KR20210091243A - 단백질 시퀀싱을 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

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카스렌 크로치
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Abstract

본 출원의 측면은 단백질, 폴리펩티드, 및 아미노산을 확인하고 시퀀싱하는 방법, 및 그에 유용한 조성물을 제공한다. 일부 측면에서, 본 출원은 폴리펩티드의 분해 프로세스 동안 데이터를 수득하고, 폴리펩티드를 대표하는 서열을 출력하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 본 출원은 폴리펩티드 시퀀싱 반응에서 광안정성을 향상시키는 차폐 요소를 포함하는 아미노산 인식 분자를 제공한다.

Description

단백질 시퀀싱을 위한 방법 및 조성물
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 9월 27일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/907,507, 및 2018년 11월 15일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/768,076에 대해 35 U.S.C. § 119(e) 하의 우선권을 주장하며, 이들의 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
단백질체학은 생물학적 시스템의 연구에서 게놈학 및 전사체학에 대한 중요하고 필수적인 보완물로서 부상되었다. 개별적인 유기체의 프로테옴 분석은 개선된 진단 및 치료 전략을 발생시키는 세포적 프로세스 및 반응 패턴으로의 통찰을 제공할 수 있다. 단백질 구조, 조성, 및 변형을 둘러싼 복잡성은 생물학적 샘플에 대한 대규모 단백질 시퀀싱 정보를 결정하는데 있어서 도전을 제시한다.
일부 측면에서, 본 출원은 폴리펩티드로부터 아미노산 서열 정보를 결정하기 위한 (예를 들어, 1개 이상의 폴리펩티드를 시퀀싱하기 위한) 방법 및 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열 정보는 단일 폴리펩티드 분자에 대해 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 예를 들어 단일 폴리펩티드 분자에 대해 폴리펩티드에서의 2개 이상의 아미노산의 상대 위치가 결정된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 1개 이상의 아미노산은 표지되고 (예를 들어, 직접적으로 또는 간접적으로), 폴리펩티드에서의 표지된 아미노산의 상대 위치가 결정된다.
일부 측면에서, 본 출원은 폴리펩티드의 분해 프로세스 동안 데이터를 수득하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 데이터를 분석하여 분해 프로세스 동안 폴리펩티드의 말단에서 순차적으로 노출된 아미노산에 상응하는 데이터의 부분을 결정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 폴리펩티드를 대표하는 아미노산 서열을 출력하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 데이터는 분해 프로세스 동안 폴리펩티드의 말단에서의 아미노산 동일성을 지시한다. 일부 실시양태에서, 데이터는 분해 프로세스 동안 말단에서의 말단 아미노산의 상이한 유형에 결합하는 1개 이상의 아미노산 인식 분자에 의해 생성된 신호를 지시한다. 일부 실시양태에서, 데이터는 분해 프로세스 동안 생성된 발광 신호를 지시한다. 일부 실시양태에서, 데이터는 분해 프로세스 동안 생성된 전기 신호를 지시한다.
일부 실시양태에서, 데이터를 분석하는 것은 일련의 절단 사건을 검출하고, 연속적인 절단 사건 사이의 데이터의 부분을 결정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 데이터를 분석하는 것은 개별적인 부분의 각각에 대한 아미노산의 유형을 결정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 개별적인 부분의 각각은 펄스 패턴 (예를 들어, 특징적인 패턴)을 포함하고, 데이터를 분석하는 것은 그의 각각의 펄스 패턴에 기반하여 부분 중 1개 이상에 대한 아미노산의 유형을 결정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산의 유형을 결정하는 것은 데이터가 역치 값 초과인 경우에 부분 내의 시간의 양을 확인하고, 시간의 양을 부분에 대한 시간의 지속기간과 비교하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산의 유형을 결정하는 것은 1개 이상의 부분의 각각에 대한 적어도 하나의 펄스 지속기간을 확인하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산의 유형을 결정하는 것은 1개 이상의 부분의 각각에 대한 적어도 하나의 펄스간 지속기간을 확인하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 부분에 상응하는 일련의 아미노산을 포함한다.
일부 측면에서, 본 출원은 적어도 1개의 하드웨어 프로세서, 및 적어도 1개의 하드웨어 프로세서에 의해 실행되는 경우, 적어도 1개의 하드웨어 프로세서가 본 출원에 따른 방법을 수행하도록 하는 프로세서-실행가능 명령을 저장하는 적어도 1개의 비-일시적 컴퓨터-판독가능 저장 매체를 포함하는 시스템을 제공한다. 일부 측면에서, 본 출원은 적어도 1개의 하드웨어 프로세서에 의해 실행되는 경우, 적어도 1개의 하드웨어 프로세서가 본 출원에 따른 방법을 수행하도록 하는 프로세서-실행가능 명령을 저장하는 적어도 1개의 비-일시적 컴퓨터-판독가능 저장 매체를 제공한다.
일부 측면에서, 본 출원은 폴리펩티드 시퀀싱의 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 단일 폴리펩티드 분자를 1개 이상의 말단 아미노산 인식 분자와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 1개 이상의 말단 아미노산 인식 분자와, 그것이 분해되고 있는 동안 단일 폴리펩티드 분자의 말단에서 노출된 연속적인 아미노산의 회합을 지시하는 일련의 신호 펄스를 검출하며, 그에 의해 단일 폴리펩티드 분자에 관한 서열 정보를 수득하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 폴리펩티드 분자의 대부분 또는 전부의 아미노산 서열이 결정된다. 일부 실시양태에서, 일련의 신호 펄스는 일련의 실시간 신호 펄스이다.
일부 실시양태에서, 1개 이상의 말단 아미노산 인식 분자와 말단에서 노출된 아미노산의 각각의 유형의 회합은 말단에서 노출된 아미노산의 다른 유형과는 상이한 일련의 신호 펄스에서의 특징적인 패턴을 생성한다. 일부 실시양태에서, 특징적인 패턴의 신호 펄스는 말단 아미노산 인식 분자 및 말단에서 노출된 아미노산 사이의 개별적인 회합 사건에 상응한다. 일부 실시양태에서, 특징적인 패턴은 단일 폴리펩티드 분자의 말단에서 노출된 아미노산과의 일련의 가역적인 말단 아미노산 인식 분자 결합 상호작용에 상응한다. 일부 실시양태에서, 특징적인 패턴은 단일 폴리펩티드 분자의 말단에서 노출된 아미노산 및 인접 위치에서의 아미노산 (예를 들어, 동일한 유형 또는 상이한 유형의 아미노산)을 지시한다.
일부 실시양태에서, 단일 폴리펩티드 분자는 단일 폴리펩티드 분자의 말단으로부터 1개 이상의 아미노산을 제거하는 절단 시약에 의해 분해된다. 일부 실시양태에서, 방법은 절단 시약과 말단의 회합을 지시하는 신호를 검출하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 절단 시약은 검출가능한 표지 (예를 들어, 발광 표지, 전도율 표지)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 폴리펩티드 분자는 표면에 고정화된다. 일부 실시양태에서, 단일 폴리펩티드 분자는 1개 이상의 말단 아미노산 인식 분자가 회합하는 말단에 대해 원위인 말단 단부를 통해 표면에 고정화된다. 일부 실시양태에서, 단일 폴리펩티드 분자는 링커 (예를 들어, 생체분자를 포함하는 가용화 링커)를 통해 표면에 고정화된다.
일부 측면에서, 본 출원은 반응 혼합물 중의 단일 폴리펩티드 분자를 1개 이상의 말단 아미노산 인식 분자 및 절단 시약를 포함하는 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는 폴리펩티드를 시퀀싱하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 절단 시약의 존재 하에서 1개 이상의 말단 아미노산 인식 분자와 단일 폴리펩티드 분자의 말단의 회합을 지시하는 일련의 신호 펄스를 검출하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 일련의 신호 펄스는 절단 시약에 의한 말단 아미노산 절단의 결과로서 시간 경과에 따른 말단에서 노출된 일련의 아미노산을 지시한다.
일부 측면에서, 본 출원은 (a) 단일 폴리펩티드 분자의 말단에서 제1 아미노산을 확인하고, (b) 제1 아미노산을 제거하여 단일 폴리펩티드 분자의 말단에서 제2 아미노산을 노출시키고, (c) 단일 폴리펩티드 분자의 말단에서 제2 아미노산을 확인하는 것을 포함하는, 폴리펩티드를 시퀀싱하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, (a)-(c)는 단일 반응 혼합물에서 수행된다. 일부 실시양태에서, (a)-(c)는 순차적으로 일어난다. 일부 실시양태에서, (c)는 (a) 및 (b) 전에 일어난다. 일부 실시양태에서, 단일 반응 혼합물은 1개 이상의 말단 아미노산 인식 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 반응 혼합물은 절단 시약을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 아미노산은 절단 시약에 의해 제거된다. 일부 실시양태에서, 방법은 단일 폴리펩티드 분자의 말단에서 1개 이상의 아미노산을 제거하고 확인하는 단계를 반복하며, 그에 의해 단일 폴리펩티드 분자의 서열 (예를 들어, 부분적 서열 또는 완전한 서열)을 결정하는 것을 추가로 포함한다.
일부 측면에서, 본 출원은 단일 폴리펩티드 분자를 단일 폴리펩티드 분자에 결합하는 1개 이상의 아미노산 인식 분자와 접촉시키는 것을 포함하는, 폴리펩티드의 아미노산을 확인하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 폴리펩티드 분해 조건 하에서 1개 이상의 아미노산 인식 분자와 단일 폴리펩티드 분자의 회합을 지시하는 일련의 신호 펄스를 검출하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 일련의 신호 펄스에서의 제1 특징적인 패턴에 기반하여 단일 폴리펩티드 분자에서의 아미노산의 제1 유형을 확인하는 것을 추가로 포함한다.
일부 측면에서, 본 출원은 폴리펩티드의 말단 아미노산 (예를 들어, N-말단 또는 C-말단 아미노산)을 확인하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 폴리펩티드를 폴리펩티드의 말단에서 말단 아미노산의 1개 이상의 유형에 선택적으로 결합하는 1개 이상의 표지된 친화도 시약 (예를 들어, 1개 이상의 아미노산 인식 분자)과 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 폴리펩티드와 1개 이상의 표지된 친화도 시약의 상호작용을 검출함으로써 폴리펩티드의 말단에서 말단 아미노산을 확인하는 것을 추가로 포함한다.
추가의 다른 측면에서, 본 출원은 에드만(Edman)-유형 분해 반응에 의한 폴리펩티드 시퀀싱의 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 에드만-유형 분해 반응은 검출 또는 절단 중 어느 하나의 목적을 위해 (예를 들어, 단일 반응 혼합물을 사용한 검출 및 절단을 포함할 수 있는 동적 시퀀싱 반응에 비해) 폴리펩티드를 상이한 반응 혼합물과 접촉시킴으로써 수행될 수 있다.
