGSETPGTSE CTGGTCCGGGTACCTCGACCGAACCAAGCGAAGGTTCGGCACCGGGTAC SATPESGPGTSTEPSE TAGCGAGAGCGCAACCCCTGAAAGCGGTCCGGGCAGCCCGGCAGGTTCT GSAPGTSESATPESGP CCAACCAGCACCGAAGAAGGTTCCCCTGCTGGTAGCCCGACCTCTACGG GSPAGSPTSTEEGSPA AGGAAGGTAGCCCTGCAGGTTCCCCAACTTCTACTGAGGAAGGTACTTC GSPTSTEEGSPAGSPT TGAGTCCGCTACCCCAGAAAGCGGTCCTGGTACCTCCACTGAACCGTCT STEEGTSESATPESGP GAAGGCTCTGCACCAGGCACTTCTGAGTCTGCTACTCCAGAAAGCGGCC GTSTEPSEGSAPGTSE CAGGTTCTGAACCAGCAACTTCTGGCTCTGAGACTCCAGGCACTTCTGA SATPESGPGSEPATSG GTCCGCAACGCCTGAATCCGGTCCTGGTTCTGAACCAGCTACTTCCGGC SETPGTSESATPESGP AGCGAAACCCCAGGTACCTCTGAGTCTGCGACTCCAGAGTCTGGTCCTG GSEPATSGSETPGTSE GTACTTCCACTGAGCCTAGCGAGGGTTCCGCACCAGGTTCTCCGGCTGG SATPESGPGTSTEPSE TAGCCCGACCAGCACGGAGGAGGGTACGTCTGAATCTGCAACGCCGGAA GSAPGSPAGSPTSTEE

Nome da Seqüência de Seqüência de DNA construção aminoácidos*

TCGGGCCCAGGTTCGGAGCCTGCAACGTCTGGCAGCGAAACCCCGGGTA GTSESATPESGPGSEP CCTCCGAATCTGCTACACCGGAAAGCGGTCCTGGCAGCCCTGCTGGTTC ATSGSETPGTSESATP TCCAACCTCTACCGAGGAGGGTTCACCGGCAGGTAGCCCGACTAGCACT ESGPGSPAGSPTSTEE GAAGAAGGTACTAGCACGGAGCCGAGCGAGGGTAGTGCTCCGGGTACGA GSPAGSPTSTEEGTST GCGAGAGCGCAACGCCAGAGAGCGGTCCAGGCACCAGCGAATCGGCCAC EPSEGSAPGTSESATP CCCTGAGAGCGGCCCAGGTACTTCTGAGAGCGCCACTCCTGAATCCGGC ESGPGTSESATPESGP CCTGGTAGCGAGCCGGCAACCTCCGGCTCAGAAACTCCTGGTTCGGAAC GTSESATPESGPGSEP CAGCGACCAGCGGTTCTGAAACTCCGGGTAGCCCGGCAGGCAGCCCAAC ATSGSETPGSEPATSG GAGCACCGAAGAGGGTACCAGCACGGAACCGAGCGAGGGTTCTGCCCCG SETPGSPAGSPTSTEE GGTACTTCCACCGAACCATCGGAGGGCTCTGCACCTGGTAGCGAACCTG GTSTEPSEGSAPGTST CGACGTCTGGTTCTGAAACGCCGGGTACCAGCGAAAGCGCTACCCCAGA EPSEGSAPGSEPATSG ATCCGGTCCGGGCACTAGCACCGAGCCATCGGAGGGCGCCGCAGAACCA SETPGTSESATPESGP GAGGCG GTSTEPSEGSAPGEPE

A AC2009 ATGAAGAAAAACATCGCTTTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTA HHHHHHSPAGSPTSTE

TTGCTACAAACGCGTACGCTCACCATCATCACCATCACTCCCCAGCAGG EGTSESATPESGPGTS CAGCCCGACCAGCACCGAGGAGGGTACGAGCGAGTCGGCTACTCCAGAG TEPSEGSAPGTSESAT AGCGGTCCGGGTACCTCTACGGAACCGTCCGAAGGTAGCGCTCCAGGCA PESGPGSEPATSGSET CGTCTGAAAGCGCGACGCCGGAAAGCGGTCCAGGCAGCGAGCCGGCGAC PGTSESATPESGPGSE CTCCGGTAGCGAAACGCCTGGTACCTCGGAGTCAGCGACTCCGGAAAGC PATSGSETPGTSESAT GGTCCGGGTAGCGAACCTGCAACGAGCGGTAGCGAGACTCCAGGCACTA PESGPGTSTEPSEGSA GCGAATCCGCAACTCCGGAGTCGGGTCCGGGCACCTCTACGGAGCCTAG PGSPAGSPTSTEEGTS CGAGGGCTCAGCACCAGGTAGCCCTGCAGGTTCCCCGACGTCAACCGAG ESATPESGPGSEPATS GAAGGTACAAGCGAAAGCGCCACCCCTGAGTCGGGCCCTGGCAGCGAAC GSETPGTSESATPESG CGGCAACTAGCGGCAGCGAGACTCCGGGTACCAGCGAGTCTGCTACGCC PGSPAGSPTSTEEGSP AGAGAGCGGCCCAGGTTCGCCAGCGGGTTCGCCGACTAGCACGGAGGAG AGSPTSTEEGTSTEPS GGCAGCCCAGCGGGTAGCCCGACCAGCACTGAGGAGGGTACGTCCACCG EGSAPGTSESATPESG

Nome da Seqüência de Seqüência de DNA construção aminoácidos*

AACCGAGCGAAGGTAGCGCACCAGGTACCTCCGAGTCTGCCACCCCTGA PGTSESATPESGPGTS ATCCGGTCCAGGTACCAGCGAATCAGCCACCCCGGAGTCGGGTCCAGGT ESATPESGPGSEPATS ACGAGCGAATCTGCTACCCCGGAATCCGGCCCAGGCAGCGAACCTGCTA GSETPGSEPATSGSET CTAGCGGCAGCGAAACGCCGGGCAGCGAACCTGCCACGTCAGGCAGCGA PGSPAGSPTSTEEGTS GACGCCGGGTTCCCCTGCAGGCTCCCCGACCAGCACTGAGGAGGGCACC TEPSEGSAPGTSTEPS TCCACCGAACCATCAGAAGGTAGCGCGCCTGGTACGTCAACCGAACCTT EGSAPGGSAPEAGRSA CCGAGGGCAGCGCACCGGGTGGCTCAGCGCCTGAGGCAGGTCGTTCTGC NHTPAGLTGPATSGSE TAACCATACCCCTGCAGGATTAACTGGCCCCGCCACCAGCGGGAGCGAG TPGTDIQMTQSPSSLS ACCCCCGGGACTGATATTCAGATGACCCAGAGCCCGTCCTCCCTGAGCG ASVGDRVTITCRASQD CTTCTGTTGGCGACCGCGTGACCATCACCTGCCGTGCTTCCCAGGATGT VNTAVAWYQQKPGKAP TAACACCGCTGTAGCTTGGTATCAACAGAAACCGGGCAAAGCACCGAAA KLLIYSASFLYSGVPS CTGCTGATCTACTCTGCTTCCTTTCTGTATAGCGGTGTTCCGTCTCGTT RFSGSRSGTDFTLTIS TCAGCGGCTCTCGTAGCGGTACGGATTTTACTCTGACGATCAGCTCTCT SLQPEDFATYYCQQHY GCAGCCGGAGGACTTCGCTACCTACTACTGCCAGCAGCACTACACCACC TTPPTFGQGTKVEIKG CCGCCTACCTTTGGTCAGGGCACCAAAGTGGAAATCAAGGGTGCAACGC ATPPETGAETESPGET CTCCGGAGACTGGTGCTGAAACTGAGTCCCCGGGCGAGACGACCGGTGG TGGSAESEPPGEGEVQ CTCTGCTGAATCCGAACCACCGGGCGAAGGCGAGGTCCAGCTGGTTGAG LVESGGGLVQPGGSLR TCTGGCGGCGGTCTGGTCCAACCTGGTGGCTCCCTGCGCCTGTCTTGCG LSCAASGFNIKDTYIH CAGCGTCCGGCTTTAATATCAAAGATACGTACATTCACTGGGTCCGCCA WVRQAPGKGLEWVARI GGCACCGGGCAAAGGCCTGGAATGGGTTGCTCGTATCTACCCGACTAAC YPTNGYTRYADSVKGR GGTTATACCCGTTATGCAGACAGCGTAAAGGGTCGCTTCACGATCTCCG FTISADTSKNTAYLQM CGGATACCTCCAAAAACACCGCATACCTGCAAATGAACTCTCTGCGTGC NSLRAEDTAVYYCSRW GGAAGATACTGCCGTGTACTACTGCTCTCGCTGGGGCGGTGACGGTTTC GGDGFYAMDYWGQGTL TATGCAATGGACTACTGGGGTCAAGGTACTCTGGTAACTGTTTCCTCTG VTVSSGGGGSELVVTQ GTGGTGGCGGCAGCGAACTGGTCGTCACGCAGGAGCCGTCCCTTACCGT EPSLTVSPGGTVTLTC TTCACCAGGTGGAACAGTGACTCTGACGTGTCGCTCCTCCACTGGGGCG RSSTGAVTTSNYANWV GTTACAACTTCCAATTATGCTAATTGGGTCCAGCAGAAGCCGGGCCAAG QQKPGQAPRGLIGGTN CCCCTCGCGGGTTGATTGGCGGCACCAACAAACGTGCTCCAGGGACACC KRAPGTPARFSGSLLG

Nome da Seqüência de Seqüência de DNA construção aminoácidos*

TGCCCGTTTTTCGGGCTCCTTATTGGGGGGCAAAGCTGCACTGACGTTG GKAALTLSGVQPEDEA TCTGGAGTTCAGCCGGAGGATGAGGCAGAGTATTACTGCGCATTGTGGT EYYCALWYSNLWVFGG ATTCTAATTTATGGGTTTTTGGAGGCGGCACAAAGCTGACCGTCCTGGG GTKLTVLGATPPETGA TGCGACCCCGCCGGAAACCGGTGCGGAAACCGAAAGCCCGGGTGAAACC ETESPGETTGGSAESE ACCGGTGGCAGCGCGGAGAGCGAACCGCCGGGTGAAGGTGAGGTTCAGT PPGEGEVQLLESGGGL TGTTGGAAAGCGGGGGCGGGCTTGTCCAACCTGGAGGTTCATTAAAATT VQPGGSLKLSCAASGF GAGCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAACACGTATGCAATGAACTGG TFNTYAMNWVRQAPGK GTCCGTCAAGCGCCCGGTAAGGGGCTGGAGTGGGTAGCTCGCATCCGCT GLEWVARIRSKYNNYA CGAAGTATAATAATTACGCAACCTACTACGCAGACAGTGTCAAAGATCG TYYADSVKDRFTISRD CTTCACTATCTCACGCGACGACAGTAAGAACACGGCCTACTTACAGATG DSKNTAYLQMNNLKTE AACAATCTTAAAACGGAGGACACCGCTGTCTACTACTGCGTGCGCCACG DTAVYYCVRHGNFGNS GGAATTTCGGTAACTCTTATGTAAGTTGGTTCGCATATTGGGGACAAGG YVSWFAYWGQGTLVTV TACGTTGGTAACCGTATCCAGCGGGACTGCTGAGGCGGCTAGCGCCTCC SSGTAEAASASGEAGR GGAGAAGCTGGAAGAAGCGCCAATCACACACCAGCTGGACTTACAGGCC SANHTPAGLTGPPGSP CGCCTGGTAGCCCCGCGGGGAGCCCTACAAGCACTGAGGAGGGCACATC AGSPTSTEEGTSESAT TGAGTCCGCTACCCCTGAGAGTGGACCCGGGACAAGCACTGAGCCTAGC PESGPGTSTEPSEGSA GAAGGAAGCGCACCAGGTTCCCCCGCTGGGAGCCCCACAAGCACAGAAG PGSPAGSPTSTEEGTS AGGGAACTTCTACCGAGCCCTCTGAGGGCTCAGCCCCTGGAACTAGCAC TEPSEGSAPGTSTEPS AGAGCCCTCCGAAGGCAGTGCACCGGGTACTTCCGAAAGCGCAACTCCG EGSAPGTSESATPESG GAATCCGGCCCTGGTTCTGAGCCTGCTACTTCCGGCTCTGAAACTCCAG PGSEPATSGSETPGSE GTAGCGAGCCAGCGACTTCTGGTTCTGAAACTCCAGGTTCACCGGCGGG PATSGSETPGSPAGSP TAGCCCGACGAGCACGGAGGAAGGTACCTCTGAGTCGGCCACTCCTGAG TSTEEGTSESATPESG TCCGGTCCGGGCACGAGCACCGAGCCGAGCGAGGGTTCAGCCCCGGGTA PGTSTEPSEGSAPGTS CCAGCACGGAGCCGTCCGAGGGTAGCGCACCGGGTTCTCCGGCGGGCTC TEPSEGSAPGSPAGSP CCCTACGTCTACGGAAGAGGGTACGTCCACTGAACCTAGCGAGGGCAGC TSTEEGTSTEPSEGSA GCGCCAGGCACCAGCACTGAACCGAGCGAAGGCAGCGCACCTGGCACTA PGTSTEPSEGSAPGTS GCGAGTCTGCGACTCCGGAGAGCGGTCCGGGTACGAGCACGGAACCAAG ESATPESGPGTSTEPS CGAAGGCAGCGCCCCAGGTACCTCTGAATCTGCTACCCCAGAATCTGGC EGSAPGTSESATPESG

Nome da Seqüência de Seqüência de DNA construção aminoácidos*

CCGGGTTCCGAGCCAGCTACCTCTGGTTCTGAAACCCCAGGTACTTCCA PGSEPATSGSETPGTS CTGAACCAAGCGAAGGTAGCGCTCCTGGCACTTCTACTGAACCATCCGA TEPSEGSAPGTSTEPS AGGTTCCGCTCCTGGTACGTCTGAAAGCGCTACCCCTGAAAGCGGCCCA EGSAPGTSESATPESG GGCACCTCTGAAAGCGCTACTCCTGAGAGCGGTCCAGGCTCTCCAGCAG PGTSESATPESGPGSP GTTCTCCAACCTCCACTGAAGAAGGCACCTCTGAGTCTGCTACCCCTGA AGSPTSTEEGTSESAT ATCTGGTCCTGGCTCCGAACCTGCTACCTCTGGTTCCGAAACTCCAGGT PESGPGSEPATSGSET ACCTCGGAATCTGCGACTCCGGAATCTGGCCCGGGCACGAGCACGGAGC PGTSESATPESGPGTS CGTCTGAGGGTAGCGCACCAGGTACCAGCACTGAGCCTTCTGAGGGCTC TEPSEGSAPGTSTEPS TGCACCGGGTACCTCCACGGAACCTTCGGAAGGTTCTGCGCCGGGTACC EGSAPGTSTEPSEGSA TCCACTGAGCCATCCGAGGGTTCAGCACCAGGTACTAGCACGGAACCGT PGTSTEPSEGSAPGTS CCGAGGGCTCTGCACCAGGTACGAGCACCGAACCGTCGGAGGGTAGCGC TEPSEGSAPGTSTEPS TCCAGGTAGCCCAGCGGGCTCTCCGACAAGCACCGAAGAAGGCACCAGC EGSAPGSPAGSPTSTE ACCGAGCCGTCCGAAGGTTCCGCACCAGGTACAAGCGAGAGCGCGACTC EGTSTEPSEGSAPGTS CTGAATCTGGTCCGGGTAGCGAGCCTGCAACCAGCGGTTCTGAGACGCC ESATPESGPGSEPATS GGGCACTTCCGAATCTGCGACCCCGGAGTCCGGTCCAGGTTCAGAGCCG GSETPGTSESATPESG GCGACGAGCGGTTCGGAAACGCCGGGTACGTCTGAATCAGCCACGCCGG PGSEPATSGSETPGTS AGTCTGGTCCGGGTACCTCGACCGAACCAAGCGAAGGTTCGGCACCGGG ESATPESGPGTSTEPS TACTAGCGAGAGCGCAACCCCTGAAAGCGGTCCGGGCAGCCCGGCAGGT EGSAPGTSESATPESG TCTCCAACCAGCACCGAAGAAGGTTCCCCTGCTGGTAGCCCGACCTCTA PGSPAGSPTSTEEGSP CGGAGGAAGGTAGCCCTGCAGGTTCCCCAACTTCTACTGAGGAAGGTAC AGSPTSTEEGSPAGSP TTCTGAGTCCGCTACCCCAGAAAGCGGTCCTGGTACCTCCACTGAACCG TSTEEGTSESATPESG TCTGAAGGCTCTGCACCAGGCACTTCTGAGTCTGCTACTCCAGAAAGCG PGTSTEPSEGSAPGTS GCCCAGGTTCTGAACCAGCAACTTCTGGCTCTGAGACTCCAGGCACTTC ESATPESGPGSEPATS TGAGTCCGCAACGCCTGAATCCGGTCCTGGTTCTGAACCAGCTACTTCC GSETPGTSESATPESG GGCAGCGAAACCCCAGGTACCTCTGAGTCTGCGACTCCAGAGTCTGGTC PGSEPATSGSETPGTS CTGGTACTTCCACTGAGCCTAGCGAGGGTTCCGCACCAGGTTCTCCGGC ESATPESGPGTSTEPS TGGTAGCCCGACCAGCACGGAGGAGGGTACGTCTGAATCTGCAACGCCG EGSAPGSPAGSPTSTE GAATCGGGCCCAGGTTCGGAGCCTGCAACGTCTGGCAGCGAAACCCCGG EGTSESATPESGPGSE

Nome da Seqüência de Seqüência de DNA construção aminoácidos*

GTACCTCCGAATCTGCTACACCGGAAAGCGGTCCTGGCAGCCCTGCTGG PATSGSETPGTSESAT TTCTCCAACCTCTACCGAGGAGGGTTCACCGGCAGGTAGCCCGACTAGC PESGPGSPAGSPTSTE ACTGAAGAAGGTACTAGCACGGAGCCGAGCGAGGGTAGTGCTCCGGGTA EGSPAGSPTSTEEGTS CGAGCGAGAGCGCAACGCCAGAGAGCGGTCCAGGCACCAGCGAATCGGC TEPSEGSAPGTSESAT CACCCCTGAGAGCGGCCCAGGTACTTCTGAGAGCGCCACTCCTGAATCC PESGPGTSESATPESG GGCCCTGGTAGCGAGCCGGCAACCTCCGGCTCAGAAACTCCTGGTTCGG PGTSESATPESGPGSE AACCAGCGACCAGCGGTTCTGAAACTCCGGGTAGCCCGGCAGGCAGCCC PATSGSETPGSEPATS AACGAGCACCGAAGAGGGTACCAGCACGGAACCGAGCGAGGGTTCTGCC GSETPGSPAGSPTSTE CCGGGTACTTCCACCGAACCATCGGAGGGCTCTGCACCTGGTAGCGAAC EGTSTEPSEGSAPGTS CTGCGACGTCTGGTTCTGAAACGCCGGGTACCAGCGAAAGCGCTACCCC TEPSEGSAPGSEPATS AGAATCCGGTCCGGGCACTAGCACCGAGCCATCGGAGGGCGCCGCAGAA GSETPGTSESATPESG

CCAGAGGCG PGTSTEPSEGAAEPEA AC1948 ATGAAGAAAAACATCGCTTTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTA SPAGSPTSTEEGTSES

TTGCTACAAACGCGTACGCTTCCCCAGCAGGCAGCCCGACCAGCACCGA ATPESGPGTSTEPSEG GGAGGGTACGAGCGAGTCGGCTACTCCAGAGAGCGGTCCGGGTACCTCT SAPGTSESATPESGPG ACGGAACCGTCCGAAGGTAGCGCTCCAGGCACGTCTGAAAGCGCGACGC SEPATSGSETPGTSES CGGAAAGCGGTCCAGGCAGCGAGCCGGCGACCTCCGGTAGCGAAACGCC ATPESGPGSEPATSGS TGGTACCTCGGAGTCAGCGACTCCGGAAAGCGGTCCGGGTAGCGAACCT ETPGTSESATPESGPG GCAACGAGCGGTAGCGAGACTCCAGGCACTAGCGAATCCGCAACTCCGG TSTEPSEGSAPGSPAG AGTCGGGTCCGGGCACCTCTACGGAGCCTAGCGAGGGCTCAGCACCAGG SPTSTEEGTSESATPE TAGCCCTGCAGGTTCCCCGACGTCAACCGAGGAAGGTACAAGCGAAAGC SGPGSEPATSGSETPG GCCACCCCTGAGTCGGGCCCTGGCAGCGAACCGGCAACTAGCGGCAGCG TSESATPESGPGSPAG AGACTCCGGGTACCAGCGAGTCTGCTACGCCAGAGAGCGGCCCAGGTTC SPTSTEEGSPAGSPTS GCCAGCGGGTTCGCCGACTAGCACGGAGGAGGGCAGCCCAGCGGGTAGC TEEGTSTEPSEGSAPG CCGACCAGCACTGAGGAGGGTACGTCCACCGAACCGAGCGAAGGTAGCG TSESATPESGPGTSES CACCAGGTACCTCCGAGTCTGCCACCCCTGAATCCGGTCCAGGTACCAG ATPESGPGTSESATPE CGAATCAGCCACCCCGGAGTCGGGTCCAGGTACGAGCGAATCTGCTACC SGPGSEPATSGSETPG

Nome da Seqüência de Seqüência de DNA construção aminoácidos*

CCGGAATCCGGCCCAGGCAGCGAACCTGCTACTAGCGGCAGCGAAACGC SEPATSGSETPGSPAG CGGGCAGCGAACCTGCCACGTCAGGCAGCGAGACGCCGGGTTCCCCTGC SPTSTEEGTSTEPSEG AGGCTCCCCGACCAGCACTGAGGAGGGCACCTCCACCGAACCATCAGAA SAPGTSTEPSEGSAPG GGTAGCGCGCCTGGTACGTCAACCGAACCTTCCGAGGGCAGCGCACCGG GSAPEAGRSANHTPAG GTGGCTCAGCGCCTGAGGCAGGTCGTTCTGCTAACCATACCCCAGCGGG LTGPATSGSETPGTDI GCTGACTGGGCCTGCTACCTCAGGCTCCGAAACCCCGGGCACCGATATC QMTQSPSSLSASVGDR CAGATGACCCAGAGCCCTTCTTCCCTGTCCGCATCCGTCGGCGATCGTG VTITCRSTKSLLHSNG TCACGATTACCTGTCGCAGCACTAAGAGCCTGCTGCACTCAAACGGTAT ITYLYWYQQKPGKAPK CACGTACCTGTACTGGTACCAGCAGAAGCCGGGCAAAGCGCCGAAGCTG LLIYQMSNLASGVPSR CTGATTTATCAGATGAGCAACCTGGCATCGGGCGTGCCGAGCCGTTTCA FSSSGSGTDFTLTISS GCAGCAGCGGTAGCGGTACCGACTTCACGCTGACCATCAGCTCGTTGCA LQPEDFATYYCAQNLE GCCAGAGGACTTTGCGACGTACTATTGTGCGCAAAACTTGGAAATTCCG IPRTFGQGTKVEIKGA CGCACCTTCGGCCAGGGTACGAAAGTTGAGATTAAAGGTGCCACCCCAC TPPETGAETESPGETT CGGAGACTGGTGCAGAAACCGAGTCTCCGGGCGAAACCACGGGCGGTAG GGSAESEPPGEGQVQL CGCGGAGAGCGAACCGCCTGGTGAGGGTCAAGTTCAATTGGTTCAGAGC VQSGPGLVQPGGSVRI GGTCCGGGTCTGGTTCAACCGGGCGGCAGCGTGCGCATTTCTTGTGCGG SCAASGYTFTNYGMNW CCAGCGGTTACACCTTTACGAACTACGGTATGAATTGGGTGAAACAAGC VKQAPGKGLEWMGWIN TCCGGGCAAAGGTCTGGAGTGGATGGGTTGGATCAATACCTATACCGGT TYTGESTYADSFKGRF GAATCCACTTACGCGGATTCCTTTAAGGGCCGTTTCACCTTCAGCCTGG TFSLDTSASAAYLQIN ACACGAGCGCGAGCGCTGCATATCTGCAAATCAATAGCCTGCGTGCCGA SLRAEDTAVYYCARFA AGATACCGCGGTGTACTATTGCGCGCGTTTTGCAATCAAGGGCGACTAT IKGDYWGQGTLLTVSS TGGGGTCAAGGCACGCTGCTGACCGTGAGCAGCGGTGGTGGCGGCAGCG GGGGSDIQMTQSPSSL ATATCCAGATGACCCAAAGCCCGAGCAGCCTGCCGGCGAGCCTGGGTGA PASLGDRVTINCQASQ CCGTGTGACCATCAACTGCCAGGCGAGCCAAGATATTAGCAACTACCTG DISNYLNWYQQKPGKA AACTGGTATCAGCAAAAGCCGGGCAAAGCGCCGAAGCTGCTGATTTACT PKLLIYYTNKLADGVP ATACCAACAAGCTGGCGGATGGTGTTCCGAGCCGTTTCAGCGGTAGCGG SRFSGSGSGRDSSFTI CAGCGGTCGTGACAGCAGCTTTACCATCAGCAGCCTGGAGAGCGAAGAT SSLESEDIGSYYCQQY ATTGGTAGCTACTATTGCCAACAATACTACAACTATCCGTGGACCTTCG YNYPWTFGPGTKLEIK

Nome da Seqüência de Seqüência de DNA construção aminoácidos*

GTCCGGGCACCAAACTGGAAATCAAAGGTGCGACCCCGCCGGAAACCGG GATPPETGAETESPGE TGCGGAAACCGAAAGCCCGGGTGAAACCACCGGTGGCAGCGCGGAGAGC TTGGSAESEPPGEGEV GAACCGCCGGGTGAAGGTGAAGTGCAACTGGTGGAGAGCGGTGGTGGTC QLVESGGGLVQPGKSL TGGTGCAACCGGGCAAGAGCCTGAAACTGAGCTGCGAAGCGAGCGGCTT KLSCEASGFTFSGYGM TACCTTTAGCGGTTATGGTATGCATTGGGTGCGTCAGGCGCCGGGTCGT HWVRQAPGRGLESVAY GGCCTGGAGAGCGTTGCGTACATCACCAGCAGCAGCATCAACATTAAAT ITSSSINIKYADAVKG ATGCGGACGCGGTGAAGGGCCGTTTCACCGTTAGCCGTGATAACGCGAA RFTVSRDNAKNLLFLQ AAACCTGCTGTTTCTGCAGATGAACATTCTGAAGAGCGAGGACACCGCG MNILKSEDTAMYYCAR ATGTACTATTGCGCGCGTTTCGACTGGGATAAAAACTATTGGGGTCAAG FDWDKNYWGQGTMVTV GCACCATGGTGACCGTTAGCAGCGGCACCGCCGAAGCAGCTAGCGCCTC SSGTAEAASASGEAGR TGGCGAGGCAGGTCGTTCTGCTAACCATACCCCAGCGGGGCTGACTGGG SANHTPAGLTGPPGSP CCTCCAGGTAGCCCAGCTGGTAGCCCAACCAGTACTGAAGAAGGTACCT AGSPTSTEEGTSESAT CTGAATCCGCTACTCCAGAATCCGGTCCTGGTACTAGCACTGAGCCAAG PESGPGTSTEPSEGSA CGAAGGTTCTGCTCCAGGCTCCCCGGCAGGTAGCCCTACCTCTACCGAA PGSPAGSPTSTEEGTS GAGGGCACTAGCACCGAACCATCTGAGGGTTCCGCTCCTGGCACCTCCA TEPSEGSAPGTSTEPS CTGAACCGTCCGAAGGCAGTGCTCCGGGTACTTCCGAAAGCGCAACTCC EGSAPGTSESATPESG GGAATCCGGCCCTGGTTCTGAGCCTGCTACTTCCGGCTCTGAAACTCCA PGSEPATSGSETPGSE GGTAGCGAGCCAGCGACTTCTGGTTCTGAAACTCCAGGTTCACCGGCGG PATSGSETPGSPAGSP GTAGCCCGACGAGCACGGAGGAAGGTACCTCTGAGTCGGCCACTCCTGA TSTEEGTSESATPESG GTCCGGTCCGGGCACGAGCACCGAGCCGAGCGAGGGTTCAGCCCCGGGT PGTSTEPSEGSAPGTS ACCAGCACGGAGCCGTCCGAGGGTAGCGCACCGGGTTCTCCGGCGGGCT TEPSEGSAPGSPAGSP CCCCTACGTCTACGGAAGAGGGTACGTCCACTGAACCTAGCGAGGGCAG TSTEEGTSTEPSEGSA CGCGCCAGGCACCAGCACTGAACCGAGCGAAGGCAGCGCACCTGGCACT PGTSTEPSEGSAPGTS AGCGAGTCTGCGACTCCGGAGAGCGGTCCGGGTACGAGCACGGAACCAA ESATPESGPGTSTEPS GCGAAGGCAGCGCCCCAGGTACCTCTGAATCTGCTACCCCAGAATCTGG EGSAPGTSESATPESG CCCGGGTTCCGAGCCAGCTACCTCTGGTTCTGAAACCCCAGGTACTTCC PGSEPATSGSETPGTS ACTGAACCAAGCGAAGGTAGCGCTCCTGGCACTTCTACTGAACCATCCG TEPSEGSAPGTSTEPS AAGGTTCCGCTCCTGGTACGTCTGAAAGCGCTACCCCTGAAAGCGGCCC EGSAPGTSESATPESG

Nome da Seqüência de Seqüência de DNA construção aminoácidos*

AGGCACCTCTGAAAGCGCTACTCCTGAGAGCGGTCCAGGCTCTCCAGCA PGTSESATPESGPGSP GGTTCTCCAACCTCCACTGAAGAAGGCACCTCTGAGTCTGCTACCCCTG AGSPTSTEEGTSESAT AATCTGGTCCTGGCTCCGAACCTGCTACCTCTGGTTCCGAAACTCCAGG PESGPGSEPATSGSET TACCTCGGAATCTGCGACTCCGGAATCTGGCCCGGGCACGAGCACGGAG PGTSESATPESGPGTS CCGTCTGAGGGTAGCGCACCAGGTACCAGCACTGAGCCTTCTGAGGGCT TEPSEGSAPGTSTEPS CTGCACCGGGTACCTCCACGGAACCTTCGGAAGGTTCTGCGCCGGGTAC EGSAPGTSTEPSEGSA CTCCACTGAGCCATCCGAGGGTTCAGCACCAGGTACTAGCACGGAACCG PGTSTEPSEGSAPGTS TCCGAGGGCTCTGCACCAGGTACGAGCACCGAACCGTCGGAGGGTAGCG TEPSEGSAPGTSTEPS CTCCAGGTAGCCCAGCGGGCTCTCCGACAAGCACCGAAGAAGGCACCAG EGSAPGSPAGSPTSTE CACCGAGCCGTCCGAAGGTTCCGCACCAGGTACAAGCGAGAGCGCGACT EGTSTEPSEGSAPGTS CCTGAATCTGGTCCGGGTAGCGAGCCTGCAACCAGCGGTTCTGAGACGC ESATPESGPGSEPATS CGGGCACTTCCGAATCTGCGACCCCGGAGTCCGGTCCAGGTTCAGAGCC GSETPGTSESATPESG GGCGACGAGCGGTTCGGAAACGCCGGGTACGTCTGAATCAGCCACGCCG PGSEPATSGSETPGTS GAGTCTGGTCCGGGTACCTCGACCGAACCAAGCGAAGGTTCGGCACCGG ESATPESGPGTSTEPS GTACTAGCGAGAGCGCAACCCCTGAAAGCGGTCCGGGCAGCCCGGCAGG EGSAPGTSESATPESG TTCTCCAACCAGCACCGAAGAAGGTTCCCCTGCTGGTAGCCCGACCTCT PGSPAGSPTSTEEGSP ACGGAGGAAGGTAGCCCTGCAGGTTCCCCAACTTCTACTGAGGAAGGTA AGSPTSTEEGSPAGSP CTTCTGAGTCCGCTACCCCAGAAAGCGGTCCTGGTACCTCCACTGAACC TSTEEGTSESATPESG GTCTGAAGGCTCTGCACCAGGCACTTCTGAGTCTGCTACTCCAGAAAGC PGTSTEPSEGSAPGTS GGCCCAGGTTCTGAACCAGCAACTTCTGGCTCTGAGACTCCAGGCACTT ESATPESGPGSEPATS CTGAGTCCGCAACGCCTGAATCCGGTCCTGGTTCTGAACCAGCTACTTC GSETPGTSESATPESG CGGCAGCGAAACCCCAGGTACCTCTGAGTCTGCGACTCCAGAGTCTGGT PGSEPATSGSETPGTS CCTGGTACTTCCACTGAGCCTAGCGAGGGTTCCGCACCAGGTTCTCCGG ESATPESGPGTSTEPS CTGGTAGCCCGACCAGCACGGAGGAGGGTACGTCTGAATCTGCAACGCC EGSAPGSPAGSPTSTE GGAATCGGGCCCAGGTTCGGAGCCTGCAACGTCTGGCAGCGAAACCCCG EGTSESATPESGPGSE GGTACCTCCGAATCTGCTACACCGGAAAGCGGTCCTGGCAGCCCTGCTG PATSGSETPGTSESAT GTTCTCCAACCTCTACCGAGGAGGGTTCACCGGCAGGTAGCCCGACTAG PESGPGSPAGSPTSTE CACTGAAGAAGGTACTAGCACGGAGCCGAGCGAGGGTAGTGCTCCGGGT EGSPAGSPTSTEEGTS

