EA042955B1 - Способ лечения заболевания или состояния, связанного с кровотечениями, с использованием комплекса фактора viii с xten и белком фактора фон виллебранда и его применение - Google Patents

Description

Уровень техники

Гемофилия А представляет собой нарушение, связанное с кровотечением, вызываемое дефектами гена, кодирующего фактор свертывания крови VIII (FVIII), она поражает 1-2 из 10000 рожденных мальчиков. Graw et al., Nat. Rev. Genet., 6(6):488-501 (2005). Пациентов, страдающих гемофилией А, можно лечить инфузиями очищенного или полученного рекомбинантным способом FVIII. Однако известно, что все коммерчески доступные продукты FVIII имеют период полувыведения, составляющий примерно 8-12 ч, что требует частого внутривенного введения пациентам. См. Weiner, M.A. and Cairo, M.S., Pediatric Hematology Secrets, Lee, M.T., 12, Disorders of Coagulation, Elsevier Health Sciences, 2001; Lillicrap, D., Thromb. Res., 122 Suppl, 4:S2-8 (2008). Кроме того, был испробован ряд подходов для увеличения периода полувыведения FVIII. Например, разрабатываемые в настоящее время подходы к увеличению периода полувыведения факторов свертывания крови включают пегилирование, гликопегилирование и конъюгацию с альбумином. См. Dumont et al., Blood, 119(13):3024-3030 (опубл. в интернете 13 января 2012 г.). Однако существуют данные о том, что независимо от используемой белковой инженерии длительно действующие продукты FVIII, разрабатываемые в настоящее время, имеют ограниченные периоды полувыведения - лишь примерно 1,5-2 ч в доклинических моделях у животных. См. указанный выше документ. Согласующиеся результаты были продемонстрированы у людей, например, сообщали, что rFVIIIFc увеличивает период полувыведения до ~1,7 раз по сравнению с АДВЕЙТ® у пациентов с гемофилией А. См. выше. Таким образом, данное увеличение периода полувыведения несмотря на небольшие улучшения может указывать на наличие других ограничивающих Т1/2 факторов. См. Liu, Т. et al., 2007, ISTH meeting, abstract #P-M-035; Henrik, A. et al., 2011, ISTH meeting, abstract #P=MO-181; Liu, T. et al., 2011, ISTH meeting abstract #P-WE-131.

Плазматический фактор фон Виллебранда (VWF) имеет период полувыведения, составляющий приблизительно 12 ч (в диапазоне от 9 до 15 ч) (http://www.nhlbi.nih.gOv/guidelines/vwd/2_scientificoverview.htm (последнее посещение 22 октября 2011 г.)). На период полувыведения VWF может влиять ряд факторов: профиль гликозилирования, ADAMTS-13 (дезинтегрин и металлопротеаза с мотивом-13 тромбоспондина) и различные мутации в VWF.

В плазме крови 95-98% FVIII циркулирует в виде устойчивого нековалентного комплекса с полноразмерным VWF. Образование данного комплекса имеет важное значение для поддержания соответствующих уровней FVIII в плазме крови in vivo. Lenting et al., Blood, 92(11):3983-96 (1998); Lenting et al., J. Thromb. Haemost., 5(7):1353-60 (2007). Полноразмерный FVIII дикого типа в основном присутствует в виде гетеродимера, содержащего тяжелую цепь (ММ 200 кДа) и легкую цепь (ММ 73 кДа). Когда FVIII активируется в результате протеолиза в положениях 372 и 740 в тяжелой цепи и в положении 1689 в легкой цепи, VWF, связанный с FVIII, освобождается от активированного FVIII. Активированный FVIII вместе с активированным фактором IX, кальцием и фосфолипидом (теназный комплекс) индуцирует активацию фактора X, в результате чего вырабатываются большие количества тромбина. Затем тромбин, в свою очередь, расщепляет фибриноген с образованием растворимых мономеров фибрина, которые затем спонтанно полимеризуются с образованием растворимого полимера фибрина. Тромбин также активирует фактор XIII, который вместе с кальцием служит для перекрестного сшивания и стабилизации растворимого полимера фибрина, образуя перекрестно сшитый (нерастворимый) фибрин. Активированный FVIII быстро выводится из кровообращения вследствие протеолиза.

Из-за частого дозирования и неудобства, вызываемого режимом дозирования, по-прежнему существует необходимость в разработке продуктов FVIII, требующих менее частого введения, т.е. продукта FVIII, имеющего период полувыведения, который больше 1,5-2-кратного предела периода полувыведения.

Краткое описание изобретения

В одном аспекте изобретения предложен способ лечения заболевания или состояния, связанного с кровотечениями, у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей (a) химерный белок, содержащий (i) фрагмент фактора фон Виллебранда (VWF), содержащий домен D' и домен D3 фактора фон Виллебранда, (ii) первую удлиненную полипептидную последовательность XTEN, и (iii) белок фактора VIII (FVIII); и (b) фармацевтически приемлемый носитель;

при этом VWF фрагмент и первая последовательность XTEN связаны, причем VWF фрагмент или первая последовательность XTEN связана с белком FVIII; и причем (a) VWF фрагмент содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 100;

(b) белок FVIII содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4 или 6; или белок FVIII содержит тяжелую цепь и легкую цепь, где тяжелая цепь белка FVIII содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотам 1-745 последовательности SEQ ID NO: 4, и лег-

- 1 042955 кая цепь белка FVIII содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотам 1649-2332 последовательности SEQ ID NO: 4; и (c) первая последовательность XTEN содержит аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136 или SEQ ID NO: 137.

В некоторых вариантах осуществления химерный белок содержит (a) единственную полипептидную цепь, содержащую VWF фрагмент, последовательность XTEN и белок FVIII; или (b) две полипептидные цепи, содержащие первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь, где первая полипептидная цепь содержит белок FVIII, а вторая полипептидная цепь содержит VWF фрагмент и последовательность XTEN.

В некоторых вариантах осуществления химерный белок дополнительно содержит (iv) константную область иммуноглобулина (Ig) или ее часть, связанную либо с VWF фрагментом, первой последовательностью XTEN, либо с белком FVIII или их любой комбинацией.

В другом аспекте изобретения предложен способ лечения заболевания или состояния, связанного с кровотечениями, у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей химерный белок и фармацевтически приемлемый носитель, причем химерный белок содержит формулу, включающую (a) V-X-FVIII;

(b) FVIII-X-V;

(с) V-X:FVni;

(d) X-V:FVni;

(е) FVni:V-X;

(f) FVIII:X-V;

(g) V-L2-X-L1-F1:FVIII-L3-F2;

(h) V-L2-X-L1-F1:F2-L3 -FVIII;

(i) Fl-Ll-X-L2-V:FVni-L3-F2;

(j) F1-L1-X-L2-V:F2-L3 -FVIII;

(k) V-L2-X-Ll-Fl-L4-FVin-L3-F2;

(1) F2-L3-FVIII-L4-F1-L1-X-L2-V;

(m) FVIII-L3 -F2-L4-V-L2-X-L1 -F1; и (n) Fl-Ll-X-L2-V-L4-F2-L3-FVni, где V содержит VWF фрагмент, каждый из L1, L2 и L3 содержит линкер,

L4 представляет собой линкер,

FVIII содержит белок FVIII,

X содержит одну или более последовательностей XTEN,

F1 содержит константную область Ig или ее часть,

F2 содержит дополнительную константную область Ig или ее часть, (-) представляет собой пептидную связь или одну или более аминокислот, и (:) представляет собой ковалентную связь или нековалентную связь.

В некоторых вариантах осуществления константная область Ig или ее часть содержит первую область Fc, которая связана с последовательностью XTEN или VWF фрагментом.

В некоторых вариантах осуществления константная область Ig или ее часть связана с последовательностью XTEN линкером.

В некоторых вариантах осуществления указанный линкер включает расщепляемый линкер.

В некоторых вариантах осуществления химерный белок содержит также дополнительную константную область Ig или ее часть.

В некоторых вариантах осуществления дополнительная константная область Ig или ее часть содержит вторую область Fc.

В некоторых вариантах осуществления дополнительная константная область Ig или ее часть связана с белком FVIII.

В некоторых вариантах осуществления вторая область Fc дополнительно связана с VWF фрагментом линкером.

В некоторых вариантах осуществления дополнительная константная область Ig или ее часть связана

- 2 042955 с константной областью Ig или ее частью.

В некоторых вариантах осуществления дополнительная константная область Ig или ее часть связана с константной областью Ig или ее частью ковалентной связью.

В некоторых вариантах осуществления указанная ковалентная связь представляет собой дисульфидную связь.

В некоторых вариантах осуществления VWF фрагмент связан с белком FVIII нековалентной связью.

В некоторых вариантах осуществления способ содержит вторую последовательность XTEN, соединенную с белком FVIII линкером на N-конце или С-конце белка FVIII, или встроенную непосредственно ниже от одного или более сайтов встраивания в белке FVIII.

В еще одном аспекте предложен способ лечения заболевания или состояния, связанного с кровотечениями, у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей химерный белок и фармацевтически приемлемый носитель, причем химерный белок содержит формулу, включающую (1) FVni(Xl)-Ll-Fl:V-L2-X2-L3-F2;

(2) FVni(Xl)-Ll-Fl :F2-L3-X2-L2-V;

(3 ) F1 -L1 -F VIII(X 1): V-L2 -X2-L3 -F2;

(4) F1 -L1 -F VIII(X 1 );F2-L3 -X2-L2-V;

(5) F ¥П1(Х1 )-L 1 -F1-L4-V-L2-X2-L3 -F2;

(6) F VIII(X 1 )-L 1 -F1-L4-F2-L3 -X2-L2-V;

(7) F1 -L1 -FVIII(X 1 )-L4-V-L2-X2-L3-F2 или (8) F1 -L1 -F VIII(X 1 )-L4-F2-L3 -X2-L2-V, где FVIII(X1) содержит белок FVIII и последовательность XTEN, при этом указанная последовательность XTEN связана с N-концом или С-концом белка FVIII или встроена непосредственно ниже одной или более аминокислот (один или более сайтов встраивания) в белке FVIII, каждый из L1, L2 и L3 представляет собой линкер,

L4 представляет собой линкер,

Х2 содержит одну или более последовательностей XTEN,

F1 содержит константную область Ig или ее часть,

F2 содержит дополнительную константную область Ig или ее часть, и

V содержит VWF фрагмент;

(-) представляет собой пептидную связь или одну или более аминокислот, и (:) содержит ковалентную связь или нековалентную связь.

В некоторых вариантах осуществления константная область Ig или ее часть и дополнительная константная область Ig или ее часть являются одинаковыми или разными.

В еще одном аспекте предложен способ лечения заболевания или состояния, связанного с кровотечениями, у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей химерный белок и фармацевтически приемлемый носитель, причем химерный белок содержит первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь, при этом указанная первая полипептидная цепь содержит белок FVIII и первую константную область Ig или ее часть, и указанная вторая полипептидная цепь содержит VWF фрагмент, первую последовательность XTEN и вторую константную область Ig или ее часть; и причем (a) VWF фрагмент содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 100;

(b) белок FVIII содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4 или 6; или белок FVIII содержит тяжелую цепь и легкую цепь, где тяжелая цепь белка FVIII содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотам 1-740 последовательности SEQ ID NO: 4, и легкая цепь белка FVIII содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотам 1649-2332 последовательности SEQ ID NO: 4; и (c) первая последовательность XTEN содержит аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155 или SEQ ID NO: 156.

В другом аспекте изобретения предложен способ лечения заболевания или состояния, связанного с кровотечениями, у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей химерный белок и фармацевтически приемлемый носитель, причем химерный белок содержит первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь, при этом указанная первая полипептидная цепь содержит фрагмент VWF, первую последовательность XTEN, первую константную область Ig или ее часть, и указанная вторая полипептидная цепь содержит белок FVIII,

- 3 042955 вторую последовательность XTEN и вторую константную область Ig или ее часть; и причем (a) VWF фрагмент содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на

90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 100;

(b) белок FVIII содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4 или 6; или белок FVIII содержит тяжелую цепь и легкую цепь, где тяжелая цепь белка FVIII содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотам 1-740 последовательности SEQ ID NO: 4, и легкая цепь белка FVIII содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотам 1649-2332 последовательности SEQ ID NO: 4; и (с) первая последовательность XTEN содержит аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155 или SEQ ID NO: 156.

В некоторых вариантах осуществления вторая последовательность XTEN встроена в один или более сайтов встраивания в белке FVIII, выбранных из группы, состоящей из аминокислотных остатков в табл. 7, 8, 9 и 10. В некоторых вариантах осуществления белок FVIII содержит домен В или его часть. В некоторых вариантах осуществления белок FVIII представляет собой FVIII с делецией домена SQ В.

В некоторых вариантах осуществления белок FVIII (i) содержит домен В или его часть; или (ii) представляет собой FVIII с делецией домена SQ В, и причем вторая последовательность XTEN встроена в домен В или его часть.

В некоторых вариантах осуществления белок FVIII содержит одноцепочечный FVIII, и указанный одноцепочечный FVIII содержит по меньшей мере одну замену аминокислоты в остатке, соответствующем остатку 1648, остатку 1645 или обоим в полноразмерном зрелом полипептиде FVIII (SEQ ID NO: 4) или остатку 754, остатку 751 или обоим в SQ BDD FVIII (SEQ ID NO: 6).

В некоторых вариантах осуществления VWF фрагмент содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичную аминокислотам с 764 по 1240 последовательности SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления VWF фрагмент по существу состоит из или состоит из аминокислот с 764 по 1240 последовательности SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления VWF фрагмент содержит замену остатка, соответствующего остатку 1099, остатку 1142 или как остатку 1099, так и остатку 1142 последовательности SEQ ID NO: 2, аминокислотой, отличной от цистеина. В некоторых вариантах осуществления VWF фрагмент по существу состоит из или состоит из домена D' и домена D3 фактора фон Виллебранда или их фрагментов. В некоторых вариантах осуществления VWF фрагмент не содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (1) аминокислот 1241-2813 последовательности SEQ ID NO: 2, (2) аминокислот 1270-2813 последовательности SEQ ID NO: 2, (3) аминокислот 1271-2813 последовательности SEQ ID NO: 2, (4) аминокислот 1272-2813 последовательности SEQ ID NO: 2, (5) аминокислот 1273-2813 последовательности SEQ ID NO: 2, (6) аминокислот 1274-2813 последовательности SEQ ID NO: 2, и любых их комбинаций.

В некоторых вариантах осуществления VWF фрагмент не содержит аминокислоты 1274-2813 последовательности SEQ ID NO: 2.

В некоторых вариантах осуществления первая последовательность XTEN содержит по меньшей мере один мотив, выбранный из табл. 2А.

В некоторых вариантах осуществления первая последовательность XTEN содержит АЕ42, АЕ72, АЕ864, АЕ576, АЕ288, АЕ144, AG864, AG576, AG288 или AG144.

В некоторых вариантах осуществления заболевание или состояние, связанное с кровотечениями, представляет собой гемофилию А.

В другом аспекте изобретения предложен способ лечения заболевания или состояния, связанного с кровотечениями, у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей химерный белок и фармацевтически приемлемый носитель, причем химерный белок содержит (a) первый полипептид, содержащий (i) фрагмент фактора фон Виллебранда (VWF), содержащий домен D' и домен D3 VWF, (ii) первую последовательность XTEN, и (iii) первую область Fc; и (b) второй полипептид, содержащий (i) белок фактора VIII (FVIII), и (ii) вторую область Fc;

причем VWF фрагмент и первая последовательность XTEN связаны пептидной связью, причем VWF фрагмент содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере

- 4 042955 на 95% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 100, причем полипептид FVIII содержит аминокислоты 1-745 и 1649-2332 полноразмерного зрелого фактора VIII человека (SEQ ID NO: 4), и причем первая последовательность XTEN содержит аминокислотную последовательность согласно

SEQ ID NO: 131.

В некоторых вариантах осуществления первая область Fc связана со второй областью Fc ковалентной связью.

В некоторых вариантах осуществления первая область Fc связана с первой последовательностью XTEN линкером.

В некоторых вариантах осуществления указанный линкер включает расщепляемый тромбином линкер.

В некоторых вариантах осуществления указанная ковалентная связь представляет собой дисульфидную связь.

В некоторых вариантах осуществления первая область Fc ассоциирована со второй областью Fc двумя дисульфидными связями.

В некоторых вариантах осуществления второй полипептид дополнительно содержит вторую XTEN.

В некоторых вариантах осуществления вторая XTEN встроена непосредственно ниже одного или более сайтов встраивания в белке FVIII.

В некоторых вариантах осуществления вторая XTEN встроена в белке FVIII непосредственно ниже сайта встраивания, соответствующего остатку 745 полноразмерного зрелого фактора VIII человека (SEQ ID NO: 4).

В некоторых вариантах осуществления первая последовательность XTEN связана с С-концом VWF фрагмента и первая область Fc связана с С-концом первой последовательности XTEN расщепляемым тромбином линкером, причем вторая область Fc связана с С-концом белка FVIII.

В некоторых вариантах осуществления первая область Fc и вторая область Fc являются идентичными.

В некоторых вариантах осуществления белок FVIII содержит домен В или его часть.

В некоторых вариантах осуществления VWF фрагмент содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 99% идентична аминокислотам с 764 по 1240 последовательности SEQ ID NO: 2.

В некоторых вариантах осуществления VWF фрагмент содержит замену остатка, соответствующего остатку 1099, остатку 1142 или как остатку 1099, так и остатку 1142 последовательности SEQ ID NO: 2, аминокислотой, отличной от цистеина.

В некоторых вариантах осуществления заболевание или состояние, связанное с кровотечениями, представляет собой гемофилию А.

В некоторых вариантах осуществления композицию вводят путем внутривенного введения.

Краткое описание чертежей/фигур

На фиг. 1А-Ю представлены схематические изображения VWFфрагментов фактора фон Виллебранда.

На фиг. 1А показаны три типичных VWFфрагмента фактора фон Виллебранда, подходящие для настоящего изобретения, например VWF-002, VWF-010 и VWF-013. VWF-002 содержит аминокислоты с 1 по 477 последовательности SEQ ID NO: 124 (аминокислоты с 764 по 1240 последовательности SEQ ID NO: 2) и синтезирован без пре/пропептидных последовательностей. VWF-010 содержит домены D1D2 в дополнение к доменам D'D3. VWF-013 содержит домены D1D2D'D3 в дополнение к остаткам аланина, заменяющим цистеины в остатках 336 и 379 последовательности SEQ ID NO: 123.

На фиг. 1В показан VWF-031, который содержит домены D1D2D'D3, слитые с константной областью Ig или ее частью, например областью Fc, с помощью расщепляемого линкера, например расщепляемого тромбином линкера из 48 аминокислот.

На фиг. 1С показан VWF-025, представляющий собой нуклеотидную последовательность, кодирующую домены D1D2D'D3, содержащуюся в векторе pLIVE, и VWF-029, представляющий собой нуклеотидную последовательность, кодирующую домены D1D2D'D3 с двумя заменами аминокислот, С336А и С379А, в векторе pLIVE.

На фиг. 1D показан полноразмерный VWFфрагмент фактора фон Виллебранда, содержащий пропептид (домены D1 и D2) и зрелые субъединицы (домены D', D3, A1, A2, A3, D4, B1-3, C1-2). VWFфрагмент фактора фон Виллебранда представляет собой белок массой примерно 250 кДа и образует мультимеры (>20 МДа) путем образования дисульфидных связей. VWFфрагмент фактора фон Виллебранда ассоциирует с FVIII (95-98%) в нековалентный комплекс, а затем увеличивает период полувыведения FVIII путем защиты FVIII от расщепления протеазой/активации, стабилизации тяжелой и легкой цепи и предотвращения клиренса FVIII фагоцитарными рецепторами. VWFфрагмент фактора фон Виллебранда также может ограничивать период полувыведения FVIII путем клиренса комплекса FVIII-VWF с помощью рецепторов VWF и предотвращения пиноцитоза, и рециркуляции rFVIIIFc.

На фиг. 2 представлены фармакокинетические характеристики rFVIII-XTEN (rFVIII-AE288 или

- 5 042955 rFVIII-288AE) у мышей, экспрессирующих DVWFD3 фактора фон Виллебранда, или у мышей с двойным нокаутом (DKO) FVIII и VWF.

На фиг. 2А показана временная шкала для гидродинамической инъекции (HDI) плазмидной ДНК, кодирующей домен D'D3 (VWF-025) (-5 день), внутривенного дозирования rFVIII-XTEN AE288 (0 день) и забора образцов для определения фармакокинетики (ФК) (5 день).

На фиг. 2В показана активность FVIII, измеренная путем хромогенного анализа FVIII после внутривенного дозирования rFVIII-XTEN288 у мышей D1D2D'D3 (перевернутый треугольник) и rFVIII-XTEN288 у мышей DKO (ромб).

На фиг. 2С показан уровень D'D3 в плазме крови (нг/мл) после введения VWF-025. Ось X представляет собой время в часах.

На фиг. 3 представлено схематическое изображение типичных гетеродимерных конструкций VWF:FVIII. Указанные конструкции имеют общую структуру, представленную в виде формулы FVIII-F1-L1-V-X-L2-F2, но содержат примеры разных вариабельных линкеров. Показанная конструкция (FVIII-161) содержит гетеродимерный FVIII (тяжелая цепь и легкая цепь ассоциированы металлической связью), связанный с первой областью Fc и VWFфрагментом фактора фон Виллебранда, который представляет собой домены D' и VWFD3 фактора фон Виллебранда (т.е. аминокислоты с 1 по 477 последовательности SEQ ID NO: 2 с заменами аминокислот С336А и С379А), связанным с последовательностью XTEN, которая также связана с расщепляемым линкером и второй областью Fc. Последовательность XTEN, содержащаяся в FVIII-161, представляет собой последовательность XTEN AE288, а линкер представляет собой расщепляемый тромбином линкер, содержащий 35 аминокислот. В FVIII-161 белок FVIII, связанный с первой областью Fc, связан с VWFфрагментом фактора фон Виллебранда процессируемым линкером. После экспрессии процессируемый линкер может быть расщеплен под действием фермента внутриклеточного процессинга, что, таким образом, приводит к ассоциации трех полипептидных цепей конструкции друг с другом.

Фиг. 4A-4E представляют собой схематические изображения примеров гетеродимера FVIII-VWF или мономеров. FVIII-168, FVIII-175, FVIII-172, FVIII-174 и FVIII170. Конструкция FVIII-168 содержит последовательность одноцепочечного FVIII (содержащую замену остатков аргинина остатками аланина в остатках 1645 и 1648), связанную с первой областью Fc, которая затем слита с VWFфрагментом фактора фон Виллебранда, связанным со второй областью Fc расщепляемым тромбином линкером, содержащим 48 аминокислот. АЕ288 XTEN встроена в домен В последовательности одноцепочечного FVIII. Связь между первой областью Fc и VWFфрагментом фактора фон Виллебранда включает линкер, который может быть расщеплен под действием фермента внутриклеточного процессинга, т.е. процессируемый линкер. Конструкция FVIII-175 содержит одноцепочечный FVIII (содержащий замену остатков аргинина остатками аланина в остатках 1645 и 1648), связанный с АЕ288 XTEN и первой областью Fc, которая связана со второй областью Fc линкером, например процессируемым линкером. АЕ288 XTEN встроена в домен В последовательности одноцепочечного FVIII. Конструкция FVIII-172 содержит две полипептидные цепи:

первую цепь, содержащую последовательность тяжелой цепи FVIII, слитую с АЕ288 XTEN;

вторую цепь, содержащую последовательность легкой цепи FVIII, первую область Fc, линкер (например, процессируемый линкер), VWFфрагмент фактора фон Виллебранда, расщепляемый тромбином линкер (например, 48 аминокислот) и вторую область Fc.

Конструкция FVIII-174 содержит две полипептидные цепи:

первую цепь, содержащую последовательность тяжелой цепи FVIII, слитую с АЕ288 XTEN; и вторую цепь, содержащую легкую цепь FVIII, первую область Fc, линкер (например, процессируемый линкер); и вторую область Fc.

Конструкция FVIII-170 содержит VWFфрагмент фактора фон Виллебранда, АЕ288 XTEN, линкер (например, расщепляемый тромбином линкер длиной в 35 аминокислот) и последовательность одноцепочечного FVIII.

На фиг. 5 представлены фармакокинетические характеристики гетеродимеров FVIII/VWF, содержащих последовательность XTEN в комбинации с областью Fc. Конструкции FVIII-161, FVIII-168 и FVIII-172 вводили мышам с двойным нокаутом (DKO) FVIILVWF путем гидродинамической инъекции (FIDI) в дозе 100 мкг/мышь. Конструкцию FVIII-170 вводили мышам DKO FVIILVWF путем HDI в дозе 50 мкг/мышь. Активность FVIII в плазме крови после HDI анализировали путем хромогенного анализа FVIII в течение 24 ч после HDI. Активность FVIII гетеродимеров FVIILVWF, содержащих последовательность XTEN и домены Fc, сравнивали с активностью FVIII BDD-FVIII без VWFфрагмента фактора фон Виллебранда, последовательности XTEN и доменов Fc.

На фиг. 6 представлены схематические изображения системы котрансфекции примеров гетеродимера FVIILVWF.

На фиг. 6А представлена конструкция FVIII-169, содержащая полноразмерную последовательность FVIII (с остатком аланина, заменяющим остатки аргинина в 1645 и 1648, и с последовательностью XTEN, встроенной в последовательность одноцепочечного FVIII), связанную с областью Fc. VWF-031

- 6 042955 содержит фрагмент D1D2D'D3 (с остатком аланина, заменяющим остатки цистеина в 336 и 379), связанный с другой областью Fc расщепляемым тромбином линкером 48. После внутриклеточного процессинга конструкция FVIII-169 образует полноразмерный одноцепочечный FVIII (SCFVIII), слитый с одним фрагментом Fc и последовательностью XTEN, и конструкция VWF-031 образует фрагмент D'D3 из 477 аминокислот, связанный с другим фрагментом Fc. Две ковалентные связи могут образовываться между фрагментами Fc, связанными с SC FVIII или фрагментом D'D3, это, в свою очередь, обеспечивает нековалентную ассоциацию FVIII и D'D3.

На фиг. 6В представлена конструкция FVIII-173, содержащая гетеродимерную последовательность FVIII, последовательность тяжелой цепи FVIII, связанную с последовательностью XTEN, и последовательность легкой цепи FVIII, связанную с областью Fc. VWF-031 описан выше. После внутриклеточного процессинга конструкция FVIII-173 образует гетеродимерный белок, тяжелую цепь FVIII, слитую с последовательностью XTEN, легкую цепь FVIII, слитую с одним фрагментом Fc, и конструкция VWF-031 образует фрагмент D'D3 из 477 аминокислот, связанный с другим фрагментом Fc. Две ковалентные связи могут образовываться между фрагментами Fc, связанными с легкой цепью FVIII или фрагментом D'D3, это, в свою очередь, обеспечивает нековалентную ассоциацию FVIII и D'D3.

На фиг. 7 представлена аффинность связывания типичного FVIILVWF, содержащего последовательность XTEN и домены Fc, в отношении иммобилизованного VWF человека (hVWF) в анализе Octet. Аффинность связывания для FVIII-169/VWF-031 и FVIII-057 (rFVIIIFc), слитого с иммобилизованным hVWF, тестировали с использованием измерений на основе биослойной интерферометрии (анализ Octet).

На фиг. 7А показан ответ в наномолях лекарственного вещества FVIII169 и FVIIIFc (положительный контроль) на иммобилизованный hVWF в виде связывания.

На фиг. 7В показан ответ IgG1 человека (отрицательный контроль) на иммобилизованный VWF человека в виде связывания.

На фиг. 8 представлены фармакокинетические (ФК) характеристики FVIII-169 у мышей HemA и мышей с двойным нокаутом (DKO) FVIILVWF.

На фиг. 8А показаны ФК характеристики FVIII-169/VWF-031 и FVIIIFc у мышей HemA. Мышей HemA лечили однократной внутривенной дозой FVIII-169/VWF-031 в количестве 200 МЕ/кг. Образцы плазмы крови, полученные от мышей, тестировали путем хромогенного анализа FVIII. Период полувыведения FVIII-169/VWF-031 рассчитывали с использованием программы WinNonlin.

На фиг. 8В показаны ФК характеристики FVIII-169/VWF-031, FVIII-169/Fc и FVIIIFc у мышей DKO FVIILVWF.

На фиг. 9 представлены ФК характеристики вариантов FVIII-XTEN у мышей DKO FVIII/VWF, экспрессирующих D'D3.

На фиг. 9А показано сравнение ФК характеристик вариантов FVIII-XTEN, FVIII с одной XTEN, FVIII с двумя XTEN и FVIII с тремя XTEN. Одну, две или три XTEN встраивали в различные части FVIII, включая С-конец и В-домен. СТ означает, что XTEN связана с С-концом FVIII. Сайт встраивания B/CT означает, что одна XTEN встроена между аминокислотным остатком 745 и аминокислотным остатком 746 белка FVIII, a другая XTEN связана с С-концом белка FVIII. Нумерация аминокислотных остатков соответствует последовательности белка SQ BDD FVIII. Сайт встраивания 1900/B/CT означает, что первая XTEN встроена между аминокислотным остатком 1900 и аминокислотным остатком 1901 в FVIII, вторая XTEN встроена между аминокислотным остатком 745 и аминокислотным остатком 746 в FVIII и третья XTEN связана с С-концом FVIII. Линия мышей, используемая для введения вариантов FVIII-XTEN, представляет собой линию мышей DKO, экспрессирующих домены D'D3.

На фиг. 9В показаны ФК характеристики FVIII-XTEN с тремя встраиваниями XTEN. Вариант FVIII-XTEN (1900/B/CT) вводили либо мышам DKO FVIII/VWF, либо мышам HemA. Сравнивали период полувыведения FVIII-XTEN (1900/B/CT).

На фиг. 10 показана FVIII-активность FVIIIFc (полый треугольник), FVIII169:Fc (заштрихованный круг) и FVIII169:VWF31 (полый треугольник) в плазме крови мышей DKO, измеренная путем хромогенного анализа. FVIILFc содержит FVIII с двойной цепью (тяжелая цепь и легкая цепь), слитый с димером Fc (т.е. гибрид мономер-димер). FVIII169 описан выше (содержащий АЕ288 в домене В, непосредственно ниже аминокислоты 745, соответствующий последовательности зрелого FVIII). FVIII169:Fc содержит FVIII169, слитый с димером Fc. FVIII169:VWF31 содержит VWF31 в дополнение к димеру Fc, FVIII169, слитый с первой областью Fc, и VWF31, слитый со второй областью Fc, при этом первая область Fc и вторая область Fc образуют ковалентную связь, например одну или более дисульфидных связей.

На фиг. 11 показано влияние Fc, XTEN и VWFфрагментов фактора фон Виллебранда-D'D3 на увеличение периода полувыведения FVIII. BDD-FVIII (РЕФАКТО®) (квадрат), FVIIFc (круг), FVIII169/Fc (треугольник) и FVIII169/VWF031 (перевернутый треугольник) вводили мышам с двойным нокаутом (DKO) FVIII и VWF. Активность FVIII измеряли путем хромогенного анализа и период полувыведения рассчитывали с использованием программы WinNonlin-Phoenix. Ось X показывает время, а ось Y показывает активность FVIII в плазме крови в мЕд/мл.

На фиг. 12А-12С показано влияние различных XTEN в гетеродимере rFVIII-XTEN/VWF у мышей HemA.

- 7 042955

На фиг. 12А показана активность FVIII в плазме крови, приведенная к значению 5-минутному (%) двух XTEN, встроенных непосредственно ниже остатков 1900 и 1656, соответствующих последовательности зрелого FVIII (т.е. FVIII-195 (изоформа FVIII с двойной цепью) и FVIII-199 (изоформа FVIII с одной цепью)), по сравнению с FVIII-169, содержащим XTEN непосредственно ниже остатка 745, соответствующего последовательности зрелого FVIII. FVIII-169/VWF031 (заштрихованный круг), FVIII-199/VWF031 (заштрихованный квадрат) и FVIII-195/VWF031 (полый квадрат) вводили мышам HemA для измерения активности FVIII в плазме крови.

На фиг. 12В показано влияние на увеличение периода полувыведения встраивания второй XTEN непосредственно ниже остатков 403 (домен А2) и 745 (домен В) (т.е. FVIII-203), и остатков 745 (домен В) и 1900 (домен A3) (FVIII-204), соответствующих последовательности зрелого FVIII, по сравнению с FVIII-169 (встраивание XTEN только в домене В). FVIII-204/VWF031 (заштрихованный треугольник), FVIII-169/VWF-031 (заштрихованный круг), FVIII-203/VWF-031 (заштрихованный квадрат) и scBDD-FVIII (полый ромб) вводили мышам HemA. Ось X показывает активность FVIII в плазме крови, приведенную к значению 5-минутному (%), а ось Y показывает время в часах.

На фиг. 12С показано влияние на увеличение периода полувыведения двух встраиваний XTEN непосредственно ниже остатков 18 (домен А1) и 745 (домен В) (т.е. FVIII-205) по сравнению с FVIII-169 (одно встраивание XTEN в домене В) и одноцепочечным FVIII без каких-либо областей Fc или какихлибо XTEN (т.е. FVIII-207). На фиг. 12С также показано влияние на увеличение периода полувыведения трех встраиваний XTEN непосредственно ниже остатков 26 (домен А1), 1656 (домен A3) и 1900 (домен A3) (т.е. FVIII-201) по сравнению с FVIII-169 (одно встраивание XTEN непосредственно ниже остатка 745). FVIII-205/VWF-031 (заштрихованный квадрат), FVIII-201/VWF-031 (перевернутый треугольник), FVIII169/VWF-031 (заштрихованный круг) и FVIII-207 (полый ромб) вводили мышам HemA. Активность FVIII в плазме крови, приведенную к значению 5-минутному (%) (ось X), измеряли с течением времени в часах (ось Y).

На фиг. 13 представлена активность FVIII гетеродимера rFVIII-XTEN/VWF-XTEN у мышей DKO FVIII/VWF. Активность FVIII в образцах плазмы крови анализировали путем хромогенного анализа FVIII, и строили кривую регрессии активности FVIII в плазме крови (ось X) в зависимости от времени (ось Y). FVIII-155 (scFVIIIFc без каких-либо XTEN) экспрессировали совместно с VWF-034 (VWF-Fc с АЕ 288 XTEN плюс расщепляемый тромбином линкер из 35 остатков). Период полувыведения FVIII-155/VWF-034 сравнивали с периодом полувыведения FVIII-169/VWF-031, содержащего АЕ 288 XTEN, встроенную в место соединения с доменом В (непосредственно ниже остатка 745, соответствующего зрелому полипептиду FVIII) FVIII.

На фиг. 14А-14Н представлены схематические изображения различных конструкций rFVIII-XTEN/VWF. Данные конструкции также описаны в других разделах настоящего документа.

На фиг. 14А показан одноцепочечный белок FVIII с делецией домена В (иногда обозначаемый в настоящем описании scBDD-FVIII). Конструкции scBDD-FVIII содержат две замены Arg на Ala в остатках 1645 и 1648.

На фиг. 14В показана конструкция с двумя полипептидными цепями (FVIII155/VWF031): первая цепь содержит одноцепочечный FVIII, связанный с областью Fc без каких-либо XTEN, и вторая цепь содержит VWFфрагмент фактора фон Виллебранда D'D3, связанный с областью Fc. Данную конструкцию используют в качестве контроля.

На фиг. 14С показана конструкция с двумя полипептидными цепями (FVIII199/VWF031): первая цепь содержит одноцепочечный FVIII, связанный с областью Fc, в котором первая XTEN встроена непосредственно ниже остатка 1900, соответствующего последовательности зрелого FVIII, а вторая XTEN встроена непосредственно ниже остатка 1656, соответствующего последовательности зрелого FVIII, и вторая цепь содержит VWFфрагмент фактора фон Виллебранда D'D3, связанный с областью Fc.

На фиг. 14D показана конструкция с двумя полипептидными цепями (FVIII201/VWF031): первая цепь содержит одноцепочечный белок FVIII, связанный с областью Fc, в котором первая XTEN встроена непосредственно ниже остатка 26, соответствующего последовательности зрелого FVIII, вторая XTEN встроена непосредственно ниже остатка 1656, соответствующего последовательности зрелого FVIII, и третья XTEN встроена непосредственно ниже остатка 1900, соответствующего последовательности зрелого FVIII, и вторая цепь содержит VWFфрагмент фактора фон Виллебранда D'D3, связанный с областью Fc.

На фиг. 14Е показаны конструкции с двумя полипептидными цепями (FVIII169/VWF031): первая цепь содержит одноцепочечный белок FVIII, связанный с областью Fc, в котором XTEN встроена непосредственно ниже остатка 745 (обозначенного В), соответствующего последовательности зрелого FVIII, и вторая цепь содержит VWFфрагмент фактора фон Виллебранда D'D3, связанный с областью Fc.

На фиг. 14F показана конструкция с двумя полипептидными цепями (FVIII203/VWF031): первая цепь содержит одноцепочечный белок FVIII, в котором первая XTEN встроена в остатке 745 (В), соответствующем последовательности зрелого FVIII, a вторая XTEN встроена в остатке 1900, соответствующем последовательности зрелого FVIII, и вторая цепь содержит VWFфрагмент фактора фон Виллебранда D'D3, связанный с областью Fc.

- 8 042955

На фиг. 14G показана конструкция с двумя полипептидными цепями (FVIII204/VWF031): первая цепь содержит одноцепочечный белок FVIII, связанный с областью Fc, в котором первая XTEN встроена непосредственно ниже остатка 403, соответствующего последовательности зрелого FVIII, а вторая XTEN встроена непосредственно ниже остатка 745 (В), соответствующего последовательности зрелого FVIII, и вторая цепь содержит VWFфрагмент фактора фон Виллебранда D'D3, связанный с областью Fc.

На фиг. 14Н показана конструкция с двумя полипептидными цепями (FVIII205/VWF031): первая цепь содержит одноцепочечный FVIII, в котором первая XTEN встроена непосредственно ниже остатка 18, соответствующего последовательности зрелого FVIII, а вторая XTEN встроена непосредственно ниже остатка 745 (В), соответствующего последовательности зрелого FVIII, и вторая цепь содержит VWFфрагмент фактора фон Виллебранда D'D3, связанный с областью Fc.

На фиг. 15 представлена FVIII-активность rFVIII-XTEN/VWF и BDD-FVIII у мышей DKO FVIII/VWF. Активность FVIII в образцах плазмы крови анализировали путем хромогенного анализа FVIII, и строили кривую регрессии активности FVIII в плазме крови (ось X) в зависимости от времени (ось Y). Период полувыведения rFVIII-XTEN/VWF (FVIII-205/VWF-031) сравнивали с периодом полувыведения BDD-FVIII и rFVIIIFc.

На фиг. 16 представлена эффективность гетеродимеров FVIII-XTEN-Fc:VWF-Fc у мышей HemA с использованием модели кровотечения при надрезе хвоста. Модель кровотечения при надрезе хвоста у мышей HemA использовали для сравнения эффективности FVIII169/VWF034, FVIII205/VWF031 и BDD-FVIII. Среднюю потерю крови в мл для 200 МЕ/кг FVIII169/VWF034 и FVIII205/VWF031 сравнивали с 200 МЕ/кг BDD-FVIII, 65 МЕ/кг BDD-FVIII, 20 МЕ/кг BDD-FVIII и носителем.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к химерному белку, содержащему (i) фрагмент фактора фон Виллебранда (VWF), содержащий домен D' и домен VWFD3 фактора фон Виллебранда, (ii) последовательность XTEN, и (iii) белок FVIII, при этом VWFфрaгмент фактора фон Виллебранда и последовательность XTEN связаны необязательным линкером, при этом VWFфрaгмент фактора фон Виллебранда или последовательность XTEN связана или ассоциирована с белком FVIII.

Указанный химерный белок может содержать одну полипептидную цепь, содержащую VWFфрагмент фактора фон Виллебранда, последовательность XTEN и белок FVIII, или две полипептидные цепи:

первую цепь, содержащую VWFфрагмент фактора фон Виллебранда; и вторую цепь, содержащую белок FVIII, при этом полипептид XTEN связан либо с VWFфрагментом фактора фон Виллебранда, либо с белком FVIII.

В одном из вариантов реализации химерный белок согласно настоящему изобретению имеет формулу, включающую (a) V-X-FVIII, (b) FVIII-X-V, (с) V-X:FVin, (d) X-V:FVIII, (е) FVIII: V-Х или (f) FVIII: X-V, где V содержит VWFфрагмент фактора фон Виллебранда,

X содержит одну или более последовательностей XTEN, и

FVIII содержит белок FVIII.

Соединительная черточка (-) может представлять собой пептидную связь или линкер, например расщепляемый линкер, тогда как двоеточие (:) представляет собой химическую ассоциацию или физическую ассоциацию между полипептидами, например ковалентную или нековалентную связь.

В другом варианте реализации химерный белок содержит также (iv) константную область иммуноглобулина (Ig) или ее часть (называемая также F1 или первой константной областью Ig или ее частью), связанную с VWFфрαгментом фактора фон Виллебранда, последовательностью XTEN, белком FVIII или их любыми комбинациями. В других вариантах реализации химерный белок также содержит дополнительную константную область Ig или ее часть (называемая также F2 или второй константной областью Ig или ее частью). Первая константная область Ig или ее часть может быть связана с VWFфрагментом фактора фон Виллебранда или последовательностью XTEN, а вторая константная область Ig может быть связана с белком FVIII. Первая константная область Ig, вторая константная область Ig или ее часть или обе могут увеличивать период полувыведения белка FVIII. В некоторых вариантах реализации вторая константная область Ig или ее часть (F2) связана с VWFфрагментом фактора фон Виллебранда линкером,

- 9 042955 например процессируемым линкером. В других вариантах реализации вторая константная область Ig или ее часть (F2) ассоциирована с (первой) константной областью Ig или ее частью (F1). Вторая константная область Ig или ее часть (F2) и первая константная область Ig или ее часть (F1) могут быть одинаковыми или разными. Вторая константная область Ig или ее часть может быть ассоциирована с константной областью Ig или ее частью ковалентной связью, например дисульфидной связью. VWFфрагмент фактора фон Виллебранда, связанный с первой константной областью Ig или ее частью, также может быть ассоциирован с белком FVIII, связанным со второй областью Fc, нековалентной связью. В некоторых вариантах реализации белок FVIII может также содержать одну или более дополнительных последовательностей XTEN, которые связаны с С-концом или N-концом белка FVIII или встроены непосредственно ниже (downstream) одной или более аминокислот в белке FVIII (например, один или более сайтов встраивания XTEN). В некоторых вариантах реализации период полувыведения белка FVIII увеличен по сравнению с белком FVIII дикого типа или белком FVIII, не содержащим VWFфрагмент фактора фон Виллебранда.

В некоторых вариантах реализации химерный белок имеет формулу, включающую (g) V-L2-X-L1-F1:FVIII-L3-F2;

(h) V-L2-X-L1-F1:F2-L3 -FVIII;

(i) F1-L1-X-L2-V:FVIII-L3-F2;

(j) F1-L1-X-L2-V:F2-L3-FVIII;

(k) V-L2-X-L1-F1-L4-FVIII-L3-F2;

(1) F2-L3-FVIII-L4-F1-L1-X-L2-V;

(m) FVIII-L3 -F2-L4-V-L2-X-L1 -F1; или (n) F1-L1-X-L2-V-L4-F2-L3-FVIII, где V содержит VWFфрагмент фактора фон Виллебранда, каждый из L1, L2 и L3 содержит необязательный линкер, например расщепляемый линкер, L4 представляет собой необязательный линкер, например процессируемый линкер, FVIII содержит белок FVIII,

X содержит одну или более последовательностей XTEN,

F1 содержит необязательную первую константную область Ig или ее часть, F2 содержит необязательную вторую константную область Ig или ее часть, и (:) представляет собой ковалентную связь или нековалентную связь.

Настоящее изобретение также относится к химерному белку, содержащему (i) белок FVIII, (ii) последовательность XTEN, и (iii) константную область Ig или ее часть, при этом последовательность XTEN связана с белком FVIII необязательным линкером на N-конце или С-конце белка FVIII или встроена непосредственно ниже одной или более аминокислот в белке FVIII (например, один или более сайтов встраивания), и при этом константная область Ig или ее часть связана или ассоциирована с белком FVIII или последовательностью XTEN.

В одном из вариантов реализации константная область Ig или ее часть, подходящая для химерного белка, содержит первую область Fc. В другом варианте реализации химерный белок также содержит дополнительную константную область Ig или ее часть. Указанная дополнительная константная область Ig или ее часть, подходящая для настоящего изобретения, может содержать вторую область Fc, которая связана или ассоциирована с первой областью Fc, например ковалентной связью. В других вариантах реализации первая область Fc связана со второй областью Fc линкером, например процессируемым линкером.

В соответствии с другими аспектами химерный белок содержит (i) белок FVIII, (ii) последовательность XTEN, (iii) VWFфрагмент фактора фон Виллебранда, и (iv) константную область Ig или ее часть, при этом содержит домен D' и домен VWFD3 фактора фон Виллебранда, при этом последовательность XTEN связана с белком FVIII необязательным линкером на N-конце или С-конце белка FVIII или встроена непосредственно ниже одной или более аминокислот в белке FVIII (например, один или более сайтов встраивания), VWFфрагмент фактора фон Виллебранда связан или ассоциирован с белком FVIII или последовательностью XTEN, и константная область Ig или ее часть связана с белком FVIII, последовательностью XTEN, VWFфрагментом фактора фон Виллебранда или их любыми комбинациями.

- 10 042955

Неограничивающие примеры химерных белков могут иметь формулу, включающую (1) F VIII(X 1 )-L 1 -F1: V-L2-X2-L3 -F2;

(2) FVni(Xl)-Ll-Fl :F2-L3-X2-L2-V;

(3 ) F1 -L1 -F VIII(X 1): V-L2-X2-L3 -F2;

(4) F1 -L1 -F VIII(X 1) :F2-L3 -X2-L2-V;

(5) F ¥П1(Х1 )-L 1 -F1-L4-V-L2-X2-L3 -F2;

(6) F VIII(X 1 )-L 1 -F1-L4-F2-L3 -X2-L2-V;

(7) F1 -L1 -FVIII(X 1 )-L4-V-L2-X2-L3-F2 или (8) F1 -L1 -F VIII(X 1 )-L4-F2-L3 -X2-L2-V, где FVIII(X1) содержит белок FVIII и одну или более последовательностей XTEN, при этом одна или более последовательностей XTEN связаны с N-концом или С-концом белка FVIII или встроены непосредственно ниже одной или более аминокислот в белке FVIII (например, один или более сайтов встраивания), каждый из L1, L2 и L3 содержит необязательный линкер, например расщепляемый линкер,

L4 представляет собой линкер, процессируемый линкер,

Х2 содержит одну или более последовательностей XTEN,

F1 содержит константную область Ig или ее часть,

F2 содержит необязательную дополнительную константную область Ig или ее часть, и

V содержит VWFфрагмент фактора фон Виллебранда, (-) представляет собой пептидную связь или одну или более аминокислот, и (:) содержит ковалентную связь или нековалентную связь.

Один из аспектов настоящего изобретения состоит в том, что VWFфрагмент фактора фон Виллебранда, подходящий для химерного белка, не связывается с рецептором, ответственным за клиренс VWF, который предотвращает или ингибирует взаимодействие белка FVIII с VWFэндогенным фактором фон Виллебранда. Таким образом, химерный белок, содержащий VWFфрагмент фактора фон Виллебранда, имеет пониженный клиренс или не выводится по пути клиренса VWF. Другой аспект настоящего изобретения состоит в том, что VWFфрагмент фактора фон Виллебранда способен защищать белок FVIII от расщепления одной или более протеазами, защищать белок FVIII от активации, стабилизировать тяжелую цепь и/или легкую цепь белка FVIII или предотвращать клиренс белка FVIII с участием одного или более рецепторов мкарофагов.

Благодаря способности VWFфрагмента фактора фон Виллебранда предотвращать или ингибировать взаимодействие между белком FVIII и VWFэндогенным фактором фон Виллебранда, период полувыведения белка FVIII увеличивается по сравнению с белком FVIII, не содержащим VWFфрагмент фактора фон Виллебранда. В одном из вариантов реализации период полувыведения белка FVIII по меньшей мере примерно в 1,5 раза, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 2,5 раза, по меньшей мере примерно в 3 раза, по меньшей мере примерно в 4 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 6 раз, по меньшей мере примерно в 7 раз, по меньшей мере примерно в 8 раз, по меньшей мере примерно в 9 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 11 раз или по меньшей мере примерно в 12 раз больше чем у FVIII дикого типа. В другом варианте реализации период полувыведения белка FVIII составляет по меньшей мере примерно 10 ч, по меньшей мере примерно 11 ч, по меньшей мере примерно 12 ч, по меньшей мере примерно 13 ч, по меньшей мере примерно 14 ч, по меньшей мере примерно 15 ч, по меньшей мере примерно 16 ч, по меньшей мере примерно 17 ч, по меньшей мере примерно 18 ч, по меньшей мере примерно 19 ч, по меньшей мере примерно 20 ч, по меньшей мере примерно 21 ч, по меньшей мере примерно 22 ч, по меньшей мере примерно 23 ч, по меньшей мере примерно 24 ч, по меньшей мере примерно 36 ч, по меньшей мере примерно 48 ч, по меньшей мере примерно 60 ч, по меньшей мере примерно 72 ч, по меньшей мере примерно 84 ч, по меньшей мере примерно 96 ч или по меньшей мере примерно 108 ч.

Константная область Ig или ее часть, подходящая для химерного белка, содержит первую область Fc, которая связана с VWFфрагментом фактора фон Виллебранда необязательным линкером, например расщепляемым линкером. Химерный белок также может содержать дополнительную константную область Ig или ее часть, которая связана с белком FVIII или последовательностью XTEN, константной областью Ig или ее частью, VWFфрагментом фактора фон Виллебранда или их любыми комбинациями необязательным линкером. В одном из вариантов реализации дополнительная константная область Ig или ее часть связана с белком FVIII необязательным линкером. Дополнительная константная область Ig или ее часть может содержать вторую область Fc. Константная область Ig или ее часть, подходящая для настоящего изобретения, и дополнительная константная область Ig или ее часть, подходящая для настоящего изобретения, являются одинаковыми или разными.

В соответствии с некоторыми аспектами белок FVIII связан с последовательностью XTEN на С-конце или N-конце белка FVIII или встроен непосредственно ниже одной или более аминокислот в

- 11 042955 зрелом нативном FVIII человека (например, один или более сайтов встраивания) или их любые комбинации. Один или более сайтов встраивания в белке FVIII могут располагаться в пределах одного или более доменов белка FVIII, выбранных из группы, состоящей из домена А1, кислотной области a1, домена А2, кислотной области а2, домена A3, домена В, домена С1, домена С2 и их любых комбинаций, или между одним или более доменами белка FVIII, выбранными из группы, состоящей из домена А1 и кислотной области a1, кислотной области a1 и домена А2, домена А2 и кислотной области а2, кислотной области а2 и домена В, домена В и домена A3, домена A3 и домена С1, домена С1, домена С2 и их любых комбинаций, или между двумя доменами белка FVIII, выбранными из группы, состоящий из домена А1 и кислотной области a1, кислотной области a1 и домена А2, домена А2 и кислотной области а2, кислотной области а2 и домена В, домена В и домена A3, домена A3 и домена С1, домена С1 и домена С2 и их любых комбинаций.

В одном из вариантов реализации один или более сайтов встраивания расположены непосредственно ниже одной или более аминокислот в зрелом нативном FVIII человека (например, SEQ ID NO: 4 [последовательность зрелого FVIII-полноразмерная]), выбранных из группы, состоящей из аминокислотных остатков из табл. 7, 8, 9, 10, 11 или их любых комбинаций.

В другом варианте реализации один или более сайтов встраивания расположены в одной или более пермиссивных петлях зрелого нативного FVIII человека. В других вариантах реализации один или более сайтов встраивания расположены в области a3 зрелого нативного FVIII человека. Например, последовательность XTEN может быть встроена непосредственно ниже аминокислоты 1656, соответствующей SEQ ID NO: 4 (полноразмерный зрелый FVIII). В других вариантах реализации белок FVIII связан по меньшей мере с двумя последовательностями XTEN: первой последовательностью XTEN, встроенной в пределах области a3, и второй последовательностью XTEN, встроенной в пределах пермиссивной петли в белке FVIII (например, A1-1, A1-2, А2-1, А2-2, А3-1 или A3-2). В других вариантах реализации белок FVIII связан по меньшей мере с тремя последовательностями XTEN: первой последовательностью XTEN, встроенной в пределах области a3, второй последовательностью XTEN и третьей последовательностью XTEN, встроенными в пределах одной или двух пермиссивных петель в белке FVIII (например, A1-1, A1-2, A2-1, А2-2, А3-1 или A3-2).

В некоторых вариантах реализации один или более сайтов встраивания для одного или более XTEN расположены непосредственно ниже одной или более аминокислот (пронумерованы относительно последовательности зрелого FVIII), выбранных из группы, состоящей из (1) аминокислоты 3, (2) аминокислоты 18, (3) аминокислоты 22, (4) аминокислоты 26, (5) аминокислоты 32, (6) аминокислоты 40, (7) аминокислоты 60, (8) аминокислоты 65, (9) аминокислоты 81, (10) аминокислоты 116, (11) аминокислоты 119, (12) аминокислоты 130, (13) аминокислоты 188, (14) аминокислоты 211, (15) аминокислоты 216, (16) аминокислоты 220, (17) аминокислоты 224, (18) аминокислоты 230, (19) аминокислоты 333, (20) аминокислоты 336, (21) аминокислоты 339, (22) аминокислоты 375, (23) аминокислоты 399, (24) аминокислоты 403, (25) аминокислоты 409, (26) аминокислоты 416, (26) аминокислоты 442, (28) аминокислоты 487, (29) аминокислоты 490, (30) аминокислоты 494, (31) аминокислоты 500, (32) аминокислоты 518,

- 12 042955 (33) аминокислоты 599, (34) аминокислоты 603, (35) аминокислоты 713, (36) аминокислоты 745, (37) аминокислоты 1656, (38) аминокислоты 1711, (39) аминокислоты 1720, (40) аминокислоты 1725, (41) аминокислоты 1749, (42) аминокислоты 1796, (43) аминокислоты 1802, (44) аминокислоты 1827, (45) аминокислоты 1861, (46) аминокислоты 1896, (47) аминокислоты 1900, (48) аминокислоты 1904, (49) аминокислоты 1905, (50) аминокислоты 1910, (51) аминокислоты 1937, (52) аминокислоты 2019, (53) аминокислоты 2068, (54) аминокислоты 2111, (55) аминокислоты 2120, (56) аминокислоты 2171, (57) аминокислоты 2188, (58) аминокислоты 2221, (59) аминокислоты 2277, и (60) двух или более комбинаций указанных аминокислот.

В некоторых вариантах реализации одна XTEN встроена в белок FVIII. В некоторых вариантах реализации две XTEN встроены в белок FVIII. В некоторых вариантах реализации 3 XTEN встроены в белок FVIII.

В конкретном примере первая XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 26, соответствующей SEQ ID NO: 4, а вторая XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 1720, соответствующей SEQ ID NO: 4 (полноразмерный зрелый FVIII). В другом примере первая XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 403, соответствующей SEQ ID NO: 4, а вторая XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 1720, соответствующей SEQ ID NO: 4. В некоторых примерах первая XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 1656, соответствующей SEQ ID NO: 4, а вторая XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 1720, соответствующей SEQ ID NO: 4. В других примерах первая XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 26, соответствующей SEQ ID NO: 4, вторая XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 1656, соответствующей SEQ ID NO: 4, и третья XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 1720, соответствующей SEQ ID NO: 4. В других вариантах реализации первая XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 403, соответствующей SEQ ID NO: 4, вторая XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 1656, соответствующей SEQ ID NO: 4, и третья XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 1720, соответствующей SEQ ID NO: 4. В других вариантах реализации первая XTEN встроена между аминокислотами 403 и 404, соответствующими SEQ ID NO: 4, вторая XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 1656, соответствующей SEQ ID NO: 4, и третья XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 1720, соответствующей SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах реализации первая XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 26, соответствующей SEQ ID NO: 4 (полноразмерный зрелый FVIII), вторая XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 1720, соответствующей SEQ ID NO: 4, и третья XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 1900, соответствующей SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах реализации первая XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 26, соответствующей SEQ ID NO: 4, вторая XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 1656, соответствующей SEQ ID NO: 2, третья XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 1720, соответствующей SEQ ID NO: 4, и четвертая XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 1900, соответствующей SEQ ID NO: 4. В другом примере XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 745, соответствующей SEQ ID NO: 4. В дополнительном примере первая XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 1656, соответствующей SEQ ID NO: 4, а вторая XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 1900, соответствующей SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах реализации первая XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 26, соответствующей SEQ ID NO: 4, вторая XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 1656, соответствующей SEQ ID NO: 4, и третья XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 1900, соответствующей SEQ ID NO: 4. В другом примере первая

- 13 042955

XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 403, соответствующей SEQ ID NO: 4, а вторая XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 745, соответствующей SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах реализации первая XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 745, соответствующей SEQ ID NO: 4, а вторая XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 1900, соответствующей SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах реализации первая XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 18, соответствующей SEQ ID NO: 4, а вторая XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 745, соответствующей SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах реализации белок FVIII представляет собой изоформу FVIII с двойной цепью. В некоторых вариантах реализации белок FVIII представляет собой изоформу FVIII с одной цепью.

В некоторых вариантах реализации XTEN, которая встроена, представляет собой SEQ ID NO: 39 (АЕ288). В некоторых примерах XTEN, которые встроены, представляют собой SEQ ID NO: 38 и 37 (AG144 и АЕ144). В некоторых примерах XTEN, которые встроены, представляют собой SEQ ID NO: 37, 38 и 37 (АЕ144, AG144 и АЕ144). В некоторых вариантах реализации XTEN, которые встроены, представляют собой SEQ ID NO: 37 и 40 (АЕ144 и АЕ288). В некоторых вариантах реализации XTEN, которые встроены, представляют собой

АЕ42 (SEQ Ш NO: 36), АЕ72 (SEQ Ш NO: 127), АЕ144 2А (SEQ Ш

NO: 128), АЕ144 3В (SEQ Ш NO: 129), АЕ144 4А (SEQ Ш NO: 130), АЕ144_5А (SEQ Ш

NO: 131), АЕ144 6В (SEQ Ш NO: 132), AG144 A (SEQ ГО NO: 133), AG144 B (SEQ ГО NO: 134), AG144 C (SEQ ГО NO: 135), AG144 F (SEQ ГО NO: 136), АЕ864 (SEQ ГО NO: 43), АЕ576 (SEQ ГО NO: 41), АЕ288 (SEQ ГО NO: 39), АЕ288 2 (SEQ ГО NO: 137), АЕ144 (SEQ ID NO: 37), AG864 (SEQ ГО NO: 44), AG576 (SEQ ГО NO: 42), AG288 (SEQ ГО NO: 40), AG144 (SEQIDNO: 38) и их любые комбинации.

Белок FVIII, подходящий для настоящего изобретения, может содержать домен В или его часть, например FVIII с делецией домена SQ В. В одном из вариантов реализации белок FVIII содержит одноцепочечный FVIII. В другом варианте реализации одноцепочечный FVIII содержит по меньшей мере одну замену аминокислоты в остатке, соответствующем остатку 1648, остатку 1645 или обоим в полноразмерном зрелом полипептиде FVIII (SEQ ID NO: 4) или остатку 754, остатку 751 или обоим в SQ BDD факторе VIII (SEQ ID NO: 6). В других вариантах реализации заменяющей аминокислотой является аминокислота, отличная от аргинина. В некоторых вариантах реализации белок FVIII содержит тяжелую цепь FVIII и легкую цепь FVIII, при этом указанная тяжелая цепь и легкая цепь ассоциированы друг с другом металлической связью.

Белок FVIII может обладать низкой аффинностью или не связывается с родственным рецептором липопротеинов низкой плотности белком (LRP), например, за счет содержания по меньшей мере одной замены аминокислоты, которая уменьшает аффинность или устраняет связывание с LRP. Такая по меньшей мере одна замена аминокислоты может быть локализована в остатке, соответствующем остатку 471, остатку 484, остатку 487, остатку 490, остатку 497, остатку 2092, остатку 2093 или двум или более комбинациям указанных остатков в полноразмерном зрелом FVIII. В конкретном варианте реализации заменяющей аминокислотой в остатке 471, 484 или 497 является аминокислота, отличная от аргинина, заменяющей аминокислотой в остатке 487 является аминокислота, отличная от тирозина, заменяющей аминокислотой в остатке 2092 является аминокислота, отличная от лизина, или заменяющей аминокислотой в остатке 2093 является аминокислота, отличная от фенилаланина.

В некоторых вариантах реализации белок FVIII содержит по меньшей мере одну замену аминокислоты, которая индуцирует увеличенную стабильность белка FVIII по сравнению с белком FVIII, не содержащим указанную замену. Такие замены могут располагаться в домене А2 и домене A3 белка FVIII, например, в остатке, соответствующем остатку 664, остатку 1826, остатку 662, остатку 1828 или двум или более комбинациям указанных остатков в полноразмерном зрелом FVIII.

VWFфрагмент фактора фон Виллебранда, подходящий для настоящего изобретения, содержит домен D' и домен D3, которые вместе способны связываться с FVIII. VWFфрагмент фактора фон Виллебранда может содержать аминокислотную последовательность домена D', которая является по меньшей мере на 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичной аминокислотам с 764 по 866 последовательности SEQ ID NO: 2, и/или аминокислотную последовательность домена D3, которая является по меньшей мере на 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичной аминокислотам с 867 по 1240 последовательности SEQ ID NO: 2. В одном из вариантов реализации VWFфрагмент фактора фон Виллебранда представляет собой мономер. В другом варианте реализации VWFфрагмент фактора фон Виллебранда содержит по меньшей мере два VWFфрагмента фактора фон Виллебранда, по меньшей мере три VWFфрагмента фактора фон Виллебранда, по меньшей мере четыре VWFфрагмента фактора фон Виллебранда, по меньшей мере пять VWFфрагментов фактора фон Виллебранда или по меньшей мере шесть VWFфрагментов фактора фон Виллебранда. В одном из вариантов реализации два или более VWFфрагментов фактора фон Виллебранда могут быть одинаковыми или они могут быть разными. VWFФрагмент фактора фон Вил

- 14 042955 лебранда может содержать аминокислоту, по меньшей мере на 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичную аминокислотам с 764 по 1240 последовательности SEQ ID NO: 2. VWFфрагмент фактора фон Виллебранда может по существу состоять из или состоять из аминокислот с 764 по 1240 последовательности SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах реализации VWFфрагмент фактора фон Виллебранда может содержать по меньшей мере одну замену аминокислоты в остатке, соответствующем остатку 1099, остатку 1142 или как остатку 1099, так и остатку 1142 последовательности SEQ ID NO: 2. В других вариантах реализации VWFфрагмент фактора фон Виллебранда содержит также домен D1, домен D2 или домены D1 и D2 VWF. VWFфрагмент фактора фон Виллебранда может дополнительно содержать домен VWF, выбранный из группы, состоящей из домена А1, домена А2, домена A3, домена D4, домена В1, домена В2, домена B3, домена С1, домена С2, домена CK, их одного или более фрагментов и их любых комбинаций. Например, VWFфрагмент фактора фон Виллебранда может по существу состоять из или состоять из (1) доменов D' и VWFD3 фактора фон Виллебранда или их фрагментов, (2) доменов D1, D' и VWFD3 фактора фон Виллебранда или их фрагментов, (3) доменов D2, D' и VWFD3 фактора фон Виллебранда или их фрагментов, (4) доменов D1, D2, D' и VWFD3 фактора фон Виллебранда или их фрагментов, или (5) доменов D1, D2, D', D3 и VWFA1 фактора фон Виллебранда или их фрагментов.

В некоторых вариантах реализации VWFфрагмент фактора фон Виллебранда содержит также сигнальный пептид VWF или FVIII, функционально связанный с VWFфрагментом фактора фон Виллебранда.

Один или более линкеров, подходящих для настоящего изобретения, имеют длину, составляющую по меньшей мере примерно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800 или 2000 аминокислот. В некоторых вариантах реализации один или более линкеров имеют длину, составляющую от примерно 1 до примерно 2000 аминокислот. В одном из вариантов реализации один или более линкеров имеют длину, составляющую по меньшей мере примерно 20, 35, 42, 48, 73, 75, 95, 98, 144, 288, 324, 333, 576 или 864 аминокислоты. В другом варианте реализации один или более линкеров содержат пептид gly/ser, последовательность XTEN или и то и другое. Примеры пептида gly/ser включают, но не ограничиваются перечисленными, формулу (Gly₄Ser)n (SEQ ID NO: 139) или S(Gly₄Ser)_n (SEQ ID NO: 140), где n представляет собой положительное целое число, выбранное из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10. Например, линкер (Gly₄Ser)_n может представлять собой (Gly₄Ser)₃ (SEQ ID NO: 63) или (Gly₄Ser)₄ (SEQ ID NO: 138). В одном из вариантов реализации линкер содержит по меньшей мере один первый сайт расщепления на N-конце линкера, по меньшей мере один второй сайт расщепления на С-конце линкера или оба сайта расщепления. В другом варианте реализации линкер включает расщепляемый тромбином линкер из 20 аминокислот, 35 аминокислот, 48 аминокислот, 73 аминокислот или 95 аминокислот. Расщепляемые линкеры могут содержать один или более сайтов расщепления протеазой, выбранной из группы, состоящей из фактора XIa, фактора XIIa, калликреина, фактора VIIa, фактора IXa, фактора Ха, фактора IIa (тромбина), эластазы-2, гранзима-В, TEV, энтерокиназы, протеазы 3C, сортазы А, ММР-12, ММР-13, ММР-17 и ММР-20, например,

TLDPRSFLLRNPNDKYEPFWEDEEK (SEQ ID NO: 8).

Неограничивающие примеры одного или более сайтов расщепления включают аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из

RRRR (SEQ Ш NO: 9), RKRRKR (SEQ Ш NO: 10),

RRRRS (SEQ Ш NO: 11), TQSFNDFTR (SEQ Ш NO: 12), SVSQTSKLTR (SEQ Ш NO: 13), DFLAEGGGVR (SEQ Ш NO: 14), TTKIKPR (SEQ Ш NO: 15), LVPRG (SEQ Ш NO: 16), ALRPR (SEQ Ш NO: 17), KLTRAET (SEQ ID NO: 18), DFTRVVG (SEQ Ш NO: 19), TMTRIVGG (SEQ ID NO: 20), SPFRSTGG (SEQ ID NO: 21), LQVRIVGG (SEQ ID NO: 22), PLGRIVGG (SEQ ID NO:23), IEGRTVGG (SEQ ID NO: 24), LTPRSLLV (SEQ ID NO: 25), LGPVSGVP (SEQ ID NO: 26), VAGDSLEE (SEQ ID NO: 27), GPAGLGGA (SEQ ID NO: 28), GPAGLRGA (SEQ ID NO: 29), APLGLRLR (SEQ ID NO: 30), PALPLVAQ (SEQ ID NO: 31), ENLYFQG (SEQ ID NO: 32), DDDKIVGG (SEQ ID NO: 33), LEVLFQGP (SEQ ID NO: 34) и

LPKTGSES (SEQ ID NO: 35).

В некоторых вариантах реализации первый сайт расщепления и второй сайт расщепления являются одинаковыми или разными.

- 15 042955

Последовательность XTEN, подходящая для настоящего изобретения, может быть выбрана из группы, состоящей из

АЕ42 (SEQ Ш NO: 36), АЕ144 (SEQ Ш NO: 37), AG144 (SEQ Ш NO: 38), АЕ288 (SEQ Ш NO: 39), AG288 (SEQ Ш NO: 40), АЕ576 (SEQ Ш NO: 41).

AG576 (SEQ Ш NO: 42), АЕ864 (SEQ Ш NO: 43), АЕ72 (SEQ Ш NO: 127), АЕ144 2А (SEQ

ГО NO: 128), АЕ144_ЗВ (SEQ ГО NO: 129), АЕ144_4А (SEQ ГО NO: 130), АЕ144_5А (SEQ

ГО NO: 131), АЕ144 6В (SEQ ГО NO: 132), AG144 A (SEQ ГО NO: 133), AG144 B (SEQ ГО

NO: 134), AG144 C (SEQ ГО NO: 135), AG144 F (SEQ ГО NO: 136), АЕ288 2 (SEQ ГО NO: 137) или AG864 (SEQ ID NO: 44).

В конкретном варианте реализации последовательность XTEN включает АЕ288 или AG288.

Химерный белок согласно настоящему изобретению может быть полисиалилирован, пегилирован или модифицирован гидроксиэтилкрахмалом. Настоящее изобретение также относится к полинуклеотиду или группе полинуклеотидов, кодирующих химерный белок. Полинуклеотид может также включать полинуклеотидную цепь, кодирующую РС5 или РС7. Настоящее изобретение также относится к вектору, содержащему полинуклеотид или группу полинуклеотидов и один или более промоторов, функционально связанных с указанным полинуклеотидом или группой полинуклеотидов. Вектор может также включать дополнительный вектор, который содержит полинуклеотидную цепь, кодирующую РС5 или РС7. Настоящее изобретение также относится к клетке-хозяину, содержащей указанный полинуклеотид или вектор. Указанная клетка-хозяин может представлять собой клетку млекопитающего, например клетку HEK293, клетку СНО или клетку ВНК. В некоторых вариантах реализации РС5 или РС7 клетки-хозяина расщепляет домены D1D2 VWF.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей химерный белок, полинуклеотид, вектор или клетку-хозяина и фармацевтически приемлемый носитель. Таким образом, композиция согласно настоящему изобретению имеет увеличенный период полувыведения по сравнению с белком FVIII дикого типа. Период полувыведения белка FVIII по меньшей мере примерно в 1,5 раза, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 2,5 раза, по меньшей мере примерно в 3 раза, по меньшей мере примерно в 4 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 6 раз, по меньшей мере примерно в 7 раз, по меньшей мере примерно в 8 раз, по меньшей мере примерно в 9 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 11 раз или по меньшей мере примерно в 12 раз больше, чем у FVIII дикого типа. Период полувыведения фактора VIII составляет по меньшей мере примерно 17 ч, по меньшей мере примерно 18 ч, по меньшей мере примерно 19 ч, по меньшей мере примерно 20 ч, по меньшей мере примерно 21 ч, по меньшей мере примерно 22 ч, по меньшей мере примерно 23 ч, по меньшей мере примерно 24 ч, по меньшей мере примерно 25 ч, по меньшей мере примерно 26 ч, по меньшей мере примерно 27 ч, по меньшей мере примерно 28 ч, по меньшей мере примерно 29 ч, по меньшей мере примерно 30 ч, по меньшей мере примерно 31 ч, по меньшей мере примерно 32 ч, по меньшей мере примерно 33 ч, по меньшей мере примерно 34 ч, по меньшей мере примерно 35 ч, по меньшей мере примерно 36 ч, по меньшей мере примерно 48 ч, по меньшей мере примерно 60 ч, по меньшей мере примерно 72 ч, по меньшей мере примерно 84 ч, по меньшей мере примерно 96 ч или по меньшей мере примерно 108 ч.

Композиция согласно настоящему изобретению может быть введена путем, выбранным из группы, состоящей из топического введения, внутриглазного введения, парентерального введения, интратекального введения, субдурального введения и перорального введения. В одном из вариантов реализации композицию вводят путем парентерального введения, например внутривенного или подкожного введения. Композиция согласно настоящему изобретению подходит для лечения заболевания или состояния, связанного с кровотечениями, у нуждающегося в этом субъекта. Указанное заболевание или состояние, связанное с кровотечениями, выбрано из группы, состоящей из нарушения свертываемости крови, сопровождающегося повышенной кровоточивостью, гемартроза, мышечного кровотечения, кровотечения в ротовой полости, кровоизлияния, кровоизлияния в мышцы, кровоизлияния в ротовой полости, травмы, травмы головы, желудочно-кишечного кровотечения, внутричерепного кровоизлияния, внутрибрюшинного кровоизлияния, внутригрудного кровоизлияния, перелома костей, кровотечения в центральной нервной системе, кровотечения в заглоточном пространстве, кровотечения в забрюшинном пространстве, кровотечения во влагалище подвздошно-поясничной мышцы и их любых комбинаций. В одном из вариантов реализации субъекту, которого лечат химерным белком, назначено оперативное вмешательство. В другом варианте реализации лечение является профилактическим или по необходимости. Настоящее изобретение также относится к способу предотвращения или ингибирования связывания белка FVIII с VWFэндогенным фактором фон Виллебранда, включающему введение эффективного количества химерного белка, полинуклеотидного вектора, клетки-хозяина или композиции нуждающемуся в этом субъекту, при этом VWFфрагмент фактора фон Виллебранда связывается с белком FVIII и таким образом предотвращает или ингибирует связывание VWFэндогенного фактора фон Виллебранда. Настоящее изобретение также относится к способу продления или увеличения периода полувыведения белка FVIII, при

- 16 042955 этом указанный способ включает введение эффективного количества химерного белка, полинуклеотида, вектора, клетки-хозяина или композиции нуждающемуся в этом субъекту, при этом VWFфрагмент фактора фон Виллебранда связывается с белком FVIII и таким образом продлевает или увеличивает период полувыведения белка FVIII. Также предложен способ предотвращения или ингибирования клиренса белка FVIII из клетки, при этом указанный способ включает введение эффективного количества химерного белка, полинуклеотида, вектора, клетки-хозяина или композиции в клетку, содержащую белок FVIII или полинуклеотид, кодирующий белок FVIII, при этом белок, обладающий VWFактивностью фактора фон Виллебранда, связывается с белком FVIII. Субъект, подходящий для настоящих способов, представляет собой животное, например человека, например пациента, страдающего гемофилией А. Согласно настоящему изобретению также предложен способ лечения заболевания или нарушения, сопровождающегося повышенной кровоточивостью, у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение эффективного количества химерного белка, полинуклеотида, вектора, клетки-хозяина или композиции, при этом указанное заболевание или нарушение, сопровождающееся повышенной кровоточивостью, выбрано из группы, состоящей из нарушения свертываемости крови, сопровождающегося повышенной кровоточивостью, гемартроза, мышечного кровотечения, кровотечения в ротовой полости, кровоизлияния, кровоизлияния в мышцы, кровоизлияния в ротовой полости, травмы, травмы головы, желудочно-кишечного кровотечения, внутричерепного кровоизлияния, внутрибрюшинного кровоизлияния, внутригрудного кровоизлияния, перелома костей, кровотечения в центральной нервной системе, кровотечения в заглоточном пространстве, кровотечения в забрюшинном пространстве и кровотечения во влагалище подвздошно-поясничной мышцы. Лечение может быть профилактическим или по необходимости. В одном из вариантов реализации эффективное количество составляет от 0,1 до 500 мг/кг.

Настоящее изобретение также включает способ получения химерного белка, включающий трансфекцию одной или более клеток-хозяев полинуклеотидом или вектором, и экспрессию химерного белка в клетке-хозяине.

Определения.

Следует отметить, что термин, называющий объект в единственном числе, относится к одному или более из таких объектов; например, понятно, что нуклеотидная последовательность представляет собой одну или более нуклеотидных последовательностей. Таким образом, термины в единственном числе, один или более и по меньшей мере один могут являться взаимозаменяемыми в настоящем описании. Термин полинуклеотид или нуклеотид включает единичную нуклеиновую кислоту, а также множество нуклеиновых кислот, и относится к выделенной молекуле или конструкции нуклеиновой кислоты, например матричной РНК (мРНК) или плазмидной ДНК (пДНК). В некоторых вариантах реализации полинуклеотид содержит традиционную фосфодиэфирную связь или нетрадиционную связь (например, амидную связь, такую как встречающаяся в пептидных нуклеиновых кислотах (ПНК)). Термин нуклеиновая кислота относится к любому одному или более сегментам нуклеиновой кислоты, например фрагментам ДНК или РНК, присутствующим в полинуклеотиде. Термин выделенная нуклеиновая кислота или полинуклеотид означает молекулу нуклеиновой кислоты, ДНК или РНК, которую извлекли из природной окружающей среды. Например, рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий полипептид фактор VIII, содержащийся в векторе, считается выделенным для целей настоящего изобретения. Другие примеры выделенного полинуклеотида включают рекомбинантные полинуклеотиды, содержащиеся в гетерологичных клетках-хозяевах или очищенные (частично или по существу) от других полинуклеотидов в растворе. Выделенные молекулы РНК включают РНК-транскрипты in vivo или in vitro полинуклеотидов согласно настоящему изобретению. Выделенные полинуклеотиды или нуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению также включают такие молекулы, полученные путем синтеза. Кроме того, полинуклеотид или нуклеиновая кислота может включать регуляторные элементы, такие как промоторы, энхансеры, сайты связывания рибосом или сигналы терминации транскрипции. В настоящем описании кодирующая область или кодирующая последовательность представляет собой часть полинуклеотида, состоящую из кодонов, транслируемых в аминокислоты. Хотя стоп-кодон (TAG, TGA или ТАА), как правило, не транслируется в аминокислоту, его можно считать частью кодирующей области, но любые фланкирующие последовательности, например промоторы, сайты связывания рибосом, терминаторы транскрипции, интроны и т.п., не являются частью кодирующей области. Границы кодирующей области, как правило, определяются стартовым кодоном на 5'-конце, кодирующим аминоконец получаемого полипептида, и терминирующим трансляцию кодоном на 3'-конце, кодирующим карбоксильный конец получаемого полипептида. Две или более кодирующих областей согласно настоящему изобретению могут присутствовать в одной полинуклеотидной конструкции, например в одном векторе, или в отдельных полинуклеотидных конструкциях, например в отдельных (разных) векторах. Из этого следует, что один вектор может содержать только одну кодирующую область или содержать две или более кодирующих областей, например один вектор может отдельно кодировать связывающий домен-А и связывающий домен-В, как описано ниже. Кроме того, вектор, полинуклеотид или нуклеиновая кислота согласно настоящему изобретению может кодировать гетерологичные кодирующие области, либо слитые, либо не слитые с нуклеиновой кислотой, кодирующей связывающий домен согласно настоящему изобретению. Гетерологичные кодирующие области включают без ограничения специальные элементы или

- 17 042955 мотивы, такие как секреторный сигнальный пептид или гетерологичный функциональный домен.