따라서, 일부 측면에서, 본 출원은 (i) 폴리펩티드를 폴리펩티드의 말단에서 말단 아미노산의 1개 이상의 유형에 선택적으로 결합하는 1개 이상의 표지된 친화도 시약과 접촉시키는 것을 포함하는, 폴리펩티드의 아미노산 서열을 결정하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 (ii) 폴리펩티드와 1개 이상의 표지된 친화도 시약의 상호작용을 검출함으로써 폴리펩티드의 말단에서 말단 아미노산 (예를 들어, N-말단 또는 C-말단 아미노산)을 확인하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 (iii) 말단 아미노산을 제거하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 (iv) (i) 내지 (iii)을 폴리펩티드의 말단에서 1회 이상 반복하여 폴리펩티드의 아미노산 서열을 결정하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 (i) 후에 및 (ii) 전에, 말단 아미노산에 선택적으로 결합하지 않는 1개 이상의 표지된 친화도 시약 중 임의의 것을 제거하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 (ii) 후에 및 (iii) 전에, 말단 아미노산에 선택적으로 결합하는 1개 이상의 표지된 친화도 시약 중 임의의 것을 제거하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 말단 아미노산을 제거하는 것 (예를 들어, (iii))은 말단 아미노산을 이소티오시아네이트 (예를 들어, 페닐 이소티오시아네이트)와 접촉시킴으로써 말단 아미노산을 변형시키고, 변형된 말단 아미노산을 변형된 말단 아미노산에 특이적으로 결합하고 이를 제거하는 프로테아제와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서 말단 아미노산을 절단하는 것 (예를 들어, (iii))은 말단 아미노산을 이소티오시아네이트와 접촉시킴으로써 말단 아미노산을 변형시키고, 변형된 말단 아미노산을 변형된 말단 아미노산을 제거하는데 충분한 산성 또는 염기성 조건으로 처리하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 말단 아미노산을 확인하는 것은 말단 아미노산을 1개 이상의 표지된 친화도 시약이 결합하는 말단 아미노산의 1개 이상의 유형 중 하나의 유형인 것으로서 확인하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 말단 아미노산을 확인하는 것은 말단 아미노산을 1개 이상의 표지된 친화도 시약이 결합하는 말단 아미노산의 1개 이상의 유형 이외의 유형인 것으로서 확인하는 것을 포함한다.
일부 측면에서, 본 출원은 예를 들어, 폴리펩티드 시퀀싱 반응에서 향상된 광안정성을 위한 차폐 요소를 포함하는 아미노산 인식 분자를 제공한다. 일부 측면에서, 본 출원은 화학식 (I)의 아미노산 인식 분자를 제공한다:
A-(Y)n-D
(I)
여기서: A는 적어도 1개의 아미노산 인식 분자를 포함하는 아미노산 결합 성분이고; Y의 각각의 경우는 공유 또는 비-공유 연결기를 형성하는 중합체이고; n은 1 내지 10 (경계값 포함)의 정수이고; D는 적어도 1개의 검출가능한 표지를 포함하는 표지 성분이다. 일부 실시양태에서, D는 200 Å 미만의 직경이다. 일부 실시양태에서, -(Y)n-은 적어도 2 nm의 길이 (예를 들어, 적어도 5 nm, 적어도 10 nm, 적어도 20 nm, 적어도 30 nm, 적어도 50 nm, 또는 그 초과의 길이)이다. 일부 실시양태에서, -(Y)n-은 is 약 2 nm 내지 약 200 nm의 길이 (예를 들어, 약 2 nm 내지 약 100 nm, 약 5 nm 내지 약 50 nm, 또는 약 10 nm 내지 약 100 nm의 길이)이다. 일부 실시양태에서, Y의 각각의 경우는 독립적으로 생체분자 또는 수지상 중합체 (예를 들어, 폴리올, 덴드리머)이다. 일부 실시양태에서, 본 출원은 화학식 (I)의 아미노산 인식 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 인식 분자는 조성물에서 가용성이다.
일부 측면에서, 본 출원은 화학식 (II)의 아미노산 인식 분자를 제공한다:
A-Y1-D
(II)
여기서: A는 적어도 1개의 아미노산 인식 분자를 포함하는 아미노산 결합 성분이고; Y1은 핵산 또는 폴리펩티드이고; D는 적어도 1개의 검출가능한 표지를 포함하는 표지 성분이다. 일부 실시양태에서, Y1이 핵산인 경우, 핵산은 공유 또는 비-공유 연결기를 형성한다. 일부 실시양태에서, 단, Y1이 폴리펩티드인 경우, 폴리펩티드는 50 × 10-9 M 미만의 해리 상수 (KD)를 특징으로 하는 비-공유 연결기를 형성한다. 일부 실시양태에서, KD는 1 × 10-9 M 미만, 1 × 10-10 M 미만, 1 × 10-11 M 미만, 또는 1 × 10-12 M 미만이다.
일부 측면에서, 본 출원은 핵산; 핵산 상의 제1 부착 부위에 부착된 적어도 1개의 아미노산 인식 분자; 및 핵산 상의 제2 부착 부위에 부착된 적어도 1개의 검출가능한 표지를 포함하고, 여기서 핵산이 적어도 1개의 아미노산 인식 분자 및 적어도 1개의 검출가능한 표지 사이에 공유 또는 비-공유 연결기를 형성하는 것인 아미노산 인식 분자를 제공한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 제1 올리고뉴클레오티드 가닥을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 제1 올리고뉴클레오티드 가닥과 혼성화된 제2 올리고뉴클레오티드 가닥을 추가로 포함한다.
일부 측면에서, 본 출원은 적어도 2개의 리간드-결합 부위를 포함하는 다가 단백질; 단백질 상의 제1 리간드-결합 부위에 결합된 제1 리간드 모이어티를 통해 단백질에 부착된 적어도 1개의 아미노산 인식 분자; 및 단백질 상의 제2 리간드-결합 부위에 결합된 제2 리간드 모이어티를 통해 단백질에 부착된 적어도 1개의 검출가능한 표지를 포함하는 아미노산 인식 분자를 제공한다. 일부 실시양태에서, 다가 단백질은 아비딘 단백질이다.
일부 실시양태에서, 차폐된 아미노산 인식 분자는 본 출원에 따른 폴리펩티드 시퀀싱 방법, 또는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 사용될 수 있다. 따라서, 일부 측면에서, 본 출원은 폴리펩티드 분자를 본 출원의 1개 이상의 차폐된 아미노산 인식 분자와 접촉시키는 것을 포함하는, 폴리펩티드 시퀀싱의 방법 (예를 들어, 에드만-유형 분해 반응에서, 동적 시퀀싱 반응, 또는 관련 기술분야에 공지된 다른 방법에서)을 제공한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 방법은 폴리펩티드 분자를 본 출원에 따른 차폐물 또는 차폐 요소를 포함하는 적어도 1개의 아미노산 인식 분자와 접촉시키고, 적어도 1개의 아미노산 인식 분자와 폴리펩티드 분자의 회합을 검출하는 것을 포함한다.
일부 측면에서, 본 출원은 혼합된 샘플에서 관심의 단백질을 확인하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 혼합된 단백질 샘플을 절단하여 복수개의 폴리펩티드 단편을 생성하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 본 출원의 방법에 따른 방법에서 복수개 중 적어도 1개의 폴리펩티드 단편의 아미노산 서열을 결정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 아미노산 서열이 관심의 단백질에 대해 고유하게 확인가능한 경우, 혼합된 샘플에서 관심의 단백질을 확인하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 혼합된 샘플에서 관심의 단백질을 확인하는 방법은 혼합된 단백질 샘플을 절단하여 복수개의 폴리펩티드 단편을 생성하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 복수개의 폴리펩티드 단편에서의 아미노산의 1개 이상의 유형을 1개 이상의 상이한 발광 표지로 표지하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 복수개 중 적어도 1개의 표지된 폴리펩티드에 대해 시간 경과에 따라 발광을 측정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 검출된 발광에 기반하여 적어도 1개의 표지된 폴리펩티드의 아미노산 서열을 결정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 아미노산 서열이 관심의 단백질에 대해 고유하게 확인가능한 경우, 혼합된 샘플에서 관심의 단백질을 확인하는 것을 추가로 포함한다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본 출원에 따라 분석되는 관심의 폴리펩티드 분자 또는 단백질은 혼합된 또는 정제된 샘플의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 관심의 폴리펩티드 분자 또는 단백질은 생물학적 샘플 (예를 들어, 혈액, 조직, 타액, 소변, 또는 다른 생물학적 공급원)로부터 수득된다. 일부 실시양태에서, 관심의 폴리펩티드 분자 또는 단백질은 환자 샘플 (예를 들어, 인간 샘플)로부터 수득된다.
본 발명의 특정 실시양태의 상세사항은 하기 기재된 바와 같은 특정 실시양태의 상세한 설명에 제시된다. 본 발명의 다른 특색, 목적, 및 이점은 정의, 실시예, 도면, 및 청구범위로부터 명백할 것이다.
통상의 기술자는 본원에 기재된 도면이 단지 예시 목적을 위한 것임을 이해할 것이다. 일부의 경우, 본 발명의 다양한 측면은 본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해 과장되거나 확대되어 나타내어질 수 있음이 이해되어야 한다. 도면에서, 비슷한 참조 부호는 일반적으로 다양한 도면 전반에 걸쳐 비슷한 특색, 기능적으로 유사하고/거나 구조적으로 유사한 요소를 지칭한다. 도면은 반드시 일정한 비율이지는 않으며, 본 개시내용의 원리를 예시할 때 대신 강조가 두어진다. 도면은 본 교시내용의 범주를 어떠한 식으로도 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
본 발명의 특색 및 이점은 도면과 함께 취할 경우에 하기 제시된 상세한 설명으로부터 보다 명백하게 될 것이다.
도면을 참조로 실시양태를 기재할 때, 방향 언급 ("위", "아래", "상부", "하부", "좌측", "우측", "수평", "수직" 등)이 사용될 수 있다. 이러한 언급은 단지 정상적인 배향에서 도면을 보는 독자에게 보조인 것으로 의도된다. 이들 방향적 언급은 구현된 장치의 바람직한 또는 유일한 배향을 기재하는 것으로 의도되지 않는다. 장치는 다른 배향에서 구현될 수 있다.
상세한 설명으로부터 명백한 바와 같이, 도면에 도시되고 본 출원 전반에 걸쳐 예시의 목적을 위해 추가로 기재된 실시예는 비-제한적 실시양태를 기재하며, 일부의 경우에 보다 명백한 예시의 목적을 위해 특정 프로세스를 단순화하거나 특색 또는 단계를 생략할 수 있다.
도 1a-1b는 단일 분자 결합 상호작용의 검출 (도 1a) 및 분석 (도 1b)에 의한 폴리펩티드 시퀀싱의 예를 나타낸다.
도 1c-1e는 본 출원에 따른 표지된 친화도 시약 및 사용 방법의 다양한 예를 나타낸다. 도 1c는 말단 아미노산의 1개 이상의 유형에 선택적으로 결합하는 표지된 효소 및 표지된 압타머를 비롯한 표지된 친화도 시약의 예시 배열을 도시한다. 도 1d는 표지된 친화도 시약을 사용한 폴리펩티드 시퀀싱의 분해-기반 프로세스를 일반적으로 도시한다. 도 1e는 말단 아미노산 검출, 변형, 및 절단의 반복된 사이클에 의한 표지된 압타머를 사용한 폴리펩티드 시퀀싱의 예를 나타낸다.
도 2는 각각 말단 아미노산의 상이한 유형에 선택적으로 결합하고 이를 절단하는 표지된 엑소펩티다제를 사용한 실시간으로의 폴리펩티드 시퀀싱의 예를 나타낸다.
도 3a-3b는 말단 및/또는 내부 아미노산과 표지된 친화도 시약 및 표지된 절단 시약 (예를 들어, 표지된 비-특이적 엑소펩티다제)의 결합 상호작용을 평가하는 것에 의한 실시간으로의 폴리펩티드 시퀀싱의 예를 나타낸다. 도 3a는 신호 출력에서 일련의 펄스를 검출하는 것에 의한 실시간 시퀀싱의 예를 나타낸다. 도 3b는 온도-의존성 시퀀싱 프로세스를 개략적으로 도시한다.