Nome da Seqüência de Seqüência de DNA construção aminoácidos*

ACGAGCGAGAGCGCAACGCCAGAGAGCGGTCCAGGCACCAGCGAATCGG TEPSEGSAPGTSESAT CCACCCCTGAGAGCGGCCCAGGTACTTCTGAGAGCGCCACTCCTGAATC PESGPGTSESATPESG CGGCCCTGGTAGCGAGCCGGCAACCTCCGGCTCAGAAACTCCTGGTTCG PGTSESATPESGPGSE GAACCAGCGACCAGCGGTTCTGAAACTCCGGGTAGCCCGGCAGGCAGCC PATSGSETPGSEPATS CAACGAGCACCGAAGAGGGTACCAGCACGGAACCGAGCGAGGGTTCTGC GSETPGSPAGSPTSTE CCCGGGTACTTCCACCGAACCATCGGAGGGCTCTGCACCTGGTAGCGAA EGTSTEPSEGSAPGTS CCTGCGACGTCTGGTTCTGAAACGCCGGGTACCAGCGAAAGCGCTACCC TEPSEGSAPGSEPATS CAGAATCCGGTCCGGGCACTAGCACCGAGCCATCGGAGGGCTCCGCACC GSETPGTSESATPESG AGGTCACCATCATCACCATCAC PGTSTEPSEGSAPGHH

HHHH AC1952 ATGAAGAAAAACATCGCTTTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTA SPAGSPTSTEEGTSES

TTGCTACAAACGCGTACGCTTCCCCAGCAGGCAGCCCGACCAGCACCGA ATPESGPGTSTEPSEG GGAGGGTACGAGCGAGTCGGCTACTCCAGAGAGCGGTCCGGGTACCTCT SAPGTSESATPESGPG ACGGAACCGTCCGAAGGTAGCGCTCCAGGCACGTCTGAAAGCGCGACGC SEPATSGSETPGTSES CGGAAAGCGGTCCAGGCAGCGAGCCGGCGACCTCCGGTAGCGAAACGCC ATPESGPGSEPATSGS TGGTACCTCGGAGTCAGCGACTCCGGAAAGCGGTCCGGGTAGCGAACCT ETPGTSESATPESGPG GCAACGAGCGGTAGCGAGACTCCAGGCACTAGCGAATCCGCAACTCCGG TSTEPSEGSAPGSPAG AGTCGGGTCCGGGCACCTCTACGGAGCCTAGCGAGGGCTCAGCACCAGG SPTSTEEGTSESATPE TAGCCCTGCAGGTTCCCCGACGTCAACCGAGGAAGGTACAAGCGAAAGC SGPGSEPATSGSETPG GCCACCCCTGAGTCGGGCCCTGGCAGCGAACCGGCAACTAGCGGCAGCG TSESATPESGPGSPAG AGACTCCGGGTACCAGCGAGTCTGCTACGCCAGAGAGCGGCCCAGGTTC SPTSTEEGSPAGSPTS GCCAGCGGGTTCGCCGACTAGCACGGAGGAGGGCAGCCCAGCGGGTAGC TEEGTSTEPSEGSAPG CCGACCAGCACTGAGGAGGGTACGTCCACCGAACCGAGCGAAGGTAGCG TSESATPESGPGTSES CACCAGGTACCTCCGAGTCTGCCACCCCTGAATCCGGTCCAGGTACCAG ATPESGPGTSESATPE CGAATCAGCCACCCCGGAGTCGGGTCCAGGTACGAGCGAATCTGCTACC SGPGSEPATSGSETPG CCGGAATCCGGCCCAGGCAGCGAACCTGCTACTAGCGGCAGCGAAACGC SEPATSGSETPGSPAG CGGGCAGCGAACCTGCCACGTCAGGCAGCGAGACGCCGGGTTCCCCTGC SPTSTEEGTSTEPSEG

Nome da Seqüência de Seqüência de DNA construção aminoácidos*

AGGCTCCCCGACCAGCACTGAGGAGGGCACCTCCACCGAACCATCAGAA SAPGTSTEPSEGSAPG GGTAGCGCGCCTGGTACGTCAACCGAACCTTCCGAGGGCAGCGCACCGG GSAPEAGRSANHTPAG GTGGCTCAGCGCCTGAGGCAGGTCGTTCTGCTAACCATACCCCAGCGGG LTGPATSGSETPGTDI GCTGACTGGGCCTGCTACCTCAGGCTCCGAAACCCCGGGCACCGATATC QMTQSPSSLSASVGDR CAGATGACCCAGAGCCCTTCTTCCCTGTCCGCATCCGTCGGCGATCGTG VTITCRSTKSLLHSNG TCACGATTACCTGTCGCAGCACTAAGAGCCTGCTGCACTCAAACGGTAT ITYLYWYQQKPGKAPK CACGTACCTGTACTGGTACCAGCAGAAGCCGGGCAAAGCGCCGAAGCTG LLIYQMSNLASGVPSR CTGATTTATCAGATGAGCAACCTGGCATCGGGCGTGCCGAGCCGTTTCA FSSSGSGTDFTLTISS GCAGCAGCGGTAGCGGTACCGACTTCACGCTGACCATCAGCTCGTTGCA LQPEDFATYYCAQNLE GCCAGAGGACTTTGCGACGTACTATTGTGCGCAAAACTTGGAAATTCCG IPRTFGQGTKVEIKGA CGCACCTTCGGCCAGGGTACGAAAGTTGAGATTAAAGGTGCCACCCCAC TPPETGAETESPGETT CGGAGACTGGTGCAGAAACCGAGTCTCCGGGCGAAACCACGGGCGGTAG GGSAESEPPGEGQVQL CGCGGAGAGCGAACCGCCTGGTGAGGGTCAAGTTCAATTGGTTCAGAGC VQSGPGLVQPGGSVRI GGTCCGGGTCTGGTTCAACCGGGCGGCAGCGTGCGCATTTCTTGTGCGG SCAASGYTFTNYGMNW CCAGCGGTTACACCTTTACGAACTACGGTATGAATTGGGTGAAACAAGC VKQAPGKGLEWMGWIN TCCGGGCAAAGGTCTGGAGTGGATGGGTTGGATCAATACCTATACCGGT TYTGESTYADSFKGRF GAATCCACTTACGCGGATTCCTTTAAGGGCCGTTTCACCTTCAGCCTGG TFSLDTSASAAYLQIN ACACGAGCGCGAGCGCTGCATATCTGCAAATCAATAGCCTGCGTGCCGA SLRAEDTAVYYCARFA AGATACCGCGGTGTACTATTGCGCGCGTTTTGCAATCAAGGGCGACTAT IKGDYWGQGTLLTVSS TGGGGTCAAGGCACGCTGCTGACCGTGAGCAGCGGTGGTGGCGGCAGCG GGGGSELVVTQEPSLT AGTTAGTTGTGACCCAAGAGCCGAGCCTGACCGTTAGCCCGGGTGGTAC VSPGGTVTLTCRSSTG GGTCACCCTGACGTGCCGTAGCAGCACCGGTGCGGTCACGACCAGCAAC AVTTSNYANWVQQKPG TATGCCAATTGGGTCCAGCAGAAACCGGGTCAAGCACCGCGTGGCCTGA QAPRGLIGGTNKRAPG TCGGCGGCACCAATAAACGTGCCCCGGGTACTCCTGCGCGTTTCTCCGG TPARFSGSLLGGKAAL TAGCCTGCTGGGCGGCAAAGCCGCTCTGACCCTGAGCGGTGTCCAGCCG TLSGVQPEDEAEYYCA GAAGATGAAGCGGAGTACTACTGCGCGCTGTGGTATTCCAATCTGTGGG LWYSNLWVFGGGTKLT TTTTTGGCGGCGGTACCAAGCTGACCGTATTGGGTGCTACGCCACCGGA VLGATPPETGAETESP GACTGGCGCAGAAACGGAAAGCCCGGGTGAGACTACGGGTGGCTCTGCG GETTGGSAESEPPGEG

Nome da Seqüência de Seqüência de DNA construção aminoácidos*

GAGAGCGAACCTCCGGGTGAGGGTGAGGTCCAACTGCTGGAGTCTGGTG EVQLLESGGGLVQPGG GTGGCCTGGTTCAACCGGGTGGCTCGTTGAAGCTGAGCTGTGCAGCTAG SLKLSCAASGFTFNTY CGGCTTTACCTTCAACACCTATGCGATGAATTGGGTTCGTCAGGCACCG AMNWVRQAPGKGLEWV GGTAAGGGCCTGGAATGGGTGGCGCGTATCCGCTCCAAGTACAACAACT ARIRSKYNNYATYYAD ACGCGACCTACTACGCGGATAGCGTTAAAGACCGCTTCACGATTAGCCG SVKDRFTISRDDSKNT TGACGATTCCAAGAATACGGCATATCTGCAAATGAACAATCTGAAAACC AYLQMNNLKTEDTAVY GAAGATACCGCGGTGTATTACTGTGTGCGCCACGGCAATTTCGGCAACA YCVRHGNFGNSYVSWF GCTACGTGAGCTGGTTTGCATATTGGGGTCAGGGCACCCTGGTTACGGT AYWGQGTLVTVSSGTA GAGCTCCGGCACCGCCGAAGCAGCTAGCGCCTCTGGCGAGGCAGGTCGT EAASASGEAGRSANHT TCTGCTAACCATACCCCAGCGGGGCTGACTGGGCCTCCAGGTAGCCCAG PAGLTGPPGSPAGSPT CTGGTAGCCCAACCTCTACCGAAGAAGGTACCTCTGAATCCGCTACTCC STEEGTSESATPESGP AGAATCCGGTCCTGGTACTAGCACTGAGCCAAGCGAAGGTTCTGCTCCA GTSTEPSEGSAPGSPA GGCTCCCCGGCAGGTAGCCCTACCTCTACCGAAGAGGGCACTAGCACCG GSPTSTEEGTSTEPSE AACCATCTGAGGGTTCCGCTCCTGGCACCTCCACTGAACCGTCCGAAGG GSAPGTSTEPSEGSAP CAGTGCTCCGGGTACTTCCGAAAGCGCAACTCCGGAATCCGGCCCTGGT GTSESATPESGPGSEP TCTGAGCCTGCTACTTCCGGCTCTGAAACTCCAGGTAGCGAGCCAGCGA ATSGSETPGSEPATSG CTTCTGGTTCTGAAACTCCAGGTTCACCGGCGGGTAGCCCGACGAGCAC SETPGSPAGSPTSTEE GGAGGAAGGTACCTCTGAGTCGGCCACTCCTGAGTCCGGTCCGGGCACG GTSESATPESGPGTST AGCACCGAGCCGAGCGAGGGTTCAGCCCCGGGTACCAGCACGGAGCCGT EPSEGSAPGTSTEPSE CCGAGGGTAGCGCACCGGGTTCTCCGGCGGGCTCCCCTACGTCTACGGA GSAPGSPAGSPTSTEE AGAGGGTACGTCCACTGAACCTAGCGAGGGCAGCGCGCCAGGCACCAGC GTSTEPSEGSAPGTST ACTGAACCGAGCGAAGGCAGCGCACCTGGCACTAGCGAGTCTGCGACTC EPSEGSAPGTSESATP CGGAGAGCGGTCCGGGTACGAGCACGGAACCAAGCGAAGGCAGCGCCCC ESGPGTSTEPSEGSAP AGGTACCTCTGAATCTGCTACCCCAGAATCTGGCCCGGGTTCCGAGCCA GTSESATPESGPGSEP GCTACCTCTGGTTCTGAAACCCCAGGTACTTCCACTGAACCAAGCGAAG ATSGSETPGTSTEPSE GTAGCGCTCCTGGCACTTCTACTGAACCATCCGAAGGTTCCGCTCCTGG GSAPGTSTEPSEGSAP TACGTCTGAAAGCGCTACCCCTGAAAGCGGCCCAGGCACCTCTGAAAGC GTSESATPESGPGTSE GCTACTCCTGAGAGCGGTCCAGGCTCTCCAGCAGGTTCTCCAACCTCCA SATPESGPGSPAGSPT

Nome da Seqüência de Seqüência de DNA construção aminoácidos*

CTGAAGAAGGCACCTCTGAGTCTGCTACCCCTGAATCTGGTCCTGGCTC STEEGTSESATPESGP CGAACCTGCTACCTCTGGTTCCGAAACTCCAGGTACCTCGGAATCTGCG GSEPATSGSETPGTSE ACTCCGGAATCTGGCCCGGGCACGAGCACGGAGCCGTCTGAGGGTAGCG SATPESGPGTSTEPSE CACCAGGTACCAGCACTGAGCCTTCTGAGGGCTCTGCACCGGGTACCTC GSAPGTSTEPSEGSAP CACGGAACCTTCGGAAGGTTCTGCGCCGGGTACCTCCACTGAGCCATCC GTSTEPSEGSAPGTST GAGGGTTCAGCACCAGGTACTAGCACGGAACCGTCCGAGGGCTCTGCAC EPSEGSAPGTSTEPSE CAGGTACGAGCACCGAACCGTCGGAGGGTAGCGCTCCAGGTAGCCCAGC GSAPGTSTEPSEGSAP GGGCTCTCCGACAAGCACCGAAGAAGGCACCAGCACCGAGCCGTCCGAA GSPAGSPTSTEEGTST GGTTCCGCACCAGGTACAAGCGAGAGCGCGACTCCTGAATCTGGTCCGG EPSEGSAPGTSESATP GTAGCGAGCCTGCAACCAGCGGTTCTGAGACGCCGGGCACTTCCGAATC ESGPGSEPATSGSETP TGCGACCCCGGAGTCCGGTCCAGGTTCAGAGCCGGCGACGAGCGGTTCG GTSESATPESGPGSEP GAAACGCCGGGTACGTCTGAATCAGCCACGCCGGAGTCTGGTCCGGGTA ATSGSETPGTSESATP CCTCGACCGAACCAAGCGAAGGTTCGGCACCGGGTACTAGCGAGAGCGC ESGPGTSTEPSEGSAP AACCCCTGAAAGCGGTCCGGGCAGCCCGGCAGGTTCTCCAACCAGCACC GTSESATPESGPGSPA GAAGAAGGTTCCCCTGCTGGTAGCCCGACCTCTACGGAGGAAGGTAGCC GSPTSTEEGSPAGSPT CTGCAGGTTCCCCAACTTCTACTGAGGAAGGTACTTCTGAGTCCGCTAC STEEGSPAGSPTSTEE CCCAGAAAGCGGTCCTGGTACCTCCACTGAACCGTCTGAAGGCTCTGCA GTSESATPESGPGTST CCAGGCACTTCTGAGTCTGCTACTCCAGAAAGCGGCCCAGGTTCTGAAC EPSEGSAPGTSESATP CAGCAACTTCTGGCTCTGAGACTCCAGGCACTTCTGAGTCCGCAACGCC ESGPGSEPATSGSETP TGAATCCGGTCCTGGTTCTGAACCAGCTACTTCCGGCAGCGAAACCCCA GTSESATPESGPGSEP GGTACCTCTGAGTCTGCGACTCCAGAGTCTGGTCCTGGTACTTCCACTG ATSGSETPGTSESATP AGCCTAGCGAGGGTTCCGCACCAGGTTCTCCGGCTGGTAGCCCGACCAG ESGPGTSTEPSEGSAP CACGGAGGAGGGTACGTCTGAATCTGCAACGCCGGAATCGGGCCCAGGT GSPAGSPTSTEEGTSE TCGGAGCCTGCAACGTCTGGCAGCGAAACCCCGGGTACCTCCGAATCTG SATPESGPGSEPATSG CTACACCGGAAAGCGGTCCTGGCAGCCCTGCTGGTTCTCCAACCTCTAC SETPGTSESATPESGP CGAGGAGGGTTCACCGGCAGGTAGCCCGACTAGCACTGAAGAAGGTACT GSPAGSPTSTEEGSPA AGCACGGAGCCGAGCGAGGGTAGTGCTCCGGGTACGAGCGAGAGCGCAA GSPTSTEEGTSTEPSE CGCCAGAGAGCGGTCCAGGCACCAGCGAATCGGCCACCCCTGAGAGCGG GSAPGTSESATPESGP

Nome da Seqüência de Seqüência de DNA construção aminoácidos*

CCCAGGTACTTCTGAGAGCGCCACTCCTGAATCCGGCCCTGGTAGCGAG GTSESATPESGPGTSE CCGGCAACCTCCGGCTCAGAAACTCCTGGTTCGGAACCAGCGACCAGCG SATPESGPGSEPATSG GTTCTGAAACTCCGGGTAGCCCGGCAGGCAGCCCAACGAGCACCGAAGA SETPGSEPATSGSETP GGGTACCAGCACGGAACCGAGCGAGGGTTCTGCCCCGGGTACTTCCACC GSPAGSPTSTEEGTST GAACCATCGGAGGGCTCTGCACCTGGTAGCGAACCTGCGACGTCTGGTT EPSEGSAPGTSTEPSE CTGAAACGCCGGGTACCAGCGAAAGCGCTACCCCAGAATCCGGTCCGGG GSAPGSEPATSGSETP CACTAGCACCGAGCCATCGGAGGGCTCCGCACCAGGTCACCATCATCAC GTSESATPESGPGTST

CATCAC EPSEGSAPGHHHHHH AC2084 ATGAAGAAAAACATCGCTTTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTA HHHHHHSPAGSPTSTE

TTGCTACAAACGCGTACGCTCACCATCATCACCATCACTCCCCAGCAGG EGTSESATPESGPGTS CAGCCCGACCAGCACCGAGGAGGGTACGAGCGAGTCGGCTACTCCAGAG TEPSEGSAPGTSESAT AGCGGTCCGGGTACCTCTACGGAACCGTCCGAAGGTAGCGCTCCAGGCA PESGPGSEPATSGSET CGTCTGAAAGCGCGACGCCGGAAAGCGGTCCAGGCAGCGAGCCGGCGAC PGTSESATPESGPGSE CTCCGGTAGCGAAACGCCTGGTACCTCGGAGTCAGCGACTCCGGAAAGC PATSGSETPGTSESAT GGTCCGGGTAGCGAACCTGCAACGAGCGGTAGCGAGACTCCAGGCACTA PESGPGTSTEPSEGSA GCGAATCCGCAACTCCGGAGTCGGGTCCGGGCACCTCTACGGAGCCTAG PGSPAGSPTSTEEGTS CGAGGGCTCAGCACCAGGTAGCCCTGCAGGTTCCCCGACGTCAACCGAG ESATPESGPGSEPATS GAAGGTACAAGCGAAAGCGCCACCCCTGAGTCGGGCCCTGGCAGCGAAC GSETPGTSESATPESG CGGCAACTAGCGGCAGCGAGACTCCGGGTACCAGCGAGTCTGCTACGCC PGSPAGSPTSTEEGSP AGAGAGCGGCCCAGGTTCGCCAGCGGGTTCGCCGACTAGCACGGAGGAG AGSPTSTEEGTSTEPS GGCAGCCCAGCGGGTAGCCCGACCAGCACTGAGGAGGGTACGTCCACCG EGSAPGTSESATPESG AACCGAGCGAAGGTAGCGCACCAGGTACCTCCGAGTCTGCCACCCCTGA PGTSESATPESGPGTS ATCCGGTCCAGGTACCAGCGAATCAGCCACCCCGGAGTCGGGTCCAGGT ESATPESGPGSEPATS ACGAGCGAATCTGCTACCCCGGAATCCGGCCCAGGCAGCGAACCTGCTA GSETPGSEPATSGSET CTAGCGGCAGCGAAACGCCGGGCAGCGAACCTGCCACGTCAGGCAGCGA PGSPAGSPTSTEEGTS GACGCCGGGTTCCCCTGCAGGCTCCCCGACCAGCACTGAGGAGGGCACC TEPSEGSAPGTSTEPS TCCACCGAACCATCAGAAGGTAGCGCGCCTGGTACGTCAACCGAACCTT EGSAPGGSAPEAGRSA

Nome da Seqüência de Seqüência de DNA construção aminoácidos*

CCGAGGGCAGCGCACCGGGTGGCTCAGCGCCTGAGGCAGGTCGTTCTGC NHTPAGLTGPATSGSE TAACCATACCCCTGCAGGATTAACTGGCCCCGCCACCAGCGGGAGCGAG TPGTDIQMTQSPASLS ACCCCCGGGACTGACATCCAGATGACCCAAAGCCCGGCGAGCCTGAGCG ASLGETVSIECLASEG CGAGCCTGGGTGAAACCGTGAGCATCGAATGCCTGGCGAGCGAGGGTAT ISNDLAWYQQKSGKSP TAGCAACGACCTGGCGTGGTACCAGCAAAAGAGCGGCAAAAGCCCGCAG QLLIYATSRLQDGVPS CTGCTGATCTATGCGACCAGCCGTCTGCAAGATGGTGTTCCGAGCCGTT RFSGSGSGTRYSLKIS TCAGCGGTAGCGGTAGCGGTACCCGTTACAGCCTGAAGATTAGCGGTAT GMQPEDEADYFCQQSY GCAGCCGGAGGACGAAGCGGATTATTTCTGCCAGCAAAGCTACAAATAT KYPWTFGGGTKLELKG CCGTGGACCTTTGGTGGCGGTACCAAGCTGGAACTGAAAGGTGCAACGC ATPPETGAETESPGET CTCCGGAGACTGGTGCTGAAACTGAGTCCCCGGGCGAGACGACCGGTGG TGGSAESEPPGEGEVQ CTCTGCTGAATCCGAACCACCGGGCGAAGGCGAAGTTCAGCTGGCGGAA LAESGGGLVQPGRSMK AGCGGCGGTGGCCTGGTGCAACCGGGCCGTAGCATGAAGCTGAGCTGCG LSCAASGFTFSNFPMA CGGCGAGCGGTTTCACCTTTAGCAACTTCCCGATGGCGTGGGTTCGTCA WVRQAPTKGLEWVATI AGCGCCGACCAAAGGCCTGGAATGGGTGGCGACCATCAGCACCAGCGGT STSGGSTYYRDSVKGR GGCAGCACCTACTATCGTGACAGCGTTAAGGGTCGTTTTACCATTAGCC FTISRDNAKSTLYLQM GTGATAACGCGAAAAGCACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGTAG NSLRSEDTATYYCTRT CGAGGACACCGCGACCTACTATTGCACCCGTACCCTGTATATTCTGCGT LYILRVFYFDYWGQGV GTGTTCTACTTTGATTATTGGGGCCAAGGTGTGATGGTTACCGTGAGCA MVTVSSGGGGSELVVT GCGGTGGTGGCGGCAGCGAGTTAGTTGTGACCCAAGAGCCGAGCCTGAC QEPSLTVSPGGTVTLT CGTTAGCCCGGGTGGTACGGTCACCCTGACGTGCCGTAGCAGCACCGGT CRSSTGAVTTSNYANW GCGGTCACGACCAGCAACTATGCCAATTGGGTCCAGCAGAAACCGGGTC VQQKPGQAPRGLIGGT AAGCACCGCGTGGCCTGATCGGCGGCACCAATAAACGTGCCCCGGGTAC NKRAPGTPARFSGSLL TCCTGCGCGTTTCTCCGGTAGCCTGCTGGGCGGCAAAGCCGCTCTGACC GGKAALTLSGVQPEDE CTGAGCGGTGTCCAGCCGGAAGATGAAGCGGAGTACTACTGCGCGCTGT AEYYCALWYSNLWVFG GGTATTCCAATCTGTGGGTTTTTGGCGGCGGTACCAAGCTGACCGTATT GGTKLTVLGATPPETG GGGTGCTACGCCACCGGAGACTGGCGCAGAAACGGAAAGCCCGGGTGAG AETESPGETTGGSAES ACTACGGGTGGCTCTGCGGAGAGCGAACCTCCGGGTGAGGGTGAGGTCC EPPGEGEVQLLESGGG AACTGCTGGAGTCTGGTGGTGGCCTGGTTCAACCGGGTGGCTCGTTGAA LVQPGGSLKLSCAASG

Nome da Seqüência de Seqüência de DNA construção aminoácidos*

GCTGAGCTGTGCAGCTAGCGGCTTTACCTTCAACACCTATGCGATGAAT FTFNTYAMNWVRQAPG TGGGTTCGTCAGGCACCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTGGCGCGTATCC KGLEWVARIRSKYNNY GCTCCAAGTACAACAACTACGCGACCTACTACGCGGATAGCGTTAAAGA ATYYADSVKDRFTISR CCGCTTCACGATTAGCCGTGACGATTCCAAGAATACGGCATATCTGCAA DDSKNTAYLQMNNLKT ATGAACAATCTGAAAACCGAAGATACCGCGGTGTATTACTGTGTGCGCC EDTAVYYCVRHGNFGN ACGGCAATTTCGGCAACAGCTACGTGAGCTGGTTTGCATATTGGGGTCA SYVSWFAYWGQGTLVT GGGCACCCTGGTGACCGTTAGCAGCGGCACCGCCGAAGCGGCTAGCGCC VSSGTAEAASASGEAG TCCGGAGAAGCTGGAAGAAGCGCCAATCACACACCAGCTGGACTTACAG RSANHTPAGLTGPPGS GCCCGCCTGGTAGCCCCGCGGGGAGCCCTACAAGCACTGAGGAGGGCAC PAGSPTSTEEGTSESA ATCTGAGTCCGCTACCCCTGAGAGTGGACCCGGGACAAGCACTGAGCCT TPESGPGTSTEPSEGS AGCGAAGGAAGCGCACCAGGTTCCCCCGCTGGGAGCCCCACAAGCACAG APGSPAGSPTSTEEGT AAGAGGGAACTTCTACCGAGCCCTCTGAGGGCTCAGCCCCTGGAACTAG STEPSEGSAPGTSTEP CACAGAGCCCTCCGAAGGCAGTGCACCGGGTACTTCCGAAAGCGCAACT SEGSAPGTSESATPES CCGGAATCCGGCCCTGGTTCTGAGCCTGCTACTTCCGGCTCTGAAACTC GPGSEPATSGSETPGS CAGGTAGCGAGCCAGCGACTTCTGGTTCTGAAACTCCAGGTTCACCGGC EPATSGSETPGSPAGS GGGTAGCCCGACGAGCACGGAGGAAGGTACCTCTGAGTCGGCCACTCCT PTSTEEGTSESATPES GAGTCCGGTCCGGGCACGAGCACCGAGCCGAGCGAGGGTTCAGCCCCGG GPGTSTEPSEGSAPGT GTACCAGCACGGAGCCGTCCGAGGGTAGCGCACCGGGTTCTCCGGCGGG STEPSEGSAPGSPAGS CTCCCCTACGTCTACGGAAGAGGGTACGTCCACTGAACCTAGCGAGGGC PTSTEEGTSTEPSEGS AGCGCGCCAGGCACCAGCACTGAACCGAGCGAAGGCAGCGCACCTGGCA APGTSTEPSEGSAPGT CTAGCGAGTCTGCGACTCCGGAGAGCGGTCCGGGTACGAGCACGGAACC SESATPESGPGTSTEP AAGCGAAGGCAGCGCCCCAGGTACCTCTGAATCTGCTACCCCAGAATCT SEGSAPGTSESATPES GGCCCGGGTTCCGAGCCAGCTACCTCTGGTTCTGAAACCCCAGGTACTT GPGSEPATSGSETPGT CCACTGAACCAAGCGAAGGTAGCGCTCCTGGCACTTCTACTGAACCATC STEPSEGSAPGTSTEP CGAAGGTTCCGCTCCTGGTACGTCTGAAAGCGCTACCCCTGAAAGCGGC SEGSAPGTSESATPES CCAGGCACCTCTGAAAGCGCTACTCCTGAGAGCGGTCCAGGCTCTCCAG GPGTSESATPESGPGS CAGGTTCTCCAACCTCCACTGAAGAAGGCACCTCTGAGTCTGCTACCCC PAGSPTSTEEGTSESA TGAATCTGGTCCTGGCTCCGAACCTGCTACCTCTGGTTCCGAAACTCCA TPESGPGSEPATSGSE

Nome da Seqüência de Seqüência de DNA construção aminoácidos*

GGTACCTCGGAATCTGCGACTCCGGAATCTGGCCCGGGCACGAGCACGG TPGTSESATPESGPGT AGCCGTCTGAGGGTAGCGCACCAGGTACCAGCACTGAGCCTTCTGAGGG STEPSEGSAPGTSTEP CTCTGCACCGGGTACCTCCACGGAACCTTCGGAAGGTTCTGCGCCGGGT SEGSAPGTSTEPSEGS ACCTCCACTGAGCCATCCGAGGGTTCAGCACCAGGTACTAGCACGGAAC APGTSTEPSEGSAPGT CGTCCGAGGGCTCTGCACCAGGTACGAGCACCGAACCGTCGGAGGGTAG STEPSEGSAPGTSTEP CGCTCCAGGTAGCCCAGCGGGCTCTCCGACAAGCACCGAAGAAGGCACC SEGSAPGSPAGSPTST AGCACCGAGCCGTCCGAAGGTTCCGCACCAGGTACAAGCGAGAGCGCGA EEGTSTEPSEGSAPGT CTCCTGAATCTGGTCCGGGTAGCGAGCCTGCAACCAGCGGTTCTGAGAC SESATPESGPGSEPAT GCCGGGCACTTCCGAATCTGCGACCCCGGAGTCCGGTCCAGGTTCAGAG SGSETPGTSESATPES CCGGCGACGAGCGGTTCGGAAACGCCGGGTACGTCTGAATCAGCCACGC GPGSEPATSGSETPGT CGGAGTCTGGTCCGGGTACCTCGACCGAACCAAGCGAAGGTTCGGCACC SESATPESGPGTSTEP GGGTACTAGCGAGAGCGCAACCCCTGAAAGCGGTCCGGGCAGCCCGGCA SEGSAPGTSESATPES GGTTCTCCAACCAGCACCGAAGAAGGTTCCCCTGCTGGTAGCCCGACCT GPGSPAGSPTSTEEGS CTACGGAGGAAGGTAGCCCTGCAGGTTCCCCAACTTCTACTGAGGAAGG PAGSPTSTEEGSPAGS TACTTCTGAGTCCGCTACCCCAGAAAGCGGTCCTGGTACCTCCACTGAA PTSTEEGTSESATPES CCGTCTGAAGGCTCTGCACCAGGCACTTCTGAGTCTGCTACTCCAGAAA GPGTSTEPSEGSAPGT GCGGCCCAGGTTCTGAACCAGCAACTTCTGGCTCTGAGACTCCAGGCAC SESATPESGPGSEPAT TTCTGAGTCCGCAACGCCTGAATCCGGTCCTGGTTCTGAACCAGCTACT SGSETPGTSESATPES TCCGGCAGCGAAACCCCAGGTACCTCTGAGTCTGCGACTCCAGAGTCTG GPGSEPATSGSETPGT GTCCTGGTACTTCCACTGAGCCTAGCGAGGGTTCCGCACCAGGTTCTCC SESATPESGPGTSTEP GGCTGGTAGCCCGACCAGCACGGAGGAGGGTACGTCTGAATCTGCAACG SEGSAPGSPAGSPTST CCGGAATCGGGCCCAGGTTCGGAGCCTGCAACGTCTGGCAGCGAAACCC EEGTSESATPESGPGS CGGGTACCTCCGAATCTGCTACACCGGAAAGCGGTCCTGGCAGCCCTGC EPATSGSETPGTSESA TGGTTCTCCAACCTCTACCGAGGAGGGTTCACCGGCAGGTAGCCCGACT TPESGPGSPAGSPTST AGCACTGAAGAAGGTACTAGCACGGAGCCGAGCGAGGGTAGTGCTCCGG EEGSPAGSPTSTEEGT GTACGAGCGAGAGCGCAACGCCAGAGAGCGGTCCAGGCACCAGCGAATC STEPSEGSAPGTSESA GGCCACCCCTGAGAGCGGCCCAGGTACTTCTGAGAGCGCCACTCCTGAA TPESGPGTSESATPES TCCGGCCCTGGTAGCGAGCCGGCAACCTCCGGCTCAGAAACTCCTGGTT GPGTSESATPESGPGS

Nome da Seqüência de Seqüência de DNA construção aminoácidos*

CGGAACCAGCGACCAGCGGTTCTGAAACTCCGGGTAGCCCGGCAGGCAG EPATSGSETPGSEPAT CCCAACGAGCACCGAAGAGGGTACCAGCACGGAACCGAGCGAGGGTTCT SGSETPGSPAGSPTST GCCCCGGGTACTTCCACCGAACCATCGGAGGGCTCTGCACCTGGTAGCG EEGTSTEPSEGSAPGT AACCTGCGACGTCTGGTTCTGAAACGCCGGGTACCAGCGAAAGCGCTAC STEPSEGSAPGSEPAT CCCAGAATCCGGTCCGGGCACTAGCACCGAGCCATCGGAGGGCGCCGCA SGSETPGTSESATPES GAACCAGAGGCG GPGTSTEPSEGAAEPE