Некоторые белки, секретируемые клетками млекопитающих, ассоциированы с секреторным сигнальным пептидом, который отщепляется от зрелого белка сразу после начала экспорта растущей цепи белка через шероховатый эндоплазматический ретикулум. Специалисту в данной области техники известно, что сигнальные пептиды, как правило, слиты с N-концом полипептида и отщепляются от полного или полноразмерного полипептида с образованием секретируемой или зрелой формы полипептида. В некоторых вариантах реализации нативный сигнальный пептид или функциональное производное данной последовательности, сохраняющее способность направлять секрецию полипептида, который с ним функционально ассоциирован. В качестве альтернативы может быть использован гетерологичный сигнальный пептид млекопитающего, например тканевой активатор плазминогена человека (ТРА) или сигнальный пептид β-глюкуронидазы мыши, или его функциональное производное. Термин расположенный ниже (downstream) относится к нуклеотидной последовательности, расположенной в направлении 3' относительно эталонной нуклеотидной последовательности. В некоторых вариантах реализации расположенные ниже нуклеотидные последовательности относятся к последовательностям, которые следуют за точкой начала транскрипции. Например, инициирующий трансляцию кодон гена расположен ниже сайта инициации транскрипции.

Термин расположенный выше (upstream) относится к нуклеотидной последовательности, расположенной в направлении 5' относительно эталонной нуклеотидной последовательности. В некоторых вариантах реализации расположенные выше нуклеотидные последовательности относятся к последовательностям, которые расположены с 5'-стороны кодирующей области или точки начала транскрипции. Например, большинство промоторов расположены выше сайта инициации транскрипции. В настоящем описании термин регуляторная область относится к нуклеотидным последовательностям, расположенным выше (5-'некодирующие последовательности), в пределах или ниже (3'-некодирующие последовательности) кодирующей области, и влияющим на транскрипцию, процессинг РНК, стабильность или трансляцию соответствующей кодирующей области. Регуляторные области могут включать промоторы, лидерные последовательности трансляции, интроны, последовательности распознавания полиаденилирования, сайты процессинга РНК, сайты связывания эффектора и структуры типа стебель-петля. Если кодирующая область предназначена для экспрессии в эукариотической клетке, сигнал полиаденилирования и терминирующая транскрипцию последовательность обычно будут расположены в направлении 3' относительно кодирующей последовательности.

Полинуклеотид, кодирующий генный продукт, например полипептид, может содержать промотор и/или другие контролирующие транскрипцию или трансляцию элементы, функционально ассоциированные с одной или более кодирующими областями. В случае функциональной ассоциации кодирующая область для генного продукта, например полипептида, ассоциирована с одной или более регуляторными областями таким образом, чтобы экспрессия генного продукта находилась под влиянием или контролем регуляторной области (областей). Например, кодирующая область и промотор являются функционально ассоциированными, если индукция функции промотора приводит к транскрипции мРНК, кодирующей генный продукт, кодируемый кодирующей областью, и если природа связи между промотором и кодирующей областью не нарушает способность промотора направлять экспрессию генного продукта или не препятствует возможности транскрибирования ДНК-матрицы. Другие контролирующие транскрипцию элементы помимо промотора, например энхансеры, операторы, репрессоры и сигналы терминации транскрипции, также могут быть функционально ассоциированы с кодирующей областью для направления экспрессии генного продукта.

Специалисту в данной области техники известны различные контролирующие транскрипцию области. Данные области включают без ограничения контролирующие транскрипцию области, которые функционируют в клетках позвоночных, такие как, но не ограничивающиеся ими, промоторные и энхансерные сегменты цитомегаловирусов (немедленно-ранний промотор в сочетании с интроном-А), вакуолизирующего обезьяньего вируса 40 (ранний промотор) и ретровирусов (таких как вирус саркомы Рауса). Другие контролирующие транскрипцию области включают области, полученные из генов позвоночных, такие как актин, белок теплового шока, бычий гормон роста и β-глобин кролика, а также другие последовательности, способные контролировать экспрессию генов в эукариотических клетках. Дополнительные подходящие контролирующие транскрипцию области включают тканеспецифические промоторы и энхансеры, а также лимфокин-индуцируемые промоторы (например, промоторы, индуцируемые интерферонами или интерлейкинами).

Подобным образом, различные контролирующие транскрипцию элементы известны специалисту в данной области техники. Данные области включают, но не ограничиваются перечисленными, сайты связывания рибосом, инициирующие и терминирующие трансляцию кодоны, и элементы, полученные из пикорнавирусов (в частности, участок внутренней посадки рибосомы или IRES, также называемый последовательностью CITE).

В настоящем описании термин экспрессия относится к процессу, в результате которого полинуклеотид продуцирует генный продукт, например РНК или полипептид. Он включает без ограничения

- 18 042955 транскрипцию полинуклеотида в матричную РНК (мРНК), транспортную РНК (тРНК), малую шпилечную РНК (shPHK), малую интерферирующую РНК (siPHK) или любой другой продукт РНК, и трансляцию мРНК в полипептид. В результате экспрессии образуется генный продукт. В настоящем описании генный продукт может представлять собой либо нуклеиновую кислоту, например матричную РНК, полученную путем транскрипции гена, либо полипептид, транслированный с транскрипта. Генные продукты, описанные в настоящем документе, также включают нуклеиновые кислоты с посттранскрипционными модификациями, например полиаденилированием или сплайсингом, или полипептиды с посттрансляционными модификациями, например метилированием, гликозилированием, присоединением липидов, ассоциацией с другими белковыми субъединицами или протеолитическим расщеплением.

Термин вектор относится к любому носителю для клонирования и/или переноса нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина. Вектор может представлять собой репликон, к которому может быть присоединен другой сегмент нуклеиновой кислоты для осуществления репликации данного присоединенного сегмента. Термин репликон относится к любому генетическому элементу (например, плазмида, фаг, космида, хромосома, вирус), функционирующему как автономная единица репликации in vivo, т.е. способная к репликации под собственным контролем. Термин вектор включает как вирусные, так и невирусные носители для введения нуклеиновой кислоты в клетку in vitro, ex vivo или in vivo. В данной области техники известно и используется большое количество векторов, включая, например, плазмиды, модифицированные эукариотические вирусы или модифицированные бактериальные вирусы. Встраивание полинуклеотида в подходящий вектор можно осуществлять посредством лигирования соответствующих фрагментов полинуклеотида в выбранный вектор, который имеет комплементарные липкие концы. Векторы могут быть созданы таким образом, чтобы кодировать селектируемые маркеры или генырепортеры, которые обеспечивают отбор или идентификацию клеток, которые включили в себя вектор. Экспрессия селектируемых маркеров или генов-репортеров позволяет идентифицировать и/или отбирать клетки-хозяева, которые включают в себя и экспрессируют другие кодирующие области, содержащиеся в векторе. Примеры селектируемых маркерных генов, известных и используемых в данной области техники, включают гены, обеспечивающие резистентность к ампициллину, стрептомицину, гентамицину, канамицину, гигромицину, гербициду биалафос, сульфонамиду и т.п.; и гены, используемые в качестве фенотипических маркеров, т.е. регуляторные гены антоциана, ген изопентанилтрансферазы и т.п.

Примеры генов-репортеров, известных и используемых в данной области техники, включают люциферазу (Luc), зеленый флуоресцентный белок (GFP), хлорамфеникол-ацетилтрансферазу (CAT), галактозидазу (LacZ), глюкуронидазу (Gus) и т.п. Селектируемые маркеры также можно рассматривать в качестве генов-репортеров.

Термин плазмида относится к экстрахромосомному элементу, часто несущему ген, который не является частью центрального метаболизма клетки и обычно находится в форме кольцевых двухцепочечных молекул ДНК. Такие элементы могут представлять собой автономно реплицирующиеся последовательности, интегрирующиеся в геном последовательности, фаговые или нуклеотидные последовательности, линейные, кольцевые или сверхспиральные, состоящие из одно- или двухцепочечной ДНК или РНК, полученные из любого источника последовательности, в которых ряд нуклеотидных последовательностей был соединен или объединен рекомбинантным путем в уникальную конструкцию, способную вводить в клетку фрагмент промотора и последовательность ДНК для определенного генного продукта наряду с соответствующей 3'-нетранслируемой последовательностью.

Эукариотические вирусные векторы, которые могут быть использованы, включают, но не ограничиваются перечисленными, аденовирусные векторы, ретровирусные векторы, аденоассоциированные вирусные векторы и поксвирусные векторы, например векторы на основе вируса осповакцины, бакуловирусные векторы или векторы на основе вируса герпеса. Невирусные векторы включают плазмиды, липосомы, электрически заряженные липиды (цитофектины), комплексы ДНК-белок и биополимеры. Термин клонирующий вектор относится к репликону, который является единицей длины нуклеиновой кислоты, которая последовательно реплицируется и который содержит точку инициации репликации, такому как плазмида, фаг или космида, к которой может быть присоединен другой сегмент нуклеиновой кислоты для осуществления репликации присоединенного сегмента. Некоторые клонирующие векторы способны к репликации в одном типе клеток, например бактериях, и экспрессии в другом, например эукариотических клетках. Клонирующие векторы, как правило, содержат одну или более последовательностей, которые могут быть использованы для отбора клеток, содержащих указанный вектор, и/или один или более многочисленных сайтов клонирования для встраивания представляющих интерес последовательностей нуклеиновых кислот. Термин вектор экспрессии относится к носителю, предназначенному для обеспечения экспрессии встроенной последовательности нуклеиновой кислоты после введения в клетку-хозяина. Встраиваемую последовательность нуклеиновой кислоты размещают таким образом, чтобы она была функционально ассоциирована с регуляторными областями, описанными выше.

Векторы вводят в клетки-хозяева способами, хорошо известными в данной области техники, например, путем трансфекции, электропорации, микроинъекции, трансдукции, слияния клеток, использо- 19 042955 вания диэтиламиноэтилдекстрана, осаждения фосфатом кальция, липофекции (слияние с лизосомами), использования генной пушки или транспортера ДНК-вектора.

В настоящем описании термин культура, культивировать и культивирование означает инкубацию клеток в условиях in vitro, которые обеспечивают рост, или деление клеток, или поддержание клеток в живом состоянии. В настоящем описании термин культивируемые клетки означает клетки, размножаемые in vitro. В настоящем описании термин полипептид включает единичный полипептид, а также множество полипептидов и относится к молекуле, состоящей из мономеров (аминокислот), линейно связанных амидными связями (также известными как пептидные связи). Термин полипептид относится к любой цепи или цепям из двух или более аминокислот и не относится к конкретной длине продукта. Таким образом, пептиды, дипептиды, трипептиды, олигопептиды, белок, цепь аминокислот или любой другой термин, употребляемый для обозначения цепи или цепей из двух или более аминокислот, включены в определение полипептида, и термин полипептид может употребляться вместо любого из данных терминов или взаимозаменяемо. Термин полипептид также относится к продуктам постэкспрессионных модификаций полипептида, включая без ограничения гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование, амидирование, дериватизацию известными защитными/блокирующими группами, протеолитическое расщепление или модификацию не встречающимися в природе аминокислотами. Полипептид может быть получен из природного биологического источника или получен с помощью рекомбинантной технологии, но не обязательно транслируется с указанной последовательности нуклеиновой кислоты. Он может быть получен любым способом, в том числе путем химического синтеза.

Термин выделенный полипептид или его фрагмент, вариант или производное относится к полипептиду, который не находится в естественной среде. Не требуется конкретного уровня очистки. Например, выделенный полипептид может быть просто извлечен из природной или естественной среды. Полученные рекомбинантным способом полипептиды и белки, экспрессированные в клетках-хозяевах, считаются выделенными для цели настоящего изобретения, так же как и нативные или рекомбинантные полипептиды, которые были отделены, фракционированы или частично или по существу очищены любым подходящим способом.

В настоящее изобретение также включены фрагменты или варианты полипептидов и их любая комбинация. Термин фрагмент или вариант, относящийся к полипептидным связывающим доменам или связывающим молекулам согласно настоящему изобретению, включает любые полипептиды, которые сохраняют по меньшей мере некоторые свойства (например, аффинность связывания FcRn для FcRnсвязывающего домена или варианта Fc, коагулирующая активность для варианта FVIII или активность связывания FVIII для VWFфрагмента фактора фон Виллебранда) исходного полипептида. Фрагменты полипептидов включают протеолитические фрагменты, а также фрагменты с делецией в дополнение к конкретным фрагментам антител, рассмотренным в иных местах настоящего документа, но не включают встречающийся в природе полноразмерный полипептид (или зрелый полипептид). Варианты полипептидных связывающих доменов или связывающих молекул согласно настоящему изобретению включают фрагменты, описанные выше, а также полипептиды с измененными аминокислотными последовательностями в результате замен, делеций или встраиваний аминокислот. Варианты могут быть встречающимися в природе или не встречающимися в природе. Не встречающиеся в природе варианты могут быть получены с использованием известных в данной области техники методов мутагенеза. Вариантные полипептиды могут содержать консервативные или неконсервативные замены, делеций или присоединения аминокислот. В настоящем описании термин VWFфрагмент фактора фон Виллебранда или фрагменты VWF означает любые фрагменты VWF, которые взаимодействуют с FVIII и сохраняют по меньшей мере одно или более свойств, обычно обеспечиваемых полноразмерным VWF в отношении FVIII, например предотвращение преждевременной активации с образованием FVIIIa, предотвращение преждевременного протеолиза, предотвращение ассоциации с фосфолипидными мембранами, которое может привести к преждевременному клиренсу, предотвращение связывания с рецепторами, ответственными за клиренс FVIII, которые могут связывать оголенный FVIII, но не FVIII, связанный с VWF, и/или стабилизация взаимодействий тяжелой цепи и легкой цепи FVIII. Консервативная замена аминокислоты представляет собой замену, при которой аминокислотный остаток заменяют аминокислотным остатком, имеющим схожую боковую цепь. В данной области техники были определены семейства аминокислотных остатков, имеющих схожие боковые цепи, включая основные боковые цепи (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотные боковые цепи (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженные полярные боковые цепи (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярные боковые цепи (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленные боковые цепи (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматические боковые цепи (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, если аминокислоту в полипептиде заменяют другой аминокислотой из того же семейства боковых цепей, данная замена считается консервативной. В другом варианте реализации ряд аминокислот может быть консервативно заменен структурно схожим рядом, отличающимся порядком и/или составом членов семейства боковых цепей. Как известно в данной области техники, идентичность последовательностей между двумя полипептидами определяют путем сравнения аминокислотной последовательности одного полипептида с последо- 20 042955 вательностью второго полипептида. При рассмотрении в настоящем описании, то, является ли какой-либо конкретный полипептид по меньшей мере примерно на 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 или 100% идентичным другому полипептиду может быть определено с использованием методов и компьютерных программ/программного обеспечения, известных в данной области техники, таких как, но не ограниченных ими, программа BESTFIT (Висконсинский пакет программ для анализа последовательностей (Wisconsin Sequence Analysis Package), версия 8 для Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI53711). В BESTFIT используется алгоритм локальной гомологии Смита (Smith) и Уотермана (Waterman), Advances in Applied Mathematics, 2:482-489 (1981), для обнаружения сегмента наибольшей гомологии двух последовательностей. При использовании BESTFIT или любой другой программы для выравнивания последовательностей для определения того, является ли конкретная последовательность, например на 95% идентичной эталонной последовательности согласно настоящему изобретению, параметры устанавливают, конечно, так, чтобы процент идентичности рассчитывался по всей длине эталонной полипептидной последовательности, и чтобы допускались пробелы (гэпы) в гомологии до 5% от общего количества аминокислот в эталонной последовательности.

В настоящем описании аминокислоту, соответствующую или эквивалентную аминокислоту в последовательности VWF или последовательности белка FVIII идентифицируют путем выравнивания для максимального увеличения идентичности или сходства между первой последовательностью VWF или FVIII и второй последовательностью VWF или FVIII. Номер, используемый для идентификации эквивалентной аминокислоты во второй последовательности VWF или FVIII, соответствует номеру, используемому для идентификации соответствующей аминокислоты в первой последовательности VWF или FVIII.

В настоящем описании термин сайт встраивания относится к положению в полипептиде FVIII или его фрагменте, варианте или производном, которое находится непосредственно выше положения, в котором может быть встроен гетерологичный фрагмент. Сайт встраивания обозначается номером, при этом указанный номер представляет собой номер аминокислоты в зрелом нативном FVIII (SEQ ID NO: 4), которой соответствует данный сайт встраивания, которая является непосредственно N-концевой по отношению к положению встраивания. Например, термин a3 содержит XTEN в сайте встраивания, соответствующем аминокислоте 1656 последовательности SEQ ID NO: 4 означает, что гетерологичный фрагмент расположен между двумя аминокислотами, соответствующими аминокислоте 1656 и аминокислоте 1657 последовательности SEQ ID NO: 4.

В настоящем описании термин непосредственно ниже аминокислоты относится к положению сразу после концевой карбоксильной группы указанной аминокислоты. Подобным образом термин непосредственно выше аминокислоты относится к положению сразу после концевой аминогруппы указанной аминокислоты. Следовательно, в настоящем описании термин между двумя аминокислотами сайта встраивания относится к положению, в котором XTEN или любой другой полипептид встроен между двумя соседними аминокислотами. Таким образом, термины встроенный непосредственно ниже аминокислоты и встроенный между двумя аминокислотами сайта встраивания употребляются в качестве синонимов термину встроенный в сайте встраивания. В настоящем описании термины встроенный, встраивают, встроенный в или грамматически родственные термины относятся к положению XTEN в химерном полипептиде относительно аналогичного положения в нативном зрелом FVIII человека. В настоящем описании указанные термины относятся к характеристикам рекомбинантного полипептида FVIII относительно нативного зрелого FVIII человека и не означают, подразумевают или предполагают какие-либо способы или процессы, посредством которых был получен химерный полипептид. Например, в отношении химерного полипептида, предложенного согласно настоящему изобретению, термин XTEN встроена непосредственно ниже остатка 745 полипептида FVIII означает, что указанный химерный полипептид содержит XTEN непосредственно ниже аминокислоты, соответствующей аминокислоте 745 в нативном зрелом FVIII человека, например, ограниченную аминокислотами, соответствующими аминокислотам 745 и 746 нативного зрелого FVIII человека.

Гибридный или химерный белок содержит первую аминокислотную последовательность, связанную со второй аминокислотной последовательностью, с которой она не связана в природе. Аминокислотные последовательности, которые обычно встречаются в отдельных белках, могут быть объединены в гибридном полипептиде, или аминокислотные последовательности, которые обычно встречаются в одном и том же белке, могут быть помещены в новую конфигурацию в гибридном полипептиде, например слияние домена фактора VIII согласно настоящему изобретению с доменом Fc Ig. Гибридный белок получают, например, путем химического синтеза или путем получения и трансляции полинуклеотида, в котором пептидные области закодированы в желаемом отношении. Химерный белок может дополнительно содержать вторую аминокислотную последовательность, ассоциированную с первой аминокислотной последовательностью ковалентной непептидной связью или нековалентной связью.

В настоящем описании термин период полувыведения относится к биологическому периоду полувыведения конкретного полипептида in vivo. Период полувыведения может представлять собой время, необходимое для выведения половины введенного субъекту количества из кровообращения и/или других тканей у животного. Когда кривую клиренса конкретного полипептида строят в зависимости от времени,

- 21 042955 указанная кривая обычно является двухфазной с быстрой α-фазой и более длительной β-фазой. α-фаза, как правило, представляет собой уравновешивание введенного полипептида Fc между внутри- и внесосудистым пространством и отчасти определяется размером полипептида. β-фаза, как правило, представляет собой катаболизм полипептида во внутрисосудистом пространстве. В некоторых вариантах реализации FVIII и химерные белки, содержащие FVIII, являются монофазными и, таким образом, не имеют альфа-фазы, а имеют только одну бета-фазу. Следовательно, в некоторых вариантах реализации термин период полувыведения, употребляемый в настоящем описании, относится к периоду полувыведения полипептида в β-фазе. Типичный период полувыведения β-фазы антитела человека у людей составляет 21 день.

В настоящем описании термин связанный относится к первой аминокислотной последовательности или нуклеотидной последовательности, ковалентно или нековалентно присоединенной ко второй аминокислотной последовательности или нуклеотидной последовательности соответственно. Первая аминокислотная или нуклеотидная последовательность может быть напрямую присоединена или соединена со второй аминокислотной или нуклеотидной последовательностью, или в качестве альтернативы вставочная последовательность может ковалентно присоединять первую последовательность ко второй последовательности. Термин связанный означает не только слияние первой аминокислотной последовательности со второй аминокислотной последовательностью на С-конце или N-конце, но также включает встраивание всей первой аминокислотной последовательности (или второй аминокислотой последовательности) в любые две аминокислоты во второй аминокислотной последовательности (или первой аминокислотной последовательности соответственно). В одном из вариантов реализации первая аминокислотная последовательность может быть связана со второй аминокислотной последовательностью пептидной связью или линкером. Первая нуклеотидная последовательность может быть связана со второй нуклеотидной последовательностью фосфодиэфирной связью или линкером. Линкер может представлять собой пептид, или полипептид (для полипептидных цепей), или нуклеотид, или нуклеотидную цепь (для нуклеотидных цепей), или любую химическую группу (как для полипептидных, так и для полинуклеотидных цепей). Термин связанный также обозначается соединительной черточкой (-).

В настоящем описании термин ассоциированный с относится к ковалентной или нековалентной связи, образованной между первой аминокислотной цепью и второй аминокислотной цепью. В одном из вариантов реализации термин ассоциированный с означает ковалентную непептидную связь или нековалентную связь. Данная ассоциация может быть обозначена двоеточием, т.е. (:). В другом варианте реализации она означает ковалентную связь за исключением пептидной связи. Например, аминокислота цистеин содержит тиольную группу, которая может образовывать дисульфидную связь или мостик с тиольной группой во втором остатке цистеина. В большинстве встречающихся в природе молекул IgG области СН1 и CL ассоциированы дисульфидной связью и две тяжелые цепи ассоциированы двумя дисульфидными связями в положениях, соответствующих 239 и 242 с использованием системы нумерации Кэбота (положение 226 или 229, система нумерации EC). Примеры ковалентных связей включают, но не ограничиваются перечисленными, пептидную связь, металлическую связь, водородную связь, дисульфидную связь, сигма-связь, пи-связь, дельта-связь, гликозидную связь, агностическую связь, изогнутую связь, диполярную связь, пи-дативное взаимодействие, двойную связь, тройную связь, четверную связь, пятикратную связь, шестикратную связь, конъюгацию, гиперконъюгацию, ароматичность, гаптность (hapticity) или антисвязывание. Неограничивающие примеры нековалентной связи включают ионную связь (например, катионная пи-связь или солевая связь), металлическую связь, водородную связь (например, диводородная связь, диводородный комплекс, низкобарьерная водородная связь или симметричная водородная связь), ван-дер-ваальсовы силы, лондоновскую дисперсионную силу, механическую связь, галогенную связь, аурофильность, интеркаляцию, стэкинг, энтропийную силу или химическую полярность.

В настоящем описании термин гибрид мономер-димер относится к химерному белку, содержащему первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь, которые ассоциированы друг с другом дисульфидной связью, при этом первая цепь содержит фактор свертывания крови, например фактор VIII, и первую область Fc, а вторая цепь содержит, по существу состоит из или состоит из второй области Fc без фактора свертывания крови. Таким образом, гибридная конструкция мономер-димер представляет собой гибрид, включающий мономерную составляющую, содержащую только один фактор свертывания крови, и димерную составляющую, содержащую две области Fc.

В настоящем описании термин сайт расщепления или сайт ферментативного расщепления относится к сайту, распознаваемому ферментом. Некоторые сайты ферментативного расщепления включают сайт внутриклеточного процессинга. В одном из вариантов реализации полипептид содержит сайт ферментативного расщепления, расщепляемый ферментом, который активируется в каскаде свертывания крови, в результате чего расщепление таких сайтов происходит в месте образования сгустка крови. Такие типичные сайты включают, например, сайты, распознаваемые тромбином, фактором XIa или фактором Xa. Типичные сайты расщепления FXIa включают, например, TQSFNDFTR (SEQ ID NO: 45) и SVSQTSKLTR (SEQ ID NO: 46). Типичные сайты расщепления тромбином включают, например, DFLAEGGGVR (SEQ

- 22 042955

ID NO: 47), TTKIKPR (SEQ ID NO: 48), LVPRG (SEQ ID NO: 49) и ALRPR (аминокислоты с 1 по 5 последовательности SEQ ID NO: 50). Другие сайты ферментативного расщепления известны в данной области техники.

В настоящем описании термин сайт процессинга или сайт внутриклеточного процессинга относится к типу сайта ферментативного расщепления в полипептиде, который является мишенью для ферментов, функционирующих после трансляции полипептида. В одном из вариантов реализации такие ферменты функционируют во время транспорта из просвета аппарата Гольджи в транскомпартмент аппарата Гольджи. Ферменты внутриклеточного процессинга расщепляют полипептиды перед секрецией белка из клетки. Примеры таких сайтов процессинга включают, например, сайты, на которые прицельно воздействует семейство эндопептидаз РАСЕ/фурина (где РАСЕ является акронимом для фермента, расщепляющего белок в месте спаренных основных аминокислот (Paired basic Amino acid Cleaving Enzyme)). Данные ферменты локализованы в мембране Гольджи и расщепляют белки на карбоксиконцевой стороне последовательности-мотива Arg-[любой остаток]-(Lys или Arg)-Arg. В настоящем описании фуриновое семейство ферментов включает, например, PCSK1 (также известный как PC1/PC3), PCSK2 (также известный как РС2), PCSK3 (также известный как фурин или PACE), PCSK4 (также известный как РС4), PCSK5 (также известный как РС5 или РС6), PCSK6 (также известный как PACE4) или PCSK7 (также известный как PC7/LPC, РС8 или SPC7). Другие сайты процессинга известны в данной области техники. Очевидно, что в конструкциях, содержащих более одного сайта процессинга или расщепления, такие сайты могут быть одинаковыми или разными.

Термин фурин относится к ферментам, соответствующим EC № 3.4.21.75. Фурин представляет собой подобную субтилизину пропротеинконвертазу, также известную как PACE (фермент, расщепляющий белок в месте спаренных основных аминокислот). Фурин удаляет фрагменты неактивных белковпредшественников с превращением их в биологически активные белки. Во время внутриклеточного транспорта пропептид VWF может быть отщеплен от зрелой молекулы VWF под действием фермента фурина. В некоторых вариантах реализации фурин отщепляет D1D2 от D'D3 в VWF. В других вариантах реализации нуклеотидная последовательность, кодирующая фурин, может быть экспрессирована совместно с нуклеотидной последовательностью, кодирующей VWFфрагмент фактора фон Виллебранда, так что домены D1D2 могут отщепляться внутри клетки под действием фурина.

Очевидно, что в конструкциях, содержащих более одного сайта процессинга или расщепления, такие сайты могут быть одинаковыми или разными.

В настоящем описании термин процессируемый линкер относится к линкеру, содержащему по меньшей мере один сайт внутриклеточного процессинга, описанный в иных местах настоящего документа.

В настоящем описании термин нарушение гемостаза означает генетически наследованное или приобретенное состояние, характеризующееся склонностью к кровоизлиянию либо спонтанному, либо в результате травмы, вследствие нарушенной способности или неспособности образовывать фибриновый сгусток. Примеры таких нарушений включают гемофилию. Три основные формы представляют собой гемофилию А (дефицит фактора VIII), гемофилию В (дефицит фактора IX или болезнь Кристмаса) и гемофилию С (дефицит фактора XI, умеренная склонность к кровотечению). Другие нарушения гемостаза включают, например, болезнь фон Виллебранда, дефицит фактора XI (дефицит PTA), дефицит фактора XII, дефицит или структурные нарушения фибриногена, протромбина, фактора V, фактора VII, фактора X или фактора XIII, синдром Бернара-Сулье, который представляет собой дефект или дефицит GPIb (GPIb, рецептор для VWF, может иметь дефект и приводить к отсутствию образования первичного сгустка (первичный гемостаз) и повышенной склонности к кровотечениям), и тромбастению Гланцманна и Негели (тромбастения Гланцманна). При печеночной недостаточности (острой и хронической формах) происходит недостаточная выработка факторов свертывания крови печенью; это может увеличивать риск кровотечения.

Химерные молекулы согласно настоящему изобретению можно применять профилактически. В настоящем описании термин профилактическое лечение относится к введению молекулы до эпизода кровотечения. В одном из вариантов реализации субъект, нуждающийся в общем гемостатическом средстве, подвергается или вскоре подвергнется оперативному вмешательству. Химерный белок согласно настоящему изобретению может быть введен до или после оперативного вмешательства в качестве профилактического средства. Химерный белок согласно настоящему изобретению может быть введен во время или после оперативного вмешательства для контроля острого эпизода кровотечения. Указанное оперативное вмешательство может включать, но не ограничивается ими, трансплантацию печени, резекцию печени, стоматологические процедуры или трансплантацию стволовых клеток.

Химерный белок согласно настоящему изобретению также применяют для лечения по необходимости. Термин лечение по необходимости относится к введению химерной молекулы в ответ на симптомы эпизода кровотечения или перед активностью, которая может вызвать кровотечение. В соответствии с одним из аспектов лечение по необходимости можно осуществлять у субъекта, когда начинается кровотечение, например, после повреждения или когда ожидается кровотечение, например, перед оперативным вмешательством. В соответствии с другим аспектом лечение по необходимости можно осуществлять до активности, которая увеличивает риск кровотечения, такой как контактные виды спорта.

- 23 042955

В настоящем описании термин острое кровотечение относится к эпизоду кровотечения вне зависимости от первопричины. Например, у субъекта может быть травма, уремия, наследственное нарушение, сопровождающееся повышенной кровоточивостью (например, дефицит фактора VII), нарушение функции тромбоцитов или резистентность вследствие выработки антител к факторам свертывания крови. В настоящем описании термин лечить, лечение, осуществление лечения относится, например, к уменьшению тяжести заболевания или состояния; уменьшению продолжительности течения заболевания;

уменьшению интенсивности одного или более симптомов, связанных с заболеванием или состоянием;

обеспечению полезных эффектов для субъекта с заболеванием или состоянием без обязательного излечивания указанного заболевания или состояния или профилактике одного или более симптомов, связанных с заболеванием или состоянием.

В одном из вариантов реализации термин осуществление лечения или лечение означает поддержание минимального уровня FVIII, составляющего по меньшей мере примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 МЕ/дл, у субъекта путем введения химерного белка или VWFфрагмента фактора фон Виллебранда согласно настоящему изобретению. В другом варианте реализации термин осуществление лечения или лечение означает поддержание минимального уровня FVIII от примерно 1 МЕ/дл до примерно 20 МЕ/дл, от примерно 2 МЕ/дл до примерно 20 МЕ/дл, от примерно 3 МЕ/дл до примерно 20 МЕ/дл, от примерно 4 МЕ/дл до примерно 20 МЕ/дл, от примерно 5 МЕ/дл до примерно 20 МЕ/дл, от примерно 6 МЕ/дл до примерно 20 МЕ/дл, от примерно 7 МЕ/дл до примерно 20 МЕ/дл, от примерно 8 МЕ/дл до примерно 20 МЕ/дл, от примерно 9 МЕ/дл до примерно 20 МЕ/дл или от примерно 10 МЕ/дл до примерно 20 МЕ/дл. Термин лечение или осуществление лечения заболевания или состояния также может включать поддержание активности FVIII у субъекта на уровне, сопоставимом с по меньшей мере примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20% активности FVIII у субъекта, не страдающего гемофилией. Минимальный уровень, необходимый для лечения, может быть измерен одним или более известными способами и может быть скорректирован (повышен или понижен) для каждого человека.

Химерные белки.

Настоящее изобретение относится к увеличению периода полувыведения белка, представляющего собой фактор VIII, с использованием VWFфрагмента фактора фон Виллебранда и последовательности XTEN путем предотвращения или ингибирования ассоциации фактора, ограничивающего период полувыведения FVIII, т.е. VWFэндогенного фактора фон Виллебранда, с белком FVIII. Эндогенный VWF ассоциирует с от примерно 95% до примерно 98% FVIII в нековалентные комплексы. Тогда как эндогенный VWF является фактором, ограничивающим период полувыведения FVIII, также известно, что эндогенный VWF, связанный с белком FVIII, защищает FVIII различными способами. Например, полноразмерный VWF (в виде мультимера, имеющего массу примерно 250 кДа) может защищать FVIII от расщепления протеазой и активации FVIII, стабилизировать тяжелую цепь и/или легкую цепь FVIII и предотвращать клиренс FVIII фагоцитарными рецепторами. Но в то же время эндогенный VWF ограничивает период полувыведения FVIII путем предотвращения пиноцитоза и путем выведения комплекса FVIIIVWF из системы по пути клиренса VWF. Без конкретного теоретического обоснования считается, что эндогенный VWF является фактором, ограничивающим период полувыведения, который препятствует более чем примерно двукратному увеличению периода полувыведения белка FVIII, слитого с увеличителем периода полувыведения, по сравнению с периодом полувыведения FVIII дикого типа. Следовательно, настоящее изобретение относится к предотвращению или ингибированию взаимодействия между VWFэндогенным фактором фон Виллебранда и белком FVIII с использованием VWFфрагмента фактора фон Виллебранда, что тем самым увеличивает период полувыведения белка FVIII, путем использования только последовательности XTEN или последовательности XTEN в комбинации с константной областью Ig или ее частью. Последовательность XTEN может быть связана с белком FVIII или VWFфрагментом фактора фон Виллебранда. Таким образом, белок FVIII, ассоциированный с VWFфрагментом фактора фон Виллебранда, медленнее выводится из кровообращения одним или более рецепторами, ответственными за клиренс VWF, и, следовательно, может демонстрировать полное увеличение периода полувыведения последовательностью XTEN или последовательностью XTEN в комбинации с константной областью Ig по сравнению с FVIII дикого типа или белком FVIII, не содержащим VWFфрагмент фактора фон Виллебранда.

В одном из вариантов реализации VWFфрагмент фактора фон Виллебранда ассоциирован (или связан) с белком FVIII ковалентной или нековалентной связью. Однако в некоторых случаях физическая блокировка или химическая ассоциация (например, образование нековалентных связей) VWFфрагмента фактора фон Виллебранда и белка FVIII может не быть достаточно сильной для обеспечения стабильного комплекса, содержащего белок FVIII и VWFфрагмент фактора фон Виллебранда, в присутствии VWFэндогенного фактора фон Виллебранда. Например, VWFфрагмент фактора фон Виллебранда, образующий нековалентную связь с белком FVIII без каких-либо других связей, может легко отделяться от белка FVIII in vivo в присутствии VWFэндогенного фактора фон Виллебранда с заменой VWFфрагмента фактора фон Виллебранда (например, рекомбинантного VWF, т.е. rVWF) на эндогенный VWF. Следователь

- 24 042955 но, белок FVIII, нековалентно связанный с VWFэндогенным фактором фон Виллебранда, будет претерпевать путь клиренса VWF и легко выводиться из системы. Для предотвращения диссоциации VWFфрагмента фактора фон Виллебранда с белком FVIII в некоторых вариантах реализации ассоциация или связь между белком FVIII и VWFфрагментом фактора фон Виллебранда представляет собой ковалентную связь, например пептидную связь, одну или более аминокислот или дисульфидную связь. В некоторых вариантах реализации ассоциация (т.е. связь) между присоединяемым фрагментом и белком FVIII представляет собой пептидную связь или линкер между белком FVIII и VWFфрагментом фактора фон Виллебранда (линкер FVIII/VWF). Неограничивающие примеры линкера описаны в иных местах настоящего документа. В некоторых вариантах реализации VWFфрагмент фактора фон Виллебранда представляет собой полипептид, содержащий, по существу состоящий из или состоящий из по меньшей мере примерно 10, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2500, 3000 или 4000 аминокислот. Неограничивающие примеры VWFфрагмента фактора фон Виллебранда описаны в иных местах настоящего документа.

В некоторых вариантах реализации VWFфрагмент фактора фон Виллебранда химически (например, нековалентно) связывается с или физически блокирует один или более сайтов VWFсвязывания фактора фон Виллебранда в белке FVIII. Сайт VWFсвязывания фактора фон Виллебранда в белке FVIII находится в пределах домена A3 или домена С2 белка FVIII. В других вариантах реализации сайт VWFсвязывания фактора фон Виллебранда в белке FVIII находится в пределах домена A3 и домена С2. Например, сайт VWFсвязывания фактора фон Виллебранда в белке FVIII может соответствовать аминокислотам с 1669 по 1689 и/или с 2303 по 2332 последовательности SEQ ID NO: 4 [полноразмерный зрелый FVIII].

Согласно настоящему изобретению также предложен химерный белок (содержащий белок FVIII и VWFфрагмент фактора фон Виллебранда), дополнительно содержащий одну или более последовательностей XTEN, которые обеспечивают свойства дополнительного увеличения периода полувыведения. Одна или более последовательностей XTEN могут быть встроены в белок FVIII или VWFфрагмент фактора фон Виллебранда или связаны с N-концом или С-концом белка FVIII или VWFфрагмента фактора фон Виллебранда. Настоящее изобретение также включает белок FVIII, связанный с последовательностью XTEN (первым фрагментом, увеличивающим период полувыведения) и константной областью Ig или ее частью (вторым фрагментом, увеличивающим период полувыведения), так чтобы указанные два фрагмента, увеличивающие период полувыведения, увеличивали период полувыведения белка FVIII по двум разным механизмам.

В некоторых вариантах реализации химерный белок содержит белок FVIII, связанный с первой константной областью Ig или ее частью (например, первым партнером по связыванию FcRn), VWFфрагмент фактора фон Виллебранда, связанный со второй константной областью Ig или ее частью (например, вторым партнером по связыванию FcRn) и одну или более последовательностей XTEN, встроенных или связанных с указанным белком FVIII или VWFфрагментом фактора фон Виллебранда, при этом VWFфрагмент фактора фон Виллебранда предотвращает связывание фактора, ограничивающего период полувыведения FVIII (например, VWFэндогенного фактора фон Виллебранда), с белком FVIII, при этом первая и вторая константные области Ig или их части образуют ковалентную связь, например дисульфидную связь, и одна или более последовательностей XTEN увеличивают период полувыведения белка FVIII. В некоторых вариантах реализации химерный белок согласно настоящему изобретению содержит белок FVIII, связанный с VWFфрагментом фактора фон Виллебранда необязательным линкером (т.е. линкером FVIII/VWF), и одну или более последовательностей XTEN, встроенных или связанных с указанным белком FVIII или VWFфрагментом фактора фон Виллебранда, при этом VWFфрагмент фактора фон Виллебранда предотвращает связывание фактора, ограничивающего период полувыведения FVIII (например, VWFэндогенного фактора фон Виллебранда), с белком FVIII, и одна или более последовательностей XTEN увеличивают период полувыведения белка FVIII. В соответствии с одним из аспектов необязательный линкер (линкер FVIII/VWF) содержит мотив распознавания сортазой. В соответствии с другим аспектом необязательный линкер (линкер FVIII/VWF) содержит расщепляемый сайт. Примеры расщепляемого линкера (т.е. линкера, содержащего один или более сайтов расщепления) описаны в иных местах настоящего документа.

Химерный белок согласно настоящему изобретению содержит, но не ограничивается ими, (1) VWFфрагмент фактора фон Виллебранда, содержащий домен D' и домен D3, последовательность XTEN и FVIII, при этом последовательность XTEN связана с VWFфрагментом фактора фон Виллебранда;

(2) белок FVIII, последовательность XTEN и константную область Ig или ее часть, при этом белок FVIII связан с последовательностью XTEN и константной областью Ig или ее частью; или (3) белок FVIII, последовательность XTEN и VWFфрагмент фактора фон Виллебранда, при этом последовательность XTEN связана с белком FVIII на С-конце или N-конце или встроена непосредственно ниже одной или более аминокислот (например, один или более сайтов встраивания XTEN) FVIII, и VWFфрагмент фактора фон Виллебранда и белок FVIII ассоциированы друг с другом.

(1) Фрагмент фактора фон Виллебранда (VWF), связанный с XTEN и FVIII.

Настоящее изобретение относится к химерному белку, содержащему

- 25 042955 (i) VWFфрагмент фактора фон Виллебранда, содержащий домен D' и домен VWFD3 фактора фон

Виллебранда;

(ii) последовательность XTEN; и (iii) белок FVIII, при этом (i), (ii) и (iii) связаны или ассоциированы друг с другом.

VWFфрагмент фактора фон Виллебранда, связанный с последовательностью XTEN, в виде части химерного белка согласно настоящему изобретению ассоциирует с белком FVIII, что таким образом предотвращает или ингибирует взаимодействие между VWFэндогенным фактором фон Виллебранда и белком FVIII. В некоторых вариантах реализации VWFфрагмент фактора фон Виллебранда, способный предотвращать или ингибировать связывание белка FVIII с VWFэндогенным фактором фон Виллебранда, в то же время может обладать по меньшей мере одним подобным VWF защитным свойством в отношении FVIII. Примеры подобных VWF защитных свойств в отношении FVIII включают, но не ограничиваются перечисленными, защиту FVIII от расщепления протеазой и активации FVIII, стабилизацию тяжелой и/или легкой цепи FVIII и предотвращение клиренса FVIII фагоцитарными рецепторами. В результате VWFфрагмент фактора фон Виллебранда может предотвращать клиренс белка FVIII по пути клиренса VWF, что таким образом снижает клиренс FVIII из системы кровообращения. В некоторых вариантах реализации фрагменты VWF согласно настоящему изобретению связываются или ассоциируются с белком FVIII и/или физически или химически блокируют сайт VWFсвязывания фактора фон Виллебранда в белке FVIII. Таким образом, белок FVIII, ассоциированный с VWFфрагментом фактора фон Виллебранда, выводится из кровообращения медленнее по сравнению с FVIII дикого типа или FVIII, не ассоциированным с VWFфрагментом фактора фон Виллебранда.

В одном из вариантов реализации настоящее изобретение относится к химерному белку, содержащему (i) VWFфрагмент фактора фон Виллебранда, содержащий домен D' и домен VWFD3 фактора фон Виллебранда;

(ii) последовательность XTEN; и (iii) белок FVIII, при этом последовательность XTEN связана с VWFфрагментом фактора фон Виллебранда (например, (a1) V-X или (а2) X-V, где V содержит VWFфрагмент фактора фон Виллебранда, и X содержит последовательность XTEN), и VWFфрагмент фактора фон Виллебранда связан или ассоциирован с белком FVIII.

В другом варианте реализации VWFфрагмент фактора фон Виллебранда и последовательность XTEN могут быть связаны линкером (например, (a3) V-L-X или (а4) X-L-V) или пептидной связью. Указанный линкер может представлять собой расщепляемый линкер, например расщепляемый тромбином линкер, который может быть расщеплен в месте коагуляции. В других вариантах реализации VWFфрагмент фактора фон Виллебранда, последовательность XTEN и белок FVIII помещены в одну полипептидную цепь. В других вариантах реализации химерный белок содержит две полипептидные цепи:

первую цепь, содержащую VWFфрагмент фактора фон Виллебранда и последовательность XTEN; и вторую цепь, содержащую белок FVIII.

В других вариантах реализации химерный белок содержит три полипептидные цепи:

перв ую цепь, содержащую VWFфрагмент фактора фон Виллебранда и последовательность XTEN;

вторую цепь, содержащую легкую цепь FVIII; и третью цепь, содержащую тяжелую цепь FVIII, при этом первая цепь и вторая цепь ассоциированы друг с другом (например, ковалентная связь, например, дисульфидная связь) и вторая цепь и третья цепь ассоциированы друг с другом (например, металлическая связь).

В других вариантах реализации последовательность XTEN может быть связана с N-концом или С-концом VWFфрагмента фактора фон Виллебранда или встроена непосредственно ниже одной или более аминокислот во фрагменте VWF.

В некоторых вариантах реализации химерный белок согласно настоящему изобретению имеет формулу, включающую (a) V-X-FVin, (b) FVIII-X-V, (с) V-X:FVni, (d) X-V:FVni, (е) FVni:V-X (f) FVIII:X-V или (a5) X-V-FVni, где V содержит VWFфрагмент фактора фон Виллебранда,

X содержит одну или более последовательностей XTEN, и FVIII содержит белок FVIII, (-) представляет собой пептидную связь или одну или более аминокислот, и

- 26 042955 (:) представляет собой химическую ассоциацию или физическую ассоциацию.

В одном из вариантов реализации (:) представляет собой химическую ассоциацию, например по меньшей мере одну непептидную связь. В другом варианте реализации химическая ассоциация, т.е. (:), представляет собой ковалентную связь. В других вариантах реализации химическая ассоциация, т.е. (:), представляет собой нековалентное взаимодействие, например ионное взаимодействие, гидрофобное взаимодействие, гидрофильное взаимодействие, ван-дер-ваальсово взаимодействие или водородную связь. В других вариантах реализации (:) представляет собой непептидную ковалентную связь. В других вариантах реализации (:) представляет собой пептидную связь. В других вариантах реализации (:) представляет собой физическую ассоциацию между двумя последовательностями, при которой часть первой последовательности располагается очень близко ко второй последовательности, в результате чего первая последовательность защищает от или блокирует взаимодействие части второй последовательности с другим фрагментом и, кроме того, данная физическая ассоциация поддерживается, не позволяя второй последовательности взаимодействовать с другими фрагментами. Ориентация полипептидных формул в настоящем описании приведена от N-конца (слева) к С-концу (справа). Например, формула V-X-FVIII означает формулу NH2-V-X-FVIII-COOH. В одном из вариантов реализации формулы, описанные в настоящем документе, могут содержать любые дополнительные последовательности между двумя фрагментами. Например, формула V-X-FVIII может дополнительно содержать любые последовательности на N-конце V между V и X, между X и FVIII или на С-конце FVIII, если не указано иное. В другом варианте реализации соединительная черточка (-) означает пептидную связь.

В других вариантах реализации химерный белок согласно настоящему изобретению имеет формулу, включающую (a) V(Xl)-X2-FVni, (b) FVin-X2-V(Xl), (с) V(Xl):FVni, (d) FVIII: V(X1) или (a5) X2-V(Xl)-FVin, где V(X1) содержит VWFфрагмент фактора фон Виллебранда и первую последовательность XTEN (X1), при этом указанная последовательность XTEN встроена непосредственно ниже одной или более аминокислот во фрагменте VWF,

Х2 содержит одну или более необязательных последовательностей XTEN,

FVIII содержит белок FVIII, (-) представляет собой пептидную связь или одну или более аминокислот, и (:) представляет собой химическую ассоциацию или физическую ассоциацию.

В некоторых вариантах реализации химерный белок содержит (i) VWFфрагмент фактора фон Виллебранда, содержащий домен D' и домен VWFD3 фактора фон Виллебранда;

(ii) последовательность XTEN;

(iii) белок FVIII;

(iv) первый необязательный линкер; и (v) второй необязательный линкер, при этом последовательность XTEN связана с VWFфрагментом фактора фон Виллебранда и/или с белком FVIII линкером.

В некоторых вариантах реализации химерный белок имеет формулу, включающую (bl) V-L1-X-L2-FVIII, (Ь2) FVIII-L2-X-L1-V, (ЬЗ) V-L1-X:FVIII, (Ь4) X-L1-V:FVIII, (Ь5) FVIII:V-L1-X, (Ь6) FVIII:X-L1-V, (Ь7) X-L1-V-L2-FVIII или (Ь8) FVIII-L2-V-L1-X, где V содержит VWFфрагмент фактора фон Виллебранда,

X содержит одну или более последовательностей XTEN,

FVIII содержит белок FVIII;

L1 содержит первый необязательный линкер, например первый расщепляемый линкер,

L2 содержит второй необязательный линкер, например второй расщепляемый линкер или возможный процессируемый линкер, (-) представляет собой пептидную связь или одну или более аминокислот, и

- 27 042955 (:) представляет собой химическую ассоциацию или физическую ассоциацию.

В одном из вариантов реализации (:) представляет собой химическую ассоциацию, например по меньшей мере одну непептидную связь. В другом варианте реализации химическая ассоциация, т.е. (:), представляет собой ковалентную связь. В других вариантах реализации химическая ассоциация, т.е. (:), представляет собой нековалентное взаимодействие, например ионное взаимодействие, гидрофобное взаимодействие, гидрофильное взаимодействие, ван-дер-ваальсово взаимодействие или водородную связь. В других вариантах реализации (:) представляет собой непептидную ковалентную связь. В других вариантах реализации (:) представляет собой пептидную связь. В других вариантах реализации (:) представляет собой физическую ассоциацию между двумя последовательностями, при которой часть первой последовательности располагается очень близко ко второй последовательности, в результате чего первая последовательность защищает от или блокирует взаимодействие части второй последовательности с другим фрагментом и, кроме того, данная физическая ассоциация поддерживается, не позволяя второй последовательности взаимодействовать с другими фрагментами. Ориентация полипептидных формул в настоящем описании приведена от N-конца (слева) к С-концу (справа). Например, формула (b1) V-L1-XL2-FVIII означает формулу NH₂-V-L1-X-L2-FVIII-COOH. В одном из вариантов реализации формулы, описанные в настоящем документе, могут содержать любые дополнительные последовательности между двумя фрагментами. В другом варианте реализации соединительная черточка (-) означает пептидную связь.

Другой аспект настоящего изобретения состоит в получении химерного белка FVIII, демонстрирующего пониженные взаимодействия или отсутствие взаимодействий с фактором, ограничивающим период полувыведения FVIII, например VWFэндогенным фактором фон Виллебранда, и одновременно максимально увеличивающего период полувыведения белка FVIII с использованием последовательности XTEN (первый увеличитель периода полувыведения) в комбинации со вторым увеличителем периода полувыведения или фрагментом, обеспечивающим ковалентную связь между белком FVIII и VWFфрагментом фактора фон Виллебранда, например константной областью Ig или ее частью. В одном из вариантов реализации химерный белок согласно настоящему изобретению содержит (i) VWFфрагмент фактора фон Виллебранда, содержащий домен D' и домен VWFD3 фактора фон Виллебранда;

(ii) последовательность XTEN;

(iii) белок FVIII; и (iv) константную область Ig или ее часть (также обозначаемую в настоящем описании F), при этом (1) VWFфрагмент фактора фон Виллебранда связан с последовательностью XTEN необязательным линкером, например, расщепляемым линкером;

(2) VWFфрагмент фактора фон Виллебранда ассоциирован или связан с белком FVIII дополнительным необязательным линкером, например, расщепляемым линкером; и (3) константная область Ig или ее часть связана с VWFфрагментом фактора фон Виллебранда, последовательностью XTEN или белком FVIII.

В другом варианте реализации химерный белок согласно настоящему изобретению содержит (i) VWFфрагмент фактора фон Виллебранда, содержащий домен D' и домен VWFD3 фактора фон Виллебранда;

(ii) последовательность XTEN;

(iii) белок FVIII;

(iv) константную область Ig или ее часть (F1 или первая константная область Ig или ее часть); и (v) дополнительную константную область Ig или ее часть (F2 или вторая константная область Ig или ее часть), при этом (1) VWFфрагмент фактора фон Виллебранда связан с последовательностью XTEN необязательным линкером, например расщепляемым линкером;

(2) последовательность XTEN или VWFфрагмент фактора фон Виллебранда связан с константной областью Ig или ее частью;

(3) FVIII связан с дополнительной константной областью Ig или ее частью; и (4) константная область Ig или ее часть ассоциирована или связана с дополнительной константной областью Ig или ее частью.

В одном из вариантов реализации ассоциация или связь между двумя константными областями Ig или их частью представляет собой ковалентную связь, например дисульфидную связь. В другом варианте реализации ассоциация или связь между двумя константными областями Ig или их частью представляет собой процессируемый линкер, при этом указанный процессируемый линкер подвергается внутриклеточному процессингу под действием протеазы.

- 28 042955

Например, химерный белок имеет формулу, включающую (g) V-L2-X-L1-F1: FVIII-L3-F2;

(h) V-L2-X-L1 -F1 :F2-L3 -FVIII;

(i) F-L1-X-L2-V: FVIII-L3-F2;

(j) F-L1-X-L2-V:F2-L3 -FVIII;

(k) V-L2-X-L1-F1-L4-FVIII-L3-F2;

(1) F2-L3-FVIII-L4-F1-L1-X-L2-V;

(m) FVIII-L2-F2-L4-V-L2-X-L1-F1; или (n) Fl-Ll-X-L2-V-L4-F2-L2-FVni, где V содержит VWFфрагмент фактора фон Виллебранда, каждый из L1 и L3 содержит необязательный линкер,

L2 содержит необязательный линкер, например расщепляемый линкер;

L4 представляет собой необязательный линкер, например процессируемый линкер,

FVIII содержит белок FVIII,

X содержит одну или более последовательностей XTEN,

F1 содержит необязательную первую константную область Ig или ее часть,

F2 содержит необязательную дополнительную константную область Ig или ее часть, (-) представляет собой пептидную связь или одну или более аминокислот, и (:) представляет собой химическую ассоциацию или физическую ассоциацию.

В некоторых вариантах реализации белок FVIII в любых конструкциях или формулах, описанных в настоящем документе, может дополнительно содержать по меньшей мере одну, по меньшей мере две, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять или по меньшей мере шесть последовательностей XTEN, при этом каждая из последовательностей XTEN встроена непосредственно ниже одной или более аминокислот в белке FVIII или связана с N-концом или С-концом белка FVIII.

Неограничивающие примеры сайтов встраивания XTEN описаны в иных местах настоящего документа.

В одном из вариантов реализации (:) представляет собой химическую ассоциацию, например по меньшей мере одну непептидную связь. В другом варианте реализации химическая ассоциация, т.е. (:), представляет собой ковалентную связь. В других вариантах реализации химическая ассоциация, т.е. (:), представляет собой нековалентное взаимодействие, например ионное взаимодействие, гидрофобное взаимодействие, гидрофильное взаимодействие, ван-дер-ваальсово взаимодействие или водородную связь. В других вариантах реализации (:) представляет собой непептидную ковалентную связь. В других вариантах реализации (:) представляет собой пептидную связь. В других вариантах реализации (:) представляет собой физическую ассоциацию между двумя последовательностями, при которой часть первой последовательности располагается очень близко ко второй последовательности, в результате чего первая последовательность защищает от или блокирует взаимодействие части второй последовательности с другим фрагментом и, кроме того, данная физическая ассоциация поддерживается, не позволяя второй последовательности взаимодействовать с другими фрагментами. Ориентация полипептидных формул в настоящем описании приведена от N-конца (слева) к С-концу (справа). Например, формула (n) F1-L1-XL2-V-L4-F2-L2-FVIII означает формулу NH2-F1-L1-X-L2-V-L4-F2-L2-FVIII-COOH. В одном из вариантов реализации формулы, описанные в настоящем документе, могут содержать любые дополнительные последовательности между двумя фрагментами. В другом варианте реализации соединительная черточка (-) означает пептидную связь.

В одном из вариантов реализации любая из или как константная область Ig или ее часть (иногда обозначаемая в настоящем описании F или F1), так и дополнительная константная область Ig или ее часть (иногда обозначаемая в настоящем описании F2), связанная с VWFфрагментом фактора фон Виллебранда или белком FVIII, могут увеличивать период полувыведения VWFфрагмента фактора фон Виллебранда, белка FVIII или обоих. В другом варианте реализации пара константной области Ig или ее части (иногда обозначаемой в настоящем описании F или F1) и дополнительной константной области Ig или ее части (иногда обозначаемой в настоящем описании F2), каждая из которых связана с VWFфрагментом фактора фон Виллебранда и белком FVIII, обеспечивает более сильную связь, чем нековалентная связь между белком FVIII и VWFфрагментом фактора фон Виллебранда, т.е. ковалентную связь, например дисульфидную связь, что тем самым предотвращает замену VWFфрагмента фактора фон Виллебранда VWFэндогенным фактором фон Виллебранда in vivo. F1 или F2 может содержать область Fc или партнер по связыванию FcRn. В других вариантах реализации любая из или как F1, так и F2, связанные с VWFфрагментом фактора фон Виллебранда и/или белком FVIII, образуют ковалентную связь (например, дисульфидную связь) между F1 и F2, тем самым располагая очень близко VWFфрагмент фактора фон Виллебранда и белок FVIII с предотвращением взаимодействия белка FVIII с VWFфрагментом фактора фон Виллебранда. В некоторых вариантах реализации F1 и F2 являются одинаковыми или раз

- 29 042955 ными. Неограничивающие примеры F1 и F2 могут быть выбраны из группы, состоящей из домена СН1, домена СН2, домена CH3, домена СН4, шарнирного домена, их любых функциональных фрагментов, производных или аналогов и их двух или более комбинаций. В одном из вариантов реализации F1, F2 или обе содержат по меньшей мере один домен СН1, по меньшей мере один домен СН2, по меньшей мере один домен CH3, по меньшей мере один домен СН4 или их функциональные фрагменты, производные или аналоги. В другом варианте реализации F1, F2 или обе содержат по меньшей мере один шарнирный домен или его часть и по меньшей мере один домен СН2 или его часть (например, в ориентации шарнирный домен-СН2). В других вариантах реализации F1, F2 или обе содержат по меньшей мере один домен СН2 или его часть и по меньшей мере один домен CH3 или его часть (например, в ориентации СН2-СНЗ). Примеры комбинации включают, но не ограничиваются перечисленными, домен СН2, домен CH3 и шарнирный домен, которые также известны как область Fc (или домен Fc), например первая область Fc или первый партнер по связыванию FcRn для F1 и вторая область Fc или второй партнер по связыванию FcRn для F2. В других вариантах реализации F1 связана с VWFфрагментом фактора фон Виллебранда линкером и/или F2 связана с белком FVIII линкером. В некоторых вариантах реализации F1 и/или F2 содержит, по существу состоит из или состоит из шарнирного домена. Дополнительные неограничивающие примеры областей Fc или партнеров по связыванию FcRn описаны в иных местах настоящего документа.

В некоторых вариантах реализации химерный белок согласно настоящему изобретению содержит две полипептидные цепи:

первую полипептидную цепь, содержащую, по существу состоящую из или состоящую из VWFфрагмента фактора фон Виллебранда, содержащего домен D' и домен D3, последовательности XTEN, первой константной области Ig или ее части (например, первой области Fc) и необязательного линкера между VWFфрагментом фактора фон Виллебранда и последовательностью XTEN или последовательностью XTEN или первой константной областью Ig или ее частью; и вторую полипептидную цепь, содержащую, по существу состоящую из или состоящую из белка FVIII и второй константной области Ig или ее части (например, второй области Fc).

Линкер между VWFфрагментом фактора фон Виллебранда и первой константной областью Ig или ее частью может представлять собой расщепляемый линкер, например расщепляемый тромбином линкер, который может быть расщеплен в месте коагуляции. В некоторых вариантах реализации первая полипептидная цепь и вторая полипептидная цепь ассоциированы друг с другом. Ассоциация первой цепи и второй цепи предотвращает замену первой цепи, содержащей VWFфрагмент фактора фон Виллебранда, VWFэндогенным фактором фон Виллебранда in vivo. В одном из вариантов реализации ассоциация между первой цепью и второй цепью может представлять собой ковалентную связь. В конкретном варианте реализации ковалентная связь представляет собой дисульфидную связь. В некоторых вариантах реализации белок FVIII во второй цепи содержит также одну или более последовательностей XTEN, связанных с С-концом или N-концом белка FVIII или встроенных непосредственно ниже одной или более аминокислот (например, по меньшей мере один сайт встраивания, описанный в настоящем документе) в белке FVIII. Неограничивающие примеры сайтов встраивания описаны в иных местах настоящего документа.

В других вариантах реализации химерный белок согласно настоящему изобретению содержит три полипептидные цепи, при этом первая полипептидная цепь содержит, по существу состоит из или состоит из тяжелой цепи белка FVIII, вторая полипептидная цепь содержит, по существу состоит из или состоит из легкой цепи белка FVIII, слитой с первой константной областью Ig или ее частью (например, первой областью Fc), и третья полипептидная цепь содержит, по существу состоит из или состоит из VWFфрагмента фактора фон Виллебранда, содержащего домен D' и домен D3, последовательности XTEN, второй константной области Ig или ее части (например, второй области Fc), и необязательного линкера между последовательностью XTEN и второй константной областью Ig или ее частью, или VWFфрагментом фактора фон Виллебранда и последовательностью XTEN. Линкер в третьей цепи может представлять собой расщепляемый линкер, который расщепляется в месте коагуляции, например расщепляемый тромбином линкер. В некоторых вариантах реализации тяжелая цепь FVIII или легкая цепь FVIII связана с одной или более последовательностями XTEN, которые могут быть связаны с N-концом, С-концом или встроены в одном или более сайтах встраивания в пределах последовательности FVIII. Неограничивающие примеры сайтов встраивания описаны в иных местах настоящего документа.

В других вариантах реализации химерный белок согласно настоящему изобретению содержит две полипептидные цепи:

первую полипептидную цепь, содержащую, по существу состоящую из или состоящую из тяжелой цепи белка FVIII; и вторую полипептидную цепь, содержащую, по существу состоящую из или состоящую из легкой цепи белка FVIII, первой константной области Ig или ее части (например, первой области Fc), первого линкера (например, процессируемого линкера, содержащего один или более сайтов расщепления протеазой, включая один или более сайтов внутриклеточного процессинга), VWFфрагмента фактора фон Виллебранда, второго линкера (например, расщепляемого тромбином линкера), последовательности XTEN и

- 30 042955 второй константной области Ig или ее части (например, второй области Fc), при этом легкая цепь белка FVIII связана с первой константной областью Ig или ее частью (например, первой областью Fc), которая также связана с VWFфрагментом фактора фон Виллебранда первым линкером, при этом VWFфрагмент фактора фон Виллебранда связан с последовательностью XTEN, которая также связана со второй константной областью Ig или ее частью вторым линкером.

В некоторых вариантах реализации первый линкер представляет собой процессируемый линкер, а второй линкер представляет собой расщепляемый линкер. После экспрессии химерный белок может быть процессирован под действием фермента внутриклеточного процессинга, который расщепляет процессируемый линкер, и, таким образом, химерный белок может содержать, по существу состоять из или состоять из трех полипептидных цепей. Кроме того, VWFфрагмент фактора фон Виллебранда может отщепляться в месте коагуляции благодаря расщепляемому линкеру.

В некоторых вариантах реализации химерный белок согласно настоящему изобретению содержит одну полипептидную цепь, содержащую одноцепочечный белок FVIII, первую константную область Ig или ее часть (например, первую область Fc), первый линкер (например, процессируемый линкер), VWFфрагмент фактора фон Виллебранда, последовательность XTEN, второй линкер (например, расщепляемый тромбином линкер) и вторую константную область Ig или ее часть (например, вторую область Fc), при этом одноцепочечный белок FVIII связан с первой константной областью Ig или ее частью, которая также связана с VWFфрагментом фактора фон Виллебранда первым линкером, и VWFфрагмент фактора фон Виллебранда связан с последовательностью XTEN, которая также связана со второй константной областью Ig или ее частью. В одном из вариантов реализации VWFфрагмент фактора фон Виллебранда и последовательность XTEN связаны вторым линкером. В другом варианте реализации последовательность XTEN и вторая константная область Ig или ее часть связаны вторым линкером. В других вариантах реализации вторая цепь содержит также третий линкер. Таким образом, одна полипептидная цепь может содержать VWFфрагмент фактора фон Виллебранда, связанный с последовательностью XTEN вторым линкером, и XTEN, связанную со второй константной областью Ig или ее частью третьим линкером. Второй линкер и третий линкер могут быть одинаковыми или разными. В одном из вариантов реализации первый линкер представляет собой процессируемый линкер. В другом варианте реализации второй линкер или третий линкер представляет собой расщепляемый линкер, содержащий один или два сайта расщепления. В конкретном варианте реализации второй линкер представляет собой расщепляемый тромбином линкер. Линкеры, используемые в настоящем изобретении, описаны в иных местах настоящего документа.

(2) FVIII, XTEN и Fc.

Химерный белок согласно настоящему изобретению также содержит (i) белок FVIII;

(ii) последовательность XTEN (первый увеличитель периода полувыведения); и (iii) константную область Ig или ее часть (второй увеличитель периода полувыведения), при этом последовательность XTEN связана с белком FVIII необязательным линкером и константной областью Ig или ее частью дополнительным необязательным линкером.

Последовательность XTEN и константную область Ig или ее часть можно использовать вместе для увеличения периода полувыведения белка FVIII. В одном из вариантов реализации химерный белок представляет собой мономер. В другом варианте реализации химерный белок представляет собой димер (гомодимер или гетеродимер).

Настоящее изобретение также относится к химерному белку, содержащему (i) белок FVIII;

(ii) последовательность XTEN;

(iii) константную область Ig или ее часть (т.е. первую константную область Ig или ее часть, F или F1); и (iv) дополнительную константную область Ig или ее часть (т.е. вторую константную область Ig или ее часть или F2).

В одном из вариантов реализации последовательность XTEN связана с белком FVIII на С-конце или N-конце или встроена непосредственно ниже одной или более аминокислот в белке FVIII (например, один или более сайтов встраивания XTEN), белок FVIII связан с первой константной областью Ig или ее частью, и первая константная область Ig или ее часть и вторая константная область Ig или ее часть ассоциированы или связаны друг с другом необязательным линкером. В соответствии с некоторыми аспектами химерный белок представляет собой гибрид мономер-димер, содержащий первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь, при этом первая полипептидная цепь содержит белок FVIII, последовательность XTEN и первую константную область Ig или ее часть, а вторая полипептидная цепь содержит, по существу состоит из или состоит из второй константной области Ig или ее части без белка FVIII, и при этом первая цепь и вторая цепь ассоциированы друг с другом. Ассоциация между константной областью Ig или ее частью (например, первой областью Fc) и дополнительной константной областью Ig или ее частью (например, второй областью Fc) представляет собой химическую ассоциацию или фи- 31 042955 зическую ассоциацию. В некоторых вариантах реализации химическая ассоциация представляет собой ковалентную связь. В других вариантах реализации химическая ассоциация представляет собой нековалентное взаимодействие, например ионное взаимодействие, гидрофобное взаимодействие, гидрофильное взаимодействие, ван-дер-ваальсово взаимодействие или водородную связь. В других вариантах реализации ассоциация представляет собой непептидную ковалентную связь. В других вариантах реализации ассоциация представляет собой пептидную связь.

В соответствии с другими аспектами химерный белок представляет собой одну полипептидную цепь, содержащую белок FVIII, последовательность XTEN, первую константную область Ig или ее часть, линкер, например процессируемый линкер, и вторую Ig константную область или ее часть, при этом указанная одна полипептидная цепь процессируется после экспрессии под действием внутриклеточного фермента и превращается в две полипептидные цепи.

В одном из вариантов реализации константная область Ig или ее часть (иногда обозначаемая в настоящем описании F или F1), связанная с белком FVIII, может увеличивать период полувыведения белка FVIII совместно с последовательностью XTEN. В другом варианте реализации константная область Ig или ее часть (F или F1) представляет собой область Fc или партнер по связыванию FcRn, описанный в иных местах настоящего документа.

В других вариантах реализации дополнительная константная область Ig или ее часть (иногда обозначаемая в настоящем описании F2 или второй константной областью Ig или ее частью), ассоциированная или связанная с первой константной областью Ig или ее частью, также может увеличивать период полувыведения белка FVIII. В других вариантах реализации вторая константная область Ig или ее часть (F2) совместно с первой константной областью Ig или ее частью и последовательностью XTEN может увеличивать период полувыведения белка FVIII. Дополнительная константная область Ig или ее часть может представлять собой область Fc или партнер по связыванию FcRn, описанный в иных местах настоящего документа.

В некоторых вариантах реализации вторая константная область Ig или ее часть, ассоциированная с первой константной областью Ig или ее частью, также связана с VWFфрагментом фактора фон Виллебранда, описанным в иных местах настоящего документа, и возможной последовательностью XTEN.

В некоторых вариантах реализации любая из или как константная область Ig или ее часть (F, или F1, или первая константная область Ig, или ее часть), так и дополнительная константная область Ig или ее часть (т.е. вторая константная область Ig, или ее часть, или F2) (обозначаемые в данном абзаце константными областями Ig или их частью) могут включать, но не ограничиваются перечисленными, домен СН1, домен СН2, домен CH3, домен СН4, шарнирный домен, их любые функциональные фрагменты, производные или аналоги, или их две или более комбинаций. В одном из вариантов реализации константная область Ig или ее часть содержит по меньшей мере один домен СН1, по меньшей мере один домен СН2, по меньшей мере один домен CH3, по меньшей мере один домен СН4 или их функциональные фрагменты, производные или аналоги. В другом варианте реализации константная область Ig или ее часть содержит по меньшей мере один шарнирный домен или его часть и по меньшей мере один домен СН2 или его часть (например, в ориентации шарнирный домен-СН2). В других вариантах реализации константная область Ig или ее часть содержит по меньшей мере один домен СН2 или его часть и по меньшей мере один домен CH3 или его часть (например, в ориентации CF2-CH3). Примеры комбинации включают, но не ограничиваются перечисленными, домен СН2, домен CH3 и шарнирный домен, которые также известны как область Fc (или домен Fc), например первая область Fc. Дополнительные примеры константных областей Ig или их части описаны в иных местах настоящего документа.

Химерный белок согласно настоящему изобретению может иметь увеличенный период полувыведения белка FVIII по сравнению с FVIII дикого типа. В одном из вариантов реализации период полувыведения белка FVIII по меньшей мере примерно в 1,5 раза, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 2,5 раза, по меньшей мере примерно в 3 раза, по меньшей мере примерно в 4 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 6 раз, по меньшей мере примерно в 7 раз, по меньшей мере примерно в 8 раз, по меньшей мере примерно в 9 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 11 раз или по меньшей мере примерно в 12 раз больше периода полувыведения FVIII дикого типа. В другом варианте реализации период полувыведения белка FVIII составляет по меньшей мере примерно 10 ч, по меньшей мере примерно 11 ч, по меньшей мере примерно 12 ч, по меньшей мере примерно 13 ч, по меньшей мере примерно 14 ч, по меньшей мере примерно 15 ч, по меньшей мере примерно 16 ч, по меньшей мере примерно 17 ч, по меньшей мере примерно 18 ч, по меньшей мере примерно 19 ч, по меньшей мере примерно 20 ч, по меньшей мере примерно 21 ч, по меньшей мере примерно 22 ч, по меньшей мере примерно 23 ч, по меньшей мере примерно 24 ч, по меньшей мере примерно 36 ч, по меньшей мере примерно 48 ч, по меньшей мере примерно 60 ч, по меньшей мере примерно 72 ч, по меньшей мере примерно 84 ч, по меньшей мере примерно 96 ч или по меньшей мере примерно 108 ч.

(3) FVIII, XTEN и VWF.

В соответствии с одним из аспектов химерный белок согласно настоящему изобретению содержит (i) белок FVIII;

- 32 042955 (ii) последовательность XTEN; и (iii) VWFфрагмент фактора фон Виллебранда, содержащий домен D' и домен VWFD3 фактора фон

Виллебранда, при этом белок FVIII связан с последовательностью XTEN, и при этом белок FVIII ассоциирован или связан с VWFфрагментом фактора фон Виллебранда.

В одном из вариантов реализации VWFфрагмент фактора фон Виллебранда химерного белка, описанного в настоящем документе, не способен связываться с рецептором, ответственным за клиренс VWF. В другом варианте реализации VWFфрагмент фактора фон Виллебранда способен защищать белок FVIII от расщепления одной или более протеазами, защищать белок FVIII от активации, стабилизировать тяжелую цепь и/или легкую цепь белка FVIII или предотвращать клиренс белка FVIII с участием одного или более рецепторов макрофагов. В других вариантах реализации VWFфрагмент фактора фон Виллебранда предотвращает или ингибирует связывание VWFэндогенного фактора фон Виллебранда с сайтом VWFсвязывания фактора фон Виллебранда в белке FVIII. Сайт VWFсвязывания фактора фон Виллебранда может быть расположен в домене A3 или домене С2 белка FVIII или как в домене A3, так и в домене С2. В конкретном варианте реализации сайт VWFсвязывания фактора фон Виллебранда содержит аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам с 1669 по 1689 и/или аминокислотам с 2303 по 2332 последовательности SEQ ID NO: 2.

В соответствии с другим аспектом химерный белок содержит (i) белок FVIII;

(ii) последовательность XTEN;

(iii) VWFфрагмент фактора фон Виллебранда, содержащий домен D' и домен VWFD3 фактора фон Виллебранда; и (iv) константную область Ig или ее часть, при этом последовательность XTEN связана с белком FVIII на С-конце или N-конце или встроена непосредственно ниже одной или более аминокислот (например, один или более сайтов встраивания XTEN, описанных в настоящем документе) в белке FVIII, VWFфрагмент фактора фон Виллебранда связан или ассоциирован с белком FVIII или последовательностью XTEN, и константная область Ig или ее часть связана с белком FVIII, последовательностью XTEN, VWFфрагментом фактора фон Виллебранда или их любыми комбинациями.

Константная область Ig или ее часть, подходящая для химерных белков согласно настоящему изобретению, описана в иных местах настоящего документа. В одном из вариантов реализации константная область Ig или ее часть способна увеличивать период полувыведения белка FVIII. В другом варианте реализации константная область Ig или ее часть содержит первую область Fc или первый партнер по связыванию FcRn. В других вариантах реализации константная область Ig или ее часть связана с белком FVIII необязательным линкером. В других вариантах реализации указанный линкер включает расщепляемый линкер. Химерный белок может представлять собой одну полипептидную цепь, т.е. мономер (т.е. одна цепь), содержащий (i), (ii), (iii) и (iv), или две цепи, содержащие первую цепь, содержащую (i) и (ii), и вторую цепь, содержащую (iii) и (iv). В соответствии с другими аспектами химерный белок представляет собой димер (например, гомодимер или гетеродимер). В одном из вариантов реализации химерный белок содержит две цепи, каждая из которых содержит (i), (ii), (iii) и (iv).

В некоторых вариантах реализации химерный белок содержит (i) белок FVIII;

(ii) последовательность XTEN;

(iii) VWFфрагмент фактора фон Виллебранда, содержащий домен D' и домен VWFD3 фактора фон Виллебранда;

(iv) константную область Ig или ее часть (иногда также обозначаемую F1, первой константной областью Ig или ее частью или F2); и (v) дополнительную константную область Ig или ее часть (иногда также обозначаемую F2 или второй константной областью Ig или ее частью), при этом (1) белок FVIII связан с последовательностью XTEN на С-конце или N-конце белка FVIII или встроен непосредственно ниже одной или более аминокислот (например, один или более сайтов встраивания XTEN, описанных в настоящем документе) в белке FVIII;

(2) либо последовательность XTEN, либо белок FVIII связан с константной областью Ig или ее частью;

(3) VWFфрагмент фактора фон Виллебранда связан со второй константной областью Ig или ее частью; и (4) константная область Ig или ее часть ассоциирована со второй константной областью Ig или ее частью.