도 4는 말단 및 내부 아미노산과 표지된 친화도 시약 및 표지된 비-특이적 엑소펩티다제의 결합 상호작용을 평가하는 것에 의한 실시간으로의 폴리펩티드 시퀀싱의 예를 나타낸다.
도 5a-5e는 차폐 요소를 통해 표지된 친화도 시약의 비-제한적 예를 나타낸다. 도 5a는 통상적인 공유 연결을 통해 표지된 친화도 시약으로의 단일-분자 펩티드 시퀀싱을 예시한다. 도 5b는 차폐 요소를 포함하는 친화도 시약으로의 단일-분자 펩티드 시퀀싱을 예시한다. 도 5c-5e는 본 출원에 따른 차폐 요소의 다양한 예를 예시한다.
도 6은 표지된 폴리펩티드에서 검출된 아미노산의 고유한 조합에 기반하여 폴리펩티드를 확인하는 것의 예를 나타낸다.
도 7은 말단 아미노산 변형 및 절단의 반복된 사이클로 처리된 표지된 폴리펩티드의 발광을 측정하는 것에 의한 폴리펩티드 시퀀싱의 예를 나타낸다.
도 8a-8c는 표지된 폴리펩티드의 진행적인 효소적 절단에 의한 폴리펩티드 시퀀싱의 예를 나타낸다. 도 8a는 고정화된 말단 펩티다제에 의한 표지된 폴리펩티드의 진행적인 효소적 절단에 의한 시퀀싱의 예를 나타낸다. 도 8b는 말단 펩티다제에 의한 고정화된 표지된 폴리펩티드의 진행적인 효소적 절단에 의한 시퀀싱의 예를 나타낸다. 도 8c는 도 8b에 따라 수행된 실시간 시퀀싱 프로세스의 예를 개략적으로 예시한다.
도 9는 고정화된 ATP-의존성 프로테아제, 공여자-표지된 ATP, 및 폴리펩티드 기질의 수용자-표지된 아미노산을 사용한 보조인자-기반 FRET에 의한 시퀀싱의 예를 개략적으로 예시한다.
도 10a-10c는 본 출원에 따른 폴리펩티드 및 단백질의 분석을 위한 샘플 및 샘플 웰 표면을 제조하는 것의 다양한 예를 나타낸다. 도 10a는 단백질 샘플로부터 말단 변형된 폴리펩티드를 제조하는 것의 예시 프로세스를 일반적으로 도시한다. 도 10b는 가용화 링커를 폴리펩티드에 접합시키는 것의 예시 프로세스를 일반적으로 도시한다. 도 10c는 하부 표면에의 단일 분자 고정화를 촉진시키는데 사용될 수 있는 변형된 표면을 갖는 샘플 웰의 예시 개략도를 나타낸다.
도 11은 본원에 기재된 기술의 일부 실시양태에 따른, 폴리펩티드 분해 프로세스 동안 수득된 데이터를 분석하기 위한 예시적인 서열 데이터 프로세싱 파이프라인의 도해이다.
도 12는 본원에 기재된 기술의 일부 실시양태에 따른, 폴리펩티드 분자의 아미노산 서열을 결정하기 위한 예시적인 프로세스의 흐름도이다.
도 13은 본원에 기재된 기술의 일부 실시양태에 따른, 폴리펩티드를 대표하는 아미노산 서열을 결정하기 위한 예시적인 프로세스의 흐름도이다.
도 14는 본원에 기재된 기술의 일부 실시양태를 실행하는데 사용될 수 있는 예시적인 컴퓨터 시스템의 블록 도해이다.
도 15a-15c는 상이한 가용화 링커에 의해 제공된 향상된 용해도에 대해 제조되고 평가된 선택 펩티드-링커 접합체에 대한 실험 데이터를 나타낸다. 도 15a는 합성되고 평가된 펩티드-링커 접합체의 예시 구조를 나타낸다. 도 15b는 N-말단에서의 펩티드 절단을 입증하는 LCMS로부터의 결과를 나타낸다. 도 15c는 로딩 실험으로부터의 결과를 나타낸다.
도 16은 실험 결과에 기반한 선택 엑소펩티다제에 대한 아미노산 절단 활성의 요약을 나타낸다.
도 17a-17c는 말단 아미노산을 검출하고 절단하기 위한 염료/펩티드 접합체 검정에 대한 실험 데이터를 나타낸다. 도 17a는 염료/펩티드 접합체 검정을 수행하는데 사용되는 예시 스킴 및 구조를 나타낸다. 도 17b는 칩상 검정에서 샘플 웰 내로의 펩티드-링커 접합체 로딩에 대한 영상화 결과를 나타낸다. 도 17c는 펩티드-접합체 로딩 및 말단 아미노산 절단을 검출한 예시 신호 트레이스를 나타낸다.
도 18a-18f는 말단 아미노산을 검출하고 절단하기 위한 FRET 염료/펩티드 접합체 검정에 대한 실험 데이터를 나타낸다. 도 18a는 FRET 염료/펩티드 접합체 검정을 수행하는데 사용되는 예시 스킴 및 구조를 나타낸다. 도 18b는 상이한 시점에 대한 FRET 영상화 결과를 나타낸다. 도 18c는 상이한 시점에서의 커팅 효율을 나타낸다. 도 18d는 상이한 시점의 각각에서 제시된 커팅을 나타낸다. 도 18e는 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis)로부터의 프롤린 이미노펩티다제 (yPIP)로의 상이한 시점에 대한 추가적인 FRET 영상화 결과를 나타낸다. 도 18f는 비브리오 프로테올리티쿠스(Vibrio proteolyiticus)로부터의 아미노펩티다제 (VPr)로의 상이한 시점에 대한 FRET 영상화 결과를 나타낸다.
도 19a-19h는 표지된 친화도 시약에 의한 말단 아미노산 식별에 대한 실험 데이터를 나타낸다. 도 19a는 이들 실험을 위해 표지된 ClpS2 단백질의 결정 구조를 나타낸다. 도 19b는 표지된 ClpS2 단백질에 의한 N-말단 아미노산 식별을 예시하는 단일 분자 강도 트레이스를 나타낸다. 도 19c는 상이한 말단 아미노산에 대한 평균 펄스 지속기간을 나타내는 플롯이다. 도 19d는 상이한 말단 아미노산에 대한 평균 펄스간 지속기간을 나타내는 플롯이다. 도 19e는 상이한 말단 아미노산 중에서의 식별자 펄스 지속기간을 추가로 예시하는 플롯을 나타낸다. 도 19f, 19g, 및 19h는 써모시노코쿠스 엘론가투스(Thermosynochoccus elongatus)로부터의 ClpS 단백질 (teClpS)에 의한 류신 인식을 입증하는 체류 시간 분석으로부터의 예시 결과를 나타낸다. 도 19i는 에이. 투메파시엔스(A. tumefaciens) ClpS1에 의한 페닐알라닌, 류신, 트립토판, 및 티로신의 구별가능한 인식을 입증하는 체류 시간 분석으로부터의 예시 결과를 나타낸다. 도 19j는 에스. 엘론가투스 ClpS2에 의한 류신 인식을 입증하는 체류 시간 분석으로부터의 예시 결과를 나타낸다. 도 19k-19l은 GID4에 의한 프롤린 인식을 입증하는 체류 시간 분석으로부터의 예시 결과를 나타낸다.
도 20a-20d는 동일한 반응 혼합물 중의 표지된 ClpS2 인식 단백질 및 아미노펩티다제 절단 시약을 사용하여 실시간으로 수행된 폴리펩티드 시퀀싱 반응으로부터의 예시 결과를 나타낸다. 도 20a는 제1 시퀀싱 반응에 대한 신호 트레이스 데이터를 나타낸다. 도 20b는 도 20a에 나타내어진 신호 트레이스 데이터에 대한 펄스 지속기간 통계를 나타낸다. 도 20c는 제2 시퀀싱 반응에 대한 신호 트레이스 데이터를 나타낸다. 도 20d는 도 20c에 나타내어진 신호 트레이스 데이터에 대한 펄스 지속기간 통계를 나타낸다.
도 21a-21f는 표지된 엑소펩티다제에 의한 말단 아미노산 확인 및 절단에 대한 실험 데이터를 나타낸다. 도 21a는 이들 실험을 위해 부위-특이적으로 표지된 프롤린 이미노펩티다제 (yPIP)의 결정 구조를 나타낸다. 도 21b는 정제된 단백질 생성물에 대한 표지화의 정도를 나타낸다. 도 21c는 yPIP의 부위-특이적 표지화를 확인하는 SDS 페이지의 영상이다. 도 21d는 부위-특이적 표지화를 확인하는 SDS 페이지 겔의 과노출된 영상이다. 도 21e는 표지된 단백질 생성물의 순도를 확인하는 쿠마시(Coomassie) 염색된 겔의 영상이다. 도 21f는 표지된 엑소펩티다제의 절단 활성을 입증하는 HPLC 트레이스이다. 서열 YPYPYPK는 서열식별번호(SEQ ID NO): 82에 상응한다. 서열 PYPYPK는 서열식별번호: 83에 상응한다.
도 22a-22f는 특이적 번역후 변형을 함유하는 아미노산의 인식을 평가하는 실험으로부터의 데이터를 나타낸다. 도 22a는 SH2 도메인-함유 단백질에 의한 포스포-티로신 인식을 입증한 대표적인 트레이스를 나타내고; 도 22b는 도 22a의 트레이스에 상응하는 펄스 지속기간 데이터를 나타내고; 도 22c는 트레이스에 대해 결정된 통계를 나타낸다. 도 22d-22f는 음성 대조군 실험으로부터의 대표적인 트레이스를 나타낸다.
도 23은 펄스 지속기간에 대한 전종단 아미노산의 효과를 평가하는 실험으로부터의 중위 펄스 지속기간을 나타내는 플롯이다.
도 24a-24c는 차등적으로 표지된 인식 분자에 의한 동시 아미노산 인식을 평가하는 실험으로부터의 데이터를 나타낸다. 도 24a는 대표적인 트레이스를 나타낸다. 도 24b는 각각의 인식 분자에 대한 이들 실험 동안 수득된 펄스 지속기간 데이터를 비교하는 플롯이다. 도 24c는 이들 실험에 대한 펄스 지속기간 통계를 나타낸다.
도 25a-25c는 단일-분자 인식 동안 펩티드의 광안정성을 평가하는 실험으로부터의 데이터를 나타낸다. 도 25a는 아미노산 결합 부위로부터 ~2 nm인 염료로 표지된 atClpS2-V1을 사용한 인식으로부터의 대표적인 트레이스를 나타낸다. 도 25b는 이들 실험에 사용된 ClpS2 단백질의 구조의 가시화를 나타낸다. 도 25c는 DNA/단백질 링커를 통해 아미노산 결합 부위로부터 >10 nm인 염료로 표지된 ClpS2를 사용한 인식으로부터의 대표적인 트레이스를 나타낸다.
도 26a-26d는 아미노펩티다제 절단 시약의 존재 하에서 DNA/스트렙타비딘 링커를 통해 표지된 ClpS2 인식 단백질을 사용하여 상보적인 금속-옥시드-반도체 (CMOS) 칩 상에서 실시간으로 수행된 폴리펩티드 시퀀싱 반응으로부터의 대표적인 트레이스를 나타낸다.
도 27은 피로코쿠스 호리코쉬이(Pyrococcus horikoshii) TET 아미노펩티다제 절단 시약의 존재 하에서 DNA/스트렙타비딘 링커를 통해 표지된 atClpS2-V1 인식 단백질을 사용하여 실시간으로 수행된 폴리펩티드 시퀀싱 반응으로부터의 대표적인 트레이스를 나타낸다.