A AC2078 ATGAAGAAAAACATCGCTTTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTA HHHHHHSPAGSPTSTE

TTGCTACAAACGCGTACGCTCACCATCATCACCATCACTCCCCAGCAGG EGTSESATPESGPGTS CAGCCCGACCAGCACCGAGGAGGGTACGAGCGAGTCGGCTACTCCAGAG TEPSEGSAPGTSESAT AGCGGTCCGGGTACCTCTACGGAACCGTCCGAAGGTAGCGCTCCAGGCA PESGPGSEPATSGSET CGTCTGAAAGCGCGACGCCGGAAAGCGGTCCAGGCAGCGAGCCGGCGAC PGTSESATPESGPGSE CTCCGGTAGCGAAACGCCTGGTACCTCGGAGTCAGCGACTCCGGAAAGC PATSGSETPGTSESAT GGTCCGGGTAGCGAACCTGCAACGAGCGGTAGCGAGACTCCAGGCACTA PESGPGTSTEPSEGSA GCGAATCCGCAACTCCGGAGTCGGGTCCGGGCACCTCTACGGAGCCTAG PGSPAGSPTSTEEGTS CGAGGGCTCAGCACCAGGTAGCCCTGCAGGTTCCCCGACGTCAACCGAG ESATPESGPGSEPATS GAAGGTACAAGCGAAAGCGCCACCCCTGAGTCGGGCCCTGGCAGCGAAC GSETPGTSESATPESG CGGCAACTAGCGGCAGCGAGACTCCGGGTACCAGCGAGTCTGCTACGCC PGSPAGSPTSTEEGSP AGAGAGCGGCCCAGGTTCGCCAGCGGGTTCGCCGACTAGCACGGAGGAG AGSPTSTEEGTSTEPS GGCAGCCCAGCGGGTAGCCCGACCAGCACTGAGGAGGGTACGTCCACCG EGSAPGTSESATPESG AACCGAGCGAAGGTAGCGCACCAGGTACCTCCGAGTCTGCCACCCCTGA PGTSESATPESGPGTS ATCCGGTCCAGGTACCAGCGAATCAGCCACCCCGGAGTCGGGTCCAGGT ESATPESGPGSEPATS ACGAGCGAATCTGCTACCCCGGAATCCGGCCCAGGCAGCGAACCTGCTA GSETPGSEPATSGSET CTAGCGGCAGCGAAACGCCGGGCAGCGAACCTGCCACGTCAGGCAGCGA PGSPAGSPTSTEEGTS GACGCCGGGTTCCCCTGCAGGCTCCCCGACCAGCACTGAGGAGGGCACC TEPSEGSAPGTSTEPS TCCACCGAACCATCAGAAGGTAGCGCGCCTGGTACGTCAACCGAACCTT EGSAPGGSAPEAGRSA CCGAGGGCAGCGCACCGGGTGGCTCAGCGCCTGAGGCAGGTCGTTCTGC NHTPAGLTGPATSGSE

Nome da Seqüência de Seqüência de DNA construção aminoácidos*

TAACCATACCCCTGCAGGATTAACTGGCCCCGCCACCAGCGGGAGCGAG TPGTDIQMTQSPASLS ACCCCCGGGACTGACATCCAGATGACCCAAAGCCCGGCGAGCCTGAGCG ASLGETVSIECLASEG CGAGCCTGGGTGAAACCGTGAGCATCGAATGCCTGGCGAGCGAGGGTAT ISNDLAWYQQKSGKSP TAGCAACGACCTGGCGTGGTACCAGCAAAAGAGCGGCAAAAGCCCGCAG QLLIYATSRLQDGVPS CTGCTGATCTATGCGACCAGCCGTCTGCAAGATGGTGTTCCGAGCCGTT RFSGSGSGTRYSLKIS TCAGCGGTAGCGGTAGCGGTACCCGTTACAGCCTGAAGATTAGCGGTAT GMQPEDEADYFCQQSY GCAGCCGGAGGACGAAGCGGATTATTTCTGCCAGCAAAGCTACAAATAT KYPWTFGGGTKLELKG CCGTGGACCTTTGGTGGCGGTACCAAGCTGGAACTGAAAGGTGCAACGC ATPPETGAETESPGET CTCCGGAGACTGGTGCTGAAACTGAGTCCCCGGGCGAGACGACCGGTGG TGGSAESEPPGEGEVQ CTCTGCTGAATCCGAACCACCGGGCGAAGGCGAAGTTCAGCTGGCGGAA LAESGGGLVQPGRSMK AGCGGCGGTGGCCTGGTGCAACCGGGCCGTAGCATGAAGCTGAGCTGCG LSCAASGFTFSNFPMA CGGCGAGCGGTTTCACCTTTAGCAACTTCCCGATGGCGTGGGTTCGTCA WVRQAPTKGLEWVATI AGCGCCGACCAAAGGCCTGGAATGGGTGGCGACCATCAGCACCAGCGGT STSGGSTYYRDSVKGR GGCAGCACCTACTATCGTGACAGCGTTAAGGGTCGTTTTACCATTAGCC FTISRDNAKSTLYLQM GTGATAACGCGAAAAGCACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGTAG NSLRSEDTATYYCTRT CGAGGACACCGCGACCTACTATTGCACCCGTACCCTGTATATTCTGCGT LYILRVFYFDYWGQGV GTGTTCTACTTTGATTATTGGGGCCAAGGTGTGATGGTTACCGTGAGCA MVTVSSGGGGSDIQMT GCGGTGGTGGCGGCAGCGATATCCAGATGACCCAAAGCCCGAGCAGCCT QSPSSLPASLGDRVTI GCCGGCGAGCCTGGGTGACCGTGTGACCATCAACTGCCAGGCGAGCCAA NCQASQDISNYLNWYQ GATATTAGCAACTACCTGAACTGGTATCAGCAAAAGCCGGGCAAAGCGC QKPGKAPKLLIYYTNK CGAAGCTGCTGATTTACTATACCAACAAGCTGGCGGATGGTGTTCCGAG LADGVPSRFSGSGSGR CCGTTTCAGCGGTAGCGGCAGCGGTCGTGACAGCAGCTTTACCATCAGC DSSFTISSLESEDIGS AGCCTGGAGAGCGAAGATATTGGTAGCTACTATTGCCAACAATACTACA YYCQQYYNYPWTFGPG ACTATCCGTGGACCTTCGGTCCGGGCACCAAACTGGAAATCAAAGGTGC TKLEIKGATPPETGAE GACCCCGCCGGAAACCGGTGCGGAAACCGAAAGCCCGGGTGAAACCACC TESPGETTGGSAESEP GGTGGCAGCGCGGAGAGCGAACCGCCGGGTGAAGGTGAAGTGCAACTGG PGEGEVQLVESGGGLV TGGAGAGCGGTGGTGGTCTGGTGCAACCGGGCAAGAGCCTGAAACTGAG QPGKSLKLSCEASGFT CTGCGAAGCGAGCGGCTTTACCTTTAGCGGTTATGGTATGCACTGGGTG FSGYGMHWVRQAPGRG

Nome da Seqüência de Seqüência de DNA construção aminoácidos*

CGTCAGGCGCCGGGTCGTGGCCTGGAGAGCGTTGCGTACATCACCAGCA LESVAYITSSSINIKY GCAGCATCAACATTAAATATGCGGACGCGGTGAAGGGCCGTTTCACCGT ADAVKGRFTVSRDNAK TAGCCGTGATAACGCGAAAAACCTGCTGTTTCTGCAGATGAACATTCTG NLLFLQMNILKSEDTA AAGAGCGAGGACACCGCGATGTACTATTGCGCGCGTTTCGACTGGGATA MYYCARFDWDKNYWGQ AAAACTATTGGGGTCAAGGCACCATGGTGACCGTTAGCAGCGGCACCGC GTMVTVSSGTAEAASA CGAAGCGGCTAGCGCCTCCGGAGAAGCTGGAAGAAGCGCCAATCACACA SGEAGRSANHTPAGLT CCAGCTGGACTTACAGGCCCGCCTGGTAGCCCCGCGGGGAGCCCTACAA GPPGSPAGSPTSTEEG GCACTGAGGAGGGCACATCTGAGTCCGCTACCCCTGAGAGTGGACCCGG TSESATPESGPGTSTE GACAAGCACTGAGCCTAGCGAAGGAAGCGCACCAGGTTCCCCCGCTGGG PSEGSAPGSPAGSPTS AGCCCCACAAGCACAGAAGAGGGAACTTCTACCGAGCCCTCTGAGGGCT TEEGTSTEPSEGSAPG CAGCCCCTGGAACTAGCACAGAGCCCTCCGAAGGCAGTGCACCGGGTAC TSTEPSEGSAPGTSES TTCCGAAAGCGCAACTCCGGAATCCGGCCCTGGTTCTGAGCCTGCTACT ATPESGPGSEPATSGS TCCGGCTCTGAAACTCCAGGTAGCGAGCCAGCGACTTCTGGTTCTGAAA ETPGSEPATSGSETPG CTCCAGGTTCACCGGCGGGTAGCCCGACGAGCACGGAGGAAGGTACCTC SPAGSPTSTEEGTSES TGAGTCGGCCACTCCTGAGTCCGGTCCGGGCACGAGCACCGAGCCGAGC ATPESGPGTSTEPSEG GAGGGTTCAGCCCCGGGTACCAGCACGGAGCCGTCCGAGGGTAGCGCAC SAPGTSTEPSEGSAPG CGGGTTCTCCGGCGGGCTCCCCTACGTCTACGGAAGAGGGTACGTCCAC SPAGSPTSTEEGTSTE TGAACCTAGCGAGGGCAGCGCGCCAGGCACCAGCACTGAACCGAGCGAA PSEGSAPGTSTEPSEG GGCAGCGCACCTGGCACTAGCGAGTCTGCGACTCCGGAGAGCGGTCCGG SAPGTSESATPESGPG GTACGAGCACGGAACCAAGCGAAGGCAGCGCCCCAGGTACCTCTGAATC TSTEPSEGSAPGTSES TGCTACCCCAGAATCTGGCCCGGGTTCCGAGCCAGCTACCTCTGGTTCT ATPESGPGSEPATSGS GAAACCCCAGGTACTTCCACTGAACCAAGCGAAGGTAGCGCTCCTGGCA ETPGTSTEPSEGSAPG CTTCTACTGAACCATCCGAAGGTTCCGCTCCTGGTACGTCTGAAAGCGC TSTEPSEGSAPGTSES TACCCCTGAAAGCGGCCCAGGCACCTCTGAAAGCGCTACTCCTGAGAGC ATPESGPGTSESATPE GGTCCAGGCTCTCCAGCAGGTTCTCCAACCTCCACTGAAGAAGGCACCT SGPGSPAGSPTSTEEG CTGAGTCTGCTACCCCTGAATCTGGTCCTGGCTCCGAACCTGCTACCTC TSESATPESGPGSEPA TGGTTCCGAAACTCCAGGTACCTCGGAATCTGCGACTCCGGAATCTGGC TSGSETPGTSESATPE CCGGGCACGAGCACGGAGCCGTCTGAGGGTAGCGCACCAGGTACCAGCA SGPGTSTEPSEGSAPG

Nome da Seqüência de Seqüência de DNA construção aminoácidos*

CTGAGCCTTCTGAGGGCTCTGCACCGGGTACCTCCACGGAACCTTCGGA TSTEPSEGSAPGTSTE AGGTTCTGCGCCGGGTACCTCCACTGAGCCATCCGAGGGTTCAGCACCA PSEGSAPGTSTEPSEG GGTACTAGCACGGAACCGTCCGAGGGCTCTGCACCAGGTACGAGCACCG SAPGTSTEPSEGSAPG AACCGTCGGAGGGTAGCGCTCCAGGTAGCCCAGCGGGCTCTCCGACAAG TSTEPSEGSAPGSPAG CACCGAAGAAGGCACCAGCACCGAGCCGTCCGAAGGTTCCGCACCAGGT SPTSTEEGTSTEPSEG ACAAGCGAGAGCGCGACTCCTGAATCTGGTCCGGGTAGCGAGCCTGCAA SAPGTSESATPESGPG CCAGCGGTTCTGAGACGCCGGGCACTTCCGAATCTGCGACCCCGGAGTC SEPATSGSETPGTSES CGGTCCAGGTTCAGAGCCGGCGACGAGCGGTTCGGAAACGCCGGGTACG ATPESGPGSEPATSGS TCTGAATCAGCCACGCCGGAGTCTGGTCCGGGTACCTCGACCGAACCAA ETPGTSESATPESGPG GCGAAGGTTCGGCACCGGGTACTAGCGAGAGCGCAACCCCTGAAAGCGG TSTEPSEGSAPGTSES TCCGGGCAGCCCGGCAGGTTCTCCAACCAGCACCGAAGAAGGTTCCCCT ATPESGPGSPAGSPTS GCTGGTAGCCCGACCTCTACGGAGGAAGGTAGCCCTGCAGGTTCCCCAA TEEGSPAGSPTSTEEG CTTCTACTGAGGAAGGTACTTCTGAGTCCGCTACCCCAGAAAGCGGTCC SPAGSPTSTEEGTSES TGGTACCTCCACTGAACCGTCTGAAGGCTCTGCACCAGGCACTTCTGAG ATPESGPGTSTEPSEG TCTGCTACTCCAGAAAGCGGCCCAGGTTCTGAACCAGCAACTTCTGGCT SAPGTSESATPESGPG CTGAGACTCCAGGCACTTCTGAGTCCGCAACGCCTGAATCCGGTCCTGG SEPATSGSETPGTSES TTCTGAACCAGCTACTTCCGGCAGCGAAACCCCAGGTACCTCTGAGTCT ATPESGPGSEPATSGS GCGACTCCAGAGTCTGGTCCTGGTACTTCCACTGAGCCTAGCGAGGGTT ETPGTSESATPESGPG CCGCACCAGGTTCTCCGGCTGGTAGCCCGACCAGCACGGAGGAGGGTAC TSTEPSEGSAPGSPAG GTCTGAATCTGCAACGCCGGAATCGGGCCCAGGTTCGGAGCCTGCAACG SPTSTEEGTSESATPE TCTGGCAGCGAAACCCCGGGTACCTCCGAATCTGCTACACCGGAAAGCG SGPGSEPATSGSETPG GTCCTGGCAGCCCTGCTGGTTCTCCAACCTCTACCGAGGAGGGTTCACC TSESATPESGPGSPAG GGCAGGTAGCCCGACTAGCACTGAAGAAGGTACTAGCACGGAGCCGAGC SPTSTEEGSPAGSPTS GAGGGTAGTGCTCCGGGTACGAGCGAGAGCGCAACGCCAGAGAGCGGTC TEEGTSTEPSEGSAPG CAGGCACCAGCGAATCGGCCACCCCTGAGAGCGGCCCAGGTACTTCTGA TSESATPESGPGTSES GAGCGCCACTCCTGAATCCGGCCCTGGTAGCGAGCCGGCAACCTCCGGC ATPESGPGTSESATPE TCAGAAACTCCTGGTTCGGAACCAGCGACCAGCGGTTCTGAAACTCCGG SGPGSEPATSGSETPG GTAGCCCGGCAGGCAGCCCAACGAGCACCGAAGAGGGTACCAGCACGGA SEPATSGSETPGSPAG

Nome da Seqüência de Seqüência de DNA construção aminoácidos*

ACCGAGCGAGGGTTCTGCCCCGGGTACTTCCACCGAACCATCGGAGGGC SPTSTEEGTSTEPSEG TCTGCACCTGGTAGCGAACCTGCGACGTCTGGTTCTGAAACGCCGGGTA SAPGTSTEPSEGSAPG CCAGCGAAAGCGCTACCCCAGAATCCGGTCCGGGCACTAGCACCGAGCC SEPATSGSETPGTSES ATCGGAGGGCGCCGCAGAACCAGAGGCG ATPESGPGTSTEPSEG

AAEPEA AC1976 ATGAAGAAAAACATCGCTTTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTA HHHHHHSPAGSPTSTE

TTGCTACAAACGCGTACGCTCACCATCATCACCATCACTCCCCAGCAGG EGTSESATPESGPGTS CAGCCCGACCAGCACCGAGGAGGGTACGAGCGAGTCGGCTACTCCAGAG TEPSEGSAPGTSESAT AGCGGTCCGGGTACCTCTACGGAACCGTCCGAAGGTAGCGCTCCAGGCA PESGPGSEPATSGSET CGTCTGAAAGCGCGACGCCGGAAAGCGGTCCAGGCAGCGAGCCGGCGAC PGTSESATPESGPGSE CTCCGGTAGCGAAACGCCTGGTACCTCGGAGTCAGCGACTCCGGAAAGC PATSGSETPGTSESAT GGTCCGGGTAGCGAACCTGCAACGAGCGGTAGCGAGACTCCAGGCACTA PESGPGTSTEPSEGSA GCGAATCCGCAACTCCGGAGTCGGGTCCGGGCACCTCTACGGAGCCTAG PGSPAGSPTSTEEGTS CGAGGGCTCAGCACCAGGTAGCCCTGCAGGTTCCCCGACGTCAACCGAG ESATPESGPGSEPATS GAAGGTACAAGCGAAAGCGCCACCCCTGAGTCGGGCCCTGGCAGCGAAC GSETPGTSESATPESG CGGCAACTAGCGGCAGCGAGACTCCGGGTACCAGCGAGTCTGCTACGCC PGSPAGSPTSTEEGSP AGAGAGCGGCCCAGGTTCGCCAGCGGGTTCGCCGACTAGCACGGAGGAG AGSPTSTEEGTSTEPS GGCAGCCCAGCGGGTAGCCCGACCAGCACTGAGGAGGGTACGTCCACCG EGSAPGTSESATPESG AACCGAGCGAAGGTAGCGCACCAGGTACCTCCGAGTCTGCCACCCCTGA PGTSESATPESGPGTS ATCCGGTCCAGGTACCAGCGAATCAGCCACCCCGGAGTCGGGTCCAGGT ESATPESGPGSEPATS ACGAGCGAATCTGCTACCCCGGAATCCGGCCCAGGCAGCGAACCTGCTA GSETPGSEPATSGSET CTAGCGGCAGCGAAACGCCGGGCAGCGAACCTGCCACGTCAGGCAGCGA PGSPAGSPTSTEEGTS GACGCCGGGTTCCCCTGCAGGCTCCCCGACCAGCACTGAGGAGGGCACC TEPSEGSAPGTSTEPS TCCACCGAACCATCAGAAGGTAGCGCGCCTGGTACGTCAACCGAACCTT EGSAPGGSAPESGRAA CCGAGGGCAGCGCACCGGGTGGCTCAGCGCCTGAATCTGGTCGTGCAGC NTEPPELGAGATSGSE TAACACCGAACCTCCCGAGCTCGGGGCCGGCGCCACCTCAGGTAGCGAG TPGTDIQMTQSPSSLS ACCCCCGGGACCGATATCCAAATGACACAGTCCCCTTCTTCTCTGAGCG ASVGDRVTITCQASQD

Nome da Seqüência de Seqüência de DNA construção aminoácidos*

CCTCTGTTGGCGATAGAGTGACAATCACCTGTCAGGCTTCTCAAGATAT ISNYLNWYQQKPGKAP AAGCAATTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAAGCCCCTAAA KLLIYDASNLETGVPS CTGCTGATCTACGATGCCAGCAATCTGGAAACAGGAGTTCCTAGCAGAT RFSGSGSGTDFTFTIS TCAGCGGCAGCGGCTCTGGAACCGATTTCACATTCACCATCAGCTCTTT SLQPEDIATYFCQHFD ACAGCCAGAGGATATCGCTACTTACTTTTGCCAGCACTTCGACCACCTG HLPLAFGGGTKVEIKG CCTCTGGCTTTTGGCGGTGGTACAAAAGTGGAGATCAAAGGGGCCACAC ATPPETGAETESPGET CCCCAGAGACTGGGGCAGAGACTGAGTCCCCCGGCGAGACAACAGGTGG TGGSAESEPPGEGQVQ TTCCGCCGAGAGTGAACCACCCGGAGAAGGACAGGTCCAGCTCCAGGAG LQESGPGLVKPSETLS AGCGGACCAGGACTGGTCAAGCCATCTGAAACCCTCTCTCTGACGTGCA LTCTVSGGSVSSGDYY CCGTTAGCGGCGGTAGTGTGTCCTCAGGCGACTACTACTGGACATGGAT WTWIRQSPGKGLEWIG CAGACAGTCCCCTGGCAAAGGATTGGAGTGGATCGGACACATTTATTAC HIYYSGNTNYNPSLKS AGCGGCAACACTAATTATAATCCTAGCCTGAAGTCTAGACTGACCATCA RLTISIDTSKTQFSLK GCATCGACACCAGCAAGACCCAGTTCAGCCTGAAGCTCAGTAGTGTTAC LSSVTAADTAIYYCVR CGCGGCTGACACCGCGATCTATTATTGCGTTCGGGACAGAGTGACAGGC DRVTGAFDIWGQGTMV GCCTTTGATATCTGGGGGCAGGGCACCATGGTGACTGTGAGCAGCGGGG TVSSGGGGSELVVTQE GGGGCGGAAGTGAGTTGGTCGTTACACAAGAGCCAAGCTTGACCGTGTC PSLTVSPGGTVTLTCR CCCGGGTGGCACAGTAACCCTCACCTGCCGATCCTCAACAGGAGCTGTG SSTGAVTTSNYANWVQ ACCACCAGCAACTATGCAAATTGGGTGCAACAAAAACCTGGTCAGGCAC QKPGQAPRGLIGGTNK CGCGTGGACTTATTGGAGGCACCAACAAAAGAGCACCTGGGACACCGGC RAPGTPARFSGSLLGG CCGGTTTTCCGGTAGCCTGCTTGGTGGCAAGGCCGCCCTCACATTATCT KAALTLSGVQPEDEAE GGAGTGCAGCCTGAGGATGAAGCCGAGTACTACTGCGCATTGTGGTACA YYCALWYSNLWVFGGG GCAACCTGTGGGTGTTTGGGGGCGGAACCAAGTTGACCGTCCTGGGAGC TKLTVLGATPPETGAE TACCCCCCCCGAAACTGGGGCCGAAACGGAATCTCCTGGTGAAACTACA TESPGETTGGSAESEP GGGGGAAGTGCAGAGAGCGAGCCACCAGGAGAGGGCGAAGTCCAGCTGC PGEGEVQLLESGGGLV TCGAATCCGGAGGCGGACTCGTGCAGCCAGGAGGAAGTCTTAAGCTCTC QPGGSLKLSCAASGFT ATGCGCCGCTAGCGGCTTTACCTTCAACACATACGCCATGAATTGGGTC FNTYAMNWVRQAPGKG CGACAGGCTCCCGGTAAAGGGCTGGAATGGGTGGCTCGAATACGTTCGA LEWVARIRSKYNNYAT AGTACAACAATTACGCTACTTACTACGCCGACAGCGTGAAGGACCGATT YYADSVKDRFTISRDD

Nome da Seqüência de Seqüência de DNA construção aminoácidos*

CACCATTAGTCGGGACGATAGCAAGAATACAGCCTACCTGCAGATGAAC SKNTAYLQMNNLKTED AACCTGAAGACCGAGGATACCGCGGTCTACTATTGTGTGCGCCATGGCA TAVYYCVRHGNFGNSY ATTTTGGCAACAGCTATGTGAGCTGGTTTGCCTATTGGGGCCAAGGCAC VSWFAYWGQGTLVTVS ACTGGTTACCGTCTCATCTGGGACCGCTGAAGCCGCTAGCGCTTCTGGG SGTAEAASASGESGRA GAATCAGGAAGAGCCGCCAATACTGAACCCCCCGAGCTGGGCGCTGGCC ANTEPPELGAGPGSPA CAGGTTCCCCCGCGGGGTCCCCCACTTCTACTGAAGAGGGCACTTCCGA GSPTSTEEGTSESATP GAGCGCTACTCCAGAGTCTGGCCCCGGAACATCCACTGAGCCTAGCGAG ESGPGTSTEPSEGSAP GGGTCGGCACCTGGGTCACCCGCTGGCTCCCCAACTTCCACCGAGGAAG GSPAGSPTSTEEGTST GGACATCAACCGAACCCTCTGAGGGCTCCGCCCCCGGTACTTCCACGGA EPSEGSAPGTSTEPSE GCCTAGTGAAGGCAGTGCCCCGGGTACTTCCGAAAGCGCAACTCCGGAA GSAPGTSESATPESGP TCCGGCCCTGGTTCTGAGCCTGCTACTTCCGGCTCTGAAACTCCAGGTA GSEPATSGSETPGSEP GCGAGCCAGCGACTTCTGGTTCTGAAACTCCAGGTTCACCGGCGGGTAG ATSGSETPGSPAGSPT CCCGACGAGCACGGAGGAAGGTACCTCTGAGTCGGCCACTCCTGAGTCC STEEGTSESATPESGP GGTCCGGGCACGAGCACCGAGCCGAGCGAGGGTTCAGCCCCGGGTACCA GTSTEPSEGSAPGTST GCACGGAGCCGTCCGAGGGTAGCGCACCGGGTTCTCCGGCGGGCTCCCC EPSEGSAPGSPAGSPT TACGTCTACGGAAGAGGGTACGTCCACTGAACCTAGCGAGGGCAGCGCG STEEGTSTEPSEGSAP CCAGGCACCAGCACTGAACCGAGCGAAGGCAGCGCACCTGGCACTAGCG GTSTEPSEGSAPGTSE AGTCTGCGACTCCGGAGAGCGGTCCGGGTACGAGCACGGAACCAAGCGA SATPESGPGTSTEPSE AGGCAGCGCCCCAGGTACCTCTGAATCTGCTACCCCAGAATCTGGCCCG GSAPGTSESATPESGP GGTTCCGAGCCAGCTACCTCTGGTTCTGAAACCCCAGGTACTTCCACTG GSEPATSGSETPGTST AACCAAGCGAAGGTAGCGCTCCTGGCACTTCTACTGAACCATCCGAAGG EPSEGSAPGTSTEPSE TTCCGCTCCTGGTACGTCTGAAAGCGCTACCCCTGAAAGCGGCCCAGGC GSAPGTSESATPESGP ACCTCTGAAAGCGCTACTCCTGAGAGCGGTCCAGGCTCTCCAGCAGGTT GTSESATPESGPGSPA CTCCAACCTCCACTGAAGAAGGCACCTCTGAGTCTGCTACCCCTGAATC GSPTSTEEGTSESATP TGGTCCTGGCTCCGAACCTGCTACCTCTGGTTCCGAAACTCCAGGTACC ESGPGSEPATSGSETP TCGGAATCTGCGACTCCGGAATCTGGCCCGGGCACGAGCACGGAGCCGT GTSESATPESGPGTST CTGAGGGTAGCGCACCAGGTACCAGCACTGAGCCTTCTGAGGGCTCTGC EPSEGSAPGTSTEPSE ACCGGGTACCTCCACGGAACCTTCGGAAGGTTCTGCGCCGGGTACCTCC GSAPGTSTEPSEGSAP

Nome da Seqüência de Seqüência de DNA construção aminoácidos*

ACTGAGCCATCCGAGGGTTCAGCACCAGGTACTAGCACGGAACCGTCCG GTSTEPSEGSAPGTST AGGGCTCTGCACCAGGTACGAGCACCGAACCGTCGGAGGGTAGCGCTCC EPSEGSAPGTSTEPSE AGGTAGCCCAGCGGGCTCTCCGACAAGCACCGAAGAAGGCACCAGCACC GSAPGSPAGSPTSTEE GAGCCGTCCGAAGGTTCCGCACCAGGTACAAGCGAGAGCGCGACTCCTG GTSTEPSEGSAPGTSE AATCTGGTCCGGGTAGCGAGCCTGCAACCAGCGGTTCTGAGACGCCGGG SATPESGPGSEPATSG CACTTCCGAATCTGCGACCCCGGAGTCCGGTCCAGGTTCAGAGCCGGCG SETPGTSESATPESGP ACGAGCGGTTCGGAAACGCCGGGTACGTCTGAATCAGCCACGCCGGAGT GSEPATSGSETPGTSE CTGGTCCGGGTACCTCGACCGAACCAAGCGAAGGTTCGGCACCGGGTAC SATPESGPGTSTEPSE TAGCGAGAGCGCAACCCCTGAAAGCGGTCCGGGCAGCCCGGCAGGTTCT GSAPGTSESATPESGP CCAACCAGCACCGAAGAAGGTTCCCCTGCTGGTAGCCCGACCTCTACGG GSPAGSPTSTEEGSPA AGGAAGGTAGCCCTGCAGGTTCCCCAACTTCTACTGAGGAAGGTACTTC GSPTSTEEGSPAGSPT TGAGTCCGCTACCCCAGAAAGCGGTCCTGGTACCTCCACTGAACCGTCT STEEGTSESATPESGP GAAGGCTCTGCACCAGGCACTTCTGAGTCTGCTACTCCAGAAAGCGGCC GTSTEPSEGSAPGTSE CAGGTTCTGAACCAGCAACTTCTGGCTCTGAGACTCCAGGCACTTCTGA SATPESGPGSEPATSG GTCCGCAACGCCTGAATCCGGTCCTGGTTCTGAACCAGCTACTTCCGGC SETPGTSESATPESGP AGCGAAACCCCAGGTACCTCTGAGTCTGCGACTCCAGAGTCTGGTCCTG GSEPATSGSETPGTSE GTACTTCCACTGAGCCTAGCGAGGGTTCCGCACCAGGTTCTCCGGCTGG SATPESGPGTSTEPSE TAGCCCGACCAGCACGGAGGAGGGTACGTCTGAATCTGCAACGCCGGAA GSAPGSPAGSPTSTEE TCGGGCCCAGGTTCGGAGCCTGCAACGTCTGGCAGCGAAACCCCGGGTA GTSESATPESGPGSEP CCTCCGAATCTGCTACACCGGAAAGCGGTCCTGGCAGCCCTGCTGGTTC ATSGSETPGTSESATP TCCAACCTCTACCGAGGAGGGTTCACCGGCAGGTAGCCCGACTAGCACT ESGPGSPAGSPTSTEE GAAGAAGGTACTAGCACGGAGCCGAGCGAGGGTAGTGCTCCGGGTACGA GSPAGSPTSTEEGTST GCGAGAGCGCAACGCCAGAGAGCGGTCCAGGCACCAGCGAATCGGCCAC EPSEGSAPGTSESATP CCCTGAGAGCGGCCCAGGTACTTCTGAGAGCGCCACTCCTGAATCCGGC ESGPGTSESATPESGP CCTGGTAGCGAGCCGGCAACCTCCGGCTCAGAAACTCCTGGTTCGGAAC GTSESATPESGPGSEP CAGCGACCAGCGGTTCTGAAACTCCGGGTAGCCCGGCAGGCAGCCCAAC ATSGSETPGSEPATSG GAGCACCGAAGAGGGTACCAGCACGGAACCGAGCGAGGGTTCTGCCCCG SETPGSPAGSPTSTEE GGTACTTCCACCGAACCATCGGAGGGCTCTGCACCTGGTAGCGAACCTG GTSTEPSEGSAPGTST

Nome da Seqüência de Seqüência de DNA construção aminoácidos*

CGACGTCTGGTTCTGAAACGCCGGGTACCAGCGAAAGCGCTACCCCAGA EPSEGSAPGSEPATSG ATCCGGTCCGGGCACTAGCACCGAGCCATCGGAGGGCGCCGCAGAACCA SETPGTSESATPESGP

GAGGCG GTSTEPSEGAAEPEA AC1969 ATGAAGAAAAACATCGCTTTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTA SPAGSPTSTEEGTSES

TTGCTACAAACGCGTACGCTTCCCCAGCAGGCAGCCCGACCAGCACCGA ATPESGPGTSTEPSEG GGAGGGTACGAGCGAGTCGGCTACTCCAGAGAGCGGTCCGGGTACCTCT SAPGTSESATPESGPG ACGGAACCGTCCGAAGGTAGCGCTCCAGGCACGTCTGAAAGCGCGACGC SEPATSGSETPGTSES CGGAAAGCGGTCCAGGCAGCGAGCCGGCGACCTCCGGTAGCGAAACGCC ATPESGPGSEPATSGS TGGTACCTCGGAGTCAGCGACTCCGGAAAGCGGTCCGGGTAGCGAACCT ETPGTSESATPESGPG GCAACGAGCGGTAGCGAGACTCCAGGCACTAGCGAATCCGCAACTCCGG TSTEPSEGSAPGSPAG AGTCGGGTCCGGGCACCTCTACGGAGCCTAGCGAGGGCTCAGCACCAGG SPTSTEEGTSESATPE TAGCCCTGCAGGTTCCCCGACGTCAACCGAGGAAGGTACAAGCGAAAGC SGPGSEPATSGSETPG GCCACCCCTGAGTCGGGCCCTGGCAGCGAACCGGCAACTAGCGGCAGCG TSESATPESGPGSPAG AGACTCCGGGTACCAGCGAGTCTGCTACGCCAGAGAGCGGCCCAGGTTC SPTSTEEGSPAGSPTS GCCAGCGGGTTCGCCGACTAGCACGGAGGAGGGCAGCCCAGCGGGTAGC TEEGTSTEPSEGSAPG CCGACCAGCACTGAGGAGGGTACGTCCACCGAACCGAGCGAAGGTAGCG TSESATPESGPGTSES CACCAGGTACCTCCGAGTCTGCCACCCCTGAATCCGGTCCAGGTACCAG ATPESGPGTSESATPE CGAATCAGCCACCCCGGAGTCGGGTCCAGGTACGAGCGAATCTGCTACC SGPGSEPATSGSETPG CCGGAATCCGGCCCAGGCAGCGAACCTGCTACTAGCGGCAGCGAAACGC SEPATSGSETPGSPAG CGGGCAGCGAACCTGCCACGTCAGGCAGCGAGACGCCGGGTTCCCCTGC SPTSTEEGTSTEPSEG AGGCTCCCCGACCAGCACTGAGGAGGGCACCTCCACCGAACCATCAGAA SAPGTSTEPSEGSAPG GGTAGCGCGCCTGGTACGTCAACCGAACCTTCCGAGGGCAGCGCACCGG GSAPESGRAANTEPPE GTGGCTCTGCTCCTGAATCAGGGAGAGCCGCGAACACAGAACCACCCGA LGAGATSGSETPGTDI GCTCGGCGCCGGAGCCACCTCTGGCAGCGAGACACCTGGGACGGACATC QMTQSPSSLSASVGDR CAGATGACACAATCCCCAAGCTCACTGTCCGCATCCGTCGGCGACCGGG VTITCRSTKSLLHSNG TTACTATTACATGTCGCAGTACAAAGTCTCTGCTGCACTCTAACGGCAT ITYLYWYQQKPGKAPK TACGTACCTGTACTGGTACCAGCAAAAGCCCGGCAAAGCCCCCAAGCTG LLIYQMSNLASGVPSR