В одном из вариантов реализации константная область Ig или ее часть, связанная с белком FVII или последовательностью XTEN, также связана с VWFфрагментом фактора фон Виллебранда линкером, например процессируемым линкером. В другом варианте реализации дополнительная константная область Ig или ее часть, подходящая для химерных белков согласно настоящему изобретению, может быть также

- 33 042955 связана с белком FVIII или константной областью Ig или ее частью необязательным линкером, например процессируемым линкером. В некоторых вариантах реализации пара константной области Ig или ее части и дополнительной константной области Ig или ее части, каждая из которых связана с VWFфрагментом фактора фон Виллебранда и белком FVIII, обеспечивает более сильную связь, чем нековалентная связь между белком FVIII и VWFфрагментом фактора фон Виллебранда, т.е. ковалентную связь, например дисульфидную связь, что тем самым предотвращает замену VWFфрагмента фактора фон Виллебранда VWFэндогенным фактором фон Виллебранда in vivo. В других вариантах реализации любая из или как константная область Ig или ее часть, так и дополнительная константная область Ig или ее часть способны увеличивать период полувыведения белка FVIII или VWFфрагмента фактора фон Виллебранда. В других вариантах реализации дополнительная константная область Ig или ее часть содержит вторую область Fc или партнер по связыванию FcRn. Константная область Ig или ее часть и дополнительная константная область Ig или ее часть в химерных белках являются одинаковыми или разными.

В некоторых вариантах реализации константная область Ig или ее часть и дополнительная константная область Ig или ее часть ассоциированы химической ассоциацией или физической ассоциацией. В одном из вариантов реализации химическая ассоциация, т.е. (:), представляет собой по меньшей мере одну непептидную связь. В некоторых вариантах реализации химическая ассоциация, т.е. (:), представляет собой ковалентную связь. В других вариантах реализации химическая ассоциация, т.е. (:), представляет собой нековалентное взаимодействие, например ионное взаимодействие, гидрофобное взаимодействие, гидрофильное взаимодействие, ван-дер-ваальсово взаимодействие или водородную связь. В других вариантах реализации (:) представляет собой непептидную ковалентную связь. В других вариантах реализации (:) представляет собой пептидную связь. В других вариантах реализации (:) представляет собой физическую ассоциацию между двумя последовательностями, при которой часть первой последовательности располагается очень близко ко второй последовательности, в результате чего первая последовательность защищает от или блокирует взаимодействие части второй последовательности с другим фрагментом. В некоторых вариантах реализации ассоциация между константной областью Ig или ее частью и дополнительной константной областью Ig или ее частью может представлять собой ковалентную связь, например, дисульфидную связь, которая предотвращает замену VWFфрагмента фактора фон Виллебранда или полипептида, содержащего VWFфрагмент фактора фон Виллебранда, VWFэндогенным фактором фон Виллебранда. Следовательно, предотвращение взаимодействия между белком FVIII и VWFэндогенным фактором фон Виллебранда уменьшает или устраняет данный фактор, ограничивающий период полувыведения, для белка FVIII и, таким образом, период полувыведения белка FVIII увеличивается по сравнению с белком FVIII, не содержащим белок VWF, или FVIII дикого типа.

В соответствии с другими аспектами химерный белок имеет формулу, включающую (1) F VIII(X 1 )-L 1 -F1: V-L2-X2-L3 -F2;

(2) FVIII(X1)-L1-F1 :F2-L3-X2-L2-V;

(3 ) F1 -L1 -F VIII(X 1): V-L2-X2-L3 -F2;

(4) F1 -L1 -F VIII(X 1) :F2-L3 -X2-L2-V;

(5) F VIII(X1 )-L 1 -F1-L4-V-L2-X2-L3 -F2;

(6) F VIII(X 1 )-L 1 -F1-L4-F2-L3 -X2-L2-V;

(7) F1 -L1 -FVIII(X 1 )-L4-V-L2-X2-L3-F2 или (8) F1-L1-FVIII(X1)-L4- F2-L3-X2-L2-V, где FVIII(X1) содержит белок FVIII и одну или более последовательностей XTEN, при этом указанная одна или более последовательностей XTEN связаны с N-концом или С-концом белка FVIII или встроены непосредственно ниже одной или более аминокислот (например, один или более сайтов встраивания, описанных в настоящем документе) в белке FVIII, каждый из L1, L2 и L3 содержит необязательный линкер, например расщепляемый линкер,

L4 представляет собой линкер, например процессируемый линкер,

Х2 содержит одну или более необязательных последовательностей XTEN,

F1 содержит константную область Ig или ее часть,

F2 содержит необязательную дополнительную константную область Ig или ее часть, и

V содержит VWFфрагмент фактора фон Виллебранда, (-) представляет собой пептидную связь или одну или более аминокислот, и (:) включает химическую ассоциацию или физическую ассоциацию.

В одном из вариантов реализации (:) представляет собой химическую ассоциацию, например по меньшей мере одну непептидную связь. В другом варианте реализации химическая ассоциация, т.е. (:), представляет собой ковалентную связь. В других вариантах реализации химическая ассоциация, т.е. (:), представляет собой нековалентное взаимодействие, например ионное взаимодействие, гидрофобное взаимодействие, гидрофильное взаимодействие, ван-дер-ваальсово взаимодействие или водородную связь. В других вариантах реализации (:) представляет собой непептидную ковалентную связь. В других вари

- 34 042955 антах реализации (:) представляет собой пептидную связь. В других вариантах реализации (:) представляет собой физическую ассоциацию между двумя последовательностями, при которой часть первой последовательности располагается очень близко ко второй последовательности, в результате чего первая последовательность защищает от или блокирует взаимодействие части второй последовательности с другим фрагментом и, кроме того, данная физическая ассоциация поддерживается, не позволяя второй последовательности взаимодействовать с другими фрагментами. Ориентация полипептидных формул в настоящем описании приведена от N-конца (слева) к С-концу (справа). Например, формула V-X-FVIII означает формулу NH2-V-X-FVIII-COOH. В одном из вариантов реализации формулы, описанные в настоящем документе, могут содержать любые дополнительные последовательности между двумя фрагментами. Например, формула V-X-FVIII может дополнительно содержать любые последовательности на N-конце V между V и X, между X и FVIII, или на С-конце FVIII, если не указано иное. В другом варианте реализации соединительная черточка (-) означает пептидную связь.

В соответствии с одним из аспектов химерный белок содержит две полипептидные цепи:

(А) первую цепь, содержащую (i) одноцепочечный белок FVIII, (ii) последовательность XTEN, и (iii) первую константную область Ig или ее часть, например первую область Fc или партнер по связыванию FcRn, при этом последовательность XTEN связана белком FVIII на N-конце или С-конце или встроена непосредственно ниже одной или более аминокислот белка FVIII (например, один или более сайтов встраивания XTEN, описанных в настоящем документе) и первая константная область Ig или ее часть связана с последовательностью XTEN, когда последовательность XTEN связана с белком FVIII на Nконце или С-конце FVIII белка или когда последовательность XTEN встроена в белок FVIII; и (В) вторую цепь, содержащую (iv) VWFфрагмент фактора фон Виллебранда, содержащий домен D' и домен D3, (v) линкер, и (vi) вторую константную область Ig или ее часть, например вторую область Fc или второй партнер по связыванию FcRn, при этом VWFфрагмент фактора фон Виллебранда связан с линкером, например расщепляемым линкером, который также связан со второй константной областью Ig или ее частью, и при этом первая полипептидная цепь и вторая полипептидная цепь ассоциированы друг с другом, например, ковалентной связью, например дисульфидной связью.

В одном из вариантов реализации линкер представляет собой расщепляемый линкер, описанный в иных местах настоящего документа, например расщепляемый тромбином линкер. В некоторых вариантах реализации вторая цепь содержит одну или более последовательностей XTEN между (iv) и (v) или (v) и (vi).

В соответствии с другими аспектами химерный белок содержит одну полипептидную цепь, содержащую (i) одноцепочечный белок FVIII;

(ii) последовательность XTEN;

(iii) первую константную область Ig или ее часть, например первую область Fc или партнер по связыванию FcRn;

(iv) первый линкер;

(v) VWFфрагмент фактора фон Виллебранда, содержащий домен D' и домен D3;

(vi) второй линкер; и (vii) вторую константную область Ig или ее часть, например вторую область Fc или второй партнер по связыванию FcRn, при этом элементы (i)-(vii) связаны в указанном порядке или в любом порядке.

В одном из вариантов реализации первый линкер представляет собой процессируемый линкер, который может быть процессирован или расщеплен внутри клетки после экспрессии и превращает одну полипептидную цепь в две полипептидные цепи. В другом варианте реализации второй линкер представляет собой расщепляемый линкер, описанный в настоящем документе, например расщепляемый тромбином линкер. Последовательность XTEN, используемая в настоящем изобретении, может быть связана с белком FVIII необязательным линкером на N-конце или С-конце белка FVIII или встроена непосредственно ниже одной или более аминокислот (например, один или более сайтов встраивания XTEN) в белке FVIII.

В соответствии с некоторыми аспектами химерный белок содержит три полипептидные цепи:

(А) первую полипептидную цепь, содержащую (i) тяжелую цепь белка FVIII, и (ii) последовательность XTEN, которые связаны друг с другом;

(В) вторую полипептидную цепь, содержащую (ii i) легкую цепь белка FVIII, и

- 35 042955 (iv) первую константную область Ig или ее часть, например первую область Fc или партнер по связыванию FcRn, которые связаны друг с другом; и (С) третью полипептидную цепь, содержащую (v) VWFфрагмент фактора фон Виллебранда, содержащий домен D' и домен D3, (vi) линкер, и (vii) вторую константную область Ig или ее часть, например вторую область Fc или второй партнер по связыванию FcRn, при этом указанная вторая цепь ассоциирована с первой цепью и третьей цепью.

В одном из вариантов реализации ассоциация между первой цепью и второй цепью представляет собой химическую ассоциацию или физическую ассоциацию. Например, ассоциация между первой цепью и второй цепью может представлять собой металлическую связь. В другом варианте реализации ассоциация между второй цепью и третьей цепью также представляет собой химическую ассоциацию или физическую ассоциацию, например ковалентную связь или нековалентную связь. В некоторых вариантах реализации ассоциация между второй цепью и третьей цепью осуществляется через две константных области Ig или их часть и представляет собой дисульфидную связь. Образование связи между второй цепью и третьей цепью предотвращает или ингибирует связывание белка FVIII с VWFэндогенным фактором фон Виллебранда, что таким образом предотвращает выведение белка FVIII по пути клиренса VWF. В некоторых вариантах реализации линкер представляет собой процессируемый линкер, который расщепляется внутри клетки после экспрессии в клетке-хозяине. Последовательность XTEN, используемая в настоящем изобретении, связана с белком FVIII необязательным линкером на N-конце или С-конце белка FVIII или встроена непосредственно ниже одной или более аминокислот (например, один или более сайтов встраивания XTEN) в белке FVIII. В некоторых вариантах реализации VWFфрагмент фактора фон Виллебранда напрямую связан с белком FVIII, содержащим одну или более XTEN, пептидной связью или линкером. В качестве одного из способов связывания VWFфрагмента фактора фон Виллебранда и белка FVIII, в который встроены или с которым связаны прямой связью (например, пептидной связью) или линкером одна или более XTEN, может быть использовано ферментативное лигирование (например, сортаза). Например, сортаза относится к группе прокариотических ферментов, которые модифицируют поверхностные белки путем распознавания и расщепления карбоксиконцевого сигнала сортировки. Для большинства субстратов ферментов, представляющих собой сортазу, сигнал распознавания состоит из мотива LPXTG (Leu-Pro-любαя-Thr-Gl·y (SEQ ID NO: 51)), затем высокогидрофобной трансмембранной последовательности, затем кластера основных остатков, таких как аргинин. Расщепление происходит между Thr и Gly с временным присоединением через остаток Thr к остатку Cys активного центра партнера по лигированию с последующей транспептидацией, которая приводит к ковалентному присоединению белка к клеточной стенке. В некоторых вариантах реализации партнер по лигированию содержит Gly(n). В других вариантах реализации химерный белок содержит также мотив распознавания сортазой. В некоторых вариантах реализации VWFфрагмент фактора фон Виллебранда присоединяют к FVIII, содержащему одну или более XTEN, встроенных или связанных с ним, с использованием опосредуемого сортазой лигирования белка in vitro.

В одном из вариантов реализации VWFфрагмент фактора фон Виллебранда, связанный с мотивом распознавания сортазой необязательным линкером, может быть слит с белком FVIII, связанным с Gly(n), под действием сортазы, где n может представлять собой любое целое число, при этом одна или более XTEN встроены или связаны с белком FVIII. Лигированная конструкция содержит VWFфрагмент фактора фон Виллебранда (N-концевая часть конструкции) и белок FVIII, в который встроена или с которым связана одна или более XTEN (С-концевая часть конструкции), при этом мотив распознавания сортазой встроен между ними. Другая лигированная конструкция содержит VWFфрагмент фактора фон Виллебранда (N-концевая часть конструкции), линкер, мотив распознавания сортазой и белок FVIII, в который встроена или с которым связана одна или более XTEN (С-концевая часть конструкции). В другом варианте реализации белок FVIII, связанный с мотивом распознавания сортазой необязательным линкером, может быть слит с VWFфрагментом фактора фон Виллебранда, связанным с Gly(n), под действием сортазы, где n представляет собой любое целое число. Полученная лигированная конструкция содержит белок FVIII (N-концевая часть конструкции), в который встроена или с которым связана одна или более XTEN, и VWFфрагмент фактора фон Виллебранда (С-концевая часть конструкции), при этом мотив распознавания сортазой встроен между ними. Другая полученная лигированная конструкция содержит белок FVIII (N-концевая часть конструкции), в который встроена или с которым связана одна или более XTEN, линкер, мотив распознавания сортазой и VWFфрагмент фактора фон Виллебранда (С-концевая часть конструкции). В других вариантах реализации VWFфрагмент фактора фон Виллебранда, связанный с мотивом распознавания сортазой первым необязательным линкером, может быть слит с гетерологичным фрагментом, например константной областью иммуноглобулина или ее частью, например областью Fc, связанным с сайтом расщепления тромбином, с помощью второго необязательного линкера. Полученная конструкция может содержать VWFфрагмент фактора фон Виллебранда (N-концевая часть), первый линкер, мотив распознавания сортазой, сайт расщепления протеазой, второй необязательный линкер и гетерологичный фрагмент.

- 36 042955

В некоторых вариантах реализации VWFфрагмент фактора фон Виллебранда ассоциирован с белком FVIII. Ассоциация между VWFфрагментом фактора фон Виллебранда и белком FVIII может представлять собой химическую ассоциацию или физическую ассоциацию. Химическая ассоциация может представлять собой нековалентное взаимодействие, например ионное взаимодействие, гидрофобное взаимодействие, гидрофильное взаимодействие, ван-дер-ваальсово взаимодействие или водородную связь. В других вариантах реализации ассоциация между белком FVIII и VWFфрагментом фактора фон Виллебранда представляет собой физическую ассоциацию между двумя последовательностями, например, обусловленную дополнительной ассоциацией между последовательностью, содержащей белок FVIII, и последовательностью, содержащей VWFфрагмент фактора фон Виллебранда, при которой часть первой последовательности располагается очень близко ко второй последовательности, в результате чего первая последовательность защищает от или блокирует взаимодействие части второй последовательности с другим фрагментом. В результате предотвращения или ингибирования взаимодействия VWFэндогенного фактора фон Виллебранда с белком FVIII с помощью VWFфрагмента фактора фон Виллебранда, химерный белок, описанный в настоящем документе, имеет увеличенный период полувыведения по сравнению с FVIII дикого типа или соответствующим химерным белком, не содержащим VWFфрагмент фактора фон Виллебранда. В одном из вариантов реализации период полувыведения белка FVIII по меньшей мере примерно в 1,5 раза, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 2,5 раза, по меньшей мере примерно в 3 раза, по меньшей мере примерно в 4 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 6 раз, по меньшей мере примерно в 7 раз, по меньшей мере примерно в 8 раз, по меньшей мере примерно в 9 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 11 раз или по меньшей мере примерно в 12 раз больше чем у белка FVIII, не содержащего VWFфрагмент фактора фон Виллебранда. В другом варианте реализации период полувыведения белка FVIII составляет по меньшей мере примерно 10 ч, по меньшей мере примерно 11 ч, по меньшей мере примерно 12 ч, по меньшей мере примерно 13 ч, по меньшей мере примерно 14 ч, по меньшей мере примерно 15 ч, по меньшей мере примерно 16 ч, по меньшей мере примерно 17 ч, по меньшей мере примерно 18 ч, по меньшей мере примерно 19 ч, по меньшей мере примерно 20 ч, по меньшей мере примерно 21 ч, по меньшей мере примерно 22 ч, по меньшей мере примерно 23 ч, по меньшей мере примерно 24 ч, по меньшей мере примерно 36 ч, по меньшей мере примерно 48 ч, по меньшей мере примерно 60 ч, по меньшей мере примерно 72 ч, по меньшей мере примерно 84 ч, по меньшей мере примерно 96 ч или по меньшей мере примерно 108 ч. В конкретном варианте реализации период полувыведения белка FVIII составляет по меньшей мере примерно 10 ч, по меньшей мере примерно 11 ч, по меньшей мере примерно 12 ч, по меньшей мере примерно 13 ч, по меньшей мере примерно 14 ч, по меньшей мере примерно 15 ч, по меньшей мере примерно 16 ч, по меньшей мере примерно 17 ч, по меньшей мере примерно 18 ч, по меньшей мере примерно 19 ч, по меньшей мере примерно 20 ч, по меньшей мере примерно 21 ч, по меньшей мере примерно 22 ч, по меньшей мере примерно 23 ч, по меньшей мере примерно 24 ч, по меньшей мере примерно 25 ч, по меньшей мере примерно 26 ч или по меньшей мере примерно 27 ч у мышей HemA.

А) Фрагмент фактора фон Виллебранда (VWF) VWF (также известный как F8VWF) представляет собой большой мультимерный гликопротеин, присутствующий в плазме крови и конститутивно вырабатываемый в эндотелии (в тельцах Вейбеля-Паладе), мегакариоцитах (α-гранулы тромбоцитов) и субэндотелиальной соединительной ткани. Основной мономер VWF представляет собой белок из 2813 аминокислот. Каждый мономер содержит ряд конкретных доменов, обладающих конкретной функцией, домен D7D3 (который связывается с фактором VIII), домен А1 (который связывается с GPIb-рецептором тромбоцитов, гепарином и/или, возможно, коллагеном), домен A3 (который связывается с коллагеном), домен С1 (в котором домен RGD связывается с интегрином αΠΒβ3 тромбоцитов, когда он активируется) и домен цистеиновый узел на С-конце белка (который является общим для VWF и фактора роста тромбоцитов (PDGF), трансформирующего фактора роста-β (TGFP) и β-хорионического гонадотропина человека (PHCG).

В настоящем описании термин VWFфрагмент фактора фон Виллебранда включает, но не ограничивается ими, функциональные фрагменты VWF, содержащие домен D' и домен D3, которые способны ингибировать связывание VWFэндогенного фактора фон Виллебранда с FVIII. В одном из вариантов реализации VWFфрагмент фактора фон Виллебранда связывается с белком FVIII. В другом варианте реализации VWFфрагмент фактора фон Виллебранда блокирует сайт VWFсвязывания фактора фон Виллебранда в белке FVIII, тем самым ингибируя взаимодействие белка FVIII с VWFэндогенным фактором фон Виллебранда. Фрагменты VWF включают производные, варианты, мутанты или аналоги, которые сохраняют данные виды активности VWF. Последовательность мономера из 2813 аминокислот для VWF человека представлена под номером доступа _NP_000543.2_ в Genbank. Нуклеотидная последовательность, кодирующая VWF человека, представлена под номером доступа NM 000552.3 в Genbank. Нуклеотидная последовательность VWF человека обозначена SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO: 2 представляет собой аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 1. Каждый домен VWF перечислен в табл. 1.

- 37 042955

Таблица 1

Последовательности VWF

Домены VWF	Аминокислотная последовательность
Сигнальный пептид VWF (Аминокислоты с 1 по 22 SEQIDNO: 2)	1 MIPARFAGVL LALALILPGT LC 22
Область D1D2 VWF	23 AEGTRGRS STARCSLFGS DFVNTFDGSM
(Аминокислоты с 23 по763 SEQIDNO: 2)	51 YSFAGYCSYL LAGGCQKRSF SIIGDFQNGK RVSLSVYLGE FFDIHLFVNG 101 TVTQGDQRVS MPYASKGLYL ETEAGYYKLS GEAYGFVARI DGSGNFQVLL 151 SDRYFNKTCG LCGNFNIFAE DDFMTQEGTL TSDPYDFANS WALSSGEQWC 201 ERASPPSSSC NISSGEMQKG LWEQCQLLKS TSVFARCHPL VDPEPFVALC 2 51 EKTLCECAGG LECACPALLE YARTCAQEGM VLYGWTDHSA CSPVCPAGME 301 YRQCVSPCAR TCQSLHINEM CQERCVDGCS CPEGQLLDEG LCVESTECPC 351 VHSGKRYPPG TSLSRDCNTC ICRNSQWICS NEECPGECLV TGQSHFKSFD 401 NRYFTFSGIC QYLLARDCQD HSFSIVIETV QCADDRDAVC TRSVTVRLPG 451 LHNSLVKLKH GAGVAMDGQD IQLPLLKGDL RIQHTVTASV RLSYGEDLQM 501 DWDGRGRLLV KLSPVYAGKT CGLCGNYNGN QGDDFLTPSG LAEPRVEDFG 551 NAWKLHGDCQ DLQKQHSDPC ALNPRMTRFS EEACAVLTSP TFEACHRAVS 601 PLPYLRNCRY DVCSCSDGRE CLCGALASYA AACAGRGVRV AWREPGRCEL 651 NCPKGQVYLQ CGTPCNLTCR SLSYPDEECN EACLEGCFCP PGLYMDERGD 701 CVPKAQCPCY YDGEIFQPED IFSDHHTMCY CEDGFMHCTM SGVPGSLLPD 751 AVLSSPLSHR SKR 763
Домен D' VWF	764 SLSCRPP MVKLVCPADN LRAEGLECTK TCQNYDLECM 801 SMGCVSGCLC PPGMVRHENR CVALERCPCF HQGKEYAPGE TVKIGCNTCV 851 CRDRKWNC Т D HVC DAT
	866
Домен VWFD3 фактора фон Виллебранда	867 с_s_t I _ gmahyl t fdg kKYLFPGECQ__YVLVQDYC_GS 901 NP G T ERILVG_ JWGCSΗ P SVK _ CKKRV T_I_LVE G GE IELEDGE__VNVKRPMK_DE 951 THFEWE_SGR YIILLLGKAL_SVVWDRHLSI GXYLKQT YQE_ _KVCG^ 10 01 GJ^NNDJ^TS^ J4LQVEEDWD_ FGJ4SWKVSSQ CAD T RKVP L D_ _S S PAT CHNNI 1051 MKQ TMVDS S C_ _R I L_TS DV FQD _ CNKLVDPE P Y L_D_VC IYDT C S_ _CE S BCDCACF 1101 CD_T IAAYAHy__CAQHj3KyyTJV_RTATLC_PQS^ EERNLRENGY ECEWRYNSCA

- 38 042955

1151 PACQVTCQHP EPLACPVQCV EGCHAHCPPG KILDELLQTC VDPEDCPVCE ’

1201 VAGRRFASGK KVTLNPSDPE HCQICHCDW

NLTCEACQEP

1240

Домен фактора	VWFA1 фон	1241 1251	GGLWPPTDA
PVSPTTLYVE LLDGSSRLSE	DISEPPLHDF AEFEVLKAFV	YCSRLLDLVF
Виллебранда		1301	VDMMERLRIS	QKWVRVAWE	YHDGSHAYIG
			LKDRKRPSEL	RRIASQVKYA
		1351	GSQVASTSEV	LKYTLFQIFS	KIDRPEASRI
			ALLLMASQEP	QRMSRNFVRY
		1401	VQGLKKKKVI	VIPVGIGPHA	NLKQIRLIEK
			QAPENKAFVL	SSVDELEQQR
		1451	DEIVSYLCDL 1479	APEAPPPTLP	PDMAQVTVG

1480	GLLGVSTLGP	KRNSMVLDVA	P
1501	FVLEGSDKIG GQDSIHVTVL	EADFNRSKEF QYSYMVTVEY	MEEVIQRMDV
1551	PFSEAQSKGD ALRYLSDHSF 1600	ILQRVREIRY LVSQGDREQA	QGGNRTNTGL
1601	PNLVYMVTGN GPNANVQELE	PASDEIKRLP RIGWPNAPIL	GDIQWPIGV
1651	IQDFETLPRE SPAPDCSQPL	APDLVLQRCC DVILLLDGSS	SGEGLQIPTL
1701	SFPASYFDEM SVLQYGSITT	KSFAKAFISK IDVPWNWPE	ANIGPRLTQV
1751	KAHLLSLVDV LTSEMHGARP	MQREGGPSQI GASKAWILV	GDALGFAVRY
1801	TDVSVDSVDA YDAAQLRILA	AADAARSNRV GPAGDSNWK	TVFPIGIGDR
1851	LQRIEDLPTM DEDGNEKRPG	VTLGNSFLHK DVWTLPDQCH	LCSGFVRICM
1901	TVTCQPDGQT QSPVKVEETC	LLKSHRVNCD GCRWTCPCVC	RGLRPSCPNS
1951	TGSSTRHIVT EQDLEVILHN	FDGQNFKLTG GACSPGARQG	SCSYVLFQNK
2001	CMKSIEVKHS VPYVGGNMEV	ALSVEXHSDM NVYGAIMHEV	EVTVNGRLVS
2051	RFNHLGHIFT TYGLCGICDE	FTPQNNEFQL NGANDFMLRD	QLSPKTFASK
2101	GTVTTDWKTL CLVPDSSHCQ	VQEWTVQRPG VLLLPLFAEC	QTCQPILEEQ
2151	HKVLAPATFY AHLCRTNGVC	AICQQDSCHQ VDWRTPDFCA	EQVCEVIASY
2201	MSCPPSLVYN PSEGCFCPPD	HCEHGCPRHC KVMLEGSCVP	DGNVSSCGDH

- 39 042955

	2251 EEACTQCIGE DGVQHQFLEA WVPDHQPCQI CTCLSGRKVN CTTQPCPTAK 2301 APTCGLCEVA RLRQNADQCC PEYECVCDPV SCDLPPVPHC ERGLQPTLTN 2351 PGECRPNFTC ACRKEECKRV SPPSCPPHRL PTLRKTQCCD EYECACNCVN 2401 STVSCPLGYL ASTATNDCGC TTTTCLPDKV CVHRSTIYPV GQFWEEGCDV 2451 CTCTDMEDAV MGLRVAQCSQ KPCEDSCRSG FTYVLHEGEC CGRCLPSACE 2501 WTGSPRGDS QSSWKSVGSQ WASPENPCLI NECVRVKEEV FIQQRNVSCP 2551 QLEVPVCPSG FQLSCKTSAC CPSCRCERME ACMLNGTVIG PGKTVMIDVC 2601 TTCRCMVQVG VISGFKLECR KTTCNPCPLG YKEENNTGEC CGRCLPTACT 2651 IQLRGGQIMT LKRDETLQDG CDTHFCKVNE RGEYFWEKRV TGCPPFDEHK 2701 CLAEGGKIMK IPGTCCDTCE EPECNDITAR LQYVKVGSCK SEVEVDIHYC 2751 QGKCASKAMY SIDINDVQDQ CSCCSPTRTE PMQVALHCTN GSWYHEVLN 2801 AMECKCSPRK CSK
	Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 1)
Полноразмерный VWF	1 ATGATTCCTG CCAGATTTGC CGGGGTGCTG CTTGCTCTGG CCCTCATTTT 51 GCCAGGGACC CTTTGTGCAG AAGGAACTCG CGGCAGGTCA TCCACGGCCC 101 GATGCAGCCT TTTCGGAAGT GACTTCGTCA ACACCTTTGA TGGGAGCATG 151 TACAGCTTTG CGGGATACTG CAGTTACCTC CTGGCAGGGG GCTGCCAGAA 201 ACGCTCCTTC TCGATTATTG GGGACTTCCA GAATGGCAAG AGAGTGAGCC 251 TCTCCGTGTA TCTTGGGGAA TTTTTTGACA TCCATTTGTT TGTCAATGGT 301 ACCGTGACAC AGGGGGACCA AAGAGTCTCC ATGCCCTATG CCTCCAAAGG 351 GCTGTATCTA GAAACTGAGG CTGGGTACTA CAAGCTGTCC GGTGAGGCCT 401 ATGGCTTTGT GGCCAGGATC GATGGCAGCG GCAACTTTCA AGTCCTGCTG 4 51 T CAGACAGAT AC T T CAACAA GACCTGCGGG CTGTGTGGCA ACTTTAACAT 501 CTTTGCTGAA GATGACTTTA TGACCCAAGA AGGGACCTTG ACCTCGGACC 551 CTTATGACTT TGCCAACTCA TGGGCTCTGA GCAGTGGAGA ACAGTGGTGT 601 GAACGGGCAT CTCCTCCCAG CAGCTCATGC AACATCTCCT CTGGGGAAAT

- 40 042955

651 GCAGAAGGGC CTGTGGGAGC AGTGCCAGCT TCTGAAGAGC ACCTCGGTGT 701 TTGCCCGCTG CCACCCTCTG GTGGACCCCG AGCCTTTTGT GGCCCTGTGT 751 GAGAAGACTT TGTGTGAGTG TGCTGGGGGG CTGGAGTGCG CCTGCCCTGC 801 CCTCCTGGAG TACGCCCGGA CCTGTGCCCA GGAGGGAATG GTGCTGTACG 851 GCTGGACCGA CCACAGCGCG TGCAGCCCAG TGTGCCCTGC TGGTATGGAG 901 TATAGGCAGT GTGTGTCCCC TTGCGCCAGG ACCTGCCAGA GCCTGCACAT 951 CAATGAAATG TGTCAGGAGC GATGCGTGGA TGGCTGCAGC TGCCCTGAGG 1001 GACAGCTCCT GGATGAAGGC CTCTGCGTGG AGAGCACCGA GTGTCCCTGC 1051 GTGCATTCCG GAAAGCGCTA CCCTCCCGGC ACCTCCCTCT CTCGAGACTG 1101 CAACACCTGC ATTTGCCGAA ACAGCCAGTG GATCTGCAGC AATGAAGAAT 1151 GTCCAGGGGA GTGCCTTGTC ACTGGTCAAT CCCACTTCAA GAGCTTTGAC 1201 AACAGATACT TCACCTTCAG TGGGATCTGC CAGTACCTGC TGGCCCGGGA 1251 TTGCCAGGAC CACTCCTTCT CCATTGTCAT TGAGACTGTC CAGTGTGCTG 1301 ATGACCGCGA CGCTGTGTGC ACCCGCTCCG TCACCGTCCG GCTGCCTGGC 1351 CTGCACAACA GCCTTGTGAA ACTGAAGCAT GGGGCAGGAG TTGCCATGGA 1401 TGGCCAGGAC ATCCAGCTCC CCCTCCTGAA AGGTGACCTC CGCATCCAGC 1451 ATACAGTGAC GGCCTCCGTG CGCCTCAGCT ACGGGGAGGA CCTGCAGATG 1501 GACTGGGATG GCCGCGGGAG GCTGCTGGTG AAGCTGTCCC CCGTCTATGC 1551 CGGGAAGACC TGCGGCCTGT GTGGGAATTA CAATGGCAAC CAGGGCGACG 1601 ACTTCCTTAC CCCCTCTGGG CTGGCRGAGC CCCGGGTGGA GGACTTCGGG 1651 AACGCCTGGA AGCTGCACGG GGACTGCCAG GACCTGCAGA AGCAGCACAG 1701 CGATCCCTGC GCCCTCAACC CGCGCATGAC CAGGTTCTCC GAGGAGGCGT 1751 GCGCGGTCCT GACGTCCCCC ACATTCGAGG CCTGCCATCG TGCCGTCAGC 1801 CCGCTGCCCT ACCTGCGGAA CTGCCGCTAC GACGTGTGCT CCTGCTCGGA 1851 CGGCCGCGAG TGCCTGTGCG GCGCCCTGGC CAGCTATGCC GCGGCCTGCG 1901 CGGGGAGAGG CGTGCGCGTC GCGTGGCGCG AGCCAGGCCG CTGTGAGCTG

- 41 042955

1951 AACTGCCCGA AAGGCCAGGT GTACCTGCAG TGCGGGACCC CCTGCAACCT 2001 GACCTGCCGC TCTCTCTCTT ACCCGGATGA GGAATGCAAT GAGGCCTGCC 2051 TGGAGGGCTG CTTCTGCCCC CCAGGGCTCT ACATGGATGA GAGGGGGGAC 2101 TGCGTGCCCA AGGCCCAGTG CCCCTGTTAC TATGACGGTG AGATCTTCCA 2151 GCCAGAAGAC ATCTTCTCAG ACCATCACAC CATGTGCTAC TGTGAGGATG 2201 GCTTCATGCA CTGTACCATG AGTGGAGTCC CCGGAAGCTT GCTGCCTGAC 2251 GCTGTCCTCA GCAGTCCCCT GTCTCATCGC AGCAAAAGGA GCCTATCCTG 2301 TCGGCCCCCC ATGGTCAAGC TGGTGTGTCC CGCTGACAAC CTGCGGGCTG 2351 AAGGGCTCGA GTGTACCAAA ACGTGCCAGA ACTATGACCT GGAGTGCATG 2401 AGCATGGGCT GTGTCTCTGG CTGCCTCTGC CCCCCGGGCA TGGTCCGGCA 2451 TGAGAACAGA TGTGTGGCCC TGGAAAGGTG TCCCTGCTTC CATCAGGGCA 2501 AGGAGTATGC CCCTGGAGAA ACAGTGAAGA TTGGCTGCAA CACTTGTGTC 2551 TGTCGGGACC GGAAGTGGAA CTGCACAGAC CATGTGTGTG ATGCCACGTG 2601 CTCCACGATC GGCATGGCCC ACTACCTCAC CTTCGACGGG CTCAAATACC 2651 TGTTCCCCGG GGAGTGCCAG TACGTTCTGG TGCAGGATTA CTGCGGCAGT 2701 AACCCTGGGA CCTTTCGGAT CCTAGTGGGG AATAAGGGAT GCAGCCACCC 2751 CTCAGTGAAA TGCAAGAAAC GGGTCACCAT CCTGGTGGAG GGAGGAGAGA 2801 TTGAGCTGTT TGACGGGGAG GTGAATGTGA AGAGGCCCAT GAAGGATGAG 2851 ACTCACTTTG AGGTGGTGGA GTCTGGCCGG TACATCATTC TGCTGCTGGG 2901 CAAAGCCCTC TCCGTGGTCT GGGACCGCCA CCTGAGCATC TCCGTGGTCC 2951 TGAAGCAGAC ATACCAGGAG AAAGTGTGTG GCCTGTGTGG GAATTTTGAT 3001 GGCATCCAGA ACAATGACCT CACCAGCAGC AACCTCCAAG TGGAGGAAGA 3051 CCCTGTGGAC TTTGGGAACT CCTGGAAAGT GAGCTCGCAG TGTGCTGACA 3101 CCAGAAAAGT GCCTCTGGAC TCATCCCCTG CCACCTGCCA TAACAACATC 3151 ATGAAGCAGA CGATGGTGGA TTCCTCCTGT AGAATCCTTA CCAGTGACGT 3201 CTTCCAGGAC TGCAACAAGC TGGTGGACCC CGAGCCATAT CTGGATGTCT

- 42 042955

3251 GCATTTACGA CACCTGCTCC TGTGAGTCCA TTGGGGACTG CGCCTGCTTC 3301 TGCGACACCA TTGCTGCCTA TGCCCACGTG TGTGCCCAGC ATGGCAAGGT 3351 GGTGACCTGG AGGACGGCCA CATTGTGCCC CCAGAGCTGC GAGGAGAGGA 3401 ATCTCCGGGA GAACGGGTAT GAGTGTGAGT GGCGCTATAA CAGCTGTGCA 3451 CCTGCCTGTC AAGTCACGTG TCAGCACCCT GAGCCACTGG CCTGCCCTGT 3501 GCAGTGTGTG GAGGGCTGCC ATGCCCACTG CCCTCCAGGG AAAATCCTGG 3551 ATGAGCTTTT GCAGACCTGC GTTGACCCTG AAGACTGTCC AGTGTGTGAG 3601 GTGGCTGGCC GGCGTTTTGC CTCAGGAAAG AAAGTCACCT TGAATCCCAG 3651 TGACCCTGAG CACTGCCAGA TTTGCCACTG TGATGTTGTC AACCTCACCT 3701 GTGAAGCCTG CCAGGAGCCG GGAGGCCTGG TGGTGCCTCC CACAGATGCC 3751 CCGGTGAGCC CCACCACTCT GTATGTGGAG GACATCTCGG AACCGCCGTT 3801 GCACGATTTC TACTGCAGCA GGCTACTGGA CCTGGTCTTC CTGCTGGATG 3851 GCTCCTCCAG GCTGTCCGAG GCTGAGTTTG AAGTGCTGAA GGCCTTTGTG 3901 GTGGACATGA TGGAGCGGCT GCGCATCTCC CAGAAGTGGG TCCGCGTGGC 3951 CGTGGTGGAG TACCACGACG GCTCCCACGC CTACATCGGG CTCAAGGACC 4001 GGAAGCGACC GTCAGAGCTG CGGCGCATTG CCAGCCAGGT GAAGTATGCG 4051 GGCAGCCAGG TGGCCTCCAC CAGCGAGGTC TTGAAATACA CACTGTTCCA 4101 AATCTTCAGC AAGATCGACC GCCCTGAAGC CTCCCGCATC GCCCTGCTCC 4151 TGATGGCCAG CCAGGAGCCG CAACGGATGT CCCGGAACTT TGTCCGCTAC 4201 GTCCAGGGCC TGAAGAAGAA GAAGGTCATT GTGATCCCGG TGGGCATTGG 4251 GCCCCATGCC AACCTCAAGC AGATCCGCCT CATCGAGAAG CAGGCCCCTG 4301 AGAACAAGGC CTTCGTGCTG AGCAGTGTGG ATGAGCTGGA GCAGCAAAGG 4351 GACGAGATCG TTAGCTACCT CTGTGACCTT GCCCCTGAAG CCCCTCCTCC 4401 TACTCTGCCC CCCGACATGG CACAAGTCAC TGTGGGCCCG GGGCTCTTGG 4451 GGGTTTCGAC CCTGGGGCCC AAGAGGAACT CCATGGTTCT GGATGTGGCG 4501 TTCGTCCTGG AAGGATCGGA CAAAATTGGT GAAGCCGACT TCAACAGGAG

- 43 042955

4551 CAAGGAGTTC ATGGAGGAGG TGATTCAGCG GATGGATGTG GGCCAGGACA 4601 GCATCCACGT CACGGTGCTG CAGTACTCCT ACATGGTGAC CGTGGAGTAC 4651 CCCTTCAGCG AGGCACAGTC CAAAGGGGAC ATCCTGCAGC GGGTGCGAGA 4701 GATCCGCTAC CAGGGCGGCA ACAGGACCAA CACTGGGCTG GCCCTGCGGT 4751 ACCTCTCTGA CCACAGCTTC TTGGTCAGCC AGGGTGACCG GGAGCAGGCG 4801 CCCAACCTGG TCTACATGGT CACCGGAAAT CCTGCCTCTG ATGAGATCAA 4851 GAGGCTGCCT GGAGACATCC AGGTGGTGCC CATTGGAGTG GGCCCTAATG 4901 CCAACGTGCA GGAGCTGGAG AGGATTGGCT GGCCCAATGC CCCTATCCTC 4951 ATCCAGGACT TTGAGACGCT CCCCCGAGAG GCTCCTGACC TGGTGCTGCA 5001 GAGGTGCTGC TCCGGAGAGG GGCTGCAGAT CCCCACCCTC TCCCCTGCAC 5051 CTGACTGCAG CCAGCCCCTG GACGTGATCC TTCTCCTGGA TGGCTCCTCC 5101 AGTTTCCCAG CTTCTTATTT TGATGAAATG AAGAGTTTCG CCAAGGCTTT 5151 CATTTCAAAA GCCAATATAG GGCCTCGTCT CACTCAGGTG TCAGTGCTGC 5201 AGTATGGAAG CATCACCACC ATTGACGTGC CATGGAACGT GGTCCCGGAG 5251 AAAGCCCATT TGCTGAGCCT TGTGGACGTC ATGCAGCGGG AGGGAGGCCC 5301 CAGCCAAATC GGGGATGCCT TGGGCTTTGC TGTGCGATAC TTGACTTCAG 5351 AAATGCATGG TGCCAGGCCG GGAGCCTCAA AGGCGGTGGT CATCCTGGTC 5401 ACGGACGTCT CTGTGGATTC AGTGGATGCA GCAGCTGATG CCGCCAGGTC 5451 CAACAGAGTG ACAGTGTTCC CTATTGGAAT TGGAGATCGC TACGATGCAG 5501 CCCAGCTACG GATCTTGGCA GGCCCAGCAG GCGACTCCAA CGTGGTGAAG 5551 CTCCAGCGAA TCGAAGACCT CCCTACCATG GTCACCTTGG GCAATTCCTT 5601 CCTCCACAAA CTGTGCTCTG GATTTGTTAG GATTTGCATG GATGAGGATG 5651 GGAATGAGAA GAGGCCCGGG GACGTCTGGA CCTTGCCAGA CCAGTGCCAC 5701 ACCGTGACTT GCCAGCCAGA TGGCCAGACC TTGCTGAAGA GTCATCGGGT 5751 CAACTGTGAC CGGGGGCTGA GGCCTTCGTG CCCTAACAGC CAGTCCCCTG 5801 TTAAAGTGGA AGAGACCTGT GGCTGCCGCT GGACCTGCCC CTGYGTGTGC

- 44 042955

5851 ACAGGCAGCT CCACTCGGCA CATCGTGACC TTTGATGGGC AGAATTTCAA 5901 GCTGACTGGC AGCTGTTCTT ATGTCCTATT TCAAAACAAG GAGCAGGACC 5951 TGGAGGTGAT TCTCCATAAT GGTGCCTGCA GCCCTGGAGC AAGGCAGGGC 6001 TGCATGAAAT CCATCGAGGT GAAGCACAGT GCCCTCTCCG TCGAGSTGCA 6051 CAGTGACATG GAGGTGACGG TGAATGGGAG ACTGGTCTCT GTTCCTTACG 6101 TGGGTGGGAA CATGGAAGTC AACGTTTATG GTGCCATCAT GCATGAGGTC 6151 AGATTCAATC ACCTTGGTCA CATCTTCACA TTCACTCCAC AAAACAATGA 6201 GTTCCAACTG CAGCTCAGCC CCAAGACTTT TGCTTCAAAG ACGTATGGTC 6251 TGTGTGGGAT CTGTGATGAG AACGGAGCCA ATGACTTCAT GCTGAGGGAT 6301 GGCACAGTCA CCACAGACTG GAAAACACTT GTTCAGGAAT GGACTGTGCA 6351 GCGGCCAGGG CAGACGTGCC AGCCCATCCT GGAGGAGCAG TGTCTTGTCC 6401 CCGACAGCTC CCACTGCCAG GTCCTCCTCT TACCACTGTT TGCTGAATGC 6451 CACAAGGTCC TGGCTCCAGC CACATTCTAT GCCATCTGCC AGCAGGACAG 6501 TTGCCACCAG GAGCAAGTGT GTGAGGTGAT CGCCTCTTAT GCCCACCTCT 6551 GTCGGACCAA CGGGGTCTGC GTTGACTGGA GGACACCTGA TTTCTGTGCT 6601 ATGTCATGCC CACCATCTCT GGTCTACAAC CACTGTGAGC ATGGCTGTCC 6651 CCGGCACTGT GATGGCAACG TGAGCTCCTG TGGGGACCAT CCCTCCGAAG 6701 GCTGTTTCTG CCCTCCAGAT AAAGTCATGT TGGAAGGCAG CTGTGTCCCT 6751 GAAGAGGCCT GCACTCAGTG CATTGGTGAG GATGGAGTCC AGCACCAGTT 6801 CCTGGAAGCC TGGGTCCCGG ACCACCAGCC CTGTCAGATC TGCACATGCC 6851 TCAGCGGGCG GAAGGTCAAC TGCACAACGC AGCCCTGCCC CACGGCCAAA 6901 GCTCCCACGT GTGGCCTGTG TGAAGTAGCC CGCCTCCGCC AGAATGCAGA 6951 CCAGTGCTGC CCCGAGTATG AGTGTGTGTG TGACCCAGTG AGCTGTGACC 7001 TGCCCCCAGT GCCTCACTGT GAACGTGGCC TCCAGCCCAC ACTGACCAAC 7051 CCTGGCGAGT GCAGACCCAA CTTCACCTGC GCCTGCAGGA AGGAGGAGTG 7101 CAAAAGAGTG TCCCCACCCT CCTGCCCCCC GCACCGTTTG CCCACCCTTC

- 45 042955

7151 GGAAGACCCA GTGCTGTGAT GAGTATGAGT GTGCCTGCAA CTGTGTCAAC 7201 TCCACAGTGA GCTGTCCCCT TGGGTACTTG GCCTCAACCG CCACCAATGA 7251 CTGTGGCTGT АССАСААССА CCTGCCTTCC CGACAAGGTG TGTGTCCACC 7301 GAAGCACCAT CTACCCTGTG GGCCAGTTCT GGGAGGAGGG CTGCGATGTG 7351 TGCACCTGCA CCGACATGGA GGATGCCGTG ATGGGCCTCC GCGTGGCCCA 7401 GTGCTCCCAG AAGCCCTGTG AGGACAGCTG TCGGTCGGGC TTCACTTACG 7451 TTCTGCATGA AGGCGAGTGC TGTGGAAGGT GCCTGCCATC TGCCTGTGAG 7501 GTGGTGACTG GCTCACCGCG GGGGGACTCC CAGTCTTCCT GGAAGAGTGT 7551 CGGCTCCCAG TGGGCCTCCC CGGAGAACCC CTGCCTCATC AATGAGTGTG 7601 TCCGAGTGAA GGAGGAGGTC ТТТАТАСААС AAAGGAACGT CTCCTGCCCC 7651 CAGCTGGAGG TCCCTGTCTG CCCCTCGGGC TTTCAGCTGA GCTGTAAGAC 7701 CTCAGCGTGC TGCCCAAGCT GTCGCTGTGA GCGCATGGAG GCCTGCATGC 7751 TCAATGGCAC TGTCATTGGG CCCGGGAAGA CTGTGATGAT CGATGTGTGC 7801 ACGACCTGCC GCTGCATGGT GCAGGTGGGG GTCATCTCTG GATTCAAGCT 7851 GGAGTGCAGG AAGACCACCT GCAACCCCTG CCCCCTGGGT TACAAGGAAG 7901 ААААТААСАС AGGTGAATGT TGTGGGAGAT GTTTGCCTAC GGCTTGCACC 7951 ATTCAGCTAA GAGGAGGACA GATCATGACA CTGAAGCGTG ATGAGACGCT 8001 CCAGGATGGC TGTGATACTC ACTTCTGCAA GGTCAATGAG AGAGGAGAGT 8051 ACTTCTGGGA GAAGAGGGTC ACAGGCTGCC CACCCTTTGA TGAACACAAG 8101 TGTCTTGCTG AGGGAGGTAA AATTATGAAA ATTCCAGGCA CCTGCTGTGA 8151 CACATGTGAG GAGCCTGAGT GCAACGACAT CACTGCCAGG CTGCAGTATG 8201 TCAAGGTGGG AAGCTGTAAG TCTGAAGTAG AGGTGGATAT CCACTACTGC 8251 CAGGGCAAAT GTGCCAGCAA AGCCATGTAC TCCATTGACA TCAACGATGT 8301 GCAGGACCAG TGCTCCTGCT GCTCTCCGAC ACGGACGGAG CCCATGCAGG 8351 TGGCCCTGCA CTGCACCAAT GGCTCTGTTG TGTACCATGA GGTTCTCAAT 8401 GCCATGGAGT GCAAATGCTC CCCCAGGAAG TGCAGCAAGT GA

В настоящем описании VWFфрагмент фактора фон Виллебранда может представлять собой VWFфрагмент фактора фон Виллебранда, содержащий домен D' и домен VWFD3 фактора фон Виллебранда, при этом указанный VWFфрагмент фактора фон Виллебранда связывается с фактором VIII (FVIII) и ингибирует связывание VWFэндогенного фактора фон Виллебранда (полноразмерного VWF) с FVIII. VWFФрагмент фактора фон Виллебранда, содержащий домен D' и домен D3, может дополнительно содержать домен VWF, выбранный из группы, состоящей из домена А1, домена А2, домена A3, домена D1, домена D2, домена D4, домена В1, домена В2, домена B3, домена С1, домена С2, домена CK, их одного или более фрагментов и их любых комбинаций. В одном из вариантов реализации VWFфрагмент фактора фон Виллебранда содержит, по существу состоит из или состоит из (1) доменов D' и VWFD3 фактора фон Виллебранда или их фрагментов;

(2) доменов D1, D' и VWFD3 фактора фон Виллебранда или их фрагментов;

(3) доменов D2, D' и VWFD3 фактора фон Виллебранда или их фрагментов;

(4) доменов D1, D2, D' и VWFD3 фактора фон Виллебранда или их фрагментов; или (5) доменов D1, D2, D', D3 и VWFA1 фактора фон Виллебранда или их фрагментов.

- 46 042955

VWFфрагмент фактора фон Виллебранда, описанный в настоящем документе, не содержит сайт связывания с рецептором, ответственным за клиренс VWF. В другом варианте реализации VWFфрагмент фактора фон Виллебранда, описанный в настоящем документе, не соответствует аминокислотам с 764 по 1274 последовательности SEQ ID NO: 2. VWFфрагмент фактора фон Виллебранда согласно настоящему изобретению может содержать любые другие последовательности, связанные или слитые с VWFфрагментом фактора фон Виллебранда. Например, VWFфрагмент фактора фон Виллебранда, описанный в настоящем документе, может дополнительно содержать сигнальный пептид. В одном из вариантов реализации VWFфрагмент фактора фон Виллебранда связывается или ассоциирует с белком FVIII. Путем связывания или ассоциации с белком FVIII VWFфрагмент фактора фон Виллебранда согласно настоящему изобретению защищает FVIII от расщепления протеазами и активации FVIII, стабилизирует тяжелую цепь и легкую цепь FVIII, и предотвращает клиренс FVIII фагоцитарными рецепторами. В другом варианте реализации VWFфрагмент фактора фон Виллебранда связывается или ассоциирует с белком FVIII и блокирует или предотвращает связывание белка FVIII к фосфолипидом и активированным протеином С. Путем предотвращения или ингибирования связывания белка FVIII с эндогенным полноразмерным VWF, VWFфрагмент фактора фон Виллебранда согласно настоящему изобретению снижает клиренс FVIII рецепторами, ответственными за клиренс VWF, и таким образом увеличивает период полувыведения белка FVIII. Таким образом, в одном из вариантов реализации увеличение периода полувыведения белка FVIII обусловлено связыванием или ассоциацией VWFфрагмента фактора фон Виллебранда, в котором отсутствует сайт связывания с рецептором, ответственным за клиренс VWF, с белком FVIII и ограждением или защитой белка FVIII VWFфрагментом фактора фон Виллебранда от VWFэндогенного фактора фон Виллебранда, который содержит сайт связывания с рецептором, ответственным за клиренс VWF. Белок FVIII, связанный с или защищенный VWFфрагментом фактора фон Виллебранда, также может обеспечивать рециркуляцию белка FVIII. За счет устранения сайтов связывания с рецептором, ответственным за клиренс VWF, содержащихся в полноразмерной молекуле VWF, гетеродимеры FVIII/VWF согласно настоящему изобретению защищены от пути клиренса VWF, что также увеличивает период полувыведения FVIII.

В одном из вариантов реализации VWFфрагмент фактора фон Виллебранда согласно настоящему изобретению содержит домен D' и домен VWFD3 фактора фон Виллебранда, при этом домен D' по меньшей мере на 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичен аминокислотам с 764 по 866 последовательности SEQ ID NO: 2, при этом VWFфрагмент фактора фон Виллебранда предотвращает связывание VWFэндогенного фактора фон Виллебранда с FVIII. В другом варианте реализации VWFфрагмент фактора фон Виллебранда содержит домен D' и домен VWFD3 фактора фон Виллебранда, при этом домен D3 по меньшей мере на 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичен аминокислотам с 867 по 1240 последовательности SEQ ID NO: 2, при этом VWFфрагмент фактора фон Виллебранда предотвращает связывание VWFэндогенного фактора фон Виллебранда с FVIII. В некоторых вариантах реализации VWFфрагмент фактора фон Виллебранда, описанный в настоящем документе, содержит, по существу состоит из или состоит из домена D' и домена VWFD3 фактора фон Виллебранда, которые по меньшей мере на 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичны аминокислотам с 764 по 1240 последовательности SEQ ID NO: 2, при этом VWFфрагмент фактора фон Виллебранда предотвращает связывание VWFэндогенного фактора фон Виллебранда с FVIII. В других вариантах реализации VWFфрагмент фактора фон Виллебранда содержит, по существу состоит из или состоит из доменов D1, D2, D' и D3, по меньшей мере на 6θ, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичных аминокислотам с 23 по 1240 последовательности SEQ ID NO: 2, при этом VWFфрагмент фактора фон Виллебранда предотвращает связывание VWFэндогенного фактора фон Виллебранда с FVIII. В других вариантах реализации VWFфрагмент фактора фон Виллебранда содержит также сигнальный пептид, функционально связанный с ним.

В некоторых вариантах реализации VWFфрагмент фактора фон Виллебранда согласно настоящему изобретению по существу состоит из или состоит из (1) домена D'D3, домена D1D'D3, домена D2D'D3 или домена D1D2D'D3; и (2) дополнительной последовательности VWF до примерно 10 аминокислот (например, любые последовательности от аминокислот с 764 по 1240 SEQ ID NO: 2 до аминокислот с 764 по 1250 SEQ ID NO: 2), до примерно 15 аминокислот (например, любые последовательности от аминокислот с 764 по 1240 SEQ ID NO: 2 до аминокислот с 764 по 1255 SEQ ID NO: 2), до примерно 20 аминокислот (например, любые последовательности от аминокислот с 764 по 1240 SEQ ID NO: 2 до аминокислот с 764 по 1260 SEQ ID NO: 2), до примерно 25 аминокислот (например, любые последовательности от аминокислот с 764 по 1240 SEQ ID NO: 2 до аминокислот с 764 по 1265 SEQ ID NO: 2) или до примерно 30 аминокислот (например, любые последовательности от аминокислот с 764 по 1240 SEQ ID NO: 2 до аминокислот с 764 по 1260 SEQ ID NO: 2).

В конкретном варианте реализации VWFфрагмент фактора фон Виллебранда, содержащий или по существу состоящий из домена D' и домена D3, не представляет собой ни аминокислоты с 764 по 1274 последовательности SEQ ID NO: 2, ни полноразмерный зрелый VWF. В некоторых вариантах реализации домен D1D2 экспрессирован в транс-положении с доменом D'D3. В некоторых вариантах реализации

- 47 042955 домен D1D2 экспрессирован в цис-положении с доменом D'D3.

В других вариантах реализации VWFфрагмент фактора фон Виллебранда, содержащий домены

D'D3, связанные с доменами D1D2, содержит также сайт внутриклеточного расщепления, например (сайт расщепления PACE (фурином) или РС5), что обеспечивает отщепление доменов D1D2 от доменов D'D3 после экспрессии. Неограничивающие примеры сайта внутриклеточного расщепления описаны в иных местах настоящего документа.

В других вариантах реализации VWFфрагмент фактора фон Виллебранда содержит домен D' и домен D3, но не содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (1) аминокислот с 1241 по 2813 SEQ ID NO (2) аминокислот с 1270 по 2813 SEQ ID NO (3) аминокислот с 1271 по 2813 SEQ ID NO (4) аминокислот с 1272 по 2813 SEQ ID NO (5) аминокислот с 1273 по 2813 SEQ ID NO (6) аминокислот с 1274 по 2813 SEQ ID NO

2;

2;

2;

2;

2;

и их любых комбинаций.

В других вариантах реализации VWFфрагмент фактора фон Виллебранда согласно настоящему изобретению содержит, по существу состоит из или состоит из аминокислотной последовательности, соответствующей домену D', домену D3 и домену А1, при этом указанная аминокислотная последовательность по меньшей мере на 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична аминокислотам с 764 по 1479 последовательности SEQ ID NO: 2, при этом указанный VWFфрагмент фактора фон Виллебранда предотвращает связывание VWFэндогенного фактора фон Виллебранда с FVIII. В конкретном варианте реализации VWFфрагмент фактора фон Виллебранда не соответствует аминокислотам с 764 по 1274 последовательности SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах реализации VWFфрагмент фактора фон Виллебранда согласно настоящему изобретению содержит домен D' и домен D3, но не содержит по меньшей мере один домен VWF, выбранный из группы, состоящей из (1) домена А1;

(2) домена А2;

(3) домена A3;

(4) домена D4;

(5) домена В1;

(6) домена В2;

(7) домена B3;

(8) домена С1;

(9) домена С2;

(10) домена CK;

(11) домена СК и домена С2;

(12) домена CK, домена С2 и домена С1;

(13) домена CK, домена С2, домена С1, домена B3;

(14) домена CK, домена С2, домена С1, домена B3, домена В2;

(15) домена CK, домена С2, домена С1, домена B3, домена В2 и домена В1;

(16) домена CK, домена С2, домена С1, домена B3, домена В2, домена В1 и домена D4;

(17) домена CK, домена С2, домена С1, домена B3, домена В2, домена В1, домена D4 и домена A3;

(18) домена CK, домена С2, домена С1, домена B3, домена В2, домена В1, домена D4, домена A3 и домена А2;

(19) домена CK, домена С2, домена С1, домена B3, домена В2, домена В1, домена D4, домена A3, домена А2 и домена А1; и (20) их любых комбинаций.

В других вариантах реализации VWFфрагмент фактора фон Виллебранда содержит домены D'D3 и один или более доменов или модулей. Примеры таких доменов или модулей включают, но не ограничиваются перечисленными, домены и модули, описанные в Zhour et al., Blood, опубликованном в интернете 6 апреля 2012 г., DOI: 10.1182/blood-2012-01-405134. Например, VWFфрагмент фактора фон Виллебранда может содержать домен D'D3 и один или более доменов или модулей, выбранных из группы, состоящей из домена А1, домена А2, домена A3, модуля D4N, модуля VWD4, модуля С8-4, модуля TIL-4, модуля С1, модуля С2, модуля С3, модуля С4, модуля С5, модуля С5, модуля С6 и их любых комбинаций. В других вариантах реализации VWFфрагмент фактора фон Виллебранда связан с гетерологичным фрагментом, при этом указанный гетерологичный фрагмент связан с N-концом или С-концом VWFфрагмента фактора фон Виллебранда, или встроен непосредственно ниже одной или более аминокислот (например, один или более сайтов встраивания XTEN) в белке FVIII во фрагменте VWF. Например, сайты встраивания для гетерологичного фрагмента во фрагменте VWF могут находиться в домене D', домене D3 или обоих. Гетерологичный фрагмент может представлять собой увеличитель периода полувыведе ния.

В некоторых вариантах реализации VWFфрагмент фактора фон Виллебранда согласно настоящему изобретению образует мультимер, например димер, тример, тетрамер, пентамер, гексамер, гептамер или

- 48 042955 мультимеры более высокого порядка. В других вариантах реализации VWFфрагмент фактора фон Виллебранда представляет собой мономер, содержащий только один VWFфрагмент фактора фон Виллебранда. В некоторых вариантах реализации VWFфрагмент фактора фон Виллебранда согласно настоящему изобретению может содержать одну или более замен, делеций, присоединений или модификаций аминокислот. В одном из вариантов реализации VWFфрагмент фактора фон Виллебранда может содержать замены, делеций, присоединения или модификации аминокислот, в результате чего VWFфрагмент фактора фон Виллебранда не способен образовывать дисульфидную связь или образовывать димер или мультимер. В другом варианте реализации замена аминокислоты находится в пределах домена D' и домена D3. В конкретном варианте реализации VWFфрагмент фактора фон Виллебранда согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере одну замену аминокислоты в остатке, соответствующем остатку 1099, остатку 1142 или как остатку 1099, так и остатку 1142 последовательности SEQ ID NO: 2. Указанная по меньшей мере одна замена аминокислоты может представлять собой любые аминокислоты, которые не встречаются в природе в VWF дикого типа. Например, замена аминокислоты может представлять собой любые аминокислоты, отличные от цистеина, например изолейцин, аланин, лейцин, аспарагин, лизин, аспарагиновую кислоту, метионин, фенилаланин, глутаминовую кислоту, треонин, глутамин, триптофан, глицин, валин, пролин, серин, тирозин, аргинин или гистидин. В другом примере замена аминокислоты включает одну или более аминокислот, которые предотвращают или ингибируют образование фрагментами VWF мультимеров. В некоторых вариантах реализации VWFфрагмент фактора фон Виллебранда, подходящий для настоящего изобретения, может быть дополнительно модифицирован для улучшения взаимодействия с FVIII, например, для повышения аффинности связывания в отношении FVIII. В качестве неограничивающего примера, VWFфрагмент фактора фон Виллебранда содержит остаток серина в остатке, соответствующем аминокислоте 764 последовательности SEQ ID NO: 2, и остаток лизина в остатке, соответствующем аминокислоте 773 последовательности SEQ ID NO: 2. Остатки 764 и/или 773 могут вносить вклад в аффинность связывания VWFфрагментов фактора фон Виллебранда в отношении FVIII. В других вариантах реализации фрагменты VWF, подходящие для настоящего изобретения, могут содержать другие модификации, например белок может быть пегилирован, гликозилирован, гэкилирован (модифицирован ГЭК) или полисиалилирован.

В) Последовательности XTEN.

В настоящем описании термин последовательность XTEN относится к полипептидам увеличенной длины с не встречающимися в природе, по существу не повторяющимися последовательностями, которые главным образом состоят из малых гидрофильных аминокислот, при этом последовательность имеет низкий уровень или не имеет вторичной или третичной структуры в физиологических условиях. В качестве партнера химерного белка, XTEN могут служить в качестве носителя, придавая определенные желаемые фармакокинетические, физико-химические и фармацевтические свойства при связывании с VWFфрагментом фактора фон Виллебранда или последовательностью FVIII согласно настоящему изобретению с образованием химерного белка. Такие желаемые свойства включают, но не ограничиваются перечисленными: улучшенные фармакокинетические параметры и характеристики растворимости. В настоящем описании термин XTEN, в частности, исключает антитела или фрагменты антител, такие как одноцепочечные антитела или фрагменты Fc легкой цепи или тяжелой цепи.

В некоторых вариантах реализации последовательность XTEN согласно настоящему изобретению представляет собой пептид или полипептид, содержащий больше примерно 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800 или 2000 аминокислотных остатков. В некоторых вариантах реализации XTEN представляет собой пептид или полипептид, содержащий больше чем от примерно 20 до примерно 3000 аминокислотных остатков, больше чем от примерно 30 до примерно 2500 остатков, больше чем от примерно 40 до примерно 2000 остатков, больше чем от 50 до примерно 1500 остатков, больше чем от 60 до примерно 1000 остатков, больше чем от 70 до примерно 900 остатков, больше чем от 80 до примерно 800 остатков, больше чем от 90 до примерно 700 остатков, больше чем от 100 до примерно 600 остатков, больше чем от 110 до примерно 500 остатков или больше чем от 120 до примерно 400 остатков.

Последовательность XTEN согласно настоящему изобретению может содержать одну или более последовательностей-мотивов из 9-14 аминокислотных остатков или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичную последовательности-мотиву, при этом указанный мотив содержит, по существу состоит из или состоит из 4-6 типов аминокислот, выбранных из группы, состоящей из глицина (G), аланина (A), серина (S), треонина (T), глутамата (E) и пролина (P). См. US 2010-0239554 А1.

В некоторых вариантах реализации XTEN содержит не перекрывающиеся последовательностимотивы, в которых примерно 80%, или по меньшей мере примерно 85%, или по меньшей мере примерно 90%, или примерно 91%, или примерно 92%, или примерно 93%, или примерно 94%, или примерно 95%, или примерно 96%, или примерно 97%, или примерно 98%, или примерно 99%, или примерно 100% последовательности состоит из нескольких единиц не перекрывающихся последовательностей, выбранных из одного семейства мотивов, выбранного из табл. 2А, что приводит к семейству последовательностей. В настоящем описании термин семейство означает, что XTEN содержит мотивы, выбранные только из

- 49 042955 одной категории мотивов из табл. 2А, т.е. AD, АЕ, AF, AG, AM, AQ, ВС или BD XTEN, и что любые другие аминокислоты в XTEN не из семейства мотивов выбраны для получения необходимого свойства, например, для обеспечения включения сайта рестрикции кодирующими нуклеотидами, включения последовательности расщепления или для достижения лучшего связывания с FVIII или VWF. В некоторых вариантах семейств XTEN последовательность XTEN содержит несколько единиц не пересекающихся последовательностей-мотивов семейства мотивов AD или семейства мотивов АЕ, или семейства мотивов AF, или семейства мотивов AG, или семейства мотивов АМ, или семейства мотивов AQ, или семейства ВС, или семейства BD, и полученная XTEN демонстрирует диапазон гомологии, описанный выше. В других вариантах реализации XTEN содержит несколько единиц последовательностей-мотивов двух или более семейств мотивов из табл. 2А. Данные последовательности могут быть выбраны для получения желаемых физических/химических характеристик, включая такие свойства, как суммарный заряд, гидрофильность, отсутствие вторичной структуры или отсутствие повторяемости, которые придает аминокислотный состав мотивов, более подробно описанный ниже. В вариантах реализации, описанных выше в данном абзаце, мотивы, включенные в XTEN, могут быть выбраны и собраны с использованием способов, описанных в настоящем документе, с получением XTEN из примерно 36 - примерно 3000 аминокислотных остатков.

Таблица 2 А

Последовательности-мотивы из аминокислот и семейства мотивов XTEN

Семейство мотивов*	ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬМОТИВ
AD	GESPGGSSGSES
AD	GSEGSSGPGESS
AD	GSSESGSSEGGP
AD	GSGGEPSESGSS
АЕ, АМ	GSPAGSPTSTEE
АЕ, AM, AQ	GSEPATSGSETP
АЕ, AM, AQ	GTSESATPESGP
АЕ, AM, AQ	GTSTEPSEGSAP
AF, АМ	GSTSESPSGTAP
AF, АМ	GTSTPESGSASP
AF, АМ	GTSPSGESSTAP
AF, АМ	GSTSSTAESPGP
AG, АМ	GTPGSGTASSSP
AG, АМ	GSSTPSGATGSP
AG, АМ	GSSPSASTGTGP
AG, АМ	GASPGTSSTGSP
AQ	GEPAGSPTSTSE
AQ	GTGEPSSTPASE
AQ	GSGPSTESAPTE
AQ	GSETPSGPSETA
AQ	GPSETSTSEPGA
AQ	GSPSEPTEGTSA
ВС	GSGASEPTSTEP
ВС	GSEPATSGTEPS
ВС	GTSEPSTSEPGA
ВС	GTSTEPSEPGSA
BD	GSTAGSETSTEA
BD	GSETATSGSETA
BD	GTSESATSESGA
BD	GTSTEASEGSAS

Обозначает отдельные последовательности-мотивы, которые при совместном использовании в различных перестановках, приводят к семейству последовательностей.

XTEN может иметь различную длину для встраивания или связывания с FVIII или VWF. В одном из вариантов реализации длина последовательности (последовательностей) XTEN выбрана исходя из свойства или функции, получаемой в гибридном белке. В зависимости от предполагаемого свойства или функции, XTEN может представлять собой короткую или средней длины последовательность или более длинную последовательность, которая может служить в качестве носителей. В некоторых вариантах реализации XTEN включает короткие сегменты от примерно 6 до примерно 99 аминокислотных остатков, сегменты средней длины от примерно 100 до примерно 399 аминокислотных остатков и более длинные сегменты от примерно 400 до примерно 1000 и до примерно 3000 аминокислотных остатков. Таким образом, XTEN, встроенная или связанная с FVIII или VWF может иметь длину, составляющую примерно 6, примерно 12, примерно 36, примерно 40, примерно 42, примерно 72, примерно 96, примерно 144, примерно 288, примерно 400, примерно 500, примерно 576, примерно 600, примерно 700, примерно 800, примерно 864, примерно 900, примерно 1000, примерно 1500, примерно 2000, примерно 2500 или до

-50042955 примерно 3000 аминокислотных остатков. В других вариантах реализации длина последовательности XTEN составляет от примерно 6 до примерно 50, от примерно 50 до примерно 100, от примерно 100 до 150, от примерно 150 до 250, от примерно 250 до 400, от примерно 400 до примерно 500, от примерно 500 до примерно 900, от примерно 900 до примерно 1500, от примерно 1500 до примерно 2000 или от примерно 2000 до примерно 3000 аминокислотных остатков. Точная длина XTEN, встроенной или связанной с FVIII или VWF, может варьироваться, не оказывая при этом отрицательного влияния на активность FVIII или VWF. В одном из вариантов реализации одна или более XTEN, используемых в настоящем изобретении, имеют длину 36 аминокислот, 42 аминокислот, 72 аминокислот, 144 аминокислот, 288 аминокислот, 576 аминокислот или 864 аминокислот, и могут быть выбраны из одной или более последовательностей семейства XTEN, т.е. AD, AE, AF, AG, AM, AQ, ВС или BD.

В некоторых вариантах реализации последовательность XTEN, используемая в настоящем изобретении, по меньшей мере на 60, 70, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична последовательности, выбранной из группы, состоящей из

АЕ42, AG42, АЕ48, АМ48, АЕ72, AG72, АЕ108, AG108, АЕ144,

AFI 44,	AG144,	AE180,	AG180,	AE216,	AG216,	AE252,	AG252,	AE288,	AG288,	AE324,
AG324,	AE360,	AG360,	AE396,	AG396,	AE432,	AG432,	AE468,	AG468,	AE504,	AG504,
AF504,	AE540,	AG540,	AF540,	AD576,	AE576,	AF576,	AG576,	AE612,	AG612,	AE624,
AE648,	AG648,	AG684,	AE720,	AG720,	AE756,	AG756,	AE792,	AG792,	AE828,	AG828,

AD836, АЕ864, AF864, AG864, АМ875, АЕ912, АМ923, АМ1318, ВС864, BD864, АЕ948,

АЕ1044, АЕ1140, АЕ1236, АЕ1332, АЕ1428, АЕ1524, АЕ1620, АЕ1716, АЕ1812, АЕ1908, АЕ2004А, AG948, AG1044, AG1140, AG1236, AG1332, AG1428, AG1524, AG1620, AG1716, AG1812, AG1908 и AG2004. См. US 2010-0239554 А1.

В одном из вариантов реализации последовательность XTEN по меньшей мере на 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из

АЕ42 (SEQ ГО NO: 36), АЕ72 (SEQ ГО NO: 127), АЕ144 2А (SEQ ГО NO: 128), АЕ144 3В (SEQ ГО NO: 129), АЕ144 4А (SEQ ГО NO: 130), АЕ144 5А (SEQ ГО NO: 131), АЕ144 6В (SEQ ГО NO: 132), AG144 A (SEQ ГО NO: 133), AG144 B (SEQ ГО NO: 134), AG144 C (SEQ ГО NO: 135), AG144 F (SEQ

ID NO: 136), АЕ864 (SEQ ГО NO: 43), АЕ576 (SEQ ID NO: 41), AE288 (SEQ ID NO: 39), AE288_2 (SEQ ID NO: 137), AE144 (SEQ ID NO: 37), AG864 (SEQ ID NO: 44), AG576 (SEQ ID NO: 42), AG288 (SEQ ID NO: 40), AG144 (SEQ ID NO: 38) и их любых комбинаций.

В некоторых вариантах реализации менее 100% аминокислот XTEN выбраны из глицина (G), аланина (A), серина (S), треонина (T), глутамата (E) и пролина (P) или менее 100% указанной последовательности состоит из последовательностей-мотивов из табл. 2А или последовательностей XTEN из табл. 2В. В таких вариантах реализации остальные аминокислотные остатки в XTEN выбраны из любых других 14 природных L-аминокислот, но могут быть предпочтительно выбраны из гидрофильных аминокислот, в результате чего последовательность XTEN содержит по меньшей мере примерно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или по меньшей мере примерно 99% гидрофильных аминокислот. Содержание гидрофобных аминокислот в XTEN, используемой в конъюгированных конструкциях, может быть меньше 5%, или меньше 2%, или меньше 1% гидрофобных аминокислот. Гидрофобные остатки, которые менее предпочтительны при формировании XTEN, включают триптофан, фенилаланин, тирозин, лейцин, изолейцин, валин и метионин. Кроме того, последовательности XTEN могут содержать меньше 5%, или меньше 4%, или меньше 3%, или меньше 2%, или меньше 1% или могут не содержать ни одной из следующих аминокислот: метионина (например, во избежание окисления) или аспарагина и глутамина (во избежание дезамидирования).

В другом варианте реализации последовательность XTEN выбрана из группы, состоящей из АЕ42 (SEQ ГО NO: 36), АЕ72 (SEQ ГО NO: 127), АЕ144 2А (SEQ ГО NO: 128),

АЕ144_ЗВ (SEQ ГО NO: 129), АЕ144 4А (SEQ ГО NO: 130), АЕ144 5А (SEQ ГО NO: 131), АЕ144 6В (SEQ ГО NO: 132), AG144 A (SEQ ГО NO: 133), AG144 B (SEQ ГО NO: 134), AG144 C (SEQ ГО NO: 135), AG144 F (SEQ ID NO: 136), АЕ864 (SEQ ГО NO: 43), АЕ576 (SEQ ID NO: 41), AE288 (SEQ ID NO: 39), AE288 2 (SEQ ID NO: 137), AE144 (SEQ ID NO: 37), AG864 (SEQ ID NO: 44), AG576 (SEQ ID NO: 42), AG288 (SEQ ID NO: 40), AG144 (SEQ ID NO: 38)

- 51 042955 и их любых комбинаций.

В конкретном варианте реализации последовательность XTEN представляет собой АЕ288. Аминокислотные последовательности для некоторых последовательностей XTEN согласно настоящему изобретению представлены в табл. 2В.