도 28a-28j는 차등적인 절단 특이성을 갖는 엑소펩티다제의 다중 유형을 사용하여 실시간으로 수행된 폴리펩티드 시퀀싱 반응으로부터의 대표적인 트레이스 데이터를 나타낸다. 도 28a는 hTET 엑소펩티다제로 수행된 반응으로부터의 대표적인 트레이스를 나타내며, 확대된 펄스 패턴 영역은 도 28b에 나타내어진다. 도 28a에서의 서열 YAAWAAFADDDWK는 서열식별번호: 78에 상응한다. 도 28c는 hTET 및 yPIP 엑소펩티다제 둘 다로 수행된 반응으로부터의 대표적인 트레이스를 나타내며, 확대된 펄스 패턴 영역은 도 28d에 나타내어지고, 추가적인 대표적인 트레이스는 도 28e에 나타내어진다. 도 28c에서의 서열 FYPLPWPDDDYK는 서열식별번호: 80에 상응한다. 도 28f는 hTET 및 yPIP 엑소펩티다제 둘 다로 수행된 추가의 반응으로부터의 대표적인 트레이스를 나타내며, 확대된 펄스 패턴 영역은 도 28g에 나타내어지고, 추가적인 대표적인 트레이스는 도 28h에 나타내어진다. 도 28i는 PfuTET 및 yPIP 엑소펩티다제 둘 다로 수행된 반응으로부터의 대표적인 트레이스를 나타내며, 확대된 펄스 패턴 영역은 도 28j에 나타내어진다. 도 28f 및 28i에서의 서열 YPLPWPDDDYK는 서열식별번호: 81에 상응한다.
본 출원의 측면은 단백질 시퀀싱 및 확인 방법, 폴리펩티드 시퀀싱 및 확인 방법, 아미노산 확인 방법, 및 이러한 방법을 수행하기 위한 조성물에 관한 것이다.
일부 측면에서, 본 출원은 소수의 장치 변형을 갖거나 전혀 갖지 않는 기존의 분석 기기를 사용하여 실행될 수 있는 폴리펩티드 시퀀싱 기법의 발견에 관한 것이다. 예를 들어, 이전의 폴리펩티드 시퀀싱 전략은 분석되는 폴리펩티드를 함유하는 반응 용기를 통한 상이한 시약 혼합물의 반복적인 사이클링을 포함하였다. 이러한 전략은 시약 사이클링이 가능한 유동 셀 또는 유사한 장치가 구비되지 않을 수 있는, 기존의 분석 기기, 예컨대 핵산 시퀀싱 기기의 변형을 요구할 수 있다. 본 발명자들은 본 출원의 특정 폴리펩티드 시퀀싱 기법이 반복적인 시약 사이클링을 요구하지 않으며, 그에 의해 기기 크기를 증가시킬 수 있는 상당한 변형 없이 기존의 기기의 사용을 허용함을 인식하고 인지하였다. 따라서, 일부 측면에서, 본 출원은 보다 작은 시퀀싱 기기의 사용을 허용하는 폴리펩티드 시퀀싱 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 본 출원은 게놈 및 프로테옴 분석 둘 다가 동일한 시퀀싱 기기를 사용하여 수행되는 것을 허용하는 폴리펩티드 시퀀싱 기법의 발견에 관한 것이다.
본 발명자들은 차등적인 결합 상호작용이 폴리펩티드 시퀀싱에서 통상적인 표지화 전략에 대한 추가적인 또는 대안적인 접근법을 제공할 수 있음을 추가로 인식하고 인지하였다. 통상적인 폴리펩티드 시퀀싱은 아미노산의 각각의 유형을 고유하게 확인가능한 표지로 표지하는 것을 포함할 수 있다. 이 프로세스는 그의 다중 번역후 변이 외에도 천연 발생 아미노산의 적어도 20가지 상이한 유형이 있기 때문에, 수고롭고 오류를 유발할 수 있다. 일부 측면에서, 본 출원은 아미노산의 상이한 유형과 차등적으로 회합하여 폴리펩티드의 아미노산 서열을 지시하는 검출가능한 특징적인 특징을 생성하는 아미노산 인식 분자의 사용을 포함하는 기법의 발견에 관한 것이다. 따라서, 본 출원의 측면은 특정 통상적인 폴리펩티드 시퀀싱 접근법에 사용되는 폴리펩티드 표지화 및/또는 가혹한 화학 시약을 요구하지 않으며, 그에 의해 샘플로부터 수득된 서열 정보의 처리량 및/또는 정확도를 증가시키는 기법을 제공한다.
일부 측면에서, 본 출원은 폴리펩티드 시퀀싱 반응이 단지 단일 반응 혼합물을 사용하여 (예를 들어, 반응 용기를 통한 반복적인 시약 사이클링을 요구하지 않으면서) 실시간으로 모니터링될 수 있다는 발견에 관한 것이다. 상기 상세화된 바와 같이, 통상적인 폴리펩티드 시퀀싱 반응은 폴리펩티드를 상이한 시약 혼합물에 노출시켜 아미노산 검출 및 아미노산 절단의 단계 사이를 사이클링하는 것을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 측면에서, 본 출원은 실시간으로 진행중인 분해 반응 전반에 걸친 아미노산 검출에 의한 폴리펩티드의 분석을 허용하는 차세대 시퀀싱에 있어서의 진보에 관한 것이다. 동적 시퀀싱에 의한 이러한 폴리펩티드 분석을 위한 접근법은 하기 기재된다.
본원에 기재된 바와 같이, 일부 측면에서, 본 출원은 폴리펩티드 분해 프로세스 동안 데이터를 수득하고, 데이터를 분석하여 분해 프로세스 동안 폴리펩티드의 말단에서 순차적으로 노출된 아미노산에 상응하는 데이터의 부분을 결정함으로써 폴리펩티드를 시퀀싱하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 데이터의 부분은 1개 이상의 아미노산 인식 분자와 (예를 들어, 분해 동안) 폴리펩티드의 말단에서 노출된 연속적인 아미노산의 회합을 지시하는 일련의 신호 펄스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 일련의 신호 펄스는 분해 프로세스 동안 폴리펩티드의 말단에서의 일련의 가역적인 단일 분자 결합 상호작용에 상응한다.
폴리펩티드 분해 프로세스 동안 단일 분자 결합 상호작용을 검출하는 것에 의한 폴리펩티드 시퀀싱의 비-제한적 예는 도 1a에 개략적으로 예시된다. 예시 신호 트레이스 (I)는 신호의 변화에 상응하는 시간에서의 상이한 회합 사건을 도시하는 일련의 패널 (II)로 나타내어진다. 나타내어진 바와 같이, 아미노산 인식 분자 (반점 형상) 및 폴리펩티드의 말단에서의 아미노산 (줄 상의 비드로서 나타내어짐) 사이의 회합 사건은 시간의 지속기간 동안 지속하는 신호의 규모의 변화를 생성한다.
패널 (A) 및 (B)는 아미노산 인식 분자 및 폴리펩티드의 말단에서 노출된 제1 아미노산 (예를 들어, 제1 말단 아미노산) 사이의 상이한 회합 사건을 도시한다. 각각의 회합 사건은 회합 사건의 지속기간 동안 지속하는 신호의 규모의 변화를 특징으로 하는 신호 트레이스 (I)의 변화를 생성한다. 따라서, 패널 (A) 및 (B)의 회합 사건 사이의 시간 지속기간은 폴리펩티드가 아미노산 인식 분자와 검출가능하게 회합되지 않는 시간의 지속기간에 상응할 수 있다.
패널 (C) 및 (D)는 아미노산 인식 분자 및 폴리펩티드의 말단에서 노출된 제2 아미노산 (예를 들어, 제2 말단 아미노산) 사이의 상이한 회합 사건을 도시한다. 본원에 기재된 바와 같이, 폴리펩티드의 말단에서 "노출된" 아미노산은 폴리펩티드에 여전히 부착되고, 분해 동안 앞의 말단 아미노산의 제거 시 말단 아미노산이 되는 (예를 들어, 단독으로 또는 1개 이상의 추가적인 아미노산과 함께) 아미노산이다. 따라서, 일련의 패널 (II)의 제1 및 제2 아미노산은 폴리펩티드의 말단에서 노출된 연속적인 아미노산의 예시적인 예를 제공하고, 여기서 제2 아미노산은 제1 아미노산의 제거 시 말단 아미노산이 되었다.
일반적으로 도시된 바와 같이, 패널 (C) 및 (D)의 회합 사건은 패널 (A) 및 (B)의 그것보다 상대적으로 더 짧은 시간 지속기간 동안 지속하는 규모의 변화를 특징으로 하는 신호 트레이스 (I)의 변화를 생성하고, 패널 (C) 및 (D)의 회합 사건 사이의 시간 지속기간은 패널 (A) 및 (B)의 그것보다 상대적으로 더 짧다. 본원에 기재된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 신호의 이러한 독특한 변화 중 하나 또는 둘 다는 아미노산의 상이한 유형 사이에 식별할 수 있는 신호 트레이스 (I)에서의 특징적인 패턴을 결정하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나의 특징적인 패턴으로부터 또 다른 것으로의 전이는 아미노산 절단을 지시한다. 본원에 사용된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 아미노산 절단은 폴리펩티드의 말단으로부터의 적어도 1개의 아미노산의 제거 (예를 들어, 폴리펩티드로부터의 적어도 1개의 말단 아미노산의 제거)를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 절단은 특징적인 패턴 사이의 시간 지속기간에 기반한 추론에 의해 결정된다. 일부 실시양태에서, 아미노산 절단은 표지된 절단 시약과 폴리펩티드의 말단에서의 아미노산의 회합에 의해 생성된 신호의 변화를 검출함으로써 결정된다. 아미노산은 분해 동안 폴리펩티드의 말단으로부터 순차적으로 절단되기 때문에, 규모의 일련의 변화, 또는 일련의 신호 펄스가 검출된다. 일부 실시양태에서, 신호 펄스 데이터는 도 1b에 예시된 바와 같이 분석될 수 있다.
일부 실시양태에서, 역치 수준을 신호 데이터의 1개 이상의 파라미터에 적용함으로써, 신호 데이터를 분석하여 신호 펄스 정보를 추출할 수 있다. 예를 들어, 패널 (III)은 예시 신호 트레이스 (I)의 신호 데이터에 적용된 역치 규모 수준 ("ML")을 도시한다. 일부 실시양태에서, ML은 시간의 지점에서 검출된 신호 및 데이터의 주어진 세트에 대해 결정된 기준선 사이의 최소 차이이다. 일부 실시양태에서, 신호 펄스 ("sp")는 ML을 초과하고 시간의 지속기간 동안 지속하는 규모의 변화를 지시하는 데이터의 각각의 부분에 할당된다. 일부 실시양태에서, 역치 시간 지속기간은 신호 펄스가 그 부분에 할당되는지 여부를 결정하기 위해 ML을 충족시키는 데이터의 부분에 적용될 수 있다. 예를 들어, 실험 인공물은 요망되는 신뢰도로 신호 펄스를 할당하는데 충분한 시간의 지속기간 동안 지속하지 않는 ML을 초과하는 규모의 변화를 발생시킬 수 있다 (예를 들어, 아미노산 유형에 대해 비-차별적일 수 있는 일시적 회합 사건, 비-특이적 검출 사건, 예컨대 관찰 영역 내로의 확산 또는 관찰 영역 내에서의 시약 적층). 따라서, 일부 실시양태에서, 신호 펄스는 역치 규모 수준 및 역치 시간 지속기간에 기반하여 신호 데이터로부터 추출된다.