Nome da Seqüência de Seqüência de DNA construção aminoácidos*

CTGATTTATCAGATGAGTAATCTGGCATCCGGAGTACCGAGCCGGTTTT FSSSGSGTDFTLTISS CCAGTTCTGGAAGCGGCACCGACTTCACGTTGACGATATCCAGCCTCCA LQPEDFATYYCAQNLE GCCTGAGGATTTCGCCACCTACTACTGCGCTCAGAATCTGGAGATCCCC IPRTFGQGTKVEIKGA CGGACTTTCGGACAGGGCACAAAGGTGGAGATTAAAGGCGCAACACCCC TPPETGAETESPGETT CCGAAACTGGAGCAGAAACTGAAAGCCCTGGAGAAACCACCGGCGGATC GGSAESEPPGEGQVQL CGCCGAGTCAGAACCGCCAGGAGAAGGGCAAGTTCAGCTCGTTCAGTCT VQSGPGLVQPGGSVRI GGCCCAGGACTCGTTCAGCCTGGTGGAAGTGTGAGGATAAGCTGCGCTG SCAASGYTFTNYGMNW CCTCTGGCTATACCTTCACGAATTACGGCATGAATTGGGTAAAACAGGC VKQAPGKGLEWMGWIN CCCCGGAAAGGGCCTGGAGTGGATGGGCTGGATCAACACCTATACAGGA TYTGESTYADSFKGRF GAGAGTACCTATGCCGACTCATTTAAGGGGCGGTTCACCTTCAGCCTGG TFSLDTSASAAYLQIN ACACCTCTGCCTCCGCCGCCTACCTCCAAATTAACTCACTAAGAGCAGA SLRAEDTAVYYCARFA GGACACCGCGGTGTATTATTGCGCAAGGTTTGCCATCAAAGGCGATTAC IKGDYWGQGTLLTVSS TGGGGCCAAGGCACCTTGCTTACAGTGAGCTCTGGAGGAGGAGGGTCAG GGGGSDIQMTQSPSSL ACATTCAAATGACCCAGAGCCCAAGCAGTCTCCCAGCTAGTCTAGGGGA PASLGDRVTINCQASQ TCGGGTTACCATAAATTGTCAGGCTTCTCAAGATATTAGTAATTATCTG DISNYLNWYQQKPGKA AACTGGTATCAACAGAAGCCCGGTAAAGCGCCAAAATTGCTCATCTACT PKLLIYYTNKLADGVP ATACGAATAAACTGGCAGATGGGGTACCCTCCAGATTCTCCGGTAGTGG SRFSGSGSGRDSSFTI TTCAGGCCGGGACTCGTCGTTCACTATTAGCAGCCTGGAGTCTGAGGAT SSLESEDIGSYYCQQY ATAGGCAGCTACTACTGCCAGCAATATTACAACTATCCATGGACCTTCG YNYPWTFGPGTKLEIK GGCCAGGCACCAAGCTGGAAATCAAGGGCGCAACACCACCCGAGACTGG GATPPETGAETESPGE TGCTGAAACCGAAAGCCCCGGTGAAACAACAGGCGGCTCTGCAGAGTCG TTGGSAESEPPGEGEV GAACCTCCCGGAGAGGGGGAGGTGCAGCTGGTGGAAAGTGGAGGCGGAC QLVESGGGLVQPGKSL TGGTGCAACCTGGGAAAAGCCTGAAGCTGTCCTGTGAAGCATCGGGCTT KLSCEASGFTFSGYGM TACATTTAGCGGGTATGGCATGCATTGGGTGCGGCAGGCGCCCGGTCGT HWVRQAPGRGLESVAY GGCCTCGAATCTGTGGCCTACATCACTAGCTCTTCAATCAACATCAAGT ITSSSINIKYADAVKG ACGCCGATGCCGTGAAGGGCAGATTTACAGTGAGCCGGGATAATGCCAA RFTVSRDNAKNLLFLQ GAACCTGCTGTTCCTTCAAATGAACATCCTAAAGAGCGAGGACACCGCC MNILKSEDTAMYYCAR ATGTACTACTGCGCAAGGTTCGACTGGGACAAGAATTATTGGGGCCAGG FDWDKNYWGQGTMVTV

Nome da Seqüência de Seqüência de DNA construção aminoácidos*

GCACAATGGTAACAGTCTCTAGCGGGACAGCCGAGGCCGCTAGCGCCTC SSGTAEAASASGESGR TGGAGAGTCGGGGCGAGCGGCTAATACAGAACCACCTGAACTGGGTGCC AANTEPPELGAGSPGS GGGTCTCCCGGTAGTCCTGCCGGGAGCCCCACAAGCACTGAAGAGGGAA PAGSPTSTEEGTSESA CCTCTGAGTCAGCTACCCCGGAAAGCGGCCCCGGCACCTCTACGGAACC TPESGPGTSTEPSEGS CTCCGAGGGATCTGCTCCAGGGTCCCCGGCCGGAAGCCCTACCTCAACA APGSPAGSPTSTEEGT GAAGAGGGCACGTCCACTGAGCCTAGCGAAGGGTCAGCCCCCGGAACCA STEPSEGSAPGTSTEP GCACAGAACCCTCAGAGGGCAGTGCACCGGGTACTTCCGAAAGCGCAAC SEGSAPGTSESATPES TCCGGAATCCGGCCCTGGTTCTGAGCCTGCTACTTCCGGCTCTGAAACT GPGSEPATSGSETPGS CCAGGTAGCGAGCCAGCGACTTCTGGTTCTGAAACTCCAGGTTCACCGG EPATSGSETPGSPAGS CGGGTAGCCCGACGAGCACGGAGGAAGGTACCTCTGAGTCGGCCACTCC PTSTEEGTSESATPES TGAGTCCGGTCCGGGCACGAGCACCGAGCCGAGCGAGGGTTCAGCCCCG GPGTSTEPSEGSAPGT GGTACCAGCACGGAGCCGTCCGAGGGTAGCGCACCGGGTTCTCCGGCGG STEPSEGSAPGSPAGS GCTCCCCTACGTCTACGGAAGAGGGTACGTCCACTGAACCTAGCGAGGG PTSTEEGTSTEPSEGS CAGCGCGCCAGGCACCAGCACTGAACCGAGCGAAGGCAGCGCACCTGGC APGTSTEPSEGSAPGT ACTAGCGAGTCTGCGACTCCGGAGAGCGGTCCGGGTACGAGCACGGAAC SESATPESGPGTSTEP CAAGCGAAGGCAGCGCCCCAGGTACCTCTGAATCTGCTACCCCAGAATC SEGSAPGTSESATPES TGGCCCGGGTTCCGAGCCAGCTACCTCTGGTTCTGAAACCCCAGGTACT GPGSEPATSGSETPGT TCCACTGAACCAAGCGAAGGTAGCGCTCCTGGCACTTCTACTGAACCAT STEPSEGSAPGTSTEP CCGAAGGTTCCGCTCCTGGTACGTCTGAAAGCGCTACCCCTGAAAGCGG SEGSAPGTSESATPES CCCAGGCACCTCTGAAAGCGCTACTCCTGAGAGCGGTCCAGGCTCTCCA GPGTSESATPESGPGS GCAGGTTCTCCAACCTCCACTGAAGAAGGCACCTCTGAGTCTGCTACCC PAGSPTSTEEGTSESA CTGAATCTGGTCCTGGCTCCGAACCTGCTACCTCTGGTTCCGAAACTCC TPESGPGSEPATSGSE AGGTACCTCGGAATCTGCGACTCCGGAATCTGGCCCGGGCACGAGCACG TPGTSESATPESGPGT GAGCCGTCTGAGGGTAGCGCACCAGGTACCAGCACTGAGCCTTCTGAGG STEPSEGSAPGTSTEP GCTCTGCACCGGGTACCTCCACGGAACCTTCGGAAGGTTCTGCGCCGGG SEGSAPGTSTEPSEGS TACCTCCACTGAGCCATCCGAGGGTTCAGCACCAGGTACTAGCACGGAA APGTSTEPSEGSAPGT CCGTCCGAGGGCTCTGCACCAGGTACGAGCACCGAACCGTCGGAGGGTA STEPSEGSAPGTSTEP GCGCTCCAGGTAGCCCAGCGGGCTCTCCGACAAGCACCGAAGAAGGCAC SEGSAPGSPAGSPTST

Nome da Seqüência de Seqüência de DNA construção aminoácidos*

CAGCACCGAGCCGTCCGAAGGTTCCGCACCAGGTACAAGCGAGAGCGCG EEGTSTEPSEGSAPGT ACTCCTGAATCTGGTCCGGGTAGCGAGCCTGCAACCAGCGGTTCTGAGA SESATPESGPGSEPAT CGCCGGGCACTTCCGAATCTGCGACCCCGGAGTCCGGTCCAGGTTCAGA SGSETPGTSESATPES GCCGGCGACGAGCGGTTCGGAAACGCCGGGTACGTCTGAATCAGCCACG GPGSEPATSGSETPGT CCGGAGTCTGGTCCGGGTACCTCGACCGAACCAAGCGAAGGTTCGGCAC SESATPESGPGTSTEP CGGGTACTAGCGAGAGCGCAACCCCTGAAAGCGGTCCGGGCAGCCCGGC SEGSAPGTSESATPES AGGTTCTCCAACCAGCACCGAAGAAGGTTCCCCTGCTGGTAGCCCGACC GPGSPAGSPTSTEEGS TCTACGGAGGAAGGTAGCCCTGCAGGTTCCCCAACTTCTACTGAGGAAG PAGSPTSTEEGSPAGS GTACTTCTGAGTCCGCTACCCCAGAAAGCGGTCCTGGTACCTCCACTGA PTSTEEGTSESATPES ACCGTCTGAAGGCTCTGCACCAGGCACTTCTGAGTCTGCTACTCCAGAA GPGTSTEPSEGSAPGT AGCGGCCCAGGTTCTGAACCAGCAACTTCTGGCTCTGAGACTCCAGGCA SESATPESGPGSEPAT CTTCTGAGTCCGCAACGCCTGAATCCGGTCCTGGTTCTGAACCAGCTAC SGSETPGTSESATPES TTCCGGCAGCGAAACCCCAGGTACCTCTGAGTCTGCGACTCCAGAGTCT GPGSEPATSGSETPGT GGTCCTGGTACTTCCACTGAGCCTAGCGAGGGTTCCGCACCAGGTTCTC SESATPESGPGTSTEP CGGCTGGTAGCCCGACCAGCACGGAGGAGGGTACGTCTGAATCTGCAAC SEGSAPGSPAGSPTST GCCGGAATCGGGCCCAGGTTCGGAGCCTGCAACGTCTGGCAGCGAAACC EEGTSESATPESGPGS CCGGGTACCTCCGAATCTGCTACACCGGAAAGCGGTCCTGGCAGCCCTG EPATSGSETPGTSESA CTGGTTCTCCAACCTCTACCGAGGAGGGTTCACCGGCAGGTAGCCCGAC TPESGPGSPAGSPTST TAGCACTGAAGAAGGTACTAGCACGGAGCCGAGCGAGGGTAGTGCTCCG EEGSPAGSPTSTEEGT GGTACGAGCGAGAGCGCAACGCCAGAGAGCGGTCCAGGCACCAGCGAAT STEPSEGSAPGTSESA CGGCCACCCCTGAGAGCGGCCCAGGTACTTCTGAGAGCGCCACTCCTGA TPESGPGTSESATPES ATCCGGCCCTGGTAGCGAGCCGGCAACCTCCGGCTCAGAAACTCCTGGT GPGTSESATPESGPGS TCGGAACCAGCGACCAGCGGTTCTGAAACTCCGGGTAGCCCGGCAGGCA EPATSGSETPGSEPAT GCCCAACGAGCACCGAAGAGGGTACCAGCACGGAACCGAGCGAGGGTTC SGSETPGSPAGSPTST TGCCCCGGGTACTTCCACCGAACCATCGGAGGGCTCTGCACCTGGTAGC EEGTSTEPSEGSAPGT GAACCTGCGACGTCTGGTTCTGAAACGCCGGGTACCAGCGAAAGCGCTA STEPSEGSAPGSEPAT CCCCAGAATCCGGTCCGGGCACTAGCACCGAGCCATCGGAGGGCTCCGC SGSETPGTSESATPES ACCAGGTCACCATCATCACCATCAC GPGTSTEPSEGSAPGH

Nome da Seqüência de Seqüência de DNA construção aminoácidos*

HHHHH AC1972 ATGAAGAAAAACATCGCTTTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTA HHHHHHSPAGSPTSTE

TTGCTACAAACGCGTACGCTCACCATCATCACCATCACTCCCCAGCAGG EGTSESATPESGPGTS CAGCCCGACCAGCACCGAGGAGGGTACGAGCGAGTCGGCTACTCCAGAG TEPSEGSAPGTSESAT AGCGGTCCGGGTACCTCTACGGAACCGTCCGAAGGTAGCGCTCCAGGCA PESGPGSEPATSGSET CGTCTGAAAGCGCGACGCCGGAAAGCGGTCCAGGCAGCGAGCCGGCGAC PGTSESATPESGPGSE CTCCGGTAGCGAAACGCCTGGTACCTCGGAGTCAGCGACTCCGGAAAGC PATSGSETPGTSESAT GGTCCGGGTAGCGAACCTGCAACGAGCGGTAGCGAGACTCCAGGCACTA PESGPGTSTEPSEGSA GCGAATCCGCAACTCCGGAGTCGGGTCCGGGCACCTCTACGGAGCCTAG PGSPAGSPTSTEEGTS CGAGGGCTCAGCACCAGGTAGCCCTGCAGGTTCCCCGACGTCAACCGAG ESATPESGPGSEPATS GAAGGTACAAGCGAAAGCGCCACCCCTGAGTCGGGCCCTGGCAGCGAAC GSETPGTSESATPESG CGGCAACTAGCGGCAGCGAGACTCCGGGTACCAGCGAGTCTGCTACGCC PGSPAGSPTSTEEGSP AGAGAGCGGCCCAGGTTCGCCAGCGGGTTCGCCGACTAGCACGGAGGAG AGSPTSTEEGTSTEPS GGCAGCCCAGCGGGTAGCCCGACCAGCACTGAGGAGGGTACGTCCACCG EGSAPGTSESATPESG AACCGAGCGAAGGTAGCGCACCAGGTACCTCCGAGTCTGCCACCCCTGA PGTSESATPESGPGTS ATCCGGTCCAGGTACCAGCGAATCAGCCACCCCGGAGTCGGGTCCAGGT ESATPESGPGSEPATS ACGAGCGAATCTGCTACCCCGGAATCCGGCCCAGGCAGCGAACCTGCTA GSETPGSEPATSGSET CTAGCGGCAGCGAAACGCCGGGCAGCGAACCTGCCACGTCAGGCAGCGA PGSPAGSPTSTEEGTS GACGCCGGGTTCCCCTGCAGGCTCCCCGACCAGCACTGAGGAGGGCACC TEPSEGSAPGTSTEPS TCCACCGAACCATCAGAAGGTAGCGCGCCTGGTACGTCAACCGAACCTT EGSAPGGSAPESGRAA CCGAGGGCAGCGCACCGGGTGGCTCAGCGCCTGAATCTGGTCGTGCAGC NTEPPELGAGATSGSE TAACACCGAACCTCCTGAATTGGGAGCCGGTGCTACAAGCGGAAGTGAG TPGTDIQMTQSPSSLS ACCCCCGGGACCGATATCCAGATGACACAGAGCCCTTCTTCTCTGAGCG ASVGDRVTITCRSTKS CCTCTGTTGGCGATAGAGTGACAATCACCTGTAGGTCGACGAAGTCTCT LLHSNGITYLYWYQQK GCTGCACAGCAATGGCATCACCTACCTATACTGGTATCAACAAAAGCCG PGKAPKLLIYQMSNLA GGTAAAGCACCTAAACTGCTGATCTACCAGATGAGTAATCTGGCCTCTG SGVPSRFSSSGSGTDF GAGTTCCTAGCCGATTTTCTTCATCTGGCTCTGGCACCGATTTTACACT TLTISSLQPEDFATYY

Nome da Seqüência de Seqüência de DNA construção aminoácidos*

GACCATCTCTAGCCTGCAGCCTGAGGATTTTGCCACCTACTATTGCGCC CAQNLEIPRTFGQGTK CAGAACCTGGAAATCCCAAGGACATTTGGACAGGGCACCAAGGTGGAGA VEIKGATPPETGAETE TTAAGGGGGCAACACCTCCTGAAACAGGGGCCGAGACAGAGAGCCCCGG SPGETTGGSAESEPPG TGAGACAACTGGCGGGTCTGCTGAGAGCGAGCCTCCCGGTGAAGGACAG EGQVQLVQSGPGLVQP GTCCAACTGGTTCAGTCTGGGCCTGGGCTGGTCCAGCCCGGCGGTTCCG GGSVRISCAASGYTFT TGAGGATTAGTTGTGCTGCCAGCGGCTACACTTTCACCAATTATGGGAT NYGMNWVKQAPGKGLE GAACTGGGTTAAGCAGGCCCCAGGTAAGGGTCTGGAATGGATGGGCTGG WMGWINTYTGESTYAD ATCAACACTTACACCGGAGAATCTACCTATGCCGATTCCTTCAAAGGGA SFKGRFTFSLDTSASA GGTTTACTTTCTCTCTGGACACCAGTGCCAGTGCCGCTTACCTGCAGAT AYLQINSLRAEDTAVY CAATTCATTGAGGGCGGAAGATACCGCGGTGTATTACTGCGCCCGGTTC YCARFAIKGDYWGQGT GCTATCAAAGGCGACTATTGGGGGCAAGGTACGTTACTAACAGTGTCGT LLTVSSGGGGSELVVT CTGGCGGGGGAGGATCTGAATTAGTTGTGACCCAAGAGCCAAGCCTGAC QEPSLTVSPGGTVTLT TGTGAGCCCAGGCGGCACAGTGACCCTGACCTGTCGCTCCTCCACCGGA CRSSTGAVTTSNYANW GCTGTGACAACCAGCAATTATGCCAACTGGGTGCAGCAGAAACCAGGTC VQQKPGQAPRGLIGGT AGGCACCGCGTGGACTTATTGGCGGCACCAACAAAAGAGCTCCAGGAAC NKRAPGTPARFSGSLL ACCAGCCAGATTTTCTGGCTCTCTGCTTGGCGGAAAAGCTGCCCTGACA GGKAALTLSGVQPEDE TTATCTGGAGTTCAGCCTGAAGATGAGGCGGAATATTACTGTGCTCTGT AEYYCALWYSNLWVFG GGTACAGCAACCTGTGGGTGTTTGGAGGAGGTACCAAACTCACAGTTCT GGTKLTVLGATPPETG GGGAGCCACCCCCCCAGAGACTGGTGCTGAGACGGAATCTCCAGGAGAA AETESPGETTGGSAES ACCACTGGAGGATCAGCTGAGAGCGAACCACCCGGAGAGGGCGAAGTGC EPPGEGEVQLLESGGG AGCTCCTCGAATCCGGGGGCGGTTTAGTTCAGCCCGGAGGTTCTCTCAA LVQPGGSLKLSCAASG GCTGAGCTGTGCAGCTAGCGGATTCACATTTAACACATATGCCATGAAT FTFNTYAMNWVRQAPG TGGGTGCGGCAGGCTCCCGGTAAGGGTCTGGAGTGGGTGGCCCGAATCC KGLEWVARIRSKYNNY GCAGCAAGTACAATAACTACGCCACGTACTATGCCGACTCCGTGAAGGA ATYYADSVKDRFTISR CAGGTTCACTATATCTCGCGACGATAGCAAGAATACAGCCTACCTGCAG DDSKNTAYLQMNNLKT ATGAACAACCTCAAAACAGAGGACACCGCGGTATATTATTGCGTGAGAC EDTAVYYCVRHGNFGN ACGGGAACTTTGGAAACAGCTATGTGAGCTGGTTTGCCTACTGGGGTCA SYVSWFAYWGQGTLVT GGGCACCCTGGTAACCGTGAGCTCTGGGACAGCCGAGGCCGCTAGCGCC VSSGTAEAASASGESG

Nome da Seqüência de Seqüência de DNA construção aminoácidos*

TCCGGCGAATCCGGAAGAGCCGCCAATACTGAACCTCCCGAACTCGGCG RAANTEPPELGAGPGS CCGGTCCTGGTAGTCCCGCGGGCTCTCCAACATCAACCGAAGAGGGCAC PAGSPTSTEEGTSESA TAGCGAATCCGCAACCCCTGAGAGCGGGCCCGGCACTTCTACCGAACCT TPESGPGTSTEPSEGS TCGGAGGGCTCAGCCCCTGGCTCGCCCGCTGGTAGTCCCACCTCCACCG APGSPAGSPTSTEEGT AGGAAGGCACAAGCACCGAGCCCTCAGAGGGCAGCGCACCCGGTACATC STEPSEGSAPGTSTEP CACAGAGCCCTCTGAGGGCAGTGCTCCGGGTACTTCCGAAAGCGCAACT SEGSAPGTSESATPES CCGGAATCCGGCCCTGGTTCTGAGCCTGCTACTTCCGGCTCTGAAACTC GPGSEPATSGSETPGS CAGGTAGCGAGCCAGCGACTTCTGGTTCTGAAACTCCAGGTTCACCGGC EPATSGSETPGSPAGS GGGTAGCCCGACGAGCACGGAGGAAGGTACCTCTGAGTCGGCCACTCCT PTSTEEGTSESATPES GAGTCCGGTCCGGGCACGAGCACCGAGCCGAGCGAGGGTTCAGCCCCGG GPGTSTEPSEGSAPGT GTACCAGCACGGAGCCGTCCGAGGGTAGCGCACCGGGTTCTCCGGCGGG STEPSEGSAPGSPAGS CTCCCCTACGTCTACGGAAGAGGGTACGTCCACTGAACCTAGCGAGGGC PTSTEEGTSTEPSEGS AGCGCGCCAGGCACCAGCACTGAACCGAGCGAAGGCAGCGCACCTGGCA APGTSTEPSEGSAPGT CTAGCGAGTCTGCGACTCCGGAGAGCGGTCCGGGTACGAGCACGGAACC SESATPESGPGTSTEP AAGCGAAGGCAGCGCCCCAGGTACCTCTGAATCTGCTACCCCAGAATCT SEGSAPGTSESATPES GGCCCGGGTTCCGAGCCAGCTACCTCTGGTTCTGAAACCCCAGGTACTT GPGSEPATSGSETPGT CCACTGAACCAAGCGAAGGTAGCGCTCCTGGCACTTCTACTGAACCATC STEPSEGSAPGTSTEP CGAAGGTTCCGCTCCTGGTACGTCTGAAAGCGCTACCCCTGAAAGCGGC SEGSAPGTSESATPES CCAGGCACCTCTGAAAGCGCTACTCCTGAGAGCGGTCCAGGCTCTCCAG GPGTSESATPESGPGS CAGGTTCTCCAACCTCCACTGAAGAAGGCACCTCTGAGTCTGCTACCCC PAGSPTSTEEGTSESA TGAATCTGGTCCTGGCTCCGAACCTGCTACCTCTGGTTCCGAAACTCCA TPESGPGSEPATSGSE GGTACCTCGGAATCTGCGACTCCGGAATCTGGCCCGGGCACGAGCACGG TPGTSESATPESGPGT AGCCGTCTGAGGGTAGCGCACCAGGTACCAGCACTGAGCCTTCTGAGGG STEPSEGSAPGTSTEP CTCTGCACCGGGTACCTCCACGGAACCTTCGGAAGGTTCTGCGCCGGGT SEGSAPGTSTEPSEGS ACCTCCACTGAGCCATCCGAGGGTTCAGCACCAGGTACTAGCACGGAAC APGTSTEPSEGSAPGT CGTCCGAGGGCTCTGCACCAGGTACGAGCACCGAACCGTCGGAGGGTAG STEPSEGSAPGTSTEP CGCTCCAGGTAGCCCAGCGGGCTCTCCGACAAGCACCGAAGAAGGCACC SEGSAPGSPAGSPTST AGCACCGAGCCGTCCGAAGGTTCCGCACCAGGTACAAGCGAGAGCGCGA EEGTSTEPSEGSAPGT

Nome da Seqüência de Seqüência de DNA construção aminoácidos*

CTCCTGAATCTGGTCCGGGTAGCGAGCCTGCAACCAGCGGTTCTGAGAC SESATPESGPGSEPAT GCCGGGCACTTCCGAATCTGCGACCCCGGAGTCCGGTCCAGGTTCAGAG SGSETPGTSESATPES CCGGCGACGAGCGGTTCGGAAACGCCGGGTACGTCTGAATCAGCCACGC GPGSEPATSGSETPGT CGGAGTCTGGTCCGGGTACCTCGACCGAACCAAGCGAAGGTTCGGCACC SESATPESGPGTSTEP GGGTACTAGCGAGAGCGCAACCCCTGAAAGCGGTCCGGGCAGCCCGGCA SEGSAPGTSESATPES GGTTCTCCAACCAGCACCGAAGAAGGTTCCCCTGCTGGTAGCCCGACCT GPGSPAGSPTSTEEGS CTACGGAGGAAGGTAGCCCTGCAGGTTCCCCAACTTCTACTGAGGAAGG PAGSPTSTEEGSPAGS TACTTCTGAGTCCGCTACCCCAGAAAGCGGTCCTGGTACCTCCACTGAA PTSTEEGTSESATPES CCGTCTGAAGGCTCTGCACCAGGCACTTCTGAGTCTGCTACTCCAGAAA GPGTSTEPSEGSAPGT GCGGCCCAGGTTCTGAACCAGCAACTTCTGGCTCTGAGACTCCAGGCAC SESATPESGPGSEPAT TTCTGAGTCCGCAACGCCTGAATCCGGTCCTGGTTCTGAACCAGCTACT SGSETPGTSESATPES TCCGGCAGCGAAACCCCAGGTACCTCTGAGTCTGCGACTCCAGAGTCTG GPGSEPATSGSETPGT GTCCTGGTACTTCCACTGAGCCTAGCGAGGGTTCCGCACCAGGTTCTCC SESATPESGPGTSTEP GGCTGGTAGCCCGACCAGCACGGAGGAGGGTACGTCTGAATCTGCAACG SEGSAPGSPAGSPTST CCGGAATCGGGCCCAGGTTCGGAGCCTGCAACGTCTGGCAGCGAAACCC EEGTSESATPESGPGS CGGGTACCTCCGAATCTGCTACACCGGAAAGCGGTCCTGGCAGCCCTGC EPATSGSETPGTSESA TGGTTCTCCAACCTCTACCGAGGAGGGTTCACCGGCAGGTAGCCCGACT TPESGPGSPAGSPTST AGCACTGAAGAAGGTACTAGCACGGAGCCGAGCGAGGGTAGTGCTCCGG EEGSPAGSPTSTEEGT GTACGAGCGAGAGCGCAACGCCAGAGAGCGGTCCAGGCACCAGCGAATC STEPSEGSAPGTSESA GGCCACCCCTGAGAGCGGCCCAGGTACTTCTGAGAGCGCCACTCCTGAA TPESGPGTSESATPES TCCGGCCCTGGTAGCGAGCCGGCAACCTCCGGCTCAGAAACTCCTGGTT GPGTSESATPESGPGS CGGAACCAGCGACCAGCGGTTCTGAAACTCCGGGTAGCCCGGCAGGCAG EPATSGSETPGSEPAT CCCAACGAGCACCGAAGAGGGTACCAGCACGGAACCGAGCGAGGGTTCT SGSETPGSPAGSPTST GCCCCGGGTACTTCCACCGAACCATCGGAGGGCTCTGCACCTGGTAGCG EEGTSTEPSEGSAPGT AACCTGCGACGTCTGGTTCTGAAACGCCGGGTACCAGCGAAAGCGCTAC STEPSEGSAPGSEPAT CCCAGAATCCGGTCCGGGCACTAGCACCGAGCCATCGGAGGGCGCCGCA SGSETPGTSESATPES GAACCAGAGGCG GPGTSTEPSEGAAEPE A

* peptídeo sublinhado representa o peptídeo sinalizador. Exemplo 46: Produção de XTEN-Único-ProTIA

[459] EXPRESSÃO: Construções que se adequam ao formato aEpCAM-aCD3-RS-XTEN_AE864_His(6) foram expressas em uma cepa proprietária de E. coli AmE098 e divididas no periplasma por meio de uma seqüência-líder secretora do terminal-N (MKKNIAFLLASMFVFSIATNAYA-), que foi clivada durante translocalização. Foram desenvolvidas culturas de fermentação com meio complexo livre de material animal a 37°C e a temperatura foi alterada para 26°C antes da depleção de fosfato. Durante a colheita, o caldo de fermentação inteiro foi centrifugado para peletizar as células. Na colheita, o volume total e o peso líquido de células (WCW; proporção de pélete para sobrenadante) foram registrados, e as células peletizadas foram coletadas e congeladas a -80°C.

[460] RECUPERAÇÃO: O pélete de células congelado foi ressuspenso em Tampão de Lise (17,7 mM de ácido cítrico, 22,3 mM de Na₂HPO₄, 75 mM de NaCl, 2 mM de EDTA, pH 4,0) visando 30% de peso líquido de células. Foi permitido que a ressuspensão equilibrasse em pH 4, e depois ela foi homogeneizada por meio de duas passagens a 800 ± 50 bar, enquanto a temperatura de saída era monitorada e mantida em 15 ± 5°C. O pH do homogeneizado foi confirmado como estando dentro da faixa especificada (pH 4,0 ± 0,2).

[461] CLARIFICAÇÃO: Para reduzir impurezas de endotoxina e da célula hospedeira, o homogeneizado foi submetido à floculação em baixa temperatura (10 ± 5°C), ácida (pH 4,0 ± 0,2) de um dia para o outro (15-20 horas). Para remover a fração insolúvel, o homogeneizado floculado foi centrifugado por 40 minutos a 16.900 RCF a 2-8°C, e o sobrenadante foi retido. O sobrenadante foi diluído aproximadamente 3 vezes com água Milli-Q (MQ), e depois ajustado até 7 ± 1 mS/cm com 5 M de NaCl. Para remover ácido nucleico, lipídeos e endotoxina e para agir como um auxiliar de filtração, o sobrenadante foi ajustado até 0,1% (m/m) de terra diatomácea. Para manter o auxiliar de filtração suspenso, o sobrenadante foi misturado por meio de um impulsor e foi permitido que equilibrasse por 30 minutos. Um trem de filtração, que consiste em um filtro profundo, seguido por um filtro de 0,22 µm, foi montado e depois enxaguado com MQ. O sobrenadante foi bombeado através do trem de filtração, enquanto o fluxo era modulado para manter uma queda de pressão de 2,73 ± 1,35 bar. Para ajustar o sistema-tampão composto (com base na proporção de ácido cítrico e Na₂HPO₄) à faixa desejada para cromatografia de captura, o filtrado foi ajustado com 500 mM de Na₂HPO₄, de modo que a proporção final de Na₂HPO₄ para ácido cítrico fosse de 9,33:1, e o pH do filtrado tamponado foi confirmado como estando dentro da faixa especificada (pH 7,0 ± 0,2).

[462] PURIFICAÇÃO: Captura por AEX: Para separar dímero, agregado e pedaços grandes de produto monomérico, e para remover endotoxina e ácidos nucleicos, cromatografia por troca de ânions (AEX) foi utilizada para capturar o domínio do XTEN eletronegativo do terminal-C (AE864). A fase estacionária de AEX1 (GE Q Sefarose FF), fase móvel A de AEX1 (12,2 mM de Na₂HPO₄, 7,8 mM de NaH₂PO₄, 40 mM de NaCl) e fase móvel B de AEX1 (12,2 mM de Na₂HPO₄, 7,8 mM de NaH₂PO₄, 500 mM de NaCl) foram usadas nesse relatório descritivo. A coluna foi equilibrada com fase móvel A de AEX1. Com base na concentração total de proteína medida por ensaio de ácido bicinconínico (BCA), o filtrado foi carregado sobre a coluna visando 28 ± 4 g/l-resina, seguida com fase móvel A de AEX1, e depois lavada com uma etapa até 30% de B. Material ligado foi eluído com um gradiente de 30% de B até 60% de B ao longo de 20 CV. Foram coletadas frações em alíquotas de 1 CV enquanto A220 ≥ 100 mAU acima do nível de base (local). As frações de eluição foram analisadas e reunidas em pool com base em SDS-PAGE e SE-HPLC.