Таблица 2В

Последовательности XTEN

XTEN	Аминокислотная последовательность
АЕ42 SEQ Ш NO: 36	GAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPASS
АЕ72	GAPTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPA TSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGASS
SEQ Ш NO: 127
AE144 SEQ ID NO:37	GSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTE EGTSTEPSEG SAPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGTSTEPSE GSAPGTSESA PESGPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSAP
AE144_2A (SEQ ID NO: 128)	TSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAP GTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSET PGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPES GPG
AE144_3B (SEQ ID NO: 129)	SPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGP GTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSA PGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGS APG
AE144_4A (SEQ ID NO: 130)	TSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETP GTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTE EGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGS APG
AE144_5A (SEQ ID NO: 131)	TSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETP GTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESG PGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTST EEG
AE144 6B (SEQ ID NO: 132)	TSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESGPGTSESATPESGP GSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSA PGTSTEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGS APG
AG144 SEQ ID NO:38	GTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGSSPSASTGTGPGSSPSASTGTG PGASPGTSST GSPGASPGTSSTGSPGSSTPSGATGSPGSSPSASTGTGPGASPGTSS TGSPGSSPSA STGTGPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSP
AG144_A (SEQ ID NO: 133)	GASPGTSSTGSPGSSPSASTGTGPGSSPSASTGTGPGTPGSGTASSS PGSSTPSGATGSPGSSPSASTGTGPGASPGTSSTGSPGTPGSGTASS SPGSSTPSGATGSPGTPGSGTASSSPGASPGTSSTGSPGASPGTSST GSP
AG144B (SEQ ID NO: 134)	GTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGASPGTSSTGSPGTPGSGTASSS PGSSTPSGATGSPGSSPSASTGTGPGSSPSASTGTGPGSSTPSGATG SPGSSTPSGATGSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGASPGTSST GSP
AG144_C	GTPGSGTASSSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGS PGSSPSASTGTGPGTPGSGTASSSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTG

- 52 042955

(SEQ ID NO: 135)	SPGASPGTSSTGSPGSSTPSGATGSPGSSTPSGATGSPGASPGTSST GSP
AG144_F (SEQ ID NO: 136)	GSSPSASTGTGPGSSPSASTGTGPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGS PGSSTPSGATGSPGSSPSASTGTGPGASPGTSSTGSPGSSPSASTGT GPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGSSTPSGATGSPGASPGTSST GSP
AE288 SEQ ID NO:39	GTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSET PGTSESATPESG PGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSE TPGTSESATPES GPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPE SGPGTSESATPE SGPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPT STEEGTSTEPSE GSAPGTSTEPSEGSAPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPS EGSAP
AE288_2 (SEQ ID NO: 137)	GSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESG PGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGS APGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEG SAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSG SETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSPAGSP TSTEEGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEP SEGSAP
AG288 SEQ ID NO :40	PGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATG SPGTPGSGTASS SPGSSTPSGATGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGSSTPSGAT GSPGSSPSASTG TGPGSSPSASTGTGPGASPGTSSTGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGA TGSPGSSPSAST GTGPGSSPSASTGTGPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGSSTPSG ATGSPGSSPSAS TGTGPGASPGTSSTGSPGSSPSASTGTGPGTPGSGTASSSPGSSTPS GATGS
AE576 SEQ ID NO :41	GSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTE EGTSTEPSEGSA PGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSE TPGSPAGSPTST EEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTS TEEGTSTEPSEG SAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATP ESGPGSEPATSG SETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESAT PESGPGSPAGSP TSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEP SEGSAPGTSTEP SEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTE PSEGSAPGSPAG SPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSE SATPESGPGSEP

- 53 042955

	ATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSP AGSPTSTEEGSP AGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAP
AG576 SEQ ID NO:42	PGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGSSPSASTGTGPGSSPSASTGT GPGSSTPSGATG SPGSSTPSGATGSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGASPGTSST GSPGTPGSGTAS SSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGSSPSAST GTGPGTPGSGTA SSSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGSSTPSG ATGSPGSSTPSG ATGSPGASPGTSSTGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGSSTPS GATGSPGSSTPS GATGSPGSSPSASTGTGPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGTPGS GTASSSPGASPG TSSTGSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGTPG SGTASSSPGSST PSGATGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGTPGSGTASSSPGSS TPSGATGSPGSS TPSGATGSPGSSPSASTGTGPGSSPSASTGTGPGASPGTSSTGSPGT PGSGTASSSPGS STPSGATGSPGSSPSASTGTGPGSSPSASTGTGPGASPGTSSTGS
AE864 SEQ ID NO:43	GSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTE EGTSTEPSEGSA PGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSEPATSGSE TPGSPAGSPTST EEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTS TEEGTSTEPSEG SAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATP ESGPGSEPATSG SETPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESAT PESGPGSPAGSP TSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEP SEGSAPGTSTEP SEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGSAPGTSTE PSEGSAPGSPAG SPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSE SATPESGPGSEP ATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSP AGSPTSTEEGSP AGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGT SESATPESGPGS EPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPG TSTEPSEGSAPG SPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGTSESATPESGP GSPAGSPTSTEE GSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGTSESATPESG PGTSESATPESG PGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGS APGTSTEPSEGS APGSEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAP

- 54 042955

AG864	GASPGTSSTGSPGSSPSASTGTGPGSSPSASTGTGPGTPGSGTASSS
SEQ ID	PGSSTPSGATGS PGSSPSASTGTGPGASPGTSSTGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATG
NO:44	SPGTPGSGTASS SPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGAT GSPGASPGTSST GSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGSSPSASTGTGPGSSPSAST GTGPGSSTPSGA TGSPGSSTPSGATGSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGASPGTS STGSPGTPGSGT ASSSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGSSPSA STGTGPGTPGSG TASSSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGSSTP SGATGSPGSSTP SGATGSPGASPGTSSTGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGSST PSGATGSPGSST PSGATGSPGSSPSASTGTGPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGTP GSGTASSSPGAS PGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGT PGSGTASSSPGS STPSGATGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGTPGSGTASSSPG SSTPSGATGSPG SSTPSGATGSPGSSPSASTGTGPGSSPSASTGTGPGASPGTSSTGSP GTPGSGTASSSP GSSTPSGATGSPGSSPSASTGTGPGSSPSASTGTGPGASPGTSSTGS PGASPGTSSTGS PGSSTPSGATGSPGSSPSASTGTGPGASPGTSSTGSPGSSPSASTGT GPGTPGSGTASS SPGSSTPSGATGSPGSSTPSGATGSPGASPGTSSTGSP

В других вариантах реализации последовательность XTEN, используемая в настоящем изобретении, влияет на физическое или химическое свойство, например фармакокинетику химерного белка согласно настоящему изобретению. Последовательность XTEN, используемая в настоящем изобретении, может демонстрировать одно или более из следующих предпочтительных свойств: конформационная гибкость, повышенная растворимость в воде, высокая степень резистентности к протеазам, низкая иммуногенность, низкое связывание с рецепторами млекопитающих или увеличенные гидродинамические радиусы (или радиусы Стокса). В конкретном варианте реализации последовательность XTEN, связанная с белком FVIII в настоящем изобретении, улучшает фармакокинетические свойства, такие как более длительный конечный период полувыведения или увеличенная площадь под кривой (ППК), так что химерный белок, описанный в настоящем документе, остается in vivo в течение увеличенного периода времени по сравнению с FVIII дикого типа. В других вариантах реализации последовательность XTEN, используемая в настоящем изобретении, улучшает фармакокинетические свойства, такие как более длительный конечный период полувыведения или увеличенная площадь под кривой (ППК), так что белок FVIII остается in vivo в течение увеличенного периода времени по сравнению с FVIII дикого типа. Для определения физических/химических свойств белков, содержащих последовательность XTEN, могут быть использованы различные методы и анализы. Такие методы включают, но не ограничиваются перечисленными, аналитическое центрифугирование, электронный парамагнитный резонанс (EPR), ВЭЖХ-ионный обмен, эксклюзионную ВЭЖХ, обращенно-фазовую ВЭЖХ, рассеяние света, капиллярный электрофорез, круговой дихроизм, дифференциальную сканирующую калориметрию, флуоресценцию, ВЭЖХ-ионный обмен, эксклюзионную ВЭЖХ, ИК, ЯМР, рамановскую спектроскопию, рефрактометрию и спектроскопию в УФ/видимой области. Дополнительные методы описаны в Amau et al., Prot. Expr. and Purif., 48, 1-13 (2006). Дополнительные примеры последовательностей XTEN, которые могут быть использованы согласно настоящему изобретению, описаны в публикации патента США № 2010/0239554 А1, 2010/0323956 А1, 2011/0046060 А1, 2011/0046061 А1, 2011/0077199 А1 или 2011/0172146 А1 или международной публикации патента № WO 2010091122 A1, WO 2010144502 А2, WO 2010144508 A1, WO 2011028228 A1, WO 2011028229 А1 или WO 2011028344 А2.

С) Белок фактора VIII (FVIII).

В настоящем описании термин белок FVIII означает функциональный полипептид FVIII, играющий обычную роль в свертывании крови, если не указано иное. Термин белок FVIII включает его функциональный фрагмент, вариант, аналог или производное, сохраняющее функцию полноразмерного фактора VIII дикого типа в пути свертывания крови. Термины белок FVIII, полипептид (или белок) FVIII или FVIII являются взаимозаменяемыми. Примеры функций FVIII включают, но не ограничиваются перечисленными, способность активировать свертывание крови, способность выступать в качестве кофактора для фактора IX или способность образовывать теназный комплекс с фактором IX в присутствии Са²⁺ и фосфолипидов, который затем превращает фактор X в активированную форму Xa. Белок FVIII может представлять собой белок FVIII человека, свиньи, собаки, крысы или мыши. Кроме того,

- 55 042955 сравнение FVIII людей и других видов позволило идентифицировать консервативные остатки, которые могут быть необходимы для выполнения функции (Cameron et al., Thromb. Haemost., 79:317-22 (1998); US 6251632). Доступен ряд тестов для оценки функции системы свертывания крови: тест на определение активированного частичного тромбопластинового времени (аРТТ), хромогенный анализ, анализ ROTEM, тест на определение протромбинового времени (РТ) (также используемый для определения международного коэффициента нормализации (INR)), тест на определение фибриногена (часто методом Клаусса), подсчет количества тромбоцитов, тестирование функции тромбоцитов (часто с помощью анализатора функции тромбоцитов (PFA-100)), процентный объем тромбоцитов в крови (ТСТ), время кровотечения, тест со смешиванием (устраняется ли анормальность, если плазму крови пациента смешивают с нормальной плазмой крови), анализы факторов свертывания крови, антифосфолипидные антитела, D-димер, генетические тесты (например, фактор V Ляйдена, протромбиновая мутация G20210A), время в пробе с разбавленным ядом гадюки Рассела (dRVVT), смешанные тесты на определение функции тромбоцитов, тромбоэластография (TEG или Sonoclot), тромбоэластометрия (ТЕМ®, например, ротационная тромбозластометрия (ROTEM )) или время лизиса эуглобулина (ELT). Тест аРТТ является показателем эффективности, позволяющим оценить эффективность как внутреннего (также называемого контактным путем активации), так и общего пути свертывания крови. Данный тест широко используют для измерения свертывающей активности коммерчески доступных рекомбинантных факторов свертывания крови, например FVIII или FIX. Его используют в сочетании с тестом на определение протромбинового времени (РТ), который позволяет оценить внешний путь. Анализ ROTEM дает информацию обо всей кинетике гемостаза: время свертывания крови, образование сгустка крови, стабильность и лизис сгустка крови. Различные параметры тромбоэластометрии зависят от активности системы свертывания плазмы крови, функции тромбоцитов, фибринолиза или многих факторов, влияющих на данные взаимодействия. Данный анализ может дать полное представление о вторичном гемостазе. Известны полипептидные и полинуклеотидные последовательности FVIII, а также многие функциональные фрагменты, мутанты и модифицированные варианты. Примеры последовательностей (полноразмерные) FVIII человека приведены ниже.

Таблица 3 Аминокислотная последовательность полноразмерного фактора VIII

Сигнальный пептид: (SEQ Ш NO: 3)

MQIELSTCFFLCLLRFCFS

Зрелый фактор VIII (SEQ Ш NO: 4)*

ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSWYKKTLFVEFT DHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTWITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASE GAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLV KDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDR DAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHT FLVRNHROASLEISPITFLTAOTLLMDLGOFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCP EEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDWRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHY IAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTRE AIOHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGV KHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGP LLICYKESVDORGNOIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVOLED PEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKH KMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNT GDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSONSRAPSTRQKQFNATTIPENDIEKTD PWFAHRTPMPKLQNVSSSDLLMLLRQSPTPHGLSLSDLQEAKYETFSDDPSPGAL DSNNSLSEMTHFRPQLHHSGDMVFTPESGLQLRLNEKLGTTAATELKKLDFKVSS TSNNLLSTLPSDNLAAGTDNTSSLGPPSMPVHYDSQLDTTLFGKKSSPLTESGGP LSLSEENNDSKLLESGLMNSQESSWGKNVSSTESGRLFKGKRAHGPALLTKDNAL FKVSISLLKTNKTSNNSATNRKTHIDGPSLLIENSPSVWQNILESDTEFKKVTPL IHDRMLMDKNATALRLNHMSNKTTSSKNMEMVQQKKEGPIPPDAQNPDMSFFKML FLPESARWIQRTHGKNSLNSGQGPSPKQLVSLGPEKSVEGQNFLSEKNKWVGKG EFTKDVGLKEMVFPSSRNLFLTNLDNLHENNTHNQEKKIQEEIEKKETLIQENVV LPQIHTVTGTKNFMKNLFLLSTRQNVEGSYDGAYAPVLQDFRSLNDSTNRTKKHT AHFSKKGEEENLEGLGNQTKQIVEKYACTTRISPNTSQQNFVTQRSKRALKQFRL PLEETELEKRIIVDDTSTQWSKNMKHLTPSTLTQIDYNEKEKGAITQSPLSDCLT RSHSIPQANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLTRVLFQDNSSHLPAASYRKKDSGVQE SSHFLQGAKKNNLSLAILTLEMTGDQREVGSLGTSATNSVTYKKVENTVLPKPDL PKTSGKVELLPKVHLYQKDLFPTETSNGSPGHLDLVEGSLLQGTEGALKWNEANR

- 56 042955

PGKVPFLRVATESSAKTPSKLLDPLAWDNHYGTQIPKEEWKSQEKSPEKTAFKKK DTILSLNACESNHAIAAINEGQNKPEIEVTWAKQGRTERLCSQNPPVLKRHQREI TRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVER LWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKWFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLG PYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTY FWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQ VTVQE FALFFTIFDE TKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPT FKENYRFHAINGYI MDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYP GVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDF QITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGAR QKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPII ARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMF ATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSM YVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPWNSLDPPLLTRYLRIHP QSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY

Полноразмерный FVIII (сигнальный пептид FVIII подчеркнут; тяжелая цепь FVIII подчеркнута двойной чертой; домен В выделен курсивом; и легкая цепь FVIII представлена в виде обычного текста).

Таблица 4 Нуклеотидная последовательность, кодирующая полноразмерный FVIII (SEQ ID NO: 5)*

661 ATG

CAAATAGAGC TCTCCACCTG

721 CTTCTTTCTG TGCCTTTTGC GATTCTGCTT TAGTGССАСC AGAAGATACT ACCTGGGTGC

781 AGTGGAACTG TCATGGGACT ATATGCAAAG TGATCTCGGT GAGCTGCCTG TGGACGCAAG

841 ATTTCCTCCT AGAGTGCCAA AATCTTTTCC ATTCAACACC TCAGTCGTGT ACAAAAAGAC

901 TCTGTTTGTA GAATTCACGG ATCACCTTTT CAACATCGCT AAGCCAAGGC CACCCTGGAT

961 GGGTCTGCTA GGTCCTACCA TCCAGGCTGA GGTTTATGAT ACAGTGGTCA TTACACTTAA

1021 GAACATGGCT TCCCATCCTG TCAGTCTTCA TGCTGTTGGT GTATCCTACT GGAAAGCTTC

1081 TGAGGGAGCT GAATATGATG ATCAGACCAG TCAAAGGGAG AAAGAAGATG ATAAAGTCTT

1141 CCCTGGTGGA AGCCATACAT ATGTCTGGCA GGTCCTGAAA GAGAATGGTC CAATGGCCTC

1201 TGACCCACTG TGCCTTACCT ACTCATATCT TTCTCATGTG

GACCTGGTAA AAGACTTGAA

1261 TTCAGGCCTC ATTGGAGCCC TACTAGTATG TAGAGAAGGG

AGTCTGGCCA AGGAAAAGAC

1321 ACAGACCTTG CACAAATTTA TACTACTTTT TGCTGTATTT

GATGAAGGGA AAAGTTGGCA

1381 CTCAGAAACA AAGAACTCCT TGATGCAGGA TAGGGATGCT GCATCTGCTC GGGCCTGGCC

1441 TAAAATGCAC ACAGTCAATG GTTATGTAAA CAGGTCTCTG CCAGGTCTGA TTGGATGCCA

1501 CAGGAAATCA GTCTATTGGC ATGTGATTGG AATGGGCACC ACTCCTGAAG TGCACTCAAT

1561 ATTCCTCGAA GGTCACACAT TTCTTGTGAG GAACCATCGC CAGGCGTCCT TGGAAATCTC

1621 GCCAATAACT TTCCTTACTG CTCAAACACT CTTGATGGAC CTTGGACAGT TTCTACTGTT

1681 TTGTCATATC TCTTCCCACC AACATGATGG CATGGAAGCT TATGTCAAAG TAGACAGCTG

1741 TCCAGAGGAA CCCCAACTAC GAATGAAAAA TAATGAAGAA GCGGAAGACT ATGATGATGA

1801 TCTTACTGAT TCTGAAATGG ATGTGGTCAG GTTTGATGAT

GACAACTCTC CTTCCTTTAT

1861 CCAAATTCGC TCAGTTGCCA AGAAGCATCC TAAAACTTGG

GTACATTACA TTGCTGCTGA

1921 AGAGGAGGAC TGGGACTATG CTCCCTTAGT CCTCGCCCCC

GATGACAGAA GTTATAAAAG

-57042955

1981 TCAATATTTG AACAATGGCC CTCAGCGGAT TGGTAGGAAG TACAAAAAAG TCCGATTTAT

2041 GGCATACACA GATGAAACCT TTAAGACTCG TGAAGCTATT CAGCATGAAT CAGGAATCTT

2101 GGGACCTTTA CTTTATGGGG AAGTTGGAGA CACACTGTTG ATTATATTTA AGAATCAAGC

2161 AAGCAGACCA TATAACATCT ACCCTCACGG AATCACTGAT GTCCGTCCTT TGTATTCAAG

2221 GAGATTACCA AAAGGTGTAA AACATTTGAA GGATTTTCCA ATTCTGCCAG GAGAAATATT

2281 CAAATATAAA TGGACAGTGA CTGTAGAAGA TGGGCCAACT AAATCAGATC CTCGGTGCCT

2341 GACCCGCTAT TACTCTAGTT TCGTTAATAT GGAGAGAGAT CTAGCTTCAG GACTCATTGG

2401 CCCTCTCCTC ATCTGCTACA AAGAATCTGT AGATCAAAGA GGAAACCAGA TAATGTCAGA

2461 CAAGAGGAAT GTCATCCTGT TTTCTGTATT TGATGAGAAC CGAAGCTGGT ACCTCACAGA

2521 GAATATACAA CGCTTTCTCC CCAATCCAGC TGGAGTGCAG CTTGAGGATC CAGAGTTCCA

2581 AGCCTCCAAC ATCATGCACA GCATCAATGG CTATGTTTTT GATAGTTTGC AGTTGTCAGT

2641 TTGTTTGCAT GAGGTGGCAT ACTGGTACAT TCTAAGCATT GGAGCACAGA CTGACTTCCT

2701 TTCTGTCTTC TTCTCTGGAT ATACCTTCAA ACACAAAATG GTCTATGAAG ACACACTCAC

2761 CCTATTCCCA TTCTCAGGAG AAACTGTCTT CATGTCGATG GAAAACCCAG GTCTATGGAT

2821 TCTGGGGTGC CACAACTCAG ACTTTCGGAA CAGAGGCATG ACCGCCTTAC TGAAGGTTTC

2881 TAGTTGTGAC AAGAACACTG GTGATTATTA CGAGGACAGT TATGAAGATA TTTCAGCATA

2941 CTTGCTGAGT AAAAACAATG CCATTGAACC AAGAAGCTTC TCCCAGAATT CAAGACACCC

3001 TAGCACTAGG CAAAAGCAAT TTAATGCCAC CACAATTCCA GAAAATGACA TAGAGAAGAC

3061 TGACCCTTGG TTTGCACACA GAACACCTAT GCCTAAAATA CAAAATGTCT CCTCTAGTGA

3121 TTTGTTGATG CTCTTGCGAC AGAGTCCTAC TCCACATGGG CTATCCTTAT CTGATCTCCA

3181 AGAAGCCAAA TATGAGACTT TTTCTGATGA TCCATCACCT GGAGCAATAG ACAGTAATAA

3241 CAGCCTGTCT GAAATGACAC ACTTCAGGCC ACAGCTCCAT CACAGTGGGG ACATGGTATT

3301 TACCCCTGAG TCAGGCCTCC AATTAAGATT AAATGAGAAA CTGGGGACAA CTGCAGCAAC

3361 AGAGTTGAAG AAACTTGATT TCAAAGTTTC TAGTACATCA AATAATCTGA TTTCAACAAT

3421 TCCATCAGAC AATTTGGCAG CAGGTACTGA TAATACAAGT TCCTTAGGAC CCCCAAGTAT

81 GCCAGTTCAT TATGATAGTC AATTAGATAC CACTCTATTT GGCAAAAAGT CATCTCCCCT

3541 TACTGAGTCT GGTGGACCTC TGAGCTTGAG TGAAGAAAAT AATGATTCAA AGTTGTTAGA

3601 ATCAGGTTTA ATGAATAGCC AAGAAAGTTC ATGGGGAAAA AATGTATCGT CAACAGAGAG

3661 TGGTAGGTTA TTTAAAGGGA AAAGAGCTCA TGGACCTGCT TTGTTGACTA AAGATAATGC

3721 CTTATTCAAA GTTAGCATCT CTTTGTTAAA GACAAACAAA ACTTCCAATA ATTCAGCAAC

3781 TAATAGAAAG ACTCACATTG ATGGCCCATC ATTATTAATT GAGAATAGTC CATCAGTCTG

3841 GCAAAATATA TTAGAAAGTG ACACTGAGTT TAAAAAAGTG ACACCTTTGA TTCATGACAG

- 58 042955

3901 AATGCTTATG GACAAAAATG CATATGTCAA ATAAAACTAC

3961 TTCATCAAAA AACATGGAAA GGCCCCATTC CACCAGATGC

4021 ACAAAATCCA GATATGTCGT CCAGAATCAG CAAGGTGGAT

081 ACAAAGGACT CATGGAAAGA GGCCCCAGTC CAAAGCAATT

4141 AGTATCCTTA GGACCAGAAA TTCTTGTCTG AGAAAAACAA

4201 AGTGGTAGTA GGAAAGGGTG CTCAAAGAGA TGGTTTTTCC

4261 AAGCAGCAGA AACCTATTTC CATGAAAATA ATACACACAA

321 T CAAGAAAAA AAAAT T CAGG ACATTAATCC AAGAGAATGT

4381 AGTTTTGCCT CAGATACATA TTCATGAAGA ACCTTTTCTT

4441 ACTGAGCACT AGGCAAAATG GCATATGCTC CAGTACTTCA

4501 AGATTTTAGG TCATTAAATG AAACACACAG CTCATTTCTC

4561 AAAAAAAGGG GAGGAAGAAA CAAACCAAGC AAATTGTAGA

4621 GAAATATGCA TGCACCACAA CAGCAGAATT TTGTCACGCA

4681 ACGTAGTAAG AGAGCTTTGA GAAGAAACAG AACTTGAAAA

4741 AAGGATAATT GTGGATGACA AACATGAAAC ATTTGACCCC

4801 GAGCACCCTC ACACAGATAG GGGGCCATTA CTCAGTCTCC

4861 CTTATCAGAT TGCCTTACGA GCAAATAGAT CTCCATTACC

4921 CATTGCAAAG GTATCATCAT TATCTGACCA GGGTCCTATT

4981 CCAAGACAAC TCTTCTCATC AAGAAAGATT CTGGGGTCCA

5041 AGAAAGCAGT CATTTCTTAC CTTTCTTTAG CCATTCTAAC

5101 CTTGGAGATG ACTGGTGATC GGGACAAGTG CCACAAATTC

5161 AGTGAGATAC AAGAAAGTTG CCAGACTTGC CCAAAACATC

5221 TGGCAAAGTT GAATTGCTTC AAGGACCTAT TCCCTACGGA

5281 AACTAGCAAT GGGTCTCCTG GGGAGCCTTC TTCAGGGAAC

5341 AGAGGGAGCG ATTAAGTGGA AAAGTTCCCT TTCTGAGAGT

5401 AGCAACAGAA AGCTCTGCAA GATCCTCTTG CTTGGGATAA

CTACAGCTTT

TGGTCCAACA

TCTTTAAGAT

ACTCTCTGAA

AATCTGTGGA

AATTTACAAA

TTACTAACTT

AAGAAATAGA

CAGTGACTGG

TAGAAGGTTC

ATTCAACAAA

ACTTGGAAGG

GGATATCTCC

AACAATTCAG

CCTCAACCCA

ACTACAATGA

GGAGTCATAG

TTCCATCTAT

TTCCAGCAGC

AAGGAGCCAA

AAAGAGAGGT

AGAACACTGT

CAAAAGTTCA

GCCATCTGGA

ATGAAGCAAA

AGACTCCCTC

GAGGCTAAAT GAAAAAAGAG GCTATTCTTG CTCTGGGCAA AGGTCAGAAT GGACGTAGGA GGATAATTTA AAAGAAGGAA CACTAAGAAT ATATGACGGG TAGAACAAAG CTTGGGAAAT TAATACAAGC ACTCCCACTA GTGGTCCAAA GAAGGAGAAA CATCCCTCAA TAGACCTATA ATCTTATAGA AAAAAATAAC TGGCTCCCTG TCTCCCGAAA CATTTATGAG TCTCGTGGAA CAGACCTGGA CAAGCTATTG

- 59 042955

5461 CCACTATGGT ACTCAGATAC CAAAAGAAGA GTGGAAATCC CAAGAGAAGT CACCAGAAAA

5521 AACAGCTTTT AAGAAAAAGG ATACCATTTT GTCCCTGAAC GCTTGTGAAA GCAATCATGC

5581 AATAGCAGCA ATAAATGAGG GACAAAATAA GCCCGAAATA GAAGTCACCT GGGCAAAGCA

5641 AGGTAGGACT GAAAGGCTGT GCTCTCAAAA CCCACCAGTC TTGAAACGCC ATCAACGGGA

5701 AATAACTCGT ACTACTCTTC AGTCAGATCA AGAGGAAATT GAG TAT GAT G AT AC CAT АТС

5761 AGTTGAAATG AAGAAGGAAG ATTTTGACAT TTATGATGAG GATGAAAATC AGAGCCCCCG

5821 CAGCTTTCAA AAGAAAACAC GACACTATTT TATTGCTGCA GTGGAGAGGC TCTGGGATTA

5881 TGGGATGAGT AGCTCCCCAC ATGTTCTAAG AAACAGGGCT CAGAGTGGCA GTGTCCCTCA

5941 GTTCAAGAAA GTTGTTTTCC AGGAATTTAC TGATGGCTCC TTTACTCAGC CCTTATACCG

6001 TGGAGAACTA AATGAACATT TGGGACTCCT GGGGCCATAT ATAAGAGCAG AAGTTGAAGA

6061 TAATATCATG GTAACTTTCA GAAATCAGGC CTCTCGTCCC TATTCCTTCT ATTCTAGCCT

6121 TATTTCTTAT GAGGAAGATC AGAGGCAAGG AGCAGAACCT AGAAAAAACT TTGTCAAGCC

6181 TAATGAAACC AAAACTTACT TTTGGAAAGT GCAACATCAT ATGGCACCCA CTAAAGATGA

6241 GTTTGACTGC AAAGCCTGGG CTTATTTCTC TGATGTTGAC CTGGAAAAAG ATGTGCACTC

6301 AGGCCTGATT GGACCCCTTC TGGTCTGCCA CACTAACACA CTGAACCCTG CTCATGGGAG

6361 ACAAGTGACA GTACAGGAAT TTGCTCTGTT TTTCACCATC TTTGATGAGA CCAAAAGCTG

6421 GTACTTCACT GAAAATATGG AAAGAAACTG CAGGGCTCCC TGCAATATCC AGATGGAAGA

6481 TCCCACTTTT AAAGAGAATT ATCGCTTCCA TGCAATCAAT GGCTACATAA TGGATACACT

6541 ACCTGGCTTA GTAATGGCTC AGGATCAAAG GATTCGATGG TATCTGCTCA GCATGGGCAG

601 CAATGAAAAC ATCCATTCTA TTCATTTCAG TGGACATGTG TTCACTGTAC GAAAAAAAGA

6661 GGAGTATAAA ATGGCACTGT ACAATCTCTA TCCAGGTGTT TTTGAGACAG TGGAAATGTT

6721 ACCATCCAAA GCTGGAATTT GGCGGGTGGA ATGCCTTATT GGCGAGCATC TACATGCTGG

6781 GATGAGCACA CTTTTTCTGG TGTACAGCAA TAAGTGTCAG ACTCCCCTGG GAATGGCTTC

6841 TGGACACATT AGAGATTTTC AGATTACAGC TTCAGGACAA TATGGACAGT GGGCCCCAAA

6901 GCTGGCCAGA CTTCATTATT CCGGATCAAT CAATGCCTGG AGCACCAAGG AGCCCTTTTC

6961 TTGGATCAAG GTGGATCTGT TGGCACCAAT GATTATTCAC GGCATCAAGA CCCAGGGTGC

- 60 042955

7021 CCGTCAGAAG TTCTCCAGCC TCTACATCTC TCAGTTTATC ATCATGTATA GTCTTGATGG

7081 GAAGAAGTGG CAGACTTATC GAGGAAATTC CACTGGAACC TTAATGGTCT TCTTTGGCAA

7141 TGTGGATTCA TCTGGGATAA AACACAATAT TTTTAACCCT CCAATTATTG CTCGATACAT

7201 CCGTTTGCAC CCAACTCATT ATAGCATTCG CAGCACTCTT CGCATGGAGT TGATGGGCTG

7261 TGATTTAAAT AGTTGCAGCA TGCCATTGGG AATGGAGAGT AAAGCAATAT CAGATGCACA

7321 GATTACTGCT TCATCCTACT TTACCAATAT GTTTGCCACC TGGTCTCCTT CAAAAGCTCG

7381 ACTTCACCTC CAAGGGAGGA GTAATGCCTG GAGACCTCAG GTGAATAATC CAAAAGAGTG

7441 GCTGCAAGTG GACTTCCAGA AGACAATGAA AGTCACAGGA GTAACTACTC AGGGAGTAAA

7501 ATCTCTGCTT ACCAGCATGT ATGTGAAGGA GTTCCTCATC TCCAGCAGTC AAGATGGCCA

7561 TCAGTGGACT CTCTTTTTTC AGAATGGCAA AGTAAAGGTT TTTCAGGGAA ATCAAGACTC

7621 CTTCACACCT GTGGTGAACT CTCTAGACCC ACCGTTACTG ACTCGCTACC TTCGAATTCA

7681 CCCCCAGAGT TGGGTGCACC AGATTGCCCT GAGGATGGAG GTTCTGGGCT GCGAGGCACA

7741 GGACCTCTAC * Подчеркнутые нуклеиновые кислоты кодируют сигнальный пептид.

Полипептиды FVIII включают полноразмерный FVIII, полноразмерный FVIII без Met на N-конце, зрелый FVIII (без сигнальной последовательности), зрелый FVIII с дополнительным Met на N-конце и/или FVIII с полной или частичной делецией домена В. В некоторых вариантах реализации варианты FVIII содержат делеции домена В, будь то частичные или полные делеции.

Последовательность нативного зрелого FVIII человека представлена в виде SEQ ID NO: 4. Нативный белок FVIII имеет следующую формулу:

А1-а1 -А2-а2-В-a3 -А3 -С 1-С2, где A1, A2 и A3 представляют собой структурно родственные домены А,

В представляет собой домен В,

С1 и С2 представляют собой структурно родственные домены С, и a1, а2 и a3 представляют собой кислотные спейсерные области.

Относительно положения первичной аминокислотной последовательности в SEQ ID NO: 4, домен A1 FVIII человека простирается от Ala1 до примерено Arg336, спейсерная область a1 простирается от примерно Met337 до примерно Val374, домен А2 простирается от примерно Ala375 до примерно Tyr719, спейсерная область а2 простирается от примерно Glu720 до примерно Arg740, домен В простирается от примерно Ser741 до примерно Arg1648, спейсерная область a3 простирается от примерно Glu1649 до примерно Arg1689, домен A3 простирается от примерно Ser1690 до примерно Leu2025, домен С1 простирается от примерно Gly2026 до примерно Asn2072, и домен С2 простирается от примерно Ser2073 до Tyr2332. За исключением конкретных сайтов протеолитического расщепления обозначение расположения границ между доменами и областями FVIII может варьироваться в разных литературных источниках. Следовательно, границы, отмеченные в настоящем описании, обозначены как приблизительные путем использования термина примерно.

Ген FVIII человека был выделен и экспрессирован в клетках млекопитающих (Toole, J.J. et al., Nature, 312:342-347 (1984); Gitschier, J. et al., Nature, 312:326-330 (1984); Wood, W.I. et al., Nature, 312:330-337 (1984); Vehar, G.A. et al., Nature, 312:337-342 (1984); WO 87/04187; WO 88/08035; WO 88/03558; патент США № 4757006). Аминокислотная последовательность FVIII была выведена из кДНК, как показано в патенте США № 4965199. Кроме того, FVIII с частичной или полной делецией В-домена показан в патентах США № 4994371 и 4868112. В некоторых вариантах реализации В-домен FVIII человека заменен В-доменом фактора V человека, как показано в патенте США № 5004803. Последовательность кДНК, кодирующая фактор VIII человека, и аминокислотная последовательность представлены в SEQ ID NO: 4 и 5 соответственно в публикации заявки США № 2005/0100990.

Последовательность FVIII свиньи опубликована в Toole, J.J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 83:5939-5942 (1986). Кроме того, полная последовательность кДНК свиньи, полученная в результате ПЦР-амплификации последовательностей FVIII из библиотеки кДНК селезенки свиньи, была описана в Healey, J.F. et al., Blood, 88:4209-4214 (1996). Гибридный FVIII человека/свиньи, содержащий замены всех доменов, всех субъединиц и конкретных аминокислотных последовательностей, описан Lollar и Runge в патенте США № 5364771 и в WO 93/20093. Недавно нуклеотидные и соответствующие амино- 61 042955 кислотные последовательности доменов А1 и А2 FVIII свиньи и химерного FVIII с заменой соответствующих доменов человека на домены А1 и/или А2 свиньи были описаны в WO 94/11503. В патенте

США № 5859204, Lollar, J.S., также описана кДНК свиньи и выведенные аминокислотные последовательности. В патенте США № 6458563 описан FVIII свиньи с делецией В-домена.

В патенте США № 5859204, Lollar, J.S., описаны функциональные мутанты FVIII, обладающие пониженной антигенностью и пониженной иммунореактивностью. В патенте США № 6376463, Lollar, J.S., также описаны мутанты FVIII, обладающие пониженной иммунореактивностью. В публикации заявки США № 2005/0100990, Saenko et al., описаны функциональные мутации в домене А2 FVIII.

В одном из вариантов реализации FVIII (или часть FVIII химерного белка) может быть по меньшей мере на 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичен аминокислотной последовательности FVIII аминокислот с 1 по 1438 SEQ ID NO: 6 или аминокислот с 1 по 2332 SEQ ID NO: 4 (без сигнальной последовательности) или аминокислотной последовательности FVIII аминокислот с 1 по 19 SEQ ID NO: 3 и с 1 по 1438 SEQ ID NO: 6 или аминокислот с 1 по 19 SEQ ID NO: 3 и аминокислот с 1 по 2332 SEQ ID NO: 4 (с сигнальной последовательностью), при этом FVIII обладает свертывающей активностью, например активирует фактор IX в качестве кофактора для превращения фактора X в активированный фактор X. FVIII (или часть FVIII химерного белка) может быть идентичен аминокислотной последовательности FVIII аминокислот с 1 по 1438 SEQ ID NO: 6 или аминокислот с 1 по 2332 SEQ ID NO: 4 (без сигнальной последовательности). FVIII может дополнительно содержать сигнальную последовательность.

В настоящем описании В-домен FVIII является таким же, что и В-домен, известный в данной области техники, который определяется идентичностью внутренней аминокислотной последовательности и сайтами протеолитического расщепления, например остатки Ser741-Arg1648 полноразмерного FVIII человека. Другие домены FVIII человека определяется следующими аминокислотными остатками: А1, остатки Ala1-Arg372; A2, остатки Ser373-Arg740; A3, остатки Serl690-Asn2019; C1, остатки Lys2020-Asn2172; C2, остатки Ser2173-Tyr2332. Последовательность А3-С1-С2 содержит остатки Ser1690-Tyr2332. Остальная последовательность, остатки Glu1649-Arg1689, обычно называется кислотной областью a3. Расположение границ для всех доменов, включая В-домены, для FVIII свиньи, мыши и собаки также известно в данной области техники. В одном из вариантов реализации домен В FVIII делетирован (фактор VIII с делецией В-домена или BDD FVIII). Примером BDD FVIII является РЕФАКТО® (рекомбинантный BDD FVIII), который содержит такую же последовательность, что и часть фактора VIII последовательности в табл. 5. (тяжелая цепь BDD FVIII подчеркнута двойной чертой; домен В выделен курсивом; и легкая цепь BDD FVIII представлена в виде обычного текста). Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 7), кодирующая аминокислотную последовательность, приведенную в табл. 5, представлена в табл. 6.

Таблица 5 Аминокислотная последовательность фактора VIII с делецией В-домена (BDD FVIII)

BDD FVIII (SEQ IDNO: 6)

ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSWYKKTLFVEFT DHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASE GAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLV KDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTOTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDR DAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHT FLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCP EEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDWRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHY IAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTRE AIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGV KHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGP LLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLED PEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKH KMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNT GDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSONPPVYKRAOREITRT TLQS DQEEIDY DDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLR NRAQSGSVPQFKKWFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVT FRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDE FDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFD ETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQR IRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAG IWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPK LARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIM YSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIR STLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQG RSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGH QWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPWNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVL GCEAQDLY

- 62 042955

Таблица 6

Нуклеотидная последовательность, кодирующая BDD FVIII (SEQ ID NO: 7)*

661 A TGCAAATAGA

GCTCTCCACC TGCTTCTTTC

721 TGTGCCTTTT GCGATTCTGC TTTAGTGCCA CCAGAAGATA

CTACCTGGGT GCAGTGGAAC

781 TGTCATGGGA CTATATGCAA AGTGATCTCG GTGAGCTGCC

TGTGGACGCA AGATTTCCTC

841 CTAGAGTGCC AAAATCTTTT CCATTCAACA CCTCAGTCGT

GTACAAAAAG ACTCTGTTTG

901 TAGAATTCAC GGATCACCTT TTCAACATCG CTAAGCCAAG GCCACCCTGG ATGGGTCTGC

961 TAGGTCCTAC CATCCAGGCT GAGGTTTATG ATACAGTGGT

CATTACACTT AAGAACATGG

1021 CTTCCCATCC TGTCAGTCTT CATGCTGTTG GTGTATCCTA

CTGGAAAGCT TCTGAGGGAG

1081 CTGAATATGA TGATCAGACC AGTCAAAGGG AGAAAGAAGA

TGATAAAGTC TTCCCTGGTG

1141 GAAGCCATAC ATATGTCTGG CAGGTCCTGA AAGAGAATGG

TCCAATGGCC TCTGACCCAC

1201 TGTGCCTTAC CTACTCATAT CTTTCTCATG TGGACCTGGT

AAAAGACTTG AATTCAGGCC

1261 TCATTGGAGC CCTACTAGTA TGTAGAGAAG GGAGTCTGGC

CAAGGAAAAG ACACAGACCT

1321 TGCACAAATT TATACTACTT TTTGCTGTAT TTGATGAAGG

GAAAAGTTGG CACTCAGAAA

1381 CAAAGAACTC CTTGATGCAG GATAGGGATG CTGCATCTGC

TCGGGCCTGG CCTAAAATGC

1441 ACACAGTCAA TGGTTATGTA AACAGGTCTC TGCCAGGTCT

GATTGGATGC CACAGGAAAT

1501 CAGTCTATTG GCATGTGATT GGAATGGGCA CCACTCCTGA

AGTGCACTCA ATATTCCTCG

1561 AAGGTCACAC ATTTCTTGTG AGGAACCATC GCCAGGCGTC

CTTGGAAATC TCGCCAATAA

1621 CTTTCCTTAC TGCTCAAACA CTCTTGATGG ACCTTGGACA

GTTTCTACTG TTTTGTCATA

1681 TCTCTTCCCA CCAACATGAT GGCATGGAAG CTTATGTCAA

AGTAGACAGC TGTCCAGAGG

1741 AACCCCAACT ACGAATGAAA AATAATGAAG AAGCGGAAGA

СТАТGATGAT GATCTTAGTG

1801 ATTCTGAAAT GGATGTGGTC AGGTTTGATG ATGACAACTC

TCCTTCCTTT ATCCAAATTC

1861 GCTCAGTTGC CAAGAAGCAT CCTAAAACTT GGGTACATTA

CATTGCTGCT GAAGAGGAGG

1921 ACTGGGACTA TGCTCCCTTA GTCCTCGCCC CCGATGACAG

AAGTTATAAA AGTCAATATT

1981 TGAACAATGG CCCTCAGCGG ATTGGTAGGA AGTACAAAAA

AGTCCGATTT ATGGCATACA

2041 CAGATGAAAC CTTTAAGACT CGTGAAGCTA TTCAGCATGA

ATCAGGAATC TTGGGACCTT

2101 TACTTTATGG GGAAGTTGGA GACACACTGT TGATTATATT

TAAGAATCAA GCAAGCAGAC

2161 CATATAACAT CTACCCTCAC GGAATCACTG ATGTCCGTCC

TTTGTATTCA AGGAGATTAC

2221 CAAAAGGTGT AAAACATTTG AAGGATTTTC CAATTCTGCC

AGGAGAAATA TTCAAATATA

2281 AATGGACAGT GACTGTAGAA GATGGGCCAA CTAAATCAGA

TCCTCGGTGC CTGACCCGCT

2341 ATTACTCTAG TTTCGTTAAT ATGGAGAGAG ATCTAGCTTC

AGGACTCATT GGCCCTCTCC

2401 TCATCTGCTA CAAAGAATCT GTAGATCAAA GAGGAAACCA

GATAATGTCA GACAAGAGGA

2461 ATGTCATCCT GTTTTCTGTA TTTGATGAGA ACCGAAGCTG

GTACCTCACA GAGAATATAC

- 63 042955

2521 AACGCTTTCT CCCCAATCCA TCCAGAGTTC CAAGCCTCCA

2581 ACATCATGCA CAGCATCAAT GCAGTTGTCA GTTTGTTTGC

2641 ATGAGGTGGC ATACTGGTAC GACTGACTTC CTTTCTGTCT

2701 TCTTCTCTGG ATATACCTTC AGACACACTC ACCCTATTCC

GCTGGAGTGC

GGCTATGTTT

ATTCTAAGCA

AGCTTGAGGA

TTGATAGTTT

TTGGAGCACA

TGGTCTATGA

2761 CATTCTCAGG AGAAACTGTC AGGTCTATGG ATTCTGGGGT

2821 GCCACAACTC AGACTTTCGG ACTGAAGGTT TCTAGTTGTG

2881 ACAAGAACAC TGGTGATTAT TATTTCAGCA TACTTGCTGA

2941 GTAAAAACAA TGCCATTGAA CCCACCAGTC TTGAAACGCC

3001 ATCAACGGGA AATAACTCGT AGAGGAAATT GACTATGATG

3061 ATACCATATC AGTTGAAATG TTATGATGAG GATGAAAATC

3121 AGAGCCCCCG CAGCTTTCAA TATTGCTGCA GTGGAGAGGC

3181 TCTGGGATTA TGGGATGAGT AAACAGGGCT CAGAGTGGCA

3241 GTGTCCCTCA GTTCAAGAAA TGATGGCTCC TTTACTCAGC

3301 CCTTATACCG TGGAGAACTA GGGGCCATAT ATAAGAGCAG

3361 AAGTTGAAGA TAATATCATG CTCTCGTCCC TATTCCTTCT

3421 ATTCTAGCCT TATTTCTTAT AGCAGAACCT AGAAAAAACT

3481 TTGTCAAGCC TAATGAAACC GCAACATCAT ATGGCACCCA

3541 CTAAAGATGA GTTTGACTGC TGATGTTGAC CTGGAAAAAG

3601 ATGTGCACTC AGGCCTGATT CACTAACACA CTGAACCCTG

3661 CTCATGGGAG ACAAGTGACA TTTCACCATC TTTGATGAGA

3721 CCAAAAGCTG GTACTTCACT CAGGGCTCCC TGCAATATCC

3781 AGATGGAAGA TCCCACTTTT TGCAATCAAT GGCTACATAA

3841 TGGATACACT ACCTGGCTTA GATTCGATGG TATCTGCTCA

3901 GCATGGGCAG CAATGAAAAC TGGACATGTG TTCACTGTAC

3961 GAAAAAAAGA GGAGTATAAA TCCAGGTGTT TTTGAGACAG

4021 TGGAAATGTT ACCATCCAAA ATGCCTTATT GGCGAGCATC

4081 TACATGCTGG GATGAGCACA TAAGTGTCAG ACTCCCCTGG

4141 GAATGGCTTC TGGACACATT TTCAGGACAA TATGGACAGT

4201 GGGCCCCAAA GCTGGCCAGA CAATGCCTGG AGCACCAAGG

4261 AGCCCTTTTC TTGGATCAAG

TTCATGTCGA

TGGAAAACCC

AACAGAGGCA

TACGAGGACA

CCAAGAAGCT

ACTACTCTTC

AAGAAGGAAG

AAGAAAACAC

AGCTCCCCAC

GTTGTTTTCC

AATGAACATT

GTAACTTTCA

GAGGAAGATC

AAAACTTACT

AAAGCCTGGG

GGACCCCTTC

GTACAGGAAT

GAAAATATGG

AAAGAGAATT

GTAATGGCTC

ATCCATTCTA

ATGGCACTGT

GCTGGAATTT

CTTTTTCTGG

AGAGATTTTC

CTTCATTATT

GTGGATCTGT

TGACCGCCTT

GTTATGAAGA

TCTCTCAAAA

AGTCAGATCA

ATTTTGACAT

GACACTATTT

ATGTTCTAAG

AGGAATTTAC

TGGGACTCCT

GAAATCAGGC

AGAGGCAAGG

TTTGGAAAGT

CTTATTTCTC

TGGTCTGCCA

TTGCTCTGTT

AAAGAAACTG

ATCGCTTCCA

AGGATCAAAG

TTCATTTCAG

ACAATCTCTA

GGCGGGTGGA

TGTACAGCAA

AGATTACAGC

CCGGATCAAT

TGGCACCAAT

GATTATTCAC GGCATCAAGA

- 64 042955

4321 CCCAGGGTGC CCGTCAGAAG TTCTCCAGCC TCTACATCTC TCAGTTTATC ATCATGTATA

4381 GTCTTGATGG GAAGAAGTGG CAGACTTATC GAGGAAATTC CACTGGAACC TTAATGGTCT

4441 TCTTTGGCAA TGTGGATTCA TCTGGGATAA AACACAATAT TTTTAACCCT CCAATTATTG

4501 CTCGATACAT CCGTTTGCAC CCAACTCATT ATAGCATTCG CAGCACTCTT CGCATGGAGT

4561 TGATGGGCTG TGATTTAAAT AGTTGCAGCA TGCCATTGGG AATGGAGAGT AAAGCAATAT

4621 CAGATGCACA GATTACTGCT TCATCCTACT TTACCAATAT GTTTGCCACC TGGTCTCCTT

4681 CAAAAGCTCG ACTTCACCTC CAAGGGAGGA GTAATGCCTG GAGACCTCAG GTGAATAATC

4741 CAAAAGAGTG GCTGCAAGTG GACTTCCAGA AGACAATGAA AGTCACAGGA GTAACTACTC

4801 AGGGAGTAAA ATCTCTGCTT ACCAGCATGT ATGTGAAGGA GTTCCTCATC TCCAGCAGTC

4861 AAGATGGCCA TCAGTGGACT CTCTTTTTTC AGAATGGCAA AGTAAAGGTT TTTCAGGGAA

4921 ATCAAGACTC CTTCACACCT GTGGTGAACT CTCTAGACCC ACCGTTACTG ACTCGCTACC

4981 TTCGAATTCA CCCCCAGAGT TGGGTGCACC AGATTGCCCT GAGGATGGAG GTTCTGGGCT

5041 GCGAGGCACA GGACCTCTAC * Подчеркнутые нуклеиновые кислоты кодируют сигнальный пептид.

FVIII с делецией В-домена может содержать полные или частичные делеции, описанные в патентах США № 6316226, 6346513, 7041635, 5789203, 6060447, 5595886, 6228620, 5972885, 6048720, 5543502, 5610278, 5171844, 5112950, 4868112 и 6458563. В некоторых вариантах реализации последовательность FVIII с делецией В-домена согласно настоящему изобретению содержит любую из делеций, описанных в 4 колонке, 4 строке - 5 колонке, 28 строке и примерах 1-5 патента США № 6316226 (также в US 6346513). В другом варианте реализации фактор VIII с делецией В-домена представляет собой фактор VIII с делецией В-домена S743/Q1638 (SQ BDD FVIII) (например, фактор VIII, содержащий делецию с аминокислоты 744 по аминокислоту 1637, например фактор VIII, содержащий аминокислоты 1-743 и аминокислоты 1638-2332 последовательности SEQ ID NO: 4, т.е. SEQ ID NO: 6). В некоторых вариантах реализации FVIII с делецией В-домена согласно настоящему изобретению содержит делецию, описанную во 2 колонке, 26-51 строках и примерах 5-8 патента США № 5789203 (также US 6060447, US 5595886 и US 6228620). В некоторых вариантах реализации фактор VIII с делецией В-домена содержит делецию, описанную в 1 колонке, 25 строке - 2 колонке, 40 строке патента США № 5972885; 6 колонке, 1-22 строках и примере 1 патента США № 6048720; 2 колонке, 17-46 строках патента США № 5543502; 4 колонке, 22 строке - 5 колонке, 36 строке патента США № 5171844; 2 колонке, 55-68 строках, фиг. 2 и примере 1 патента США № 5112950; 2 колонке, 2 строке - 19 колонке, 21 строке и табл. 2 патента США № 4868112; 2 колонке, 1 строке - 3 колонке, 19 строке, 3 колонке, 40 строке - 4 колонке, 67 строке, 7 колонке, 43 строке - 8 колонке, 26 строке и 11 колонке, 5 строке - 13 колонке, 39 строке патента США № 7041635; или 4 колонке, 25-53 строках патента США № 6458563. В некоторых вариантах реализации FVIII с делецией В-домена содержит делецию большей части домена В, но по-прежнему содержит аминоконцевые последовательности домена В, которые необходимы для протеолитического процессинга in vivo первичного продукта трансляции с образованием двух полипептидных цепей, как описано в WO 91/09122. В некоторых вариантах реализации получен FVIII с делецией В-домена с делецией аминокислот 747-1638, т.е. практически с полной делецией домена В. Hoeben, R.C. et al., J. Biol. Chem., 265(13):7318-7323 (1990). Фактор VIII с делецией В-домена также может содержать делецию аминокислот 771-1666 или аминокислот 868-1562 FVIII. Meulien, P. et al., Protein Eng., 2(4):301-6 (1988). Дополнительные делеции домена В, которые являются частью настоящего изобретения, включают делецию аминокислот с 982 по 1562 или с 760 по 1639 (Toole et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA (1986), 83, 5939-5942), с 797 по 1562 (Eaton, et al., Biochemistry (1986), 25:8343-8347), с 741 по 1646 (Kaufman (опубликованная заявка PCT № WO 87/04187)), 747-1560 (Sarver et al., DNA (1987), 6:553-564), с 741 по 1648 (Pasek (опубликованная заявка PCT № 88/00831)) или с 816 по 1598, или с 741 по 1648 (Lagner (Behring Inst. Mitt. (1988), № 82:16-25, ЕР 295597)). В других вариантах реализации BDD FVIII включает полипептид FVIII, содержащий фрагменты В-домена, сохраняющие один или более сайтов N-связанного гликозилирования, например, остатки 757, 784, 828, 900, 963 или, возможно, 943, которые соответствуют аминокислотной последовательности полноразмерной последовательности FVIII. Примеры фрагментов В-домена включают 226 аминокислот или 163 аминокислоты В-домена, описанные в Miao, H.Z. et al., Blood, 103(a):3412-3419 (2004), Kasuda, A. et al., J. Thromb. Haemost., 6:1352-1359 (2008); и Pipe, S.W. et al., J. Thromb. Haemost.,

- 65 042955

9:2235-2242 (2011) (т.е. первые 226 аминокислот или 163 аминокислоты домена В сохраняются). В других вариантах реализации BDD FVIII содержит также точечную мутацию в остатке 309 (от Phe к Ser) для улучшения экспрессии белка BDD FVIII. См. Miao, H.Z. et al., Blood, 103(a):3412-3419 (2004). В других вариантах реализации BDD FVIII включает полипептид FVIII, содержащий часть В-домена, но не содержащий один или более сайтов расщепления фурином (например, Arg1313 и Arg1648). См. Pipe, S.W. et al., J. Thromb. Haemost., 9:2235-2242 (2011). Каждая из вышеуказанных делеций может быть произведена в любой последовательности FVIII.

В некоторых вариантах реализации FVIII содержит частичный В-домен. В некоторых вариантах реализации белок FVIII, содержащий частичный В-домен, представляет собой FVIII198 (SEQ ID NO: 89). FVIII198 представляет собой содержащую частичный В-домен одноцепочечную молекулу FVIIIFc-226N6. 226 представляет собой N-концевую аминокислоту 226 В-домена FVIII, и N6 представляет собой шесть сайтов N-гликозилирования в В-домене.

В одном из вариантов реализации FVIII расщепляется сразу после аргинина в аминокислоте 1648 (в полноразмерном факторе VIII или SEQ ID NO: 4), аминокислоте 754 (в факторе VIII с делецией В-домена S743/Q1638 или SEQ ID NO: 6) или соответствующем остатке аргинина (в других вариантах), что тем самым приводит к образованию тяжелой цепи и легкой цепи. В другом варианте реализации FVIII содержит тяжелую цепь и легкую цепь, которые связаны или ассоциированы нековалентной связью, опосредуемой ионом металла.

В других вариантах реализации FVIII представляет собой одноцепочечный FVIII, который не был расщеплен сразу после аргинина в аминокислоте 1648 (в полноразмерном FVIII или SEQ ID NO: 4), аминокислоте 754 (в FVIII с делецией В-домена S743/Q1638 или SEQ ID NO: 6) или соответствующем остатке аргинина (в других вариантах). Одноцепочечный FVIII может содержать одну или более замен аминокислот. В одном из вариантов реализации замена аминокислоты находится в остатке, соответствующем остатку 1648, остатку 1645 или обоим в полноразмерном зрелом полипептиде FVIII (SEQ ID NO: 4), или остатку 754, остатку 751 или обоим в SQ BDD факторе VIII (SEQ ID NO: 6). Замена аминокислоты может представлять собой любые аминокислоты, отличные от аргинина, например изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, треонин, триптофан, валин, аланин, аспарагин, аспарагиновую кислоту, цистеин, глутаминовую кислоту, глутамин, глицин, пролин, селеноцистеин, серии, тирозин, гистидин, орнитин, пирролизин или таурин.

FVIII также может расщепляться тромбином, а затем активироваться в виде FVIIIa, служащего в качестве кофактора для активированного фактора IX (FIXa). И активированный FIX совместно с активированным FVIII образует комплекс Xase и превращает фактор X в активированный фактор X (FXa). Для активации FVIII расщепляется тромбином после трех остатков аргинина, в аминокислотах 372, 740 и 1689 (соответствующих аминокислотам 372, 740 и 795 в последовательности FVIII с делецией В-домена); в результате данного расщепления образуется FVIIIa, содержащий цепи А1 50 кДа, А2 43 кДа и А3-С1-С2 73 кДа. В одном из вариантов реализации белок FVIII, подходящий для настоящего изобретения, представляет собой неактивный FVIII. В другом варианте реализации белок FVIII представляет собой активированный FVIII.

Белок, содержащий полипептид FVIII, связанный или ассоциированный с VWFфрагментом фактора фон Виллебранда, может содержать последовательность, по меньшей мере на 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичную SEQ ID NO: 4 или 6, при этом указанная последовательность обладает свертывающей активностью FVIII, например активирует фактор IX в качестве кофактора для превращения фактора X в активированный фактор X (FXa).

В настоящем описании термин гибридные или химерные полипептиды и белки включает комбинацию первой полипептидной цепи, например, VWFфрагмента фактора фон Виллебранда, возможно слитого с первой константной областью Ig или ее частью, со второй полипептидной цепью, например белком FVIII, связанным с последовательностью XTEN, возможно слитой со второй константной областью Ig или ее частью, тем самым образуя гетеродимер. В одном из вариантов реализации первый полипептид и второй полипептид в гибриде ассоциированы друг с другом за счет белок-белковых взаимодействий, таких как взаимодействия заряд-заряд или гидрофобные взаимодействия. В другом варианте реализации первый полипептид и второй полипептид в гибриде ассоциированы друг с другом дисульфидной или другой ковалентной(ыми) связью(ями). Гибриды описаны, например, в US 2004/101740 и US 2006/074199. Второй полипептид может представлять собой идентичную копию первого полипептида или неидентичный полипептид. В одном из вариантов реализации первый полипептид представляет собой гибридный белок FVIII-белок(X)-Fc, а второй полипептид представляет собой полипептид, содержащий, по существу состоящий из или состоящий из области Fc, при этом первый полипептид и второй полипептид ассоциированы друг с другом. В другом варианте реализации первый полипептид содержит гибридный белок VWFфрагмент фактора фон Виллебранда-XTEN-Fc, а второй полипептид содержит гибридный белок FVIII-Fc, образующие гибрид - гетеродимер. В других вариантах реализации первый полипептид содержит гибридный белок VWFфрагмент фактора фон Виллебранда-Fc, а второй полипептид содержит гибридный белок FVIII(X)-Fc, образующие гибрид - гетеродимер. В других вариантах реализации первый полипептид содержит гибридный белок VWFфрагмент фактора фон Виллебранда-XTEN-Fc, а второй

- 66 042955 полипептид содержит гибридный белок FVin(X)-Fc. Первый полипептид и второй полипептид могут быть ассоциированы ковалентной связью, например дисульфидной связью между первой областью Fc и второй областью Fc. Первый полипептид и второй полипептид также могут быть ассоциированы друг с другом путем образования связи между VWFфрагментом фактора фон Виллебранда и белком FVIII.

Белок FVIII, подходящий для настоящего изобретения, может включать FVIII, содержащий одну или более дополнительных последовательностей XTEN, которые не влияют на коагулирующую активность FVIII. Такие последовательности XTEN могут быть слиты с С-концом или N-концом белка FVIII, или встроены между одним или более из двух аминокислотных остатков в белке FVIII, при этом данные встраивания не влияют на коагулирующую активность FVIII или функцию FVIII. В одном из вариантов реализации указанные встраивания улучшают фармакокинетические свойства белка FVIII (например, период полувыведения). В другом варианте реализации встраивания могут представлять собой многочисленные встраивания, например, больше двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти или десяти встраиваний. Примеры сайтов встраивания включают, но не ограничиваются перечисленными: сайты, перечисленные в табл. 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, или их любые комбинации.

Белок FVIII, связанный с одной или более последовательностями XTEN, может быть представлен в виде FVIII(X), FVIII(X1), FVIII(_a^_b)-X-FVIII(c^d), где FVIII^;

содержит, по существу состоит из или состоит из первой части белка FVIII от аминокислотного остатка a до аминокислотного остатка b;

X или XI содержит, по существу состоит из или состоит из одной или более последовательностей XTEN, FVIII_{(c >d)} содержит, по существу состоит из или состоит из второй части белка FVIII от аминокислотного остатка c до аминокислотного остатка d;

a представляет собой N-концевой аминокислотный остаток первой части белка FVIII;

b представляет собой С-концевой аминокислотный остаток первой части белка FVIII, a также представляет собой N-концевой аминокислотный остаток двух аминокислот сайта встраивания, в который встроена последовательность XTEN;

с представляет собой N-концевой аминокислотный остаток второй части белка FVIII, a также представляет собой С-концевой аминокислотный остаток двух аминокислот сайта встраивания, в который встроена последовательность XTEN; и d представляет собой С-концевой аминокислотный остаток белка FVIII, при этом первая часть белка FVIII и вторая часть белка FVIII не идентичны друг другу и вместе имеют достаточную длину, в результате чего указанный белок FVIII обладает коагулирующей активностью FVIII.

В одном из вариантов реализации первая часть белка FVIII и вторая часть белка FVIII представляют собой фрагменты SEQ ID NO: 4 [полноразмерная последовательность зрелого FVIII] или SEQ ID NO: 6 [FVIII с делецией В-домена], например N-концевую часть и С-концевую часть соответственно. В некоторых вариантах реализации первая часть белка FVIII содержит домен А1 и домен А2 белка FVIII. Вторая часть белка FVIII содержит домен A3, домен С1 и, возможно, домен С2. В других вариантах реализации первая часть белка FVIII содержит домен А1 и домен А2, а вторая часть белка FVIII содержит часть домена В, домен A3, домен С1 и возможно домен С2. В других вариантах реализации первая часть белка FVIII содержит домен А1, домен А2 и часть домена В белка FVIII, а вторая часть белка FVIII содержит домен A3, домен С1 и возможно домен С2. В других вариантах реализации первая часть белка FVIII содержит домен А1, домен А2 и первую часть домена В белка FVIII. Вторая часть белка FVIII содержит вторую часть домена В, домен A3, домен С1 и возможно домен С2. В некоторых вариантах реализации две аминокислоты (b и с) могут представлять собой любой один или более аминокислотных остатков сайтов встраивания, представленных в табл. 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 и 15. Например, b может представлять собой аминокислотный остаток непосредственно выше сайта, в который встроена или с которым связана одна или более последовательностей XTEN, и с может представлять собой аминокислотный остаток непосредственно ниже сайта, в который встроена или с которым связана одна или более последовательностей XTEN. В некоторых вариантах реализации a представляет собой первую зрелую аминокислотную последовательность белка FVIII, и d представляет собой последнюю аминокислотную последовательность белка FVIII. Например, FVIII(_a^_b); может представлять собой аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичную аминокислотам с 1 по 745 последовательности SEQ ID NO: 6 [аминокислотная последовательность FVIII с делецией В-домена] или последовательности SEQ ID NO: 4 [полноразмерный FVIII], и FVIII_{(c >d)} может представлять собой аминокислоты с 746 по 1438 последовательности SEQ ID NO: 6 или аминокислоты с 1641 по 2332 последовательности SEQ ID NO: 4 соответственно. В соответствии с некоторыми аспектами сайт встраивания в белке FVIII располагается в одном или более доменах белка FVIII, которые представляют собой N-конец, домен А1, домен А2, домен A3, домен В, домен С1, домен С2, С-конец или их две или более комбинаций, или между двумя доменами белка FVIII, которые представляют собой домен А1 и кислотную область a1, и кислотную область a1 и домен А2, домен А2 и кислотную область а2, кислотную область а2 и домен В, домен В и домен A3, и домен A3 и домен С1, домен С1 и домен С2 или их

- 67 042955 любые комбинации. Например, сайты встраивания, в которые может быть встроена последовательность XTEN, выбраны из группы, состоящей из N-конца и домена А1, N-конца и домена А2, N-конца и домена A3, N-конца и домена В, N-конца и домена С1, N-конца и домена С2, N-конца и С-конца, доменов А1 и А2, доменов А1 и A3, доменов А1 и В, доменов А1 и С1, доменов А1 и С2, домена А1 и С-конца, доменов А2 и A3, доменов А2 и В, доменов А2 и С1, доменов А2 и С2, домена А2 и С-конца, доменов A3 и В, доменов A3 и С1, доменов A3 и С2, домена A3 и С-конца, доменов В и С1, доменов В и С2, домена В и С-конца, доменов С1 и С2, С1 и С-конца, домена С2 и С-конца, и их двух или более комбинаций. Неограничивающие примеры сайтов встраивания перечислены в табл. 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 и 15.

Белок FVIII, в котором последовательность XTEN встроена непосредственно ниже одной или более аминокислот (например, один или более сайтов встраивания XTEN) в белке FVIII или связана с С-концом или N-концом, сохраняет активность FVIII после связывания или встраивания последовательности XTEN. Последовательность XTEN может быть встроена в белок FVIII один раз или более одного раза, два раза, три раза, четыре раза, пять раз или шесть раз так, чтобы указанные встраивания не влияли на активность FVIII (т.е. белок FVIII по-прежнему сохранял коагулирующее свойство).

Белок FVIII, подходящий для настоящего изобретения, может быть связан с одним или более полипептидами XTEN на N-конце или С-конце белка FVIII необязательным линкером, или указанные полипептиды могут быть встроены непосредственно ниже одной или более аминокислот (например, один или более сайтов встраивания XTEN) в белке FVIII с помощью одного или более необязательных линкеров. В одном из вариантов реализации два аминокислотных остатка, в которые встроена последовательность XTEN, или аминокислотный остаток, с которым связана последовательность XTEN, соответствуют двум или одному аминокислотному остатку последовательности SEQ ID NO: 4 [полноразмерный зрелый FVIII], выбранному из группы, состоящей из остатков в табл. 7, 8, 9 и 10, и их любых комбинаций.

В других вариантах реализации по меньшей мере одна последовательность XTEN встроена в любом одном или более сайтах встраивания XTEN, описанных в настоящем документе, или их любых комбинациях. В соответствии с одним из аспектов по меньшей мере одна последовательность XTEN встроена в одном или более сайтах встраивания XTEN, описанных в табл. 7.

Таблица 7

Типичные сайты встраивания XTEN

No.	Точка встраивания XTEN*	Остаток встраивания	Нижележащая последовательность BDD FVIII	Домен FVIII
1	0	(N-конец)	ATR	Al
2	3	R	RYY	Al
3	17	М	QSD	Al
4	18	Q	SDL	Al
5	22	G	ELP	Al
6	24	L	PVD	Al
7	26	V	DAR	Al
8	28	А	RFP	Al
9	32	Р	RVP	Al
10	38	F	PFN	Al
И	40	F	NTS	Al
12	41	N	TSV	Al
13	60	N	IAK	Al
14	61	I	AKP	Al
15	65	R	PPW	Al
16	81	Y	DTV	Al
17	111	G	AEY	Al
18	116	D	QTS	Al
19	119	S	QRE	Al
20	120	Q	REK	Al
21	128	V	FPG	Al
22	129	F	PGG	Al
23	130	Р	GGS	Al
24	182	G	SLA	Al
25	185	А	KEK	Al
26	188	К	TQT	Al
27	205	G	KSW	Al
28	210	S	ETK	Al
29	211	Е	TKN	Al
30	216	L	MQD	Al

- 68 042955

31	220	R	DAA	Al
32	222	A	ASA	Al
33	223	A	SAR	Al
34	224	S	ARA	Al
35	230	К	MHT	Al
36	243	P	GLI	Al
37	244	G	LIG	Al
38	250	R	KSV	Al
39	318	D	GME	Al
40	333	P	QLR	Al
42	334	Q	LRM	Al
43	336	R	MKN	al
44	339	N	NEE	al
45	345	D	YDD	al
46	357	V	VRF	al
47	367	s	FIQ	al
48	370	s	RPY	al
49	375	A	KKH	A2
50	376	К	КНР	A2
51	378	H	PKT	A2
52	399	V	LAP	A2
53	403	D	DRS	A2
54	405	R	SYK	A2
55	409	S	QYL	A2
56	416	P	QRI	A2
57	434	E	TFK	A2
58	438	T	REA	A2
59	441	A	IQH	A2
60	442	I	QHE	A2
61	463	I	IFK	A2
62	487	Y	SRR	A2
63	490	R	LPK	A2
64	492	P	KGV	A2
65	493	К	GVK	A2
66	494	G	VKH	A2
67	500	D	FPI	A2
68	506	G	EIF	A2
69	518	E	DGP	A2
70	556	К	ESV	A2
71	565	Q	IMS	A2
72	566	I	MSD	A2
73	598	P	AGV	A2
74	599	A	GVQ	A2
75	603	L	EDP	A2
76	616	S	ING	A2
77	686	G	LWI	A2
78	713	К	NTG	A2
79	719	Y	EDS	A2
80	730	L	LSK	A2
81	733	К	NNA	A2
82	745	N	PPV**	В
83	1640	P	PVL	В
84	1652	R	TTL	В
85	1656	Q	SDQ	АЗ
86	1685	N	QSP	АЗ
87	1711	M	sss	АЗ
88	1713	s	SPH	АЗ
89	1720	N	RAQ	АЗ
90	1724	s	GSV	АЗ
91	1725	G	SVP	АЗ
92	1726	S	VPQ	АЗ
93	1741	G	SFT	АЗ
94	1744	T	QPL	АЗ
95	1749	R	GEL	АЗ
96	1773	V	TFR	АЗ
97	1792	Y	EED	АЗ
98	1793	E	EDQ	АЗ
99	1796	Q	RQG	АЗ

- 69 042955

100	1798	Q	GAE	A3
101	1799	G	АЕР	A3
102	1802	Р	RKN	A3
103	1803	R	KNF	A3
104	1807	V	KPN	A3
105	1808	К	PNE	A3
106	1827	К	DEF	A3
107	1844	Е	KDV	A3
108	1861	N	TLN	A3
109	1863	L	NPA	A3
ПО	1896	Е	RNC	A3
111	1900	R	АРС	A3
112	1904	N	IQM	A3
113	1905	I	QME	A3
114	1910	Р	TFK	A3
115	1920	А	ING	A3
116	1937	D	QRI	A3
117	1981	G	VFE	A3
118	2019	N	KCQ	A3
119	2020	К	CQT	Cl
120	2044	G	QWA	Cl
121	2068	F	SWI	Cl
122	2073	V	DLL	Cl
123	2090	R	QKF	Cl
124	2092	К	FSS	Cl
125	2093	F	SSL	Cl
126	2111	К	WQT	Cl
127	2115	Y	RGN	Cl
128	2120	Т	GTL	Cl
129	2125	V	FFG	Cl
130	2171	L	NSC	Cl
131	2173	S	CSM	C2
132	2188	А	QIT	C2
133	2223	V	NNP	C2
134	2224	N	NPK	C2
135	2227	К	EWL	C2
136	2268	G	HQW	C2
137	2277	N	GKV	C2
138	2278	G	KVK	C2
139	2290	F	TPV	C2
140	2332	Y	С-конец FVIII	CT

* Показывает точку встраивания XTEN на основе номера аминокислоты в зрелом полноразмерном FVIII человека, при этом указанное встраивание может происходить либо в N-, либо в С-концевой части указанной аминокислоты.

В некоторых вариантах реализации одна или более последовательностей XTEN встроены в пределах примерно шести аминокислот выше или ниже аминокислот 32, 220, 224, 336, 339, 399, 416, 603, 1656, 1711, 1725, 1905 или 1910, соответствующих последовательности SEQ ID NO: 4, или их любых комбинаций.

Таблица 8

Типичные диапазоны встраивания XTEN

No.	Точка встраивания XTEN*	Остаток встраивания	Нижележащая последовательность BDD FVIII	Домен FVIII	Отдаленность от остатка встраивания*
9	32	P	RVP	Al	-3,+6
31	220	R	DAA	Al	-
34	224	S	ARA	Al	+5
43	336	R	MKN	al	-1,+6
44	339	N	NEE	al	-4, +5
52	399	V	LAP	A2	-6, +3
56	416	P	QRI	A2	+6
75	603	L	EDP	A2	6, +6
85	1656	Q	SDQ	В	-3,+6
87	1711	M	sss	A3	-6,+1
91	1725	G	SVP	A3	+6
113	1905	I	QME	A3	+6
114	1910	P	TFK	A3	-5,+6

* Отдаленность от остатка встраивания относится к относительному числу аминокислот от N-конца (отрицательные числа) или С-конца (положитель- 70 042955 ные числа) обозначенного остатка встраивания (остаток 0), где может быть произведено встраивание.

Обозначение -x относится к сайту встраивания, который расположен на х аминокислот в сторону на N-концевой части обозначенного остатка встраивания. Подобным образом, обозначение +x относится к сайту встраивания, который расположен на x аминокислот в сторону на С-концевой части обозначенного остатка встраивания.

Например, -1, +2 означает, что встраивание произведено на N-конце или С-конце аминокислотных остатков, обозначенных -1, 0, +1 или +2.

В других вариантах реализации одна или более последовательностей XTEN встроены непосредственно ниже одной или более аминокислот, соответствующих полноразмерному зрелому FVIII человека, выбранных из группы, состоящей из одного или более сайтов встраивания в табл. 9.

Таблица 9 _____Типичные сайты или диапазоны встраивания XTEN_____

No.	Диапазон точек встраивания XTEN *	Первый остаток встраивания	Домен FVIII
3	18-32	Q	Al
8	40	F	Al
18	211-224	Е	Al
27	336-403	R	Al, A2
43	599	А	A2
47	745-1640	N	В
50	1656-1728	Q	В, аЗ, АЗ
57	1796-1804	R	АЗ
65	1900-1912	R	АЗ
81	2171-2332	L	Cl, С2

* Показывает диапазон сайтов встраивания, пронумерованных относительно номера аминокислоты зрелого FVIII человека.

В других вариантах реализации одна или более XTEN встроены в домен В FVIII. В одном из примеров XTEN встроена между аминокислотами 740 и 1640, соответствующими SEQ ID NO: 4, при этом последовательность FVIII между аминокислотами 740 и 1640 возможно не присутствует. В другом примере XTEN встроена между аминокислотами 741 и 1690, соответствующими SEQ ID NO: 4, при этом последовательность FVIII между аминокислотами 740 и 1690 возможно не присутствует. В других примерах XTEN встроена между аминокислотами 741 и 1648, соответствующими SEQ ID NO: 4, при этом последовательность FVIII между аминокислотами 741 и 1648 возможно не присутствует. В других примерах XTEN встроена между аминокислотами 743 и 1638, соответствующими SEQ ID NO: 4, при этом последовательность FVIII между аминокислотами 743 и 1638 возможно не присутствует. В других примерах XTEN встроена между аминокислотами 745 и 1656, соответствующими SEQ ID NO: 4, при этом последовательность FVIII между аминокислотами 745 и 1656 возможно не присутствует. В некоторых примерах XTEN встроена между аминокислотами 745 и 1657, соответствующими SEQ ID NO: 4, при этом последовательность FVIII между аминокислотами 745 и 1657 возможно не присутствует. В некоторых примерах XTEN встроена между аминокислотами 745 и 1667, соответствующими SEQ ID NO: 4, при этом последовательность FVIII между аминокислотами 745 и 1667 возможно не присутствует. В других примерах XTEN встроена между аминокислотами 745 и 1686, соответствующими SEQ ID NO: 4, при этом последовательность FVIII между аминокислотами 745 и 1686 возможно не присутствует. В некоторых других примерах XTEN встроена между аминокислотами 747 и 1642, соответствующими SEQ ID NO: 4, при этом последовательность FVIII между аминокислотами 747 и 1642 возможно не присутствует. В других примерах XTEN встроена между аминокислотами 751 и 1667, соответствующими SEQ ID NO: 4, при этом последовательность FVIII между аминокислотами 751 и 1667 возможно не присутствует.

В некоторых вариантах реализации одна или более XTEN встроены в одну или более аминокислот непосредственно ниже аминокислоты сайта встраивания, выбранного из группы, состоящей из аминокислотных остатков в табл. 10.

- 71 042955

Таблица 10

Сайты встраивания XTEN FVIII и обозначения конструкций

Номер конструкции	Домен	№ вышележащего остатка*	№ нижележащего остатка*	Вышележащая последовательность	Нижележащая последовательность
F8X-1	А1	3	4	ATR	RYY
F8X-2	А1	18	19	YMQ	SDL
F8X-3	А1	22	23	DLG	ELP
F8X-4	А1	26	27	LPV	DAR
F8X-5	А1	40	41	FPF	NTS
F8X-6	А1	60	61	LFN	IAK
F8X-7	А1	116	117	YDD	QTS
F8X-8	А1	130	131	VFP	GGS
F8X-9	А1	188	189	КЕК	TQT
F8X-10	А1	216	217	NSL	MQD
F8X-11	А1	230	231	WPK	MHT
F8X-12	А1	333	334	ЕЕР	QLR
F8X-13	А2	375	376	SVA	KKH
F8X-14	А2	403	404	APD	DRS
F8X-15	А2	442	443	EAI	QHE
F8X-16	А2	490	491	RRL	PKG
F8X-17	А2	518	519	TVE	DGP
F8X-18	А2	599	600	NPA	GVQ
F8X-19	А2	713	714	CDK	NTG
F8X-20	BD	745	746	SQN	PPV
F8X-21	BD	745	746	SQN	PPV
F8X-22	BD**	745	746	SQN	PPV
F8X-23	АЗ	1720	1721	APT	KDE
F8X-24	АЗ	1796	1797	EDQ	RQG
F8X-25	АЗ	1802	1803	АЕР	RKN
F8X-26	АЗ	1827	1828	РТК	DEF
F8X-27	АЗ	1861	1862	HTN	TLN
F8X-28	АЗ	1896	1897	NME	RNC
F8X-29	АЗ	1900	1901	NCR	APC
F8X-30	АЗ	1904	1905	PCN	IQM
F8X-31	АЗ	1937	1938	AQD	QRI
F8X-32	С1	2019	2020	YSN	KCQ
F8X-33	С1	2068	2069	EPF	SWI
F8X-34	С1	2111	2112	GKK	WQT
F8X-35	С1	2120	2121	NST	GTL
F8X-36	С2	2171	2172	CDL	NSC
F8X-37	С2	2188	2189	SDA	QIT
F8X-38	С2	2227	2228	NPK	EWL
F8X-39	С2	2277	2278	FQN	GKV

- 72 042955

F8X-40	CT	2332	нет данных	DLY	NA
F8X-41	CT	2332	нет данных	DLY	NA
F8X-42	Al	3	4	ATR	ATR
pSDOOOl	A2	403	404
pSD0002	A2	599	600
pSD0021	N-koh.	0	1
pSD0022	Al	32	33
pSD0023	Al	65	66
pSD0024	Al	81	82
pSD0025	Al	119	120
pSD0026	Al	211	212
pSD0027	Al	220	221
pSD0028	Al	224	225
pSD0029	Al	336	337
pSD0030	Al	339	340
pSD0031	A2	378	379
pSD0032	A2	399	400
pSD0033	A2	409	410
pSD0034	A2	416	417
pSD0035	A2	487	488
pSD0036	A2	494	495
pSD0037	A2	500	501
pSD0038	A2	603	604
pSD0039	A3	1656	1657
pSD0040	A3	1711	1712
pSD0041	A3	1725	1726
pSD0042	A3	1749	1750
pSD0043	A3	1905	1906
pSD0044	A3	1910	1911
pDS0062	A3	1900	1901

* Показывает номер аминокислоты зрелого белка FVIII.