추출된 신호 펄스 정보는 예시적인 목적을 위해 덧붙여진 예시 신호 트레이스 (I)를 갖는 패널 (III)에 나타내어진다. 일부 실시양태에서, 신호 펄스의 규모에서의 피크는 ML 초과로 지속하는 시간의 지속기간에 걸쳐 검출된 규모를 평균함으로써 결정된다. 일부 실시양태에서, 본원에 사용된 바와 같은 "신호 펄스"는 기준선 초과의 시간의 지속기간 동안 지속하는 신호 데이터 (예를 들어, 예시 신호 트레이스 (I)에 의해 예시된 바와 같은 원시 신호 데이터)의 변화, 또는 그로부터 추출된 신호 펄스 정보 (예를 들어, 패널 (IV)에 예시된 바와 같이 프로세싱된 신호 데이터)를 지칭할 수 있음이 인지되어야 한다.
패널 (IV)는 예시 신호 트레이스 (I)로부터 추출된 신호 펄스 정보를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 신호 펄스 정보를 분석하여 일련의 신호 펄스에서의 상이한 특징적인 패턴에 기반하여 서열에서 아미노산의 상이한 유형을 확인할 수 있다. 예를 들어, 패널 (IV)에 나타내어진 바와 같이, 신호 펄스 정보는 제1 특징적인 패턴 ("CP1")에 기반한 아미노산의 제1 유형 및 제2 특징적인 패턴 ("CP2")에 기반한 아미노산의 제2 유형을 지시한다. 예로서, 보다 이른 시점에서 검출된 2개의 신호 펄스는 CP1에 기반한 폴리펩티드의 말단에서의 제1 아미노산을 지시하는 정보를 제공하고, 보다 나중의 시점에서 검출된 2개의 신호 펄스는 CP2에 기반한 폴리펩티드의 말단에서의 제2 아미노산을 지시하는 정보를 제공한다.
또한 패널 (IV)에 나타내어진 바와 같이, 각각의 신호 펄스는 아미노산 인식 분자 및 특징적인 패턴의 아미노산 사이의 회합 사건에 상응하는 펄스 지속기간 ("pd")을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펄스 지속기간은 결합의 해리 속도의 특징이다. 또한 나타내어진 바와 같이, 특징적인 패턴의 각각의 신호 펄스는 펄스간 지속기간 ("ipd")에 의한 특징적인 패턴의 또 다른 신호 펄스로부터 분리된다. 일부 실시양태에서, 펄스간 지속기간은 결합의 회합 속도의 특징이다. 일부 실시양태에서, 규모의 변화 ("ΔM")는 기준선 및 신호 펄스의 피크 사이의 차이에 기반하여 신호 펄스에 대해 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 특징적인 패턴은 펄스 지속기간에 기반하여 결정된다. 일부 실시양태에서, 특징적인 패턴은 펄스 지속기간 및 펄스간 지속기간에 기반하여 결정된다. 일부 실시양태에서, 특징적인 패턴은 펄스 지속기간, 펄스간 지속기간, 및 규모의 변화 중 임의의 하나 이상에 기반하여 결정된다.
따라서, 도 1a-1b에 의해 예시된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 시퀀싱은 1개 이상의 아미노산 인식 분자와 진행중인 분해 반응에서 폴리펩티드의 말단에서 노출된 연속적인 아미노산의 회합을 지시하는 일련의 신호 펄스를 검출함으로써 수행된다. 일련의 신호 펄스를 분석하여 일련의 신호 펄스에서 특징적인 패턴을 결정할 수 있으며, 특징적인 패턴의 시간 과정은 폴리펩티드의 아미노산 서열을 결정하는데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 일련의 신호 펄스는 시간 경과에 따른 광학 신호의 규모의 일련의 변화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 광학 신호의 일련의 변화는 회합 사건 동안 생성된 발광의 일련의 변화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 발광은 시퀀싱 반응의 1개 이상의 시약과 회합된 검출가능한 표지에 의해 생성된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 인식 분자의 각각은 발광 표지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 절단 시약은 발광 표지를 포함한다. 본 출원에 따른 발광 표지의 예 및 그들의 용도는 본원의 다른 곳에서 제공된다.
일부 실시양태에서, 일련의 신호 펄스는 시간 경과에 따른 전기 신호의 규모의 일련의 변화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 전기 신호의 일련의 변화는 회합 사건 동안 생성된 전도도의 일련의 변화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 전도율은 시퀀싱 반응의 1개 이상의 시약과 회합된 검출가능한 표지에 의해 생성된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 인식 분자의 각각은 전도율 표지를 포함한다. 본 출원에 따른 전도율 표지의 예 및 그들의 용도는 본원의 다른 곳에서 제공된다. 전도율 표지를 사용하여 단일 분자를 확인하는 방법은 기재되었다 (예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2017/0037462 참조).
일부 실시양태에서, 전도도의 일련의 변화는 나노포어를 통한 전도도의 일련의 변화를 포함한다. 예를 들어, 나노포어를 사용하여 수용체-리간드 상호작용을 평가하는 방법은 기재되었다 (예를 들어, 문헌 [Thakur, A.K. & Movileanu, L. (2019) Nature Biotechnology 37(1)] 참조). 본 발명자들은 이러한 나노포어가 본 출원에 따른 폴리펩티드 시퀀싱 반응을 모니터링하는데 사용될 수 있음을 인식하고 인지하였다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 출원은 단일 폴리펩티드 분자를 1개 이상의 아미노산 인식 분자와 접촉시키는 것을 포함하고, 여기서 단일 폴리펩티드 분자가 나노포어에 고정화된 것인 폴리펩티드 시퀀싱의 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 1개 이상의 말단 아미노산 인식 분자와, 단일 폴리펩티드가 분해되고 있는 동안 단일 폴리펩티드의 말단에서 노출된 연속적인 아미노산의 회합을 지시하는 나노포어를 통해 전도도의 일련의 변화를 검출하며, 그에 의해 단일 폴리펩티드 분자를 시퀀싱하는 것을 추가로 포함한다.
일부 측면에서, 본 출원은 혼합물로부터 폴리펩티드의 아미노산의 1개 이상의 유형을 확인함으로써 단백질의 복합체 혼합물에서 개별적인 단백질을 시퀀싱 및/또는 확인하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 1개 이상의 아미노산 (예를 들어, 말단 아미노산 및/또는 내부 아미노산)은 표지되고 (예를 들어, 직접적으로 또는 간접적으로, 예를 들어 결합제, 예컨대 아미노산 인식 분자를 사용하여), 폴리펩티드에서의 표지된 아미노산의 상대 위치가 결정된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드에서의 아미노산의 상대 위치는 일련의 아미노산 표지화 및 절단 단계를 사용하여 결정된다. 그러나, 일부 실시양태에서, 폴리펩티드에서의 표지된 아미노산의 상대 위치는 폴리펩티드 분자에서의 표지된 아미노산의 상대 위치를 결정하기 위해, 폴리펩티드로부터 아미노산을 제거하지 않으면서, 그러나 기공 (예를 들어, 단백질 채널)을 통해 표지된 폴리펩티드를 전위시키고, 기공을 통한 전위 동안 표지된 아미노산(들)으로부터 신호 (예를 들어, FRET 신호)를 검출함으로써 결정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 말단 아미노산 (예를 들어, N-말단 또는 C-말단 아미노산)의 동일성이 평가되고, 그 후 말단 아미노산이 제거되고, 말단에서의 다음 아미노산의 동일성이 평가되고, 이 프로세스는 폴리펩티드에서의 복수개의 연속적인 아미노산이 평가될 때까지 반복된다. 일부 실시양태에서, 아미노산의 동일성을 평가하는 것은 존재하는 아미노산의 유형을 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산의 유형을 결정하는 것은 예를 들어 천연-발생 20가지 아미노산의 어느 것이 말단 아미노산인지 결정함으로써 (예를 들어, 개별적인 말단 아미노산에 대해 특이적인 결합제를 사용하여), 실제 아미노산 동일성을 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산의 유형은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 셀레노시스테인, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 및 발린으로부터 선택된다.
그러나, 일부 실시양태에서 말단 아미노산 유형의 동일성을 평가하는 것은 폴리펩티드의 말단에 존재할 수 있는 잠재적인 아미노산의 하위세트를 결정하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이는 아미노산이 1개 이상의 특이적 아미노산이 아님 (및 따라서 다른 아미노산 중 임의의 것일 수 있음)을 결정함으로써 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이는 아미노산의 특정된 하위세트의 어느 것이 (예를 들어, 크기, 전하, 소수성, 번역후 변형, 결합 특성에 기반하여) 폴리펩티드의 말단에 있을 수 있는지를 (예를 들어 2개 이상의 말단 아미노산의 특정된 하위세트에 결합하는 결합제를 사용하여) 결정함으로써 달성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 말단 아미노산 유형의 동일성을 평가하는 것은 아미노산이 번역후 변형을 포함함을 결정하는 것을 포함한다. 번역후 변형의 비-제한적 예는 아세틸화, ADP-리보실화, 카스파제 절단, 시트룰린화, 포르밀화, N-연결된 글리코실화, O-연결된 글리코실화, 히드록실화, 메틸화, 미리스토일화, 네딜화, 니트로화, 산화, 팔미토일화, 인산화, 프레닐화, S-니트로실화, 황산화, 수모일화, 및 유비퀴틴화를 포함한다.
일부 실시양태에서, 말단 아미노산 유형의 동일성을 평가하는 것은 아미노산이 하나 이상의 생화학적 특성을 특징으로 하는 측쇄를 포함함을 결정하는 것을 포함한다. 예를 들어, 아미노산은 비극성 지방족 측쇄, 양으로 하전된 측쇄, 음으로 하전된 측쇄, 비극성 방향족 측쇄, 또는 극성 비하전된 측쇄를 포함할 수 있다. 비극성 지방족 측쇄를 포함하는 아미노산의 비-제한적 예는 알라닌, 글리신, 발린, 류신, 메티오닌, 및 이소류신을 포함한다. 양으로 하전된 측쇄를 포함하는 아미노산의 비-제한적 예는 리신, 아르기닌, 및 히스티딘을 포함한다. 음으로 하전된 측쇄를 포함하는 아미노산의 비-제한적 예는 아스파르테이트 및 글루타메이트를 포함한다. 비극성, 방향족 측쇄를 포함하는 아미노산의 비-제한적 예는 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판을 포함한다. 극성 비하전된 측쇄를 포함하는 아미노산의 비-제한적 예는 세린, 트레오닌, 시스테인, 프롤린, 아스파라긴, 및 글루타민을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단백질 또는 폴리펩티드는 복수개의 보다 작은 폴리펩티드로 소화될 수 있고, 서열 정보는 이들 보다 작은 폴리펩티드 중 1종 이상으로부터 수득될 수 있다 (예를 들어, 폴리펩티드의 말단 아미노산을 순차적으로 평가하고, 그 아미노산을 제거하여 말단에서 다음 아미노산을 노출시키는 것을 포함하는 방법을 사용하여).
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 그의 아미노 (N) 말단으로부터 시퀀싱된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 그의 카르복시 (C) 말단으로부터 시퀀싱된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 제1 말단 (예를 들어, N 또는 C 말단)은 고정화되고, 다른 말단 (예를 들어, C 또는 N 말단)은 본원에 기재된 바와 같이 시퀀싱된다.