[463] Purificação intermediária por IMAC: Para assegurar integridade do terminal-C, cromatografia por afinidade imobilizada em metal (IMAC) foi usada para capturar o tag de polihistidina (His(6)) do terminal-C. A fase estacionária de IMAC (GE IMAC Sefarose FF), fase móvel A de IMAC (18,3 mM de Na₂HPO₄, 1,7 mM de NaH₂PO₄, 500 mM de NaCl, 1 mM de imidazol), e fase móvel B de IMAC (18,3 mM de Na₂HPO₄, 1,7 mM de NaH₂PO₄, 500 mM de NaCl, 500 mM de imidazol) foram usadas nesse relatório descritivo. A coluna foi carregada com solução de zinco e equilibrada com fase móvel A de IMAC. O Pool de AEX1 foi ajustado até pH 7,8 ± 0,1, 50 ± 5 mS/cm (com 5 M de NaCl) e 1 mM de imidazol, carregada sobre a coluna de IMAC visando 2 g/l-resina, e seguida com fase móvel A de IMAC até que a absorbância a 280 nm (A280) retornasse ao nível de base (local). Material ligado foi eluído com uma etapa até 25% de fase móvel B de IMAC. A coleta da Eluição de IMAC foi iniciada quando A280 ≥ 10 mAU acima do nível de base (local), direcionada a um recipiente pré-estriado com EDTA suficiente para levar 2 CV a 2 mM de EDTA, e terminada após 2 CV terem sido coletados. A eluição foi analisada por SDS-PAGE.

[464] Purificação intermediária de Proteína-L: Para assegurar a integridade do terminal-N, Proteína-L foi usada para capturar domínios kappa presentes próximos ao terminal- N da molécula (especificamente o scFv de aEpCAM). Fase estacionária de Proteína-L (GE Capto L), fase móvel A de Proteína-L (16,0 mM de ácido cítrico, 20,0 mM de Na₂HPO₄, pH 4,0 ± 0,1), fase móvel B de Proteína-L (29,0 mM de ácido cítrico, 7,0 mM de Na₂HPO₄, pH 2,60 ± 0,02) e fase móvel C de Proteína-L (3,5 mM de ácido cítrico, 32,5 mM de Na₂HPO₄, 250 mM de NaCl, pH 7,0 ± 0,1) foram usadas nesse relatório descritivo. A coluna foi equilibrada com fase móvel C de Proteína-L. A Eluição de IMAC foi ajustada até pH 7,0 ± 0,1 e 30 ± 3 mS/cm (com 5 M de NaCl e MQ) e carregada sobre a coluna de Proteína-L visando 2 g/l-resina, e depois seguida com fase móvel C de Proteína-L até que a absorbância a 280 nm (A280) retornasse ao nível de base (local). A coluna foi lavada com fase móvel A de Proteína-L e fases móveis A e B de Proteína-L foram usadas para efetuar eluição em pH baixo. Material ligado foi eluído em pH de aproximadamente 3,0 e coletado em um recipiente pré-estriado com uma parte de 0,5 M de Na₂HPO₄ para cada volume coletado de 10 partes. As frações foram analisadas por SDS-PAGE.

[465] Polimento por HIC: Para separar variantes do terminal-N (4 resíduos no terminal-N absoluto não são essenciais para ligação à Proteína-L) e variantes de conformação global, cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) foi usada. A fase estacionária de HIC (GE Capto Phenyl ImpRes), fase móvel A de HIC (20 mM de histidina, 0,02% (p/v) de polissorbato 80, pH 6,5 ± 0,1) e fase móvel B de HIC (1 M de sulfato de amônio, 20 mM de histidina, 0,02% (p/v) de polissorbato 80, pH 6,5 ± 0,1) foram usadas nesse relatório descritivo. A coluna foi equilibrada com fase móvel B de HIC. A Eluição ajustada de Proteína-L foi carregada sobre a coluna de HIC visando 2 g/l-resina e seguida com fase móvel B de HIC até que a absorbância a 280 nm (A280) retornasse ao nível de base (local). A coluna foi lavada com 50% de B. Material ligado foi eluído com um gradiente de 50% de B até 0% de B ao longo de 75 CV. Foram coletadas frações em alíquotas de 1 CV enquanto A280 ≥ 3 mAU acima do nível de base (local). As frações de eluição foram analisadas e reunidas em pool com base em SE-HPLC e HI-HPLC.

[466] FORMULAÇÃO: Para trocar o produto em tampão de formulação e para levar o produto até a concentração-alvo (0,5 g/l), foi novamente usada troca de ânions para capturar o XTEN do terminal-C (AE864). Fase estacionária de AEX2 (GE Q Sefarose FF), fase móvel A de AEX2 (20 mM de histidina, 40 mM de NaCl, 0,02% (p/v) de polissorbato 80, pH 6,5 ± 0,2), fase móvel B de AEX2 (20 mM de histidina, 1 M de NaCl, 0,02% (p/v) de polissorbato 80, pH 6,5 ± 0,2) e fase móvel C de AEX2 (12,2 mM de Na₂HPO₄, 7,8 mM de NaH₂PO₄, 40 mM de NaCl, 0,02% (p/v) de polissorbato 80, pH 7,0 ± 0,2) foram usadas nesse relatório descritivo. A coluna foi equilibrada com fase móvel C de AEX2. O Pool de HIC foi ajustado até pH 7,0 ± 0,1 e 7 ± 1 mS/cm (com MQ) e carregado sobre a coluna de AEX2 visando 2 g/l-resina, e depois seguida com fase móvel C de AEX2 até que a absorbância a A280 retornasse ao nível de base (local). A coluna foi lavada com fase móvel A de AEX2 (20 mM de histidina, 40 mM de NaCl, 0,02% (p/v) de polissorbato 80, pH 6,5 ± 0,2). As fases móveis A e B de AEX2 foram usadas para gerar uma etapa de [NaCl] e efetuar a eluição. Material ligado foi eluído com uma etapa até 38%

de fase móvel B de AEX2. A coleta da Eluição de AEX2 foi iniciada quando A280 ≥ 5 mAU acima do nível de base (local) e terminada após 2 CV terem sido coletados. A Eluição de AEX2 foi filtrada a 0,22 µm dentro de um BSC, dividida em alíquotas, rotulada e armazenada a -80°C como Substância Farmacológica a Granel (BDS). A Substância Farmacológica a Granel (BDS) foi confirmada por vários métodos analíticos para atender a todos os critérios de liberação de lote. A qualidade global foi analisada por SDS-PAGE (FIG. 84), a proporção de monômero para dímero e agregado foi analisada por SE-HPLC (FIG. 85A), e a qualidade do terminal-N e homogeneidade do produto foram analisados por HI-HPLC (FIG. 85B). Exemplo 47: Produção de XTEN-Duplo-ProTIA Molécula AC1955: His(6)_XTEN_AE288-RSR2295-aEGFR-aCD3- RSR2295-XTEN_AE864_EPEA

[467] EXPRESSÃO: AC1955 foi expresso em uma cepa proprietária de E. coli AmE098 e dividido no periplasma por meio de uma seqüência-líder secretora do terminal-N (MKKNIAFLLASMFVFSIATNAYA-), que foi clivada durante translocalização. Foram desenvolvidas culturas de fermentação com meio complexo livre de material animal a 37°C e a temperatura foi alterada para 26°C antes da depleção de fosfato. Durante a colheita, o caldo de fermentação inteiro foi centrifugado para peletizar as células. Na colheita, o volume total e o peso líquido de células (WCW; proporção de pélete para sobrenadante) foram registrados, e as células peletizadas foram coletadas e congeladas a -80°C.

[468] RECUPERAÇÃO: O pélete de células congelado foi ressuspenso em Tampão de Lise (100 mM de ácido cítrico)

visando 30% de peso líquido de células. Foi permitido que a ressuspensão equilibrasse em pH 4,4, e depois homogeneizada a 17.000 ± 200 bar, enquanto a temperatura de saída era monitorada e mantida em 15 ± 5°C. O pH do homogeneizado foi confirmado como estando dentro da faixa especificada (pH 4,4 ± 0,1).

[469] CLARIFICAÇÃO: Para reduzir impurezas de endotoxina e da célula hospedeira, o homogeneizado foi submetido à floculação em baixa temperatura (10 ± 5°C), ácida (pH 4,4 ± 0,1) de um dia para o outro (15-20 horas). Para remover a fração insolúvel, o homogeneizado floculado foi centrifugado por 40 minutos a 8.000 RCF e 2-8°C, e o sobrenadante foi retido. Para remover ácido nucleico, lipídeos e endotoxina e para agir como um auxiliar de filtração, o sobrenadante foi ajustado até 0,1% (m/m) de terra diatomácea. Para manter o auxiliar de filtração suspenso, o sobrenadante foi misturado por meio de um impulsor e foi permitido que equilibrasse por 30 minutos. Um trem de filtração, que consiste em um filtro profundo, seguido por um filtro de 0,22 µm, foi montado e depois enxaguado com MQ. O sobrenadante foi bombeado através do trem de filtração, enquanto o fluxo era modulado para manter uma queda de pressão de 2,73 ± 1,35 bar.

[470] PURIFICAÇÃO: Captura de Proteína-L: Para remover proteínas da célula hospedeira, endotoxina e ácido nucleico, Proteína-L foi usada para capturar o domínio kappa presente dentro do scFv de aEGFR da molécula de AC1955. A fase estacionária de Proteína-L (Tosoh TP AF-rProtein L-650F), fase móvel A de Proteína-L (11,5 mM de ácido cítrico, 24,5 mM de Na₂HPO₄, 125 mM de NaCl, polissorbato 80 0,005%, pH

5,0) e fase móvel B de Proteína-L (11 mM de ácido fosfórico, polissorbato 80 0,005%, pH 2,0) foram usadas nesse relatório descritivo. A coluna foi equilibrada com fase móvel A de Proteína-L. O filtrado foi ajustado até pH 5,5 ± 0,2 e carregado sobre a coluna de Proteína-L visando 2- 4 g/l-resina, e depois seguida com fase móvel A de Proteína- L até que a absorbância a 280 nm (A280) retornasse ao nível de base (local). Material ligado foi eluído com fase móvel B e coletado como uma fração de 2 CV pré-estriada com 0,4 CV de 0,5 M de Na₂HPO₄ e foi analisado por SDS-PAGE.

[471] Purificação intermediária por IMAC: Para assegurar a integridade do terminal-N, Cromatografia por Afinidade Imobilizada em Metal (IMAC) foi usada para capturar o tag de polihistidina (His(6)) do terminal-N da molécula de AC1955. A fase estacionária de IMAC (GE IMAC Sefarose FF), fase móvel A de IMAC (12,2 mM de Na₂HPO₄, 7,8 mM de NaH₂PO₄, 500 mM de NaCl, polissorbato 80 0,005%, pH 7,0) e a fase móvel B de IMAC (50 mM de histidina, 200 mM de NaCl, polissorbato 80 0,005%, pH 6,5) foram usadas nesse relatório descritivo. A coluna foi equilibrada com fase móvel A de IMAC. A Eluição de Proteína-L foi ajustada até pH 7,8 ± 0,1 e 50 ± 5 mS/cm (com 5 M de NaCl). O Pool de Proteína-L ajustado foi carregado sobre a coluna de IMAC visando 2 g/l- resina e seguida com fase móvel A de IMAC até que a absorbância a 280 nm (A280) retornasse ao nível de base (local). Material ligado foi eluído com fase móvel B de IMAC. A Eluição de IMAC foi coletada como uma fração de 2 CV pré- estriada com 0,02 CV 200 mM de EDTA e foi analisada por SDS- PAGE.

[472] Purificação intermediária de C-tag: Para assegurar integridade do terminal-C, Cromatografia por Afinidade de C-tag foi usada para capturar o tag do terminal- C-EPEA. A fase estacionária de C-tag (Thermo C-tagXL), fase móvel A de C-tag (50 mM de histidina, 200 mM de NaCl, polissorbato 80 0,005%, pH 6,5) e fase móvel B de C-tag (20 mM de Tris, 0,6 M MgCl₂, polissorbato 80 0,005%, pH 7,0) foram usadas nesse relatório descritivo. A coluna foi equilibrada com fase móvel A de C-tag. A Eluição de IMAC foi carregada sobre a coluna de C-tag visando 2 g/l-resina e seguida com fase móvel A de C-tag até que a absorbância a 280 nm (A280) retornasse ao nível de base (local). Material ligado foi eluído com a fase móvel B de C-tag. A Eluição de C-tag foi coletada como uma fração de 2 CV e foi analisada por SDS-PAGE.

[473] Polimento por AEX: Para separar dímero e agregado de produto monomérico, cromatografia por troca de ânions (AEX) foi utilizada para capturar os domínios do XTEN eletronegativo do terminal-N e do terminal-C. A fase estacionária de AEX1 (BIA QA-80), fase móvel A de AEX1 (50 mM de histidina, 200 mM de NaCl, polissorbato 80 0,005%, pH 6,5) e fase móvel B de AEX1 (50 mM de histidina, 500 mM de NaCl, polissorbato 80 0,005%, pH 6,5) foram usadas nesse relatório descritivo. A coluna foi equilibrada com fase móvel A de AEX. A eluição de C-tag foi diluída até 10 mS/cm com MQ, carregada visando 2 g/l-resina, e depois seguida com fase móvel A de AEX até que a absorbância a 280 nm retornasse ao nível de base (local). Material ligado foi eluído com um gradiente de 0% de B a 100% de B ao longo de 60 CV. Foram coletadas frações em alíquotas de 1 CV enquanto A280 ≥ 2 mAU acima do nível de base (local). As frações de eluição foram analisadas por SDS-PAGE e SE-HPLC, e frações com ≥ 98% monômero foram reunidas em pool (AEX Pool) para processamento adicional.

[474] FORMULAÇÃO: Para trocar o produto em tampão de formulação e para levar o produto até a concentração-alvo (0,5 g/l), foi usada Ultrafiltração/Diafiltração (UF/DF). Usando uma membrana de 10 kDa com uma área de 0,1 m² e um alvo de TMP de 103,42 kPa, o pool de AEX foi concentrado até 0,5 g/l, e depois diluído 10 vezes com Tampão de Formulação (50 mM de histidina, 200 mM de NaCl, polissorbato 80 0,005%, pH 6,5). O pool de AEX foi concentrado 10 vezes e diluído 10 vezes mais duas vezes. O produto formulado recuperado foi filtrado a 0,22 µm dentro de um BSC, dividido em alíquotas, rotulado e armazenado a -80°C como Substância Farmacológica a Granel (BDS). O BDS foi confirmado por vários métodos analíticos para atender a doso os critérios de liberação de lote. A qualidade global foi analisada por SDS-PAGE (FIG. 86A), a proporção de monômero para dímero e agregado foi analisada por SE-HPLC (FIG. 87A), e a N-homogeneidade do produto foi analisada por HI-HPLC (FIG. 87B). A identidade foi confirmada por ESI-MS (FIG. 86B). Exemplo 48: Ligação à célula avaliada por citometria de fluxo.

[475] A ligação biespecífica da composição de ProTIA anti-EGFR x anti-CD3 também é avaliada por ensaios baseados em citometria de fluxo utilizando células Jurkat humanas CD3-positivas e células humanas EGFR-positivas selecionadas de HT-29, HCT-116, NCI-H1573, NCI-H1975, FaDu e SCC-9 ou uma linhagem de célula CHO estável que expressa EGFR. Células CD3+ e EGFR+ são incubadas com uma faixa de doses de ProTIA anti-EGFR x anti-CD3 não tratado (AC1955, que compreende 2 XTEN e 2 RS), AC1955 tratado com protease e scFv anti-CD3 e controles positivos de scFv anti-EGFR por 30 min a 4°C em tampão de ligação contendo HBSS com 2% de BSA e 5 mM de EDTA. Após lavagem com tampão de ligação para remover material de teste não ligado, as células são incubadas com anti-His tag conjugado à FITC (Abcam Nº de Catálogo ab1206) por 30 min a 4°C. Anticorpo conjugado à FITC não ligado é removido por lavagem com tampão de ligação e as células ressuspensas em tampão de ligação para aquisição em um citômetro de fluxo de FACS Calibur (Becton Dickerson) ou instrumento equivalente. Todos os dados de citometria de fluxo são analisados com o software FlowJo (FlowJo LLC) ou equivalente.

[476] Tendo em vista que é esperado que scFv anti-EGFR se ligue às células Jurkat, scFv anti-CD3, espera-se que AC1955 não tratado e AC1955 tratado com protease se liguem às células Jurkat, como indicado por um aumento na intensidade de fluorescência, quando comparadas com células Jurkat incubadas com anticorpo anti-His tag conjugado à FITC isoladamente. Similarmente, espera-se que scFv anti-EGFR, AC1955 tratado e não tratado com protease se liguem às células EGFR-positivas, enquanto não se espera que scFv anti- CD3 se ligue às células EGFR-positivas. Espera-se que esses dados refletirão a habilidade de ligação biespecífica da composição de ProTIA anti-EGFR x anti-CD3 para reconhecer tanto o antígeno de CD3 quanto o de EGFR expressos, respectivamente, em Jurkat e no painel de linhagens de células humanas que expressam EGFR. Além disso, como o polímero de XTEN causa alguma interferência na ligação de superfície, espera-se que o ProTIA anti-EGFR x anti-CD3 não tratado se ligue em uma afinidade menor do que ProTIA tratado com protease tanto aos antígenos de CD3 quanto aos de EpCAM. Exemplo 49: Lise de células avaliada por citometria de fluxo.

[477] A lise de células pela composição de ProTIA anti- EGFR x anti-CD3 é avaliada por citometria de fluxo utilizando PBMCs humanas e uma linhagem de células EGFR-positivas. Células HCT-116-alvo EGFR-positivas (ou células-alvo selecionadas de HT-29, NCI-H1573, NCI-H1975, FaDu e SCC-9 ou uma linhagem de célula CHO estável que expressa EGFR) são marcadas com o corante de membrana fluorescente corante CellVue Maroon (Affymetrix/eBioscience, Nº de Catálogo 88- 0870-16) de acordo com instruções do fabricante. Alternativamente, PKH26 (Sigma, Nº de Catálogo MINI26 e PKH26GL) também pode ser usada. Resumidamente, células HCT- 116 são lavadas duas vezes com PBS, seguido por ressuspensão de 2 x 106 células em 0,1 ml de Diluente C fornecido com o kit de marcação CellVue Maroon. Em um tubo separado, 2 µl de corante CellVue Maroon são misturados com 0,5 ml de diluente C, e depois 0,1 ml adicionado à suspensão de células HCT-

116. A suspensão de células e o corante CellVue Maroon são misturados e incubados por 2 min em temperatura ambiente. A reação de marcação é então extinta pela adição de 0,2 ml de soro bovino fetal (FCS). As células marcadas são lavadas duas vezes com meio completo de cultura de célula (RPMI-1640 contendo FCS 10%) e o número total de células viáveis determinado por exclusão de Azul tripano. Para uma proporção de célula-efetora para célula-alvo de 10:1 em um volume total de 200 µl por poço, 1 x 105 PBMCs são cocultivadas com 1 x 104 células HCT-116 marcadas com CellVue Maroon por poço em uma placa de 96 poços de fundo redondo na ausência ou presença da concentração de faixa de dose indicada de amostras de ProTIA anti-EGFR x anti-CD3 tratado e não tratado com protease (AC1955, que compreende 2 XTEN e 2 RS). Após 24 h, as células são colhidas com Accutase (Innovative Cell Technologies, Nº de Catálogo AT104) e lavadas com FCS 2%/PBS. Antes da aquisição de células em um citômetro de fluxo Guava EasyCyte (Millipore), as células são ressuspensas em 100 µl de FCS 2%/PBS suplementado com 2,5 microgramas/ml de 7-AAD (Affymetrix/eBioscience, Nº de Catálogo 00-6993-50) para discriminar entre células vivas (7-AAD-negativas) e mortas (7-AAD-positivas). Os dados de FACS são analisados com o software guavaSoft (Millipore); e a percentagem de células- alvo mortas é calculada pelo número de células 7-AAD- positivas/CellVue Maroon-positivas dividido pelo número total de células CellVue Maroon-positivas.

[478] Curvas de dose-resposta de morte de citotoxicidade percentual contra concentração de ProTIA são analisadas por equação de regressão logística de 4 parâmetros usando GraphPad Prism; e a concentração de ProTIA que induziu metade da citotoxicidade celular percentual máxima é, dessa forma, determinada.

[479] Espera-se que os resultados de citotoxicidade utilizando citometria de fluxo estejam em concordância com os resultados obtidos com outros ensaios de citotoxicidade, incluindo LDH e caspase. Espera-se que exposição de células HCT-116 às composições de ProTIA anti-EGFR x anti-CD3 clivado por protease e não clivado na ausência de PBMC não tenha nenhum efeito. Similarmente, não se espera que PBMCs sejam ativadas na presença de ProTIA sem células-alvo. Espera-se que esses resultados indiquem que composições de ProTIA precisam ser agrupadas na superfície de células-alvo a fim de estimular PBMCs para atividade de citotoxicidade. Na presença de PBMC e células-alvo, haveria um efeito citotóxico concentração-dependente em função do ProTIA pré-tratado ou não tratado com protease. Além disso, espera-se que os resultados mostrem que a exposição de células HCT-116 ao ProTIA não tratado (sem protease) na presença de PBMCs exiba citotoxicidade reduzida, comparada com a composição de ProTIA clivado com protease. Exemplo 50: Ensaios de marcador de ativação de célula T da composição de ativador imune anti-EGFR x anti-CD3 desencadeado por protease (ProTIA).

[480] Para medir os marcadores de ativação (CD69 e CD25) induzida por ProTIA anti-EGFR x anti-CD3, 1 x 105 PBMCs ou células CD3+ purificadas são cocultivadas em RPMI-1640 contendo FCS 10% com 1 x 104 HCT-116 ou células HT-29 por poço de ensaio (ou seja, proporção de célula-efetora para célula-alvo de 10:1) na presença de ProTIA anti-EGFR x anti- CD3 (AC1955, que compreende 2 XTEN e 2 RS) em uma placa de 96 poços de fundo redondo com volume total final de 200 µl. Após incubação por 20 h em uma incubadora umidificada com CO2 5% a 37°C, as células são coradas com anti-CD4 conjugado a PECy5, anti-CD8 conjugado a APC, anti-CD25 conjugado à PE e anti-CD69 conjugado à FITC (todos anticorpos de BioLegend) em tampão de FACS (BSA 1%/PBS) a 4°C, lavadas duas vezes com tampão de FACS, e depois ressuspensas em tampão de FACS para aquisição em um citômetro de fluxo Guava EasyCyte (Millipore).

[481] Espera-se que a tendência da expressão de marcador de ativação de célula T das três moléculas de ProTIA seja similar àquela observada por ensaios de citotoxicidade, incluindo LDH e caspase. Espera-se que a ativação de CD69 em populações CD8 e CD4 de PBMCs ou células CD3+ por ProTIA anti-EGFR x anti-CD3 não tratado (AC1955) seja menos ativa do que ProTIA tratado com protease AC1955; e espera-se que o ProTIA anti-EGFR x anti-CD3 não-clivável (AC1991) seja menos ativo do que o AC1955 não tratado. Exemplo 51: Análise por arranjo citométrico de microesferas para citocinas Th1/Th2 humanas usando PBMCs humanas saudáveis normais estimuladas e ProTIA anti-EGFR x anti-CD3 intacto e tratado com protease

[482] Como uma avaliação de segurança da habilidade de ProTIA anti-EGFR x anti-CD3 intacto versus clivado (AC1955, que compreende 2 XTEN e 2 RS) para estimular liberação de citocinas relacionadas às células T em um ensaio baseado em células in vitro, um painel de citocinas, incluindo IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-alfa, IFN-gama, é analisado usando o arranjo citométrico de microesferas (CBA) em sobrenadantes de PBMCs humanas cultivadas estimuladas com amostras de ProTIA anti-EGFR x anti-CD3 tratado e não tratado com protease. O anticorpo anti-CD3 humano, OKT3, é usado como controle positivo e poços não tratados servem como controle negativo.

[483] Resumidamente, OKT3 (0, 10 nM, 100 nM e 1000 nM) e ProTIA anti-EGFR x anti-CD3 tratado e não tratado com protease (AC1955 a 10 nM, 100 nM, 1000 nM e 2.000 nM) são revestidos a seco sobre uma placa de 96 poços de fundo plano permitindo-se que os poços evaporem de um dia para o outro no exaustor de biossegurança. Os poços são então lavados uma vez gentilmente com PBS e 1 x 106 PBMCs em 200 µl foram adicionados a cada poço. A placa é então incubada a 37°C, CO2 5% por 24 h, e depois o sobrenadante da cultura de tecido é coletado de cada poço e analisado para citocina liberada usando o kit de CBA comercial validado (“BD CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit”, Nº de Catálogo 551809) por citometria de fluxo seguindo as instruções do fabricante.

[484] Espera-se que OKT3, mas não poços não tratados, induza secreção robusta de todas as citocinas (IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-alfa, IFN-gama) avaliadas confirmando, dessa forma, o desempenho do ensaio de citocina por CBA. Espera-se que a estimulação com ProTIA anti-EGFR x anti-CD3 tratado com protease desencadeie a expressão significante de citocina, especialmente em concentrações maiores do que 100 nM para todas as citocinas testadas. São esperados níveis basais de IL-2, IL-6, IL-10, TNF-alfa e IFN-gama quando a molécula de ProTIA anti-EGFR x anti-CD3 intacto não clivado é o estimulante em uma faixa de concentração de 10 a 2.000 nM. Esses dados dão suporte ao fato de que o polímero de XTEN da composição de ProTIA intacto fornece efeito de blindagem considerável e impede respostas de citocina estimuladas por PBMCs, comparado com o ProTIA tratado com protease no qual a porção de EGFR x anti-CD3 é liberada da composição. Exemplo 52: Ensaios de citotoxicidade da composição de ativador imune anti-EGFR x anti-CD3 desencadeado por protease (ProTIA) na presença de células T CD3-positivas purificadas.

[485] Para demonstrar que a atividade citotóxica de moléculas de ProTIA é mediada por células T CD3-positivas,

ProTIA anti-EGFR x anti-CD3 não-clivável sem o segmento de liberação (AC1991, que compreende 2 XTEN) e ProTIA anti-EGFR x anti-CD3 tratado e não tratado com protease (AC1955, que compreende 2 XTEN e 2 RS) são avaliados em linhagens de células humanas EGFR+ (por exemplo, HCT-116 ou HT-29) na presença de células T humanas CD3-positivas purificadas.

Células T humanas CD3-positivas purificadas são adquiridas de Bioreclamation IV, em que são isoladas por seleção negativa usando “MagCellect Human CD3+ T Cell Isolation Kit” de sangue total de doadores saudáveis.

Nesse experimento, células T humanas CD3-positivas purificadas são misturadas com uma linhagem de célula EGFR+ em uma proporção de cerca de 10:1 e todas as três moléculas de ProTIA foram testadas como uma curva de dose de diluição serial 5x de 12 pontos no ensaio de LDH como descrito acima.

Espera-se que a tendência de atividade das três moléculas de ProTIA perfiladas com células CD3+ seja similar ao perfil da mesma linhagem de célula com PBMCs.

Espera-se que AC1955 não tratado seja menos ativo do que AC1955 tratado com protease; e espera-se que o AC1991 não-clivável seja menos ativo do que AC1955 não tratado.

Esses resultados demonstrariam que a atividade citotóxica de moléculas de ProTIA é, na verdade, mediada por células T CD3-positivas.

A suscetibilidade do segmento de liberação contido dentro da molécula de ProTIA anti-EGFR x anti-CD3 clivável às proteases postuladas como sendo liberadas das células tumorais e/ou células T CD3-positivas ativadas na mistura do ensaio provavelmente difere entre linhagens de células.

Exemplo 53: Ensaios de marcador de ativação de célula T e liberação de citocinas da composição de ativador imune anti-EGFR x anti-CD3 desencadeado por protease (ProTIA).

[486] Para medir a expressão de citocinas induzida por ProTIA anti-EGFR x anti-CD3, células CD3+ purificadas são cocultivadas com células HCT-116 por poço de ensaio (ou seja, proporção de célula-efetora para célula-alvo de cerca de 10:1) na presença de ProTIA anti-EGFR x anti-CD3 (AC1955, que compreende 2 XTEN e 2 RS) em uma placa de 96 poços de fundo redondo com volume total final de 200 µl. Após incubação por 20 h em uma incubadora umidificada com CO2 5% a 37°C, o sobrenadante celular é colhido para medições de citocina. Esse ensaio também pode ser realizado com outras células-alvo selecionadas de HT-29, NCI-H1573, NCI-H1975, FaDu, e SCC-9, bem como PBMCs no lugar de células CD3+ purificadas.

[487] A análise de citocina de interleucina (IL)-2, IL-4, IL-6, IL-10, fator de necrose tumoral (TNF)-alfa e interferon (IFN)-gama secretadas no sobrenadante da cultura de células é quantificada usando o kit “Human Th1/Th2 Cytokine Cytometric Bead Array” (CBA) (BD Biosciences Nº de Catálogo 550749) seguindo as instruções do fabricante. Na ausência de ProTIA, nenhuma secreção de citocina acima do nível de fundo é esperada pelas células CD3+ purificadas. Espera-se que AC1955, na presença de células-alvo EGFR- positivas e células CD3+ purificadas, ative células T e secrete um padrão de citocinas de célula T com uma proporção elevada de citocinas Th1 como, por exemplo, IFN-gama e TNF- alfa. Comparado com intacto AC1955, espera-se que concentrações menores de AC1955 tratado com protease ativem células T e secretem citocinas de célula T, dando suporte ao efeito de blindagem do polímero de XTEN em ProTIA.

Exemplo 54: Ensaio de caspase 3/7 de composição de ativador imune desencadeado por protease (ProTIA) anti-EpCAM de camundongo x anti-CD3 de camundongo.

[488] A citotoxicidade celular redirecionada de composições de ProTIA anti-EpCAM de camundongo x anti-CD3 de camundongo foi avaliada por meio do ensaio de atividades de caspase 3/7 de células apoptóticas. Esplenócitos de camundongo foram dissociados mecanicamente de baços de camundongo BALB/c por trituração entre as extremidades de vidro fosco de duas lâminas de microscópio, lise de células sangüíneas vermelhas com ACK, e filtração através de um filtro de 40 micrômetros. Células CD3 de camundongo foram purificadas por seleção negativa de esplenócitos de camundongos usando “EasySep Mouse T Cell Isolation Kit” (StemCell Nº de Catálogo 19851). Células T CD3-positivas purificadas foram misturadas com células tumorais-alvo EpCAM-positivas de camundongo como, por exemplo, 4T1, msEp- CT26 (um pool estável de CT26 transfectada com EpCAM de camundongo com densidade média de EpCAM de camundongo de

500.000), e msEp-CT26-3 (um clone de CT26 transfectada com EpCAM de camundongo com densidade média de EpCAM de camundongo de 410.000 por célula) em uma proporção de 5 ou 10 células efetoras para 1 célula-alvo; e todas as três versões de ProTIA foram testadas como concentrações de doses de diluição serial de 5x ou 8x de 8 ou de 12 pontos.

[489] Mediante lise celular, caspase 3/7 liberada em sobrenadantes de cultura foi medida pela quantidade de clivagem de substrato luminogênico de caspase 3/7 por caspase 3/7 para gerar o sinal luminescente do tipo “glow” (Promega Caspase-Glo 3/7 Nº de Catálogo G8091). A quantidade de luminescência é proporcional à quantidade de atividades de caspase.

[490] Resultados: Como mostrado na Tabela 19, as atividades dos AC1867 e AC1554 não-cliváveis são consistentemente mais pobres, quando comparados com ProTIA não tratado com protease (AC1696 e AC1553) in all linhagens de células que expressam EpCAM de camundongo testadas. Como esperado, AC1696 e AC1553 clivados por protease foram os mais ativos, construções de ProTIA não tratado e clivável com protease mostraram atividades variáveis, dependendo da seqüência do segmento de liberação e linhagem da célula- alvo. Tabela 19: Atividade de citotoxicidade in vitro de variantes de anti-EpCAM de camundongo x anti-CD3 de camundongo em linhagens de células de camundongos. ProTIA Segmento de EC50 (pM) liberação msEp-CT26 4T1 pool ms-Ep-CT26-3 RSR-2089 AC1696 clivado clivado 128 6,8 5.0-13 AC1553 BSRS-1 1831 240 AC1696 RSR-2089 2000 286 140 AC1598 RSR-2295 3310 235 225 AC1677 RSR-2298 2400 140 AC1712 RSR-2485 2550 1600 AC1713 RSR-2486 4220 1000 510 AC1690 RSR-2488 8470 710 AC1710 RSR-2599 2470 1220 1700 AC1867 RSR-3058 2770 4800 AC1553 clivado BSRS-1 clivado 83,3

AC1554 nenhum 20800 AC1868 RSR-2783 3700 2600 AC1869 RSR-2787 4200 AC1870 RSR-2789 280 200 AC1871 RSR-3047 3900 AC1872 RSR-3052 4000 AC1873 RSR-3043 160 AC1822 RSR-2486 840 AC1992 RSR-3107 5400 AC1993 RSR-3103 4200 AC1994 RSR-3102 5200 AC1995 RSR-3119 3400 AC1996 RSR-3110 1100 AC1997 RSR-3114 1200 AC1998 RSR-3115 1100 AC1999 RSR-3126 1700 AC2000 RSR-3127 2000 Exemplo 55: Ensaio de caspase 3/7 de composição de ativador imune desencadeado por protease (ProTIA) anti-EpCAM humana x anti-CD3 de camundongo.