В одном из вариантов реализации один или более сайтов встраивания XTEN расположены в пределах одной или более гибких петлеобразных структур белка FVIII с доступностью поверхностных групп (например, пермиссивная петля). Например, по меньшей мере одна последовательность XTEN может быть встроена в каждый домен А FVIII, содержащий по меньшей мере две пермиссивных петли, в которые может быть встроен по меньшей мере один полипептид XTEN без устранения прокоагулянтной активности рекомбинантного белка или способности рекомбинантных белков экспрессироваться in vivo или in vitro в клетке-хозяине. Пермиссивные петли представляют собой области, которые допускают встраивание по меньшей мере одной последовательности XTEN, с высокой степенью доступности поверхностных групп или высокой степенью доступности для растворителей, и высокой конформационной гибкостью, среди других признаков. Домен А1 содержит область пермиссивной петли-1 (А1-1), и область пермиссивной петли-2 (А1-2), домен А2 содержит область пермиссивной петли-1 (А2-1) и область пермиссивной петли-2 (А2-2), домен A3 содержит область пермиссивной петли-1 (A3-1) и область пермиссивной петли-2 (A3-2). В соответствии с одним из аспектов первая пермиссивная петля в домене А1 (А1-1) FVIII расположена между бета-нитью 1 и бета-нитью 2, а вторая пермиссивная петля в домене А2 (A1-2) FVIII расположена между бета-нитью 11 и бета-нитью 12. Первая пермиссивная петля в домене А2 (А2-1) FVIII расположена между бета-нитью 22 и бета-нитью 23, а вторая пермиссивная петля в домене А2 (А2-2) FVIII расположена между бета-нитью 32 и бета-нитью 33. Первая пермиссивная петля в домене A3 (A3-1) FVIII расположена между бета-нитью 38 и бета-нитью 39, а вторая пермиссивная петля в A3 (А3-2) FVIII расположена между бета-нитью 45 и бета-нитью 46. В соответствии с некоторыми аспектами гибкая петлеобразная структура с доступностью поверхностных групп, содержащая А1-1, соответствует области в нативном зрелом FVIII человека от примерно аминокислоты 15 до примерно аминокислоты 45 последовательности SEQ ID NO: 4, например от примерно аминокислоты 18 до примерно аминокислоты 41 последовательности SEQ ID NO: 4. В соответствии с другими аспектами гибкая петлеобразная структура с доступностью поверхностных групп, содержащая А1-2, соответствует области в нативном зрелом FVIII человека от примерно аминокислоты 201 до примерно аминокислоты 232 последовательности SEQ ID NO: 4, например, от примерно аминокислоты 218 до примерно аминокислоты 229 последовательности SEQ ID NO: 4. В соответствии с другими аспектами гибкая петлеобразная структура с доступностью поверхностных групп, содержащая А2-1, соответствует области в нативном зрелом FVIII человека от примерно аминокислоты 395 до примерно аминокислоты 421 последовательности SEQ ID NO: 4, например от примерно аминокислоты 397 до примерно аминокислоты 418 последовательности SEQ ID NO: 4. В соответствии с другими аспектами гибкая петлеобразная структура с доступностью поверхностных групп,

- 73 042955 содержащая А2-2, соответствует области в нативном зрелом FVIII человека от примерно аминокислоты 577 до примерно аминокислоты 635 последовательности SEQ ID NO: 4, например от примерно аминокислоты 595 до примерно аминокислоты 607 последовательности SEQ ID NO: 4. В соответствии с другими аспектами гибкая петлеобразная структура с доступностью поверхностных групп, содержащая А3-1, соответствует области в нативном зрелом FVIII человека от примерно аминокислоты 1705 до примерно аминокислоты 1732 последовательности SEQ ID NO: 4, например, от примерно аминокислоты 1711 до примерно аминокислоты 1725 последовательности SEQ ID NO: 4. В соответствии с другими аспектами гибкая петлеобразная структура с доступностью поверхностных групп, содержащая A3-2, соответствует области в нативном зрелом FVIII человека от примерно аминокислоты 1884 до примерно аминокислоты 1917 последовательности SEQ ID NO: 4, например, от примерно аминокислоты 1899 до примерно аминокислоты 1911 последовательности SEQ ID NO: 4.

В другом варианте реализации одна или более аминокислот, в которые встроена по меньшей мере одна последовательность XTEN, расположены в пределах домена a3, например аминокислоты с 1649 по 1689, соответствующие полноразмерному зрелому полипептиду FVIII. В конкретном варианте реализации последовательности XTEN встроена между аминокислотами 1656 и 1657 последовательности SEQ ID NO: 4 (полноразмерный зрелый FVIII). В конкретном варианте реализации белок FVIII, содержащий последовательность XTEN, встроенную непосредственно ниже аминокислоты 1656, соответствующей SEQ ID NO: 4, также содержит делецию с аминокислоты 745 по аминокислоту 1656, соответствующую SEQ ID NO: 4.

В некоторых вариантах реализации один или более сайтов встраивания для одного или более встраиваний XTEN расположены непосредственно ниже одной или более аминокислот, выбранных из группы, состоящей из (1) аминокислоты 3, (2) аминокислоты 18, (3) аминокислоты 22, (4) аминокислоты 26, (5) аминокислоты 32, (6) аминокислоты 40, (7) аминокислоты 60, (8) аминокислоты 65, (9) аминокислоты 81, (10) аминокислоты 116, (11) аминокислоты 119, (12) аминокислоты 130, (13) аминокислоты 188, (14) аминокислоты 211, (15) аминокислоты 216, (16) аминокислоты 220, (17) аминокислоты 224, (18) аминокислоты 230, (19) аминокислоты 333, (20) аминокислоты 336, (21) аминокислоты 339, (22) аминокислоты 375, (23) аминокислоты 399, (24) аминокислоты 403, (25) аминокислоты 409, (26) аминокислоты 416, (26) аминокислоты 442, (28) аминокислоты 487, (29) аминокислоты 490, (30) аминокислоты 494, (31) аминокислоты 500, (32) аминокислоты 518, (33) аминокислоты 599, (34) аминокислоты 603, (35) аминокислоты 713, (36) аминокислоты 745, (37) аминокислоты 1656, (38) аминокислоты 1711, (39) аминокислоты 1720, (40) аминокислоты 1725,

- 74 042955 (41) аминокислоты 1749, (42) аминокислоты 1796, (43) аминокислоты 1802, (44) аминокислоты 1827, (45) аминокислоты 1861, (46) аминокислоты 1896, (47) аминокислоты 1900, (48) аминокислоты 1904, (49) аминокислоты 1905, (50) аминокислоты 1910, (51) аминокислоты 1937, (52) аминокислоты 2019, (53) аминокислоты 2068, (54) аминокислоты 2111, (55) аминокислоты 2120, (56) аминокислоты 2171, (57) аминокислоты 2188, (58) аминокислоты 2221, (59) аминокислоты 2277, и (60) двух или более комбинаций указанных кислот.

В одном из вариантов реализации белок FVIII, подходящий для настоящего изобретения, содержит две последовательности XTEN:

первую последовательность XTEN, встроенную в первый сайт встраивания XTEN; и вторую XTEN, встроенную во второй сайт встраивания XTEN.

Неограничивающие примеры первого сайта встраивания XTEN и второго сайта встраивания XTEN перечислены в табл. 11.

Таблица 11

Типичные сайты встраивания для двух XTEN________

Встраив Сайт встраивания	ание 1 Домен
745	В
26	А1
40	А1
18	А1
26	А1
40	А1
18	А1
1720	АЗ
1725	АЗ
1711	АЗ
1720	АЗ
1725	АЗ
1656	АЗ
1656	АЗ
1656	АЗ
1656	АЗ
1656	АЗ
1656	АЗ
1656	АЗ
1900	АЗ
1900	АЗ
1900	АЗ
1905	АЗ
1905	АЗ
1905	АЗ
1910	АЗ
18	А1
26	А1
40	А1
18	А1
1656	АЗ
1656	АЗ
1711	АЗ
1711	АЗ
1720	АЗ
1720	АЗ

Встраи! Сайт встраивания	$ание 2 Домен
2332	СТ
403	А2
403	А2
403	А2
599	А2
599	А2
599	А2
1900	АЗ
1900	АЗ
1905	АЗ
1905	АЗ
1905	АЗ
26	А1
18	А1
40	А1
399	А2
403	А2
1725	АЗ
1720	АЗ
18	А1
26	А1
40	А1
18	А1
40	А1
26	А1
26	А1
399	А2
399	А2
399	А2
403	А2
1900	АЗ
1905	АЗ
40	А1
26	А1
26	А1
40	А1

- 75 042955

1720	АЗ	18	А1
1725	АЗ	26	А1
1725	АЗ	40	А1
1725	АЗ	18	А1
1720	АЗ	403	А2
1720	АЗ	399	А2
1711	АЗ	403	А2
1720	АЗ	403	А2
1725	АЗ	403	А2
1725	АЗ	399	А2
1711	АЗ	403	А2
1900	АЗ	399	А2
1900	АЗ	403	А2
1905	АЗ	403	А2
1905	АЗ	399	А2
1910	АЗ	403	А2

Две XTEN, встроенные или связанные с белком FVIII, могут быть одинаковыми или разными. В некоторых вариантах реализации белок FVIII, подходящий для настоящего изобретения, содержит две последовательности XTEN, встроенные в белок FVIII:

первую последовательность XTEN, встроенную непосредственно ниже аминокислоты 745, соответствующей SEQ ID NO: 4; и вторую последовательность XTEN, встроенную непосредственно ниже аминокислоты 2332, соответствующей SEQ ID NO: 4 (С-конец).

В других вариантах реализации первая последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 18, 26, 40, 1656 или 1720, соответствующей SEQ ID NO: 4, а вторая последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 403, соответствующей SEQ ID NO: 4. В других вариантах реализации первая последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 18, 26 или 40, соответствующей SEQ ID NO: 4, а вторая последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 599, соответствующей SEQ ID NO: 4. В других вариантах реализации первая последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 1656, соответствующей SEQ ID NO: 4, а вторая последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 18, 26, 40, 399, 403, 1725, 1720, 1900, 1905 или 2332, соответствующей SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах реализации первая последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 1900, соответствующей SEQ ID NO: 4, а вторая последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 18, 26 или 40, соответствующей SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах реализации первая последовательность встроена непосредственно ниже аминокислоты 18, 26 или 40, соответствующей SEQ ID NO: 4, а вторая последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 399, соответствующий SEQ ID NO: 4. В других вариантах реализации первая последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 1720, соответствующей SEQ ID NO: 4, а вторая последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 18, 26, или 40, соответствующей SEQ ID NO: 4. В других вариантах реализации первая последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 1720, соответствующей SEQ ID NO: 4, а вторая последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 18, соответствующей SEQ ID NO: 4. В конкретном варианте реализации белок FVIII содержит две последовательности XTEN:

первую последовательность XTEN, встроенную непосредственно ниже аминокислоты 745, соответствующей SEQ ID NO: 4; и вторую последовательность XTEN, встроенную непосредственно ниже аминокислоты 2332, соответствующей SEQ ID NO: 4, при этом указанный белок FVIII также содержит делецию с аминокислоты 745, соответствующей SEQ ID NO: 4, по аминокислоту 1685, соответствующую SEQ ID NO: 4, мутацию или замену в аминокислоте 1680, соответствующей SEQ ID NO: 4, например Y1680F, мутацию или замену в аминокислоте 1648, соответствующей SEQ ID NO: 4, например R1648A, или по меньшей мере две мутации или замены в аминокислоте 1648, соответствующей SEQ ID NO: 4, например R1648А, и аминокислоте 1680, соответствующей SEQ IDNO: 4, например Y1680F.

В конкретном варианте реализации белок FVIII содержит две последовательности XTEN:

первую последовательность XTEN, встроенную непосредственно ниже аминокислоты 1656, соответствующей SEQ ID NO: 4; и вторую последовательность XTEN, встроенную непосредственно ниже аминокислоты 2332 последовательности SEQ ID NO: 4, при этом указанный белок FVIII также содержит делецию с аминокислоты 745 по аминокислоту 1656, соответствующую SEQ ID NO: 4.

В некоторых вариантах реализации белок FVIII содержит три последовательности XTEN:

первую последовательность XTEN, встроенную в первый сайт встраивания XTEN;

-76042955 вторую последовательность XTEN, встроенную во второй сайт встраивания XTEN; и третью последовательность XTEN, встроенную в третий сайт встраивания XTEN.

Указанная первая, вторая или третья последовательности XTEN могут быть одинаковыми или разными. Указанный первый, второй и третий сайты встраивания могут быть выбраны из группы любого из сайтов встраивания, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации белок FVIII, содержащий три последовательности XTEN, также может содержать мутацию или замену, например, аминокислоты 1648, соответствующей SEQ ID NO: 4, например R1648A. Например, неограничивающие примеры первого, второго и третьего сайтов встраивания XTEN перечислены в табл. 12.

Таблица 12

Типичные сайты встраивания для трех XTEN

Встраивание 1	Встраивание 2	Встраивание 3
Сайт встраивания	Домен	Сайт встраивания	Домен	Сайт встраивания	Домен
26	А1	403	А2	1656	АЗ
26	А1	403	А2	1720	АЗ
26	А1	403	А2	1900	АЗ
26	А1	1656	АЗ	1720	АЗ
26	А1	1656	АЗ	1900	АЗ
26	А1	1720	АЗ	1900	АЗ
403	А2	1656	АЗ	1720	АЗ
403	А2	1656	АЗ	1900	АЗ
403	А2	1720	АЗ	1900	АЗ
1656	АЗ	1720	АЗ	1900	АЗ
745	В	1900		2332	СТ
18	А1	745	В	2332	ст
26	А1	745	В	2332	ст
40	А1	745	в	2332	ст
18	А1	745	в	2332	ст
40	А1	745	в	2332	ст
403	А2	745	в	2332	ст
399	А2	745	в	2332	ст
1725	АЗ	745	в	2332	ст
1720	АЗ	745	в	2332	ст
1711	АЗ	745	в	2332	ст
1900	АЗ	745	в	2332	ст
1905	АЗ	745	в	2332	ст
1910	АЗ	745	в	2332	ст

В некоторых вариантах реализации белок FVIII содержит три последовательности XTEN: первую последовательность XTEN, встроенную непосредственно ниже аминокислоты 26, соответствующей SEQ ID NO: 4, вторую последовательность XTEN, встроенную непосредственно ниже аминокислоты 403, соответствующей SEQ ID NO: 4, и третью последовательность XTEN, встроенную непосредственно ниже аминокислоты 1656, 1720 или 1900, соответствующей SEQ ID NO: 4. В других вариантах реализации первая последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 26, соответствующей SEQ ID NO: 4, вторая последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 1656, соответствующей SEQ ID NO: 4, а третья последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 1720 или 1900, соответствующей SEQ ID NO: 4. В других вариантах реализации первая последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 26, соответствующей SEQ ID NO: 4, вторая последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 1720, соответствующей SEQ ID NO: 4, а третья последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 1900, соответствующей SEQ ID NO: 4. В других вариантах реализации первая последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 403, соответствующей SEQ ID NO: 4, вторая последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 1656, соответствующей SEQ ID NO: 4, а третья последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 1720 или 1900, соответствующей SEQ ID NO: 4. В других вариантах реализации первая последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 403 или 1656, соответствующей SEQ ID NO: 4, вторая последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 1720, соответствующей SEQ ID NO: 4, а третья последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 1900, соответствующей SEQ ID NO: 4. В других вариантах реализации первая последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 18, 26, 40, 399, 403, 1711, 1720, 1725, 1900, 1905 или 1910, соответствующей SEQ ID NO: 4, вторая последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 745, соответствующей SEQ ID NO: 4, а третья последовательность XTEN встроена непосредственно ниже аминокислоты 2332, соответствующей SEQ ID NO: 4. В других вариантах реализации белок FVIII содержит четыре последовательности XTEN: первую последовательность XTEN, встроенную в первый сайт встраивания, вторую последовательность XTEN, встроенную во второй сайт встраивания, третью после

- 77 042955 довательность XTEN, встроенную в третий сайт встраивания, и четвертую последовательность XTEN, встроенную в четвертый сайт встраивания. Указанная первая, вторая, третья и четвертая последовательности XTEN могут быть одинаковыми, разными или представлять собой их комбинации. В некоторых вариантах реализации белок FVIII, содержащий четыре последовательности XTEN, также может содержать мутацию или замену, например, аминокислоты 1648, соответствующей SEQ ID NO: 4, например R1648A. Неограничивающие примеры первого, второго, третьего и четвертого сайтов встраивания XTEN перечислены в табл. 13.

Таблица 13

Типичные сайты встраивания для четырех XTEN

Встраивание 1	Встраивание 2	Встраивание 3	Встраивание 4
Сайт встраивания	Домен	Сайт встраивания	Домен	Сайт встраива НИЯ	Домен	Сайт встраивания	Домен
26	А1	403	А2	1656	аЗ	1720	АЗ
26	А1	403	А2	1656	аЗ	1900	АЗ
26	А1	403	А2	1720	АЗ	1900	АЗ
26	А1	1656	аЗ	1720	АЗ	1900	АЗ
403	А2	1656	аЗ	1720	АЗ	1900	АЗ
0040	А1	0403	А2	745	В	2332	СТ
0040	А1	0403	А2	745	В	2332	ст
0018	А1	0409	А2	745	в	2332	ст
0040	А1	0409	А2	745	в	2332	ст
0040	А1	0409	А2	745	в	2332	ст
0018	А1	0409	А2	745	в	2332	ст
0040	А1	1720	АЗ	745	в	2332	ст
0026	А1	1720	АЗ	745	в	2332	ст
0018	А1	1720	АЗ	745	в	2332	ст
0018	А1	1720	АЗ	745	в	2332	ст
0018	А1	1720	АЗ	745	в	2332	ст
0026	А1	1720	АЗ	745	в	2332	ст
0018	А1	1720	АЗ	745	в	2332	ст
0018	А1	1900	АЗ	745	в	2332	ст
0018	А1	1900	АЗ	745	в	2332	ст
0026	А1	1900	АЗ	745	в	2332	ст
0040	А1	1900	АЗ	745	в	2332	ст
0040	А1	1905	АЗ	745	в	2332	ст
0018	А1	1905	АЗ	745	в	2332	ст
0040	А1	1905	АЗ	745	в	2332	ст
0026	А1	1905	АЗ	745	в	2332	ст
0018	А1	1905	АЗ	745	в	2332	ст
0018	А1	1905	АЗ	745	в	2332	ст
0018	А1	1910	АЗ	745	в	2332	ст
0018	А1	1910	АЗ	745	в	2332	ст
0040	А1	1910	АЗ	745	в	2332	ст
0026	А1	1910	АЗ	745	в	2332	ст
0018	А1	1910	АЗ	745	в	2332	ст
0026	А1	1910	АЗ	745	в	2332	ст
0040	А1	1910	АЗ	745	в	2332	ст
0018	А1	1910	АЗ	745	в	2332	ст
0409	А2	1720	АЗ	745	в	2332	ст
0403	А2	1720	АЗ	745	в	2332	ст
0409	А2	1720	АЗ	745	в	2332	ст
0403	А2	1720	АЗ	745	в	2332	ст
0403	А2	1720	АЗ	745	в	2332	ст
0403	А2	1900	АЗ	745	в	2332	ст
0403	А2	1900	АЗ	745	в	2332	ст
0409	А2	1900	АЗ	745	в	2332	ст
0403	А2	1900	АЗ	745	в	2332	ст
0403	А2	1900	АЗ	745	в	2332	ст
0409	А2	1900	АЗ	745	в	2332	ст
0409	А2	1905	АЗ	745	в	2332	ст
0403	А2	1905	АЗ	745	в	2332	ст
0403	А2	1905	АЗ	745	в	2332	ст
0403	А2	1905	АЗ	745	в	2332	ст

- 78 042955

0409	А2	1905	АЗ	745	В	2332	СТ
0403	А2	1905	АЗ	745	В	2332	ст
0409	А2	1910	АЗ	745	В	2332	ст
0403	А2	1910	АЗ	745	в	2332	ст
0403	А2	1910	АЗ	745	в	2332	ст
0403	А2	1910	АЗ	745	в	2332	ст
0403	А2	1910	АЗ	745	в	2332	ст
1720	АЗ	1900	АЗ	745	в	2332	ст
1720	АЗ	1905	АЗ	745	в	2332	ст
1720	АЗ	1910	АЗ	745	в	2332	ст
1720	АЗ	1910	АЗ	745	в	2332	ст
0403	А2	1656	аЗ	1720	АЗ	2332	ст
0403	А2	1656	аЗ	1900	АЗ	2332	ст
0403	А2	1720	АЗ	1900	АЗ	2332	ст
1656	аЗ	1720	АЗ	1900	АЗ	2332	ст
0018	А1	0403	А2	1656	аЗ	2332	ст
0018	А1	0403	А2	1720	АЗ	2332	ст
0018	А1	0403	А2	1900	АЗ	2332	ст
0018	А1	1656	аЗ	1720	АЗ	2332	ст
0018	А1	1656	аЗ	1900	АЗ	2332	ст
0018	А1	1720	АЗ	1900	АЗ	2332	ст
0018	А1	0403	А2	0745	В	2332	ст
0018	А1	0745	В	1720	АЗ	2332	ст
0018	А1	0745	В	1900	АЗ	2332	ст
0403	А2	0745	В	1720	АЗ	2332	ст
0403	А2	0745	в	1900	АЗ	2332	ст
0745	В	1720	АЗ	1900	АЗ	2332	ст
0188	А1	1900	АЗ	0745	В	2332	ст
0599		1900	АЗ	0745	В	2332	ст
2068		1900	АЗ	0745	в	2332	ст
2171		1900	АЗ	0745	в	2332	ст
2227		1900	АЗ	0745	в	2332	ст
2277		1900	АЗ	0745	в	2332	ст

В некоторых вариантах реализации белок FVIII содержит пять последовательностей XTEN:

первую последовательность XTEN, встроенную в первый сайт встраивания;

вторую последовательность XTEN, встроенную во второй сайт встраивания;

третью последовательность XTEN, встроенную в третий сайт встраивания;

четвертую последовательность XTEN, встроенную в четвертый сайт встраивания; и пятую последовательность XTEN, встроенную в пятый сайт встраивания.

Указанная первая, вторая, третья, четвертая и пятая последовательности XTEN могут быть одинаковыми, разными или представлять собой их комбинации. Неограничивающие примеры первого, второго, третьего, четвертого и пятого сайтов встраивания XTEN перечислены в табл. 14.

Таблица 14

Типичные сайты встраивания для пяти XTEN

Встраивание XTEN 1	Встраивание XTEN 2	Встраивание XTEN3	Встраивание XTEN 4	Встраивание XTEN 5
0403	1656	1720	1900	2332
0018	0403	1656	1720	2332
0018	0403	1656	1900	2332
0018	0403	1720	1900	2332
0018	1656	1720	1900	2332
0018	0403	0745	1720	2332
0018	0403	0745	1900	2332
0018	0745	1720	1900	2332
0403	0745	1720	1900	2332

В некоторых вариантах реализации белок FVIII содержит шесть последовательностей XTEN: первую последовательность XTEN, встроенную в первый сайт встраивания;

вторую последовательность XTEN, встроенную во второй сайт встраивания;

третью последовательность XTEN, встроенную в третий сайт встраивания;

четвертую последовательность XTEN, встроенную в четвертый сайт встраивания;

пятую последовательность XTEN, встроенную в пятый сайт встраивания; и шестую последовательность XTEN, встроенную в шестой сайт встраивания.

Указанная первая, вторая, третья, четвертая, пятая или шестая последовательности XTEN могут

- 79 042955 быть одинаковыми, разными или представлять собой их комбинации. Примеры шести сайтов встраивания

XTEN включают, но не ограничиваются перечисленными: сайты встраивания, перечисленные в табл. 15.

Таблица 15

Типичные сайты встраивания XTEN для шести XTEN

B страивание ΧΤΕΝΙ	Встраивание XTEN 2	Встраивание XTEN3	Встраивание XTEN 4	Встраивание XTEN 5	Встраивание XTEN 6
0018	0403	1656	1720	1900	2332
0018	0403	0745	1720	1900	2332

В конкретном примере первая XTEN встроена между аминокислотами 26 и 27, соответствующими SEQ ID NO: 4, а вторая XTEN встроена между аминокислотами 1720 и 1721, соответствующими SEQ ID NO: 4 (полноразмерный зрелый FVIII). В другом примере первая XTEN встроена между аминокислотами 403 и 404, соответствующими SEQ ID NO: 4, а вторая XTEN встроена между аминокислотами 1720 и 1721, соответствующими SEQ ID NO: 4. В некоторых примерах первая XTEN встроена между аминокислотами 1656 и 1657, соответствующими SEQ ID NO: 4, а вторая XTEN встроена между аминокислотами 1720 и 1721, соответствующими SEQ ID NO: 4. В других примерах первая XTEN встроена между аминокислотами 26 и 27, соответствующими SEQ ID NO: 4, вторая XTEN встроена между аминокислотами 1656 и 1657, соответствующими SEQ ID NO: 4, а третья XTEN встроена между аминокислотами 1720 и 1721, соответствующими SEQ ID NO: 4. В других вариантах реализации первая XTEN встроена между аминокислотами 403 и 404, соответствующими SEQ ID NO: 4, вторая XTEN встроена между аминокислотами 1656 и 1657, соответствующими SEQ ID NO: 4, а третья XTEN встроена между аминокислотами 1720 и 1721, соответствующими SEQ ID NO: 4. В других вариантах реализации первая XTEN встроена между аминокислотами 403 и 404, соответствующими SEQ ID NO: 4, вторая XTEN встроена между аминокислотами 1656 и 1657, соответствующими SEQ ID NO: 4, а третья XTEN встроена между аминокислотами 1720 и 1721, соответствующими SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах реализации первая XTEN встроена между аминокислотами 26 и 27, соответствующими SEQ ID NO: 4, вторая XTEN встроена между аминокислотами 1720 и 1721, соответствующими SEQ ID NO: 4, а третья XTEN встроена между аминокислотами 1900 и 1901, соответствующими SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах реализации первая XTEN встроена между аминокислотами 26 и 27, соответствующими SEQ ID NO: 4, вторая XTEN встроена между аминокислотами 1656 и 1657, соответствующими SEQ ID NO: 4, третья XTEN встроена между аминокислотами 1720 и 1721, соответствующими SEQ ID NO: 4, а четвертая XTEN встроена между аминокислотами 1900 и 1901, соответствующими SEQ ID NO: 4.

В конкретном варианте реализации последовательность XTEN встроена между аминокислотами 745 и 746 полноразмерного фактора VIII или в соответствующий сайт встраивания фактора VIII с делецией В-домена.

В некоторых вариантах реализации химерный белок согласно настоящему изобретению содержит две полипептидных последовательности:

первую полипептидную последовательность, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере примерно на 80, 90, 95 или 100% идентичную последовательности, выбранной из

FVin-161 (SEQ Ш NO: 101), FVIII-169 (SEQ Ш NO: 103), FVIII-170 (SEQ ID NO:102),

FVIII-173 (SEQ ID NO: 104); FVIII-195 (SEQ ID NO: 105); FVIII-196 (SEQ ID NO:106),

FVIII-199 (SEQ ID NO: 107), FVIII-201 (SEQ ID NO: 108); FVIII-203 (SEQ ID NO:109),

FVIII-204 (SEQ ID NO: 110), FVIII-205 (SEQ ID NO: 111), FVIII-266 (SEQ ID NO: 112), FVIII267 (SEQ ID NO: 113), FVIII-268 (SEQ ID NO: 114), FVIII-269 (SEQ ID NO: 115), FVIII-271 (SEQ ID NO: 116) или FVIII-272 (SEQ ID NO: 117), и вторую полипептидную последовательность, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере примерно на 80, 90, 95 или 100% идентичную последовательности, выбранной из VWF031 (SEQ ID NO: 118), VWF034 (SEQ ID NO: 119) или VWF-036 (SEQ ID NO: 120).

D) Константная область Ig или ее часть.

VWFфрагмент фактора фон Виллебранда или белок FVIII, связанный с последовательностью XTEN в настоящем изобретении, может дополнительно содержать константную область Ig или ее часть. Указанная константная область Ig или ее часть может улучшать фармакокинетические или фармакодинамические свойства VWFфрагмента фактора фон Виллебранда или белка FVIII в комбинации с последовательностью XTEN. В некоторых вариантах реализации константная область Ig или ее часть увеличивает период полувыведения молекулы, слитой с данной константной областью Ig или ее частью. Константная область Ig состоит из доменов, обозначаемых доменами СН (константные тяжелые) (CH1, CH2 и т.д.). В зависимости от изотипа (т.е. IgG, IgM, IgA, IgD или IgE) константная область может состоять из трех или четырех доменов СН. Константные области некоторых изотипов (например, IgG) также содержат шарнирную область. См. Janeway et al., 2001, Immunobiology, Garland Publishing, N.Y., N.Y. Константная область Ig или ее часть для получения химерного белка согласно настоящему изобретению может быть получена из ряда различных источников. В некоторых вариантах реализации константная область Ig или

- 80 042955 ее часть получена из Ig человека. Однако понятно, что константная область Ig или ее часть может быть получена из Ig других видов млекопитающих, включая, например, грызунов (например, мышей, крыс, кроликов, морских свинок) или нечеловекообразных приматов (например, шимпанзе, макак). Более того, константная область Ig или ее часть может быть получена из любого класса Ig, включая IgM, IgG, IgD, IgA и IgE, и любого изотипа Ig, включая IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. В одном из вариантов реализации используют изотип IgG1 человека. Различные последовательности генов константной области Ig (например, последовательности генов константной области человека) доступны в форме общедоступных хранилищ. Может быть выбрана последовательность доменов константной области, имеющая конкретную эффекторную функцию (или с отсутствием конкретного эффекторной функции) или с конкретной модификацией для снижения иммуногенности. Были опубликованы многие последовательности антител и генов, кодирующих антитела, и подходящие последовательности константной области Ig (например, шарнирные последовательности, последовательности СН2 и/или CH3 или их части) могут быть получены из данных последовательностей с использованием методов, известных в данной области техники. Генетический материал, полученный с использованием любого из вышеуказанных методов, может быть затем изменен или синтезирован с получением полипептидов согласно настоящему изобретению. Также очевидно, что в объем настоящего изобретения включены аллели, варианты и мутации последовательностей ДНК константной области.

Последовательности константной области Ig или ее части могут быть клонированы, например, с использованием полимеразной цепной реакции и праймеров, выбранных для амплификации представляющего интерес домена. Для клонирования последовательности константной области Ig или ей части из антитела, мРНК может быть выделена из гибридомы, селезенки или лимфоцитов, обратно транскрибирована в ДНК и гены антител амплифицированы путем ПЦР. Методы ПЦР-амплификации подробно описаны в патентах США № 4683195; 4683202; 4800159; 4965188; и, например, в PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al., eds., Academic Press, San Diego, CA (1990); Ho et al., 1989, Gene 77:51; Horton et al., 1993, Methods Enzymol., 217:270. ПНР может быть инициирована консенсусными праймерами константной области или более специфическими праймерами на основе опубликованных ДНК- и аминокислотных последовательностей тяжелой и легкой цепи. Как рассмотрено выше, ПЦР также можно использовать для выделения клонов ДНК, кодирующих легкую и тяжелую цепь антител. В данном случае может быть проведен скрининг библиотек с помощью консенсусных праймеров или более крупных гомологичных зондов, таких как зонды константной области мыши. В данной области техники известны многочисленные наборы праймеров, подходящие для амплификации генов антител (например, 5' праймеры на основе N-концевой последовательности очищенных антител (Benhar and Pastan, 1994, Protein Engineering, 7:1509); быстрая амплификация концов кДНК (Ruberti, F. et al., 1994, J. Immunol. Methods, 173:33); лидерные последовательности антител (Larrick et al., 1989, Biochem. Biophys. Res. Commun., 160:1250)). Клонирование последовательностей антител также описано у Newman et al., патент США № 5658570, зарегистрированный 25 января 1995 г., содержание которого включено в настоящее описание посредством ссылки. Константная область Ig, используемая согласно настоящему изобретению, может содержать все домены и шарнирную область или их части. В одном из вариантов реализации константная область Ig или ее часть содержит домен СН2, домен CH3 и шарнирную область, т.е. область Fc или партнер по связыванию FcRn. В настоящем описании термин область Fc определяется как часть полипептида, соответствующая области Fc нативного Ig, т.е. как образованная путем димерной ассоциации соответствующих доменов Fc двух тяжелых цепей. Нативная область Fc образует гомодимер с другой областью Fc. В отличие от этого, в настоящем описании термин генетически слитая область Fc или одноцепочечная область Fc (область scFc) относится к синтетической димерной области Fc, состоящей из доменов Fc, генетически связанных в пределах одной полипептидной цепи (т.е. кодированных в одной непрерывной генетической последовательности).

В одном из вариантов реализации термин область Fc относится к части одной тяжелой цепи Ig, начинающейся в шарнирной области непосредственно выше сайта расщепления папаином (т.е. остаток 216 в IgG, принимая первый остаток константной области тяжелой цепи за 114) и заканчивающейся на С-конце антитела. Соответственно, полный домен Fc содержит по меньшей мере шарнирный домен, домен СН2 и домен CH3. Область Fc константной области Ig в зависимости от изотипа Ig может включать домены СН2, CH3 и СН4, а также шарнирную область. Химерные белки, содержащие область Fc Ig, приобретают некоторые желаемые свойства, включая повышенную стабильность, увеличенный период полувыведения из сыворотки (см. Capon et al., 1989, Nature, 337:525), а также связывание с рецепторами Fc, такими как неонатальный рецептор Fc (FcRn) (патенты США № 6086875, 6485726, 6030613; WO 03/077834; US 2003-0235536 А1, полное содержание которых включено в настоящее описание посредством ссылки).

Константная область Ig или ее часть может являться партнером по связыванию FcRn. FcRn активен в эпителиальных тканях взрослых и экспрессируется в полости кишечника, легочных дыхательных путях, носовых поверхностях, вагинальных поверхностях, поверхностях толстой и прямой кишки (патент США № 6485726). Партнер по связыванию FcRn представляет собой часть Ig, которая связывается с FcRn. Рецептор FcRn был выделен из нескольких видов млекопитающих, включая людей. Известны по

- 81 042955 следовательности FcRn человека, FcRn обезьяны, FcRn крысы и FcRn мыши (Story et al., 1994, J. Exp. Med., 180:2377). Рецептор FcRn связывает IgG (но не другие классы Ig, такие как IgA, IgM, IgD и IgE) при относительно низком pH, активно переносит IgG трансклеточным путем по направлению от просвета органа к серозной оболочке, а затем высвобождает IgG при относительно более высоком pH, обнаруживаемом в интерстициальных жидкостях. Он экспрессируется в эпителиальной ткани взрослых (патенты США № 6485726, 6030613, 6086875; WO 03/077834; US 2003-0235536 A1), включая эпителий легких и кишечника (Israel et al., 1997, Immunology, 92:69), эпителий проксимальных почечных канальцев (Kobayashi et al., 2002, Am. J. Physiol. Renal. Physiol., 282:F358), а также эпителий носовой полости, вагинальные поверхности и поверхности желчного дерева.

Партнеры по связыванию FcRn, подходящие для настоящего изобретения, включают молекулы, которые могут быть специфично связаны рецептором FcRn, включая целый IgG, Fc-фрагмент IgG и другие фрагменты, которые содержат полную область связывания рецептора FcRn. Область Fc-части IgG, которая связывается с рецептором FcRn, была описана на основе рентгеновской кристаллографии (Burmeister et al., 1994, Nature, 372:379). Основная область контакта Fc с FcRn располагается вблизи соединения доменов СН2 и CH3. Все контакты Fc-FcRn происходят в пределах одной тяжелой цепи Ig. Партнеры по связыванию FcRn включают полный IgG, Fc-фрагмент IgG и другие фрагменты, которые содержат полную область связывания FcRn. Основные контактные участки включают аминокислотные остатки 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 и 314 домена СН2, и аминокислотные остатки 385-387, 428 и 433-436 домена CH3. Все ссылки на нумерацию аминокислот Ig или фрагментов, или областей Ig приведены на основе Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, Md.

Области Fc или партнеры по связыванию FcRn, связанные с FcRn, могут эффективно курсировать через эпителиальные барьеры за счет FcRn, что таким образом обеспечивает неинвазивные способы системного введения желаемой терапевтической молекулы. Кроме того, гибридные белки, содержащие область Fc или партнер по связыванию FcRn, подвергаются эндоцитозу клетками, экспрессирующими FcRn. Но вместо намеченного распада данные гибридные белки снова возвращаются в кровообращение, что таким образом увеличивает период полувыведения данных белков in vivo. В некоторых вариантах реализации части константных областей Ig представляют собой область Fc или партнер по связыванию FcRn, который, как правило, ассоциирует через дисульфидные связи и другие неспецифические взаимодействия с другой областью Fc или другим партнером по связыванию FcRn с образованием димеров и мультимеров более высокого порядка.

Два рецептора FcRn могут связывать одну молекулу Fc. Кристаллографические данные позволяют предположить, что каждая молекула FcRn связывает один полипептид гомодимера Fc. В одном из вариантов реализации связывание партнера по связыванию FcRn, например Fc-фрагмента IgG, с биологически активной молекулой позволяет доставлять указанную биологически активную молекулу перорально, трансбуккально, сублингвально, ректально, вагинально, в виде аэрозоля, вводимого назально, или легочным путем, или глазным путем. В другом варианте реализации химерный белок может быть введен инвазивным путем, например подкожно, внутривенно.

Область, являющаяся партнером по связыванию FcRn, представляет собой молекулу или ее часть, которая может быть специфично связана рецептором FcRn с последующим активным переносом рецептором FcRn области Fc. Термин специфично связанный относится к двум молекулам, образующим комплекс, который является относительно стабильным в физиологических условиях. Специфическое связывание характеризуется высокой аффинностью и способностью от низкой до умеренной в отличие от неспецифического связывания, которое обычно имеет низкую аффинность и способность от умеренной до высокой. Как правило, связывание считается специфическим, когда константа аффинности KA больше 106 М^-1 или больше 10⁸ М^-1. При необходимости неспецифическое связывание может быть уменьшено по существу без влияния на специфическое связывание путем варьирования условий связывания. Соответствующие условия связывания, такие как концентрация молекул, ионная сила раствора, температура, время, отведенное на связывание, концентрация блокирующего агента (например, сывороточного альбумина, казеина молока) и т.д., могут быть оптимизированы специалистом в данной области техники с использованием обычных способов. В некоторых вариантах реализации химерный белок согласно настоящему изобретению содержит одну или более укороченных областей Fc, которые однако при этом являются достаточными для придания области Fc связывающих свойств в отношении рецептора Fc (FcR). Например, часть области Fc, которая связывается с FcRn (т.е. FcRn-связывающая часть) содержит аминокислоты примерно 282-438 IgG1, система нумерации ЕС (первичными контактными сайтами являются аминокислоты 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 и 314 домена СН2 и аминокислотные остатки 385-387, 428 и 433-436 домена CH3. Таким образом, область Fc согласно настоящему изобретению может содержать или состоять из FcRn-связывающей части. FcRn-связывающие части могут быть получены из тяжелых цепей любого изотипа, включая IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. В одном из вариантов реализации используют FcRn-связывающую часть антитела изотипа IgG1 человека. В другом варианте реализации используют FcRn-связывающую часть антитела изотипа IgG4 человека.

В другом варианте реализации область Fc включает аминокислотную последовательность домена

- 82 042955

Fc или полученную из домена Fc. В некоторых вариантах реализации область Fc содержит по меньшей мере один из: шарнирный (например, верхняя, средняя и/или нижняя шарнирная область) домен (аминокислоты примерно 216-230 области Fc антитела в соответствии с нумерацией ЕС), домен СН2 (аминокислоты примерно 232-340 области Fc антитела в соответствии с нумерацией ЕС), домен CH3 (аминокислоты примерно 341-438 области Fc антитела в соответствии с нумерацией ЕС), домен СН4 или их вариант, часть или фрагмент. В других вариантах реализации область Fc содержит полный домен Fc (т.е. шарнирный домен, домен СН2 и домен CH3). В некоторых вариантах реализации область Fc содержит, по существу состоит из или состоит из шарнирного домена (или его части), слитого с доменом CH3 (или его частью), шарнирного домена (или его части), слитого с доменом СН2 (или его частью), домена СН2 (или его части), слитого с доменом CH3 (или его частью), домена СН2 (или его части), слитого как с шарнирным доменом (или его частью), так и с доменом CH3 (или его частью). В других вариантах реализации область Fc не содержит по меньшей мере часть домена СН2 (например, весь или часть домена СН2). В конкретном варианте реализации область Fc содержит или состоит из аминокислот, соответствующих номерам ЕС с 221 по 447. Области Fc, обозначаемые в настоящем описании F, F1 или F2, могут быть получены из ряда различных источников. В одном из вариантов реализации область Fc полипептида получена из Ig человека. Однако понятно, что область Fc может быть получена из Ig других видов млекопитающих, включая, например, грызунов (например, мышей, крыс, кроликов или морских свинок) или нечеловекообразных приматов (например, шимпанзе, макак). Более того, полипептид доменов Fc или их частей может быть получен из любого класса Ig, включая IgM, IgG, IgD, IgA и IgE, и любого изотипа Ig, включая IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. В другом варианте реализации используют изотип IgG1 человека. В некоторых вариантах реализации вариант Fc обеспечивает изменение по меньшей мере одной эффекторной функции, наделенной областью Fc, содержащей указанный домен Fc дикого типа (например, улучшение или снижение способности области Fc связываться с рецепторами Fc (например, FcyRI, FcyRII или FcyRIII) или белками комплемента (например, C1q), или запускать антителозависимую цитотоксичность (ADCC), фагоцитоз или комплементзависимую цитотоксичность (CDCC)). В других вариантах реализации вариант Fc обеспечивает встроенный остаток цистеина. В областях Fc согласно настоящему изобретению можно использовать известные в данной области техники варианты Fc, которые, как известно, придают изменение (например, увеличение или уменьшение) эффекторной функции и/или связывания FcR или FcRn. В частности, связывающая молекула согласно настоящему изобретению может содержать, например, изменение (например, замену) в одном или более положениях аминокислот, описанных в международных публикациях PCT WO 88/07089 A1, WO 96/14339 A1, WO 98/05787 A1, WO 98/23289 A1, WO 99/51642 A1, WO 99/58572 A1, WO 00/09560 A2, WO 00/32767 A1, WO 00/42072 A2, WO 02/44215 A2, WO 02/060919 A2, WO 03/074569 A2, WO 04/016750 A2, WO 04/029207 A2, WO 04/035752 A2, WO 04/063351 A2, WO 04/074455 A2, W O04/099249 A2, WO 05/040217 A2, WO 04/044859, WO 05/070963 A1, WO 05/077981 A2, WO 05/092925 A2, WO 05/123780 A2, WO 06/019447 A1,

WO 06/047350 A2 и WO 06/085967 A2; публикациях патента США № US 2007/0231329,

US 2007/0231329, US 2007/0237765, US 2007/0237766, US 2007/0237767, US 2007/0243188,

US 20070248603, US 20070286859, US 20080057056; или патентах США 5648260; 5739277; 5834250; 5869046; 6096871; 6121022; 6194551; 6242195; 6277375; 6528624; 6538124; 6737056; 6821505; 6998253; 7083784; 7404956 и 7317091, содержание каждого из которых включено в настоящее описание посредством ссылки. В одном из вариантов реализации может быть произведено конкретное изменение (например, конкретная замена одной или более аминокислот, описанная в данной области техники) в одном или более из описанных положений аминокислот. В другом варианте реализации может быть произведено другое изменение в одном или более из описанных положений аминокислот (например, другая замена одного или более положений аминокислот, описанная в данной области техники). Область Fc или партнер по связыванию FcRn IgG может быть модифицирован в соответствии с хорошо известными процедурами, такими как сайт-направленный мутагенез и т.п., с получением модифицированных фрагментов IgG или Fc, или их частей, которые будет связывать FcRn. Такие модификации включают модификации, удаленные от контактных сайтов FcRn, а также модификации в пределах контактных сайтов, которые сохраняют или даже увеличивают связывание с FcRn. Например, следующие единичные аминокислотные остатки в Fc IgG1 человека (Fcy1) могут быть заменены без значительной потери аффинности связывания Fc в отношении

- 83 042955

FcRn: P238A, S239A, K246A, K248A,

D249A, M252A, T256A, E258A, T260A, D265A, S267A, H268A, E269A, D270A, E272A,

L274A, N276A, Y278A, D280A, V282A, E283A, H285A, N286A, T289A, K290A, R292A, E293A, E294A, Q295A, Y296F, N297A, S298A, Y300F, R301A, V303A, V305A, T307A, L309A, Q311A, D312A, N315A, K317A, E318A, K320A, K322A, S324A, K326A, A327Q, P329A, A330Q, P331A, ЕЗЗЗА, K334A, T335A, S337A, K338A, K340A, Q342A, R344A, E345A, Q347A, R355A, E356A, M358A, T359A, K360A, N361A, Q362A, Y373A, S375A, D376A, A378Q, E380A, E382A, S383A, N384A, Q386A, E388A, N389A, N390A, Y391F, K392A, L398A, S400A, D401A, D413A, K414A, R416A, Q418A, Q419A, N421A, V422A, S424A, E430A, N434A, T437A, Q438A, K439A, S440A, S444A и К447А, где, например, Р238А представляет собой замену пролина дикого типа аланином в положении номер 238. В качестве примера конкретный вариант реализации включает мутацию N297A, позволяющую удалить высококонсервативный сайт N-гликозилирования. В дополнение к аланину другие аминокислоты могут заменять аминокислоты дикого типа в положениях, указанных выше. Мутации могут быть введены в Fc по отдельности, что приводит к образованию более ста областей Fc, отличных от нативной Fc. Кроме того, комбинации двух, трех или более данных отдельных мутаций могут быть введены совместно, что приводит к образованию еще сотен областей Fc. Более того, одна из областей Fc конструкции согласно настоящему изобретению может быть мутирована, а другая область Fc указанной конструкции может быть совсем не мутирована или они обе могут быть мутированы, но с использованием разных мутаций.

Некоторые из вышеуказанных мутаций могут придавать области Fc или партнеру по связыванию FcRn новую функциональность. Например, один из вариантов реализации включает N297A, позволяющую удалить высококонсервативный сайт N-гликозилирования. Влияние данной мутации заключается в снижении иммуногенности и тем самым увеличении периода полувыведения области Fc из крови, и в приведении области Fc в состояние неспособности связываться с FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB и FcyRIIIA, не нарушая при этом аффинности в отношении FcRn (Routledge et al., 1995, Transplantation 60:847; Friend et al., 1999, Transplantation, 68:1632; Shields et al., 1995, J. Biol. Chem., 276:6591). Другим примером новой функциональности, являющейся результатом мутаций, описанных выше, является возможность увеличения аффинности в отношении FcRn, которая в некоторых случаях будет выше аффинности дикого типа. Данная увеличенная аффинность может отражать повышенную скорость ассоциации, пониженную скорость диссоциации или как повышенную скорость ассоциации, так и пониженную скорость диссоциации. Примеры мутаций, которые, как считается, наделяют повышенной аффинностью в отношении FcRn, включают Т256А, Т307А, Е380А и N434A (Shields et al., 2001, J. Biol. Chem., 276:6591). Кроме того, по меньшей мере три гамма-рецептора Fc человека, по-видимому, распознают сайт связывания в IgG в пределах нижней шарнирной области, как правило, аминокислоты 234-237. Следовательно, другой пример новой функциональности и возможно пониженной иммуногенности может являться результатом мутаций данной области, например, путем замены аминокислот 233-236 ELLG IgG1 человека на соответствующую последовательность PVA IgG2 (с делецией одной аминокислоты). Было показано, что FcyRI, FcyRII и FcyRIII, которые опосредуют различные эффекторные функции, не будут связываться с IgG1, когда введены такие мутации. Ward and Ghetie, 1995, Therapeutic Immunology, 2:77; и Armour et al., 1999, Eur. J. Immunol., 29:2613. В одном из вариантов реализации константная область Ig или ее часть, например область Fc, представляет собой полипептид, содержащий последовательность PKNSSMISNTP (SEQ ID NO: 52) и возможно дополнительно содержащий последовательность, выбранную из HQSLGTQ (SEQ ID NO: 53), HQNLSDGK (SEQ ID NO: 54), HQNISDGK (SEQ ID NO: 55) или VISSHLGQ (SEQ ID NO: 56) (патент США № 5739277).

В другом варианте реализации константная область иммуноглобулина или ее часть содержит аминокислотную последовательность в шарнирной области или ее часть, которая образует одну или более дисульфидных связей с другой константной областью иммуноглобулина или ее частью. Дисульфидная связь, образованная константной областью иммуноглобулина или ее частью, располагает первый полипептид, содержащий FVIII, и второй полипептид, содержащий VWFфрагмент фактора фон Виллебранда, вместе, так что эндогенный VWF не заменяет VWFфрагмент фактора фон Виллебранда и не связывается с FVIII. Следовательно, дисульфидная связь между первой константной областью иммуноглобулина или ее частью и второй константной областью иммуноглобулина или ее частью предотвращает взаимодействие между VWFэндогенным фактором фон Виллебранда и белком FVIII. Данное ингибирование взаимодействия между VWF и белком FVIII позволяет периоду полувыведения белка FVIII превысить двукратный предел. Шарнирная область или ее часть также может быть связана с одним или более доменами CH1, CH2, CH3, их фрагментом и их любыми комбинациями. В конкретном варианте реализации константная область иммуноглобулина или ее часть представляет собой шарнирную область и СН2.

- 84 042955

В некоторых вариантах реализации константная область Ig или ее часть является полугликозилированной. Например, химерный белок, содержащий две области Fc или партнера по связыванию FcRn, может содержать первую гликозилированную область Fc (например, гликозилированную область СН2) или партнер по связыванию FcRn, и вторую агликозилированную область Fc (например, агликозилированную область СН2) или партнер по связыванию FcRn. В одном из вариантов реализации линкер может быть помещен между гликозилированной и агликозилированной областями Fc. В другом варианте реализации область Fc или партнер по связыванию FcRn является полностью гликозилированной, т.е. все области Fc являются гликозилированными. В других вариантах реализации область Fc может быть агликозилированной, т.е. ни один из фрагментов Fc не является гликозилированным.

В некоторых вариантах реализации химерный белок согласно настоящему изобретению содержит замену аминокислоты в константной области Ig или ее части (например, варианты Fc), которая изменяет антигеннезависимые эффекторные функции константной области Ig, в частности, период полувыведения белка из крови. Такие белки демонстрируют либо повышенное, либо пониженное связывание с FcRn по сравнению с белками, не содержащими данные замены, и, следовательно, имеют увеличенный или уменьшенный период полувыведения из сыворотки соответственно. Варианты Fc с повышенной аффинностью в отношении FcRn, как ожидается, имеют более длительные периоды полувыведения из сыворотки, и такие молекулы имеют полезное применение в способах лечения млекопитающих, когда желаемым является длительный период полувыведения вводимого полипептида, например, для лечения хронического заболевания или нарушения (см., например, патенты США 7348004, 7404956 и 7862820). В отличие от этого варианты Fc с пониженной аффинностью связывания в отношении FcRn, как ожидается, имеют более короткие периоды полувыведения и такие молекулы также являются полезными, например, для введения млекопитающему, когда может быть предпочтительным сокращенное время в кровообращении, например, для диагностической визуализации in vivo или в ситуациях, когда исходный полипептид обладает токсическими побочными эффектами при нахождении в кровообращении в течение длительных периодов времени. Кроме того, варианты Fc с пониженной аффинностью связывания в отношении FcRn с меньшей вероятностью проходят через плаценту и, таким образом, также подходят для лечения заболеваний или нарушений у беременных женщин. Кроме того, другие виды применения, при которых может быть желательной пониженная аффинность связывания в отношении FcRn, включают те виды применения, при которых желательной является локализация в головном мозге, почках и/или печени. В одном из типичных вариантов реализации химерный белок согласно настоящему изобретению демонстрирует пониженный транспорт через эпителий почечных клубочков из сосудистой сети. В другом варианте реализации химерный белок согласно настоящему изобретению демонстрирует пониженный транспорт через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) из головного мозга в сосудистое пространство. В одном из вариантов реализации белок с измененным связыванием FcRn содержит по меньшей мере одну область Fc или партнер по связыванию FcRn (например, одну или две области Fc или партнера по связывания FcRn), содержащий одну или более замен аминокислот в пределах FcRn-связывающей петли константной области Ig. FcRn-связывающая петля состоит из аминокислотных остатков 280-299 (в соответствии с нумерацией ЕС) полноразмерной области Fc дикого типа. В других вариантах реализации константная область Ig или ее часть в химерном белке согласно настоящему изобретению, обладающая измененной аффинностью связывания в отношении FcRn, содержит по меньшей мере одну область Fc или партнер по связыванию FcRn, содержащий одну или более замен аминокислот в пределах 15 А зоны контакта FcRn. В настоящем описании термин 15 А зона контакта FcRn включает остатки в следующих положениях полноразмерного фрагмента Fc дикого типа: 243-261, 275-280, 282-293, 302-319, 336-348, 367, 369, 372-389, 391, 393, 408, 424, 425-440 (нумерация ЕС). В других вариантах реализации константная область Ig или ее часть согласно настоящему изобретению, обладающая измененной аффинностью связывания в отношении FcRn, содержит по меньшей мере одну область Fc или партнер по связыванию FcRn, содержащий одну или более замен аминокислот в положении аминокислоты, соответствующем любому из следующих положений согласно ЕС: 256, 277-281, 283-288, 303-309, 313, 338, 342, 376, 381, 384, 385, 387, 434 (например, N434A или N434K) и 438. Типичные замены аминокислот, которые изменяли связывающую активность в отношении FcRn, описаны в международной публикации PCT № WO 05/047327, содержание которой включено в настоящее описание посредством ссылки.

Область Fc или партнер по связыванию FcRn, используемый в настоящем изобретении, также может содержать известную в данной области техники замену аминокислоты, которая изменяет гликозилирование химерного белка. Например, область Fc или партнер по связыванию FcRn химерного белка, связанный с VWFфрагментом фактора фон Виллебранда или белком FVIII, может включать область Fc, содержащую мутацию, приводящую к уменьшению гликозилирования (например, N- или О-связанного гликозилирования), или может включать измененную гликоформу фрагмента Fc дикого типа (например, гликан с низким содержанием фукозы или гликан, не содержащий фукозы). В одном из вариантов реализации непроцессированный химерный белок согласно настоящему изобретению может содержать генетически слитую область Fc (т.е. область scFc), содержащую две или более составляющих константных областей Ig или их частей, независимо выбранных из константной области Ig или ее части, описанной в настоящем документе. В одном из вариантов реализации области Fc димерной Fc области являются оди

- 85 042955 наковыми. В другом варианте реализации по меньшей мере две из областей Fc являются разными. Например, области Fc или партнеры по связыванию FcRn белков согласно настоящему изобретению содержат одинаковое количество аминокислотных остатков или они могут отличаться по длине на один или более аминокислотных остатков (например, на примерно 5 аминокислотных остатков (например, 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотных остатков), примерно 10 остатков, примерно 15 остатков, примерно 20 остатков, примерно 30 остатков, примерно 40 остатков или примерно 50 остатков). В других вариантах реализации области Fc или партнеры по связыванию FcRn белка согласно настоящему изобретению могут отличаться последовательностью в одном или более положениях аминокислот. Например, по меньшей мере две из областей Fc или партнеров по связыванию FcRn могут отличаться примерно 5 положениями аминокислот (например, 1, 2, 3, 4 или 5 положениями аминокислот), примерно 10 положениями, примерно 15 положениями, примерно 20 положениями, примерно 30 положениями, примерно 40 положениями или примерно 50 положениями).

Е) Линкеры.

Химерный белок согласно настоящему изобретению содержит также один или более линкеров. Одним из типов линкеров является расщепляемый линкер, который может быть расщеплен под действием различных протеаз при введении субъекту in vivo, например, в месте коагуляции. В одном из вариантов реализации расщепляемый линкер обеспечивает отщепление фрагмента, например, VWFфрагмента фактора фон Виллебранда, от химерного белка в месте каскада свертывания крови, что таким образом позволяет активированному FVIII (FVIIIa) обладать активностью FVIIIa. Другим типом линкеров является процессируемый линкер, который содержит сайт внутриклеточного расщепления и, таким образом, может быть расщеплен под действием фермента внутриклеточного процессинга в клетке-хозяине, что обеспечивает подходящую экспрессию полипептида и образование химерного белка.

Один или более линкеров могут присутствовать между любыми двумя белками в химерном белке. В одном из вариантов реализации химерный белок содержит (i) VWFфрагмент фактора фон Виллебранда;

(ii) последовательность XTEN; и (iii) белок FVIII, при этом VWFфрагмент фактора фон Виллебранда связан с последовательностью XTEN линкером, например расщепляемым линкером, и последовательность XTEN также связана с белком FVIII (т.е. V-L-X-FVIII).

В другом варианте реализации химерный белок содержит (i) VWFфрагмент фактора фон Виллебранда;

(ii) последовательность XTEN; и (iii) белок FVIII, при этом VWFфрагмент фактора фон Виллебранда связан с последовательностью XTEN и последовательность XTEN связана с белком FVIII линкером, например расщепляемым линкером (т.е. V-X-L-FVIII).

В некоторых вариантах реализации химерный белок содержит (i) VWFфрагмент фактора фон Виллебранда;

(ii) последовательность XTEN;

(iii) первую константную область Ig или ее часть (например, первую область Fc);

(iv) белок FVIII; и (v) вторую константную область Ig или ее часть (например, вторую область Fc), при этом VWFфрагмент фактора фон Виллебранда связан с последовательностью XTEN необязательным линкером, например расщепляемым линкером.

Последовательность XTEN также может быть связана с первой константной областью Ig или ее частью линкером, например расщепляемым линкером. Белок FVIII (с последовательностью XTEN или без нее) также может быть связан со второй константной областью Ig или ее частью необязательным линкером, например, расщепляемым линкером. В некоторых вариантах реализации химерный белок содержит также один или более линкеров, например процессируемых линкеров, между первой константной областью Ig или ее частью (например, первой областью Fc) и второй константной областью Ig или ее частью (например, второй областью Fc), между VWFфрагментом фактора фон Виллебранда и второй константной областью Ig или ее частью или между белком FVIII и первой константной областью Ig или ее частью (например, первой областью Fc).

В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение включает химерный белок, содержащий (i) белок FVIII;

(ii) последовательность XTEN;

(iii) первую константную область Ig или ее часть; и (iv) вторую константную область Ig или ее часть, при этом первая константная область Ig или ее часть и вторая константная область Ig или ее часть связаны процессируемым линкером.

Линкер, подходящий для настоящего изобретения, может содержать любую органическую молеку

- 86 042955 лу. В одном из вариантов реализации линкер содержит полимер, например полиэтиленгликоль (ПЭГ) или гидроксиэтилкрахмал (ГЭК). В другом варианте реализации линкер содержит аминокислотную последовательность. Линкер может содержать по меньшей мере примерно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400 ,500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900 или 2000 аминокислот. Линкер может содержать 1-5 аминокислот, 1-10 аминокислот, 1-20 аминокислот, 10-50 аминокислот, 50-100 аминокислот, 100-200 аминокислот, 200-300 аминокислот, 300-400 аминокислот, 400-500 аминокислот, 500-600 аминокислот, 600-700 аминокислот, 700-800 аминокислот, 800-900 аминокислот или 900-1000 аминокислот. В одном из вариантов реализации линкер содержит последовательность XTEN. Дополнительные примеры XTEN могут быть использованы согласно настоящему изобретению, и они описаны в публикациях патента США № 2010/0239554 А1, 2010/0323956 А1, 2011/0046060 А1, 2011/0046061 А1, 2011/0077199 А1 или 2011/0172146 А1, или международных публикациях патента № WO 2010091122 A1, WO 2010144502 А2, WO 2010144508 A1, WO 2011028228 A1, WO 2011028229 А1 или WO 2011028344 А2. В другом варианте реализации линкер представляет собой последовательность PAS. Линкер, подходящий для настоящего изобретения, может содержать любую органическую молекулу. В одном из вариантов реализации линкер представляет собой полимер, например полиэтиленгликоль (ПЭГ) или гидроксиэтилкрахмал (ГЭК). В другом варианте реализации линкер представляет собой аминокислотную последовательность. Линкер может содержать по меньшей мере примерно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900 или 2000 аминокислот. Линкер может содержать 1-5 аминокислот, 1-10 аминокислот, 1-20 аминокислот, 10-50 аминокислот, 50-100 аминокислот, 100-200 аминокислот, 200-300 аминокислот, 300-400 аминокислот, 400-500 аминокислот, 500-600 аминокислот, 600-700 аминокислот, 700-800 аминокислот, 800-900 аминокислот или 900-1000 аминокислот.

Примеры линкеров хорошо известны в данной области техники. В одном из вариантов реализации линкер содержит последовательность Gn. Линкер может содержать последовательность (GA)n. Линкер может содержать последовательность (GGS)n. В других вариантах реализации линкер содержит (GGGS)n (SEQ ID NO: 57). В других вариантах реализации линкер содержит последовательность (GGS)n(GGGGS)n (SEQ ID NO: 58). В данных случаях n может представлять собой целое число 1-100. В других случаях n может представлять собой целое число 1-20, т.е. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20. Примеры линкеров включают, но не ограничиваются перечисленными,

GGG, SGGSGGS (SEQ ID NO: 59), GGSGGSGGSGGSGGG (SEQ ID NO: 60), GGSGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 61), GGSGGSGGSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 62) или GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 63).

Линкер не устраняет или не снижает активность VWFфрагмента фактора фон Виллебранда или свертывающую активность фактора VIII. Линкер возможно усиливает активность VWFфрагмента фактора фон Виллебранда или свертывающую активность белка, представляющего собой фактор VIII, например, за счет дополнительного снижения влияния стерического препятствия и делая VWFфрагмент фактора фон Виллебранда или часть фактора VIII более доступными для целевого сайта связывания.

В одном из вариантов реализации линкер, подходящий для химерного белка, имеет длину 15-25 аминокислот. В другом варианте реализации линкер, подходящий для химерного белка, имеет длину 15-20 аминокислот. В некоторых вариантах реализации линкер для химерного белка имеет длину 10-25 аминокислот. В других вариантах реализации линкер для химерного белка имеет длину 15 аминокислот. В других вариантах реализации линкер для химерного белка представляет собой (GGGGS)n (SEQ ID NO: 64), где G представляет собой глицин, S представляет собой серии и n представляет собой целое число 1-20.

F) Сайты расщепления.

Линкер также может включать фрагмент, способный расщепляться либо химически (например, гидролиз сложноэфирной связи), под воздействием ферментов (т.е. включение последовательности, расщепляемой протеазой) или фотолитически (например, хромофор, такой как 3-амино-3-(2нитрофенил)пропионовая кислота (ANP)), для освобождения одной молекулы от другой.

В одном из вариантов реализации линкер представляет собой расщепляемый линкер. Расщепляемые линкеры могут содержать один или более сайтов расщепления на N-конце, или С-конце, или обоих. В другом варианте реализации расщепляемый линкер по существу состоит из или состоит из одного или более сайтов расщепления. В других вариантах реализации расщепляемый линкер содержит гетерологичные аминокислотные линкерные последовательности, описанные в настоящем документе, или полимеры и один или более сайтов расщепления.

В некоторых вариантах реализации расщепляемый линкер содержит один или более сайтов расщепления, которые могут расщепляться в клетке-хозяине (например, сайты внутриклеточного процессинга). Неограничивающие примеры сайта расщепления включают RRRR (SEQ ID NO: 9), RKRRKR (SEQ Ю NO: 10) и RRRRS (SEQ ID NO: 11).

В других вариантах реализации расщепляемый линкер содержит один или более сайтов расщепления, которые расщепляются под действием протеазы после введения химерного белка, содержащего ука

- 87 042955 занный расщепляемый линкер, субъекту. В одном из вариантов реализации сайт расщепления расщепляется под действием протеазы, выбранной из группы, состоящей из фактора XIa, фактора ХПа, калликреина, фактора VIIa, фактора IXa, фактора Ха, фактора IIa (тромбина), эластазы-2, ММР-12, ММР-13, ММР-17 и ММР-20. В другом варианте реализации сайт расщепления выбран из группы, состоящей из сайта расщепления FXIa (например, KLTR^AET (SEQ ID NO: 65)), сайта расщепления FXIa (например, DFTrIvVG (SEQ ID NO: 66)), сайта расщепления FXIIa (например, TMTR^IVGG (SEQ ID NO: 67)), сайта расщепления калликреином (например, SPFR^STGG (SEQ ID NO: 68)), сайта расщепления FVIIa (например, LQVR^IVGG (SEQ ID NO: 69)), сайта расщепления FIXa (например, PLGR^IVGG (SEQ ID NO: 70)), сайта расщепления FXa (например, IEGR^TVGG (SEQ ID NO: 71)), сайта расщепления FIIa (тромбином) (например, LTPR^SLLV (SEQ ID NO: 72)), сайта расщепления эластазой-2 (например, LGPV^SGVP (SEQ ID NO: 73)), сайта расщепления гранзимом-В (например, VAGD^SLEE (SEQ ID NO: 74)), сайта расщепления ММР-12 (например, GPAG^LGGA (SEQ ID NO: 75)), сайта расщепления ММР-13 (например, GPAG^LRGA (SEQ ID NO: 76)), сайта расщепления ММР-17 (например, APLG^LRLR (SEQ ID NO: 77)), сайта расщепления ММР-20 (например, PALP^LVAQ (SEQ ID NO: 78)), сайта расщепления TEV (например, ENLYFQ^G (SEQ ID NO: 79)), сайта расщепления энтерокиназой (например, DDDK^IVGG (SEQ ID NO: 80)), сайта расщепления протеазой 3С (PRESCISSION™) (например, LEVLFQ^GP (SEQ ID NO: 81)) и сайта расщепления сортазой А (например, LPKT^GSES) (SEQ ID NO: 82). В некоторых вариантах реализации сайты расщепления FXIa включают, но не ограничиваются перечисленными: например, TQSFNDFTR (SEQ ID NO: 83) и SVSQTSKLTR (SEQ ID NO: 84).

Неограничивающие типичные сайты расщепления тромбином включают, например, DFLAEGGGVR (SEQ Ш NO: 85), TTKKPR (SEQ Ш NO: 86) или LVPRG (SEQ ID NO: 87), и последо вательность, содержащую, по существу состоящую из или состоящую из ALRPR(SEQIDNO: 17) (например, ALRPRVVGGA(SEQ ID NO: 88)).

В конкретном варианте реализации сайт расщепления представляет собой TLDPRSFLLRNPNDKYEPFWEDEEK (SEQ ID NO: 8).

Полинуклеотиды, векторы и клетки-хозяева.

Согласно настоящему изобретению также предложен полинуклеотид, кодирующий (а) VWFфрагмент фактора фон Виллебранда, связанный с последовательностью XTEN и белком

FVIII;

(b) белок FVIII, связанный с последовательностью XTEN и Fc; или (с) белок FVIII, связанный с последовательностью XTEN и VWFфрагментом фактора фон Виллеб ранда, описанным в настоящем документе.

В случае когда химерный белок представляет собой одну полипептидную цепь (например, F2-L2-XV-L1-F1-FVIII, где FVIII содержит белок FVIII, F1 содержит первую константную область Ig или ее часть, например, первую область Fc, L1 содержит первый линкер, V содержит VWFфрагмент фактора фон Виллебранда, X содержит последовательность XTEN, L2 содержит второй линкер и F2 содержит вторую константную область Ig или ее часть, например вторую область Fc), настоящее изобретение относится к одной полинуклеотидной цепи, кодирующей указанную одну полипептидную цепь. В случае когда химерный белок содержит первую и вторую полипептидные цепи (F2-L2-X-V:FVIII-F1):

первую полипептидную цепь, содержащую VWFфрагмент фактора фон Виллебранда, связанный с последовательностью XTEN, который также связан с первой константной областью Ig или ее частью (например, первой областью Fc) расщепляемым линкером (например, F2-L2-X-V); и вторую полипептидную цепь, содержащую белок FVIII и вторую константную область Ig или ее часть (например, вторую область Fc) (например, FVIII-F1), при этом первая полипептидная цепь и вторая полипептидная цепь ассоциированы друг с другом, полинуклеотид может содержать первую нуклеотидную последовательность и вторую нуклеотидную последовательность.

В одном из вариантов реализации первая полипептидная цепь и вторая полипептидная цепь могут кодироваться одной полинуклеотидной цепью. В другом варианте реализации первая полипептидная цепь и вторая полипептидная цепь кодируются двумя разными полинуклеотидами, т.е. первой нуклеотидной последовательностью и второй нуклеотидной последовательностью. В другом варианте реализации первая нуклеотидная последовательность и вторая нуклеотидная последовательность присутствуют в двух разных полинуклеотидах (например, разных векторах). В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение относится к группе полинуклеотидов, содержащей первую нуклеотидную цепь и вторую нуклеотидную цепь, при этом первая нуклеотидная цепь кодирует VWFфрагмент фактора фон Виллебранда химерного белка, а вторая нуклеотидная цепь кодирует белок FVIII. В некоторых вариантах реализации химерный белок, содержащий две полипептидные цепи или три полипептидные цепи, может быть кодирован одной полинуклеотидной цепью, а затем процессирован с образованием двух или трех (или более) полипептидных цепей. В других вариантах реализации химерный белок, содержащий данные полипептидные цепи, может быть кодирован двумя или тремя полинуклеотидными цепями. В других

- 88 042955 вариантах реализации группа полинуклеотидов также содержит дополнительную нуклеотидную цепь (например, вторую нуклеотидную цепь, когда химерный полипептид кодируется одной полинуклеотидную цепью, или третью нуклеотидную цепь, когда химерный белок кодируется двумя полинуклеотидными цепями), которая кодирует протеинконвертазу. Протеинконвертаза может быть выбрана из группы, состоящей из пропротеинконвертазы субтилизин/кексинового типа 5 (PCSK5 или РС5), пропротеинконвертазы субтилизин/кексинового типа 7 (PCSK7 или РС5), Kex 2 дрожжей, пропротеинконвертазы субтилизин/кексинового типа 3 (PACE или PCSK3) и их двух или более комбинаций. В некоторых вариантах реализации протеинконвертаза представляет собой PACE, PC5 или РС7. В конкретном варианте реализации протеинконвертаза представляет собой РС5 или РС7. См. международную заявку № PCT/US2011/043568.

В настоящем описании термин вектор экспрессии относится к любой конструкции нуклеиновой кислоты, которая содержит элементы, необходимые для транскрипции и трансляции встроенной кодирующей последовательности, или в случае РНК-вирусного вектора - элементы, необходимые для репликации и трансляции, при введении в соответствующую клетку-хозяина. Векторы экспрессии могут включать плазмиды, фагмиды, вирусы и их производные.

Векторы экспрессии согласно настоящему изобретению будут включать полинуклеотиды, кодирующие химерный белок, описанный в настоящем документе. В одном из вариантов реализации одна или более кодирующих последовательностей для VWFфрагмента фактора фон Виллебранда и XTEN, белка FVIII и XTEN или тех и других, функционально связаны с последовательностью, контролирующей экспрессию. В настоящем изобретении две последовательности нуклеиновых кислот являются функционально связанными, когда они ковалентно связаны таким образом, чтобы обеспечивать сохранение функциональности каждого компонента, представляющего собой последовательность нуклеиновой кислоты. Говорят, что кодирующая последовательность и последовательность, контролирующая экспрессию генов, являются функционально связанными, когда они ковалентно связаны таким образом, чтобы экспрессия или транскрипция и/или трансляция кодирующей последовательности находилась под влиянием или контролем последовательности, контролирующей экспрессию генов. Говорят, что две последовательности ДНК являются функционально связанными, если индукция промотора на 5'-конце последовательности для экспрессии генов приводит к транскрипции кодирующей последовательности, и если природа связи между двумя последовательностями ДНК (1) не приводит к введению мутации со сдвигом рамки;

(2) не нарушает способность промоторной области направлять транскрипцию кодирующей последовательности; или (3) не нарушает способность соответствующего РНК-транскрипта транслироваться в белок.

Таким образом, последовательность для экспрессии генов была бы функционально связана с кодирующей последовательностью нуклеиновой кислоты, если бы указанная последовательность для экспрессии генов была способна осуществлять транскрипцию данной кодирующей последовательности нуклеиновой кислоты так, чтобы полученный транскрипт транслировался в желаемый белок или полипептид. В настоящем описании последовательность, контролирующая экспрессию генов, представляет собой любую регуляторную нуклеотидную последовательность, такую как промоторная последовательность или комбинация промотор-энхансер, которая способствует эффективной транскрипции и трансляции кодирующей нуклеиновой кислоты, с которой она функциональна связана. Последовательность, контролирующая экспрессию генов, может, например, представлять собой промотор млекопитающего или вирусный промотор, такой как конститутивный или индуцируемый промотор. Конститутивные промоторы млекопитающих включают, но не ограничиваются перечисленными, промоторы для следующих генов: гипоксантинфосфорибозилтрансфераза (HPRT), аденозиндеаминаза, пируваткиназа, промотор бета-актина и другие конститутивные промоторы. Типичные вирусные промоторы, которые конститутивно функционируют в эукариотических клетках, включают, например, промоторы цитомегаловируса (CMV), обезьяньего вируса (например, SV40), вируса папилломы, аденовируса, вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), вируса саркомы Рауса, цитомегаловируса, длинные концевые повторы (LTR) вируса лейкоза Молони и других ретровирусов, и тимидинкиназный промотор вируса простого герпеса. Другие конститутивные промоторы известны специалисту в данной области техники. Промоторы, подходящие в качестве последовательностей для экспрессии генов согласно настоящему изобретению, также включают индуцируемые промоторы. Индуцируемые промоторы экспрессируются в присутствии индуцирующего агента. Например, промотор металлотионеина индуцируется для того, чтобы способствовать транскрипции и трансляции, в присутствии некоторых ионов металла. Другие индуцируемые промоторы известны специалисту в данной области техники.

В целом последовательность, контролирующая экспрессию генов, будет включать при необходимости 5' нетранскрибируемые и 5' нетранслируемые последовательности, вовлеченные в инициацию транскрипции и трансляции соответственно, такие как ТАТА-бокс, кэпирующая последовательность, последовательность СААТ и т.п. В частности, такие 5' нетранскрибируемые последовательности будут включать промоторную область, которая включает промоторную последовательность для транскрипционного контроля функционально присоединенной кодирующей нуклеиновой кислоты. Последовательности для экспрессии генов возможно включают энхансерные последовательности или вышележащие активирующие

- 89 042955 последовательности, при необходимости. Вирусные векторы включают, но не ограничиваются перечисленными, последовательности нуклеиновых кислот следующих вирусов: ретровирус, такой как вирус лейкоза Молони мышей, вирус саркомы Харви мышей, вирус опухоли молочной железы мышей и вирус саркомы Рауса; аденовирус, аденоассоциированный вирус; вирусы типа SV40; полиомавирусы; вирусы Эпштейна-Барра; вирусы папилломы; вирус герпеса; вирус осповакцины; полиовирус; и РНК-вирус, такой как ретровирус. Можно легко использовать другие векторы, хорошо известные в данной области техники. Некоторые вирусные векторы основаны на нецитопатических эукариотических вирусах, в которых нежизненно важные гены были заменены представляющим интерес геном. Нецитопатические вирусы включают ретровирусы, в жизненный цикл которых вовлечена обратная транскрипция геномной вирусной РНК в ДНК с последующей провирусной интеграцией в ДНК клетки-хозяина. Ретровирусы были одобрены для исследований генной терапии человека. Наиболее подходящими являются те ретровирусы, которые являются дефектными по репликации (т.е. способны направлять синтез желаемых белков, но не способны производить инфекционные частицы). Такие генетически измененные ретровирусные векторы экспрессии в целом применимы для высокоэффективной трансдукции генов in vivo. Стандартные протоколы получения дефектных по репликации ретровирусов (включая этапы включения экзогенного генетического материала в плазмиду, трансфекции пакующей линии клеток плазмидой, выработки рекомбинантных ретровирусов пакующей линией клеток, сбора вирусных частиц из сред для культивирования ткани и инфицирования целевых клеток вирусными частицами) приведены в Kriegler, M., Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, W.H. Freeman Co., New York (1990); и Murry, E.J., Methods in Molecular Biology, vol. 7, Humana Press, Inc., Cliffton, N.J. (1991). В одном из вариантов реализации вирус представляет собой аденоассоциированный вирус, двухцепочечный ДНК-вирус. Аденоассоциированный вирус может быть создан дефектным по репликации и способным инфицировать широкий диапазон типов и видов клеток. Он также обладает такими преимуществами, как термостабильность и стабильность в отношении липидных растворителей; высокая частота трансдукции в клетках различных линий, включая гемопоэтические клетки; и отсутствие ингибирования суперинфекции, что таким образом обеспечивает множественные серии трансдукции. По сообщениям, аденоассоциированный вирус может интегрироваться в клеточную ДНК человека сайт-специфическим способом, что тем самым минимизирует возможность инсерционного мутагенеза и вариабельность экспрессии встроенных генов, характерную для ретровирусной инфекции. Кроме того, инфекции аденоассоциированного вируса дикого типа прослеживались в тканевой культуре более чем через 100 пересевов в отсутствие селективного давления, что позволяет предположить, что геномная интеграция аденоассоциированного вируса является относительно стабильной.