본원에 사용된 바와 같이, 폴리펩티드를 시퀀싱하는 것은 폴리펩티드에 대한 서열 정보를 결정하는 것을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 이는 폴리펩티드의 부분 (또는 전부)에 대한 각각의 순차적인 아미노산의 동일성을 결정하는 것을 포함할 수 있다. 그러나, 일부 실시양태에서, 이는 폴리펩티드 내의 아미노산의 하위세트의 동일성을 평가하는 것 (예를 들어, 그리고 폴리펩티드에서의 각각의 아미노산의 동일성을 결정하지 않으면서 1개 이상의 아미노산 유형의 상대 위치를 결정하는 것)을 포함할 수 있다. 그러나, 일부 실시양태에서 아미노산 함량 정보는 폴리펩티드에서의 아미노산의 상이한 유형의 상대 위치를 직접적으로 결정하지 않으면서 폴리펩티드로부터 수득될 수 있다. 아미노산 함량 단독은 존재하는 폴리펩티드의 동일성을 추론하는데 사용될 수 있다 (예를 들어, 아미노산 함량을 폴리펩티드 정보의 데이터베이스와 비교하고, 어느 폴리펩티드(들)가 동일한 아미노산 함량을 갖는지를 결정함으로써).
일부 실시양태에서, 보다 긴 폴리펩티드 또는 단백질로부터 수득된 복수개의 폴리펩티드 생성물에 대한 서열 정보 (예를 들어, 효소적 및/또는 화학적 절단을 통해)는 보다 긴 폴리펩티드 또는 단백질의 서열을 재구축하거나 추론하기 위해 분석될 수 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, 아미노산의 1개 이상의 유형은 아미노산의 1개 이상의 유형에 선택적으로 결합하는 1개 이상의 표지된 친화도 시약의 발광을 검출함으로써 확인된다. 일부 실시양태에서, 아미노산의 1개 이상의 유형은 표지된 폴리펩티드의 발광을 검출함으로써 확인된다.
본 발명자들은 본원에 기재된 폴리펩티드 시퀀싱 기법이 특히 통상적인 폴리펩티드 시퀀싱 기법과 대조적으로 신규한 폴리펩티드 시퀀싱 데이터를 생성하는 것을 포함할 수 있음을 추가로 인식하고 인지하였다. 따라서, 폴리펩티드 시퀀싱 데이터를 분석하기 위한 통상적인 기법은 본원에 기재된 폴리펩티드 시퀀싱 기법을 사용하여 생성된 데이터에 적용될 경우에 충분하지 않을 수 있다.
예를 들어, 반복적인 시약 사이클링을 포함하는 통상적인 폴리펩티드 시퀀싱 기법은 시퀀싱되는 폴리펩티드의 개별적인 아미노산과 연관된 데이터를 생성할 수 있다. 이러한 경우, 생성된 데이터를 분석하는 것은, 검출되는 데이터가 단지 1개의 아미노산에 상응하기 때문에, 단순히 어느 아미노산이 특정한 시간에 검출되고 있는지를 결정하는 것을 포함할 수 있다. 대조적으로, 본원에 기재된 폴리펩티드 시퀀싱 기법은 폴리펩티드 분자의 다중 아미노산이 검출되고 있는 동안 폴리펩티드 분해 프로세스 동안 데이터를 생성할 수 있어, 폴리펩티드의 상이한 아미노산에 상응하는 데이터의 섹션 사이에 식별하는 것이 곤란할 수 있는 데이터를 발생시킨다. 따라서, 본 발명자들은 예컨대 데이터를 각각의 아미노산 회합 사건에 상응하는 부분으로 절편화함으로써, 개별적인 아미노산에 상응하는 데이터의 섹션을 결정하는 것을 포함하는 본원에 기재된 폴리펩티드 시퀀싱 기법에 의해 생성된 이러한 데이터를 분석하기 위한 새로운 컴퓨터 기법을 개발하였다. 그러한 섹션은 그 후 그러한 개별적인 섹션 동안 검출되고 있는 아미노산을 확인하기 위해 추가로 분석될 수 있다.
또 다른 예로서, 아미노산의 각각의 유형에 대한 고유하게 확인가능한 표지를 사용하는 것을 포함하는 통상적인 시퀀싱 기법은 어떻게 개별적인 아미노산이 다른 분자와 상호작용하는지에 있어서 임의의 역학을 고려하지 않으면서 어느 표지가 특정한 시간에 검출되고 있는지를 간단히 분석하는 것을 포함할 수 있다. 대조적으로, 본원에 기재된 폴리펩티드 시퀀싱 기법은 어떻게 아미노산이 인식 분자와 상호작용하는지를 지시하는 데이터를 생성한다. 상기 논의된 바와 같이, 데이터는 아미노산 및 그들의 각각의 인식 분자 사이의 회합 사건에 상응하는 일련의 특징적인 패턴을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 일련의 상이한 특징적인 패턴을 분석함으로써 폴리펩티드의 아미노산 서열이 결정되는 것을 허용하는, 특징적인 패턴을 분석하여 데이터의 그 부분에 상응하는 아미노산의 유형을 결정하는 새로운 컴퓨터 기법을 개발하였다.
표지된 친화도 시약 및 사용 방법
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 방법은 폴리펩티드를 말단 아미노산의 하나의 유형에 선택적으로 결합하는 표지된 친화도 시약 (또한 본원에서 표지를 포함할 수 있거나 그렇지 않을 수 있는 아미노산 인식 분자로 지칭됨)과 접촉시키는 것을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 말단 아미노산은 폴리펩티드의 아미노-말단 아미노산 또는 폴리펩티드의 카르복시-말단 아미노산을 지칭할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표지된 친화도 시약은 말단 아미노산의 다른 유형에 비해 말단 아미노산의 하나의 유형에 선택적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 표지된 친화도 시약은 동일한 유형의 내부 아미노산에 비해 말단 아미노산의 하나의 유형에 선택적으로 결합한다. 추가의 다른 실시양태에서, 표지된 친화도 시약은 폴리펩티드의 임의의 위치에서의 아미노산의 하나의 유형, 예를 들어, 말단 아미노산 및 내부 아미노산과 동일한 유형의 아미노산에 선택적으로 결합한다.
본원에 사용된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 아미노산의 유형은 20가지 천연 발생 아미노산 또는 그의 유형의 하위세트 중 하나를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 아미노산의 유형은 20가지 천연 발생 아미노산 또는 그의 비변형된 및/또는 변형된 변이체의 하위세트 중 하나의 변형된 변이체를 지칭한다. 변형된 아미노산 변이체의 예는 제한 없이, 번역후-변형된 변이체 (예를 들어, 아세틸화, ADP-리보실화, 카스파제 절단, 시트룰린화, 포르밀화, N-연결된 글리코실화, O-연결된 글리코실화, 히드록실화, 메틸화, 미리스토일화, 네딜화, 니트로화, 산화, 팔미토일화, 인산화, 프레닐화, S-니트로실화, 황산화, 수모일화, 및 유비퀴틴화), 화학적으로 변형된 변이체, 비천연 아미노산, 및 단백질생성 아미노산, 예컨대 셀레노시스테인 및 피로리신을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산의 유형의 하위세트는 하나 이상의 유사한 생화학적 특성을 갖는 1종 초과 및 20종 미만의 아미노산을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 아미노산의 유형은 하전된 측쇄 (예를 들어, 양으로 및/또는 음으로 하전된 측쇄)를 갖는 아미노산, 극성 측쇄 (예를 들어, 극성 비하전된 측쇄)를 갖는 아미노산, 비극성 측쇄 (예를 들어, 비극성 지방족 및/또는 방향족 측쇄)를 갖는 아미노산, 및 소수성 측쇄를 갖는 아미노산으로부터 선택되는 하나의 유형을 지칭한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 방법은 폴리펩티드를 말단 아미노산의 1개 이상의 유형에 선택적으로 결합하는 1개 이상의 표지된 친화도 시약과 접촉시키는 것을 포함한다. 예시적인 및 비-제한적 예로서, 4개의 표지된 친화도 시약이 본 출원의 방법에 사용되는 경우, 임의의 1개의 시약은 다른 3개 중 임의의 것이 선택적으로 결합하는 아미노산의 또 다른 유형과는 상이한 말단 아미노산의 하나의 유형에 선택적으로 결합한다 (예를 들어, 제1 시약은 말단 아미노산의 제1 유형에 결합하고, 제2 시약은 제2 유형에 결합하고, 제3 시약은 제3 유형에 결합하고, 제4 시약은 제4 유형에 결합한다). 이 논의의 목적을 위해, 본원에 기재된 방법의 맥락에서 1개 이상의 표지된 친화도 시약은 대안적으로 표지된 친화도 시약의 세트로 지칭될 수 있다.
일부 실시양태에서, 표지된 친화도 시약의 세트는 적어도 1개 및 최대 6개의 표지된 친화도 시약을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 표지된 친화도 시약의 세트는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 표지된 친화도 시약을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표지된 친화도 시약의 세트는 10개 이하의 표지된 친화도 시약을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표지된 친화도 시약의 세트는 8개 이하의 표지된 친화도 시약을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표지된 친화도 시약의 세트는 6개 이하의 표지된 친화도 시약을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표지된 친화도 시약의 세트는 4개 이하의 표지된 친화도 시약을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표지된 친화도 시약의 세트는 3개 이하의 표지된 친화도 시약을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표지된 친화도 시약의 세트는 2개 이하의 표지된 친화도 시약을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표지된 친화도 시약의 세트는 4개의 표지된 친화도 시약을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표지된 친화도 시약의 세트는 적어도 2개 및 20개 이하 (예를 들어, 적어도 2개 및 최대 10개, 적어도 2개 및 최대 8개, 적어도 4개 및 최대 20개, 적어도 4개 및 최대 10개)의 표지된 친화도 시약을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표지된 친화도 시약의 세트는 20개 초과 (예를 들어, 20 내지 25개, 20 내지 30개)의 친화도 시약을 포함한다. 그러나, 임의의 수의 친화도 시약은 요망되는 용도를 제공하기 위해 본 출원의 방법에 따라 사용될 수 있음이 인지되어야 한다.
본 출원에 따르면, 일부 실시양태에서, 아미노산의 1개 이상의 유형은 표지된 친화도 시약 (예를 들어, 발광 표지를 포함하는 아미노산 인식 분자)의 발광을 검출함으로써 확인된다. 일부 실시양태에서, 표지된 친화도 시약은 아미노산의 하나의 유형에 선택적으로 결합하는 친화도 시약 및 친화도 시약과 회합되는 발광을 갖는 발광 표지를 포함한다. 이렇게 하여, 발광 (예를 들어, 본원의 다른 곳에 기재된 발광 수명, 발광 강도, 및 다른 발광 특성)은 폴리펩티드의 아미노산을 확인하기 위해 친화도 시약의 선택적 결합과 연관될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표지된 친화도 시약의 복수개의 유형은 본 출원에 따른 방법에 사용될 수 있고, 여기서 각각의 유형은 복수개 중에서로부터 고유하게 확인가능한 발광을 갖는 발광 표지를 포함한다. 적합한 발광 표지는 발광 분자, 예컨대 형광단 염료를 포함할 수 있으며, 본원의 다른 곳에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 아미노산의 1개 이상의 유형은 표지된 친화도 시약의 하나 이상의 전기적 특징을 검출함으로써 확인된다. 일부 실시양태에서, 표지된 친화도 시약은 아미노산의 하나의 유형에 선택적으로 결합하는 친화도 시약 및 친화도 시약과 회합되는 전도율 표지를 포함한다. 이렇게 하여, 하나 이상의 전기적 특징 (예를 들어, 전하, 전류 진동 색상, 및 다른 전기적 특징)은 폴리펩티드의 아미노산을 확인하기 위해 친화도 시약의 선택적 결합과 연관될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표지된 친화도 시약의 복수개의 유형은 본 출원에 따른 방법에 사용될 수 있고, 여기서 각각의 유형은 복수개 중에서로부터 고유하게 확인가능한 전기 신호의 변화 (예를 들어, 전도도의 변화, 예컨대 특징적인 패턴의 전도율 및 전도율 전이의 진폭의 변화)를 생성하는 전도율 표지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표지된 친화도 시약의 복수개의 유형은 각각 상이한 수의 하전된 기 (예를 들어, 상이한 수의 음으로 및/또는 양으로 하전된 기)를 갖는 전도율 표지를 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 전도율 표지는 전하 표지이다. 전하 표지의 예는 다중 하전된 기를 갖는 덴드리머, 나노입자, 핵산 및 다른 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 전도율 표지는 그의 순전하 (예를 들어, 순양전하 또는 순음전하)에 의해, 그의 전하 밀도에 의해, 및/또는 그의 하전된 기의 수에 의해 고유하게 확인가능하다.