[491] A citotoxicidade celular redirecionada de composições de ProTIA anti-EpCAM humana x anti-CD3 de camundongo foi avaliada por meio do ensaio de atividades de caspase 3/7 de células apoptóticas. Esplenócitos de camundongo foram dissociados mecanicamente de baços de camundongo C57BL/6 por trituração entre as extremidades de vidro fosco de duas lâminas de microscópio, lise de células sangüíneas vermelhas com ACK, e filtração através de um filtro de 40 micrômetros. Células CD3 de camundongo foram purificadas por seleção negativa de esplenócitos de camundongos usando “EasySep Mouse T Cell Isolation Kit” (StemCell Nº de Catálogo 19851). Células T CD3-positivas purificadas foram misturadas com células tumorais-alvo EpCAM humana-positivas como, por exemplo, hEp-CHO 4-12B (um clone de CHO transfectada com EpCAM humana), HCT-116, hEp-LL/2 (um pool de linhagem de célula de pulmão de Lewis transfectada com EpCAM humana), e hEp-LL/2-1 até hEp-LL/2-5 (cinco clones de células de pulmão de Lewis transfectadas com EpCAM humana) em uma proporção de 5 ou 10 células efetoras para 1 célula- alvo; e todas as três versões de ProTIA foram testadas como concentrações de doses de diluição serial de 5x ou 8x de 8 ou de 12 pontos.

[492] Mediante lise celular, caspase 3/7 liberada em sobrenadantes de cultura foi medida pela quantidade de clivagem de substrato luminogênico de caspase 3/7 por caspase 3/7 para gerar o sinal luminescente do tipo “glow” (Promega Caspase-Glo 3/7 Nº de Catálogo G8091). A quantidade de luminescência é proporcional à quantidade de atividades de caspase.

[493] Resultados: Como mostrado na Tabela 20, para ProTIA com uma única porção de XTEN, a atividade do AC1916 não-clivável é consistentemente mais pobre, quando comparada com AC1783 não tratado com protease em todas as linhagens de células que expressam EpCAM humana testadas. Para ProTIA com duas porções de XTENs, as atividades do AC1949 e AC1956 não- cliváveis são mais pobres, comparadas com os AC1948 e AC1957 não tratados com protease. Curiosamente, o ProTIA não tratado com protease com o scFv de EpCAM humana e scFv de CD3 de camundongo (AC1948) foram menos ativos do que o ProTIA não tratado com protease com o diabody de cadeia única para EpCAM humana e CD3 de camundongo (AC1957). Essa tendência também foi observada para o scFv de EpCAM humana e scFv de CD3 de camundongo não-cliváveis (AC1949) e ProTIA não-clivável com o diabody de cadeia única para EpCAM humana e CD3 de camundongo (AC1956). Como esperado, AC1783 e AC1948 clivados por protease foram os mais ativos. Dados para citotoxicidade contra huEp-CHO 4-12B estão incluídos na FIG. 37. Tabela 20: Atividade de citotoxicidade in vitro de variantes de anti-EpCAM de camundongo x anti-CD3 de camundongo em linhagens de células de camundongos. ProTIA Segmento de EC50 (pM) liberação hEp-CHO Pool de hEp- Clones de 4-12B HCT-116 LL/2 hEp-LL/2 AC1783 RSR-2295 clivado 230 1040 370 670-6600 AC1783 clivado RSR-2295 clivado 9,5 420 170 130-500 AC1948 clivado RSR-2295 12 180 AC1948 RSR-2295 5650 4100 AC1916 RSR-3058 3050 >9.000 3.800-38.000 AC1949 RSR-3058 240000 >100.000 AC1957 RSR-2295 255 AC1956 RSR-3058 4900 Exemplo 56: Determinação da dose máxima tolerada de composição de ativador imune desencadeado por protease (ProTIA) anti-EpCAM humana x anti-CD3 de camundongo em camundongos B6.FVB-Tg(TACSTD1)02Leij/J.

[494] A toxicidade de ProTIA com um único XTEN foi avaliada em camundongos B6.FVB-Tg(TACSTD1)02Leij/J (Jackson Laboratory estoque #008426) usando uma molécula substituta que se liga às proteínas de EpCAM humana e CD3 de camundongo. B6.FVB-Tg(TACSTD1)02Leij/J é uma linhagem de camundongos hemizigotos transgênicos para EpCAM humana. Os artigos de teste foram AC1783 não clivado (RSR-2295), AC1783 clivado e AC1916 não-clivável (RSR-3058). Camundongos B6.FVB- Tg(TACSTD1)02Leij/J foram dosados com quantidade variável de AC1783 não clivado (0,87, 2,6 e 8,7 nmol/kg), AC1783 clivado (0,26, 0,87 e 2,6 nmol/kg) e AC1916 não-clivável (2,6, 8,7, e 26,1 nmol/kg), e a saúde e o peso corporal dos camundongos foram monitorados por 14 dias pós-dosagem.

[495] Resultados: Um de cincos camundongos tratados com 2,6 nmol/kg de AC1783 e todos os cincos camundongos tratados com 8,7 nmol/kg de AC1783 morreram por volta do quinto dia pós-tratamento. Um de cincos camundongos tratados com 2,6 nmol/kg de AC1783 clivado com protease morreu por volta do oitavo dia pós-tratamento. Um de cincos camundongos tratados com 26 nmol/kg de AC1916 não-clivável morreu por volta do quinto dia pós-tratamento. Perda de peso corporal dose-dependente foi observada para cada artigo de teste (FIG. 77). Os dados observados indicam uma MTD para AC1783 não clivado entre 0,87 e 2,6 nmol/kg, para AC1783 clivado entre 0,87 nmol/kg e 2,6 nmol/kg, e para AC1916 não-clivável entre 8,7 e 26,1 nmol/kg.

[496] Conclusões: A toxicidade de construções de ProTIA anti-EpCAM humana x anti-CD3 de camundongo, como avaliada por perda de peso corporal e morte após uma dose única, indica que XTEN mascara a atividade in vivo, como observado por um aumento de 10 vezes na MTD para AC1916 não- clivável, comparado com AC1783 clivado. O AC1783 não clivado possui uma MTD similar ao AC1783 clivado, sugerindo que clivagem in vivo de AC1783 ocorre nos camundongos transgênicos Tg(TACSTD1)02Leij/J. Exemplo 57: Determinação da dose máxima tolerada de composição de ativador imune desencadeado por protease (ProTIA) anti-EpCAM humana x anti-CD3 de camundongo em camundongos B6.FVB-Tg(TACSTD1)02Leij/J.

[497] A toxicidade de construções de ProTIA com um ou dois XTENs foi avaliada em camundongos B6.FVB- Tg(TACSTD1)02Leij/J (Jackson Laboratory estoque #008426) usando uma molécula substituta que se liga às proteínas de EpCAM humana e CD3 de camundongo. B6.FVB-Tg(TACSTD1)02Leij/J é uma linhagem de camundongos hemizigotos transgênicos para EpCAM humana. Os artigos de teste foram AC1783 não clivado (RSR-2295, XTEN único), AC1948 não clivado (RSR-2295, dois XTENs), AC1948 clivado e AC1949 não-clivável (RSR-3058, dois XTENs). Camundongos B6.FVB-Tg(TACSTD1)02Leij/J foram dosados com uma quantidade variável de AC1783 não clivado (0,87, 2,6 e 8,7 nmol/kg), AC1948 não clivado (0,87, 2,6, 8,7, 26,1 e 78,3 nmol/kg), AC1948 clivado (0,26, 0,87, 2,6 e 8,7 nmol/kg) ou AC1949 não-clivável (8,7, 26,1 e 78,3 nmol/kg), e a saúde e o peso corporal dos camundongos foram monitorados por 14 dias pós-dosagem.

[498] Resultados: Um de cincos camundongos tratados com 0,87 ou 2,6 nmol/kg de AC1783 e quatro dos cincos camundongos tratados com 8,7 nmol/kg de AC1783 morreram por volta do quarto dia pós-tratamento. Um ou dois dos cincos camundongos tratados com 8,7 nmol/kg, 3 dos 5 camundongos tratados com 26,1 nmol/kg e todos os cincos camundongos tratados com 78,3 nmol/kg de AC1948 morreram por volta do sétimo, quarto e terceiro dia pós-tratamento,

respectivamente. Um de cincos camundongos tratados com 0,26 nmol/kg, três dos cincos camundongos tratados com 2,6 nmol/kg e todos os cincos camundongos tratados com 8,7 nmol/kg de AC1948 clivado com protease morreram por volta do quarto dia pós-tratamento. Um de cincos camundongos tratados com 78,3 nmol/kg de AC1949 não-clivável morreu por volta do quarto dia pós-tratamento. Perda de peso corporal dose-dependente foi observada para cada artigo de teste (FIG. 78). Os dados observados indicam uma MTD para AC1783 não clivado de menos do que 0,87 nmol/kg, para AC1948 não clivado entre 2,6 e 8,7 nmol/kg, para AC1948 clivado de menos do que 0,26 nmol/kg e para AC1949 não-clivável entre 26,1 e 78,3 nmol/kg.

[499] Conclusões: A toxicidade de construções de ProTIA anti-EpCAM humana x anti-CD3 de camundongo, como avaliada por perda de peso corporal e morte após uma dose única, indica que dois XTENs mascaram a atividade in vivo, como observado por um aumento de pelo menos 100 vezes na MTD para AC1949 não-clivável, comparado com AC1948 clivado. O AC1948 não clivado possui um aumento de pelo menos 10 vezes na MTD, comparado com AC1948 clivado, sugerindo que somente uma fração de AC1948 é clivada in vivo nos camundongos transgênicos Tg(TACSTD1)02Leij/J. Exemplo 58: Determinação da dose máxima tolerada de composição de ativador imune desencadeado por protease (ProTIA) anti-EpCAM de camundongo x anti-CD3 de camundongo em camundongos BALB/c.

[500] A toxicidade de construções de ProTIA foi avaliada em camundongos BALB/c usando uma molécula substituta que se liga às proteínas de EpCAM de camundongo e CD3 de camundongo. Vários estudos foram realizados usando artigos de teste com um XTEN e seqüências do segmento de liberação de taxas variáveis.

[501] Os artigos de teste foram dosados em níveis entre 0,87 e 78,3 nmol/kg (com 3, 4 ou 5 camundongos por grupo), e a saúde e o peso corporal dos camundongos foram monitorados por 14 dias pós-dosagem.

[502] Resultados: A Tabela 21 mostra um resumo dos resultados, com diferenças na toxicidade, como observado por perda de peso corporal e morte, dependendo da taxa e inclusão de protease da seqüência do segmento de liberação.

[503] Conclusões: A toxicidade de construções de ProTIA anti-EpCAM de camundongo x anti-CD3 de camundongo, como avaliada por perda de peso corporal e morte após uma dose única, indica que XTEN mascara a atividade in vivo, como observado por um aumento de 90 vezes na MTD para AC1867 não-clivável, comparado com AC1696 clivado. Dependendo do segmento de liberação, as construções de ProTIA não clivado com um XTEN possuem aumentos de 10 a 90 vezes na MTD, comparado com AC1696 clivado, demonstrando que a protease incluída e a taxa do segmento de liberação afetam a atividade in vivo. Tabela 21: Determinação in vivo da MTD de variantes de anti- EpCAM de camundongo x anti-CD3 de camundongo em camundongos BALB/c. ProTIA Segmento de Dose (nmol/kg) liberação 0,87 2,6 8,7 26,1 78,3 AC1696 clivado RSR-2089 clivado 40 D D AC1696 RSR-2089 D D AC1598 RSR-2295 N 80 D AC1677 RSR-2298 D

AC1712 RSR-2485 N N 20 AC1713 RSR-2486 N 20 D AC1690 RSR-2488 N 67 60 AC1710 RSR-2599 N N 20 AC1867 RSR-3058 N N 40 AC1868 RSR-2783 N N 20 AC1870 RSR-2789 N 100 AC1822 RSR-2486 N N D D AC1993 RSR-3103 N N 40 AC1995 RSR-3119 N N 20 AC1997 RSR-3114 N 60 D AC1999 RSR-3126 N 25 D AC2000 RSR-3127 N N 40 N = nos camundongos observados com perda de peso corporal maior do que 10% D = morte observada número = percentagem de camundongos com perda de peso corporal maior do que 10% Exemplo 59: Afinidade de ligação da composição de ativador imune desencadeado por protease anti-EpCAM x anti- CD3 (ProTIA).

[504] A afinidade de ligação de construções de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 à EpCAM humana e ao CD3 humano foi medida usando citometria de fluxo com huEp-CHO 4-12B (linhagem de célula CHO transfectada com EpCAM humana) e células Jurkat.

[505] As constantes de ligação para ligação de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 às células que expressam EpCAM e que expressam CD3 foi medida por ligação por competição com um ProTIA tratado com protease marcado de forma fluorescente.

O ProTIA tratado com protease marcado de forma fluorescente foi feito por conjugação de Alexa Flúor 647 C2 maleimida (Thermo Fisher, Nº de Catálogo A20347) a um mutante de ProTIA tratado com protease contendo cisteína (tratado com MMP-9 AC1531). Os experimentos de ligação foram realizados em

10.000 células a 4°C por 1 hora em um volume total de 100 µl de tampão de ligação (FCS 2%, 5 mM de EDTA, HBSS). As células foram lavadas uma vez com tampão de ligação gelado, e depois ressuspensas em formaldeído 2% em solução salina tamponada com fosfato e imediatamente analisadas em um citômetro de fluxo Guava EasyCyte de Millipore. Foi verificado que a ligação do AC1531 tratado com protease marcado de forma fluorescente possui um valor de Kd aparente de 1 nM para hEp- CHO 4-12B e 6 nM para células Jurkat CD3+.

[506] Experimentos de ligação por competição foram realizados em 10.000 células B hEp-CHO 4-12 com 1,5 nM de AC1531 tratado com protease marcado de forma fluorescente a 4°C por 1 hora em um volume total de 100 µl de tampão de ligação (FCS 2%, 5 mM de EDTA, HBSS). As células foram lavadas uma vez com tampão de ligação gelado, e depois ressuspensas em formaldeído 2% em solução salina tamponada com fosfato e imediatamente analisadas em um citômetro de fluxo Guava EasyCyte de Millipore.

[507] Os resultados da ensaios de ligação estão resumidos na Tabela 22. A ligação por competição de AC1531 tratado com protease marcado de forma fluorescente às células B hEp-CHO 4-12 com ProTIA clivado resultou em constantes de ligação aparente de 0,5-0,8 nM para hEp.2, enquanto ProTIA não clivado com um único XTEN mostrou constantes de ligação para hEp.2 mais fracas (6,1 a 8,9 nM) e ProTIA não clivado com dois XTENs mostrou a constante de ligação para hEp.2 mais fraca (100 nM).

[508] Experimentos de ligação por competição foram realizados em 10.000 células Jurkat com 10 nM de AC1531 tratado com protease marcado de forma fluorescente a 4°C por 1 hora em um volume total de 100 µl de tampão de ligação (FCS 2%, 5 mM de EDTA, HBSS). As células foram lavadas uma vez com tampão de ligação gelado, e depois ressuspensas em formaldeído 2% em solução salina tamponada com fosfato e imediatamente analisadas em um citômetro de fluxo Guava EasyCyte de Millipore. A ligação por competição de AC1531 tratado com protease marcado de forma fluorescente às células Jurkat com ProTIA clivado resultou em constantes de ligação aparente de 12 nM para hCD3.3 (Tabela 22), enquanto ProTIA com um único XTEN mostrou constantes de ligação para hCD3.3 mais fracas (128 a 158 nM) e ProTIA com dois XTENs mostrou a constante de ligação para hCD3.3 mais fraca (412 nM). A ligação por competição de AC1531 tratado com protease marcado de forma fluorescente às células Jurkat com ProTIA clivado resultou em constantes de ligação aparente de 75 nM para hCD3.9, enquanto ProTIA com um único XTEN mostrou constantes de ligação para hCD3.9 mais fracas (370 nM) e ProTIA com dois XTENs mostrou a constante de ligação para hCD3.9 mais fraca (930 nM).

[509] Conclusões: A blindagem de construções de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 por um XTEN (AC1703 e AC1968) enfraqueceu a afinidade de ligação para EpCAM humana em células B hEp-CHO 4-12 por cerca de 10 vezes, comparado com construções clivadas (AC1695 clivado e AC1968 clivado). ProTIA com dois XTENs diminuiu as afinidades de ligação por cerca de 100 vezes (AC1886 e AC1952, comparados com AC1695 clivado e AC1968 clivado, respectivamente). A blindagem de construções de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3.3 por um XTEN (AC1703) enfraqueceu a afinidade de ligação para CD3 humano em células Jurkat por cerca de 10 vezes, comparado com AC1695 clivado, enquanto a blindagem de construções de ProTIA anti- EpCAM x anti-CD3.9 por um XTEN (AC1968) enfraqueceu a afinidade de ligação para CD3 humano em células Jurkat por cerca de 5 vezes, comparado com AC1968 clivado.

ProTIA com dois XTENs diminuiu as afinidades de ligação por cerca de 30 vezes para CD3.3 e 10 vezes para CD3.9 (AC1886, comparado com AC1695 clivado, e AC1952, comparado com AC1968 clivado, respectivamente). No geral, os dados demonstram que um XTEN blinda ambos os domínios anti-EpCAM e anti-CD3 de ProTIA, e dois XTENs blindavam ainda mais ambos os domínios.

Tabela 22: Constantes de ligação de variantes de anti-EpCAM humana x anti-CD3 humano por ligação por competição às células hEp-CHO 4-12B ou células Jurkat.

ProTIA Segmento de Constante de ligação aparente (nM)

liberação hEp-CHO 4-12B Jurkat

AC1695 clivado RSR-2089 clivado 0,8 12

AC1703 RSR-3058 8,9 128

AC1878 RSR-3058 4,6 158

AC1886 RSR-3058 100 412

AC1968 clivado RSR-2295 clivado 0,5 75

AC1968 RSR-2295 6,1 370

AC1953 RSR-2295 6,8 clivado AC1952 RSR-2295 clivado 78

AC1952 RSR-2295 52 930

Exemplo 60: Propriedades antitumorais de ativador imune desencadeado por protease anti-EpCAM x anti-CD3 (ProTIA) que abriga composição diferente de sítio de liberação no modelo estabelecido de tumor de mama.

[510] No modelo estabelecido de tumor de mama, células tumorais BT-474 foram implantadas independentemente, na presença de matrigel, por via subcutânea em camundongos NOG (NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull) ou NSG (NOD.Cg- Prkdcscid.IL2rgtm1Wjl/SzJ) no dia 0 (os camundongos NOG ou NSG são camundongos NOD/SCID que abrigam mutação IL-2Rγ que faz com que os camundongos não tenham de células T, B e NK, tenham macrófagos disfuncionais, células dendríticas disfuncionais e atividade de complemento reduzida). PBMCs humanas foram então introduzidas por via intravenosa quando o volume tumoral de BT-474 alcançava 100-200 mm3. O tratamento com veículo, composição de ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease com sítio de liberação diferente (por exemplo, AC1714, AC1684 e AC1686) e um ProTIA anti-Her2 x anti-CD3 (por exemplo, AC1503) como um controle positivo foi iniciado como três doses intravenosa por semana por quatro semanas. O Coorte 1 foi o grupo tratado com veículo. Os Coortes 2 e 3 foram os grupos tratados com AC1714 dosados a 0,1 mg/kg e 0,5 mg/kg, respectivamente. O Coortes 4 e 5 foram os grupos tratados com AC1684 dosados a 0,1 mg/kg e 0,5 mg/kg, respectivamente. O Coorte 6 foi o grupo tratado com AC1686 dosado a 0,1 mg/kg; e o coorte 7 foi o ProTIA anti-Her2 x anti-CD3 de controle positivo (AC1503) dosado a 0,5 mg/kg.

[511] Os tumores foram medidos duas vezes por semana por uma projeção de 45 dias com um compasso de calibre em duas dimensões perpendiculares e os volumes tumorais foram calculados por aplicação da fórmula (largura2 X comprimento) / 2. Peso corporal, aparência geral e observações clínicas como, por exemplo, convulsões, tremores, letargia, hiperreatividade, piloereção, respiração difícil/rápida, coloração e ulceração do tumor e morte, também foram intimamente monitorados como uma indicação de toxicidade relacionada ao tratamento. O índice percentual de inibição do crescimento tumoral (%TGI) foi calculado para cada um dos grupos de tratamento por aplicação da fórmula: ((Volume tumoral médio de Grupo 2 controle de veículo – Volume tumoral médio do tratamento com ProTIA)/volume tumoral médio de Grupo 2 controle de veículo) x 100. Um resultado do tratamento com um %TGI ≥60% foi considerado terapeuticamente ativo.

[512] Resultados: Os dados do volume tumoral estão retratados nas FIGS. 79A e 79B. No dia 45, camundongos tratados com veículo do coorte 1 não exibiram progressão do tumor que possui um carga tumoral de 410 ± 215 mm3, demonstrando que células efetoras humanas isoladamente como tal não podiam provocar um efeito antitumoral. Como esperado, o tratamento com o ProTIA anti-Her2 x anti-CD3 de controle positivo a 0,5 mg/kg (AC1503, o coorte 7) na presença de células efetoras humanas exibiu regressão antitumoral nítida com um %TGI de 95%. O tratamento com o ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 AC1714 a 0,1 mg/kg e 0,5 mg/kg (coortes 2 e 3, respectivamente) na presença de células efetoras humanas inibiu o crescimento tumoral de uma forma dose-dependente. A 0,5 mg/kg, AC1714 foi terapeuticamente ativo com %TGI de 94%; e terapeuticamente inativo a 0,1 mg/kg com um %TGI de 50%. AC1684, que abriga um segmento de liberação diferente, comparado com AC1714, foi terapeuticamente inativo a 0,1 mg/kg (%TGI de 34%), bem como 0,5 mg/kg (%TGI de 41%). Também foi observado que AC1686 dosado a 0,1 mg/kg não é terapeuticamente ativo (%TGI de 41%).

[513] Conclusões: Os dados sugerem que a 0,5 mg/kg, ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 AC1714 suficiente era eficazmente clivado por proteases no ambiente tumoral de BT- 474 in vivo na porção anti-EpCAM x anti-CD3 não-XTENilada, mais ativa, para gerar a resposta antitumoral robusta observada. AC1684 e AC1686 são, ambos, bem menos eficazes, comparados com AC1714, na geração de porção anti-EpCAM x anti-CD3 ativa em BT-474 para provocar qualquer eficácia significante. Exemplo 61: Ensaio de caspase 3/7 in vitro da composição de ativador imune anti-EGFR x anti-CD3 desencadeado por protease (ProTIA)

[514] A citotoxicidade celular redirecionada de composições de ProTIA anti-EGFR x anti-CD3 não tratado com protease (por exemplo, AC1955 e AC1958), comparado com ProTIA anti-EGFR x anti-CD3 tratado com protease e não-clivável por protease (por exemplo, AC1991) foi avaliada em um ensaio baseado em células in vitro de atividades de caspase 3/7 de células apoptóticas. Similar ao ensaio de citotoxicidade de caspase descrito nos Exemplos acima, PBMCs foram misturadas com células tumorais-alvo EGFR-positivas em uma proporção de 10 células efetoras para 1 célula-alvo e incubadas a 37°C/ CO2 5% por 24 h ou 48 h. Todas as variantes de ProTIA foram testadas usando concentrações de doses de uma diluição serial 5x de 12 pontos. As linhagens de células tumorais humanas- alvo avaliadas foram FaDu (carcinoma de célula escamosa da cabeça e pescoço, SCCHN), SCC-9 (SCCHN), HCT-116 (cólon-

retal que abriga mutação de KRAS), NCI-H1573 (cólon-retal que abriga mutação de KRAS), HT-29 (cólon-retal que abriga mutação de BRAF) e NCI-H1975 (mutação de EGFR T790M). As linhagens de células foram selecionadas para representar tumores cólon-retais e de SCCHN com mutações de EGFR do tipo selvagem e T790M, KRAF e BRAF.

[515] Mediante lise celular, caspase 3/7 liberada em sobrenadantes de cultura foi medida pela quantidade de clivagem de substrato luminogênico de caspase 3/7 por caspase 3/7 para gerar o sinal luminescente do tipo “glow” (Promega Caspase-Glo 3/7 Nº de Catálogo G8091). A quantidade de luminescência é proporcional à quantidade de atividades de caspase.

[516] Resultados: Os resultados dos ensaios são retratados nas FIGS. 80A e B e na Tabela 23. Quando avaliada em linhagem de célula HCT-116 mutante de EGFR KRAS, a atividade da EC50 da variante de ProTIA não tratado com protease AC1955 foi de 3,408 pM e AC1958 foi de 778 pM. A atividade da EC50 do ProTIA não-clivável AC1991 foi de >100.000 pM e a atividade da EC50 do ProTIA clivado com protease foi de 0,8 pM.

[517] Quando avaliada em linhagem de célula HT-29 mutante para EGFR BRAF, a atividade da EC50 da variante de ProTIA não tratado com protease AC1955 foi de 10,930 pM e a atividade de EC50 de AC1958 foi de 12.100 pM. A atividade da EC50 do ProTIA não-clivável AC1991 foi de >100.000 pM e a atividade da EC50 do ProTIA clivado com protease foi de 0,8 pM.

[518] As duas variantes de ProTIA não tratado com protease (por exemplo, AC1955 e AC1958) tiveram uma diferença de 4 vezes na atividade em HCT-116 e atividade similar em HT-29. No entanto, ambas as variantes foram >1.000 a 15.000 vezes menos ativas do que o ProTIA anti-EGFR x anti-CD3 clivado nas duas linhagens de células mutantes de EGFR testadas. Como esperado, a atividade do ProTIA não-clivável (AC1991) foi a menos ativa das versões de PoTIA avaliadas com EC50 maior do que 100.000 pM.

[519] Conclusões: Os resultados demonstraram que ProTIAs anti-EGFR x anti-CD3 são citotoxicamente ativos contra linhagens de células mutantes de EGFR KRAS e BRAF. ProTIAs anti-EGFR x anti-CD3 não clivados que abrigam dois XTENs (por exemplo, AC1955) ofereceram forte mascaramento da atividade de citotoxicidade de 4.000 a 14.000 vezes menos citotoxicidade, comparados com a forma clivada. Tabela 23: Atividade de citotoxicidade in vitro de variantes de anti-EGFR x anti-CD3 tratado com protease, não tratado com protease e não-clivável por protease em linhagens de células humanas HT-29 e HCT-116 ProTIA EC50 (pM) HCT-116 HT-29 AC1955 tratado com protease 0,8 0,8 AC1955 não tratado com protease 3.408 10.930 AC1958 não tratado com protease 778 12.100 AC1991 não-clivável por protease >100.000 >100.000 Exemplo 62: Ensaio de caspase 3/7 in vitro de composição de ativador imune desencadeado por protease anti-Her2 x anti- CD3 (ProTIA)

[520] A citotoxicidade celular redirecionada de composições de ProTIA anti-Her2 x anti-CD3 não tratado com protease (por exemplo, AC2038 e AC2040), comparadas com

ProTIA anti-Her2 x anti-CD3 tratado com protease e não- clivável por protease (por exemplo, AC2039) foi avaliada em um ensaio baseado em células in vitro de atividades de caspase 3/7 de células apoptóticas. Similar aos ensaios de citotoxicidade caspase descritos acima, PBMCs foram misturadas com células tumorais-alvo Her2-positivas em uma proporção de 5 células efetoras para 1 célula-alvo e incubadas a 37°C/CO2 5% por 24 h. Todas as variantes de ProTIA foram testadas usando concentrações de doses de uma diluição serial 5x de 12 pontos como no ensaio de caspase descrito acima. As linhagens de células de tumor de mama humano que expressam Her2 usadas no ensaio foram BT-474, SK-BR-3, JIMT- 1, T-47D, ZR-75-1, MCF-7, MBA-MB-231, linhagem de células tumorais ovarianas humanas SK-OV-3 que expressam Her2, linhagens de células tumorais gástricas humanas NCI-N87, MNK7, SNU-216, NUGC-4 que expressam Her2, e linhagem de células da bexiga humana, por exemplo, RT-112, que expressam Her2. As linhagens de células que foram selecionadas não apenas representam tipos diferentes de câncer, mas também níveis diferentes de expressão de Her2 por célula, com BT- 474, SK-OV-3, SK-BR-3, NCI-N87 e MNK7 expressando nível elevado de Her2; JIMT-1, SNU-216, NUGC-4 e RT-112 expressando um nível médio de Her2; e T-47D, ZR-75-1, MCF-7, MDA-MB-231 expressando um nível baixo ou sem expressão de Her2.

[521] Mediante lise celular, caspase 3/7 liberada em sobrenadantes de cultura foi medida pela quantidade de clivagem de substrato luminogênico de caspase 3/7 por caspase 3/7 para gerar o sinal luminescente do tipo “glow” (Promega Caspase-Glo 3/7 Nº de Catálogo G8091). A quantidade de luminescência é proporcional à quantidade de atividades de caspase.

[522] Resultados: Os resultados dos ensaios são retratados nas FIGS. 81A-D e na Tabela 24. Quando avaliada em uma linhagem de célula BT-474 com nível elevado de Her2, a atividade da EC50 das variantes de ProTIA não tratado com protease AC2038 e AC2040 foi de 66.020 pM e 7.729 pM, respectivamente. Em comparação, a atividade da EC50 de AC2038 tratado com protease foi de 1,5 pM e a atividade da EC50 de ProTIA não-clivável (por exemplo, AC2039) foi >100.000 pM.

[523] Quando avaliada na linhagem de célula SK-OV-3 com nível elevado de Her2, a atividade da EC50 das variantes de ProTIA não tratado com protease AC2038 e AC2040 foi de

14.140 pM e 6.127 pM, respectivamente. Em comparação, a atividade da EC50 de AC2038 tratado com protease foi 1 pM e a atividade da EC50 de ProTIA não-clivável (por exemplo, AC2039) foi >100.000 pM.

[524] Quando avaliada na linhagem de célula JIMT-1 com nível médio de Her2, a atividade da EC50 do AC2038 tratado com protease foi de 52 pM, comparado com uma atividade da EC50 de >100.000 pM para o AC2038 e AC2040 não tratados com protease e para o ProTIA não-clivável AC2039.

[525] Quando avaliada em linhagem de célula MDA-MB-231 com nível baixo de Her2, a atividade da EC50 do AC2038 tratado com protease foi de 124 pM, comparada com uma atividade da EC50 de >100.000 pM para AC2038 e AC2040 não tratados com protease e para o ProTIA não-clivável AC2039.

[526] A comparação das duas variantes de ProTIA anti- Her2 x anti-CD3 não tratado com protease AC2038 e AC2040 foi avaliada em linhagens de células com nível elevado de expressão de Her2 como, por exemplo, SK-OV-3 e BT-474. A diferença na atividade da EC50 entre as duas variantes foi apenas de 2 vezes a 9 vezes. Significantemente, ambas as variantes de ProTIA foram 440 a 14.000 vezes menos ativas do que o ProTIA clivado anti-Her2 x anti-CD3 nas linhagens de células BT-474 e SK-OV-3 testadas. Como esperado, a atividade do ProTIA não-clivável AC2039 foi a manos ativa das versões de PoTIA avaliadas, com uma EC50 maior do que 100.000 pM.