Аденоассоциированный вирус также может функционировать экстрахромосомным способом.

Другие векторы включают плазмидные векторы. Плазмидные векторы подробно описаны в данной области техники и хорошо известны специалисту. См., например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. В последние несколько лет было обнаружено, что плазмидные векторы особенно предпочтительны для доставки генов в клетки in vivo из-за их неспособности в них реплицироваться и интегрироваться в геном хозяина. Однако данные плазмиды, содержащие промотор, совместимый с клеткой-хозяином, могут экспрессировать пептид с гена, функционально кодированного в плазмиде. Некоторые широко используемые плазмиды, доступные от коммерческих поставщиков, включают pBR322, pUC18, pUC19 различные плазмиды pcDNA, pRC/CMV, различные плазмиды pCMV, pSV40 и pBlueScript. Дополнительные примеры конкретных плазмид включают pcDNA3.1, номер по каталогу V79020; pcDNA3.1/hygro, номер по каталогу V87020; pcDNA4/myc-His, номер по каталогу V86320; и pBudCE4.1, номер по каталогу V53220, все от Invitrogen (Карлсбад, Калифорния). Другие плазмиды хорошо известны специалисту в данной области техники. Кроме того, плазмиды могут быть индивидуально разработаны с использованием стандартных методов молекулярной биологии для удаления и/или добавления конкретных фрагментов ДНК.

В одной из систем экспрессии у насекомых, которую можно использовать для получения белков согласно настоящему изобретению, используют вирус ядерного полигидроза Autographa californica (AcNPV) в качестве вектора для экспрессии чужеродных генов. Указанный вирус выращивают в клетках Spodoptera frugiperda. Кодирующая последовательность может быть клонирована в нежизненно важные области (например, ген polyhedron) вируса и помещена под контроль промотора ACNPV (например, промотор polyhedron). Успешное встраивание кодирующей последовательности приведет к инактивации гена polyhedron и образованию невкрапленного рекомбинантного вируса (т.е. вируса, у которого отсутствует белковоподобная оболочка, кодируемая геном polyhedron). Затем данные рекомбинантные вирусы используют для инфицирования клеток Spodoptera frugiperda, в которых экспрессируется встроенный ген (см., например, Smith et al. (1983), J. Virol., 46:584; патент США № 4215051). Дополнительные примеры данной системы экспрессии можно найти в Ausubel et al., eds. (1989), Current Protocols in Molecular Biology, vol. 2, Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience.

Другая система, которую можно использовать для экспрессии белков согласно настоящему изобретению, представляет собой систему экспрессии гена глутаминсинтетазы, также называемую системой экспрессии GS (Lonza Biologics PLC, Беркшир, Соединенное Королевство). Данная система экспрессии

- 90 042955 подробно описана в патенте США № 5981216.

В клетках-хозяевах млекопитающих можно использовать ряд систем экспрессии на основе вирусов. В случаях когда в качестве вектора экспрессии используют аденовирус, кодирующая последовательность может быть лигирована с комплексом контроля транскрипции/трансляции аденовируса, например поздним промотором и состоящей из трех частей лидерной последовательностью. Затем данный химерный ген может быть встроен в аденовирусный геном путем рекомбинации in vitro или in vivo. Встраивание в нежизненно важную область вирусного генома (например, область Е1 или Е3) приведет к рекомбинантному вирусу, который является жизнеспособным и способен экспрессировать пептид в инфицированных хозяевах (см., например, Logan & Shenk (1984), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81:3655). В качестве альтернативы, можно использовать промотор осповакцины 7.5 K. См., например, Mackett et al. (1982), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79:7415; Mackett et al. (1984), J. Virol., 49:857; Panicali et al. (1982), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79:4927.

Для повышения эффективности получения могут быть разработаны полинуклеотиды, кодирующие многочисленные единицы белка согласно настоящему изобретению, разделенные сайтами ферментативного расщепления. Полученный полипептид может быть расщеплен (например, путем обработки соответствующим ферментом) с получением полипептидных единиц. Это может увеличивать выход полипептидов, управляемых одним промотором. При использовании в соответствующих вирусных системах экспрессии направление трансляции каждого полипептида, кодируемого мРНК, происходит внутри транскрипта, например, участком внутренней посадки рибосомы, IRES. Таким образом, полицистронная конструкция направляет транскрипцию одной крупной полицистронной мРНК, которая, в свою очередь, направляет трансляцию многочисленных отдельных полипептидов. Данный подход исключает образование и ферментативный процессинг полипротеинов и может значительно увеличивать выход полипептидов под управлением одного промотора. Векторы, используемые для трансформации, как правило, будут содержать селектируемый маркер, используемый идентификации трансформантов. В бактериальных системах он может включать ген резистентности к антибиотику, такому как ампициллин или канамицин. Селектируемые маркеры для применения в культивируемых клетках млекопитающих включают гены, которые придают резистентность к лекарственным средствам, таким как неомицин, гигромицин и метотрексат. Селектируемый маркер может представлять собой амплифицируемый селектируемый маркер. Одним из амплифицируемых селектируемых маркеров является ген дигидрофолатредуктазы (DHFR). Simonsen С.С. et al. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 80:2495-9. Селектируемые маркеры рассмотрены Thilly (1986), Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, Mass., и выбор селектируемых маркеров находится в рамках компетенции специалиста в данной области техники.

Селектируемые маркеры могут быть введены в клетку в отдельной плазмиде одновременно с представляющим интерес геном или они могут быть введены в той же плазмиде. В случае одной плазмиды селектируемый маркер и представляющий интерес ген могут находиться под контролем разных промоторов или одного и того же промотора, в случае последнего расположения образуется дицистронная мРНК. Конструкции данного типа известны в данной области техники (например, патент США № 4713339). Векторы экспрессии могут кодировать метки, которые позволяют легко очищать полученный рекомбинантным способом белок. Примеры включают, но не ограничиваются перечисленными, вектор pUR278 (Ruther et al. (1983), EMBO J., 2:1791), в котором кодирующие последовательности для экспрессируемого белка могут быть лигированы в вектор в рамке с lac z-кодирующей областью, так что образуется меченый гибридный белок; векторы pGEX могут быть использованы для экспрессии белков согласно настоящему изобретению с меткой в виде глутатион-S-трансферазы (GST). Данные белки обычно являются растворимыми и могут быть легко очищены от клеток путем адсорбции на глутатион-агарозных гранулах с последующим элюированием в присутствии свободного глутатиона. Векторы содержат сайты расщепления (протеаза, представляющая собой тромбин или фактор Ха, или PRESCISSION PROTEASE™ (Pharmacia, Пипак, Нью-Джерси)) для легкого удаления метки после очистки.

Затем вектор или векторы экспрессии трансфицируют или совместно трансфицируют в подходящую целевую клетку, которая будет экспрессировать полипептиды. Методы трансфекции, известные в данной области техники, включают, но не ограничиваются перечисленными: осаждение фосфатом кальция (Wigler et al. (1978), Cell, 14:725), электропорацию (Neumann et al. (1982), EMBO J., 1:841) и реагенты на основе липосом. Для экспрессии белков, описанных в настоящем документе, можно применять различные векторные системы, использующие механизмы экспрессии хозяина, включая как прокариотические, так и эукариотические клетки. Данные системы включают, но не ограничиваются перечисленными, микроорганизмы, такие как бактерии (например, Е. colt), трансформированные рекомбинантными векторами экспрессии из ДНК бактериофага или плазмидной ДНК, содержащими соответствующую кодирующую последовательность;

дрожжевые или мицелиальные грибы, трансформированные рекомбинантными векторами экспрессии дрожжей или грибов, содержащими соответствующую кодирующую последовательность;

системы клеток насекомых, инфицированные рекомбинантными вирусными векторами экспрессии (например, бакуловирусом), содержащими соответствующую кодирующую последовательность;

системы клеток растений, инфицированные рекомбинантными вирусными векторами экспрессии

- 91 042955 (например, вирус мозаики цветной капусты или вирус табачной мозаики) или трансформированные рекомбинантными плазмидными векторами экспрессии (например, Ti-плазмида), содержащими соответствующую кодирующую последовательность; или системы клеток животных, включая клетки млекопитающих (например, клетки HEK293, СНО, Cos,

HeLa, НКВ11 и BHK).

В одном из вариантов реализации клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку. В настоящем описании термин эукариотическая клетка относится к любой клетке животного или растения, содержащей характерное ядро. Эукариотические клетки животных включают клетки позвоночных, например, млекопитающих и клетки беспозвоночных, например, насекомых. Эукариотические клетки растений, в частности, могут включать без ограничения клетки дрожжей. Эукариотическая клетка отличается от прокариотической клетки, например, бактерий.

В некоторых вариантах реализации эукариотическая клетка представляет собой клетку млекопитающего. Клетка млекопитающего представляет собой любую клетку, полученную от млекопитающего. Клетки млекопитающих, в частности, включают, но не ограничиваются перечисленными, линии клеток млекопитающих. В одном из вариантов реализации клетка млекопитающего представляет собой клетку человека. В другом варианте реализации клетка млекопитающего представляет собой клетку HEK293, которая представляет собой линию клеток мезонефроса человека. Клетки HEK293 доступны в виде CRL-1533 от Американской коллекции типовых культур, Манассас, Вирджиния, и в виде клеток 293-Н, номер по каталогу 11631-017, или клеток 293-F, номер по каталогу 11625-019 от Invitrogen (Карлсбад, Калифорния). В некоторых вариантах реализации клетка млекопитающего представляет собой клетку PER.C6 , которая представляет собой линию клеток человека, полученную из сетчатки. Клетки PER.C6 доступны от Crucell (Лейден, Нидерланды). В других вариантах реализации клетка млекопитающего представляет собой клетку яичника китайского хомячка (СНО). Клетки СНО доступны от Американской коллекции типовых культур, Манассас, Вирджиния (например, СНО-Ki; CCL-61). В других вариантах реализации клетка млекопитающего представляет собой клетку почки новорожденного хомяка (ВНК). Клетки ВНК доступны от Американской коллекции типовых культур, Манассас, Вирджиния (например, CRL-1632). В некоторых вариантах реализации клетка млекопитающего представляет собой клетку НКВ11, которая представляет собой гибридную линию клеток на основе линии клеток HEK293 и В-клеток человека. Mei et al., Mol Biotechnol., 34(2):165-78 (2006).

В одном из вариантов реализации плазмиду, содержащую последовательность, кодирующую гибрид FVHI(X)-Fc, последовательность, кодирующую гибрид VWFфрагмент фактора фон Виллебранда-L-Fc, или обе последовательности и селектируемый маркер, например, ген резистентности к зеоцину, трансфицируют в клетки HEK293 для получения химерного белка.

В другом варианте реализации плазмиду, содержащую последовательность, кодирующую гибрид FVIII-Fc, последовательность, кодирующую гибрид VWFфрагмент фактора фон Виллебранда-XTEN-L-Fc, или обе последовательности и селектируемый маркер, например, ген резистентности к зеоцину, трансфицируют в клетки HEK293 для получения химерного белка.

В других вариантах реализации плазмиду, содержащую последовательность, кодирующую гибрид FVIII(X)-Fc, последовательность, кодирующую Fc, или обе последовательности и селектируемый маркер, например, ген резистентности к зеоцину, трансфицируют в клетки HEK293 для получения химерного белка.

В некоторых вариантах реализации первую плазмиду, содержащую последовательность, кодирующую гибрид FVIII(X)-Fc и первый селектируемый маркер, например ген резистентности к зеоцину, и вторую плазмиду, содержащую последовательность, кодирующую Fc, или последовательность, кодирующую VWFфрагмент фактора фон Виллебранда-L-Fc и второй селектируемый маркер, например ген резистентности к неомицину, и третью плазмиду, содержащую последовательность, кодирующую протеинконвертазу, и третий селектируемый маркер, например ген резистентности к гигромицину, совместно трансфицируют в клетки HEK293 для получения химерного белка. Указанная первая и вторая плазмиды могут быть введены в равных количествах (т.е. молярное соотношение 1:1) или они могут быть введены в неравных количествах.

В других вариантах реализации первую плазмиду, содержащую последовательность, кодирующую гибрид FVIII-Fc и первый селектируемый маркер, например ген резистентности к зеоцину, и вторую плазмиду, содержащую последовательность, кодирующую VWFфрагмент фактора фон ВиллебрандаXTEN-L-Fc, и второй селектируемый маркер, например ген резистентности к неомицину, и третью плазмиду, содержащую последовательность, кодирующую протеинконвертазу, и третий селектируемый маркер, например ген резистентности к гигромицину, совместно трансфицируют в клетки HEK293 для получения химерного белка. Указанная первая и вторая плазмиды могут быть введены в равных количествах (т.е. молярное соотношение 1:1) или они могут быть введены в неравных количествах.

В других вариантах реализации первую плазмиду, содержащую последовательность, кодирующую гибрид FVIII(X)-Fc и первый селектируемый маркер, например ген резистентности к зеоцину, и вторую плазмиду, содержащую последовательность, кодирующую VWFфрагмент фактора фон ВиллебрандаXTEN-L-Fc, и второй селектируемый маркер, например ген резистентности к неомицину, и третью плаз- 92 042955 миду, содержащую последовательность, кодирующую протеинконвертазу, и третий селектируемый маркер, например ген резистентности к гигромицину, совместно трансфицируют в клетки HEK293 для получения химерного белка. Указанная первая и вторая плазмиды могут быть введены в равных количествах (т.е. молярное соотношение 1:1) или они могут быть введены в неравных количествах.

В некоторых вариантах реализации первую плазмиду, содержащую последовательность, кодирующую химерный белок FVIII (с или без XTEN)-F1-L1-V-XTEN-L2-F2 и первый селектируемый маркер, например ген резистентности к зеоцину, и вторую плазмиду, содержащую последовательность, кодирующую протеинконвертазу, и второй селектируемый маркер, например ген резистентности к гигромицину, совместно трансфицируют в клетки HEK293 для получения химерного белка. Промоторы для последовательности, кодирующей FVIII(X)-Fc, и последовательности, кодирующей VWF-XTEN-Fc, могут быть разными или они могут быть одинаковыми.

В других вариантах реализации трансфицированные клетки являются стабильно трансфицированными. Данные клетки можно отбирать и хранить в виде стабильной линии клеток с использованием обычных методов, известных специалисту в данной области техники.

Клетки-хозяева, содержащие ДНК-конструкции белка, выращивают в соответствующей питательной среде. В настоящем описании термин соответствующая питательная среда означает среду, содержащую питательные вещества, необходимые для роста клеток. Питательные вещества, необходимые для роста клеток, могут включать источник углерода, источник азота, незаменимые аминокислоты, витамины, минералы и факторы роста. Среды могут содержать один или более факторов отбора. Среды могут содержать телячью сыворотку или фетальную телячью сыворотку (FCS). В одном из вариантов реализации среды по существу не содержат IgG. Питательная среда, как правило, будет обеспечивать отбор клеток, содержащих ДНК-конструкцию, например, путем отбора по чувствительности к лекарственному средству или дефициту незаменимого питательного вещества, который дополняет селектируемый маркер в ДНК-конструкции или совместно трансфицированный с ДНК-конструкцией. Культивируемые клетки млекопитающих обычно выращивают в коммерчески доступных содержащих сыворотку или бессывороточных средах (например, MEM, DMEM, DMEM/F12). В одном из вариантов реализации среда представляет собой CD293 (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния). В другом варианте реализации среда представляет собой CD17 (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния). Выбор среды, подходящей для конкретной линии клеток, находится в рамках компетенции специалиста в данной области техники.

Для совместной экспрессии двух полипептидных цепей химерного белка клетки-хозяева культивируют в условиях, обеспечивающих экспрессию обеих цепей. В настоящем описании термин культивирование относится к выдерживанию живых клеток in vitro в течение по меньшей мере определенного времени. Выдерживание может включать, но не обязательно включает, увеличение популяции живых клеток. Например, популяция клеток, выдерживаемых в культуре, может не меняться, но они попрежнему являются жизнеспособными и способны продуцировать желаемый продукт, например, рекомбинантный белок или рекомбинантный гибридный белок. Подходящие условия для культивирования эукариотических клеток хорошо известны в данной области техники и включают соответствующий выбор питательных сред, добавок в питательные среды, температуры, pH, насыщения кислородом и т.п. Для коммерческих целей культивирование может включать использование любого из различных типов систем увеличения масштаба, включая шейкерные колбы, роллерные флаконы, биореакторы с полыми волокнами, биореакторы с механическим перемешиванием, эрлифтные биореакторы, волновые биореакторы и другие.

Условия для культивирования клеток также выбирают таким образом, чтобы обеспечить ассоциацию VWFфрагмента фактора фон Виллебранда с белком FVIII.

Условия, обеспечивающие экспрессию VWFфрагмента фактора фон Виллебранда и/или белка FVIII, могут включать присутствие источника витамина K. Например, в одном из вариантов реализации стабильно трансфицированные клетки HEK293 культивируют в средах CD293 (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния) или средах OptiCHO (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния) с добавлением 4 мМ глутамина.

Один из аспектов настоящего изобретения относится к способу экспрессии, получения или продуцирования химерного белка согласно настоящему изобретению, включающему

а) трансфекцию клетки-хозяина, содержащей полинуклеотид, кодирующий химерный белок; и

b) культивирование клетки-хозяина в культуральной среде в условиях, подходящих для экспрессии химерного белка, при которых происходит экспрессия химерного белка.

В других вариантах реализации белковый продукт, содержащий VWFфрагмент фактора фон Виллебранда, связанный с последовательностью XTEN, или белок FVIII, связанный с последовательностью XTEN, секретируется в среды. Среды отделяют от клеток, концентрируют, фильтруют, а затем пропускают через две или три колонки для аффинной хроматографии, например колонку с белком А и одну или две анионообменные колонки.

Некоторые аспекты настоящего изобретения относятся к химерному белку, получаемому способами, описанными в настоящем документе.

Получение in vitro позволяет увеличивать масштаб для получения больших количеств желаемых измененных полипептидов согласно настоящему изобретению.

- 93 042955

Методы культивирования клеток млекопитающих в условиях культивирования тканей известны в данной области техники и включают однородную суспензионную культуру, например, в эрлифтном реакторе или в реакторе с непрерывным перемешиванием, или культуру иммобилизованных или захваченных клеток, например, в полых волокнах, микрокапсулах, на агарозных микрогранулах или керамических картриджах. При необходимости и/или желании растворы полипептидов могут быть очищены обычными методами хроматографии, например, гель-фильтрации, ионообменной хроматографии, гидрофобной хроматографии (HIC), хроматографии на DEAE-целлюлозе или аффинной хроматографии.

Фармацевтическая композиция.

Композиции, содержащие химерный белок согласно настоящему изобретению, могут содержать подходящий фармацевтически приемлемый носитель. Например, они могут содержать вспомогательные вещества и/или дополнительные вещества, которые облегчают переработку активных соединений в препараты, предназначенные для доставки к месту действия.

Фармацевтическая композиция может быть представлена в форме для парентерального введения (т.е. внутривенного, подкожного или внутримышечного) путем болюсной инъекции. Составы для инъекции могут быть представлены в единичной лекарственной форме, например в ампулах или в многодозовых емкостях с добавлением консерванта. Композиции могут принимать такие формы, как суспензии, растворы или эмульсии в масляных или водных носителях, и могут содержать вспомогательные вещества, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие вещества. В качестве альтернативы, активный ингредиент может находиться в форме порошка для восстановления подходящим носителем, например, апирогенной водой. Подходящие составы для парентерального введения также включают водные растворы активных соединений в водорастворимой форме, например водорастворимые соли. Кроме того, могут быть введены суспензии активных соединений в виде соответствующих масляных суспензий для инъекций. Подходящие липофильные растворители или носители включают жирные масла, например кунжутное масло, или синтетические эфиры жирных кислот, например этилолеат или триглицериды. Водные суспензии для инъекций могут содержать вещества, повышающие вязкость суспензии, включая, например, натрийкарбоксиметилцеллюлозу, сорбитол и декстран. Суспензия также может содержать стабилизаторы. Липосомы также можно использовать для инкапсулирования молекул согласно настоящему изобретению для доставки в клетки или интерстициальные пространства. Типичными фармацевтически приемлемыми носителями являются физиологически совместимые растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и замедляющие абсорбцию агенты, вода, физиологический раствор, фосфатный буферный раствор, декстроза, глицерин, этанол и т.п. В некоторых вариантах реализации композиция содержит изотонические агенты, например, сахара, полиспирты, такие как маннитол, сорбитол, или хлорид натрия. В других вариантах реализации композиции содержат фармацевтически приемлемые вещества, такие как смачивающие агенты, или незначительные количества вспомогательных веществ, таких как смачивающие агенты или эмульгаторы, консерванты или буферы, которые увеличивают срок хранения или эффективность активных ингредиентов.

Композиции согласно настоящему изобретению могут находиться в различных формах, включая, например, жидкие лекарственные формы (например, растворы для инъекций и инфузий), дисперсии, суспензии, полужидкие и твердые лекарственные формы. Предпочтительная форма зависит от способа введения и терапевтического применения. Композиция может быть представлена в виде раствора, микроэмульсии, дисперсии, липосомы или другой упорядоченной структуры, подходящей для высокой концентрации лекарственного средства. Стерильные растворы для инъекций могут быть приготовлены путем включения активного ингредиента в требуемом количестве в соответствующий растворитель с одним ингредиентом или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, при необходимости с последующей стерилизацией путем фильтрации. Как правило, дисперсии готовят путем включения активного ингредиента в стерильный носитель, содержащий основную дисперсионную среду и другие требуемые ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных растворов для инъекций, предпочтительные способы получения представляют собой вакуумную сушку и сушку методом сублимации, которые позволяют получить порошок активного ингредиента, а также любого желаемого дополнительного ингредиента из предварительно стерилизованного путем фильтрации раствора. Необходимая текучесть раствора может быть сохранена, например, путем использования покрытия, такого как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии или путем использования поверхностно-активных веществ. Пролонгированную абсорбцию композиций для инъекций можно вызвать путем включения в композицию агента, который отсрочивает абсорбцию, например, моностеаратных солей и желатина. Активный ингредиент может быть включен в состав или устройство с контролируемым высвобождением. Примеры таких составов и устройств включают имплантаты, трансдермальные пластыри и микроинкапсулированные системы доставки. Могут быть использованы биоразлагаемые биосовместимые полимеры, например, этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Способы получения таких составов и устройств известны в данной области техники. См., например, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

- 94 042955

Депо-составы для инъекций могут быть получены путем образования микроинкапсулированных матриц лекарственного средства в биоразлагаемых полимерах, таких как полилактид-полигликолид. В зависимости от соотношения лекарственного средства и полимера, и природы используемого полимера, можно контролировать скорость высвобождения лекарственного средства. Другие типичные биоразлагаемые полимеры представляют собой полиортоэфиры и полиангидриды. Депо-составы для инъекций также могут быть получены путем включения лекарственного средства в липосомы или микроэмульсии.

В композиции могут быть включены дополнительные активные соединения. В одном из вариантов реализации химерный белок согласно настоящему изобретению включают в состав совместно с другим фактором свертывания крови или его вариантом, фрагментом, аналогом или производным. Например, фактор свертывания крови включает, но не ограничивается ими, фактор V, фактор VII, фактор VIII, фактор IX, фактор X, фактор XI, фактор XII, фактор XIII, протромбин, фибриноген, фактор фон Виллебранда или рекомбинантный растворимый тканевой фактор (rsTF), или активированные формы любого из предшествующих. Фактор свертывания крови гемостатического средства также может включать антифибринолитические лекарственные средства, например, эпсилон-аминокапроновую кислоту, транексамовую кислоту.

Режимы дозирования можно корректировать для обеспечения оптимального желаемого ответа. Например, можно вводить однократную болюсную дозу, можно вводить несколько раздельных доз в течение некоторого времени или дозу можно пропорционально уменьшать или увеличивать в зависимости от обстоятельств терапевтической ситуации. Предпочтительным является получение композиций для парентерального введения в единичной лекарственной форме для удобства введения и однородности дозы. См., например, Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., Easton, Pa., 1980). В дополнение к активному соединению жидкая лекарственная форма может содержать инертные ингредиенты, такие как вода, этиловый спирт, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, диметилформамид, масла, глицерин, тетрагидрофурфуриловый спирт, полиэтиленгликоли и сложные эфиры сорбитана и жирных кислот.

Неограничивающие примеры подходящих фармацевтических носителей также описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences, E. W. Martin. Некоторые примеры вспомогательных веществ включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропиленгликоль, воду, этанол и т.п. Композиция также может содержать pH буферные реагенты и смачивающие агенты или эмульгаторы. Для перорального введения фармацевтическая композиция может принимать форму таблеток или капсул, полученных обычными способами. Композиция также может быть получена в виде жидкости, например, сиропа или суспензии. Указанная жидкость может содержать суспендирующие агенты (например, сорбитовый сироп, производные целлюлозы или гидрогенизированные пищевые жиры), эмульгаторы (лецитин или камедь), неводные носители (например, миндальное масло, масляные сложные эфиры, этиловый спирт или фракционированные растительные масла) и консерванты (например, метил- или пропил-п-гидроксибензоаты или сорбиновая кислота). Препараты также могут содержать ароматизаторы, красители и подсластители. В качестве альтернативы, композиция может быть представлена в виде сухого продукта для восстановления водой или другим подходящим носителем.

Для трансбуккального введения композиция может принимать форму таблеток или пастилок в соответствии с традиционными протоколами.

Для введения путем ингаляции соединения для применения согласно настоящему изобретению удобным образом доставляют в форме распыляемого аэрозоля, содержащего или не содержащего вспомогательные вещества, или в форме спрея-аэрозоля из находящейся под давлением упаковки или распылителя возможно с использованием пропеллента, например, дихлордифторметана, трихлорфторметана, дихлортетрафторэтана, диоксида углерода или другого подходящего газа. В случае аэрозоля, находящегося под давлением, единицу дозирования можно определять путем снабжения клапаном для доставки отмеренного количества. Могут быть получены капсулы и картриджи, например, из желатина для применения в ингаляторе или инсуффляторе, содержащие порошковую смесь соединения и подходящей порошковой основы, такой как лактоза или крахмал. Фармацевтическая композиция также может быть получена в форме для ректального введения в виде суппозитория или удерживающей клизмы, например, содержащей традиционные основы для суппозиториев, такие как масло какао или другие глицериды.

В одном из вариантов реализации фармацевтическая композиция содержит химерный белок, полинуклеотид, кодирующий указанный химерный белок, вектор, содержащий полинуклеотид, или клеткухозяина, содержащую вектор, и фармацевтически приемлемый носитель. Белок FVIII в химерном белке имеет увеличенный период полувыведения по сравнению с белком FVIII дикого типа или соответствующим белком FVIII, не содержащим VWFфрагмент фактора фон Виллебранда. В одном из вариантов реализации период полувыведения белка FVIII по меньшей мере примерно в 1,5 раза, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 2,5 раза, по меньшей мере примерно в 3 раза, по меньшей мере примерно в 4 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 6 раз, по меньшей мере примерно в 7 раз, по меньшей мере примерно в 8 раз, по меньшей мере примерно в 9 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 11 раз или по меньшей мере примерно

- 95 042955 в 12 раз больше чем у FVIII дикого типа. В другом варианте реализации период полувыведения фактора

VIII составляет по меньшей мере примерно 17 ч, по меньшей мере примерно 18 ч, по меньшей мере примерно 19 ч, по меньшей мере примерно 20 ч, по меньшей мере примерно 21 ч, по меньшей мере примерно 22 ч, по меньшей мере примерно 23 ч, по меньшей мере примерно 24 ч, по меньшей мере примерно ч, по меньшей мере примерно 26 ч, по меньшей мере примерно 27 ч, по меньшей мере примерно 28 ч, по меньшей мере примерно 29 ч, по меньшей мере примерно 30 ч, по меньшей мере примерно 31 ч, по меньшей мере примерно 32 ч, по меньшей мере примерно 33 ч, по меньшей мере примерно 34 ч, по меньшей мере примерно 35 ч, по меньшей мере примерно 36 ч, по меньшей мере примерно 48 ч, по меньшей мере примерно 60 ч, по меньшей мере примерно 72 ч, по меньшей мере примерно 84 ч, по меньшей мере примерно 96 ч или по меньшей мере примерно 108 ч. В некоторых вариантах реализации композицию вводят путем, выбранным из группы, состоящей из топического введения, внутриглазного введения, парентерального введения, интратекального введения, субдурального введения и перорального введения. Парентеральное введение может представлять собой внутривенное или подкожное введение.

В других вариантах реализации композицию применяют для лечения заболевания или состояния, связанного с кровотечениями, у нуждающегося в этом субъекта. Указанное заболевание или состояние, связанное с кровотечениями, выбрано из группы, состоящей из нарушения свертываемости крови, сопровождающегося повышенной кровоточивостью, гемартроза, мышечного кровотечения, кровотечения в ротовой полости, кровоизлияния, кровоизлияния в мышцы, кровоизлияния в ротовой полости, травмы, травмы головы, желудочно-кишечного кровотечения, внутричерепного кровоизлияния, внутрибрюшинного кровоизлияния, внутригрудного кровоизлияния, перелома костей, кровотечения в центральной нервной системе, кровотечения в заглоточном пространстве, кровотечения в забрюшинном пространстве, кровотечения во влагалище подвздошно-поясничной мышцы и их любых комбинаций. В других вариантах реализации субъекту назначено оперативное вмешательство. В других вариантах реализации лечение является профилактическим или по необходимости.

Генная терапия.

Химерный белок согласно настоящему изобретению может быть получен in vivo у млекопитающего, например пациента, представляющего собой человека, с использованием подхода на основе генной терапии для лечения заболевания или нарушения, сопровождающегося повышенной кровоточивостью, выбранного из группы, состоящей из нарушения свертываемости крови, сопровождающегося повышенной кровоточивостью, гемартроза, мышечного кровотечения, кровотечения в ротовой полости, кровоизлияния, кровоизлияния в мышцы, кровоизлияния в ротовой полости, травмы, травмы головы, желудочно-кишечного кровотечения, внутричерепного кровоизлияния, внутрибрюшинного кровоизлияния, внутригрудного кровоизлияния, перелома костей, кровотечения в центральной нервной системе, кровотечения в заглоточном пространстве, кровотечения в забрюшинном пространстве, кровотечения во влагалище подвздошно-поясничной мышцы. В одном из вариантов реализации заболевание или нарушение, сопровождающееся повышенной кровоточивостью, представляет собой гемофилию. В другом варианте реализации заболевание или нарушение, сопровождающееся повышенной кровоточивостью, представляет собой гемофилию А. Данный подход включает введение подходящей нуклеиновой кислоты, кодирующей химерный белок, функционально связанной с подходящими последовательностями, контролирующими экспрессию. В определенном варианте реализации данные последовательности включены в вирусный вектор. Подходящие вирусные векторы для такой генной терапии включают аденовирусные векторы, лентивирусные векторы, бакуловирусные векторы, векторы на основе вируса Эпштейна-Барра, паповавирусные векторы, векторы на основе вируса осповакцины, векторы на основе вируса простого герпеса и векторы на основе аденоассоциированного вируса (AAV). Вирусный вектор может представлять собой дефектный по репликации вирусный вектор. В других вариантах реализации аденовирусный вектор содержит делецию в гене E1 или гене E3. При использовании аденовирусного вектора млекопитающее могут не подвергать воздействию нуклеиновой кислотой, кодирующей селектируемый маркерный ген. В других вариантах реализации последовательности включают в невирусный вектор, известный специалисту в данной области техники.

Способы применения химерного белка.

Настоящее изобретение относится к способу применения химерного белка, описанного в настоящем документе, для предотвращения или ингибирования связывания VWFэндогенного фактора фон Виллебранда с белком FVIII. Настоящее изобретение также относится к способу применения химерного белка, содержащего белок FVIII, связанный с XTEN и константной областью Ig или ее частью.

Один из аспектов настоящего изобретения относится к предотвращению или ингибированию взаимодействия FVIII с VWFэндогенным фактором фон Виллебранда путем блокировки или защиты сайта VWFсвязывания фактора фон Виллебранда в FVIII от VWFэндогенного фактора фон Виллебранда, и в то же время к увеличению периода полувыведения белка FVIII с использованием последовательности XTEN в комбинации с константной областью Ig или ее частью, которая также может представлять собой увеличитель периода полувыведения. Один из вариантов реализации настоящего изобретения относится к способу конструирования белка FVIII, имеющего более длительный период полувыведения, чем FVIII дикого типа. В одном из вариантов реализации последовательность XTEN ингибирует или предот- 96 042955 вращает взаимодействие белка FVIII в химерном белке с VWFэндогенным фактором фон Виллебранда. В другом варианте реализации константная область Ig или ее часть ингибирует или предотвращает взаимодействие белка FVIII с VWFэндогенным фактором фон Виллебранда. Химерный белок, применяемый в данном способе, включает любой один или более химерных белков, описанных в настоящем документе.

Другой аспект настоящего изобретения включает способ введения нуждающемуся в этом субъекту химерного белка, содержащего белок FVIII, имеющий более длительный период полувыведения, чем FVIII дикого типа, при этом указанный способ включает введение указанному субъекту химерного белка, описанного в настоящем документе. Один из вариантов реализации настоящего изобретения относится к способу применения последовательности XTEN и константной области Ig или ее части для увеличения периода полувыведения белка FVIII, и VWFфрагмента фактора фон Виллебранда для предотвращения или ингибирования взаимодействия VWFэндогенного фактора фон Виллебранда с белком FVIII. Белок FVIII, связанный с последовательностью XTEN (например, FVIII(X)), а затем связанный или ассоциированный с VWFфрагментом фактора фон Виллебранда, огражден или защищен от пути клиренса VWF и, таким образом, демонстрирует пониженный клиренс по сравнению с белком FVIII, не связанный с VWFфрагментом фактора фон Виллебранда. Таким образом, защищенный белок FVIII демонстрирует максимальное увеличение периода полувыведения по сравнению с белком FVIII, не связанным или не ассоциированным с последовательностью XTEN и VWFфрагментом фактора фон Виллебранда. В некоторых вариантах реализации белок FVIII, ассоциированный с или защищенный VWFфрагментом фактора фон Виллебранда, и связанный с последовательностью XTEN, не выводится рецептором, ответственным за клиренс VWF. В других вариантах реализации белок FVIII, ассоциированный с или защищенный VWFфрагментом фактора фон Виллебранда, и связанный с последовательностью XTEN, выводится из системы медленнее, чем белок FVIII, который не ассоциирован с или не защищен VWFфрагментом фактора фон Виллебранда и не связан с последовательностью XTEN.

В соответствии с одним из аспектов химерный белок, содержащий белок FVIII, связанный с последовательностью XTEN, или белок FVIII, связанный или ассоциированный с VWFфрагментом фактора фон Виллебранда, связанным с XTEN, демонстрирует пониженный клиренс из кровообращения, поскольку указанный VWFфрагмент фактора фон Виллебранда не содержит сайт связывания с рецептором, ответственным за клиренс VWF. VWFфрагмент фактора фон Виллебранда предотвращает или ингибирует клиренс FVIII, связанного или ассоциированного с VWFфрагментом фактора фон Виллебранда, из системы по пути клиренса VWF. Фрагменты VWF, подходящие для настоящего изобретения, также могут обеспечивать по меньшей мере одно или более защитных свойств в отношении FVIII, подобных VWF, которые обеспечивает эндогенный VWF. В некоторых вариантах реализации VWFфрагмент фактора фон Виллебранда или последовательность XTEN также может маскировать один или более сайтов связывания с рецептором, ответственным за клиренс FVIII, тем самым предотвращая клиренс FVIII по собственному пути клиренса.

В некоторых вариантах реализации предотвращение или ингибирование VWFфрагментом фактора фон Виллебранда или последовательностью XTEN связывания белка FVIII с VWFэндогенным фактором фон Виллебранда может происходить in vitro или in vivo.

Также предложен способ увеличения периода полувыведения белка FVIII, включающий введение химерного белка, описанного в настоящем документе, нуждающемуся в этом субъекту. Период полувыведения неактивированного FVIII, связанного или ассоциированного с полноразмерным VWF, составляет от примерно 12 до 14 ч в плазме крови. При болезни фон Виллебранда (БВ) 3 типа, когда в кровообращении почти отсутствует VWF, период полувыведения FVIII составляет лишь примерно шесть часов, что у таких пациентов приводит к симптомам гемофилии А от легкой до умеренной из-за пониженных концентраций FVIII. Период полувыведения белка FVIII, связанного или ассоциированного с VWFфрагментом фактора фон Виллебранда или последовательностью XTEN, согласно настоящему изобретению может увеличиваться по меньшей мере примерно в 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9 или 4,0 раза по сравнению с периодом полувыведения неактивированного FVIII, связанного или ассоциированного с полноразмерным VWF.

В одном из вариантов реализации период полувыведения белка FVIII, связанного или ассоциированного с VWFфрагментом фактора фон Виллебранда, или связанного с константной областью Ig или ее частью в химерного белке, содержащем последовательность XTEN, увеличивается по меньшей мере примерно в 2, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 7, 8, 9 или 10 раз по сравнению с периодом полувыведения неактивированного FVIII, связанного или ассоциированного с полноразмерным VWF. В другом варианте реализации период полувыведения белка FVIII, связанного или ассоциированного с VWFфрагментом фактора фон Виллебранда или константной областью Ig или ее частью в химерного белке, содержащем последовательность XTEN, увеличивается от примерно в 2 до примерно в 5 раз, от примерно в 3 до примерно в 10 раз, от примерно в 5 до примерно в 15 раз, от примерно в 10 до примерно в 20 раз, от примерно в 15 до примерно в 25 раз, от примерно в 20 до примерно в 30 раз, от примерно в 25 до примерно в 35 раз, от примерно в 30 до примерно в 40 раз, от примерно в 35 до примерно в 45 раз по сравнению с периодом полувыведения неактивированного FVIII, связанного или ассоциированного с полноразмерным VWF, или FVIII дикого типа. В конкретном варианте реализации период полувыведения бел- 97 042955 ка FVIII, связанного или ассоциированного с VWFфрагментом фактора фон Виллебранда, или связанного с константной областью Ig в химерного белке, содержащем последовательность XTEN, увеличивается по меньшей мере примерно в 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 раз по сравнению с периодом полувыведения FVIII дикого типа у мышей с двойным нокаутом FVIII и VWF.

В некоторых вариантах реализации период полувыведения химерного белка, содержащего VWFфрагмент фактора фон Виллебранда, слитый с первой константной областью Ig или ее частью, например первой областью Fc, и последовательностью XTEN, и белком FVIII, связанным с последовательностью XTEN и второй константной областью Ig или ее частью, например второй областью Fc, больше периода полувыведения FVIII, ассоциированного с VWFэндогенным фактором фон Виллебранда. В других вариантах реализации период полувыведения химерного белка по меньшей мере примерно в 1,5, 2, 2,5, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,5 или 5,0 раз больше периода полувыведения FVIII дикого типа или белка FVIII, ассоциированного с VWFэндогенным фактором фон Виллебранда.

В некоторых вариантах реализации благодаря настоящему изобретению период полувыведения белка FVIII увеличен по сравнению с белком FVIII, не содержащим VWFфрагмент фактора фон Виллебранда, или FVIII дикого типа. Период полувыведения химерного белка согласно настоящему изобретению по меньшей мере примерно в 1,5 раза, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 2,5 раза, по меньшей мере примерно в 3 раза, по меньшей мере примерно в 4 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 6 раз, по меньшей мере примерно в 7 раз, по меньшей мере примерно в 8 раз, по меньшей мере примерно в 9 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 11 раз или по меньшей мере примерно в 12 раз больше периода полувыведения белка FVIII, не содержащего VWFфрагмент фактора фон Виллебранда, или FVIII дикого типа. В одном из вариантов реализации период полувыведения FVIII от примерно в 1,5 раза до примерно в 20 раз, от примерно в 1,5 раза до примерно в 15 раз или от примерно в 1,5 раза до примерно в 10 раз больше пе риода полувыведения FVIII дикого типа.

В другом варианте реализации период полувыведения FVIII увеличен от примерно в 2 раза до примерно в 10 раз, от примерно в 2 раза до примерно в 9 раз, от примерно в 2 раза до примерно в 8 раз, от примерно в 2 раза до примерно в 7 раз, от примерно в 2 раза до примерно в 6 раз, от примерно в 2 раза до примерно в 5 раз, от примерно в 2 раза до примерно в 4 раза, от примерно в 2 раза до примерно в 3 раза, от примерно в 2,5 раза до примерно 10 раз, от примерно в 2,5 раза до примерно в 9 раз, от примерно в

2,5 раза до примерно в 8 раз, от примерно в 2,5 раза до примерно в 7 раз, от примерно в 2,5 раза до при мерно в 6 раз, от примерно в 2,5 раза до примерно в 5 раз, от примерно в 2,5 раза до примерно в 4 раза, от примерно в 2,5 раза до примерно в 3 раза, от примерно в 3 раза до примерно в 10 раз, от примерно в 3 раза до примерно в 9 раз, от примерно в 3 раза до примерно в 8 раз, от примерно в 3 раза до примерно в 7 раз, от примерно в 3 раза до примерно в 6 раз, от примерно в 3 раза до примерно в 5 раз, от примерно в 3 раза до примерно в 4 раза, от примерно в 4 раза до примерно в 6 раз, от примерно в 5 раз до примерно в раз или от примерно в 6 раз до примерно в 8 раз по сравнению с FVIII дикого типа или белком FVIII, не содержащим VWFфрагмент фактора фон Виллебранда. В других вариантах реализации период полувыведения химерного белка согласно настоящему изобретению составляет по меньшей мере примерно 17 ч, по меньшей мере примерно 18 ч, по меньшей мере примерно 19 ч, по меньшей мере примерно 20 ч, по меньшей мере примерно 21 ч, по меньшей мере примерно 22 ч, по меньшей мере примерно 23 ч, по меньшей мере примерно 24 ч, по меньшей мере примерно 25 ч, по меньшей мере примерно 26 ч, по меньшей мере примерно 27 ч, по меньшей мере примерно 28 ч, по меньшей мере примерно 29 ч, по меньшей мере примерно 30 ч, по меньшей мере примерно 31 ч, по меньшей мере примерно 32 ч, по меньшей мере примерно 33 ч, по меньшей мере примерно 34 ч, по меньшей мере примерно 35 ч, по меньшей мере примерно 36 ч, по меньшей мере примерно 48 ч, по меньшей мере примерно 60 ч, по меньшей мере примерно 72 ч, по меньшей мере примерно 84 ч, по меньшей мере примерно 96 ч или по меньшей мере примерно 108 ч. В других вариантах реализации период полувыведения химерного белка согласно настоящему изобретению составляет от примерно 15 ч до примерно двух недель, от примерно ч до примерно одной недели, от примерно 17 ч до примерно одной недели, от примерно 18 ч до при мерно одной недели, от примерно 19 ч до примерно одной недели, от примерно 20 ч до примерно одной недели, от примерно 21 ч до примерно одной недели, от примерно 22 ч до примерно одной недели, от примерно 23 ч до примерно одной недели, от примерно 24 ч до примерно одной недели, от примерно 36 ч до примерно одной недели, от примерно 48 ч до примерно одной недели, от примерно 60 ч до примерно одной недели, от примерно 24 ч до примерно шести дней, от примерно 24 ч до примерно пяти дней, от примерно 24 ч до примерно четырех дней, от примерно 24 ч до примерно трех дней или от примерно 24 ч до примерно двух дней.

В некоторых вариантах реализации средний период полувыведения химерного белка согласно настоящему изобретению у субъекта составляет примерно 15 ч, примерно 16 ч, примерно 17 ч, примерно 18 ч, примерно 19 ч, примерно 20 ч, примерно 21 ч, примерно 22 ч, примерно 23 ч, примерно 24 ч (1 день), примерно 25 ч, примерно 26 ч, примерно 27 ч, примерно 28 ч, примерно 29 ч, примерно 30 ч, примерно 31 ч, примерно 32 ч, примерно 33 ч, примерно 34 ч, примерно 35 ч, примерно 36 ч, примерно 40 ч, примерно 44 ч, примерно 48 ч (2 дня), примерно 54 ч, примерно 60 ч, примерно 72 ч (3 дня), при- 98 042955 мерно 84 ч, примерно 96 ч (4 дня), примерно 108 ч, примерно 120 ч (5 дней), примерно 6 дней, примерно дней (одна неделя), примерно 8 дней, примерно 9 дней, примерно 10 дней, примерно 11 дней, примерно дней, примерно 13 дней или примерно 14 дней.

Более того, согласно настоящему изобретению предложен способ лечения или предотвращения заболевания или нарушения, сопровождающегося повышенной кровоточивостью, включающий введение эффективного количества химерного белка. В одном из вариантов реализации указанное заболевание или нарушение, сопровождающееся повышенной кровоточивостью, выбрано из группы, состоящей из нарушения свертываемости крови, сопровождающегося повышенной кровоточивостью, гемартроза, мышечного кровотечения, кровотечения в ротовой полости, кровоизлияния, кровоизлияния в мышцы, кровоизлияния в ротовой полости, травмы, травмы головы, желудочно-кишечного кровотечения, внутричерепного кровоизлияния, внутрибрюшинного кровоизлияния, внутригрудного кровоизлияния, перелома костей, кровотечения в центральной нервной системе, кровотечения в заглоточном пространстве, кровотечения в забрюшинном пространстве и кровотечения во влагалище подвздошно-поясничной мышцы. В конкретном варианте реализации заболевание или нарушение, сопровождающееся повышенной кровоточивостью, представляет собой гемофилию А. Химерный белок, содержащий последовательность XTEN и константную область Ig или ее часть в комбинации с VWFфрагментом фактора фон Виллебранда, описанным в настоящем документе, который предотвращает или ингибирует взаимодействие белка FVIII с VWFэндогенным фактором фон Виллебранда, полученный в соответствии с настоящим изобретением, имеет множество применений, очевидных для специалиста в данной области техники, включая, но не ограничиваясь ими, способы лечения субъекта с нарушением гемостаза и способы лечения субъекта, нуждающегося в общем гемостатическом средстве. Один из вариантов реализации настоящего изобретения относится к способу лечения субъекта с нарушением гемостаза, включающему введение терапевтически эффективного количества химерного белка.

Часть химерного белка, представляющая собой белок FVIII, лечит или предотвращает нарушение гемостаза, выступая в качестве кофактора для фактора IX на отрицательно заряженной фосфолипидной поверхности, тем самым образуя комплекс Xase. Связывание активированных факторов свертывания крови с фосфолипидной поверхностью локализует данный процесс в местах повреждения сосудов. На фосфолипидной поверхности фактор VIIIa увеличивает максимальную скорость активации фактора X фактором IXa приблизительно в 200000 раз, что приводит к значительному второму выбросу тромбина.

Химерный белок согласно настоящему изобретению можно применять для лечения любого нарушения гемостаза. Нарушения гемостаза, которые можно лечить путем введения химерного белка согласно настоящему изобретению, включают, но не ограничиваются перечисленными: гемофилию А, а также дефициты или структурные нарушения, относящиеся к фактору VIII. В одном из вариантов реализации нарушение гемостаза представляет собой гемофилию А.

Химерный белок согласно настоящему изобретению можно применять профилактически для лечения субъекта с нарушением гемостаза. Химерный белок согласно настоящему изобретению можно применять для лечения острого эпизода кровотечения у субъекта с нарушением гемостаза. В другом варианте реализации нарушение гемостаза может являться следствием дефекта фактора свертывания крови, например, фактора фон Виллебранда. В одном из вариантов реализации нарушение гемостаза представляет собой наследственное нарушение. В другом варианте реализации нарушение гемостаза представляет собой приобретенное нарушение. Приобретенное нарушение может являться следствием первопричинного вторичного заболевания или состояния. Состояние, не связанное с указанным нарушением, может представлять собой, в качестве примера, но без ограничения, рак, аутоиммунное заболевание или беременность. Приобретенное нарушение может возникать вследствие преклонного возраста или лекарственных средств для лечения первопричинного вторичного заболевания (например, химиотерапия рака).

Настоящее изобретение также относится к способам лечения субъекта, у которого нет врожденного нарушения гемостаза, но который страдает вторичным заболеванием или состоянием, приводящим к приобретению нарушения гемостаза, например, вследствие выработки антител анти-FVШ или оперативного вмешательства. Таким образом, настоящее изобретение относится к способу лечения субъекта, нуждающегося в общем гемостатическом средстве, включающему введение терапевтически эффективного количества химерного белка, полученного настоящими способами.

Настоящее изобретение также относится к способам снижения иммуногенности FVIII или индукции меньшей иммуногенности в отношении FVIII, включающим введение эффективного количества химерных белков, описанных в настоящем документе, или полинуклеотидов, кодирующих указанные белки.

В одном из вариантов реализации субъект, нуждающийся в общем гемостатическом средстве, подвергается или вскоре подвергнется оперативному вмешательству. Химерный белок согласно настоящему изобретению может быть введен до, во время или после оперативного вмешательства в качестве профилактического средства. Химерный белок согласно настоящему изобретению может быть введен до, во время или после оперативного вмешательства для контроля острого эпизода кровотечения. Химерный белок согласно настоящему изобретению можно применять для лечения субъекта с острым эпизодом кровотечения, который не страдает нарушением гемостаза. Указанный острый эпизод кровотечения может являться следствием тяжелой травмы, например оперативного вмешательства, автомобильной ката- 99 042955 строфы, ранения, огнестрельного ранения с разрывом или любого другого травматического случая, приводящего к неконтролируемому кровотечению. Неограничивающие примеры эпизодов кровотечения включают нарушение свертываемости крови, сопровождающееся повышенной кровоточивостью, гемартроз, мышечное кровотечение, кровотечение в ротовой полости, кровоизлияние, кровоизлияние в мышцы, кровоизлияние в ротовой полости, травму, травму головы, желудочно-кишечное кровотечение, внутричерепное кровоизлияние, внутрибрюшинное кровоизлияние, внутригрудное кровоизлияние, перелом костей, кровотечение в центральной нервной системе, кровотечение в заглоточном пространстве, кровотечение в забрюшинном пространстве, кровотечение во влагалище подвздошно-поясничной мышцы и их любые комбинации.

При профилактическом применении одну или более композиций, содержащих химерный белок согласно настоящему изобретению, или их смесь вводят пациенту еще не в состоянии заболевания для повышения резистентности пациента или уменьшения симптомов, связанных с заболеванием или нарушением. Такое количество определяется как профилактически эффективная доза. При терапевтическом применении иногда требуется относительно высокая доза (например, от примерно 1 до 400 мг/кг полипептида на дозу, при этом дозы от 5 до 25 мг чаще используют для радиоиммуноконьюгатов, а более высокие дозы - для полипептидов, модифицированных цитотоксиновыми лекарственными средствами) с относительно короткими интервалами пока не произойдет ослабление или прекращение прогрессирования заболевания и пока пациент не будет демонстрировать частичное или полное уменьшение интенсивности симптомов заболевания. После этого пациент может быть переведен на профилактический режим.

В некоторых вариантах реализации химерный белок или композицию согласно настоящему изобретению применяют для лечения по необходимости, которое включает лечение эпизода кровотечения, гемартроза, мышечного кровотечения, кровотечения в ротовой полости, кровоизлияния, кровоизлияния в мышцы, кровоизлияния в ротовой полости, травмы, травмы головы, желудочно-кишечного кровотечения, внутричерепного кровоизлияния, внутрибрюшинного кровоизлияния, внутригрудного кровоизлияния, перелома костей, кровотечения в центральной нервной системе, кровотечения в заглоточном пространстве, кровотечения в забрюшинном пространстве и кровотечения во влагалище подвздошнопоясничной мышцы. Субъект может нуждаться в профилактике при оперативном вмешательстве, периоперационном ведении или лечении для оперативного вмешательства. Такие оперативные вмешательства включают, например, малое оперативное вмешательство, обширное оперативное вмешательство, удаление зуба, тонзиллэктомию, герниотомию паховой грыжи, синовэктомию, полную замену коленного сустава, краниотомию, остеосинтез, оперативное вмешательство при травме, внутричерепное оперативное вмешательство, внутрибрюшное оперативное вмешательство, внутригрудное оперативное вмешательство или оперативное вмешательство по замене сустава.

В одном из вариантов реализации химерный белок согласно настоящему изобретению вводят внутривенно, подкожно, внутримышечно или через какую-либо поверхность слизистой оболочки, например, перорально, сублингвально, трансбуккально, интраназально, ректально, вагинально или через легкие. Химерный белок, содержащий VWFфрагмент фактора фон Виллебранда и белок FVIII, согласно настоящему изобретению может быть внедрен или связан с твердой биополимерной подложкой, которая обеспечивает медленное высвобождение химерного белка в место кровотечения, или внедрен в бинт/перевязочный материал. Доза химерного белка будет варьироваться в зависимости от субъекта и от конкретного используемого пути введения. Дозы могут находиться в диапазоне от 0,1 до 100000 мкг/кг массы тела. В одном из вариантов реализации диапазон доз составляет 0,1-1000 мкг/кг. В другом варианте реализации диапазон доз составляет 0,1-500 мкг/кг. Белок можно вводить непрерывно или с конкретными установленными интервалами. Для определения оптимальных диапазонов доз и/или режимов введения можно использовать анализы in vitro. Анализы in vitro для измерения активности факторов свертывания крови известны в данной области техники, например, анализ свертывания STA-CLOT VIIa-rTF или анализ свертывания ROTEM. Кроме того, эффективные дозы могут быть экстраполированы из кривых доза-ответ, полученных в моделях у животных, например, собаки, страдающей гемофилией (Mount et al., 2002, Blood, 99(8):2670).

После подробного описания настоящего изобретения оно станет более понятным со ссылкой на следующие примеры, которые включены только в целях иллюстрации и не ограничивают настоящее изобретение. Содержание всех патентов, публикаций и статей, указанных в настоящем документе, явным образом и определенно включено в настоящее описание посредством ссылки.

Примеры

В примерах использовали следующие материалы и способы, если не указано иное.

Материалы и способы.

В целом при осуществлении настоящего изобретения использовали, если не указано иное, общепринятые методики химии, биофизики, молекулярной биологии, технологии рекомбинантных ДНК, иммунологии (в особенности, например, технологии антител) и стандартные методики электрофореза. См., например, Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1996); Antibodies:

- 100 042955

A Laboratory Manual, Harlow et al., CS.H.L. Press, Pub. (1999); и Current Protocols in Molecular Biology, eds.

Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992).

Пример 1. Клонирование различных доменов VWF (фиг. 1).

(а) Клонирование pSYN-VWF-002.

pSYN-VWF-002 содержит нуклеотидные последовательности, кодирующие фрагмент VWF, представляющий собой аминокислоты 1-477 SEQ ID NO: 100 [белковая последовательность VWF-D'D3]. Нумерация аминокислот представляет собой последовательность зрелого VWF без пропептида и соответствует аминокислотам 764-1240 SEQ ID NO: 2. Конструкт pSYN-VWF-002 содержит сигнальный пептид FVIII на N-конце, который обеспечивает надлежащую секрецию синтезированного белка и за которым следует маркер 6xHis на С-конце, который используется для очистки белка. Его синтезировали с применением следующих комбинаций праймеров: ESC48-прямой праймер-VWF-D'D3 с сигнальным пептидом VIII и сайтом BsiW1

TCGCGACGTACGGCCGCCACCATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGC

CTTTTGCGATTCTGCTTTAGCCTATCCTGTCGGCCCCCCATG (SEQ ID NO: 90)

ESC51-обратный праймер-VWF D'D3 (аминокислоты 1-477) с 6His и сайтом Not 1

TGACCTCGAGCGGCCGCTCAGTGGTGATGGTGATGATGCGGCTCCTGGCAGGCTTCA

CAGGTGAGGTTGACAAC (SEQ ID NO: 91)

ПЦР в объеме 50 мкл проводили с применением комбинации праймеров ESC 48/ESC 51 и полноразмерной плазмиды VWF в качестве матрицы, используя 2-этапный цикл PCR-амплификации: 2 мин при 94°С; 21 цикл (30 с при 96°С, 2 мин при 68°С). Полосу 1460 п.о. очищали в геле с помощью комплекта для гель-экстракции (Qiagen, Валенсия, штат Калифорния, США) и клонировали в сайтах рестрикции BsiWI и Not1 плазмиды pcDNA 4, получая pSYN-VWF 002.

(b) Клонирование pSYN-VWF-010 и 013.

pSYN-VWF-010 конструировали с использованием pSYN-VWF-008 и pSYN-VWF-002. pSYN-VWF-008 содержала полноразмерную последовательность VWF в pcDNA 3.1 (аминокислоты 1-2813 SEQ ID NO: 2), она включала пропептид из 763 аминокислот (т.е. домены D1D2), за которым следовали остальные 2050 аминокислот последовательности зрелого VWF. Сигнальный пептид FVIII в pSYN-VWF-002 заменяли доменами D1D2 из pSYN-VWF-008; полученный конструкт представлял собой pSYN-VWF-010. pSYNVWF-008 содержал сайт BamH1 в положении Arg907 и Not1 в конце кодирующей области (после стопкодона). pSYN-VWF-008 и 002 гидролизовали с помощью ферментов рестрикции BamH1 и Not1. Вставки из pSYN-VWF-002 (1026 п.о.) лигировали с pSYN-VWF-008 (8242 п.о.), гидролизованным BamH1/Not1, получая pSYN-VWF-010 (D1D2D'D3: аминокислоты 1-1240 SEQ ID NO: 2), к С-концу также добавляли маркер 6xHis. В трансформированных клетках синтезировали pSYN-VWF-010 с пропептидом, однако вследствие внутриклеточного процессинга секретируемый продукт не содержал пропептида (D1D2). Белок VWF-010 существует в виде димера.

pSYN-VWF-010 использовали для создания pSYN-VWF-013, который содержал две точечные мутации в положениях С336А и С379А, соответствующие SEQ ID NO: 100 (нумерация аминокислот представляла собой последовательность зрелого VWF без домена D1D2 - последовательность VWF 2). Согласно прогнозам, указанные мутации предотвращали димеризацию домена D'D3 VWF.

(с) Клонирование pSYN-VWF-025 и pSYN-VWF-029.

pSYN-VWF-025 содержала последовательности D1D2D'D3 дикого типа из полноразмерного VWF в векторе pLIVE, a pSYN-VWF-029 содержит последовательность D1D2D'D3 с мутациями С336А и С379А. Для клонирования pSYN-VWF-025 использовали следующую комбинацию праймеров:

ESC 89-прямой праймер с сайтом

Nhe1=CTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCCG (SEQ ID NO: 92)

ESC 91-обратный праймер с сайтом

Sal1=CTGGATCCCGGGAGTCGACTCGTCAGTGGTGATGGTGATGATG (SEQ ID NO: 93)

ПЦР в объеме 50 мкл проводили с применением комбинации праймеров ESC 89/ESC91 и плазмиды pSYN-VWF 010 (для pSYN-VWF-025) или pSYN-VWF 013 (для pSYN-VWF-029) в качестве матрицы, используя 3-этапный цикл PCR-амплификации: 2 мин при 94°С; 21 цикл (30 с при 96°С, 30 с при 55°С, 4 мин при 68°С). Полосу ожидаемого размера (~3800 п.о.) очищали в геле с помощью комплекта для гель-экстракции (Qiagen, Валенсия, штат Калифорния, США) и клонировали в сайтах рестрикции Nhe1 и Sal1 вектора pLIVE-Mirus (Invitrogen, Карлсбад, штат Калифорния,США), получая pSYN-VWF 025 и 029.

(d) Клонирование pSYN-VWF-031.

pSYN-VWF-031 представлял собой конструкт D1D2D'D3(C336A/C379A)-Fc, содержащий тромбинрасщепляемый линкер длиной 48 аминокислот (8х GGGGS (SEQ ID NO 94)+сайт тромбина) между последовательностями VWF D1D2D'D3(C336A/C379A) и Fc. Для получения этого конструкта область VWF-Fc амплифицировали из конструкта pSYN-FVIII-064 (см. конструкт FVIII-VWF ниже). pSYN-FVIIIVWF расщепляли с помощью Xba1 и Nhe1. Полученную область вставки размером 4165 п.о., содержащую фрагмент VWF и область Fc, использовали в качестве матрицы для амплификации VWF и области

- 101 042955

Fc с помощью комбинации праймеров LW 22/LW23.

LW 22-прямой праймер-VWF-D'D3 с сигнальной последовательностью FVIII и сайтом BsiW1

GCGCCGGCCGTACGATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGCCTTTTGCG

ATTCTGCTTTAGCCTATCCTGTCGGCCCCCCATG (SEQ ID NO: 95)

LW 23-обратный праймер-Fc со стоп-кодоном и сайтом Not1

TCATCAATGTATCTTATCATGTCTGAATTCGCGGCCGCTCATTTACC (SEQ ID NO:96)

Продукт ПЦР, полученный в результате амплификации LW22/LW23 (~2300 п.о.), клонировали в pSYN-VWF-002, гидролизованном с помощью BsiW1/Not1, получая промежуточный конструкт pSYN-VWF-014. pSYN-VWF-014 содержал сигнальный пептид FVШ-D'D3-20-аминокислотный тромбинрасщепляемый линкер с последующей областью Fc.

Для получения конструкта D1D2D'D3-Fc область D1D2D'D3 амплифицировали из pSYN-OB-013 с использованием комбинации праймеров LW24/LW27 и стандартной методики ПЦР.

LW24- прямой праймер- VWF D1D2D'D3 клонируемый олигонуклеотид с сайтом BsiW1

GCGCCGGCCGTACGATGATTCCTGCCAGATTTGCCGGGGTG (SEQ ID NO:97)

LW27-обратный праймер-VWF D'D3 олигонуклеотид с EcoRV

CCACCGCCAGATATCGGCTCCTGGCAGGCTTCACAGGTGAG (SEQ ID NO:98)

Продукт ПЦР, полученный в результате амплификации LW22/LW23 (~3750 п.о.), клонировали в pSYN-VWF-014, расщепленном с помощью BsiW1/EcoRV, получая промежуточный конструкт pSYNVWF-015. Длину линкера между фрагментом VWF и областью Fc меняли, получая pSYN-VWF-031.

Белковая последовательность VWF-D1D2D'D3 1 (SEQ ID NO: 99).

MIPARFAGVL LALALILPGT LCAEGTRGRS STARCSLFGS DFVNTFDGSM

YSFAGYCSYL LAGGCQKRSF SIIGDFQNGK RVSLSVYLGE FFDIHLFVNG

101 TVTQGDQRVS MPYASKGLYL ETEAGYYKLS GEAYGFVARI DGSGNFQVLL

151 SDRYFNKTCG LCGNFNIFAE DDFMTQEGTL TSDPYDFANS WALSSGEQWC

201 ERASPPSSSC NISSGEMQKG LWEQCQLLKS TSVFARCHPL VDPEPFVALC

251 EKTLCECAGG LECACPALLE YARTCAQEGM VLYGWTDHSA CSPVCPAGME

301 YRQCVSPCAR TCQSLHINEM CQERCVDGCS CPEGQLLDEG LCVESTECPC

351 VHSGKRYPPG TSLSRDCNTC ICRNSQWICS NEECPGECLV TGQSHFKSFD

401 NRYFTFSGIC QYLLARDCQD HSFSIVIETV QCADDRDAVC TRSVTVRLPG

451 LHNSLVKLKH GAGVAMDGQD IQLPLLKGDL RIQHTVTASV RLSYGEDLQM

501 DWDGRGRLLV KLSPVYAGKT CGLCGNYNGN QGDDFLTPSG LAEPRVEDFG

551 NAWKLHGDCQ DLQKQHSDPC ALNPRMTRFS EEACAVLTSP TFEACHRAVS

601 PLPYLRNCRY DVCSCSDGRE CLCGALASYA AACAGRGVRV AWREPGRCEL

651 NCPKGQVYLQ CGTPCNLTCR SLSYPDEECN EACLEGCFCP PGLYMDERGD

701 CVPKAQCPCY YDGEIFQPED IFSDHHTMCY CEDGFMHCTM SGVPGSLLPD

751 AVLSSPLSHR SKRSLSCRPP MVKLVCPADN LRAEGLECTK TCQNYDLECM

801 SMGCVSGCLC PPGMVRHENR CVALERCPCF HQGKEYAPGE TVKIGCNTCV

851 CRDRKWNCTD HVCDATCSTI GMAHYLTFDG LKYLFPGECQ YVLVQDYCGS

901 NPGTFRILVG NKGCSHPSVK CKKRVTILVE GGEIELFDGE VNVKRPMKDE

951 THFEVVESGR YIILLLGKAL SVVWDRHLSI SVVLKQTYQE KVCGLCGNFD 1001 GIQNNDLTSS NLQVEEDPVD FGNSWKVSSQ CADTRKVPLD SSPATCHNNI

1051 MKQTMVDSSC RILTSDVFQD CNKLVDPEPY LDVCIYDTCS CESIGDCACF

1101 CDTIAAYAHV CAQHGKVVTW RTATLCPQSC EERNLRENGY ECEWRYNSCA

1151 PACQVTCQHP EPLACPVQCV EGCHAHCPPG KILDELLQTC VDPEDCPVCE

1201 VAGRRFASGK KVTLNPSDPE HCQICHCDVV NLTCEACQEP*

- 102 042955

Белковая последовательность VWF-DO3 2 (SEQ ID NO: 100).

SLSCRPPMVK LVCPADNLRA EGLECTKTCQ NYDLECMSMG CVSGCLCPPG

MVRHENRCVA LERCPCFHQG KEYAPGETVK IGCNTCVCRD RKWNCTDHVC

101 D АТС STIGMA HYLTFDGLKY LFPGECQYVL VQDYCGSNPG TFRILVGNKG

151 CSHPSVKCKK RVTILVEGGEIELFDGEVNV KRPMKDETHF EWESGRYII

201 LLLGKALSVV WDRHLSISVV LKQTYQEKVC GLCGNFDGIQ NNDLTS SNLQ

251 VEEDPVDFGN SWKVSSQCAD TRKVPLDSSP ATCHNNIMKQ TMVDSSCRIL

301 TSDVFQDCNK LVDPEPYLDV CIYDTCSCES IGDCACFCDT IAAYAHVCAQ

351 HGKVVTWRTA TLCPQSCEER NLRENGYECE WRYNSCAPAC QVTCQHPEPL

401 ACPVQCVEGC HAHCPPGKIL DELLQTCVDP EDCPVCEVAG RRFASGKKVT

451 LNPSDPEHCQ ICHCDVVNLT CEACQEP

Пример 2. Влияние гибридного продукта D'D3 и XTEN на увеличение периода полужизни FVIII.

Для оценки возможности увеличения периода полужизни D'D3 FVIII в гибридном белке rFVIII-XTEN димер VWF D'D3 вводили мышам FVIII-VWF DKO мышей путем гидродинамической инъекции соответствующего ДНК-конструкта VWF-025 (пример 1).

После достижения равновесной экспрессии D'D3 (на 5 день после инъекции) вводили разовую дозу 200 МЕ/кг rFVIII-XTEN посредством в/в инъекции. Образцы крови собирали до 120 ч после введения rFVIII-XTEN. Активность FVIII в плазме анализировали посредством хромогенного анализа FVIII. Уровень экспрессии D'D3 измеряли посредством твердофазного ИФА VWF, а ФК-профиль rFVIIIFc анализировали с помощью программы WinNonlin.

Результаты исследования показаны на фиг. 2, а ФК-параметр rFVIII-XTEN с/без D'D3 в кровотоке приведен в табл. 16. tl/2 rFIII-XTEN для димера D'D3 увеличивалось с 3,4 до 17,8 ч, т.е. в 5 раз. В дополнение к периоду полужизни наблюдали 5-кратное повышение MRT, 3,6-кратное повышение ПИК и 3,8кратное снижение клиренса.

Авторы изобретения наблюдали синергический эффект фрагмента D'D3 и технологии XTEN; будет выполнена оценка возможности увеличения времени полужизни ряда конструктов FVIII/VWF/XTEN у животных с гемофилией.

Таблица 16

ФК-параметр rFVIII-XTEN с/без D'D3 в кровотоке

Обработка	5-мин восстановление (%)	tl/2 (ч)	MRT (ч)	Cl (мл/ч/кг)	Vss (мл/кг)	THIKD (ч * кг* мМЕ/мл/мМЕ)
rFVIIIXTEN VWF-025	80	17,8	19,3	3,5	67,4	0,29
rFVIIIXTEN	74	3,4	3,8	13,1	63,68	0,08
Улучшение крат	1,1	5,2	5,1	3,8	0,9	3,6

Очистка белка FVIII-XTEN.

Для данного исследования АЕ288 XTEN вставляли по С-концу BDD-FVIII. Для очистки данного белка вначале использовали этап тангенциальной проточной фильтрации (TFF) для замены буфера кондиционированной среды. Затем продукты в фильтрате захватывали с помощью ионообменной хроматографии сильных анионов, а затем выполняли дальнейшую очистку с помощью аффинной хроматографии. Чистота молекул была приемлема согласно эксклюзионной ВЭЖХ и дополнительно подтверждалась с помощью вестерн-блоттинга. Удельная активность молекулы была сопоставима с активностью FVIII с удаленным В-доменом согласно измерениям с помощью анализа аЧТВ и твердофазного ИФА.

Хромогенный анализ FVIII.

Активность FVIII измеряли с помощью набора COATEST SP FVIII от DiaPharma (№ партии N089019), все этапы инкубирования проводили на нагревателе планшетов при 37°С и встряхивании.

Диапазон стандартов rFVIII составлял от 100 до 0,78 мМЕ/мл. Контрольные образцы объединенной нормальной плазмы человека и образцы плазмы (разбавленные буфером IX Coatest) добавляли в 96-луночные планшеты Immulon 2НВ в двух повторностях (25 мкл/лунку). Свежеприготовленную смесь IXa/FX/фосфолипид (50 мкл), 25 мкл 25 мМ СаС1₂ и 50 мкл субстрата FXa последовательно добавляли в каждую лунку, после добавления каждого реагента осуществляли инкубирование в течение 5 мин. После инкубирования с субстратом добавляли 25 мкл 20% уксусной кислоты для остановки цветной реакции и измеряли оптическую плотность OD₄₀5 с помощью прибора SpectraMAX plus (Molecular Devices). Данные

- 103 042955 анализировали с помощью программного обеспечения SoftMax Pro (версии 5.2). Нижний предел количественного определения (НПКО) составлял 7,8 мМЕ/мл.

Твердофазный ИФА VWF.

При твердофазном ИФА VWF в качестве иммобилизованного антитела использовали антитело козы против VWF человека (аффинно очищенное, Affinity Biologicals, GAVWF-AP) в количестве 0,5 мкг/лунку, а в качестве обнаруживающего антитела - VWF-EIA-D (Affinity Biologicals, VWF-EIA-D, разбавление 1:100). Твердофазный ИФА выполняли в соответствии со стандартной процедурой твердофазного ИФА; в качестве субстрата ПХ использовали ТМБ, в качестве блокирующего буфера и буфера для связывания буфер PBST/1,5% БСА/0,5 М NaCl. Стандартный диапазон анализа составлял от 100 до 0,78 нг, нижний предел количественного определения (НПКО) составил 7,8 нг/мл.

Пример 3. Конструирование плазмиды XTEN, содержащей конструкты FVIII/VWF.

(а) Клонирование pSYN-FVIII-161 (фиг. 3).

Плазмида FVIII-161 содержит одноцепочечный каркас Fc (scFc) с сайтами ферментативного расщепления, который подвергается процессингу во время синтеза в клетке. Конструкт содержит домен связывания FVIII из полноразмерного VWF (D'D3). Плазмиду (pSYN-FVIII-161) разработали с целью экспрессии гетеродимеров FVIII-Fc и VWF-Fc, причем домены D'D3 должны связывать FVIII и предотвращать взаимодействие FVIII с фосфолипидами и активированным белком С. Белок pSYN-FVIII-161 экспрессировался в клетке в виде единого полипептида, в котором С-конец субъединицы FVIII-Fc был связан с N-концом субъединицы VWF D'D3-Fc посредством полипептидного линкера 6х (GGGGS) (SEQ ID NO: 64). Кроме того, на 5'- и 3'-концах полипептидного линкера вставили последовательности RRRRS (SEQ ID NO: 11) и RKRRKR (SEQ ID NO: 10), соответственно, с целью внутриклеточного расщепления каждой последовательности пропротеинконвертазами после последнего Arg. Следовательно, клетки могли экспрессировать двуцепочечный гетеродимер FVIII-Fc/D'D3-Fc, в котором цепь FVIII-Fc содержала последовательность RRRRS (SEQ ID NO: 11) на С-конце, однако остальная часть последовательности линкера удалялась. Фрагмент АЕ288 XTEN, непосредственно за которым следовал полипептид IS{5X(GGGGS)}LVPRGSGG (SEQ ID NO: 122) (содержавший сайт расщепления тромбином) внедряли между доменами VWF и областью Fc для содействия отщепления фрагмента VWF от FVIII при активации гетеродимерного белка FVIII-VWF тромбином, что обеспечивало взаимодействие FVIII с другими факторами свертывания крови.

Белковая последовательность pSYN-FVIII-161 (SEQ ID NO: 101) (положения аминокислот последовательности FVIII - 1-1457; подчеркнутая область представляет собой область Fc; волнистым подчеркиванием обозначен расщепляемый линкер между первым Fc и фрагментом VWF; двойным подчеркиванием обозначен фрагмент VWF; полужирным шрифтом обозначен расщепляемый линкер между фрагментом VWF и Fc.

MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQSDL

GELPVDARFP

PRVPKSFPFN TSVVYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY

101 DTVVITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG

151 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE

201 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM

251 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH

301 RQASLEISPITFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE

351 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDVVRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT

401 WVHYIAAEEE DWD YAPLVLA PDDRS YKSQ Y LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY

451 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT

501 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR

551 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE

601 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL

651 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS

701 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL

751 SKNNAIEPRS FSQNPPVLKR HQREITRTTL QSDQEEIDYD DTISVEMKKE

801 DFDIYDEDEN QSPRSFQKKT RHYFIAAVER LWDYGMSSSP HVLRNRAQSG

851 SVPQFKKVVF QEFTDGSFTQ PLYRGELNEH LGLLGPYIRA EVEDNIMVTF

901 RNQASRPYSF YS SLISYEED QRQGAEPRKN FVKPNETKTY FWKVQHHMAP

- 104 042955

951 TKDEFDCKAW AYFSDVDLEK DVHSGLIGPL LVCHTNTLNP AHGRQ VT VQE

1001 FALFFTIFDE TKSWYFTENM ERNCRAPCNI QMEDPTFKEN YRFHAINGYI

1051 MDTLPGLVMA QDQRIRWYLL SMGSNENIHS IHFSGHVFTV RKKEEYKMAL

1101 YNLYPGVFET VEMLPSKAGIWRVECLIGEH LHAGMSTLFL VYSNKCQTPL

1151 GMASGHIRDF QITASGQYGQ WAPKLARLHY SGSINAWSTK EPFSWIKVDL

1201 LAPMIIHGIK TQGARQKFSS LYISQFIIMY SLDGKKWQTY RGNSTGTLMV

1251 FFGNVDSSGIKHNIFNPPII ARYIRLHPTH YSIRSTLRME LMGCDLNSCS

1301 MPLGMESKAI SDAQITASSY FTNMFATWSP SKARLHLQGR SNAWRPQVNN

1351 PKEWLQVDFQ KTMKVTGVTT QGVKSLLTSM YVKEFLISSS QDGHQWTLFF

1401 QNGKVKVFQG NQDSFTPVVN SLDPPLLTRY LRIHPQSWVH QIALRMEVLG

1451 CEAQDLYDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV

1501 VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW

1551 LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SRDELTKNQV

1601 SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD

1651 KSRWQQGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGKRRRRSG GGGSGGGGSG

1701 GGGSGGGGSG GGGSGGGGSR KRRKRSLSCR PPMVKLVCP A DNLRAEGLEC

1751 TKTCQNYDLE CMSMGCVSGC LCPPGMVRHE NRC VALERCP CFHQGKEYAP

1801 GETVKIGCNT CVCRDRKWNC TDHVCDATCS TIGMAHYLTF DGLKYLFPGE

1851 CQYVLVQDYC GSNPGTFRIL VGNKGCSHPS VKCKKRVTIL VEGGEIELFD

1901 GEVNVKRPMK DETHFEVVES GRYIILLLGK ALSVVWDRHL SISVVLKQTY

1951 QEKVCGLCGN FDGIQNNDLT SSNLQVEEDP VDFGNSWKVS SQCADTRKVP

2001 LDSSPATCHNNIMKQTMVDS SCRILTSDVF QDCNKLVDPE PYLDVCIYDT

2051 CSCESIGDCA AFCDTIAAYA HVCAQHGKVV TWRTATLCPQ SCEERNLREN

2101 GYEAEWRYNS CAPACQVTCQ HPEPLACPVQ CVEGCHAHCP PGKILDELLQ

2151 TCVDPEDCPV CEVAGRRFAS GKKVTLNPSD PEHCQICHCD VVNLTCEACQ

2201 EPISGTSESA TPESGPGSEP ATSGSETPGT SESATPESGP GSEPATSGSE

2251 TPGTSESATP ESGPGTSTEP SEGSAPGSPA GSPTSTEEGT SESATPESGP

2301 GSEPATSGSE TPGTSESATP ESGPGSPAGS PTSTEEGSPA GSPTSTEEGT

2351 STEPSEGSAP GTSESATPES GPGTSESATP ESGPGTSESA TPESGPGSEP

2401 ATSGSETPGS EPATSGSETP GSPAGSPTST EEGTSTEPSE GSAPGTSTEP

2451 SEGSAPGSEP ATSGSETPGT SESATPESGP GTSTEPSEGS APDSGGGGSG

2501 GGGSGGGGSG GGGSGGGGSL VPRGSGGDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF

2551 PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE

2601 EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP

2651 REPQVYTLPP SRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT

2701 TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL

2751 SPGK (b) Клонирование pSYN-FVIII-168, 175, 172 и 174 (фиг. 4A-4D).

pSYN-FVIII-168, 172, 174 и 175 происходят от pSYN-FVIII-161. В pSYN-FVIII-161 внедряли мутации R1645A/R1648A с целью получения pSYN-FVIII-168, который продуцировал изоформу SC-FVIII, а для дополнительного увеличения периода полужизни к С-концу FVIII-HC непосредственно присоединили АЕ288 XTEN. Для конструирования pSYN-FVIII-175 из pSYN-FVIII-168 удалили последовательность кодонов DD3 с целью оценки влияния Fc и технологии XTEN на увеличение периода полужизни FVIII.