일부 실시양태에서, 친화도 시약 (예를 들어, 아미노산 인식 분자)은 통상적으로 공지된 기법을 사용하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 조작될 수 있다. 일부 실시양태에서, 요망되는 특성은 단지 그것이 폴리펩티드의 말단 (예를 들어, N-말단 또는 C-말단)에 위치하는 경우에 아미노산의 하나의 유형에 선택적으로 및 고 친화도로 결합하는 능력을 포함할 수 있다. 추가의 다른 실시양태에서, 요망되는 특성은 그것이 폴리펩티드의 말단 (예를 들어, N-말단 또는 C-말단)에 위치하는 경우에 및 그것이 폴리펩티드의 내부 위치에 위치하는 경우에 아미노산의 하나의 유형에 선택적으로 및 고 친화도로 결합하는 능력을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 요망되는 특성은 아미노산의 1개 초과의 유형에 선택적으로 및 저 친화도로 (예를 들어, 약 50 nM 이상, 예를 들어, 약 50 nM 내지 약 50 μM, 약 100 nM 내지 약 10 μM, 약 500 nM 내지 약 50 μM의 KD로) 결합하는 능력을 포함한다. 예를 들어, 일부 측면에서, 본 출원은 폴리펩티드 분해 프로세스 동안 가역적인 결합 상호작용을 검출하는 것에 의한 시퀀싱의 방법을 제공한다. 유리하게는, 이러한 방법은 아미노산의 1개 초과의 유형 (예를 들어, 아미노산 유형의 하위세트)에 저 친화도로 가역적으로 결합하는 친화도 시약을 사용하여 수행될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 용어 "선택적" 및 "특이적" (및 그의 파생어, 예를 들어, 선택적으로, 특이적으로, 선택성, 특이성)은 우선적인 결합 상호작용을 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 아미노산의 하나의 유형에 선택적으로 결합하는 표지된 친화도 시약은 아미노산의 또 다른 유형에 비해 하나의 유형에 우선적으로 결합한다. 선택적 결합 상호작용은 아미노산의 하나의 유형 (예를 들어, 말단 아미노산의 하나의 유형) 및 아미노산의 다른 유형 (예를 들어, 말단 아미노산의 다른 유형) 사이에, 전형적으로 약 10배 내지 100배 이상 초과 (예를 들어, 약 1,000배 또는 10,000배 초과) 식별할 것이다. 따라서, 선택적 결합 상호작용은 아미노산의 다른 유형에 비해 아미노산의 하나의 유형에 대해 고유하게 확인가능한 임의의 결합 상호작용을 지칭할 수 있음이 인지되어야 한다. 예를 들어, 일부 측면에서, 본 출원은 1개 이상의 아미노산 인식 분자와 폴리펩티드 분자의 회합을 지시하는 데이터를 수득하는 것에 의한 폴리펩티드 시퀀싱의 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 데이터는 폴리펩티드 분자의 아미노산과의 일련의 가역적인 아미노산 인식 분자 결합 상호작용에 상응하는 일련의 신호 펄스를 포함하고, 데이터는 아미노산의 동일성을 결정하는데 사용될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, "선택적" 또는 "특이적" 결합 상호작용은 아미노산의 하나의 유형 및 아미노산의 다른 유형 사이에 식별하는 검출된 결합 상호작용을 지칭한다.
일부 실시양태에서, 표지된 친화도 시약 (예를 들어, 아미노산 인식 분자)은 아미노산의 다른 유형에 유의하게 결합하지 않으면서 약 10-6 M 미만 (예를 들어, 약 10-7 M 미만, 약 10-8 M 미만, 약 10-9 M 미만, 약 10-10 M 미만, 약 10-11 M 미만, 약 10-12 M 미만, 내지 10-16 M만큼 낮은) 해리 상수 (KD)로 아미노산의 하나의 유형에 선택적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 표지된 친화도 시약은 약 100 nM 미만, 약 50 nM 미만, 약 25 nM 미만, 약 10 nM 미만, 또는 약 1 nM 미만의 KD로 아미노산의 하나의 유형 (예를 들어, 말단 아미노산의 하나의 유형)에 선택적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 표지된 친화도 시약은 약 50 nM 내지 약 50 μM (예를 들어, 약 50 nM 내지 약 500 nM, 약 50 nM 내지 약 5 μM, 약 500 nM 내지 약 50 μM, 약 5 μM 내지 약 50 μM, 또는 약 10 μM 내지 약 50 μM)의 KD로 아미노산의 하나의 유형에 선택적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 표지된 친화도 시약은 약 50 nM의 KD로 아미노산의 하나의 유형에 선택적으로 결합한다.
일부 실시양태에서, 표지된 친화도 시약 (예를 들어, 아미노산 인식 분자)은 약 10-6 M 미만 (예를 들어, 약 10-7 M 미만, 약 10-8 M 미만, 약 10-9 M 미만, 약 10-10 M 미만, 약 10-11 M 미만, 약 10-12 M 미만, 내지 10-16 M만큼 낮은)의 해리 상수 (KD)로 아미노산의 2개 이상의 유형에 선택적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 표지된 친화도 시약은 약 100 nM 미만, 약 50 nM 미만, 약 25 nM 미만, 약 10 nM 미만, 또는 약 1 nM 미만의 KD로 아미노산의 2개 이상의 유형에 선택적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 표지된 친화도 시약은 약 50 nM 내지 약 50 μM (예를 들어, 약 50 nM 내지 약 500 nM, 약 50 nM 내지 약 5 μM, 약 500 nM 내지 약 50 μM, 약 5 μM 내지 약 50 μM, 또는 약 10 μM 내지 약 50 μM)의 KD로 아미노산의 2개 이상의 유형에 선택적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 표지된 친화도 시약은 약 50 nM의 KD로 아미노산의 2개 이상의 유형에 선택적으로 결합한다.
본원에서 제공된 방법 및 조성물에 따르면, 도 1c는 표지된 친화도 시약의 다양한 예시 배열 및 용도를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 표지된 친화도 시약 (100)은 발광 표지 (110) (예를 들어, 표지) 및 폴리펩티드 (120)의 말단 아미노산의 1개 이상의 유형에 선택적으로 결합하는 친화도 시약 (반점 형상으로서 나타내어짐)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 친화도 시약은 말단 위치에서의 또는 말단 및 내부 위치 둘 다에서의 아미노산의 하나의 유형 또는 아미노산의 유형의 하위세트 (예를 들어, 아미노산의 20종 미만의 통상적인 유형)에 대해 선택적이다.
본원에 기재된 바와 같이, 친화도 시약 (또한 "인식 분자"로 공지됨)은 또 다른 분자에 비해 하나의 분자 (예를 들어, 본원에서 지칭된 "아미노산 인식 분자"와 같이, 아미노산의 또 다른 유형에 비해 아미노산의 하나의 유형)에 선택적으로 또는 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 생체분자일 수 있다. 일부 실시양태에서, 친화도 시약은 펩티다제가 아니거나, 펩티다제 활성을 갖지 않는다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 출원의 폴리펩티드 시퀀싱의 방법은 폴리펩티드 분자를 1개 이상의 친화도 시약 및 절단 시약과 접촉시키는 것을 포함한다. 이러한 실시양태에서, 1개 이상의 친화도 시약은 펩티다제 활성을 갖지 않고, 폴리펩티드 분자로부터의 1개 이상의 아미노산의 제거 (예를 들어, 폴리펩티드 분자의 말단으로부터의 아미노산 제거)는 절단 시약에 의해 수행된다.
친화도 시약 (예를 들어, 인식 분자)은 예를 들어, 합성 또는 재조합일 수 있는 단백질 및 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 친화도 시약 또는 인식 분자는 항체 또는 항체의 항원-결합 부분, SH2 도메인-함유 단백질 또는 그의 단편, 또는 효소적 생체분자, 예컨대 펩티다제, 아미노트랜스퍼라제, 리보자임, 압타자임, 또는 아미노아실-tRNA 신테타제를 비롯한 tRNA 신테타제 및 발명의 명칭이 "반복적인 폴리펩티드 분석 및 프로세싱을 위한 분자 및 방법"인 2016년 9월 2일에 출원된 미국 특허 출원 번호 15/255,433에 기재된 관련된 분자일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 출원의 친화도 시약 또는 인식 분자는 분해 경로 단백질이다. 인식 분자로서 사용하기에 적합한 분해 경로 단백질의 예는 제한 없이, N-단부 규칙 경로 단백질, 예컨대 Arg/N-단부 규칙 경로 단백질, Ac/N-단부 규칙 경로 단백질, 및 Pro/N-단부 규칙 경로 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인식 분자는 Gid 단백질 (예를 들어, Gid4 또는 Gid10 단백질), UBR 박스 단백질 (예를 들어, UBR1, UBR2) 또는 그의 UBR 박스 도메인-함유 단백질 단편, p62 단백질 또는 그의 ZZ 도메인-함유 단편, 및 ClpS 단백질 (예를 들어, ClpS1, ClpS2)로부터 선택되는 N-단부 규칙 경로 단백질이다.
일부 실시양태에서, 본 출원의 친화도 시약 또는 인식 분자는 ClpS 단백질, 예컨대 아그로박테리움 투미파시엔스(Agrobacterium tumifaciens) ClpS1, 아그로박테리움 투미파시엔스 ClpS2, 시네코코쿠스 엘론가투스(Synechococcus elongatus) ClpS1, 시네코코쿠스 엘론가투스 ClpS2, 써모시네코코쿠스 엘론가투스(Thermosynechococcus elongatus) ClpS, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) ClpS, 또는 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum) ClpS이다. 일부 실시양태에서, 인식 분자는 L/F 트랜스퍼라제, 예컨대 에스케리키아 콜라이 류실/페닐알라닐-tRNA-단백질 트랜스퍼라제이다. 일부 실시양태에서, 인식 분자는 D/E 류실트랜스퍼라제, 예컨대 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus) 아스파르테이트/글루타메이트 류실트랜스퍼라제 Bpt이다. 일부 실시양태에서, 인식 분자는 UBR 단백질 또는 UBR-박스 도메인, 예컨대 인간 UBR1 및 UBR2 또는 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) UBR1의 UBR 단백질 또는 UBR-박스 도메인이다. 일부 실시양태에서, 인식 분자는 p62 단백질, 예컨대 에이치. 사피엔스(H. sapiens) p62 단백질 또는 라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus) p62 단백질, 또는 ZZ 도메인을 최소로 포함하는 그의 말단절단 변이체이다. 일부 실시양태에서, 인식 분자는 Gid4 단백질, 예컨대 에이치. 사피엔스 GID4 또는 사카로미세스 세레비지아에 GID4이다. 일부 실시양태에서, 인식 분자는 Gid10 단백질, 예컨대 사카로미세스 세레비지아에 GID10이다. 일부 실시양태에서, 인식 분자는 N-메리스토일트랜스퍼라제, 예컨대 리슈마니아 메이저(Leishmania major) N-메리스토일트랜스퍼라제 또는 에이치. 사피엔스 N-메리스토일트랜스퍼라제 NMT1이다. 일부 실시양태에서, 인식 분자는 BIR2 단백질, 예컨대 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster) BIR2이다. 일부 실시양태에서, 인식 분자는 티로신 키나제 또는 티로신 키나제의 SH2 도메인, 예컨대 에이치. 사피엔스 Fyn SH2 도메인, 에이치. 사피엔스 Src 티로신 키나제 SH2 도메인, 또는 그의 변이체, 예컨대 에이치. 사피엔스 Fyn SH2 도메인 삼중 돌연변이체 초결합제이다. 일부 실시양태에서, 인식 분자는 항체 또는 항체 단편, 예컨대 포스포티로신에 대한 단일-쇄 항체 가변 단편 (scFv) 또는 본원에 기재된 또 다른 번역후 변형된 아미노산 변이체이다.