[527] Conclusões: Os resultados demonstraram que, embora ProTIA anti-Her2 x anti-CD3 tratado com protease fosse altamente ativo, com uma magnitude robusta de morte em linhagens de células com expressão elevada e média de Her2, a atividade e magnitude de morte foram mais pobres em linhagens de células com baixa expressão de Her2. Em concordância com a tendência de atividade do ProTIA não tratado com protease perfilada acima, ProTIAs anti-Her2 x anti-CD3 que abriga dois XTENs (por exemplo, AC2038) ofereceram forte mascaramento da atividade de citotoxicidade, com uma atividade da EC50 reduzida de pelo menos mais do que 14.000 vezes. Tabela 24: Atividade de citotoxicidade in vitro variantes de anti-Her2 x anti-CD3 tratado com protease, não tratado com protease e não-clivável por protease em linhagens de células humanas BT-474, SK-OV-3, JIMT-1 e MDA-MB-231. EC50 (pM) BT-474 SK-OV-3 JIMT-1 MDA-MB-231 ProTIA Nível elevado Nível Nível médio Nível baixo de Her2 elevado Her2 de Her2 de Her2 Tratado com protease 1,5 1 52 Aprox. 124 AC2038 Protease-não tratado 66.020 14.140 >100.000 >100.000

AC2038 Protease-não tratado 7.726 6.127 >100.000 >100.000 AC2040 Protease-não-clivável >100.000 >100.000 >100.000 >100.000 AC2039 Exemplo 63: Propriedades antitumorais da composição de ativador imune anti-EGFR x anti-CD3 desencadeado por protease (ProTIA) no tratamento precoce do modelo de HT-29 in vivo

[528] Um experimento de eficácia in vivo foi realizado em camundongos imunodeficientes NOD/SCID, caracterizados pela deficiência de células T e B e células natural killer defeituosas. Os camundongos foram mantidos em condições ambientais padronizadas, estéreis, e o experimento foi realizado de acordo com as diretrizes do “US Institutional Animal Care Association for Assessment and Use Committee” (IACUC) - “Accreditation of Laboratory Animal Care” (AAALAC)). A eficácia de ProTIA anti-EGFR x anti-CD3 tratado com protease e não tratado com protease (por exemplo, AC1955) foi avaliada usando o modelo de xenoenxerto de adenocarcinoma humano HT-29 mutante para EGFR BRAF. Resumidamente, no dia 0, 6 camundongos NOD/SCID foram implantados por via subcutânea no flanco direito com 3 x 106 células HT-29 por camundongo (Coorte 1). No mesmo dia, os coortes 2 a 7, cada um consistindo em 6 camundongos NOD/SCID por grupo, foram injetados por via subcutânea no flanco direito com uma mistura de 6 x 106 PBMCs humanas e 3 x 106 células HT-29 por camundongo. Quatro horas depois da inoculação da mistura de HT-29 ou HT-29/PBMC, os tratamentos foram iniciados. Os Coortes 1 e 2 foram injetados por via intravenosa com veículo

(PBS + Tween 80 0,05%), os coortes 3 e 4 foram injetados com 0,05 mg/kg e 0,5 mg/kg de ProTIA anti-EGFR x anti-CD3 tratado com protease, respectivamente, os coortes 5 e 6 foram injetados com 0,143 mg/kg e 1,43 mg/kg de ProTIA anti-EGFR x anti-CD3 não tratado com protease, e o coorte 7 foi injetado com 50 mg/kg de Cetuximab. Coortes 1 a 6 ainda receberam sete doses adicionais administradas diariamente do dia 1 ao dia 7 (total de 8 doses). O Coorte 7 foi dosado com cetuximab duas vezes por semana por 4 semanas, por um total de 8 doses.

[529] Os tumores foram medidos duas vezes por semana por uma projeção de 33 dias com um compasso de calibre em duas dimensões perpendiculares e os volumes tumorais foram calculados por aplicação da fórmula (largura2 X comprimento) / 2. Peso corporal, aparência geral e observações clínicas como, por exemplo, convulsões, tremores, letargia, hiperreatividade, piloereção, respiração difícil/rápida, coloração e ulceração do tumor e morte, também foram intimamente monitorados como uma indicação de toxicidade relacionada ao tratamento. O índice percentual de inibição do crescimento tumoral (%TGI) foi calculado para cada um dos grupos de tratamento por aplicação da fórmula: ((Volume tumoral médio de Grupo 2 controle de veículo – Volume tumoral médio do tratamento com ProTIA)/volume tumoral médio de Grupo 2 controle de veículo) x 100. Resultados do tratamento com um %TGI ≥60% são considerados terapeuticamente ativos.

[530] Resultados: Os resultados estão retratados nas FIGS. 82A e B. No dia 33, camundongos tratados com veículo do coorte 1 que abriga células tumorais só tiveram uma um carga tumoral de 250 ± 113 mm3. Os camundongos do Coorte 2 tratados com veículo na presença de células efetoras humanas não exibiram progressão do tumor, tendo um carga tumoral de 238 ± 228 mm3, demonstrando que células efetoras humanas isoladamente como tal não podiam provocar um efeito antitumoral. O tratamento com o ProTIA anti-EGFR x anti-CD3 tratado com protease a 0,05 mg/kg e 0,5 mg/kg (coortes 3 e 4, respectivamente) na presença de células efetoras humanas exibiu regressão antitumoral nítida com um %TGI de 99% para ambas. Com destaque, o tratamento com ProTIA anti-EGRF x anti-CD3 a 0,143 mg/kg e 1,43 mg/kg (coortes 5 e 6, respectivamente) na presença de células efetoras humanas também inibiu o crescimento tumoral de uma forma dose- dependente com %TGI de 70% para o grupo de dose de 0,143 mg/kg e 96% no coorte de 1,43 mg/kg. Os dados sugerem que a 0,143 mg/kg e 1,43 mg/kg, quantidades suficientes de ProTIAs anti-EGRF x anti-CD3 foram eficazmente clivadas por proteases no ambiente tumoral in vivo na porção anti-EGFR x anti-CD3 não-XTENilada, mais ativa, para gerar a eficácia observada. Significantemente, o coorte 7 tratado com 50 mg/kg de cetuximab não exibiu regressão tumoral com um %TGI de - 20%.

[531] Conclusões: Os resultados sugerem que ProTIA anti-EGFR x anti-CD3 não tratado com protease (por exemplo, AC1955) pode ser eficazmente clivado e é eficaz no ambiente tumoral de HT-29 mutante para EGFR BRAF para inibir a progressão do tumor. Além disso, ProTIA anti-EGFR x anti-CD3 não tratado com protease é superior ao cetuximab na atividade antitumoral. É digno de nota que nenhuma perda de peso corporal significante foi observada em todos os grupos de tratamento com ProTIA e controle de veículo, indicando que todos os tratamentos foram bem tolerados. Exemplo 64: Propriedades antitumorais de ativador imune desencadeado por protease anti-EpCAM x anti-CD3 (ProTIA) que abriga um ou dois XTENs no modelo estabelecido de tumor de mama

[532] No modelo estabelecido de tumor de mama, células tumorais BT-474 foram implantadas independentemente, na presença de matrigel, por via subcutânea em camundongos NOG (NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull) ou NSG (NOD.Cg- Prkdcscid.IL2rgtm1Wjl/SzJ) no dia 0 (os camundongos NOG ou NSG são camundongos NOD/SCID que abrigam mutação IL-2Rγ que faz com que os camundongos não tenham de células T, B e NK, tenham macrófagos disfuncionais, células dendríticas disfuncionais e atividade de complemento reduzida). PBMCs humanas foram então introduzidas por via intravenosa quando o volume tumoral de BT-474 alcançava 100-200 mm3. O tratamento com veículo, ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease que carrega um polímero de XTEN (por exemplo, AC1968) e um ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 que abriga dois polímeros de XTENs (por exemplo, AC1952) foi iniciado por via intravenosa como três doses por semana por quatro semanas. O Coorte 1 foi o grupo tratado com veículo, o coorte 2 foi o grupo tratado com AC1968 a 0,5 mg/kg, e o coorte 3 foi o grupo tratado com AC1952 a 0,5 mg/kg.

[533] Os tumores foram medidos duas vezes por semana por uma projeção de 45 dias com um compasso de calibre em duas dimensões perpendiculares e os volumes tumorais foram calculados por aplicação da fórmula (largura2 X comprimento) / 2. Peso corporal, aparência geral e observações clínicas como, por exemplo, convulsões, tremores, letargia,

hiperreatividade, piloereção, respiração difícil/rápida, coloração e ulceração do tumor e morte, também foram intimamente monitorados como uma indicação de toxicidade relacionada ao tratamento. O índice percentual de inibição do crescimento tumoral (%TGI) foi calculado para cada um dos grupos de tratamento por aplicação da fórmula: ((Volume tumoral médio de Grupo 2 controle de veículo – Volume tumoral médio do tratamento com ProTIA)/volume tumoral médio de Grupo 2 controle de veículo) x 100. Um grupo de tratamento com %TGI ≥60% é considerado terapeuticamente ativo.

[534] Resultados: Os resultados estão retratados nas FIGS. 83A e B. Provisoriamente, no dia 27, camundongos tratados com veículo do coorte 1 não exibiram progressão do tumor que possui um carga tumoral de 219 ± 30 mm3, demonstrando que células efetoras humanas isoladamente como tal não podiam provocar um efeito antitumoral. Como esperado, o tratamento com ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 AC1968 a 0,5 mg/kg (coorte 2) na presença de células efetoras humanas exibiu regressão antitumoral nítida com %TGI de 68%. Com destaque, o tratamento com ProTIA anti-EpCAM x anti-CD3 AC1952 a 0,5 mg/kg (coorte 3) na presença de células efetoras humanas também provocou uma resposta antitumoral robusta, gerando um %TGI de 76%.

[535] Conclusões: Dados provisórios sugerem que, a 0,5 mg/kg, no ambiente tumoral in vivo de BT-474, ProTIA anti- EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease que abriga dois XTENs (por exemplo, AC1952) é tão eficaz quanto ProTIA anti- EpCAM x anti-CD3 não tratado com protease que abriga um polímero de XTEN (por exemplo, AC1968). É digno de nota que nenhuma perda de peso corporal significante foi observada em todos os grupos de tratamento com ProTIA e controle de veículo, indicando que todos os tratamentos foram bem tolerados. Exemplo 65: Determinação da farmacocinética de dose única e multidoses de ProTIA anti-EGFR x anti-CD3 em primatas não humanos

[536] A farmacocinética (PK) e tolerabilidade geral de ProTIA anti-EGFR x anti-CD3 (por exemplo, AC1955) após administrações intravenosas únicas e múltiplas serão avaliadas em primatas não humanos saudáveis naïve (NHP) (por exemplo, macacos Cynomolgus). Resumidamente, um macaco fêmea e um macho são infundidos por via intravenosa através da veia cefálica. Ambos os animais serão monitorados por duas semanas. Quando nenhum evento adverso é observado, os animais serão submetidos a um regime multidoses iniciado como uma dose a cada três dias por três semanas (9 doses totais no estudo). Em pontos do tempo específicos ao longo de todo o estudo, sangue será coletado para ensaio de farmacocinética, citocinas, hematologia e bioquímica do soro.

[537] O monitoramento dos animais incluirá peso corporal, consumo de alimentos, temperatura corporal e observações ao lado das gaiolas uma ou duas vezes diariamente durante a duração do estudo. Os animais serão monitorados quanto à saúde e aparência gerais; sinais de dor e sofrimento; febre, calafrios, náuseas, vômitos e integridade da pele. Nos dias de dosagem, os animais serão verificados quanto a reações colaterais da injeção antes e depois da administração de ProTIA.

[538] A quantidade de AC1955 presente no plasma será quantificada em um ELISA em sanduíche usando EGFR capturado com biotina em uma placa de eletroquimioluminescência com estreptavidina com anticorpo anti-XTEN sulfo-tagged como detecção. Parâmetros farmacocinéticos, incluindo Cmax, Tmax, área sob a curva, meia-vida e exposição, serão analisados usando o software WinNonLin.

[539] O painel de citocinas inclui medição de IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10 e TNFα usando a plataforma Meso-Scale Discovery.

[540] O painel de hematologia inclui medição de células sangüíneas brancas, células sangüíneas vermelhas, hemoglobina, hematócrito, volume da hemoglobina corpuscular média, concentração da hemoglobina corpuscular média, largura da distribuição de células sangüíneas vermelhas, plaqueta, volume plaquetário médio, % de neutrófilos, % de linfócitos, % de monócitos, % de eosinófilo e % de basófilos.

[541] O painel da bioquímica do soro inclui medição de alanina aminotransferase, aspartato aminotransferase, proteínas totais, albumina, fosfatase alcalina, globulina, proporção albumina/globulina, γ-glutamiltransferase, glicose, uréia, creatinina, cálcio, colesterol total, triglicerídeos, bilirrubina total, sódio, potássio, cloro e creatina quinase.

[542] Espera-se que AC1955 não despertará nenhum evento adverso em uma dose de 1,7 µg/kg. Não são esperados síndrome de citocinas, calafrios, febre, náusea, vômitos e erupção cutânea. Os painéis de hematologia e clínico devem estar dentro da faixa normal. Com base em dados históricos de proteínas XTENiladas, prevê-se que AC1955 tenha uma T1/2 de 3-5 dias. Exemplo 66: Achados de faixa de doses de anti-EGFR x anti-CD3 em primatas não humanos

[543] Um estudo para a dose máxima tolerada de AC1955 em NHP será realizado em macacos Cynomolgus saudáveis naïve com um macaco fêmea e um macho por coorte. O Coorte 1 será infundido por via intravenosa com 25,5 µg/kg de AC1955 através da veia cefálica. Ambos os macacos serão monitorados por uma semana. Quando nenhum evento adverso como, por exemplo, febre, calafrios, erupção cutânea, náusea, vômitos, abnormal hematologia e bioquímica do soro, é observado, os animais serão submetidos a um regime multidoses iniciado como duas doses por semana por 3 semanas (7 doses totais por coorte). Em um tempo específico, sangue será retirado para análises farmacocinéticas, de citocinas, estrutura imune, hematologia e bioquímica do soro.

[544] Quando nenhum evento adverso é observado uma semana após a primeira dose no Coorte 1, AC1955 terá a dose escalonada 3 vezes até 76,5 mg/kg no Coorte 2. O regime de dosagem, monitoramento e coleta de sangue do Coorte 2 serão similares àqueles de Coorte 1. Quando nenhum evento adverso é observado uma semana após a primeira dose no Coorte 2, AC1955 terá a dose escalonada mais 3 vezes até 230 µg/kg no Coorte 3. O escalonamento de dose de três vezes de AC1955 procederá até que sejam observados eventos adversos.

[545] O monitoramento dos animais incluirá peso corporal, consumo de alimentos, temperatura corporal e observações ao lado das gaiolas uma ou duas vezes diariamente durante a duração do estudo. Os animais serão monitorados quanto à saúde e aparência gerais; sinais de dor e sofrimento; febre, calafrios, náuseas, vômitos e integridade da pele. Nos dias de dosagem, os animais também serão verificados quanto a reações no local da injeção antes e depois da administração de ProTIA.

[546] A quantidade de AC1955 presente no plasma será quantificada em um ELISA em sanduíche usando EGFR capturado com biotina em uma placa de eletroquimioluminescência com estreptavidina com anticorpo anti-XTEN sulfo-tagged como detecção. Parâmetros farmacocinéticos, incluindo Cmax, Tmax, área sob a curva, meia-vida e exposição, serão analisados usando o software WinNonLin.

[547] O painel de citocinas inclui medição de IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, IFN-γ e TNFα usando o “Beckon Dickinson Cytometric Bead Array”.

[548] A estrutura imune inclui medição de CD3, CD4, CD8, CD16, CD20, CD25, CD45, CD69, Foxp3 e PD-1.

[549] O painel de hematologia inclui medição de células sangüíneas brancas, células sangüíneas vermelhas, hemoglobina, hematócrito, volume da hemoglobina corpuscular média, concentração da hemoglobina corpuscular média, largura da distribuição de células sangüíneas vermelhas, plaqueta, volume plaquetário médio, % de neutrófilos, % de linfócitos, % de monócitos, % de eosinófilo e % de basófilos.

[550] O painel da bioquímica do soro inclui medição de alanina aminotransferase, aspartato aminotransferase, proteínas totais, albumina, fosfatase alcalina, globulina, proporção albumina/globulina, γ-glutamiltransferase, glicose, uréia, creatinina, cálcio, colesterol total, triglicerídeos, bilirrubina total, sódio, potássio, cloro e creatina quinase.

[551] Espera-se que AC1955 atingirá uma dose máxima tolerada em um dos níveis de dose que provocam alguns eventos adversos.

Os eventos adversos previstos poderiam ser um ou uma combinação de calafrios, febre, náusea, vômitos, erupção cutânea, e leituras anormais de hematologia e bioquímica, picos em citocinas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Polipeptídeo recombinante, caracterizado por compreender um primeiro segmento de liberação (RS1), em que o RS1 é um substrato para clivagem por uma protease de mamífero.

2. Polipeptídeo recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o RS1 compreende uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos 88%, ou pelo menos 94%, ou pelo menos 100% de identidade de seqüência para uma seqüência selecionada das seqüências apresentadas na Tabela 1.

3. Polipeptídeo recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o RS1 compreende uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos 88% ou pelo menos 94% seqüência, ou pelo menos 100% de identidade para uma seqüência selecionada das seqüências apresentadas na Tabela 2.

4. Polipeptídeo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, caracterizado por compreender uma primeira porção de ligação (FBM) que possui afinidade de ligação para um marcador de célula-alvo em um tecido ou célula-alvo.

5. Polipeptídeo recombinante, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a protease de mamífero é produzida por ou está colocalizada com o tecido ou célula-alvo.

6. Polipeptídeo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o RS1 é um substrato para uma serina-protease e/ou uma cisteína-protease e/ou uma metaloproteinase.

7. Polipeptídeo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o RS1 é um substrato para uma protease selecionada de legumaína, MMP-2, MMP-7, MMP-9, MMP-11, MMP-14, uPA e matriptase.

8. Polipeptídeo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o RS1 é um substrato para uma protease apresentada na Tabela 3.

9. Polipeptídeo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o RS1 é um substrato para clivagem por múltiplas proteases em um, dois ou três sítios de clivagem.

10. Polipeptídeo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o RS1 é um substrato para clivagem em dois ou mais sítios de clivagem por duas ou mais proteases selecionadas de legumaína, MMP-2, MMP-7, MMP-9, MMP-11, MMP-14, uPA e matriptase.

11. Polipeptídeo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o RS1 é um substrato para clivagem em três ou mais sítios de clivagem por três ou mais proteases selecionadas de legumaína, MMP-2, MMP-7, MMP-9, MMP-11, MMP-14, uPA e matriptase.

12. Polipeptídeo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a taxa de clivagem do RS1 por legumaína, MMP-2, MMP- 7, MMP-9, MMP-11, MMP-14, uPA ou matriptase é pelo menos duas vezes mais rápida, comparada com a taxa de clivagem de uma seqüência de controle que possui a seqüência EAGRSANHEPLGLVAT pela mesma protease, quando testada in vitro sob concentrações molares equivalentes.

13. Polipeptídeo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a taxa de clivagem do RS1 por legumaína, MMP-2, MMP- 7, MMP-9, MMP-11, MMP-14, uPA ou matriptase é pelo menos duas vezes mais lenta, comparada com a taxa de clivagem de uma seqüência de controle que possui a seqüência EAGRSANHEPLGLVAT pela mesma protease, quando testada in vitro sob concentrações molares equivalentes.

14. Polipeptídeo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o RS1 é um substrato para clivagem por uma protease selecionada de legumaína, MMP-2, MMP-7, MMP-9, MMP-11, MMP- 14, uPA ou matriptase e em que o RS1 possui uma eficiência de clivagem pelo menos 0,2 log2, ou 0,4 log2, ou 0,8 log2 ou 1,0 log2 maior em um ensaio bioquímico competitivo in vitro, comparada com a clivagem pela mesma protease de uma seqüência de controle que possui a seqüência EAGRSANHEPLGLVAT.

15. Polipeptídeo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o RS1 é um substrato para clivagem por uma protease selecionada de legumaína, MMP-2, MMP-7, MMP-9, MMP-11, MMP- 14, uPA ou matriptase e em que o RS1 possui uma eficiência de clivagem pelo menos 0,2 log2, ou 0,4 log2, ou 0,8 log2, ou 1,0 log2 menor em um ensaio bioquímico competitivo in vitro, comparada com a clivagem pela mesma protease de uma seqüência de controle que possui a seqüência EAGRSANHEPLGLVAT.

16. Polipeptídeo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4-15, caracterizado pelo fato de que a FBM é um anticorpo, uma citocina, um receptor celular, ou um fragmento destes.

17. Polipeptídeo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado ainda por compreender um primeiro polipeptídeo recombinante estendido (XTEN1).

18. Polipeptídeo recombinante, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o XTEN1 compreende uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de seqüência para uma seqüência selecionada das seqüências apresentadas na Tabela 8 ou Tabela

10.

19. Polipeptídeo recombinante, de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que o XTEN1 compreende uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de seqüência para uma seqüência selecionada de AE 144_1A, AE 144_2A, AEE144_2B, AE 144_3A, AE144_3B, AE 144_4A, AE 144_4B, AE 144_5A, AE 144_6B, AE284, AE288_1, AE288_2, AE288_3, AE576, AE864, AE864_2, AE865, AE866, AE867 e AE868.

20. Polipeptídeo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17-19, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo recombinante compreende a FBM, o RS1, e o XTEN1 e, em um estado não clivado, possui um arranjo estrutural do terminal-N para o terminal-C de FBM-RS1-XTEN1 ou XTEN1-RS1-FBM.

21. Polipeptídeo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17-19, caracterizado pelo fato de que, mediante clivagem do RS1 pela protease de mamífero, o XTEN1 e a FBM são liberados do polipeptídeo recombinante.

22. Polipeptídeo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4-21, caracterizado pelo fato de que a FBM é um fragmento de anticorpo selecionado do grupo que consiste em Fv, Fab, Fab′, Fab′-SH, anticorpo linear e fragmento variável de cadeia única (scFv).

23. Polipeptídeo recombinante, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o fragmento de anticorpo possui afinidade de ligação para um antígeno da célula efetora expresso na superfície de uma célula efetora selecionada de célula plasmática, célula T, célula B, célula killer induzida por citocina (célula CIK), mastócito, célula dendrítica, célula T reguladora (célula TReg), célula T helper, célula mielóide e célula NK.

24. Polipeptídeo recombinante, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a célula efetora é uma célula T.

25. Polipeptídeo recombinante, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o antígeno da célula efetora é CD3.

26. Polipeptídeo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23-25, caracterizado pelo fato de que o fragmento de anticorpo compreende uma VL e uma VH derivadas de um anticorpo monoclonal que possui especificidade de ligação para CD3.

27. Polipeptídeo recombinante, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que as VL e VH são selecionadas das seqüências apresentadas na Tabela 4.

28. Polipeptídeo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23-25, caracterizado pelo fato de que o fragmento de anticorpo compreende regiões determinantes de complementaridade (CDR) derivadas de um anticorpo monoclonal que possui especificidade de ligação para CD3.

29. Polipeptídeo recombinante, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o fragmento de anticorpo compreende uma região CDR-H1, uma região CDR- H2, uma região CDR-H3, uma região CDR-L1, uma região CDR-L2 e uma região CDR-H3, em que cada uma é derivada de um anticorpo monoclonal da Tabela 4.

30. Polipeptídeo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4-29, caracterizado por compreender uma segunda porção de ligação (SBM) fundida à FBM por um ligante peptídico, em que a SBM é um fragmento de anticorpo que possui afinidade de ligação para um marcador de célula- alvo, em que o fragmento de anticorpo é selecionado do grupo que consiste em Fv, Fab, Fab′, Fab′-SH, anticorpo linear, um anticorpo de domínio único, e fragmento variável de cadeia única (scFv), ou as VL e VH da FBM e SBM são configuradas como um diabody de cadeia única.

31. Polipeptídeo recombinante, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o marcador de célula-alvo é um marcador em uma célula tumoral ou uma célula de câncer.

32. Polipeptídeo recombinante, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o marcador de célula-alvo é selecionado dos marcadores de célula-alvo apresentados na Tabela 5.

33. Polipeptídeo recombinante, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o marcador de célula-alvo é selecionado de antígeno A33, alfa- fetoproteína (AFP), integrina alfa 4, Ang2, B7-H3, B7-H6, antígeno de maturação de célula B (BCMA), antígeno de câncer 19-9 (CA19-9), antígeno de câncer 125 (CA-125), Anidrase Carbônica 6 (CA6), anidrase carbônica IX (CAIX), CEACAM5, cMET, CTLA4, Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 1 (CCR1), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 2 (CCR2), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 3 (CCR3), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 4 (CCR4), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 5 (CCR5), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 6 (CCR6), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 7 (CCR7), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 8 (CCR8), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 9 (CCR9), Agrupamento de Diferenciação 7 (CD7), CD22, CD70, CD79a, CD79b, CD19, CCR8, CEA, βhCG, Lewis-Y, CA19-9, CA-125, CD20, CD22, CD25, CD33, CD38, CD30, CD44v6, CD47, CD56 (NCAM), CD63, CD79b, CD123, CD133, CD138, CD166, claudina-1, claudina 18.2, molécula do tipo lectina do tipo- C-1 (CLL-1), família do domínio de lectina do tipo-C 12 (CLEC12), antígeno Cora, ligante Notch canônico do tipo delta 3 (DDL3), desmogleína 4, ligante Notch não canônico do tipo delta 1 (DLK1), Ectonucleotídeo- Pirofosfatase/Fosfodiesterase 3 (ENPP3), EGFR, EGFRvIII, EpCAM, endosialina (CD248), variante do receptor do fator de crescimento epidérmico III (EGFRvIII), EphA2, antígeno F19, receptor de acetilcolina fetal (fnAChR), antígeno de ativação de fibroblasto (FAP), antígeno relacionado ao Fos 1 (FRA1), Receptor de Folato 1 (FOLR1), fucosil GM1, G250, gangliosídeo GD3, glipicano-3 (GPC3), 9-O-Acetil-GD3, GM2, Receptor de TNF induzido por glicocorticóide (GITR),

globohexaosilceramida (globo-H), GD2, Glipicano 3 (GPC3), guanilil ciclase C (GCC), HER2, HER2 neu, HER3, HER4, HER1, IL13Rα2, receptor do fator de crescimento do tipo insulina I (IGF-IR ), Proteína Lisossomal Associada à Membrana 1 (LAMP1), Molécula de Adesão Celular L1 (L1CAM), antígeno de linfócito 6 (Ly-6), proteoglicano de sulfato de condroitina do melanoma (MCSP), Metaloproteinase do tipo membrana (MT- MMP), mesotelina, mucina 1 (MUC1), MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC7, MUC16, receptor de substância inibidora muelleriana tipo II (MISIIR), molécula de adesão celular de nectina 4 (Nectina-4), antígeno epitelial transmembrana da próstata-6 (STEAP), antígeno de célula plasmática 1, antígeno de célula-tronco da próstata (PSCA), Morte Celular Programada 1 (PD1), Ligante de morte programada 1 (PD-L1), PSMA, Receptor Órfão do Tipo Receptor Tirosina-Quinase 1 (ROR1), antígeno Tn sialilado (s TN), proteína de transporte de fosfato sódio-dependente 2b (NaPi2b), Sonic Hedgehog (Shh), SAS, Membro 7 da Família SLAM (SLAM7), Receptor de Somatostatina 2 (SSTR2), Proteína Autoantigênica Espermática 17 (SP17), TAG72, Antígeno de Thomsen-Friedenreich (antígeno-TF), antígeno associado um tumor L6 (TAL6), glicoproteína trofoblástica (5T4), Trop-2, Wue-1, VEGFR1, VEGFR2 e proteína de tumor de Wilms (WT1).

34. Polipeptídeo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30-33, caracterizado pelo fato de que a SBM é um fragmento de anticorpo que compreende uma VL e uma VH derivadas de um anticorpo monoclonal que possui afinidade de ligação para o marcador de célula-alvo.

35. Polipeptídeo recombinante, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que as VL e VH são selecionadas das seqüências apresentadas na Tabela 5.

36. Polipeptídeo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30-33, caracterizado pelo fato de que o fragmento de anticorpo compreende uma região CDR-H1, uma região CDR-H2, uma região CDR-H3, uma região CDR-L1, uma região CDR-L2 e uma região CDR-H3, em que cada uma é derivada de um anticorpo monoclonal apresentado na Tabela 5.

37. Polipeptídeo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30-36, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo recombinante compreende a FBM, a SBM, o RS1 e o XTEN1 e, em um estado não clivado, possui um arranjo estrutural do terminal-N para o terminal-C de SBM-FBM-RS1- XTEN1, FBM-SBM-RS1-XTEN1, XTEN1-RS1-SBM-FBM, XTEN1-RS1-FBM- SBM, ou diabody-RS1-XTEN1 ou XTEN1-RS1-diabody, em que o diabody compreende VL e VH das FBM e SBM.

38. Polipeptídeo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30-36, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo recombinante compreende uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de seqüência para uma seqüência selecionada do grupo de seqüências apresentadas na Tabela 14.

39. Polipeptídeo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30-38, caracterizado pelo fato de que, mediante clivagem do RS1 pela protease de mamífero e liberação das FBM e SBM do polipeptídeo recombinante, as FBM e SBM permanecem fundidas e são capazes de se ligar e de se unir junto com uma célula T que abriga o antígeno CD3 e uma célula tumoral que abriga o marcador de célula-alvo em um ensaio in vitro que compreende tanto as células T quanto as células tumorais.

40. Polipeptídeo recombinante, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que a ligação em conjunto das FBM e SBM liberadas à célula T e à célula tumoral resulta em atividade citotóxica contra a célula tumoral no ensaio in vitro, como determinado por quantificação da lise celular ou liberação de componentes intracelulares.

41. Polipeptídeo recombinante, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que a FBM e SBM liberadas do polipeptídeo recombinante são capazes de efetuar uma quantidade maior de lise celular da célula tumoral, comparada com a lise celular produzida pelo polipeptídeo recombinante não clivado em ensaios in vitro realizados sob concentrações molares equivalentes, como determinado por quantificação da lise celular ou liberação de componentes intracelulares.

42. Polipeptídeo recombinante, de acordo com a reivindicação 40 ou 41, caracterizado pelo fato de que a quantidade de lise celular produzida pelas FBM e SBM liberadas do polipeptídeo recombinante é pelo menos 10 vezes maior, ou pelo menos 30 vezes, ou pelo menos 100 vezes, ou pelo menos 300 vezes, ou pelo menos 1.000 vezes, ou pelo menos 10.000 vezes maior, comparada com a lise celular produzida pelo polipeptídeo recombinante não clivado nos ensaios in vitro realizados sob concentrações molares equivalentes, como determinado por quantificação da lise celular ou liberação de componentes intracelulares.

43. Polipeptídeo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 40-42, caracterizado pelo fato de que a atividade citotóxica e/ou lise celular da célula tumoral é mediada por ativação da célula T alvo-específica.

44. Polipeptídeo recombinante, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que a quantidade de ativação da célula T produzida pelas FBM e SBM liberadas é pelo menos 10 vezes maior, ou pelo menos 30 vezes, ou pelo menos 100 vezes, ou pelo menos 300 vezes, ou pelo menos 1.000 vezes maior, ou pelo menos 10.000 vezes maior, comparada com a ativação produzida pelo polipeptídeo recombinante não clivado, como determinado por quantificação de moléculas efetoras derivadas de células T nos ensaios in vitro realizados sob concentrações molares equivalentes.

45. Polipeptídeo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30-38, caracterizado pelo fato de que, mediante clivagem do RS1 pela protease de mamífero e liberação das FBM e SBM do polipeptídeo recombinante, as FBM e SBM permanecem fundidas e exibem afinidade de ligação aumentada para o antígeno CD3 e/ou para o marcador de célula- alvo em um ensaio in vitro que compreende antígeno CD3 ou marcador de célula-alvo, comparada com a afinidade de ligação do polipeptídeo recombinante não clivado para o antígeno CD3 ou para o marcador de célula-alvo, quando testada sob concentrações molares equivalentes.

46. Polipeptídeo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 0-0, caracterizado pelo fato de que a afinidade de ligação da FBM liberada para o antígeno CD3 ou da SBM liberada para o marcador de célula-alvo é pelo menos 3 vezes, ou pelo menos 10 vezes maior, ou pelo menos 30 vezes, ou pelo menos 100 vezes, ou pelo menos 300 vezes, ou pelo menos 1.000 vezes maior, como determinado as a constante de dissociação (Kd) constante no ensaio in vitro, comparada com a afinidade de ligação do polipeptídeo recombinante não clivado para o antígeno CD3 ou para o marcador de célula-alvo, quando testada sob concentrações molares equivalentes.

47. Polipeptídeo recombinante, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que a constante Kd da ligação da FBM liberada do polipeptídeo recombinante para o antígeno CD3 é entre 10-5 a 10-9 M e a Kd da ligação da SBM liberada para o marcador alvo-específico é entre 10-5 a 10-9 M.

48. Polipeptídeo recombinante, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que a afinidade de ligação da SBM liberada para o marcador de célula-alvo é pelo menos uma ordem de magnitude maior, comparada com a afinidade de ligação menor da FBM liberada para o antígeno CD3, como determinada como constantes Kd no ensaio in vitro, quando testada sob concentrações molares equivalentes.

49. Polipeptídeo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 0-0, caracterizado pelo fato de que o ensaio in vitro é selecionado de ensaio de integridade da membrana celular, ensaio de cultura de células mistas, ensaio de iodeto de propídio baseado em FACS, ensaio de influxo de Azul tripano, ensaio fotométrico de liberação de enzima, ensaio radiométrico de liberação de 51Cr, ensaio fluorimétrico de liberação de európio, ensaio de liberação de Calceína-AM, ensaio fotométrico de MTT, ensaio de XTT, ensaio de WST-1, ensaio de Azul de Alamar, ensaio radiométrico de incorporação de 3H-Thd, ensaio clonogênico que mede atividade de divisão celular, ensaio fluorimétrico de rodamina-123 que mede o gradiente transmembrana mitocondrial, ensaio de apoptose monitorado por exposição à fosfatidilserina baseado em FACS, ensaio de teste de TUNEL baseado em ELISA, ELISA em sanduíche, ensaio de atividade de caspase, ensaio de liberação de LDH baseado em células e ensaio de morfologia celular, ou qualquer combinação destes.

50. Polipeptídeo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17-49, caracterizado ainda por compreender: i) um segundo segmento de liberação (RS2) que é um substrato para clivagem por uma protease de mamífero e ii) um segundo XTEN (XTEN2), em que, em um estado não clivado, o polipeptídeo recombinante possui um arranjo estrutural do terminal-N para o terminal-C do seguinte modo: XTEN1-RS1- SBM-FBM-RS2-XTEN2, XTEN1-RS1-FBM-SBM-RS2-XTEN2, XTEN2-RS2- SBM-FBM-RS1-XTEN1, XTEN2-RS2-FBM-SBM-RS1-XTEN1, XTEN2-RS2- diabody-RS1-XTEN1, em que o diabody compreende VL e VH das FBM e SBM, ou XTEN1-RS1-diabody-RS2-XTEN2, em que o diabody compreende VL e VH das FBM e SBM.