Для конструирования pSYN-FVIII-172 к С-концу FVIII-HC непосредственно присоединили АЕ288 XTEN с целью дополнительного увеличения периода полужизни, а для получения pSYN-FVIII-174 из pSYN-FVIII-172 удалили последовательность кодонов D'D3 с целью оценки влияния Fc и технологии XTEN на увеличение периода полужизни FVIII.

(с) Клонирование pSYN-FVIII-170 (фиг. 4Е).

pSYN-FVIII-170 сконструировали для оценки влияния XTEN и фрагмента D'D3 на увеличение периода полужизни FVIII. Последовательность кодонов фрагмента VWF-D1D2D'D3 и BDD-FVIII внедрили по 5'- и 3'-концу экспрессирующей кассеты, последовательность кодонов АЕ288 XTEN с последующим

- 105 042955

35-аминокислотным тромбин-расщепляемым линкером использовали для соединения молекул VWF и

FVIII. После внутриклеточного процессинга секретируемые белки содержали полипептид, содержавший фрагмент D'D3 зрелой молекулы VWF, связанный с N-концом зрелого BDD-FVIII посредством АЕ288

XTEN/35-аминокислотного тромбин-расщепляемого линкера.

Белковая последовательность pSYN-FVIII-170 (SEQ ID NO: 102).

SLSCRPPMVK LVCPADNLRA EGLECTKTCQ NYDLECMSMG CVSGCLCPPG

MVRHENRCVA LERCPCFHQG KEYAPGETVK IGCNTCVCRD RKWNCTDHVC

101 D АТС STIGMA HYLTFDGLKY LFPGECQYVL VQDYCGSNPG TFRILVGNKG

151 CSHPSVKCKK RVTILVEGGE IELFDGEVNV KRPMKDETHF EVVESGRYII

201 LLLGKALSVV WDRHLSISVV LKQTYQEKVC GLCGNFDGIQ NNDLTSSNLQ

251 VEEDPVDFGN SWKVSSQCAD TRKVPLDSSP ATCHNNIMKQ TMVDSSCRIL

301 TSDVFQDCNK LVDPEPYLDV CIYDTCSCES IGDCAAFCDT IAAYAHVCAQ

351 HGKVVTWRTA TLCPQSCEER NLRENGYEAE WRYNSCAPAC QVTCQHPEPL

401 ACPVQCVEGC HAHCPPGKIL DELLQTCVDP EDCPVCEVAG RRFASGKKVT

451 LNPSDPEHCQ ICHCDVVNLT CEACQEPISG TSESATPESG PGSEPATSGS

501 ETPGTSESAT PESGPGSEPA TSGSETPGTS ESATPESGPG TSTEPSEGSA

551 PGSPAGSPTS TEEGTSESAT PESGPGSEPA TSGSETPGTS ESATPESGPG

601 SPAGSPTSTE EGSPAGSPTS TEEGTSTEPS EGSAPGTSES ATPESGPGTS

651 ESATPESGPG TSESATPESG PGSEPATSGS ETPGSEPATS GSETPGSPAG

701 SPTSTEEGTS TEPSEGSAPG TSTEPSEGSA PGSEPATSGS ETPGTSESAT

751 PESGPGTSTE PSEGSAPDSG GGGSGGGGSG GGGSGGGGSG GGGSLVPRGS

801 GGASATRRYY LGAVELSWDY MQSDLGELPV DARFPPRVPK SFPFNTSVVY

851 KKTLFVEFTD HLFNIAKPRP PWMGLLGPTI QAEVYDTVVI TLKNMASHPV

901 SLHAVGVSYW KASEGAEYDD QTSQREKEDD KVFPGGSHTY VWQVLKENGP

951 MASDPLCLTY SYLSHVDLVK DLNSGLIGAL LVCREGSLAK EKTQTLHKFI

1001 LLFAVFDEGK SWHSETKNSL MQDRDAASAR AWPKMHTVNG YVNRSLPGLI

1051 GCHRKSVYWH VIGMGTTPEV HSIFLEGHTF LVRNHRQASL EISPITFLTA

1101 QTLLMDLGQF LLFCHISSHQ HDGMEAYVKV DSCPEEPQLR MKNNEEAEDY

1151 DDDLTDSEMD VVRFDDDNSP SFIQIRSVAK KHPKTWVHYI AAEEEDWDYA

1201 PLVLAPDDRS YKSQYLNNGP QRIGRKYKKV RFMAYTDETF KTREAIQHES

1251 GILGPLLYGE VGDTLLIIFK NQASRPYNIY PHGITDVRPL YSRRLPKGVK

1301 HLKDFPILPG EIFKYKWTVT VEDGPTKSDP RCLTRYYSSF VNMERDLASG

1351 LIGPLLICYK ESVDQRGNQIMSDKRNVILF SVFDENRSWY LTENIQRFLP

1401 NPAGVQLEDP EFQASNIMHS INGYVFDSLQ LSVCLHEVAY WYILSIGAQT

1451 DFLSVFFSGY TFKHKMVYED TLTLFPFSGE TVFMSMENPG LWILGCHNSD

1501 FRNRGMTALL KVSSCDKNTG DYYEDSYEDI SAYLLSKNNA IEPRSFSQNP

1551 PVLKRHQREI TRTTLQSDQE EIDYDDTISV EMKKEDFDIY DEDENQSPRS

1601 FQKKTRHYFI AAVERLWDYG MSSSPHVLRN RAQSGSVPQF KKVVFQEFTD

1651 GSFTQPLYRG ELNEHLGLLG PYIRAEVEDN IMVTFRNQAS RPYSFYSSLI

1701 SYEEDQRQGA EPRKNFVKPN ETKTYFWKVQ HHMAPTKDEF DCKAWAYFSD

1751 VDLEKDVHSG LIGPLLVCHT NTLNPAHGRQ VTVQEFALFF TIFDETKSWY

1801 FTENMERNCR APCNIQMEDP TFKENYRFHAINGYIMDTLP GLVMAQDQRI

1851 RWYLLSMGSN ENIHSIHFSG HVFTVRKKEE YKMALYNLYP GVFETVEMLP

1901 SKAGIWRVEC LIGEHLHAGM STLFLVYSNK CQTPLGMASG HIRDFQITAS

- 106 042955

1951 GQYGQWAPKL ARLHYSGSIN AWSTKEPFSW IKVDLLAPMIIHGIKTQGAR

2001 QKFSSLYISQ FIIMYSLDGK KWQTYRGNST GTLMVFFGNV DSSGIKHNIF

2051 NPPIIARYIR LHPTHYSIRS TLRMELMGCD LNSCSMPLGM ESKAISDAQI

2101 TASSYFTNMF ATWSPSKARL HLQGRSNAWR PQVNNPKEWL QVDFQKTMKV

2151 TGVTTQGVKS LLTSMYVKEF LISSSQDGHQ WTLFFQNGKV KVFQGNQDSF

2201 TPVVNSLDPP LLTRYLRIHP QSWVHQIALR MEVLGCEAQD LY

Пример 4. Гидродинамическая инъекция XTEN-содержащих конструктов FVIIIF/VWF мышам с недостаточностью FVIII и VWF.

XTEN-содержащие ДНК-конструкты на фиг. 3 и 4 содержат 2-3 элемента, обеспечивающих увеличение периода полужизни, объединенных друг с другом. Для оценки возможности увеличения периода полужизни FVIII селективную группу ДНК-конструктов, изображенных на фиг. 3 и 4, ввели мышам с двойным нокаутом (DKO) FVIII/VWF путем гидродинамической инъекции (HDI) в дозе 100 мкг/мышь. Затем через 24 ч после HDI собрали образцы крови путем ретроорбитального пробоотбора крови. Активность FVIII в плазме после HDI анализировали посредством хромогенного анализа FVIII; результаты приведены в табл. 17 и на фиг. 5. По сравнению с BDD-FVIII дикого типа, все XTEN-содержащие ДНКконструкты позволяли получить значительно повышенную активность FVIII в плазме через 24 ч после HDI, что указывало на значительно более продолжительный период полужизни молекул соответствующего циркулирующего белка по сравнению с BDD-FVIII. Затем оценивали применение комбинации указанных элементов, увеличивающих период полужизни, у животных с гемофилией.

Таблица 17

Активность FVIII в плазме через 24 ч после HDI у мышей FVIII/VWF DKO

ДНК- конструкт	BDD- FVIII	FVIII-161	FVIII-168	FVIII-172	BDD- FVIII	FVIII-170
Доза ДНК (мкг/мышь)	100	100	100	100	50	50
Активность FVIII (мЕ/мл)	219 ±72	2446 ± 1012	2209 ± 609	1671 ±223	197 ±21	399 ±30

Гидродинамическая инъекция.

Гидродинамическая инъекция является эффективным и безопасным способом доставки невирусных генов в печень мелких животных, например, мышей и крыс. Первоначально ее описали как быструю инъекцию раствора депротеинизированной плазмидной ДНК/NaCl, не содержащего эндотоксинов, в объеме одной десятой от массы тела животного в течение приблизительно 5-7 с. Депротеинизированная плазмидная ДНК содержала исследуемый ген, а печень составляет одну десятую от массы тела животного. Белок-мишень продуцировался в печени из введенной ДНК и мог обнаруживаться в течение 24 ч после инъекции. Для исследования терапевтических свойств экспрессированного белка собирали образцы плазмы.

При всех гидродинамических инъекциях, выполненных в рамках настоящего исследования, вводили 2 мл плазмидной ДНК в стерильном 0,9% физиологическом растворе путем внутривенной инъекции в хвостовую вену мышей массой 20-35 г в течение приблизительно 4-7 с. Мышей подвергали тщательному мониторингу в течение первых нескольких часов до возобновления нормальной деятельности. После ретроорбитального отбора образцов крови получали образцы плазмы и хранили их при температуре 80°С для дальнейшего анализа.

Пример 5. Конструирование плазмид для систем совместной трансфекции гетеродимера FVIIIFcVWF, содержавшего вставки XTEN (фиг. 6).

Для увеличения выхода продукции белка создали две системы совместной трансфекции, содержавшие три ДНК-конструкта. Первый ДНК-конструкт кодировал гибридный белок FVIII-Fc, в котором фрагмент АЕ288 XTEN был непосредственно присоединен к С-концу тяжелой цепи FVIII, а за ним следовал фрагмент легкой цепи FVIII дикого типа (pSYN-FVIII-173, фиг. 6В) или фрагмент легкой цепи FVIII с мутациями R1645A/R1648A(pSYN-FVIII-169, фиг. 6А), а легкая цепь FVIII была непосредственно присоединена к одиночному Fc-фрагменту. Второй ДНК-конструкт представлял собой pSYN-VWF-031, который кодировал гибридный белок D'D3-Fc (пример 1). Клетки HEK293F трансфицировали двумя плазмидами вместе с третьей плазмидой (РС5) в соотношении 80:15:5. Синтезированные белки секретировались в виде гетеродимера FVIII (XTEN) Fc/D'D3Fc и димера D'D3Fc; гетеродимер FVIII (XTEN) Fc/D'D3Fc отделяли от димера D'D3Fc путем очистки белка.

- 107 042955

Зрелая белковая последовательность pSYN-FVIII-169 (SEQ ID NO: 103).

ATRRYYLGAV ELSWDYMQSD LGELPVDARF PPRVPKSFPF NTSVVYKKTL

FVEFTDHLFN IAKPRPPWMG LLGPTIQAEV YDTVVITLKN MASHPVSLHA

101 VGVSYWKASE GAEYDDQTSQ REKEDDKVFP GGSHTYVWQV LKENGPMASD 151 PLCLTYSYLS HVDLVKDLNS GLIGALLVCR EGSLAKEKTQ TLHKFILLFA

201 VFDEGKSWHS ETKNSLMQDR DAASARAWPK MHTVNGYVNR SLPGLIGCHR 251 KSVYWHVIGM GTTPEVHSIF LEGHTFLVRN HRQASLEISP ITFLTAQTLL

301 MDLGQFLLFC HISSHQHDGM EAYVKVDSCP EEPQLRMKNN EEAEDYDDDL 351 TDSEMDVVRF DDDNSPSFIQ IRSVAI<I<HPI< TWVHYIAAEE EDWDYAPLVL 401 APDDRSYKSQ YLNNGPQRIG RI<YI<I<VRFMA YTDETFKTRE AIQHESGILG 451 PLLYGEVGDT LLIIFKNQAS RPYNIYPHGI TDVRPLYSRR LPKGVKHLKD 501 FPILPGEIFK YKWTVTVEDG PTKSDPRCLT RYYSSFVNME RDLASGLIGP

551 LLICYKESVD QRGNQIMSDK RNVILFSVFD ENRSWYLTEN IQRFLPNPAG 601 VQLEDPEFQA SNIMHSINGY VFDSLQLSVC LHEVAYWYIL SIGAQTDFLS 651 VFFSGYTFKH KMVYEDTLTL FPFSGETVFM SMENPGLWIL GCHNSDFRNR

701 GMTALLKVSS CDKNTGDYYE DSYEDISAYL LSKNNAIEPR SFSQNGAPGT

751 SESATPESGP GSEPATSGSE TPGTSESATP ESGPGSEPAT SGSETPGTSE 801 SATPESGPGT STEPSEGSAP GSPAGSPTST EEGTSESATP ESGPGSEPAT

851 SGSETPGTSE SATPESGPGS PAGSPTSTEE GSPAGSPTST EEGTSTEPSE

901 GSAPGTSESA TPESGPGTSE SATPESGPGT SESATPESGP GSEPATSGSE

951 TPGSEPATSG SETPGSPAGS PTSTEEGTST EPSEGSAPGT STEPSEGSAP

1001 GSEPATSGSE TPGTSESATP ESGPGTSTEP SEGSAPASSP PVLKRHQAEI

1051 TRTTLQSDQE EIDYDDTISV EMKKEDFDIY DEDENQSPRS FQKKTRHYFI

1101 AAVERLWDYG MSSSPHVLRN RAQSGSVPQF KKVVFQEFTD GSFTQPLYRG 1151 ELNEHLGLLG PYIRAEVEDN IMVTFRNQAS RPYSFYSSLI SYEEDQRQGA

1201 EPRKNFVKPN ETKTYFWKVQ HHMAPTKDEF DCKAWAYFSD VDLEKDVHSG 1251 LIGPLLVCHT NTLNPAHGRQ VTVQEFALFF TIFDETKSWY FTENMERNCR 1301 APCNIQMEDP TFKENYRFHA INGYIMDTLP GLVMAQDQRIRWYLLSMGSN 1351 ENIHSIHFSG HVFTVRKKEE YKMALYNLYP GVFETVEMLP SKAGIWRVEC 1401 LIGEHLHAGM STLFLVYSNK CQTPLGMASG HIRDFQITAS GQYGQWAPKL 1451 ARLHYSGSIN AWSTKEPFSW IKVDLLAPMIIHGIKTQGAR QKFSSLYISQ

1501 FIIMYSLDGK KWQTYRGNST GTLMVFFGNV DSSGIKHNIF NPPIIARYIR 1551 LHPTHYSIRS TLRMELMGCD LNSCSMPLGM ESKAISDAQI TASSYFTNMF

1601 ATWSPSKARL HLQGRSNAWR PQVNNPKEWL QVDFQKTMKV TGVTTQGVKS 1651 LLTSMYVKEF LISSSQDGHQ WTLFFQNGKV KVFQGNQDSF TPVVNSLDPP 1701 LLTRYLRIHP QSWVHQIALR MEVLGCEAQD LYDKTHTCPP CPAPELLGGP 1751 SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK 1801 TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK 1851 AKGQPREPQV YTLPPSRDEL TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE 1901 NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ 1951 KSLSLSPGK

- 108 042955

Зрелая белковая последовательность pSYN-FVIII-173 (SEQ ID NO: 104).

ATRRYYLGAV ELSWDYMQSD LGELPVDARF PPRVPKSFPF NTSVVYKKTL

FVEFTDHLFN IAKPRPPWMG LLGPTIQAEV YDTVVITLKN MASHPVSLHA

101 VGVSYWKASE GAEYDDQTSQ REKEDDKVFP GGSHTYVWQV LKENGPMASD

151 PLCLTYSYLS HVDLVKDLNS GLIGALLVCR EGSLAKEKTQ TLHKFILLFA

201 VFDEGKSWHS ETKNSLMQDR DAASARAWPK MHTVNGYVNR SLPGLIGCHR

251 KSVYWHVIGM GTTPEVHSIF LEGHTFLVRN HRQASLEISP ITFLTAQTLL

301 MDLGQFLLFC HISSHQHDGM EAYVKVDSCP EEPQLRMKNN EEAEDYDDDL

351 TDSEMDVVRF DDDNSPSFIQ IRSVAI<I<HPI< TWVHYIAAEE EDWDYAPLVL

401 APDDRSYKSQ YLNNGPQRIG RKYKKVRFMA YTDETFKTRE AIQHESGILG

451 PLLYGEVGDT LLIIFKNQAS RPYNIYPHGI TDVRPLYSRR LPKGVKHLKD

501 FPILPGEIFK YKWTVTVEDG PTKSDPRCLT RYYSSFVNME RDLASGLIGP

551 LLICYKESVD QRGNQIMSDK RNVILFSVFD ENRSWYLTEN IQRFLPNPAG

601 VQLEDPEFQA SNIMHSINGY VFDSLQLSVC LHEVAYWYIL SIGAQTDFLS

651 VFFSGYTFKH KMVYEDTLTL FPFSGETVFM SMENPGLWIL GCHNSDFRNR

701 GMTALLKVSS CDKNTGDYYE DSYEDISAYL LSKNNAIEPR SFSQNGAPGT

751 SESATPESGP GSEPATSGSE TPGTSESATP ESGPGSEPAT SGSETPGTSE

801 SATPESGPGT STEPSEGSAP GSPAGSPTST EEGTSESATP ESGPGSEPAT

851 SGSETPGTSE SATPESGPGS PAGSPTSTEE GSPAGSPTST EEGTSTEPSE

901 GSAPGTSESA TPESGPGTSE SATPESGPGT SESATPESGP GSEPATSGSE

951 TPGSEPATSG SETPGSPAGS PTSTEEGTST EPSEGSAPGT STEPSEGSAP

1001 GSEPATSGSE TPGTSESATP ESGPGTSTEP SEGSAPASSP PVLKRHQREI

1051 TRTTLQSDQE EIDYDDTISV EMKKEDFDIY DEDENQSPRS FQKKTRHYFI

1101 AAVERLWDYG MSSSPHVLRN RAQSGSVPQF KKVVFQEFTD GSFTQPLYRG

1151 ELNEHLGLLG PYIRAEVEDN IMVTFRNQAS RPYSFYSSLI SYEEDQRQGA

1201 EPRKNFVKPN ETKTYFWKVQ HHMAPTKDEF DCKAWAYFSD VDLEKDVHSG

1251 LIGPLLVCHT NTLNPAHGRQ VTVQEFALFF TIFDETKSWY FTENMERNCR

1301 APCNIQMEDP TFKENYRFHA INGYIMDTLP GLVMAQDQRIRWYLLSMGSN

1351 ENIHSIHFSG HVFTVRKKEE YKMALYNLYP GVFETVEMLP SKAGIWRVEC

1401 LIGEHLHAGM STLFLVYSNK CQTPLGMASG HIRDFQITAS GQYGQWAPKL

1451 ARLHYSGSIN AWSTKEPFSW IKVDLLAPMIIHGIKTQGAR QKFSSLYISQ

1501 FIIMYSLDGK KWQTYRGNST GTLMVFFGNV DSSGIKHNIF NPPIIARYIR

1551 LHPTHYSIRS TLRMELMGCD LNSCSMPLGM ESKAISDAQI TASSYFTNMF

1601 ATWSPSKARL HLQGRSNAWR PQVNNPKEWL QVDFQKTMKV TGVTTQGVKS

1651 LLTSMYVKEF LISSSQDGHQ WTLFFQNGKV KVFQGNQDSF TPVVNSLDPP

1701 LLTRYLRIHP QSWVHQIALR MEVLGCEAQD LYDKTHTCPP CPAPELLGGP

1751 SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK

1801 TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK

1851 AKGQPREPQV YTLPPSRDEL TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE

1901 NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ

1951 KSLSLSPGK

Пример 6. Очистка белка FVIH-169/VWF-031 и FVIH-173/VWF-031.

Для замены буфера осветленной кондиционированной среды использовали этап тангенциальной проточной фильтрации (TFF). Затем гетеродимер FVIII-169/VWF-031 или FVIII-173/VWF-031 очищали с использованием двухступенчатого хроматографического процесса. Использовали анионообменную смолу для слабых анионов, а затем аффинную хроматографию. Конечный очищенный продукт обладал приемлемой чистотой согласно эксклюзионной ВЭЖХ. Удельная активность была совместима с активностью FVIII с удаленным В-доменом согласно измерению с помощью хромогенного анализа FVIII и концентрации А280. Чистоту и присутствие каждого фрагмента указанной молекулы подтверждали с помо- 109 042955 щью электрофореза в ДСН-ПААГ и вестерн-блоттинга.

Пример 7. Оценка способности FVIII- 169/VWF-031 к связыванию VWF с помощью Octet-анализа.

Способность FVIII-169/VWF-031 к связыванию VWF получали с помощью измерений на основе интерферометрии в биологическом слое (BLI) (Octet-анализа) при 25°С с использованием прибора ForteBio Octet 384 и трис-буфера для связывания (50 мМ трис, pH 7,2, 150 мМ NaCl, 5 мМ CaCl₂). Octet-анализ для определения связывания FVIII был основан на гидрофобной иммобилизации фактора фон Виллебранда человека (Haematologic Technologies, № по каталогу HCVWF-0191) на биосенсоре APS с последующим связыванием 1,0% бычьего сывороточного альбумина (Jackson ImmunoResearch, № по каталогу 001-000-161). Вкратце, hvWF (20 мкг/мл) разбавляли трис-буфером и наносили на биосенсор APS в течение 600 с, получая на поверхности реакционных датчиков слой связавшихся молекул толщиной приблизительно 3,0-3,5 нм. На контрольные датчики APS наносили 1,0% БСА в отсутствие hvWF для вычитания сигнала сравнения. После загрузки все датчики инкубировали в трис-буфере в течение 300 с для определения нового исходного уровня. Затем датчики биосенсора инкубировали в растворах FVIII-XTEN 169 или лекарственного вещества FVIIIFc (0, 0,6, 2, 6, 20, 60, 200, 600 МЕ/мл) в течение 5 мин при комнатной температуре с последующим этапом диссоциации в течение 5 мин. С использованием программного обеспечения для анализа данных Octet находили ответ на связывание (нм) из вычтенных данных (реакционный датчик минус датчик сравнения). Для FVIII-169/VWF-031 обнаружено отсутствие связывания с иммобилизованным VWF (фиг. 7), что указывает на полное экранирование FVIII от полноразмерной молекулы VWF фрагментом D'D3.

Пример 8. ФК FVIII-169/VWF-031 у мышей HemA и мышей FVIII/VWF DKO.

ФК-профиль FVIII-169/VWF-031 проверяли на мышах HemA и мышах FVIII/VWF DKO для оценки способности фрагмента D'D3 экранировать молекулу FVIII от эндогенного VWF. Мышей HemA или мышей FVIII/VWF DKO обрабатывали путем внутривенного введения FVIII-169/VWF-031 в разовой дозе 200 МЕ/кг; затем выполняли отбор образцов плазмы через 5 мин, 8, 24, 48 и 72 ч после введения. Активность FVIII в образцах плазмы проверяли с помощью хромогенного анализа FVIII; период полужизни FVIII-169/VWF-031 рассчитывали с помощью программы WinNonlin. Для FVIII-169/VWF-031 с помощью интерферометрии в биологическом слое было продемонстрировано полное ингибирование связывания конструкта с иммобилизованным VWF (фиг. 7). Это означает, что фрагмент D'D3 в составе молекулы успешно блокировал связывание FVIII с нативной молекулой VWF; поэтому в двух различных линиях мышей прогнозировали аналогичный период полужизни FVIII-169/VWF-031. На фиг. 8А и в табл. 18 показано, что, как и ожидалось, FVIII-169/VWF-031 обладал аналогичными ФК-профилями у мышей HemA и мышей FVIII/VWF DKO, что подтвердило независимость периода полужизни гетеродимера FVIIIFc/VWF от периода полужизни эндогенного VWF. Отделение периода полужизни гетеродимера FVIIIFc/VWF от периода полужизни эндогенного VWF устранило верхний предел увеличения периода полужизни FVIII и открыло возможность дальнейшего увеличения периода полужизни FVIII более чем в 2 раза по сравнению с верхним пределом, обусловленным эндогенным VWF.

Таблица 18

ФК FVIII-169/VWF-031 у мышей HemA и мышей FVIII/VWF DKO

Линия мыши. Восстановление.

Линия мышей	Выход (%)	ϊΐ.'ΐ (Ό	MRT ω	Cl (млчкг)	Vss (мл;кг)	ППК (ч*кг“мМЕ нл/мМЕ)
DKO	69	17,94	20,1	4.06	81,69	0,2461
HemA	83	16,65	18,44	3,57	85,72	0,28

Защитную способность вставки XTEN и фрагмента D'D3 по отношению к FVIII оценивали путем сравнения периодов полужизни FVIII-169/VWF-031 с FVIII-169/Fc и FVIIIFc у мышей FVIII/VWF DKO. После разового в/в введения выполняли отбор образцов крови через 5 мин, 8, 24, 48 и 72 ч для FVIII-169/VWF-031, через 5 мин, 8, 24, 32, 48 ч для FVIII-169/Fc и через 5 мин, 1, 2, 4, 6 и 8 ч для FVIIIFc. Активность FVIII в образцах плазмы проверяли с помощью хромогенного анализа FVIII; период полужизни FVIII-155/VWF-031 рассчитывали с помощью программы WinNonlin.

Сводка по результатам исследования представлена на фиг. 8В ив табл. 19; rFVIIIFc обладал 1,6-часовым периодом полужизни у мышей DKO из-за потери защиты от VWF. При внедрении вставки XTEN в молекулу FVIIIFc полученная молекула FVIII-169/Fc обладала 7-часовым периодом полужизни, т.е. вставка XTEN увеличивала период полужизни в 4 раза. Наконец, при внедрении в молекулу фрагмента D'D3 с образованием FVIII-169/VWF-031, наблюдали 17-часовой период полужизни, т.е. фрагмент D'D3 обеспечивал его дополнительное увеличение еще в 2,5 раза. Кроме улучшения периода полужизни, наблюдали улучшение среднего времени пребывания (MRT), клиренса (С1) и ППК, как показано в табл. 19.

- 110 042955

Для FVIII-169/VWF-031 у мышей НешА и мышей FVIII/VWF DKO достигалось tl/2, равное 17-18 ч, что представляет собой верхний предел tl/2, обусловленный клиренсом VWF. В данную молекулу можно внедрить дополнительные элементы, обеспечивающие увеличение tl/2, например вторую вставку XTEN в пределах FVIII. Синергический эффект фрагмента D'D3 и вставок XTEN предоставляет возможность полной защиты FVIII от факторов его клиренса; варианты FVIIIFc/XTEN/VWF могут достичь окончательного прорыва 2-кратного предела увеличения tl/2 FVIII.

Таблица 19

ФК FVIII- 169/VWF-031 у мышей FVIII/VWF DKO

Линия мыши	Обработк а	Восстан овление (%)	tl/2 (ч)	MRT (ч)	Cl (мл/ч/кг)	Vss (мл/кг)	AUC/D (ч*кг* мЕД /мл/ мЕД)
FVIII/VW FDKO	rFVIIIFc	35	1,6	2,1	57,7	120,2	0,0173
rFVIII169/ Fc	77	7,0	6,2	6,4	39,2	0,1573
rFVIII- 169/ VWF-031	69	17,9	20,1	4,1	81,7	0,2461

Пример 9. ФК концентрата клеточной среды вариантов FVIII-ΧΤΕΝ у мышей FVIII/VWF DKO, экспрессирующих D'D3.

Способность фрагмента D'D3 увеличивать tl/2 FVII-XTEN оценивали в модели мыши FVIII/VWF DKO, экспрессирующей D'D3 (описанной в примере 2). В данном исследовании вместо использования VWF-025 для внедрения димера D'D3 в кровоток использовали конструкт VWF-029 для внедрения мономера D'D3 в кровоток. Для получения вариантов белка FVIII-ΧΤΕΝ подготовили ограниченный объем (50-100 мл) культуральной среды для временной трансфекции, в день 4 после трансфекции культуру клеток собирали и концентрировали до диапазона активности FVIII 10-20 МЕ/мл, подходящего для исследования ФК. Концентрированную клеточную среду затем использовали для стандартного исследования ФК у мышей FVIII/VWF DKO с D'D3 или без него в кровотоке.

В общей сложности в системе протестировали 6 вариантов FVIII-ΧΤΕΝ, содержавших 1-3 вставки XTEN; сводка по их tl/2 приведена в табл. 20, данные типичных вариантов нанесены на график на фиг. 9А.

Для всех вариантов FVIII-ΧΤΕΝ, переносящих фрагмент D'D3 в кровоток, наблюдали увеличенный период полужизни (табл. 20), что продемонстрировало защиту FVIII-ΧΤΕΝ от факторов его клиренса со стороны D'D3. Кроме того, по сравнению с 14-часовым временем полужизни у мышей НешА, LSD0055.021 обладал 20,4-часовым tl/2 у мышей с DKO, экспрессирующих D'D3 (фиг. 9В, табл. 20), что указывает на окончательный прорыв 2-кратного предела увеличения периода полужизни для молекул FVIII. За счет дальнейшей модификации молекулы FVIII(XTEN)/VWF потенциально возможно достичь еще более продолжительного tl/2 FVIII и обеспечить пациентов с НетА белком FVIII, который требует приема раз в неделю или реже.

Таблица 20 tl/2 FVIII-ΧΤΕΝ у мышей FVIII/VWF DKO, экспрессирующих D'D3

FVIII-XTEN ID	Количество вставок XTEN	Сайты инсерции	Размер XTEN	tl/2 (ч) Мыши DKO	tl/2 (ч) Мыши pLTVE-D'D3/ DKO	tl/2 (ч) Мыши НешА
pSD-0013	1	ст	144	3,3	7,9
ESD0003.009	2	в*/ст	144/288	9,7	16,4
ESD0038.015	2	1656/26	144/144	7,8	17,2
LSD0049.002	3	18/BVCT	144/144/288	12,6	17,5
LSD0051.002	3	403/BVCT	144/144/288	11,1	19,9
LSD0055.021	3	1900/BVCT	144/144/288	16	20,4	14

* В указывает, что последовательность XTEN (например, 144) вставлена непосредственно после аминокислотного остатка 745, соответствующего последовательности зрелого FVIII.

Пример 10. Стабильность VWF- и XTEN-содержащих вариантов FVIII в плазме при двойном нокауте (DKO) FVIII/VWF.

Стабильность вариантов белка rFVIIIFc в плазме тестировали в плазме мыши с двойным нокаутом (DKO) FVIII/VWF. Для анализа стабильности клетки НЕК293 совместно трансфицировали плазмидами, управляющими экспрессией rFVIIIFc или FVIII-169 (rFVIIIFc с 288 АЕ XTEN, вставленным на стыке В-домена) и плазмидами, управляющими экспрессией IgG-Fc или VWF-031 (области D'D3 VWF, присоединенной к IgG-Fc). На четвертый день после трансфекции собирали культуральную среду и концентри- 111 042955 ровали ее до 30 МЕ/мл согласно хромогенной активности FVIII. Затем концентрированную культуральную среду добавляли в плазму мыши DKO, получая активность FVIII 5 МЕ/мл, и инкубировали при 37°С. В разные моменты времени выполняли отбор аликвот для измерения активности путем хромогенного анализа. Активность в каждый момент времени измеряли в двух повторностях, и среднюю активность наносили на график зависимости от времени. Активность FVIIIFc - двуцепочечной (дц) молекулы FVIII, в которой тяжелые и легкие цепи удерживаются вместе за счет нековалентных взаимодействий, снижалась в плазме мыши DKO со временем (фиг. 10). Активность FVIII-169:Fc, содержащего вставку 288 АЕ XTEN на стыке В-домена, убывала медленнее по сравнению с rFVIIIFc, что указывает на улучшенную стабильность за счет вставки XTEN. Учитывая, что предлагалось использовать VWF для повышения стабильности FVIII in vivo, авторы изобретения выполнили оценку стабильности FVIII-169:VWF-031 в плазме. Эта гетеродимерная молекула, содержащая элемент FVIII и элемент VWF D'D3, объединенные в соответствующие гемидомены Fc, демонстрировала стабильность в плазме, повышенную по сравнению с FVIII-169:Fc, что указывало на синергическое действие домена VWF D'D3 и XTEN на стабильность rFVIIIFc в плазме.

Пример 11. Влияние гибрида Fc, вставки XTEN и фрагмента D'D3 VWF на период полужизни FVIII.

Для оценки влияния гибрида Fc, вставки XTEN и фрагмента D'D3 VWF на период полужизни FVIII оценивали фармакокинетические свойства рекомбинантного FVIII с удаленным В-доменом (rBDD-FVIII), rFVIIIFc, FVIII-169:Fc и FVIII-169: VWF-031 у мышей с двойным нокаутом (DKO) FVIII/VWF.

Мышей DKO обрабатывали путем разового внутривенного введения белков FVIII в дозе 200 МЕ/кг; в заданные моменты времени выполняли отбор образцов плазмы, как указано на фиг. 11. Активность FVIII в образцах плазмы анализировали с помощью хромогенного анализа FVIII; период полужизни рассчитывали с помощью программы WinNonlin-Phoenix. Фармакокинетические параметры протестированных молекул перечислены в табл. 21. Графики регрессии активности FVIII в плазме от времени для каждого варианта FVIII приведены на фиг. 11.

У мышей DKO немодифицированный BDD-FVIII обладал периодом полужизни, равным 0,23 ч; гибридный белок FVIIIFc обладал увеличенным периодом полужизни, равным 1,66 ч, из-за кругооборота белка FVIIIFc за счет взаимодействия Fc:FcRn. При внедрении 288 остатков полипептида AEXTEN в область В-домена FVIII в молекуле FVIIIFc период полужизни полученного белка FVIII169/Fc у мышей DKO увеличился до 7,41 ч. Наконец, при добавлении домена D'D3 VWF период полужизни гетеродимера FVIII169/VWF031 у мышей DKO достиг 17,9 ч (фиг. 11, табл. 21). Кроме периода полужизни, все другие ФК-параметры также пропорционально улучшались с добавлением каждого элемента (табл. 21). FVIII может допускать встраивание нескольких элементов, увеличивающих период полужизни, и это синергическое действие трех элементов на увеличение периода полужизни FVIII обеспечило дальнейшее улучшение периода полужизни гетеродимеров FVIII-XTEN VWF.

Таблица 21

ФК-параметры вариантов FVIII

FVUI	И^оформд Fvm	Вставки ΧΊΈΝ	Т иг 00	MRT (ч)	С1 (мл/ч/кг)	Vss (мл/кг)	ГПЖЕ> кг*ч/мл
Сайт	Длина ΧΊΈΝ
BDD-FVIH	дц			0,23	0,24	407,72	97,42	0,0025
FVIIIFc	дц			1,66	2,06	62,66	128,82	0,0161
FVIII 169/Гс	оц	В*	АЕ288	7,41	6,67	6,24	41,61	0,1603
FV1U169/VWF0 31	оц	в*	АЕ288	17,94	20,1	4,06	81,69	0,2463

* В указывает, что последовательность XTEN (например, 144) вставлена непосредственно после аминокислотного остатка 745, соответствующего последовательности зрелого FVIII.

Пример 12. Фармакокинетические свойства различных гетеродимеров FVIII-XTENVWF.

Для оценки совокупного действия фрагмента VWF-D'D3 и вставок XTEN на период полужизни FVIII протестировали фармакокинетические свойства гетеродимеров FVIII-XTEN-Fc:VWF-Fc на мышах HemA и сравнили их со свойствами одноцепочечной изоформы BDD-FVIII (scBDD-FVIII) и FVIII-169:VWF-031 (пример 10). Получили семь новых конструктов FVIII-XTEN-Fc (белковые последовательности приведены в табл. 24). Схемы этих конструктов приведены на фиг. 14А-14Н. FVIII-195 и FVIII-199 соответственно являются двуцепочечной и одноцепочечной изоформами FVIII, и каждая из них содержит две вставки XTEN в положениях 1900 и 1656. FVIII-196 и FVIII-201 соответственно являются двуцепочечной и одноцепочечной изоформами FVIII, и каждая из них содержит три вставки XTEN в положениях 26, 1656 и 1900. FVIII-203, -204 и -205 являются одноцепочечными молекулами FVIIIFc с двумя вставками XTEN на стыке В-домена и в положениях 1900, 403 или 18 соответственно. Каждый конструкт FVIII-XTEN-Fc совместно экспрессировали с VWF-031 в клетках HEK293, получая гетеродимерные белки FVIII-XTEN-Fc/VWF. На четвертый день после трансфекции собирали культуральную

- 112 042955 среду и концентрировали ее до 20 МЕ/мл согласно хромогенной активности FVIII (FVIII-195 :VWF-031, FVIII-196:VWF-031, FVIII-199: VWF-031, FVIII-203:VWF-031 и FVIII-204:VWF-031) или очищали (scBDDFVIII, FVIII-169:VWF-031, FVIII-201:VWF-031 и FVIII-205:VWF-031). После демонстрации полного внутримолекулярного экранирования молекулы FVIII в гетеродимере FVIII-XTEN-Fc:VWF-Fc от эндогенного VWF фрагментом D'D3 (FVIII-169:VWF-031, пример 5) для ФК-оценок выбрали мышей НешА. Очищенный белок или концентрированную культуральную среду вводили мышам НешА в возрасте 8-12 недель путем внутривенного введения в дозе 200 ME/IO мл/кг. Отбор образцов плазмы выполняли через 5 мин, 8, 16, 24, 32, 48, 72 и 96 ч после введения. Активность FVIII в образцах плазмы анализировали с помощью хромогенного анализа FVIII; период полужизни рассчитывали с помощью программы WinNonlin-Phoenix. Фармакокинетические параметры протестированных молекул перечислены в табл. 22. Активность FVIII в плазме в выбранные моменты времени для вариантов FVIII-XTEN-Fc/VWF-Fc нанесена на графики на фиг. 12А-12С.

При вставке XTEN в положениях 1900 и 1656 (FVIII-195, FVIII-199) наблюдали умеренное улучшение периода полужизни для изоформы scFVIII (FVIII-199:VWF-031) по сравнению c FVIII-169:VWF-031. Однако изоформа dcFVIII демонстрировала более короткий период полужизни, чем FVIII-169:VWF-031, что указывало на возможность значительно большей стабильности одноцепочечной изоформы по сравнению с соответствующей двуцепочечной изоформой (табл. 22 и фиг. 12А). При внедрении третьей вставки XTEN в FVIII-199 в положении 26 период полужизни полученной молекулы FVIII-201: VWF-031 достигал 24,6 ч, что представляет более чем трехкратное улучшение периода полужизни по сравнению с scBDD-FVIII (табл. 22 и фиг. 12С). Авторы изобретения также протестировали действие второй вставки XTEN в каждом из положений 403 (домен А2), 1900 (домен АЗ) и 18 (домен А1) на увеличение периода полужизни в комбинации со вставкой XTEN в В-домен. В то время как добавление вставки XTEN в А2 или АЗ не давало дополнительного положительного действия на период полужизни (табл. 22, фиг. 12В), добавление вставки А1 увеличивало период полужизни гетеродимера FVIII-XTEN-Fc:VWF-Fc до 29,4 ч (табл. 22, фиг. 12С), что более чем в три раза превышало период полужизни scBDD-FVIII.

При внедрении XTEN в конструкт гетеродимера FVIIIFc/VWF степень улучшения периода полужизни полученных молекул менялась; очевидной корреляции между периодом период полужизни и сайтом или количеством вставок XTEN не наблюдали, что указывает на то, что период полужизни гетеродимера FVIII-XTEN-Fc/VWF определяется целостностью всей молекулы, а не количеством или положением вставок XTEN.

Период полужизни продолжительностью 24,6 и 29,4 ч, наблюдавшийся для гетеродимеров FVIII-XTEN-Fc/VWF, однозначно превысил 1,6-2-кратное ограничение увеличения периода полужизни FVIII. При переносе этих результатов на пациентов с НешА это даст возможность профилактического приема FVIII раз в неделю или реже.

Таблица 22

ФК-параметры гетеродимеров FVIII-XTEN-Fc/VWF-Fc

FVIII	FVIII	Вставки XTEN	A w	MRT (ч)	Cl мл/ч/кг	Vss (мл/кг).	ППК_В кг*ч/мл
Сайт	Длина XTEN
scBDD-FVIII	ОЦ			7,16	10,1 6	4,38	44,44	0,23
FVIII 169/VWFO 3i	ОЦ	в*	АЕ288	16,6 5	18,4 4	3,57	65,79	0,28
FVIII195/VWF0 3i	ДЦ	1656/190 0	AG 144/ ΑΕΙ 44	12,5 6	13,8 8	9,04	125,4 8	0,11
FVIII199/VWF0 31	ОЦ	1656/190 0	AG 144/ ΑΕΙ 44	18,5 7	20,0 9	6,24	125,2 8	0,16
FV111201/VWF0 31	ОЦ	26/1656/ 1900	AG 144/AG144/ΑΕ1 44	24,6 3	33,6 7	1,9	63,97	0,53
FVIII203/VWF0 31	ОЦ	403/В*	AE144/AE288	15,5 2	18	3,65	65,61	0,27
FVH1204/VWF0 31	ОЦ	1900/В*	AE144/AE288	16,3	20,6 3	2,87	59,14	0,35
FV111205/VWF0 31	ОЦ	18/В*	AE144/AE288	29,4	37,0 6	1,82	67,39	0,55

* В указывает, что последовательность XTEN (например, 144) вставлена непосредственно после аминокислотного остатка 745, соответствующего последовательности зрелого FVIII.

Помимо внедрения XTEN в молекулу FVIII, авторы изобретения также оценивали потенциальное положительное действие внедрения XTEN в качестве линкера между D'D3 и фрагментом Fc на увеличение периода полужизни. FVIII-155 (scFVIIIFc) совместно экспрессировали с VWF-034 (VWF-Fc с АЕ 288

-113042955

XTEN и тромбин-расщепляемым линкером из 35 остатков) в клетках HEK293. На 4 день после трансфекции собирали культуральную среду и концентрировали ее до 20 МЕ/мл согласно анализу активности FVIII. Мышам FVIII/VWF DKO вводили концентрированную культуральную среду в дозировке 200 МЕ/10 мл/кг в виде разовой внутривенной инъекции. Отбор образцов плазмы выполняли через 5 мин, 8, 24, 48, 72 и 96 ч после введения. Активность FVIII в образцах плазмы анализировали с помощью хромогенного анализа FVIII и строили график кривой регрессии активности FVIII в плазме в зависимости от времени (фиг. 13). FVIII-155/VWF-034 демонстрировал такое же улучшение периода полужизни, как и FVIII-169/VWF-031, который содержал АЕ 288 XTEN, внедренный в стыке В-домена FVIII, что подтверждается перекрывающимися кривыми регрессии для указанных двух молекул (фиг. 13). Демонстрация того, что вставка XTEN в полипептид VWF-Fc вызывает улучшение периода полужизни, аналогичное по величине улучшению, обусловленному вставкой XTEN на стыке В-домена полипептида FVIII, свидетельствует о возможности дальнейшего улучшения периода полужизни гетеродимерной молекулы с комбинацией внутримолекулярной вставки XTEN в полипептид FVIII и междоменной вставки XTEN между VWF и Fc-элементами полипептида VWF-Fc.

Пример 13А. Фармакокинетические свойства дополнительных гетеродимеров FVIII-XTENVWF.

Помимо гетеродимеров FVIII-XTEN VWF, перечисленных в табл. 22, при HemA проводилось или будет проводиться тестирование фармакокинетических свойств гетеродимеров FVIII-XTEN VWF, содержащих различные композиции вставок XTEN, одноцепочечную и двуцепочечную версию FVIII (табл. 23А). Кроме того, ниже описаны различные конструкты FVIII (табл. 23В) и VWF (табл. 23С). Мышей HemA обрабатывали посредством разового внутривенного введения гетеродимерных белков в дозе 200 МЕ/10 мл/кг. Затем выполняли отбор образцов плазмы через 5 мин, 24, 48, 72, 96 и 120 ч после введения. Активность FVIII в образцах плазмы анализировали с помощью хромогенного анализа FVIII; период полужизни рассчитывали с помощью программы WinNonlin-Phoenix. Белковые последовательности перечисленных гетеродимеров перечислены в табл. 25.

Таблица 23А

Вероятные комбинации гетеродимера FVIII-XTEN-Fc:VWF-Fc для улучшения ФК и активности

	pSYN VWF015	pSYN VWF031	pSYN VWF034**	pSYN VWF-036
pSYN FVIII 010		11^8,7 ч DKO	Подлежит тестированию	I -
pSYN FVIII 155	11,2 6.3 ч DKO	t|/2 10.8 ч Мыши HemA	t|/2 18,6 Ч Мыши HemA	t|/2 13,3 ч Мыши HemA
pSYN FVIII 169 **	.	tb216,7 4 Мыши HemA	tl.231 J Η Мыши HemA	-
pSYN FVIII 173 **	-	ti/215,2ч DKO	t|;22K9 ч Мыши HemA	Подлежит тестированию
pSYN FVIII 205	=	0.229,4 ч Мыши HemA	32,4 ч Мыши HemA	ti/2 29,7 ч Мыши HemA
pSYN FVIII 266		^24,5 h Мыши HemA	ф. 27,4 ч Мыши HemA	-
pSYN FVII 267	-	Ф2 23,0 ч Мыши HemA	25,7 н Мыши HemA
pSYN FVIII 268		Подлежит тестированию	Подлежит тестированию	Подлежит тестированию
Двуцепочечная изоформа pSYN РУШ 268		Подлежит тестированию	Подлежит тестированию	Подлежит тестированию
**Длину XTEN можно изменять на 72= 144= 288= 324= 333: 576 или 864.

- 114 042955

Таблица 23В

Конструкты FVIII

pSYN FVIII 010	двуцепочечный ГУ 111 Нс.
pSYN FVIII 169	Одноцепочечный РУШРс с 288 АЕ XTEN в В-домене
pSYN FVIII 173	двуцепочечный РУШРс с 288 АЕ XTEN в В-домене
pSYN FVIII 195	двуцепочечный FV111 Нг. с двумя 144 X1EN в области аминокислот 1656 и 1900
pSYN FVIII 196	двуцепочечный FV 111 Нг. с тремя 144 XTEN в области аминокислот 2б= 1656 и 1900
pSYN FVIII 199	Одноцепочечный FVlHFc с двумя 144 XTEN в области аминокислот 1656 и 1900
pSYN FVIII 201	Одноцепочечный РУ111 Нг. с тремя 144 XTEN в области аминокислот 26; 1656 и 1900
pSYN FVIII 203	Одноцепочечный FV 111 Нг. с 144 АЕ XTEN в области аминокислоты 1900 и 288 АЕ XTEN в В-домене
pSYN FVIII 204	Одноцепочечный РУШНс с 144 АЕ XTEN в области аминокислоты 403 и 288 АЕ XTEN в В-домене
pSYN FVIII 205	Одноцепочечный РУШРс с 144 АЕ XTEN в области аминокислоты 18 и 288 АЕ XTEN в В-домене
pSYN FVIII 207	Одноцепочечный РУШ (без Рс= без X1EN)
pSYN FVIII 266	Одноцепочечный РУ 111 Нг. с 42 АЕ Χ1ΕΝ в области аминокислоты 18 и 288 АЕ XTEN в В-домене
pSYN FVIII 267	Одноцепочечный РУШРс с 72 АЕ XTEN в области аминокислоты 18 и 288 АЕ XTEN в В-домене
pSYN FVIII 268	Одноцепочечный РУШРс с 144 АЕ XTEN в области аминокислоты 18
pSYN FVIII	Одноцепочечный РУШНс с 72 АЕ XTEN в области аминокислоты 18
269
pSYN FVIII 271	Одноцепочечный РУШНс с 42 АЕ XTEN в области аминокислоты 18
pSYN FVIII 272	Одноцепочечный РУШ с 144 АЕ XTEN в области аминокислоты 18 и 288 АЕ XTEN в В-домене (без Рс)

Конструкты VWF

Таблица 23С

pSYN VWF031	VWF-D1D2DO3 - тромбин-расщепляемый GS-линкер-Рс длиной 48 AKc C1099AC1142A
pSYN VWF034	VWF-D1D2D'D3- 288AE XiEN + тромбин-расщепляемый GS-линкер-Рс длиной 35 AKc C1099AC1142A
pSYN VWF035	VWF-D1D2DD3- тоомбин-расщепляемый GS-линкер-Рс длиной 72 АК с С1099А С1142А
pSYN VWF036	VWF-D1D2DD3- тромбин-расщепляемый GS-линкер-Рс длиной 98 АКс С1099АС1142А
pSYN VWF041	VWF-D1D2D'D3 с 288 АЕ XTEN в D3 и тромбин-расщепляемый GS-линкер-Рс длиной 48 АК после D3-Fc с С1099ΑΌ1142А

Пример 13В. Фармакокинетические свойства дополнительных гетеродимеров FVIII-XTENVWF.

Фармакокинетические свойства гетеродимеров FVIII-XTENVWF протестировали на мышах HemA. Протестированные гетеродимеры представляли собой FVIII169/VWF034, FVIII205/VWF034, FVIII205/VWF036 и FVIII266/VWF031. Мышам HemA вводили разовую внутривенную дозу различных гетеродимерных белков 200 МЕ/10 мл/кг. Отбор образцов плазмы выполняли через 5 мин, 24, 48, 72, 96 и 120 ч после введения. Активность FVIII в образцах плазмы анализировали с помощью хромогенного анализа FVIII; периоды полужизни рассчитывали с помощью программы WinNonlin-Phoenix. Результаты ФК приведены ниже в табл. 24.

- 115 042955

Таблица 24

Дополнительные FVIII-XTENVWF - ФК у мышей HemA

Обработка	5-мин икстааоЕление ΐ%)	HLQ)	MRT (ч)	Cl. (мл/ч/кг}	Vss {мл/кг)	ΠΠΚϋ (ч*кг*мМЕ' мл/мМЕ)	Кратность увеличения ti/2no сравнению с scBDD-FVm
ScBDD- FV111		7J6	10 J 6	4.83	44.44	0.23	-
FVUT169/V WF034	76	31.1	34.57	1.73	59.77	0.58	4.3
FVIII205/V WF034	68	32.41	39.79	1.55	61.73	0.64	4.6
FV1II205/V WF036	74	29.71 5	36.35	1.61	58.43	0.62	4.1
FVIII266/V	66	24.45	22.75	2.67	60.83	0.37	3:4
WF031

Нуклеотидная последовательность pSYNFVIII 010 (двуцепочечный FVIIIFc) (SEQ ID NO: 125).

ATGCAAATAG AGCTCTCCAC CTGCTTCTTT CTGTGCCTTT TGCGATTCTG

CTTTAGTGCC ACCAGAAGAT ACTACCTGGG TGCAGTGGAA CTGTCATGGG

101 ACTATATGCA AAGTGATCTC GGTGAGCTGC CTGTGGACGC AAGATTTCCT

151 CCTAGAGTGC CAAAATCTTT TCCATTCAAC ACCTCAGTCG TGTACAAAAA

201 GACTCTGTTT GTAGAATTCA CGGATCACCT TTTCAACATC GCTAAGCCAA

251 GGCCACCCTG GATGGGTCTG CTAGGTCCTA CCATCCAGGC TGAGGTTTAT

301 GATACAGTGG TC ATT AC ACT TAAGAACATG GCTTCCCATC CTGTC AGTCT

51 TCATGCTGTT GGTGTATCCT ACTGGAAAGC TTCTGAGGGA GCTGAATATG

401 ATGATCAGAC CAGTCAAAGG GAGAAAGAAG ATGATAAAGT CTTCCCTGGT

451 GGAAGCCATA CATATGTCTG GCAGGTCCTG AAAGAGAATG GTCCAATGGC 501 CTCTGACCCA CTGTGCCTTA CCTACTCATA TCTTTCTCAT GTGGACCTGG

551 TAAAAGACTT GAATTCAGGC CTCATTGGAG CCCTACTAGT ATGTAGAGAA

601 GGGAGTCTGG CC AAGGAAAA GAC AC AGACC TTGC AC AAAT TTAT ACT ACT

651 TTTTGCTGTA TTTGATGAAG GGAAAAGTTG GCACTCAGAA ACAAAGAACT

701 CCTTGATGCA GGATAGGGAT GCTGCATCTG CTCGGGCCTG GCCTAAAATG

751 CACACAGTCA ATGGTTATGT AAACAGGTCT CTGCCAGGTC TGATTGGATG

801 CCACAGGAAA TCAGTCTATT GGCATGTGAT TGGAATGGGC ACCACTCCTG

851 AAGTGCACTC AATATTCCTC GAAGGTCACA CATTTCTTGT GAGGAACCAT

901 CGCCAGGCGT CCTTGGAAAT CTCGCCAATA ACTTTCCTTA CTGCTCAAAC

951 ACTCTTGATG GACCTTGGAC AGTTTCTACT GTTTTGTCAT ATCTCTTCCC

1001 ACCAACATGA TGGCATGGAA GCTTATGTCA AAGTAGACAG CTGTCCAGAG

1051 GAACCCCAAC TACGAATGAA AAATAATGAA GAAGCGGAAG

ACTATGATGA

1101 TGATCTTACT GATTCTGAAA TGGATGTGGT CAGGTTTGAT GATGACAACT

1151 CTCCTTCCTT TATCCAAATT CGCTCAGTTG CCAAGAAGCA TCCTAAAACT

1201 TGGGTACATT ACATTGCTGC TGAAGAGGAG GACTGGGACT ATGCTCCCTT

1251 AGTCCTCGCC CCCGATGACA GAAGTTATAA AAGTCAATAT TTGAACAATG

1301 GCCCTCAGCG GATTGGTAGG AAGTACAAAA AAGTCCGATT TATGGCATAC

1351 ACAGATGAAA CCTTTAAGAC TCGTGAAGCT ATTCAGCATG AATCAGGAAT

1401 CTTGGGACCT TTACTTTATG GGGAAGTTGG AGACACACTG TTGATTATAT

1451 TTAAGAATCA AGCAAGCAGA CC AT AT AAC A TCTACCCTCA CGGAATCACT

- 116 042955

1501 GATGTCCGTC CTTTGTATTC AAGGAGATTA CCAAAAGGTG TAAAACATTT

1551 GAAGGATTTT CCAATTCTGC CAGGAGAAAT ATTCAAATAT AAATGGACAG

1601 TGACTGT AGA AGATGGGCC A ACTAAATC AG ATCCTCGGTG CCTGACCCGC

1651 TATTACTCTA GTTTCGTTAA TATGGAGAGA GATCTAGCTT CAGGACTCAT

1701 TGGCCCTCTC CTCATCTGCT ACAAAGAATC TGTAGATCAA AGAGGAAACC

1751 AGATAATGTC AGACAAGAGG AATGTCATCC TGTTTTCTGT ATTTGATGAG

1801 AACCGAAGCT GGTACCTCAC AGAGAATATA CAACGCTTTC TCCCCAATCC

1851 AGCTGGAGTG CAGCTTGAGG ATCCAGAGTT CCAAGCCTCC AACATCATGC

1901 ACAGCATCAA TGGCTATGTT TTTGATAGTT TGCAGTTGTC AGTTTGTTTG

1951 CATGAGGTGG CATACTGGTA CATTCTAAGC ATTGGAGCAC AGACTGACTT

2001 CCTTTCTGTC TTCTTCTCTG GATATACCTT CAAACACAAA ATGGTCTATG

2051 AAGACACACT CACCCTATTC CCATTCTCAG GAGAAACTGT CTTCATGTCG

2101 ATGGAAAACC CAGGTCTATG GATTCTGGGG TGCCACAACT CAGACTTTCG

2151 GAACAGAGGC ATGACCGCCT TACTGAAGGT TTCTAGTTGT GACAAGAACA

2201 CTGGTGATTA TTACGAGGAC AGTTATGAAG ATATTTCAGC ATACTTGCTG

2251 AGTAAAAACA ATGCCATTGA ACCAAGAAGC TTCTCTCAAA ACCCACCAGT

2301 CTTGAAACGC CATCAACGGG AAATAACTCG TACTACTCTT CAGTCAGATC

51 AAGAGGAAAT TGACTATGAT GAT ACC AT AT C AGTTGAAAT GAAGAAGGAA

2401 GATTTTGACA TTTATGATGA GGATGAAAAT CAGAGCCCCC GCAGCTTTCA

2451 AAAGAAAACA CGACACTATT TTATTGCTGC AGTGGAGAGG CTCTGGGATT

2501 ATGGGATGAG TAGCTCCCCA CATGTTCTAA GAAACAGGGC TCAGAGTGGC

2551 AGTGTCCCTC AGTTCAAGAA AGTTGTTTTC CAGGAATTTA CTGATGGCTC

2601 CTTTACTCAG CCCTTATACC GTGGAGAACT AAATGAACAT TTGGGACTCC

2651 TGGGGCCATA TAT AAGAGC A GAAGTTGAAG AT AAT АТС AT GGTAACTTTC

2701 AGAAATCAGG CCTCTCGTCC CTATTCCTTC TATTCTAGCC TTATTTCTTA

2751 TGAGGAAGAT CAGAGGCAAG GAGCAGAACC TAGAAAAAAC

TTTGTCAAGC

2801 CTAATGAAAC CAAAACTTAC TTTTGGAAAG TGCAACATCA TATGGCACCC

2851 ACTAAAGATG AGTTTGACTG CAAAGCCTGG GCTTATTTCT CTGATGTTGA

2901 CCTGGAAAAA GATGTGCACT CAGGCCTGAT TGGACCCCTT CTGGTCTGCC

2951 ACACTAACAC ACTGAACCCT GCTCATGGGA GACAAGTGAC AGTACAGGAA

3001 TTTGCTCTGT TTTTCACCAT CTTTGATGAG ACCAAAAGCT GGTACTTCAC

3051 TGAAAATATG GAAAGAAACT GCAGGGCTCC CTGCAATATC CAGATGGAAG

3101 ATCCCACTTT TAAAGAGAAT TATCGCTTCC ATGCAATCAA TGGCTACATA

3151 ATGGATACAC TACCTGGCTT AGTAATGGCT CAGGATCAAA GGATTCGATG

3201 GTATCTGCTC AGCATGGGCA GCAATGAAAA CATCCATTCT ATTCATTTCA

3251 GTGGACATGT GTTCACTGTA CGAAAAAAAG AGGAGTATAA AATGGCACTG

3301 TACAATCTCT ATCCAGGTGT TTTTGAGACA GTGGAAATGT TACCATCCAA

3351 AGCTGGAATT TGGCGGGTGG AATGCCTTAT TGGCGAGCAT CTACATGCTG

3401 GGATGAGCAC ACTTTTTCTG GTGTACAGCA ATAAGTGTCA GACTCCCCTG

3451 GGAATGGCTT CTGGACACAT TAGAGATTTT CAGATTACAG CTTCAGGACA

3501 ATATGGACAG TGGGCCCCAA AGCTGGCCAG ACTTCATTAT TCCGGATCAA

3551 TCAATGCCTG GAGCACCAAG GAGCCCTTTT CTTGGATCAA GGTGGATCTG

3601 TTGGCACCAA TGATTATTCA CGGCATCAAG ACCCAGGGTG CCCGTCAGAA

3651 GTTCTCCAGC CTCTACATCT CTCAGTTTAT CATCATGTAT AGTCTTGATG

3701 GGAAGAAGTG GCAGACTTAT CGAGGAAATT CCACTGGAAC CTTAATGGTC

- 117 042955

3751 TTCTTTGGCA ATGTGGATTC ATCTGGGATA AAACACAATA TTTTTAACCC 3801 TCCAATTATT GCTCGATACA TCCGTTTGCA CCCAACTCAT TATAGCATTC 3851 GCAGCACTCT TCGCATGGAG TTGATGGGCT GTGATTTAAA TAGTTGCAGC 3901 ATGCCATTGG GAATGGAGAG TAAAGCAATA TCAGATGCAC AGATTACTGC 3951 TTCATCCTAC TTTACCAATA TGTTTGCCAC CTGGTCTCCT TCAAAAGCTC 4001 GACTTCACCT CCAAGGGAGG AGTAATGCCT GGAGACCTCA GGTGAATAAT 4051 CCAAAAGAGT GGCTGCAAGT GGACTTCCAG AAGACAATGA AAGTCACAGG

4101 AGTAACTACT CAGGGAGTAA AATCTCTGCT TACCAGCATG TATGTGAAGG 4151 AGTTCCTCAT CTCCAGCAGT CAAGATGGCC ATCAGTGGAC TCTCTTTTTT 4201 CAGAATGGCA AAGTAAAGGT TTTTCAGGGA AATCAAGACT CCTTCACACC 4251 TGTGGTGAAC TCTCTAGACC CACCGTTACT GACTCGCTAC CTTCGAATTC 4301 ACCCCCAGAG TTGGGTGCAC CAGATTGCCC TGAGGATGGA GGTTCTGGGC 4351 TGCGAGGCAC AGGACCTCTA CGACAAAACT CACACATGCC CACCGTGCCC 4401 AGCTCCAGAA CTCCTGGGCG GACCGTCAGT CTTCCTCTTC CCCCCAAAAC 4451 CCAAGGACAC CCTCATGATC TCCCGGACCC CTGAGGTCAC ATGCGTGGTG 4501 GTGGACGTGA GCCACGAAGA CCCTGAGGTC AAGTTCAACT GGTACGTGGA 4551 CGGCGTGGAG GTGCATAATG CCAAGACAAA GCCGCGGGAG GAGCAGTACA

4601 ACAGCACGTA CCGTGTGGTC AGCGTCCTCA CCGTCCTGCA CCAGGACTGG 4651 CTGAATGGCA AGGAGTACAA GTGCAAGGTC TCCAACAAAG CCCTCCCAGC 4701 CCCCATCGAG AAAACCATCT CCAAAGCCAA AGGGCAGCCC CGAGAACCAC 4751 AGGTGTACAC CCTGCCCCCA TCCCGGGATG AGCTGACCAA GAACCAGGTC 4801 AGCCTGACCT GCCTGGTCAA AGGCTTCTAT CCCAGCGACA TCGCCGTGGA 4851 GTGGGAGAGC AATGGGCAGC CGGAGAACAA CTACAAGACC ACGCCTCCCG

4901 TGTTGGACTC CGACGGCTCC TTCTTCCTCT ACAGCAAGCT CACCGTGGAC 4951 AAGAGCAGGT GGCAGCAGGG GAACGTCTTC TCATGCTCCG TGATGCATGA 5001 GGCTCTGCAC AACCACTACA CGCAGAAGAG CCTCTCCCTG TCTCCGGGTA 5051 AATGA

Белковая последовательность pSYNFVIII 010 (двуцепочечный FVIIIFc) (SEQ ID NO: 126).

MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQSDL GELPVDARFP

PRVPKSFPFN TSVVYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY

101 DTVVITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG

151 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE 201 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM 251 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH 301 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE 351 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDVVRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT 401 WVHYIAAEEE DWD YAPLVLA PDDRS YKSQ Y LNNGPQRIGR К YK К VRFM AY' 451 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT 501 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR

- 118 042955

551 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE 601 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL 651 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS 701 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL 751 SKNNAIEPRS FSQNPPVLKR HQREITRTTL QSDQEEIDYD DTISVEMKKE 801 DFDIYDEDEN QSPRSFQKKT RHYFIAAVER LWDYGMSSSP HVLRNRAQSG 851 SVPQFKKVVF QEFTDGSFTQ PLYRGELNEH LGLLGPYIRA EVEDNIMVTF 901 RNQASRPYSF YS SLISYEED QRQGAEPRKN FVKPNETKTY FWK VQHHMAP 951 TKDEFDCKAW AYFSDVDLEK DVHSGLIGPL LVCHTNTLNP AHGRQVTVQE 1001 FALFFTIFDE TKSWYFTENM ERNCRAPCNI QMEDPTFKEN YRFHAINGYI 1051 MDTLPGLVMA QDQRIRWYLL SMGSNENIHS IHFSGHVFTV RKKEEYKMAL 1101 YNLYPGVFET VEMLPSKAGIWRVECLIGEH LHAGMSTLFL VYSNKCQTPL 1151 GMASGHIRDF QITASGQYGQ WAPKLARLHY SGSINAWSTK EPFSWIKVDL 1201 LAPMIIHGIK TQGARQKFSS LYISQFIIMY SLDGKKWQTY RGNSTGTLMV 1251 FFGNVDSSGIKHNIFNPPII ARYIRLHPTH YSIRSTLRME LMGCDLNSCS

1301 MPLGMESKAI SDAQITASSY FTNMFATWSP SKARLHLQGR SNAWRPQVNN

1351 PKEWLQVDFQ KTMKVTGVTT QGVKSLLTSM YVKEFLISSS QDGHQWTLFF

1401 QNGKVKVFQG NQDSFTPVVN SLDPPLLTRY LRIHPQSWVH QIALRMEVLG

1451 CEAQDLYDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV

1501 VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW

1551 LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SRDELTKNQV

1601 SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD

1651 KSRWQQGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK*

Пример 14. Новый класс молекул фактора VIII свертывания крови с более чем трехкратным увеличением периода полужизни у мышей с гемофилией А.

Разработан новый класс молекул FVIII, содержащих два полипептида, один из которых состоит из одиночной цепи FVIII с удаленным В-доменом (BDD) и вставкой XTEN в одном или нескольких положений в пределах последовательности FVIII, а второй состоит из области D'D3 VWF. Кроме того, каждый полипептид рекомбинантно объединен с областью Fc IgG1, что обеспечивает правильное выравнивание области D'D3 для связывания молекулы FVIII. Полученные варианты FVIII экспрессировали в клетках HEK293 посредством временной трансфекции и очищали от кондиционированной среды. Активность FVIII оценивали путем хромогенного анализа FVIII, оценку фармакокинетических свойств выполняли на мышах с нокаутом FVIII (HemA) и двойным нокаутом (DKO) FVIII/VWF.

Внедрение XTEN и области D'D3 VWF в rFVIII привело к разобщению клиренса гибридных белков и эндогенного VWF при увеличении их периода полужизни в кровотоке. FVIII в указанной гибридной конфигурации полностью экранировался от взаимодействия с VWF согласно измерению с помощью интерферометрии в биологическом слое (Octet). В соответствии с этим обнаружено, что их фармакокинетические профили у мышей HemA и DKO были идентичны, что указывает на эффективное разобщение скорости их клиренса у мышей и VWF. Оптимизация длины XTEN и положений для вставки XTEN позволила выявить подмножество белков, которые превысили ограничение VWF (16 ч), достигая периода полужизни в кровотоке мышей HemA до 30 ч, что представляет собой 4-кратное улучшение по сравнению с BDD-FVIII. Важно отметить, что эти белки поддерживали свою функциональность, согласно хромогенному анализу FVIII. Зависимость от VWF обуславливает фундаментальное ограничение периода полужизни терапевтического FVIII. Разобщение FVIII и путей клиренса VWF при увеличении периода полужизни за счет присоединения области D'D3 VWF и XTEN позволило получить новые молекулы FVIII с 4-кратно увеличенным периодом полужизни. Настоящий документ является первым сообщением о рекомбинантном FVIII, превысившем ограничение периода полужизни, наблюдаемое при попытках промышленной разработки FVIII длительного действия, что потенциально представляет собой значительное усовершенствование профилактического лечения гемофилии А.

- 119 042955

Таблица 25

Белковые последовательности конструктов FVIII-XTEN-Fc и VWF-Fc Белковая последовательность FVIII 195 (двуцепочечный FVIIIFc с двумя 144 АЕ XTEN в области аминокислот 1656 и 1900) (SEQ ID NO: 105).

MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQSDL

GELPVDARFP

PRVPKSFPFN TSVVYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY

101 DTVVITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG

151 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE

201 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM

251 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH

301 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE

351 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDVVRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT

401 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY

451 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT

501 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR

551 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE

601 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL

651 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS

701 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL

751 SKNNAIEPRS FSQNPPVLKR HQREITRTTL QGAPGTPGSG TASSSPGASP

801 GTSSTGSPGA SPGTSSTGSP GASPGTSSTG SPGSSPSAST GTGPGTPGSG

851 TASSSPGASP GTSSTGSPGA SPGTSSTGSP GASPGTSSTG SPGSSTPSGA

901 TGSPGSSTPS GATGSPGASP GTSSTGSPAS SSDQEEIDYD DTISVEMKKE

951 DFDIYDEDEN QSPRSFQKKT RHYFIAAVER LWDYGMSSSP HVLRNRAQSG

1001 SVPQFKKVVF QEFTDGSFTQ PLYRGELNEH LGLLGPYIRA EVEDNIMVTF

1051 RNQASRPYSF YSSLISYEED QRQGAEPRKN FVKPNETKTY FWKVQHHMAP

1101 TKDEFDCKAW AYFSDVDLEK DVHSGLIGPL LVCHTNTLNP AHGRQVTVQE

1151 FALFFTIFDE TKSWYFTENM ERNCRGAPTS ESATPESGPG SEPATSGSET

1201 PGTSESATPE SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGTS TEPSEGSAPG

1251 TSESATPESG PGSPAGSPTS TEEGSPAGSP TSTEEGSPAG SPTSTEEGTS

1301 ESATPESGPG TSTEPSEGSA PGASSAPCNI QMEDPTFKEN YRFHAINGYI

1351 MDTLPGLVMA QDQRIRWYLL SMGSNENIHS IHFSGHVFTV RKKEEYKMAL

1401 YNLYPGVFET VEMLPSKAGIWRVECLIGEH LHAGMSTLFL VYSNKCQTPL

1451 GMASGHIRDF QITASGQYGQ WAPKLARLHY SGSINAWSTK EPFSWIKVDL

1501 LAPMIIHGIK TQGARQKFSS LYISQFIIMY SLDGKKWQTY RGNSTGTLMV

1551 FFGNVDSSGIKHNIFNPPII ARYIRLHPTH YSIRSTLRME LMGCDLNSCS

1601 MPLGMESKAI SDAQITASSY FTNMFATWSP SKARLHLQGR SNAWRPQVNN

1651 PKEWLQVDFQ KTMKVTGVTT QGVKSLLTSM YVKEFLISSS QDGHQWTLFF

1701 QNGKVKVFQG NQDSFTPVVN SLDPPLLTRY LRIHPQSWVH QIALRMEVLG

1751 CEAQDLYDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV

1801 VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW

1851 LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SRDELTKNQV

1901 SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD

1951 KSRWQQGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK*

- 120 042955

Белковая последовательность FVIII 196 (двуцепочечный FVIIIFc с тремя 144 АЕ XTEN в области аминокислот 26, 1656 и 1900) (SEQ ID NO: 106).

MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQSDL

GELPVGAPGS

SPSASTGTGP GSSPSASTGT GPGASPGTSS TGSPGASPGT SSTGSPGSST

101 PSGATGSPGS SPSASTGTGP GASPGTSSTG SPGSSPSAST GTGPGTPGSG

151 TASSSPGSST PSGATGSPGS STPSGATGSP GASPGTSSTG SPASSDARFP

201 PRVPKSFPFN TSVVYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY

251 DTVVITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG 3 01 GSHTYVWQ VL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE 3 51 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM 401 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH

451 RQASLEISPITFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE 501 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDVVRFD DDNSPSFIQIRSVAKKHPKT

51 WVHYIAAEEE DWD YAPLVLA PDDRS YKSQ Y LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY 601 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT

651 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR 701 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE 751 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL 801 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS 851 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL 901 SKNNAIEPRS FSQNPPVLKR HQREITRTTL QGAPGTPGSG TASSSPGASP 951 GTSSTGSPGA SPGTSSTGSP GASPGTSSTG SPGSSPSAST GTGPGTPGSG 1001 TASSSPGASP GTSSTGSPGA SPGTSSTGSP GASPGTSSTG SPGSSTPSGA

1051 TGSPGSSTPS GATGSPGASP GTSSTGSPAS SSDQEEIDYD DTISVEMKKE

1101 DFDIYDEDEN QSPRSFQKKT RHYFIAAVER LWDYGMSSSP HVLRNRAQSG 1151 SVPQFKKVVF QEFTDGSFTQ PLYRGELNEH LGLLGPYIRA EVEDNIMVTF 1201 RNQASRPYSF YSSLISYEED QRQGAEPRKN FVKPNETKTY FWKVQHHMAP 1251 TKDEFDCKAW AYFSDVDLEK DVHSGLIGPL LVCHTNTLNP AHGRQVTVQE 1301 FALFFTIFDE TKSWYFTENM ERNCRGAPTS ESATPESGPG SEPATSGSET 1351 PGTSESATPE SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGTS TEPSEGSAPG 1401 TSESATPESGPGSPAGSPTS TEEGSPAGSP TSTEEGSPAG SPTSTEEGTS 1451 ESATPESGPG TSTEPSEGSA PGASSAPCNI QMEDPTFKEN YRFHAINGYI

1501 MDTLPGLVMA QDQRIRWYLL SMGSNENIHS IHFSGHVFTV RKKEEYKMAL 1551 YNLYPGVFET VEMLPSKAGIWRVECLIGEH LHAGMSTLFL VYSNKCQTPL 1601 GMASGHIRDF QITASGQYGQ WAPKLARLHY SGSINAWSTK EPFSWIKVDL 1651 LAPMIIHGIK TQGARQKFSS LYISQFIIMY SLDGKKWQTY RGNSTGTLMV 1701 FFGNVDSSGIKHNIFNPPII ARYIRLHPTH YSIRSTLRME LMGCDLNSCS

1751 MPLGMESKAI SDAQITASSY FTNMFATWSP SKARLHLQGR SNAWRPQVNN 1801 PKEWLQVDFQ KTMKVTGVTT QGVKSLLTSM YVKEFLISSS QDGHQWTLFF 1851 QNGKVKVFQG NQDSFTPVVN SLDPPLLTRY LRIHPQSWVH QIALRMEVLG 1901 CEAQDLYDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV

1951 VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW 2001 LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SRDELTKNQV 2051 SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD 2101 KSRWQQGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK*

- 121 042955

Белковая последовательность FVIII 199 (одноцепочечный FVIIIFc с тремя 144 АЕ XTEN в области аминокислот 1656 и 1900) (SEQ ID NO: 107).

MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQSDL

GELPVDARFP

PRVPKSFPFN TS VVYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY

101 DTVVITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG

151 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE 201 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM 251 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH 301 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE

351 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDVVRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT

401 WVHYIAAEEE DWD Y APLVLA PDDRS YKSQ Y LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY

451 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT

501 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR

551 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE 601 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL 651 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS 701 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MT ALLKVSSC DKNTGDYYED S YEDIS AYLL

751 SKNNAIEPRS FSQNPPVLKR HQAEITRTTL QGAPGTPGSG TASSSPGASP 801 GTSSTGSPGA SPGTSSTGSP GASPGTSSTG SPGSSPSAST GTGPGTPGSG

851 TASSSPGASP GTSSTGSPGA SPGTSSTGSP GASPGTSSTG SPGSSTPSGA

901 TGSPGSSTPS GATGSPGASP GTSSTGSPAS SSDQEEIDYD DTISVEMKKE

951 DFDIYDEDEN QSPRSFQKKT RHYFIAAVER LWDYGMSSSP HVLRNRAQSG

1001 SVPQFKKVVF QEFTDGSFTQ PLYRGELNEH LGLLGPYIRA EVEDNIMVTF

1051 RNQASRPYSF YS SLISYEED QRQGAEPRKN FVKPNETKTY FWKVQHHMAP 1101 TKDEFDCKAW AYFSDVDLEK DVHSGLIGPL LVCHTNTLNP AHGRQVTVQE 1151 FALFFTIFDE TKSWYFTENM ERNCRGAPTS ESATPESGPG SEPATSGSET

1201 PGTSESATPE SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGTS TEPSEGSAPG

1251 TSESATPESGPGSPAGSPTS TEEGSPAGSP TSTEEGSPAG SPTSTEEGTS

1301 ESATPESGPG TSTEPSEGSA PGASSAPCNI QMEDPTFKEN YRFHAINGYI

1351 MDTLPGLVMA QDQRIRWYLL SMGSNENIHS IHFSGHVFTV RKKEEYKMAL 1401 YNLYPGVFET VEMLPSKAGIWRVECLIGEH LHAGMSTLFL VYSNKCQTPL 1451 GMASGHIRDF QITASGQYGQ WAPKLARLHY SGSINAWSTK EPFSWIKVDL 1501 LAPMIIHGIK TQGARQKFSS LYISQFIIMY SLDGKKWQTY RGNSTGTLMV 1551 FFGNVDSSGIKHNIFNPPII ARYIRLHPTH YSIRSTLRME LMGCDLNSCS

1601 MPLGMESKAI SDAQITASSY FTNMFATWSP SKARLHLQGR SNAWRPQVNN 1651 PKEWLQVDFQ KTMKVTGVTT QGVKSLLTSM YVKEFLISSS QDGHQWTLFF

1701 QNGKVKVFQG NQDSFTPVVN SLDPPLLTRY LRIHPQSWVH QIALRMEVLG 1751 CEAQDLYDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV

1801 VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW 1851 LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SRDELTKNQV 1901 SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD

1951 KSRWQQGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK*

- 122 042955

Белковая последовательность FVIII 201 (одноцепочечный FVIIIFc с тремя 144 АЕ XTEN в области аминокислот 26, 1656 и 1900) (SEQ ID NO: 108).

MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQSDL GELPVGAPGS

SPSASTGTGP GSSPSASTGT GPGASPGTSS TGSPGASPGT SSTGSPGSST

101 PSGATGSPGS SPSASTGTGP GASPGTSSTG SPGSSPSAST GTGPGTPGSG

151 TASSSPGSST PSGATGSPGS STPSGATGSP GASPGTSSTG SPASSDARFP

201 PRVPKSFPFN TSVVYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY

251 DTVVITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG

301 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE

51 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM

401 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH

451 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE

501 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDVVRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT

51 WVHYIAAEEE DWD YAPLVLA PDDRS YKSQ Y LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY

601 TDETFKTREA IQHES GILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT

651 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR

701 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE

751 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL

801 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS

851 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL

901 SKNNAIEPRS FSQNPPVLKR HQAEITRTTL QGAPGTPGSG TASSSPGASP

951 GTSSTGSPGA SPGTSSTGSP GASPGTSSTG SPGSSPSAST GTGPGTPGSG

1001 TASSSPGASP GTSSTGSPGA SPGTSSTGSP GASPGTSSTG SPGSSTPSGA

1051 TGSPGSSTPS GATGSPGASP GTSSTGSPAS SSDQEEIDYD DTISVEMKKE

1101 DFDIYDEDEN QSPRSFQKKT RHYFIAAVER LWDYGMSSSP HVLRNRAQSG

1151 SVPQFKKVVF QEFTDGSFTQ PLYRGELNEH LGLLGPYIRA EVEDNIMVTF

1201 RNQASRPYSF YSSLISYEED QRQGAEPRKN FVKPNETKTY FWKVQHHMAP 1251 TKDEFDCKAW AYFSDVDLEK DVHSGLIGPL LVCHTNTLNP AHGRQVTVQE

1301 FALFFTIFDE TKSWYFTENM ERNCRGAPTS ESATPESGPG SEPATSGSET

1351 PGTSESATPE SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGTS TEPSEGSAPG

1401 TSESATPESGPGSPAGSPTS TEEGSPAGSP TSTEEGSPAG SPTSTEEGTS

1451 ESATPESGPG TSTEPSEGSA PGASSAPCNI QMEDPTFKEN YRFHAINGYI

1501 MDTLPGLVMA QDQRIRWYLL SMGSNENIHS IHFSGHVFTV RKKEEYKMAL

1551 YNLYPGVFET VEMLPSKAGIWRVECLIGEH LHAGMSTLFL VYSNKCQTPL

1601 GMASGHIRDF QITASGQYGQ WAPKLARLHY SGSINAWSTK EPFSWIKVDL

1651 LAPMIIHGIK TQGARQKFSS LYISQFIIMY SLDGKKWQTY RGNSTGTLMV

1701 FFGNVDSSGIKHNIFNPPII ARYIRLHPTH YSIRSTLRME LMGCDLNSCS

1751 MPLGMESKAI SDAQITASSY FTNMFATWSP SKARLHLQGR SNAWRPQVNN

1801 PKEWLQVDFQ KTMKVTGVTT QGVKSLLTSM YVKEFLISSS QDGHQWTLFF

1851 QNGKVKVFQG NQDSFTPVVN SLDPPLLTRY LRIHPQSWVH QIALRMEVLG

1901 CEAQDLYDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV

1951 VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW

2001 LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SRDELTKNQV

2051 SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD 2101 KSRWQQGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK*

- 123 042955

Белковая последовательность FVIII203 (одноцепочечный FVIIIFc с двумя АЕ XTEN; одним 288АЕ XTEN в В-домене и одним 144 АЕ XTEN в области аминокислоты 1900) (SEQ ID NO: 109).

MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQSDL GELPVDARFP

PRVPKSFPFN TSVVYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY

101 DTVVITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG

151 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE 201 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM 251 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH 301 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE 351 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDVVRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT 401 WVHYIAAEEE DWD YAPLVLA PDDRS YKSQ Y LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY 451 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT 501 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR 551 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE 601 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL 651 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS 701 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL 751 SKNNAIEPRS FSQNGAPGTS ESATPESGPG SEPATSGSET PGTSESATPE 801 SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGTS TEPSEGSAPG SPAGSPTSTE 851 EGTSESATPE SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGSP AGSPTSTEEG 901 SPAGSPTSTE EGTSTEPSEG SAPGTSESAT PESGPGTSES ATPESGPGTS

951 ESATPESGPG SEPATSGSET PGSEPATSGS ETPGSPAGSP TSTEEGTSTE 1001 PSEGSAPGTS TEPSEGSAPG SEPATSGSET PGTSESATPE SGPGTSTEPS 1051 EGSAPASSPP VLKRHQAEIT RTTLQSDQEE IDYDDTISVE MKKEDFDIYD 1101 EDENQSPRSF QKKTRHYFIA AVERLWDYGM SSSPHVLRNR AQSGSVPQFK 1151 KVVFQEFTDG SFTQPLYRGE LNEHLGLLGP YIRAEVEDNIMVTFRNQASR 1201 PYSFYSSLIS YEEDQRQGAE PRKNFVKPNE TKTYFWKVQH HMAPTKDEFD 1251 CKAWAYFSDV DLEKDVHSGL IGPLLVCHTN TLNPAHGRQV TVQEFALFFT 1301 IFDETKSWYF TENMERNCRG APTSESATPE SGPGSEPATS GSETPGTSES 1351 ATPESGPGSE PATSGSETPG TSESATPESGPGTSTEPSEG SAPGTSESAT 1401 PESGPGSPAG SPTSTEEGSP AGSPTSTEEG SPAGSPTSTE EGTSESATPE

1451 SGPGTSTEPS EGSAPGASSA PCNIQMEDPT FKENYRFHAINGYIMDTLPG

1501 LVMAQDQRIR WYLLSMGSNE NIHSIHFSGH VFTVRKKEEY KMALYNLYPG 1551 VFETVEMLPS KAGIWRVECL IGEHLHAGMS TLFLVYSNKC QTPLGMASGH

1601 IRDFQITASG QYGQWAPKLA RLHYSGSINA WSTKEPFSWIKVDLLAPMII 1651 HGIKTQGARQ KFSSLYISQF IIMYSLDGKK WQTYRGNSTG TLMVFFGNVD 1701 SSGIKHNIFN PPIIARYIRL HPTHYSIRST LRMELMGCDL NSCSMPLGME

1751 SKAISDAQIT ASSYFTNMFA TWSPSKARLH LQGRSNAWRP QVNNPKEWLQ 1801 VDFQKTMKVT GVTTQGVKSL LTSMYVKEFL ISSSQDGHQW TLFFQNGKVK 1851 VFQGNQDSFT PVVNSLDPPL LTRYLRIHPQ SWVHQIALRM EVLGCEAQDL 1901 YDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE

1951 DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY 2001 KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV

2051 KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ 2101 GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK*

- 124 042955

Белковая последовательность FVIII204 (одноцепочечный FVIIIFc с двумя АЕ XTEN; одним 288АЕ XTEN в В-домене и одним 144 АЕ XTEN в области аминокислоты 403) (SEQ ID NO: 110).

MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQSDL GELPVDARFP

PRVPKSFPFN TS VVYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY

101 DTVVITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG

151 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE 201 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM 251 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK S VYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH 301 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE

351 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDVVRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT 401 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDGAPTSTEP SEGSAPGSPA GSPTSTEEGT 451 STEPSEGSAP GTSTEPSEGS APGTSESATP ESGPGTSTEP SEGSAPGTSE

501 SATPESGPGS EPATSGSETP GTSTEPSEGS APGTSTEPSE GSAPGTSESA

551 TPESGPGTSE SATPESGPGA SSDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY

601 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT

651 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR

701 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE 751 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL

801 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS 851 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL 901 SKNNAIEPRS FSQNGAPGTS ESATPESGPG SEPATSGSET PGTSESATPE

951 SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGTS TEPSEGSAPG SPAGSPTSTE 1001 EGTSESATPE SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGSP AGSPTSTEEG

1051 SPAGSPTSTE EGTSTEPSEG SAPGTSESAT PESGPGTSES ATPESGPGTS

1101 ESATPESGPG SEPATSGSET PGSEPATSGS ETPGSPAGSP TSTEEGTSTE

1151 PSEGSAPGTS TEPSEGSAPG SEPATSGSET PGTSESATPE SGPGTSTEPS

1201 EGSAPAS SPP VLKRHQAEIT RTTLQ SDQEE ID YDDTISVE MKKEDFDIYD

1251 EDENQSPRSF QKKTRHYFIA AVERLWDYGM SSSPHVLRNR AQSGSVPQFK 1301 KVVFQEFTDG SFTQPLYRGE LNEHLGLLGP YIRAEVEDNIMVTFRNQASR 1351 PYSFYSSLIS YEEDQRQGAE PRKNFVKPNE TKTYFWKVQH HMAPTKDEFD 1401 CKAWAYFSDV DLEKDVHSGL IGPLLVCHTN TLNPAHGRQV TVQEFALFFT 1451 IFDETKSWYF TENMERNCRA PCNIQMEDPT FKENYRFHAINGYIMDTLPG 1501 LVMAQDQRIR WYLLSMGSNE NIHSIHFSGH VFTVRKKEEY KMALYNLYPG 1551 VFETVEMLPS KAGIWRVECL IGEHLHAGMS TLFLVYSNKC QTPLGMASGH 1601 IRDFQITASG QYGQWAPKLA RLHYSGSINA WSTKEPFSWIKVDLLAPMII

1651 HGIKTQGARQ KFSSLYISQF IIMYSLDGKK WQTYRGNSTG TLMVFFGNVD 1701 SSGIKHNIFN PPIIARYIRL HPTHYSIRST LRMELMGCDL NSCSMPLGME

1751 SKAISDAQIT ASSYFTNMFA TWSPSKARLH LQGRSNAWRP QVNNPKEWLQ 1801 VDFQKTMKVT GVTTQGVKSL LTSMYVKEFL ISSSQDGHQW TLFFQNGKVK 1851 VFQGNQDSFT PVVNSLDPPL LTRYLRIHPQ SWVHQIALRM EVLGCEAQDL 1901 YDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE

1951 DPEVKFNWYV DGVEVHNАКТ KPREEQYNST YRVVS VLTVL HQDWLNGKEY 2001 KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV

2051 KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ 2101 GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*

- 125 042955

Белковая последовательность FVIII 205 (одноцепочечного FVIIIFc с двумя АЕ XTEN; одним 288АЕ XTEN в В-домене и одним 144 АЕ XTEN в области аминокислоты 18) (SEQ ID NO: 111).

MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQGAP TSESATPESG

PGSEPATSGS ETPGTSESAT PESGPGSEPA TSGSETPGTS ESATPESGPG

101 TSTEPSEGSA PGSPAGSPTS TEEGTSESAT PESGPGSEPA TSGSETPGTS

151 ESATPESGPG SPAGSPTSTE EGSPAGSPTS TEEGASSSDL GELPVDARFP

201 PRVPKSFPFN TSVVYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY

251 DTVVITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG 301 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE

51 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM 401 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH

451 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE 501 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDVVRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT

551 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY 601 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT

651 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR

701 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE

751 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL 801 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS 851 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL 901 SKNNAIEPRS FSQNGAPGTS ESATPESGPG SEPATSGSET PGTSESATPE

951 SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGTS TEPSEGSAPG SPAGSPTSTE 1001 EGTSESATPE SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGSP AGSPTSTEEG

1051 SPAGSPTSTE EGTSTEPSEG SAPGTSESAT PESGPGTSES ATPESGPGTS 1101 ESATPESGPG SEPATSGSET PGSEPATSGS ETPGSPAGSP TSTEEGTSTE 1151 PSEGSAPGTS TEPSEGSAPG SEPATSGSET PGTSESATPE SGPGTSTEPS

1201 EGSAPASSPP VLKRHQAEIT RTTLQSDQEE IDYDDTISVE MKKEDFDIYD

1251 EDENQSPRSF QKKTRHYFIA AVERLWDYGM SSSPHVLRNR AQSGSVPQFK 1301 KVVFQEFTDG SFTQPLYRGE LNEHLGLLGP YIRAEVEDNIMVTFRNQASR 1351 PYSFYSSLIS YEEDQRQGAE PRKNFVKPNE TKTYFWKVQH HMAPTKDEFD 1401 CKAWAYFSDV DLEKDVHSGL IGPLLVCHTN TLNPAHGRQV TVQEFALFFT 1451 IFDETKSWYF TENMERNCRA PCNIQMEDPT FKENYRFHAINGYIMDTLPG 1501 LVMAQDQRIR WYLLSMGSNE NIHSIHFSGH VFTVRKKEEY KMALYNLYPG 1551 VFETVEMLPS KAGIWRVECL IGEHLHAGMS TLFLVYSNKC QTPLGMASGH 1601 IRDFQITASG QYGQWAPKLA RLHYSGSINA WSTKEPFSWIKVDLLAPMII

1651 HGIKTQGARQ KFSSLYISQF IIMYSLDGKK WQTYRGNSTG TLMVFFGNVD 1701 SSGIKHNIFN PPIIARYIRL HPTHYSIRST LRMELMGCDL NSCSMPLGME

1751 SKAISDAQIT ASSYFTNMFA TWSPSKARLH LQGRSNAWRP QVNNPKEWLQ 1801 VDFQKTMKVT GVTTQGVKSL LTSMYVKEFL ISSSQDGHQW TLFFQNGKVK 1851 VFQGNQDSFT PVVNSLDPPL LTRYLRIHPQ SWVHQIALRM EVLGCEAQDL 1901 YDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE

1951 DPEVKFNWYV DGVEVHNАКТ KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY 2001 KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV

- 126 042955

301 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE 3 51 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM 401 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH 451 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE

501 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDVVRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT 5 51 WVHYIAAEEE DWD YAPLVLA PDDRS YKSQ Y LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY 601 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT

651 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR

701 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE 751 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL

801 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS 851 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL 901 SKNNAIEPRS FSQNGAPGTS ESATPESGPG SEPATSGSET PGTSESATPE

951 SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGTS TEPSEGSAPG SPAGSPTSTE 1001 EGTSESATPE SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGSP AGSPTSTEEG

1051 SPAGSPTSTE EGTSTEPSEG SAPGTSESAT PESGPGTSES ATPESGPGTS

1101 ESATPESGPG SEPATSGSET PGSEPATSGS ETPGSPAGSP TSTEEGTSTE

1151 PSEGSAPGTS TEPSEGSAPG SEPATSGSET PGTSESATPE SGPGTSTEPS

1201 EGSAPASSPP VLKRHQAEIT RTTLQSDQEE IDYDDTISVE MKKEDFDIYD

1251 EDENQSPRSF QKKTRHYFIA AVERLWDYGM SSSPHVLRNR AQSGSVPQFK 1301 KVVFQEFTDG SFTQPLYRGE LNEHLGLLGP YIRAEVEDNIMVTFRNQASR

1351 PYSFYS SLIS YEEDQRQGAE PRKNFVKPNE TKTYFWKVQH HMAPTKDEFD 1401 CKAWAYFSDV DLEKDVHSGL IGPLLVCHTN TLNPAHGRQV TVQEFALFFT 1451 IFDETKSWYF TENMERNCRA PCNIQMEDPT FKENYRFHAINGYIMDTLPG 1501 LVMAQDQRIR WYLLSMGSNE NIHSIHFSGH VFTVRKKEEY KMALYNLYPG 1551 VFETVEMLPS KAGIWRVECL IGEHLHAGMS TLFLVYSNKC QTPLGMASGH 1601 IRDFQITASG QYGQWAPKLA RLHYSGSINA WSTKEPFSWIKVDLLAPMII 1651 HGIKTQGARQ KFSSLYISQF IIMYSLDGKK WQTYRGNSTG TLMVFFGNVD 1701 SSGIKHNIFN PPIIARYIRL HPTHYSIRST LRMELMGCDL NSCSMPLGME

1751 SKAISDAQIT ASSYFTNMFA TWSPSKARLH LQGRSNAWRP QVNNPKEWLQ 1801 VDFQKTMKVT GVTTQGVKSL LTSMYVKEFL ISSSQDGHQW TLFFQNGKVK 1851 VFQGNQDSFT PVVNSLDPPL LTRYLRIHPQ SWVHQIALRM EVLGCEAQDL 1901 YDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE

1951 DPEVKFNWYV DGVEVHNАКТ KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY 2001 KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV

2051 KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ 2101 GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK*

- 127 042955

Белковая последовательность pSYN FVIII 266 (FVIII Fc с 42 AE-XTEN в области аминокислоты 18 и 288 АЕ XTEN в В-домене) SEQ ID NO: 112.

MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQGAP GSPAGSPTST

EEGTSESATP ESGPGSEPAT SGSETPASSS DLGELPVDAR FPPRVPKSFP

101 FNTSVVYKKT LFVEFTDHLF NIAKPRPPWM GLLGPTIQAE VYDTVVITLK

151 NMASHPVSLH AVGVSYWKAS EGAEYDDQTS QREKEDDKVF PGGSHTYVWQ 201 VLKENGPMAS DPLCLTYSYL SHVDLVKDLN SGLIGALLVC REGSLAKEKT

251 QTLHKFILLF AVFDEGKSWH SETKNSLMQD RDAASARAWP KMHTVNGYVN

301 RSLPGLIGCH RKSVYWHVIG MGTTPEVHSI FLEGHTFLVR NHRQASLEIS

351 PITFLTAQTL LMDLGQFLLF CHISSHQHDG MEAYVKVDSC PEEPQLRMKN

401 NEEAEDYDDD LTDSEMDVVR FDDDNSPSFI QIRSVAKKHP KTWVHYIAAE

451 EEDWDYAPLV LAPDDRSYKS QYLNNGPQRI GRKYKKVRFM AYTDETFKTR

501 EAIQHESGIL GPLLYGEVGD TLLIIFKNQA SRPYNIYPHG ITDVRPLYSR

551 RLPKGVKHLK DFPILPGEIF KYKWTVTVED GPTKSDPRCL TRYYS SFVNM

601 ERDLASGLIG PLLICYKESV DQRGNQIMSD KRNVILFSVF DENRSWYLTE

651 NIQRFLPNPA GVQLEDPEFQ ASNIMHSING YVFDSLQLSV CLHEVAYWYI

701 LSIGAQTDFL SVFFSGYTFK HKMVYEDTLT LFPFSGETVF MSMENPGLWI

751 LGCHNSDFRN RGMTALLKVS SCDKNTGDYY EDSYEDISAY LLSKNNAIEP

801 RSFSQNGAPG TSESATPESG PGSEPATSGS ETPGTSESAT PESGPGSEPA

851 TSGSETPGTS ESATPESGPG TSTEPSEGSA PGSPAGSPTS TEEGTSESAT

901 PESGPGSEPA TSGSETPGTS ESATPESGPG SPAGSPTSTE EGSPAGSPTS

951 TEEGTSTEPS EGSAPGTSES ATPESGPGTS ESATPESGPG TSESATPESG

1001 PGSEPATSGS ETPGSEPATS GSETPGSPAG SPTSTEEGTS TEPSEGSAPG

1051 TSTEPSEGSA PGSEPATSGS ETPGTSESAT PESGPGTSTE PSEGSAPASS

1101 PPVLKRHQAE ITRTTLQSDQ EEIDYDDTIS VEMKKEDFDIYDEDENQSPR

1151 SFQKKTRHYF IAAVERLWDY GMSSSPHVLR NRAQSGSVPQ FKKVVFQEFT

1201 DGSFTQPLYR GELNEHLGLL GPYIRAEVED NIMVTFRNQA SRPYSFYSSL

1251 ISYEEDQRQG AEPRKNFVKP NETKTYFWKV QHHMAPTKDE FDCKAWAYFS

1301 DVDLEKDVHS GLIGPLLVCH TNTLNPAHGR QVTVQEFALF FTIFDETKSW

1351 YFTENMERNC RAPCNIQMED PTFKENYRFH AINGYIMDTL PGLVMAQDQR

1401 IRWYLLSMGS NENIHSIHFS GHVFTVRKKE EYKMALYNLY PGVFETVEML

1451 PSKAGIWRVE CLIGEHLHAG MSTLFLVYSN KCQTPLGMAS GHIRDFQITA

1501 SGQYGQWAPK LARLHYSGSINAWSTKEPFS WIKVDLLAPM IIHGIKTQGA

1551 RQKFSSLYIS QFIIMYSLDG KKWQTYRGNS TGTLMVFFGN VDSSGIKHNI

1601 FNPPIIARYIRLHPTHYSIR STLRMELMGC DLNSCSMPLG MESKAISDAQ

1651 ITASSYFTNM FATWSPSKAR LHLQGRSNAW RPQVNNPKEW LQVDFQKTMK

1701 VTGVTTQGVK SLLTSMYVKE FLISSSQDGH QWTLFFQNGK VKVFQGNQDS

1751 FTPVVNSLDP PLLTRYLRIH PQSWVHQIAL RMEVLGCEAQ DLYDKTHTCP

1801 PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW

1851 YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA

1901 LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI

1951 AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV

2001 MHEALHNHYT QKSLSLSPGK *

- 128 042955

Белковая последовательность pSYN FVIII 267 (FVIII Fc с 72 AE-XTEN в области аминокислоты 18 и 288 АЕ XTEN в В-домене) SEQ ID NO: 113.

MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQGAP TSESATPESG

PGSEPATSGS ETPGTSESAT PESGPGSEPA TSGSETPGTS ESATPESGPG

101 TSTEPSEGSA PGASSSDLGE LPVDARFPPR VPKSFPFNTS VVYKKTLFVE

151 FTDHLFNIAK PRPPWMGLLG PTIQAEVYDT VVITLKNMAS HPVSLHAVGV

201 SYWKASEGAE YDDQTSQREK EDDKVFPGGS HTYVWQVLKE NGPMASDPLC 251 LTYSYLSHVD LVKDLNSGLI GALLVCREGS LAKEKTQTLH KFILLFAVFD

301 EGKSWHSETK NSLMQDRDAA SARAWPKMHT VNGYVNRSLP GLIGCHRKSV 3 51 YWHVIGMGTT PEVHSIFLEG HTFLVRNHRQ ASLEISPITF LTAQTLLMDL

401 GQFLLFCHIS SHQHDGMEAY VKVDSCPEEP QLRMKNNEEA EDYDDDLTDS 451 EMDVVRFDDD NSPSFIQIRS VAI<I<HPI<TWV HYIAAEEEDW DYAPLVLAPD 501 DRSYKSQYLN NGPQRIGRKY KKVRFMAYTD ETFKTREAIQ HESGILGPLL

51 YGEVGDTLLIIFKNQASRPY NIYPHGITDV RPL YSRRLPK GVKHLKDFPI

601 LPGEIFKYKW TVTVEDGPTK SDPRCLTRYY SSFVNMERDL ASGLIGPLLI

651 CYKESVDQRG NQIMSDKRNV ILFSVFDENR SWYLTENIQR FLPNPAGVQL

701 EDPEFQASNIMHSINGYVFD SLQLSVCLHE VAYWYILSIG AQTDFLSVFF

751 SGYTFKHKMV YEDTLTLFPF SGETVFMSME NPGLWILGCH NSDFRNRGMT

801 ALLKVSSCDK NTGDYYEDSY EDISAYLLSK NNAIEPRSFS QNGAPGTSES

851 ATPESGPGSE PATSGSETPG TSESATPESG PGSEPATSGS ETPGTSESAT

901 PESGPGTSTE PSEGSAPGSP AGSPTSTEEG TSESATPESG PGSEPATSGS

951 ETPGTSESAT PESGPGSPAG SPTSTEEGSP AGSPTSTEEG TSTEPSEGSA

1001 PGTSESATPE SGPGTSESAT PESGPGTSES ATPESGPGSE PATSGSETPG 1051 SEPATSGSET PGSPAGSPTS TEEGTSTEPS EGSAPGTSTE PSEGSAPGSE

1101 PATSGSETPG TSESATPESG PGTSTEPSEG SAPASSPPVL KRHQAEITRT

1151 TLQSDQEEID YDDTISVEMK KEDFDIYDED ENQSPRSFQK KTRHYFIAAV 1201 ERLWDYGMSS SPHVLRNRAQ SGSVPQFKKV VFQEFTDGSF TQPLYRGELN 1251 EHLGLLGPYIRAEVEDNIMV TFRNQASRPY SFYSSLISYE EDQRQGAEPR

1301 KNFVKPNETK TYFWKVQHHM APTKDEFDCK AWAYFSDVDL EKDVHSGLIG 1351 PLLVCHTNTL NPAHGRQVTV QEFALFFTIF DETKSWYFTE NMERNCRAPC 1401 NIQMEDPTFK ENYRFHAING YIMDTLPGLV MAQDQRIRW Y LLSMGSNENI 1451 HSIHFSGHVF TVRKKEEYKM ALYNLYPGVF ETVEMLPSKA GIWRVECLIG

1501 EHLHAGMSTL FLVYSNKCQT PLGMASGHIR DFQITASGQY GQWAPKLARL 1551 HYSGSINAWS TKEPFSWIKV DLLAPMIIHGIKTQGARQKF SSLYISQFII

1601 MYSLDGKKWQ TYRGNSTGTL MVFFGNVDSS GIKHNIFNPP IIARYIRLHP 1651 THYSIRSTLR MELMGCDLNS CSMPLGMESK AISDAQITAS SYFTNMFATW

1701 SPSKARLHLQ GRSNAWRPQV NNPKEWLQVD FQKTMKVTGV TTQGVKSLLT 1751 SMYVKEFLIS SSQDGHQWTL FFQNGKVKVF QGNQDSFTPV VNSLDPPLLT 1801 RYLRIHPQSW VHQIALRMEV LGCEAQDLYD KTHTCPPCPA PELLGGPSVF 1851 LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP 1901 REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP IEKTISKAKG

1951 QPREPQVYTL PPSRDELTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY 2001 KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL 2051 SLSPGK*

- 129 042955

Белковая последовательность pSYN FVIII 268 (FVIII Fc с 144 AE-XTEN в области аминокислоты 18) SEQ ID NO: 114.

MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQGAP TSESATPESG 51 PGSEPATSGS ETPGTSESAT PESGPGSEPA TSGSETPGTS ESATPESGPG

101 TSTEPSEGSA PGSPAGSPTS TEEGTSESAT PESGPGSEPA TSGSETPGTS

151 ESATPESGPG SPAGSPTSTE EGSPAGSPTS TEEGASSSDL GELPVDARFP

201 PRVPKSFPFN TSVVYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY

251 DTVVITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG 301 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE

51 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM 401 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH 451 RQASLEISPITFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE

501 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDVVRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT 551 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY 601 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT

651 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR 701 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE

751 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL 801 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS 851 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL

901 SKNNAIEPRS FSQNPPVLKR HQAEITRTTL QSDQEEIDYD DTISVEMKKE

951 DFDIYDEDEN QSPRSFQKKT RHYFIAAVER LWDYGMSSSP HVLRNRAQSG 1001 SVPQFKKVVF QEFTDGSFTQ PLYRGELNEH LGLLGPYIRA EVEDNIMVTF 1051 RNQASRPYSF YSSLISYEED QRQGAEPRKN FVKPNETKTY FWKVQHHMAP 1101 TKDEFDCKAW AYFSDVDLEK DVHSGLIGPL LVCHTNTLNP AHGRQVTVQE 1151 FALFFTIFDE TKSWYFTENM ERNCRAPCNI QMEDPTFKEN YRFHAINGYI 1201 MDTLPGLVMA QDQRIRWYLL SMGSNENIHS IHFSGHVFTV RKKEEYKMAL 1251 YNLYPGVFET VEMLPSKAGIWRVECLIGEH LHAGMSTLFL VYSNKCQTPL 1301 GMASGHIRDF QITASGQYGQ WAPKLARLHY SGSINAWSTK EPFSWIKVDL 1351 LAPMIIHGIK TQGARQKFSS LYISQFIIMY SLDGKKWQTY RGNSTGTLMV 1401 FFGNVDSSGIKHNIFNPPII ARYIRLHPTH YSIRSTLRME LMGCDLNSCS

1451 MPLGMESKAI SDAQITASSY FTNMFATWSP SKARLHLQGR SNAWRPQVNN 1501 PKEWLQVDFQ KTMKVTGVTT QGVKSLLTSM YVKEFLISSS QDGHQWTLFF 1551 QNGKVKVFQG NQDSFTPVVN SLDPPLLTRY LRIHPQSWVH QIALRMEVLG 1601 CEAQDLYDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV

1651 VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW 1701 LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SRDELTKNQV 1751 SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD 1801 KSRWQQGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK*

Белковая последовательность pSYN FVIII 269 (FVIII Fc с 72 AE-XTEN в области аминокислоты 18) SEQ ID NO: 115.

MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQGAP TSESATPESG

PGSEPATSGS ETPGTSESAT PESGPGSEPA TSGSETPGTS ESATPESGPG

101 TSTEPSEGSA PGASSSDLGE LPVDARFPPR VPKSFPFNTS VVYKKTLFVE

151 FTDHLFNIAK PRPPWMGLLG PTIQAEVYDT VVITLKNMAS HPVSLHAVGV 201 SYWKASEGAE YDDQTSQREK EDDKVFPGGS HTYVWQVLKE NGPMASDPLC

- 130 042955

251 LTYSYLSHVD LVKDLNSGLI GALLVCREGS LAKEKTQTLH KFILLFAVFD

301 EGKSWHSETK NSLMQDRDAA S ARAWPKMHT VNGYVNRSLP GLIGCHRKSV

51 YWHVIGMGTT PEVHSIFLEG HTFLVRNHRQ ASLEISPITF LTAQTLLMDL

401 GQFLLFCHIS SHQHDGMEAY VKVDSCPEEP QLRMKNNEEA EDYDDDLTDS

451 EMDVVRFDDD NSPSFIQIRS VAKKHPKTWV HYIAAEEEDW DYAPLVLAPD 501 DRSYKSQYLN NGPQRIGRKY KKVRFMAYTD ETFKTREAIQ HESGILGPLL

51 YGEVGDTLLIIFKNQASRPY NIYPHGITDV RPLYSRRLPK GVKHLKDFPI

601 LPGEIFKYKW TVTVEDGPTK SDPRCLTRYY SSFVNMERDL ASGLIGPLLI

651 CYKESVDQRG NQIMSDKRNV ILFSVFDENR SWYLTENIQR FLPNPAGVQL

701 EDPEFQASNIMHSINGYVFD SLQLSVCLHE VAYWYILSIG AQTDFLSVFF

751 SGYTFKHKMV YEDTLTLFPF SGETVFMSME NPGLWILGCH NSDFRNRGMT

801 ALLKVSSCDK NTGDYYEDSY EDISAYLLSK NNAIEPRSFS QNPPVLKRHQ

851 AEITRTTLQS DQEEIDYDDT ISVEMKKEDF DIYDEDENQS PRSFQKKTRH

901 YFIAAVERLW DYGMSSSPHV LRNRAQSGSV PQFKKVVFQE FTDGSFTQPL

951 YRGELNEHLG LLGPYIRAEV EDNIMVTFRN QASRPYSFYS SLISYEEDQR

1001 QGAEPRKNFV KPNETKTYFW KVQHHMAPTK DEFDCKAWAY FSDVDLEKDV 1051 HSGLIGPLLV CHTNTLNPAH GRQVTVQEFA LFFTIFDETK SWYFTENMER

1101 NCRAPCNIQM EDPTFKENYR FHAINGYIMD TLPGLVMAQD QRIRWYLLSM

1151 GSNENIHSIH FSGHVFTVRK KEEYKMALYN LYPGVFETVE MLPSKAGIWR

1201 VECLIGEHLH AGMSTLFLVY SNKCQTPLGM ASGHIRDFQI TASGQYGQWA

1251 PKLARLHYSG SINAWSTKEP FSWIKVDLLA PMIIHGIKTQ GARQKFSSLY

1301 ISQFIIMYSL DGKKWQTYRGNSTGTLMVFF GNVDSSGIKH NIFNPPIIAR

1351 YIRLHPTHYS IRSTLRMELM GCDLNSCSMP LGMESKAISD AQITASSYFT

1401 NMFATWSPSK ARLHLQGRSN AWRPQVNNPK EWLQVDFQKT MKVTGVTTQG

1451 VKSLLTSMYV KEFLISSSQD GHQWTLFFQN GKVKVFQGNQ DSFTPVVNSL 1501 DPPLLTRYLR IHPQSWVHQI ALRMEVLGCE AQDLYDKTHT CPPCPAPELL 1551 GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH

1601 NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT

1651 ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG

1701 QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH

1751 YTQKSLSLSP GK*

Белковая последовательность pSYNFVIII 271 (FVIII Fc с 42 AE-XTEN в области аминокислоты 18) SEQ ID NO: 116.

MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQGAP GSPAGSPTST

EEGTSESATP ESGPGSEPAT SGSETPASSS DLGELPVDAR FPPRVPKSFP

101 FNTSVVYKKT LFVEFTDHLF NIAKPRPPWM GLLGPTIQAE VYDTVVITLK

151 NMASHPVSLH AVGVSYWKAS EGAEYDDQTS QREKEDDKVF PGGSHTYVWQ 201 VLKENGPMAS DPLCLTYSYL SHVDLVKDLN SGLIGALLVC REGSLAKEKT

251 QTLHKFILLF AVFDEGKSWH SETKNSLMQD RD A AS ARA WP KMHTVNGYVN

301 RSLPGLIGCH RKSVYWHVIG MGTTPEVHSIFLEGHTFLVR NHRQASLEIS

351 PITFLTAQTL LMDLGQFLLF CHISSHQHDG MEAYVKVDSC PEEPQLRMKN

401 NEEAEDYDDD LTDSEMDVVR FDDDNSPSFI QIRSVAKKHP KTWVHYIAAE

451 EEDWDYAPLV LAPDDRSYKS QYLNNGPQRI GRI<YI<I<VRFM AYTDETFKTR

501 EAIQHESGIL GPLLYGEVGD TLLIIFKNQA SRPYNIYPHGITDVRPLYSR

- 131 042955

551 RLPKGVKHLK DFPILPGEIF KYKWTVTVED GPTKSDPRCL TRYYS SFVNM

601 ERDLASGLIG PLLICYKESV DQRGNQIMSD KRNVILFSVF DENRSWYLTE

651 NIQRFLPNPA GVQLEDPEFQ ASNIMHSING YVFDSLQLSV CLHEVAYWYI

701 LSIGAQTDFL SVFFSGYTFK HKMVYEDTLT LFPFSGETVF MSMENPGLWI 751 LGCHNSDFRN RGMTALLKVS SCDKNTGDYY EDSYEDISAY LLSKNNAIEP

801 RSFSQNPPVL KRHQAEITRT TLQSDQEEID YDDTISVEMK KEDFDIYDED

851 ENQSPRSFQK KTRHYFIAAV ERLWDYGMSS SPHVLRNRAQ SGSVPQFKKV

901 VFQEFTDGSF TQPLYRGELN EHLGLLGPYIRAEVEDNIMV TFRNQASRPY

951 SFYSSLISYE EDQRQGAEPR I<NFVI<PNETI< TYFWKVQHHM APTKDEFDCK

1001 AWAYFSDVDL EKDVHSGLIG PLLVCHTNTL NPAHGRQVTV QEFALFFTIF

1051 DETKSWYFTE NMERNCRAPC NIQMEDPTFK ENYRFHAING YIMDTLPGLV

1101 MAQDQRIRWY LLSMGSNENIHSIHFSGHVF TVRKKEEYKM ALYNLYPGVF 1151 ETVEMLPSKA GIWRVECLIG EHLHAGMSTL FLVYSNKCQT PLGMASGHIR 1201 DFQITASGQY GQWAPKLARL HYSGSINAWS TKEPFSWIKV DLLAPMIIHG 1251 IKTQGARQKF SSLYISQFIIMYSLDGKKWQ TYRGNSTGTL MVFFGNVDSS 1301 GIKHNIFNPP IIARYIRLHP THYSIRSTLR MELMGCDLNS CSMPLGMESK

1351 AISDAQITAS SYFTNMFATW SPSKARLHLQ GRSNAWRPQV NNPKEWLQVD 1401 FQKTMKVTGV TTQGVKSLLT SMYVKEFLIS SSQDGHQWTL FFQNGKVKVF 1451 QGNQDSFTPV VNSLDPPLLT RYLRIHPQSW VHQIALRMEV LGCEAQDLYD 1501 KTHTCPPCPA PELLGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP

1551 EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC

1601 KVSNKALPAP IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSRDELTKN QVSLTCLVKG

1651 FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN

1701 VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGK*

Белковая последовательность pSYN FVIII 272 (FVIII с 144 AE XTEN в области аминокислоты 18 и 244 AE XTEN в В-домене, без Fc) SEQ ID NO: 117.

MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQGAP TSESATPESG

PGSEPATSGS ETPGTSESAT PESGPGSEPA TSGSETPGTS ESATPESGPG

101 TSTEPSEGSA PGSPAGSPTS TEEGTSESAT PESGPGSEPA TSGSETPGTS

151 ESATPESGPG SPAGSPTSTE EGSPAGSPTS TEEGASSSDL GELPVDARFP

201 PRVPKSFPFN TSVVYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY

251 DTVVITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG 301 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE 351 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM 401 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH

451 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE

501 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDVVRFD DDNSPSFIQIRSVAKKHPKT

51 W VH YIA A EEE D WD Y APEVLA PDDRS YKSQ Y LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY 601 TDETFKTREA IQHESGILGP LLYGEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT

651 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR

701 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE

- 132 042955

751 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL 801 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS 851 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVS SC DKNTGDYYED SYEDISAYLL 901 SKNNAIEPRS FSQNGAPGTS ESATPESGPG SEPATSGSET PGTSESATPE

951 SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGTS TEPSEGSAPG SPAGSPTSTE 1001 EGTSESATPE SGPGSEPATS GSETPGTSES ATPESGPGSP AGSPTSTEEG

1051 SPAGSPTSTE EGTSTEPSEG SAPGTSESAT PESGPGTSES ATPESGPGTS

1101 ESATPESGPG SEPATSGSET PGSEPATSGS ETPGSPAGSP TSTEEGTSTE

1151 PSEGSAPGTS TEPSEGSAPG SEPATSGSET PGTSESATPE SGPGTSTEPS

1201 EGSAPASSPP VLKRHQAEIT RTTLQSDQEE IDYDDTISVE MKKEDFDIYD 1251 EDENQSPRSF QKKTRHYFIA AVERLWDYGM SSSPHVLRNR AQSGSVPQFK 1301 KVVFQEFTDG SFTQPLYRGE LNEHLGLLGP YIRAEVEDNIMVTFRNQASR 1351 PYSFYSSLIS YEEDQRQGAE PRKNF VKPNE TKTYFWKVQH HMAPTKDEFD 1401 CKAWAYFSDV DLEKDVHSGL IGPLLVCHTN TLNPAHGRQV TVQEFALFFT 1451 IFDETKSWYF TENMERNCRA PCNIQMEDPT FKENYRFHAINGYIMDTLPG 1501 LVMAQDQRIR WYLLSMGSNE NIHSIHFSGH VFTVRKKEEY KMALYNLYPG 1551 VFETVEMLPS KAGIWRVECLIGEHLHAGMS TLFLVYSNKC QTPLGMASGH

1601 IRDFQITASG QYGQWAPKLA RLHYSGSINA WSTKEPF SWIKVDLLAPMII 1651 HGIKTQGARQ KFSSLYISQF IIMYSLDGKK WQTYRGNSTG TLMVFFGNVD 1701 SSGIKHNIFN PPIIARYIRL HPTHYSIRST LRMELMGCDL NSCSMPLGME

1751 SKAISDAQIT ASSYFTNMFA TWSPSKARLH LQGRSNAWRP QVNNPKEWLQ 1801 VDFQKTMKVT GVTTQGVKSL LTSMYVKEFL ISSSQDGHQW TLFFQNGKVK 1851 VFQGNQDSFT PVVNSLDPPL LTRYLRIHPQ SWVHQIALRM EVLGCEAQDL 1901 Y*

Белковая последовательность pSYN VWF 031 (VWF D1D2D'D3тромбин-расщепляемый GS линкер длиной 48 AK-Fc) SEQ ID NO: 118.

MIPARFAGVL LALALILPGT LCAEGTRGRS STARCSLFGS DFVNTFDGSM

YSFAGYCSYL LAGGCQKRSF SIIGDFQNGK RVSLSVYLGE FFDIHLFVNG

101 TVTQGDQRVS MPYASKGLYL ETEAGYYKLS GEAYGFVARI DGSGNFQVLL

151 SDRYFNKTCG LCGNFNIFAE DDFMTQEGTL TSDPYDFANS WALSSGEQWC 201 ERASPPSSSC NISSGEMQKG LWEQCQLLKS TSVFARCHPL VDPEPFVALC 251 EKTLCECAGG LECACPALLE YARTCAQEGM VLYGWTDHSA CSPVCPAGME 301 YRQCVSPCAR TCQSLHINEM CQERCVDGCS CPEGQLLDEG LCVESTECPC 351 VHSGKRYPPG TSLSRDCNTC ICRNSQWICS NEECPGECLV TGQSHFKSFD 401 NRYFTFSGIC QYLLARDCQD HSFSIVIETV QCADDRDAVC TRSVTVRLPG

451 LHNSLVKLKH GAGVAMDGQD IQLPLLKGDL RIQHTVTASV RLSYGEDLQM 501 DWDGRGRLLV KLSPVYAGKT CGLCGNYNGN QGDDFLTPSG LAEPRVEDFG 551 NAWKLHGDCQ DLQKQHSDPC ALNPRMTRFS EEACAVLTSP TFEACHRAVS 601 PLPYLRNCRY DVCSCSDGRE CLCGALASYA AACAGRGVRV AWREPGRCEL

651 NCPKGQVYLQ CGTPCNLTCR SLSYPDEECN EACLEGCFCP PGLYMDERGD 701 CVPKAQCPCY YDGEIFQPED IFSDHHTMCY CEDGFMHCTM SGVPGSLLPD

- 133 042955

751 AVLSSPLSHR SKRSLSCRPP MVKLVCPADN LRAEGLECTK TCQNYDLECM 801 SMGCVSGCLC PPGMVRHENR C VALERCPCF HQGKEYAPGE TVKIGCNTC V 851 CRDRKWNCTD HVCDATCSTI GMAHYLTFDG LKYLFPGECQ YVLVQDYCGS 901 NPGTFRIL VG NKGC SHP SVK CKKRVTIL VE GGEIELFDGE VNVKRPMKDE 951 THFEVVESGR YIILLLGKAL S VVWDRHLSI SVVLKQTYQE KVCGLCGNFD 1001 GIQNNDLTSS NLQVEEDPVD FGNSWKVSSQ CADTRKVPLD SSPATCHNNI 1051 MKQTMVDSSC RILTSDVFQD CNKLVDPEPY LDVCIYDTCS CESIGDCAAF 1101 CDTIAAYAHV CAQHGKVVTW RTATLCPQSC EERNLRENGY EAEWRYNSC A 1151 PACQVTCQHP EPLACPVQCV EGCHAHCPPG KILDELLQTC VDPEDCPVCE 1201 VAGRRFASGK KVTLNPSDPE HCQICHCDVV NLTCEACQEP ISGGGGSGGG 1251 GSGGGGSGGG GSGGGGSGGG GSLVPRGSGG GGSGGGGSDK THTCPPCPAP 1301 ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSHEDPE VKFNWYVDGV 1351 EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VS VLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNK ALP API 1401 EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSRDELTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE 1451 SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV FSCSVMHEAL 1501 HNHYTQKSLS LSPGK*

Белковая последовательность pSYN VWF 034 (VWF D1D2D'D3-288AE XTEN-тромбин-расщепляемый GS линкер длиной 35 AK-Fc) SEQ ID NO: 119.

MIPARFAGVL LALALILPGT LCAEGTRGRS STARCSLFGS DFVNTFDGSM

YSFAGYCSYL LAGGCQKRSF SIIGDFQNGK RVSLSVYLGE FFDIHLFVNG 101 TVTQGDQRVS MPYASKGLYL ETEAGYYKLS GEAYGFVARI DGSGNFQVLL 151 SDRYFNKTCG LCGNFNIFAE DDFMTQEGTL TSDPYDFANS WALSSGEQWC 201 ERASPPSSSC NISSGEMQKG LWEQCQLLKS TSVFARCHPL VDPEPFVALC 251 EKTLCECAGG LECACPALLE YARTCAQEGM VLYGWTDHSA CSPVCPAGME 301 YRQCVSPCAR TCQSLHINEM CQERCVDGCS CPEGQLLDEG LCVESTECPC 351 VHSGKRYPPG TSLSRDCNTC ICRNSQWICS NEECPGECLV TGQSHFKSFD 401 NRYFTFSGIC QYLLARDCQD HSFSIVIETV QCADDRDAVC TRSVTVRLPG 451 LHNSLVKLKH GAGVAMDGQD IQLPLLKGDL RIQHTVTASV RLSYGEDLQM 501 DWDGRGRLLV KLSPVYAGKT CGLCGNYNGN QGDDFLTPSG LAEPRVEDFG 551 NAWKLHGDCQ DLQKQHSDPC ALNPRMTRFS EEACAVLTSP TFEACHRAVS 601 PLPYLRNCRY DVCSCSDGRE CLCGALASYA AACAGRGVRV AWREPGRCEL 651 NCPKGQVYLQ CGTPCNLTCR SLSYPDEECN EACLEGCFCP PGLYMDERGD 701 CVPKAQCPCY YDGEIFQPED IFSDHHTMCY CEDGFMHCTM SGVPGSLLPD 751 AVLSSPLSHR SKRSLSCRPP MVKLVCPADN LRAEGLECTK TCQNYDLECM 801 SMGCVSGCLC PPGMVRHENR CVALERCPCF HQGKEYAPGE TVKIGCNTCV 851 CRDRKWNCTD HVCDATCSTI GMAHYLTFDG LKYLFPGECQ YVLVQDYCGS 901 NPGTFRILVG NKGCSHPSVK CKKRVTILVE GGEIELFDGE VNVKRPMKDE 951 THFEVVESGR YIILLLGKAL SVVWDRHLSI SVVLKQTYQE KVCGLCGNFD 1001 GIQNNDLTSS NLQVEEDPVD FGNSWKVSSQ CADTRKVPLD SSPATCHNNI 1051 MKQTMVDSSC RILTSDVFQD CNKLVDPEPY LDVCIYDTCS CESIGDCAAF 1101 CDTIAAYAHV CAQHGKVVTW RTATLCPQSC EERNLRENGY EAEWRYNSCA 1151 PACQVTCQHP EPLACPVQCV EGCHAHCPPG KILDELLQTC VDPEDCPVCE 1201 VAGRRFASGK KVTLNPSDPE HCQICHCDVV NLTCEACQEP ISGTSESATP 1251 ESGPGSEPAT SGSETPGTSE SATPESGPGS EPATSGSETP GTSESATPES

- 134 042955

1301 GPGTSTEPSE GSAPGSPAGS PTSTEEGTSE SATPESGPGS EPATSGSETP

1351 GTSESATPES GPGSPAGSPT STEEGSPAGS PTSTEEGTST EPSEGSAPGT

1401 SESATPESGP GTSESATPES GPGTSESATP ESGPGSEPAT SGSETPGSEP

1451 ATSGSETPGS PAGSPTSTEE GTSTEPSEGS APGTSTEPSE GSAPGSEPAT

1501 SGSETPGTSE SATPESGPGT STEPSEGSAP DIGGGGGSGG GGSLVPRGSG

1551 GDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE

1601 DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY 1651 KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV

1701 KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ

1751 GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK*

Белковая последовательность pSYN VWF 036 (VWF D1D2D'D-tpom6uhрасщепляемый GS линкер длиной 98 AK-Fc) SEQ ID NO: 120.

MIPARFAGVL LALALILPGT LCAEGTRGRS STARCSLFGS DFVNTFDGSM

YSFAGYCSYL LAGGCQKRSF SIIGDFQNGK RVSLSVYLGE FFDIHLFVNG

101 TVTQGDQRVS MPYASKGLYL ETEAGYYKLS GEAYGFVARI DGSGNFQVLL

151 SDRYFNKTCG LCGNFNIFAE DDFMTQEGTL TSDPYDFANS WALSSGEQWC 201 ERASPPSSSC NISSGEMQKG LWEQCQLLKS TSVF ARCHPL VDPEPFVALC

251 EKTLCECAGG LECACPALLE YARTCAQEGM VLYGWTDHSA CSPVCPAGME

301 YRQCVSPCAR TCQSLHINEM CQERCVDGCS CPEGQLLDEG LCVESTECPC

351 VHSGKRYPPG TSLSRDCNTC ICRNSQWICS NEECPGECLV TGQSHFKSFD

401 NRYFTFSGIC QYLLARDCQD HSFSIVIETV QCADDRDAVC TRSVTVRLPG

451 LHNSLVKLKH GAGVAMDGQD IQLPLLKGDL RIQHTVTASV RLSYGEDLQM 501 DWDGRGRLLV KLSPVYAGKT CGLCGNYNGN QGDDFLTPSG LAEPRVEDFG 551 NAWKLHGDCQ DLQKQHSDPC ALNPRMTRFS EEACAVLTSP TFEACHRAVS 601 PLPYLRNCRY DVCSCSDGRE CLCGALASYA AACAGRGVRV AWREPGRCEL

651 NCPKGQVYLQ CGTPCNLTCR SLSYPDEECN EACLEGCFCP PGLYMDERGD

701 CVPKAQCPCY YDGEIFQPED IF SDHHTMCY CEDGFMHCTM SGVPGSLLPD

751 AVLSSPLSHR SKRSLSCRPP MVKLVCPADN LRAEGLECTK TCQNYDLECM

801 SMGC VSGCLC PPGMVRHENR CVALERCPCF HQGKEYAPGE TVKIGCNTCV

851 CRDRKWNCTD HVCD АТС STI GMAHYLTFDG LKYLFPGECQ YVLVQD YCGS

901 NPGTFRILVG NKGC SHP S VK CKKRVTILVE GGEIELFDGE VNVKRPMKDE

951 THFEVVESGR YIILLLGKAL SVVWDRHLSI SVVLKQTYQE KVCGLCGNFD 1001 GIQNNDLTSS NLQVEEDPVD FGNSWKVSSQ CADTRKVPLD SSPATCHNNI 1051 MKQTMVDSSC RILTSDVFQD CNKLVDPEPY LDVCIYDTCS CESIGDCAAF

1101 CDTIAAYAHV CAQHGKVVTW RTATLCPQSC EERNLRENGY EAEWRYNSCA

1151 PACQVTCQHP EPLACPVQCV EGCHAHCPPG KILDELLQTC VDPEDCPVCE

1201 VAGRRFASGK KVTLNPSDPE HCQICHCDVV NLTCEACQEP ISGGGGSGGG

1251 GSGGGGSGGG GSGGGGSGGG GSGGGGSGGG GSGGGGSGGG GSGGGGSGGG 1301 GSGGGGSGGG GSGGGGSGGG GSLVPRGSGG GGSGGGGSDK THTCPPCPAP 1351 ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSHEDPE VKFNWYVDGV 1401 EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKALPAPT 1451 EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSRDELTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE

1501 SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV FSCSVMHEAL 1551 HNHYTQKSLS LSPGK*

- 135 042955

Белковая последовательность pSYN Fc-015 (Fc-домен IgG) SEQ ID NO: 121.

METDTLLLWV LLLWVPGSTG DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT

LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY

101 RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT

151 LPPSRDELTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS

201 DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK*

Пример 15.

Гетеродимеры FVIII-XTEN-Fc:VWF-Fc сохраняли нормальную FVШ-специфическую активность по сравнению с BDD-FVIII дикого типа. Определили FVШ-специфическую активность гетеродимеров FVIII-XTEN-Fc:VWF-Fc. Гетеродимеры очищали с помощью двухэтапного хроматографического процесса. Использовали анионообменную смолу для слабых анионов, а затем аффинную хроматографию. Конечный очищенный продукт обладал приемлемой чистотой согласно эксклюзионной ВЭЖХ. Удельная активность была сопоставима с активностью FVIII с удаленным В-доменом (BDD-FVIII) согласно измерению с помощью хромогенного анализа FVIII и концентрации А280. Данные представлены в табл. 26. Все протестированные молекулы продемонстрировали FVIII-специфическую активность, сопоставимую с активностью BDD-FVIII. Чистоту и присутствие каждого фрагмента указанных молекул подтверждали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ и вестерн-блоттинга.

Таблица 26

FVIII-специфическая активность гетеродимеров FVIII-XTEN-Fc:VWF-Fc

Конструкт	FVIII 207 scBDDFVHI	FVH1-66 dcRDD FVIII)	FVIII 155/ vWF31	FVIII 155/ vWF39	FVIII 169/ vWF31	FVIII 205/ vWF31	FVIII 169/ vWF34
Измененная удельная активность (МЕ/нмоль)	1473	1592	1534	1796	1511	1345	1505

Сравнивали периоды полужизни rFVIII-XTEN/D'D3 и BDD-FVIII у мышей HemA (фиг. 15; табл. 27). Как показано на фиг. 15, rFVIII-XTEN/D'D3 достигал периода полужизни, четырехкратно превышающего период полужизни, достигнутый BDD-FVIII.

Таблица 27 rFVIII-XTEN/D’D3 и BDD-FVIII у мышей HemA

Обработка	5-минутное восстановление СУ	HE (ч)	MRT (ч)	Cl (мл/ч/кг)	Vss (мл/кг)	EUIKD (ч*кг*мМЕ/ мл/мМЕ)
BDD-FVIII	89	7,6	11	4,5	49,2	0,22
rFVIIIFc	78	16	20	2,9	57,8	0,35
rFVIII- XTEN/DD3	86	30	36	1,8	63,4	0,57

Пример 16. Эффективность гетеродимера FVIII-XTEN-Fc:VWF-Fc (активность FVIII) при гемостазе согласно измерению с помощью одноэтапного анализа аЧТВ.

Эффективность гетеродимеров FVIII-XTEN-Fc:VWF-Fc при гемостазе оценивали по их FVIII-специфической аЧТВ-активности; сводные данные представлены в табл. 28. Как продемонстрировано в табл. 28, хотя добавление фрагмента D'D3 VWF и внедрение XTEN в пределах доменов FVIII снижало FVIII-специфическую аЧТВ-активность гетеродимеров (согласно данным FVIII155/VWF031 и данным FVIII205/VWF031), вставки XTEN в области В-домена FVIII или С-конца фрагмента D'D3 VWF не оказывали негативного влияния на aFVIII-специфическую аЧТВ-активность (согласно данным FVIII169/VWF031 и данным FVIII169/VWF034). По сравнению с двуцепочечным BDD-FVIII (dcBDD-FVIII), FVIII155/VWF031, FVIII169/VWF031, FVIII169/VWF034 и VWF205/VWF031 демонстрировали снижение удельной аЧТВ-активности в 2,5, 2,8, 2,6 и 5,5 раза соответственно.

Таблица 28

FVIII-специфическая аЧТВ-активность гетеродимеров FVIII-XTEN-Fc:VWF-Fc

Конструкт	FVIII 207 scBDD- FVIU	FVIII-66 dcBDDFVTTI	FVIII 155/ VWF31	FVIII 169 /VWF31	FVIII 205 / VWF31	FVIII 169/ VWF34
Измеренная удельная аЧТВактивность (МЕ^нмоль)	818± 153	1188±213	448 ± 111	416±70	214 ± 38	436 ±189

FVIII-специфический анализ аЧТВ.

Варианты FVIII разбавляли буфером для определения аЧТВ (0,15 М NaCl, 0,05 М трис-HCl, 1%

- 136 042955

БСА, pH 7,4) в линейном аналитическом диапазоне (200-1,6 мЕ/мл). 50 мкл разбавленных образцов или стандартов последовательно смешивали с 50 мкл наивной объединенной плазмы человека с HemA при 37°С, 50 мкл аЧТВ-реагента (ACTIN® FSL-активированного цефалопластинового реагента - Dade Behring, регистрационный номер В4219-2) при 37°С и инкубировали при 37°С в течение 4 мин. Для запуска реакций свертывания к реакционной смеси добавляли 50 мкл 20 мМ CaCl₂ (Dade Behring [регистрационный номер ORFO37]). На основании времени свертывания каждого образца (продолжительность времени от добавления CaCl₂ до начала образования тромба) рассчитывали аЧТВ-активность по сравнению со стандартом, полученным с использованием концентрата 8-го международного стандарта FVIII. Удельную аЧТВ-активность рассчитывали в зависимости от концентрации белка каждой молекулы, которую измеряли по OD280.

Пример 17. Эффективность гетеродимера FVIII-XTEN-Fc:VWF-Fc гетеродимера in vivo в модели кровотечения при обрезке хвоста мышей HemA.

Для дальнейшей оценки эффективности гетеродимеров при гемостазе оценивали острую эффективность FVIII169/VWF034 и FVIII205/VWF031 по сравнению с BDD-FVIII в модели кровотечения при обрезке хвоста мышей HemA. Мышей HemA обрабатывали посредством разовой в/в инъекции BDD-FVIII в дозе 200, 65 и 20 МЕ/кг для определения контрольного уровня кровопотери после обрезки хвоста. Кровопотерю у мышей, получавших 200 МЕ/кг FVIII169/VWF034 или FVIII205/VWF031, сравнивали с кровопотерей у контрольной группы мышей, получавших BDD-FVIII, для оценки их эффективности при гемостазе. Животных, получавших носитель, использовали для определения исходной кровопотери в данной модели. Как показано на фиг. 16, во всех группах, получавших FVIII, наблюдалось значительное снижение кровопотери по сравнению с животными, получавшими носитель (р<0,05). Как FVIII169/VWF034, так и FVIII205/VWF031 являлись эффективными в модели обрезки хвоста мышей HemA. По сравнению с BDD-FVIII, наблюдали приблизительно 3-кратное снижение эффективности для FVIII169/VWF034 согласно аналогичному снижению кровопотери, достигаемому за счет 65 МЕ/кг BDD-FVIII и 200 МЕ/кг FVIII169/VWF034. Как и для FVIII205/VWF034, наблюдали 10-кратное снижение эффективности согласно аналогичному снижению кровопотери, достигаемому за счет 20 МЕ/кг BDD-FVIII и 200 МЕ/кг FVIII205/VWF031. Даже несмотря на аналогичную удельную хромогенную FVIII-активность FVIII69/VWF034 и FVIII205/VWF031 по сравнению с rBDD-FVIII их аЧТВ-активность FVIII и эффективность in vivo снижались вследствие модификации молекул. Указанные данные показывают, что аЧТВ-активность молекул FVIII представляет собой более точный прогностический показатель их эффективности при гемостазе in vivo, чем хромогенная FVIII-активность.

Модель кровотечения при обрезке хвоста мышей HemA.

В данном исследовании использовали самцов мышей HemA в возрасте 8-10 недель. Перед обрезкой хвоста мышей анестезировали с помощью смеси 50 мг/кг кетамина/0,5 мг/кг дексмедетомидина и помещали на грелку-подушку при 37°С для поддержания температуры тела. Затем хвосты мышей погружали в воду, нагретую до 37°С, на 10 мин для расширения боковой вены. После расширения вены вводили инъекцию rFVIII или раствора носителя в хвостовую вену и через 5 мин отрезали дистальные 1 см хвоста скальпелем № 11 с прямым краем. Пролитую кровь собирали в 13 мл физиологического раствора, нагретого до 37°С в течение 30 мин, и подвергали анестезированных мышей эвтаназии путем двусторонней торакотомии. Кровопотерю (в граммах) количественно определяли гравиметрически по изменению массы пробирки для отбора крови до и после отбора крови, а затем переводили в миллилитры (мл) объема кровопотери (1 г изменения массы=1 мл кровопотери).

Приведенное выше описание конкретных вариантов реализации настолько полно раскрывает общий характер изобретения, что посторонние лица легко могут, применяя знания в данной области техники, модифицировать и/или адаптировать такие конкретные варианты реализации для различных областей применения без чрезмерного экспериментирования, не отходя от общей концепции настоящего изобретения. Следовательно, такие адаптации и модификации должны находиться в рамках описанных вариантов реализации, основываясь на информации и рекомендациях, представленных в настоящем документе. Следует понимать, что фразеология или терминология, приведенная в настоящем документе, предназначена для цели описания, а не для ограничения, поэтому специалист должен интерпретировать терминологию или фразеологию настоящего описания в свете указанной информации и рекомендаций.

Для специалистов в данной области техники после рассмотрения описания и вариантов реализации настоящего изобретения, описанных в настоящем документе, будут очевидны другие варианты реализации настоящего изобретения. Предполагается, что описание и примеры следует рассматривать лишь в качестве типичных образцов, а подлинные рамки и суть изобретения указаны в следующей формуле изобретения. Все патенты и публикации, цитируемые в настоящем документе, полностью включены в него посредством ссылок.

Claims (50)

1. Способ лечения заболевания или состояния, связанного с кровотечениями, у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение эффективного количества фармацевтической композиции, содер-

- 137 042955 жащей (а) химерный белок, содержащий (i) фрагмент фактора фон Виллебранда (VWF), содержащий домен D' и домен D3 фактора фон Виллебранда, (ii) первую удлиненную полипептидную последовательность XTEN, и (ii i) белок фактора VIII (FVIII); и (b) фармацевтически приемлемый носитель;

при этом VWF фрагмент и первая последовательность XTEN связаны, причем VWF фрагмент или первая последовательность XTEN связана с белком FVIII; и причем (a) VWF фрагмент содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 100;

(b) белок FVIII содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6; или белок FVIII содержит тяжелую цепь и легкую цепь, где тяжелая цепь белка FVIII содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотам 1-745 последовательности SEQ ID NO: 4, и легкая цепь белка FVIII содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотам 1649-2332 последовательности SEQ ID NO: 4; и (c) первая последовательность XTEN содержит аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136 или SEQ ID NO: 137.

2. Способ по п.1, в котором химерный белок содержит (a) единственную полипептидную цепь, содержащую VWF фрагмент, последовательность XTEN и белок FVIII; или (b) две полипептидные цепи, содержащие первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь, где первая полипептидная цепь содержит белок FVIII, а вторая полипептидная цепь содержит VWF фрагмент и последовательность XTEN.

3. Способ по п.1 или 2, в котором химерный белок дополнительно содержит (iv) константную область иммуноглобулина (Ig) или ее часть, связанную либо с VWF фрагментом, первой последовательностью XTEN, либо с белком FVIII или их любой комбинацией.

4. Способ лечения заболевания или состояния, связанного с кровотечениями, у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей химерный белок и фармацевтически приемлемый носитель, причем химерный белок содержит формулу, включающую (a) V-X-FVIII, (b) FVIII-X-V, (c) V-X:FVIII, (d) X-V:FVIII, (e) FVII:IV-X, (f) FVIII:X-V, (g) V-L2-X-L1-F1:FVIII-L3-F2, (h) V-L2-X-L1-F1:F2-L3-FVIII, (i) F1-L1-X-L2-V:FVIII-L3-F2, (j) F1-L1-X-L2-V:F2-L3-FVIII, (k) V-L2-X-L1-F1-L4-FVIII-L3-F2, (l) F2-L3-FVIII-L4-F1-L1-X-L2-V, (m) FVIII-L3-F2-L4-V-L2-X-L1-F1, и (n) F1-L1-X-L2-V-L4-F2-L3-FVIII, где V содержит VWF фрагмент, каждый из L1, L2 и L3 содержит линкер,

L4 представляет собой линкер,

FVIII содержит белок FVIII,

X содержит одну или более последовательностей XTEN,

F1 содержит константную область Ig или ее часть,

F2 содержит дополнительную константную область Ig или ее часть, (-) представляет собой пептидную связь или одну или более аминокислот, и (:) представляет собой ковалентную связь или нековалентную связь.

5. Способ по п.3 или 4, отличающийся тем, что константная область Ig или ее часть содержит первую область Fc, которая связана с последовательностью XTEN или VWF фрагментом.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что константная область Ig или ее часть связана с последовательностью XTEN линкером.

- 138 042955

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что указанный линкер включает расщепляемый линкер.

8. Способ по любому из пп.3-7, в котором химерный белок содержит также дополнительную константную область Ig или ее часть.

9. Способ по п.8, отличающийся тем, что дополнительная константная область Ig или ее часть содержит вторую область Fc.

10. Способ по п.9, отличающийся тем, что дополнительная константная область Ig или ее часть связана с белком FVIII.

11. Способ по п.9 или 10, отличающийся тем, что вторая область Fc дополнительно связана с VWF фрагментом линкером.

12. Способ по любому из пп.8-11, отличающийся тем, что дополнительная константная область Ig или ее часть связана с константной областью Ig или ее частью.

13. Способ по п.12, отличающийся тем, что дополнительная константная область Ig или ее часть связана с константной областью Ig или ее частью ковалентной связью.

14. Способ по п.13, отличающийся тем, что указанная ковалентная связь представляет собой дисульфидную связь.

15. Способ по любому из пп.1-14, отличающийся тем, что VWF фрагмент связан с белком FVIII нековалентной связью.

16. Способ по любому из пп.4-15, который также содержит вторую последовательность XTEN, соединенную с белком FVIII линкером на N-конце или С-конце белка FVIII или встроенную непосредственно ниже от одного или более сайтов встраивания в белке FVIII.

17. Способ лечения заболевания или состояния, связанного с кровотечениями, у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей химерный белок и фармацевтически приемлемый носитель, причем химерный белок содержит формулу, включающую (1) FVIII(X1)-L 1-F1 :V-L2-X2-L3-F2, (2) FVIIl(x1)-L 1 -F1 :F2-L3 -X2-L2-V, (3) F1-L1 -FVIII(X1):V-L2-X2-L3 -F2, (4) F1-L1 -FVIIl(x1):F2-L3 -X2-L2-V, (5) FVIII(X1)-L 1 -F1-L4-V-L2-X2-L3 -F2, (6) FVIIl(x1)-L 1 -F1-L4-F2-L3-X2-L2-V, (7) F1-L1-FVIII(X1)-L4-V-L2-X2-L3-F2, или (8) F1-L1-FVIIl(x1)-L4-F2-L3-X2-L2-V, где FVIII(X1) содержит белок FVIII и последовательность XTEN, при этом указанная последовательность XTEN связана с N-концом или С-концом белка FVIII или встроена непосредственно ниже одной или более аминокислот (один или более сайтов встраивания) в белке FVIII, каждый из L1, L2 и L3 представляет собой линкер,

L4 представляет собой линкер,

Х2 содержит одну или более последовательностей XTEN,

F1 содержит константную область Ig или ее часть,

F2 содержит дополнительную константную область Ig или ее часть, и

V содержит VWF фрагмент, (-) представляет собой пептидную связь или одну или более аминокислот, и (:) содержит ковалентную связь или нековалентную связь.

18. Способ по любому из пп.8-17, отличающийся тем, что константная область Ig или ее часть и дополнительная константная область Ig или ее часть являются одинаковыми или разными.

19. Способ лечения заболевания или состояния, связанного с кровотечениями, у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей химерный белок и фармацевтически приемлемый носитель, причем химерный белок содержит первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь, при этом указанная первая полипептидная цепь содержит белок FVIII и первую константную область Ig или ее часть и указанная вторая полипептидная цепь содержит VWF фрагмент, первую последовательность XTEN и вторую константную область Ig или ее часть; и причем (a) VWF фрагмент содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 100;

(b) белок FVIII содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6; или белок FVIII содержит тяжелую цепь и легкую цепь, где тяжелая цепь белка FVIII содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотам 1-740 последовательности SEQ ID NO: 4, и легкая цепь белка FVIII содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотам 1649-2332 последовательности SEQ ID NO: 4; и (с) первая последовательность XTEN содержит аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 154,

- 139 042955

SEQ ID NO: 155 или SEQ ID NO: 156.

20. Способ лечения заболевания или состояния, связанного с кровотечениями, у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей химерный белок и фармацевтически приемлемый носитель, причем химерный белок содержит первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь, при этом указанная первая полипептидная цепь содержит фрагмент VWF, первую последовательность XTEN, первую константную область Ig или ее часть и указанная вторая полипептидная цепь содержит белок FVIII, вторую последовательность XTEN и вторую константную область Ig или ее часть; и причем (a) VWF фрагмент содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 100;

(b) белок FVIII содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6; или белок FVIII содержит тяжелую цепь и легкую цепь, где тяжелая цепь белка FVIII содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотам 1-740 последовательности SEQ ID NO: 4, и легкая цепь белка FVIII содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотам 1649-2332 последовательности SEQ ID NO: 4; и (c) первая последовательность XTEN содержит аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155 или SEQ ID NO: 156.

21. Способ по п.20, отличающийся тем, что вторая последовательность XTEN встроена в один или более сайтов встраивания в белке FVIII, выбранных из группы, состоящей из аминокислотных остатков в табл. 7, 8, 9 и 10.

22. Способ по любому из пп.1-21, отличающийся тем, что белок FVIII содержит домен В или его часть.

23. Способ по п.22, отличающийся тем, что белок FVIII представляет собой FVIII с делецией домена SQ В.

24. Способ по п.21, отличающийся тем, что белок FVIII (i) содержит домен В или его часть; или (ii) белок FVIII представляет собой FVIII с делецией домена SQ В, причем вторая последовательность XTEN встроена в домен В или его часть.

25. Способ по любому из пп.1-24, отличающийся тем, что белок FVIII содержит одноцепочечный FVIII и указанный одноцепочечный FVIII содержит по меньшей мере одну замену аминокислоты в остатке, соответствующем остатку 1648, остатку 1645 или обоим в полноразмерном зрелом полипептиде FVIII (SEQ ID NO: 4), или остатку 754, остатку 751 или обоим в SQ BDD FVIII (SEQ ID NO: 6).

26. Способ по любому из пп.1-25, отличающийся тем, что VWF фрагмент содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичную аминокислотам с 764 по 1240 последовательности SEQ ID NO: 2.

27. Способ по п.26, отличающийся тем, что VWF фрагмент по существу состоит из или состоит из аминокислот с 764 по 1240 последовательности SEQ ID NO: 2.

28. Способ по любому из пп.1-27, отличающийся тем, что VWF фрагмент содержит замену остатка, соответствующего остатку 1099, остатку 1142 или как остатку 1099, так и остатку 1142 последовательности SEQ ID NO: 2, аминокислотой, отличной от цистеина.

29. Способ по любому из пп.1-28, отличающийся тем, что VWF фрагмент по существу состоит из или состоит из домена D' и домена D3 фактора фон Виллебранда или их фрагментов.

30. Способ по любому из пп.1-28, отличающийся тем, что VWF фрагмент не содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (1) аминокислот 1241-2813 последовательности SEQ ID NO: 2, (2) аминокислот 1270-2813 последовательности SEQ ID NO: 2, (3) аминокислот 1271-2813 последовательности SEQ ID NO: 2, (4) аминокислот 1272-2813 последовательности SEQ ID NO: 2, (5) аминокислот 1273-2813 последовательности SEQ ID NO: 2, (6) аминокислот 1274-2813 последовательности SEQ ID NO: 2, и любых их комбинаций.

31. Способ по любому из пп.1-28, отличающийся тем, что VWF фрагмент не содержит аминокислоты 1274-2813 последовательности SEQ ID NO: 2.

32. Способ по любому из пп.1-31, отличающийся тем, что первая последовательность XTEN содержит по меньшей мере один мотив, выбранный из табл. 2А.

33. Способ по любому из пп.1-32, отличающийся тем, что первая последовательность XTEN содержит АЕ42, АЕ72, АЕ864, АЕ576, АЕ288, АЕ144, AG864, AG576, AG288 или AG144.

34. Способ по любому из пп.1-33, отличающийся тем, что заболевание или состояние, связанное с кровотечениями, представляет собой гемофилию А.

35. Способ лечения заболевания или состояния, связанного с кровотечениями, у субъекта, нуждаю-

- 140 042955 щегося в этом, включающий введение эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей химерный белок и фармацевтически приемлемый носитель, причем химерный белок содержит (a) первый полипептид, содержащий (i) фрагмент фактора фон Виллебранда (VWF), содержащий домен D' и домен D3 VWF, (ii) первую последовательность XTEN, и (iii) первую область Fc; и (b) второй полипептид, содержащий (i) белок фактора VIII (FVIII), и (ii) вторую область Fc, причем VWF фрагмент и первая последовательность XTEN связаны пептидной связью, причем VWF фрагмент содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 100, причем полипептид FVIII содержит аминокислоты 1-745 и 1649-2332 полноразмерного зрелого фактора VIII человека (SEQ ID NO: 4), и причем первая последовательность XTEN содержит аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 131.

36. Способ по п.35, отличающийся тем, что первая область Fc связана со второй областью Fc ковалентной связью.

37. Способ по п.35 или 36, отличающийся тем, что первая область Fc связана с первой последовательностью XTEN линкером.

38. Способ по п.37, отличающийся тем, что указанный линкер включает расщепляемый тромбином линкер.

39. Способ по п.36, отличающийся тем, что указанная ковалентная связь представляет собой дисульфидную связь.

40. Способ по п.39, отличающийся тем, что первая область Fc ассоциирована со второй областью Fc двумя дисульфидными связями.

41. Способ по любому из пп.35-40, отличающийся тем, что второй полипептид дополнительно содержит вторую XTEN.

42. Способ по п.41, отличающийся тем, что вторая XTEN встроена непосредственно ниже одного или более сайтов встраивания в белке FVIII.

43. Способ по п.41 или 42, отличающийся тем, что вторая XTEN встроена в белке FVIII непосредственно ниже сайта встраивания, соответствующего остатку 745 полноразмерного зрелого фактора VIII человека (SEQ ID NO: 4).

44. Способ по любому из пп.41-43, отличающийся тем, что первая последовательность XTEN связана с С-концом VWF фрагмента и первая область Fc связана с С-концом первой последовательности XTEN расщепляемым тромбином линкером, причем вторая область Fc связана с С-концом белка FVIII.

45. Способ по пп.35-44, отличающийся тем, что первая область Fc и вторая область Fc являются идентичными.

46. Способ по любому из пп.35-45, отличающийся тем, что белок FVIII содержит домен В или его часть.

47. Способ по любому из пп.35-46, отличающийся тем, что VWF фрагмент содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 99% идентична аминокислотам с 764 по 1240 последовательности SEQ ID NO: 2.

48. Способ по любому из пп.35-47, отличающийся тем, что VWF фрагмент содержит замену остатка, соответствующего остатку 1099, остатку 1142 или как остатку 1099, так и остатку 1142 аминокислотой последовательности SEQ ID NO: 2, отличной от цистеина.

49. Способ по любому из пп.35-48, отличающийся тем, что заболевание или состояние, связанное с кровотечениями, представляет собой гемофилию А.

50. Способ по любому из пп.35-49, отличающийся тем, что композицию вводят путем внутривенного введения.