51. Polipeptídeo recombinante, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o XTEN2 compreende uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de seqüência para uma seqüência selecionada do grupo de seqüências apresentadas na Tabela 8 ou Tabela 10.

52. Polipeptídeo recombinante, de acordo com a reivindicação 0, caracterizado pelo fato de que o XTEN2 compreende uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de seqüência para uma seqüência selecionada de AE 144_1A, AE 144_2A, AEE144_2B, AE 144_3A, AE144_3B, AE 144_4A, AE 144_4B, AE 144_5A, AE 144_6B, AE284, AE288_1, AE288_2, AE288_3, AE576, AE864, AE864_2, AE865, AE866, AE867 e AE868.

53. Polipeptídeo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 50-52, caracterizado pelo fato de que a seqüência de RS2 é idêntica, comparada com a seqüência de RS1.

54. Polipeptídeo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 50-52, caracterizado pelo fato de que: a seqüência de RS2 é diferente, comparada com a seqüência de RS1; e compreende uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos 88% ou pelo menos 94% de identidade de seqüência para uma seqüência selecionada das seqüências da Tabela 1 ou Tabela 2.

55. Polipeptídeo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 50-52, caracterizado pelo fato de que a seqüência de RS2 é diferente, comparada com a seqüência de RS1 e compreende uma seqüência selecionada das seqüências da Tabela 1 ou Tabela 2.

56. Polipeptídeo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 50-55, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo recombinante compreende uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de seqüência para uma seqüência selecionada do grupo de seqüências apresentadas na Tabela 15 ou Tabela 18.

57. Polipeptídeo recombinante caracterizado por compreender um RS1, RS2, FBM, SBM, XTEN1 e XTEN2, em que:

a. o RS1 e RS2, em que o RS1 e RS2 são cada um, um substrato para clivagem por uma protease de mamífero e cada uma compreende uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos 90%, pelo menos 93%, pelo menos 97%, ou 100% de identidade de seqüência para uma seqüência selecionada das seqüências da Tabela 2; b. a FBM é um fragmento de anticorpo que compreende uma VL e uma VH derivadas de um anticorpo monoclonal que possui especificidade de ligação para uma célula efetora; c. a SBM é um fragmento de anticorpo que compreende uma VL e uma VH derivadas de um anticorpo monoclonal que possui afinidade de ligação para um marcador de célula-alvo; d. o XTEN1 e XTEN2, cada um, compreendem uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de seqüência para uma seqüência selecionada do grupo de seqüências apresentadas na Tabela 10; e e. o polipeptídeo recombinante possui um arranjo estrutural do terminal-N para o terminal-C do seguinte modo: XTEN1-RS1-SBM-FBM-RS2-XTEN2, XTEN1-RS1-FBM-SBM-RS2-XTEN2, XTEN2-RS2-SBM-FBM-RS1-XTEN1, XTEN2-RS2-FBM-SBM-RS1-XTEN1, XTEN2-RS2-diabody-RS1-XTEN1, em que o diabody compreende VL e VH das FBM e SBM.

58. Polipeptídeo recombinante, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que a célula efetora é uma célula T e o marcador de célula-alvo é selecionado de antígeno A33, alfa-fetoproteína (AFP), integrina alfa 4, Ang2, B7-H3, B7-H6, antígeno de maturação de célula B (BCMA), antígeno de câncer 19-9 (CA19-9), antígeno de câncer 125 (CA-125), Anidrase Carbônica 6 (CA6),

anidrase carbônica IX (CAIX), CEACAM5, cMET, CTLA4, Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 1 (CCR1), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 2 (CCR2), Receptor de Quimiocina de Motivo C- C 3 (CCR3), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 4 (CCR4), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 5 (CCR5), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 6 (CCR6), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 7 (CCR7), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 8 (CCR8), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 9 (CCR9), Agrupamento de Diferenciação 7 (CD7), CD22, CD70, CD79a, CD79b, CD19, CCR8, CEA, βhCG, Lewis-Y, CA19-9, CA-125, CD20, CD22, CD25, CD33, CD38, CD30, CD44v6, CD47, CD56 (NCAM), CD63, CD79b, CD123, CD133, CD138, CD166, claudina-1, claudina 18.2, molécula do tipo lectina do tipo-C-1 (CLL-1), família do domínio de lectina do tipo-C 12 (CLEC12), antígeno Cora, ligante Notch canônico do tipo delta 3 (DDL3), desmogleína 4, ligante Notch não canônico do tipo delta 1 (DLK1), Ectonucleotídeo Pirofosfatase/ Fosfodiesterase 3 (ENPP3), EGFR, EGFRvIII, EpCAM, endosialina (CD248), variante do receptor do fator de crescimento epidérmico III (EGFRvIII), EphA2, antígeno F19, receptor de acetilcolina fetal (fnAChR), antígeno de ativação de fibroblasto (FAP), antígeno relacionado ao Fos 1 (FRA1), Receptor de Folato 1 (FOLR1), fucosil GM1, G250, gangliosídeo GD3, glipicano-3 (GPC3), 9-O-Acetil-GD3, GM2, Receptor de TNF induzido por glicocorticóide (GITR), globohexaosilceramida (globo-H), GD2, Glipicano 3 (GPC3), guanilil ciclase C (GCC), HER2, HER2 neu, HER3, HER4, HER1, IL13Rα2, receptor do fator de crescimento do tipo insulina I (IGF-IR ), Proteína Lisossomal Associada à Membrana 1 (LAMP1), Molécula de Adesão Celular L1 (L1CAM), antígeno de linfócito 6 (Ly-6), proteoglicano de sulfato de condroitina do melanoma (MCSP), Metaloproteinase do tipo membrana (MT-MMP), mesotelina, mucina 1 (MUC1), MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC7, MUC16, receptor de substância inibidora muelleriana tipo II (MISIIR), molécula de adesão celular de nectina 4 (Nectina-4), antígeno epitelial transmembrana da próstata-6 (STEAP), antígeno de célula plasmática 1, antígeno de célula-tronco da próstata (PSCA), Morte Celular Programada 1 (PD1), Ligante de morte programada 1 (PD-L1), PSMA, Receptor Órfão do Tipo Receptor Tirosina- Quinase 1 (ROR1), antígeno Tn sialilado (s TN), proteína de transporte de fosfato sódio-dependente 2b (NaPi2b), Sonic Hedgehog (Shh), SAS, Membro 7 da Família SLAM (SLAM7), Receptor de Somatostatina 2 (SSTR2), Proteína Autoantigênica Espermática 17 (SP17), TAG72, Antígeno de Thomsen- Friedenreich (antígeno-TF), antígeno associado um tumor L6 (TAL6), glicoproteína trofoblástica (5T4), Trop-2, Wue-1, VEGFR1, VEGFR2 e proteína de tumor de Wilms (WT1).

59. Polipeptídeo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 50-58, caracterizado pelo fato de que a seqüência de RS2 é diferente, comparada com a seqüência de RS1 e cada uma é um substrato para uma protease diferente apresentada na Tabela 3.

60. Polipeptídeo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 50-58, caracterizado pelo fato de que as seqüências de RS1 e de RS2 são idênticos e cada é um substrato para duas ou mais proteases selecionadas de legumaína, MMP-2, MMP-7, MMP-9, MMP-11, MMP-14, uPA e matriptase.

61. Polipeptídeo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 50-60, caracterizado pelo fato de que,

mediante clivagem do RS1 e do RS2 pela protease(s) de mamífero e liberação das FBM e SBM do polipeptídeo recombinante, as FBM e SBM permanecem fundidas e são capazes de se ligar e união juntos o antígeno CD3 da célula T que abriga e o marcador de célula-alvo da célula tumoral que abriga em um ensaio in vitro que compreende tanto as células T quanto as células tumorais.

62. Polipeptídeo recombinante, de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que a habilidade do polipeptídeo recombinante em um estado não clivado para induzir lise da célula tumoral que abriga o antígeno de marcador de célula-alvo em um ensaio in vitro que compreende tanto células T quanto células tumorais é pelo menos duas ordens de magnitude menor, ou pelo menos três ordens de magnitude menor, ou pelo menos quatro ordens de magnitude menor, comparada com a lise induzida pela FBM ou pela SBM que foi liberada do polipeptídeo recombinante por clivagem do RS1 e RS2, como determinada por quantificação da lise celular ou liberação de componentes intracelulares quando testada sob concentrações molares equivalentes.

63. Polipeptídeo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 50-60, caracterizado pelo fato de que a afinidade de ligação do polipeptídeo recombinante não clivado para o antígeno CD3 ou para o marcador de célula- alvo em um ensaio in vitro que compreende antígeno CD3 ou marcador de célula-alvo é pelo menos uma ordem de magnitude menor, como determinada como uma constante Kd, comparada com a afinidade de ligação do polipeptídeo recombinante não clivado que não compreende um segundo segmento de liberação e um segundo XTEN para o antígeno CD3 ou para o marcador de célula-alvo, quando testada sob concentrações molares equivalentes.

64. Polipeptídeo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 50-60, caracterizado pelo fato de que a afinidade de ligação do polipeptídeo recombinante não clivado para o antígeno CD3 ou para o marcador de célula- alvo em um ensaio in vitro que compreende antígeno CD3 ou marcador de célula-alvo é pelo menos duas ordens de magnitude menor, ou pelo menos três ordens de magnitude menor, ou pelo menos quatro ordens de magnitude menor, como determinada como uma constante Kd no ensaio in vitro, comparada com a afinidade de ligação para antígeno CD3 ou marcador de célula- alvo da FBM ou da SBM que foi liberada do polipeptídeo recombinante por clivagem do RS1 e o RS2, quando testada sob concentrações molares equivalentes.

65. Polipeptídeo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 61-64, caracterizado pelo fato de que o ensaio in vitro é selecionado de ensaio de integridade da membrana celular, ensaio de cultura de células mistas, baseado em células ligação competitiva ensaio, ensaio de iodeto de propídio baseado em FACS, ensaio de influxo de Azul tripano, ensaio fotométrico de liberação de enzima, ensaio radiométrico de liberação de 51Cr, ensaio fluorimétrico de liberação de európio, ensaio de liberação de Calceína-AM, ensaio fotométrico de MTT, ensaio de XTT, ensaio de WST-1, ensaio de Azul de Alamar, ensaio radiométrico de incorporação de 3H-Thd, ensaio clonogênico que mede atividade de divisão celular, ensaio fluorimétrico de rodamina-123 que mede o gradiente transmembrana mitocondrial, ensaio de apoptose monitorado por exposição à fosfatidilserina baseado em FACS, ensaio de teste de TUNEL baseado em ELISA, ELISA em sanduíche, ensaio de atividade de caspase, ensaio de liberação de LDH baseado em células e ensaio de morfologia celular, ou qualquer combinação destes.

66. Polipeptídeo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que, mediante administração do polipeptídeo recombinante a um indivíduo que possui um tumor, os segmentos de liberação do polipeptídeo recombinante são capazes de serem clivados quando nas proximidades do tumor, em que o tumor ou tecido circundante está expressando uma ou mais proteases para as quais os segmentos de liberação são a substrato.

67. Polipeptídeo recombinante, de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo fato de que, mediante clivagem do(s) segmento(s) de liberação pela protease e liberação das FBM e SBM do polipeptídeo recombinante, as FBM e SBM fundidas são capazes de se ligar e de se unir junto com uma célula T que abriga o antígeno CD3 e uma célula tumoral que abriga um marcador tumor-específico que é um ligante para a SBM no indivíduo.

68. Polipeptídeo recombinante, de acordo com a reivindicação 67, caracterizado pelo fato de que, mediante a ligação em conjunto da célula T que abriga o antígeno CD3 e da célula tumoral que abriga o marcador de célula tumoral pelas FBM e SBM liberadas, formando uma sinapse imunológica, a ligação resulta na liberação de um ou mais moléculas efetoras derivadas de células T pela célula T.

69. Polipeptídeo recombinante, de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que as (uma ou mais) moléculas efetoras são selecionadas de TNF-alfa, IFN-

gama, interleucina 2, perforina e granzimas.

70. Polipeptídeo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 67-69, caracterizado pelo fato de que a ligação em conjunto da célula T que abriga o antígeno CD3 e da célula tumoral que abriga o marcador tumor-específico, lise da célula tumoral é efetuada pelas moléculas efetoras derivadas de células T.

71. Polipeptídeo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30-70, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo recombinante não clivado exibe uma meia-vida terminal após administração de uma dose única a um indivíduo que é pelo menos cinco vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes ou 100 vezes maior, comparada com a meia- vida terminal das FBM e SBM fundidas não ligadas ao polipeptídeo recombinante quando o polipeptídeo recombinante não clivado e as FBM e SBM fundidas são, cada um administrados a um indivíduo em uma dose molar equivalente.

72. Polipeptídeo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30-70, caracterizado pelo fato de que, após a administração de uma dose única terapeuticamente eficaz do polipeptídeo recombinante a um indivíduo que possui uma ou mais proteases associadas a tumores capazes de clivar o(s) segmento(s) de liberação do polipeptídeo recombinante, as FBM e SBM fundidas clivadas e liberadas do polipeptídeo recombinante exibem uma meia-vida terminal que é pelo menos cinco vezes, 10 vezes, ou 20 vezes, ou 30 vezes, ou 50 vezes ou 100 vezes menor, comparada com a meia-vida terminal do polipeptídeo recombinante correspondente que não é clivado no indivíduo.

73. Polipeptídeo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30-70, caracterizado pelo fato de que, após a administração de uma dose única terapeuticamente eficaz do polipeptídeo recombinante a um indivíduo que possui uma protease associada a tumores capaz de clivar o(s) segmento(s) de liberação do polipeptídeo recombinante, a concentração plasmática Cmax das FBM e SBM liberadas não excede cerca de 0,01 ng/ml, ou cerca de 0,1 ng/ml, ou cerca de 1 ng/ml, ou cerca de 10 ng/ml, ou cerca de 100 ng/ml.

74. Polipeptídeo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30-70, caracterizado pelo fato de que, após a administração de uma dose única terapeuticamente eficaz do polipeptídeo recombinante a um indivíduo que possui uma protease associada a tumores capaz de clivar o(s) segmento(s) de liberação do polipeptídeo recombinante, a área plasmática sob a curva das FBM e SBM liberadas é pelo menos 10 vezes menor, ou pelo menos 30 vezes menor, ou pelo menos 100 vezes menor, comparada com a área plasmática sob a curva do polipeptídeo recombinante não clivado no indivíduo.

75. Polipeptídeo recombinante, de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é selecionado do grupo que consiste em camundongo, rato, macaco, cão e humano.

76. Composição farmacêutica caracterizada por compreender o polipeptídeo recombinante conforme definido em de qualquer uma das reivindicações precedentes e um ou mais excipientes farmaceuticamente adequados.

77. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 76, caracterizada pelo fato de que a composição é formulada para administração intradérmica, subcutânea, intravenosa, intra-arterial, intra-abdominal,

intraperitoneal, intratecal ou intramuscular.

78. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 76, caracterizada pelo fato de que a composição está em uma forma líquida.

79. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 78, caracterizada pelo fato de que a composição está em uma seringa pré-preenchida para uma injeção única.

80. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 760, caracterizada pelo fato de que a composição é formulada como um pó liofilizado para ser reconstituído antes da administração.

81. Uso do polipeptídeo recombinante conforme definido em qualquer uma das reivindicações 30-70 caracterizado por ser na preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença em um indivíduo.

82. Uso, de acordo com a reivindicação 81, caracterizado pelo fato de que a doença é selecionada do grupo que consiste em carcinoma, linfoma de Hodgkin e linfoma não-Hodgkin, linfoma difuso de grandes células B, linfoma folicular, linfoma de célula do manto, blastoma, câncer de mama, câncer de mama ER/PR+, câncer de mama Her2+, câncer de mama triplo- negativo, câncer de cólon, câncer de cólon com ascite maligna, tumores mucinosos, câncer de próstata, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pele, melanoma, câncer do trato geniturinário, câncer ovariano, câncer ovariano com ascite maligna, carcinomatose peritoneal, carcinoma seroso uterino, câncer endometrial, câncer cervical, câncer cólon-retal, câncer uterino, mesotelioma no peritônio, câncer renal, tumor de Wilm, câncer de pulmão, câncer de pulmão de pequena célula, câncer de pulmão de célula não-pequena, câncer gástrico, câncer do estômago, câncer do intestino delgado, câncer do fígado, hepatocarcinoma, hepatoblastoma, lipossarcoma, câncer pancreático, câncer da vesícula biliar, cânceres do ducto biliar, câncer esofágico, carcinoma da glândula salivar, câncer da tireóide, câncer epitelial, arrenoblastoma, adenocarcinoma, sarcoma e leucemia linfática crônica derivada de células B.

83. Método de tratamento de uma doença em um indivíduo, caracterizado por compreender a administração ao indivíduo necessitado de uma ou mais doses terapeuticamente eficazes do polipeptídeo recombinante ou de uma composição farmacêutica que compreende o polipeptídeo recombinante conforme definido em qualquer uma das reivindicações 17-75.

84. Método, de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de que a doença é selecionada do grupo que consiste em carcinomas, linfoma de Hodgkin, linfoma não-Hodgkin, linfoma de célula B, linfoma de célula T, linfoma folicular, linfoma de célula do manto, blastoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer de próstata, câncer de cabeça e pescoço, qualquer forma de câncer de pele, melanoma, câncer do trato geniturinário, câncer ovariano, câncer ovariano com ascite maligna, carcinomatose peritoneal, carcinoma seroso uterino, câncer endometrial, câncer cervical, câncer cólon-retal, uma malignidade intraperitoneal dos epitélios com ascite maligna, câncer uterino, mesotelioma no peritônio, cânceres renais, câncer de pulmão, câncer de pulmão de pequena célula, câncer de pulmão de célula não-pequena, câncer gástrico, câncer esofágico, câncer do estômago, câncer do intestino delgado, câncer do fígado, hepatocarcinoma, hepatoblastoma,

lipossarcoma, câncer pancreático, câncer da vesícula biliar, cânceres do ducto biliar, carcinoma da glândula salivar, câncer da tireóide, câncer epitelial, adenocarcinoma, sarcomas de qualquer origem, malignidades hematológicas primárias, incluindo leucemias linfocíticas agudas ou crônicas, leucemias mielógenas agudas ou crônicas, distúrbios neoplásicos mieloproliferativos, ou distúrbios mielodisplásicos, miastenia grave, doença de Graves, tireoidite de Hashimoto ou síndrome de Goodpasture.

85. Método, de acordo com a reivindicação 83 ou 84, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica ou polipeptídeo recombinante é administrado ao indivíduo como uma ou mais doses terapeuticamente eficazes administradas duas vezes por semana, uma vez por semana, a cada duas semanas, a cada três semanas ou mensalmente.

86. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 83-85, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica ou polipeptídeo recombinante é administrado ao indivíduo como uma ou mais doses terapeuticamente eficazes ao longo de um período de pelo menos duas semanas, ou pelo menos um mês, ou pelo menos dois meses, ou pelo menos três meses, ou pelo menos quatro meses, ou pelo menos cinco meses, ou pelo menos seis meses.

87. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 83-86, caracterizado pelo fato de que a dose é administrada por via intradérmica, subcutânea, intravenosa, intra-arterial, intra-abdominal, intraperitoneal, intratecal ou intramuscular.

88. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 83-87, caracterizado pelo fato de que a dose é administrada como uma dose em bolo ou por infusão de 5 minutos a 96 horas, como tolerada para segurança e eficácia máximas.

89. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 83-88, caracterizado pelo fato de que a dose é selecionada do grupo que consiste em pelo menos cerca de 0,005 mg/kg, pelo menos cerca de 0,01 mg/kg, pelo menos cerca de 0,02 mg/kg, pelo menos cerca de 0,04 mg/kg, pelo menos cerca de 0,08 mg/kg, pelo menos cerca de 0,1 mg/kg, pelo menos cerca de 0,12 mg/kg, pelo menos cerca de 0,14 mg/kg, pelo menos cerca de 0,16 mg/kg, pelo menos cerca de 0,18 mg/kg, pelo menos cerca de 0,20 mg/kg, pelo menos cerca de 0,22 mg/kg, pelo menos cerca de 0,24 mg/kg, pelo menos cerca de 0,26 mg/kg, pelo menos cerca de 0,27 mg/kg, pelo menos cerca de 0,28 mg/kg, pelo menos 0,3 mg/kg, pelo menos 0,4 mg/kg, pelo menos cerca de 0,5 mg/kg, pelo menos cerca de 0,6 mg/kg, pelo menos cerca de 0,7 mg/kg, pelo menos cerca de 0,8 mg/kg, pelo menos cerca de 0,9 mg/kg, pelo menos cerca de 1,0 mg/kg, pelo menos cerca de 1,5 mg/kg, ou pelo menos cerca de 2,0 mg/kg.

90. Método, de acordo com qualquer uma ou combinação das reivindicações 83-88, caracterizado pelo fato de que uma dose inicial é selecionada do grupo que consiste em pelo menos cerca de 0,005 mg/kg, pelo menos cerca de 0,01 mg/kg, pelo menos cerca de 0,02 mg/kg, pelo menos cerca de 0,04 mg/kg, pelo menos cerca de 0,08 mg/kg, pelo menos cerca de 0,1 mg/kg, e uma dose subseqüente é selecionada do grupo que consiste em pelo menos cerca de 0,1 mg/kg, pelo menos cerca de 0,12 mg/kg, pelo menos cerca de 0,14 mg/kg, pelo menos cerca de 0,16 mg/kg, pelo menos cerca de 0,18 mg/kg, pelo menos cerca de 0,20 mg/kg, pelo menos cerca de 0,22 mg/kg, pelo menos cerca de 0,24 mg/kg, pelo menos cerca de 0,26 mg/kg, pelo menos cerca de 0,27 mg/kg, pelo menos cerca de 0,28 mg/kg, pelo menos 0,3 mg/kg, pelo menos 0,4. mg/kg, pelo menos cerca de 0,5 mg/kg, pelo menos cerca de 0,6 mg/kg, pelo menos cerca de 0,7 mg/kg, pelo menos cerca de 0,8 mg/kg, pelo menos cerca de 0,9 mg/kg, pelo menos cerca de 1,0 mg/kg, pelo menos cerca de 1,5 mg/kg, ou pelo menos cerca de 2,0 mg/kg.

91. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 83-88, caracterizado pelo fato de que a administração ao indivíduo resulta em uma concentração plasmática do polipeptídeo recombinante de pelo menos cerca de 0,1 ng/ml até pelo menos cerca de 2 ng/ml ou mais no indivíduo por pelo menos cerca de 3 dias, pelo menos cerca de 7 dias, pelo menos cerca de 10 dias, pelo menos cerca de 14 dias, ou pelo menos cerca de 21 dias.

92. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 83-91, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é selecionado do grupo que consiste em camundongo, rato, macaco e humano.

93. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 76-80 ou o polipeptídeo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30-70, caracterizado por ser usado em um método para o tratamento de uma doença, o método compreendendo a administração da composição farmacêutica ou do polipeptídeo recombinante a um indivíduo com a doença, opcionalmente de acordo com um regime de tratamento que compreende uma ou mais doses consecutivas com o uso de uma dose terapeuticamente eficaz.

94. Composição farmacêutica ou o polipeptídeo recombinante para o uso, de acordo com a reivindicação 93, caracterizada pelo fato de que a doença é selecionada do grupo que consiste em carcinomas, linfoma de Hodgkin, linfoma não-Hodgkin, linfoma de célula B, linfoma de célula T, linfoma folicular, linfoma de célula do manto, blastoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer de próstata, câncer de cabeça e pescoço, qualquer forma de câncer de pele, melanoma, câncer do trato geniturinário, câncer ovariano, câncer ovariano com ascite maligna, carcinomatose peritoneal, carcinoma seroso uterino, câncer endometrial, câncer cervical, câncer cólon-retal, uma malignidade intraperitoneal dos epitélios com ascite maligna, câncer uterino, mesotelioma no peritônio, cânceres renais, câncer de pulmão, câncer de pulmão de pequena célula, câncer de pulmão de célula não-pequena, câncer gástrico, câncer esofágico, câncer do estômago, câncer do intestino delgado, câncer do fígado, hepatocarcinoma, hepatoblastoma, lipossarcoma, câncer pancreático, câncer da vesícula biliar, cânceres do ducto biliar, carcinoma da glândula salivar, câncer da tireóide, câncer epitelial, adenocarcinoma, sarcomas de qualquer origem, malignidades hematológicas primárias, incluindo leucemias linfocíticas agudas ou crônicas, leucemias mielógenas agudas ou crônicas, distúrbios neoplásicos mieloproliferativos, ou distúrbios mielodisplásicos, miastenia grave, doença de Graves, tireoidite de Hashimoto, e síndrome de Goodpasture.

95. Composição farmacêutica ou o polipeptídeo recombinante para o uso, de acordo com a reivindicação 0 ou 0, caracterizada pelo fato de que o regime de tratamento é parte de um ciclo de tratamento especificado.

96. Composição farmacêutica ou o polipeptídeo recombinante para o uso, de acordo com a reivindicação 95, caracterizada pelo fato de que o ciclo de tratamento especificado compreende administração da composição farmacêutica ou do polipeptídeo recombinante duas vezes por semana, a cada semana, a cada 10 dias, a cada duas semanas, a cada três semanas, ou a cada mês por cada ciclo de tratamento.

97. Composição farmacêutica ou o polipeptídeo recombinante para o uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 93-96, caracterizada pelo fato de que o regime de tratamento resulta na melhora de um parâmetro ou desfecho clínico associado com a doença no indivíduo.

98. Composição farmacêutica ou o polipeptídeo recombinante para o uso, de acordo com a reivindicação 97, caracterizada pelo fato de que o parâmetro ou desfecho clínico é selecionado de um ou qualquer combinação do grupo que consiste em redução da massa tumoral como uma resposta completa, parcial ou incompleta; tempo até progressão, tempo até fracasso do tratamento, resposta de biomarcador; sobrevida livre de progressão; sobrevida livre de doença; tempo até recorrência; tempo até metástase; tempo de sobrevida global; melhora da qualidade de vida; e melhora de sintomas.

99. Kit caracterizado por compreender a composição farmacêutica conforme definida em qualquer uma das reivindicações 0-0, um recipiente e um rótulo ou bula sobre ou associada ao recipiente.

100. Ácido nucleico isolado, o ácido nucleico caracterizado por compreender (a) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo recombinante conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-0; ou (b) o complemento do polinucleotídeo de (a).

101. Vetor de expressão caracterizado por compreender a seqüência de polinucleotídeos da reivindicação 0 e uma seqüência reguladora recombinante ligada operativamente à seqüência de polinucleotídeos.

102. Célula hospedeira isolada, caracterizada por compreender o vetor de expressão da reivindicação 101.

103. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 102, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira é um procariota.

104. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 103, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira é E. coli.

105. Método de fabricação de uma composição de polipeptídeo recombinante ativável, o método caracterizado por compreender: a. cultivo de uma célula hospedeira que compreende uma construção de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo recombinante ativável sob condições que levam à expressão do polipeptídeo recombinante ativável, em que o polipeptídeo recombinante ativável compreende um RS1, RS2, FBM, SBM, XTEN1 e XTEN2, em que: i. o RS1 e RS2, em que o RS1 e RS2 são, cada um, substratos para clivagem por uma protease de mamífero e cada um compreende uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos 88% ou pelo menos 94%, ou 100% de identidade de seqüência para uma seqüência selecionada das seqüências da

Tabela 1 ou Tabela 2; ii. a FBM é um fragmento de anticorpo que compreende uma VL e uma VH derivadas de um anticorpo monoclonal que possui especificidade de ligação para CD3; iii. a SBM é um fragmento de anticorpo que compreende uma VL e uma VH derivadas de um anticorpo monoclonal que possui afinidade de ligação para o marcador de célula-alvo selecionado de antígeno A33, alfa-fetoproteína (AFP), integrina alfa 4, Ang2, B7-H3, B7-H6, antígeno de maturação de célula B (BCMA), antígeno de câncer 19-9 (CA19-9), antígeno de câncer 125 (CA-125), Anidrase Carbônica 6 (CA6), anidrase carbônica IX (CAIX), CEACAM5, cMET, CTLA4, Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 1 (CCR1), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 2 (CCR2), Receptor de Quimiocina de Motivo C- C 3 (CCR3), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 4 (CCR4), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 5 (CCR5), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 6 (CCR6), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 7 (CCR7), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 8 (CCR8), Receptor de Quimiocina de Motivo C-C 9 (CCR9), Agrupamento de Diferenciação 7 (CD7), CD22, CD70, CD79a, CD79b, CD19, CCR8, CEA, βhCG, Lewis-Y, CA19-9, CA-125, CD20, CD22, CD25, CD33, CD38, CD30, CD44v6, CD47, CD56 (NCAM), CD63, CD79b, CD123, CD133, CD138, CD166, claudina-1, claudina 18.2, molécula do tipo lectina do tipo-C-1 (CLL-1), família do domínio de lectina do tipo-C 12 (CLEC12), antígeno Cora, ligante Notch canônico do tipo delta 3 (DDL3), desmogleína 4, ligante Notch não canônico do tipo delta 1 (DLK1), Ectonucleotídeo Pirofosfatase/ Fosfodiesterase 3 (ENPP3), EGFR, EGFRvIII, EpCAM, endosialina (CD248), variante do receptor do fator de crescimento epidérmico III

(EGFRvIII), EphA2, antígeno F19, receptor de acetilcolina fetal (fnAChR), antígeno de ativação de fibroblasto (FAP), antígeno relacionado ao Fos 1 (FRA1), Receptor de Folato 1 (FOLR1), fucosil GM1, G250, gangliosídeo GD3, glipicano-3 (GPC3), 9-O-Acetil-GD3, GM2, Receptor de TNF induzido por glicocorticóide (GITR), globohexaosilceramida (globo-H), GD2, Glipicano 3 (GPC3), guanilil ciclase C (GCC), HER2, HER2 neu, HER3, HER4, HER1, IL13Rα2, receptor do fator de crescimento do tipo insulina I (IGF-IR ), Proteína Lisossomal Associada à Membrana 1 (LAMP1), Molécula de Adesão Celular L1 (L1CAM), antígeno de linfócito 6 (Ly-6), proteoglicano de sulfato de condroitina do melanoma (MCSP), Metaloproteinase do tipo membrana (MT-MMP), mesotelina, mucina 1 (MUC1), MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC7, MUC16, receptor de substância inibidora muelleriana tipo II (MISIIR), molécula de adesão celular de nectina 4 (Nectina-4), antígeno epitelial transmembrana da próstata-6 (STEAP), antígeno de célula plasmática 1, antígeno de célula-tronco da próstata (PSCA), Morte Celular Programada 1 (PD1), Ligante de morte programada 1 (PD-L1), PSMA, Receptor Órfão do Tipo Receptor Tirosina- Quinase 1 (ROR1), antígeno Tn sialilado (s TN), proteína de transporte de fosfato sódio-dependente 2b (NaPi2b), Sonic Hedgehog (Shh), SAS, Membro 7 da Família SLAM (SLAM7), Receptor de Somatostatina 2 (SSTR2), Proteína Autoantigênica Espermática 17 (SP17), TAG72, Antígeno de Thomsen- Friedenreich (antígeno-TF), antígeno associado um tumor L6 (TAL6), glicoproteína trofoblástica (5T4), Trop-2, Wue-1, VEGFR1, VEGFR2 e proteína de tumor de Wilms (WT1); iv. o XTEN1 e XTEN2, cada um, compreendem uma seqüência de aminoácidos que possui pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%,

93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de seqüência para uma seqüência selecionada do grupo de seqüências apresentadas na Tabela 8 ou Tabela 10; v. o polipeptídeo recombinante possui um arranjo estrutural do terminal-N para o terminal-C do seguinte modo: XTEN1-RS1-SBM-FBM-RS2-XTEN2, XTEN1-RS1-FBM-SBM-RS2-XTEN2, XTEN2-RS2-SBM-FBM-RS1-XTEN1, XTEN2-RS2-FBM-SBM-RS1-XTEN1, XTEN2-RS2-diabody-RS1-XTEN1, em que o diabody compreende VL e VH das FBM e SBM; b. recuperação da composição de polipeptídeo ativável.

106. Método, de acordo com a reivindicação 105, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo recombinante ativável é ativado por clivagem do RS1 e RS2 por uma ou mais proteases capazes de clivar o RS1 e RS2, resultando na liberação das FBM e SBM da composição, em que as FBM e SBM permanecem fundidas.

107. Método, de acordo com a reivindicação 105, caracterizado pelo fato de que o XTEN1 e XTEN2 do polipeptídeo recombinante ativável em um estado não clivado interferem com a ligação específica da FBM ao CD3 e da SBM ao marcador de célula-alvo, de modo que a constante de dissociação (Kd) da FBM do polipeptídeo recombinante ativável em um estado não clivado para CD3 ou da SBM para o marcador de célula-alvo é pelo menos 100 vezes maior, comparada com a FBM ou com a SBM liberadas do polipeptídeo recombinante ativável por clivagem do RS1 e RS2, quando medida em ensaios in vitro que compreendem o marcador de célula-alvo sob concentrações molares equivalentes.