표 1은 아미노산 인식 분자의 예시 서열의 목록을 제공한다. 또한, 표 1에서 달리 특정되지 않는 한, 폴리펩티드의 말단 위치에서의 아미노산 동일성에 관하여 각각의 분자의 아미노산 결합 선호도가 나타내어진다. 이들 서열 및 본원에 기재된 다른 예는 비-제한적인 것으로 의미되며, 본 출원에 따른 인식 분자는 펩티드 인식을 담당하는 도메인 또는 서브도메인을 최소로 함유하는 임의의 동족체, 그의 변이체, 또는 그의 단편을 포함할 수 있음이 인지되어야 한다.
표 1. 아미노산 인식 단백질의 비-제한적 예.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
따라서, 일부 실시양태에서, 본 출원은 표 1로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 (또는 표 1로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 80-90%, 90-95%, 95-99%, 또는 그 초과의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는) 아미노산 인식 분자를 제공한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 인식 분자는 표 1에 열거된 아미노산 인식 분자와 25-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90%, 90-95%, 또는 95-99%, 또는 그 초과의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 아미노산 인식 분자는 변형된 아미노산 인식 분자이고, 표 1에 제시된 서열에 비해 1개 이상의 아미노산 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 아미노산 인식 분자는 아미노산 결합 이외의 하나 이상의 기능을 제공하는 태그 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 태그 서열은 인식 분자의 비오티닐화 (예를 들어, 비오틴 및 비스-비오틴 모이어티를 비롯한 1개 이상의 비오틴 분자의 혼입)를 허용하는 비오틴 리가제 인식 서열을 포함한다. 태그 서열에서의 기능적 서열의 추가적인 예는 인식 분자의 정제 및/또는 변형에 유용한 정제 태그, 절단 부위, 및 다른 모이어티를 포함한다. 표 2는 말단 태그 서열의 비-제한적 서열의 목록을 제공하며, 그 중 임의의 1개 이상은 본 출원의 아미노산 인식 분자 중 어느 하나와 조합으로 (예를 들어, 표 1에 제시된 서열과 조합으로) 사용될 수 있다. 표 2에 나타내어진 태그 서열은 비-제한적인 것으로 의미되며, 본 출원에 따른 인식 분자는 N- 및 C-말단 사이에 분할된, 또는 다르게는 관련 기술분야에서 실시되는 바와 같이 재배열된 인식 분자 폴리펩티드의 N- 또는 C-말단에 태그 서열 (예를 들어, His-태그 및/또는 비오티닐화 태그) 중 임의의 1개 이상을 포함할 수 있음이 인지되어야 한다.
표 2. 말단 태그 서열의 비-제한적 예.
Figure pct00006
일부 실시양태에서, 본 출원의 인식 분자 또는 친화도 시약은 펩티다제이다. 또한 프로테아제 또는 프로테이나제로 지칭되는 펩티다제는 펩티드 결합의 가수분해를 촉매하는 효소이다. 펩티다제는 폴리펩티드를 보다 짧은 단편으로 소화시키며, 일반적으로 각각 내부로 및 말단으로 폴리펩티드 쇄를 절단하는 엔도펩티다제 및 엑소펩티다제로 분류될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표지된 친화도 시약 (100)은 엑소펩티다제 또는 엔도펩티다제 활성을 불활성화시키도록 변형된 펩티다제를 포함한다. 이렇게 하여, 표지된 친화도 시약 (100)은 또한 폴리펩티드로부터 아미노산을 절단하지 않으면서 선택적으로 결합한다. 추가의 다른 실시양태에서, 엑소펩티다제 또는 엔도펩티다제 활성을 불활성화시키도록 변형되지 않은 펩티다제가 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 표지된 친화도 시약은 표지된 엑소펩티다제 (102)를 포함한다.
본 출원의 특정 실시양태에 따르면, 단백질 시퀀싱 방법은 폴리펩티드의 말단 단부에서의 반복적인 검출 및 절단을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표지된 엑소펩티다제 (102)는 아미노산의 검출 및 절단의 둘 다의 단계를 수행하는 단일 시약으로서 사용될 수 있다. 일반적으로 도시된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 표지된 엑소펩티다제 (102)는 그것이 폴리펩티드로부터 각각 N-말단 또는 C-말단 아미노산에 결합하고 이를 절단하도록 아미노펩티다제 또는 카르복시펩티다제 활성을 갖는다. 특정 실시양태에서, 표지된 엑소펩티다제 (102)는 표지된 엑소펩티다제 (102)가 본원에 기재된 바와 같이 비-절단 표지된 친화도 시약 (100)으로서 사용하기 위한 선택적 결합 특성을 보유하도록 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 촉매적으로 불활성화될 수 있음이 인지되어야 한다.
엑소펩티다제는 일반적으로 폴리펩티드 기질이 그의 아미노-말단에 유리 아미노 기 또는 그의 카르복시-말단에 유리 카르복실 기 중 적어도 하나를 포함할 것을 요구한다. 일부 실시양태에서, 본 출원에 따른 엑소펩티다제는 폴리펩티드의 말단에서 또는 부근에서 결합을 가수분해한다. 일부 실시양태에서, 엑소펩티다제는 폴리펩티드 말단으로부터 3개 이하의 잔기에서 결합을 가수분해한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 엑소펩티다제에 의해 촉매되는 단일 가수분해 반응은 폴리펩티드 말단 단부로부터 단일 아미노산, 디펩티드, 또는 트리펩티드를 절단한다.
일부 실시양태에서, 본 출원에 따른 엑소펩티다제는 각각 아미노- 또는 카르복시-말단으로부터 단일 아미노산을 절단하는 아미노펩티다제 또는 카르복시펩티다제이다. 일부 실시양태에서, 본 출원에 따른 엑소펩티다제는 각각 아미노- 또는 카르복시-말단으로부터 디펩티드를 절단하는 디펩티딜-펩티다제 또는 펩티딜-디펩티다제이다. 추가의 다른 실시양태에서, 본 출원에 따른 엑소펩티다제는 아미노-말단으로부터 트리펩티드를 절단하는 트리펩티딜-펩티다제이다. 펩티다제 분류 및 그의 각각의 부류 및 하위부류의 활성은 널리 공지되어 있으며, 문헌에 기재되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Gurupriya, V. S. & Roy, S. C. Proteases and Protease Inhibitors in Male Reproduction. Proteases in Physiology and Pathology 195-216 (2017)]; 및 [Brix, K. & Stoecker, W. Proteases: Structure and Function. Chapter 1] 참조). 일부 실시양태에서, 본 출원에 따른 펩티다제는 폴리펩티드 말단으로부터 3개 초과의 아미노산을 제거한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 펩티다제는 예를 들어, 특정한 위치에서 (예를 들어, 특정한 아미노산의 앞 또는 뒤에서) 우선적으로 절단하는 엔도펩티다제이다. 일부 실시양태에서, 엔도펩티다제 활성의 폴리펩티드 절단 생성물의 크기는 분석되는 폴리펩티드 내의 절단 부위 (예를 들어, 아미노산)의 분포에 의존할 것이다.
본 출원에 따른 엑소펩티다제는 시퀀싱 반응의 방향성에 기반하여 선택되거나 조작될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드의 아미노-말단으로부터 카르복시-말단으로의 시퀀싱의 실시양태에서, 엑소펩티다제는 아미노펩티다제 활성을 포함한다. 반대로, 폴리펩티드의 카르복시-말단으로부터 아미노-말단으로의 시퀀싱의 실시양태에서, 엑소펩티다제는 카르복시펩티다제 활성을 포함한다. 표지된 엑소펩티다제로서 사용되거나, 본원에 기재된 비-절단 표지된 친화도 시약으로서 사용되도록 불활성화될 수 있는 특이적 카르복시-말단 아미노산을 인식하는 카르복시펩티다제의 예는 문헌에 기재되었다 (예를 들어, 문헌 [Garcia-Guerrero, M.C., et al. (2018) PNAS 115(17)] 참조).
절단 시약 및/또는 친화도 시약 (예를 들어, 인식 분자)으로서 사용하기 위한 적합한 펩티다제는 아미노산의 1개 이상의 유형에 선택적으로 결합하는 아미노펩티다제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노펩티다제 인식 분자는 아미노펩티다제 활성을 불활성화시키도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 아미노펩티다제 절단 시약은 그것이 폴리펩티드의 말단 단부로부터 아미노산의 대부분의 또는 모든 유형을 절단하도록 비-특이적이다. 일부 실시양태에서, 아미노펩티다제 절단 시약은 폴리펩티드의 말단 단부에서의 아미노산의 다른 유형에 비해 폴리펩티드의 말단 단부로부터 아미노산의 1개 이상의 유형을 절단하는데 있어서 보다 효율적이다. 예를 들어, 본 출원에 따른 아미노펩티다제는 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 셀레노시스테인, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 및/또는 발린을 특이적으로 절단한다. 일부 실시양태에서, 아미노펩티다제는 프롤린 아미노펩티다제이다. 일부 실시양태에서, 아미노펩티다제는 프롤린 이미노펩티다제이다. 일부 실시양태에서, 아미노펩티다제는 글루타메이트/아스파르테이트-특이적 아미노펩티다제이다. 일부 실시양태에서, 아미노펩티다제는 메티오닌-특이적 아미노펩티다제이다. 일부 실시양태에서, 아미노펩티다제는 표 3에 제시된 아미노펩티다제이다. 일부 실시양태에서, 아미노펩티다제 절단 시약은 표 3에 제시된 바와 같은 펩티드 기질을 절단한다.
일부 실시양태에서, 아미노펩티다제는 비-특이적 아미노펩티다제이다. 일부 실시양태에서, 비-특이적 아미노펩티다제는 아연 메탈로프로테아제이다. 일부 실시양태에서, 비-특이적 아미노펩티다제는 표 4에 제시된 아미노펩티다제이다. 일부 실시양태에서, 비-특이적 아미노펩티다제는 표 4에 제시된 바와 같은 펩티드 기질을 절단한다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본 출원은 표 3 또는 표 4로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 (또는 표 3 또는 표 4로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 80-90%, 90-95%, 95-99%, 또는 그 초과의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는) 아미노펩티다제 (예를 들어, 아미노펩티다제 인식 분자, 아미노펩티다제 절단 시약)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 아미노펩티다제는 표 3 또는 표 4에 열거된 아미노펩티다제와 25-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90%, 90-95%, 또는 95-99%, 또는 그 초과의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 아미노펩티다제는 변형된 아미노펩티다제이고, 표 3 또는 표 4에 제시된 서열에 비해 1개 이상의 아미노산 돌연변이를 포함한다.
표 3. 아미노펩티다제의 비-제한적 예.
Figure pct00007
Figure pct00008
표 4. 비-특이적 아미노펩티다제의 비-제한적 예.
Figure pct00009
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Figure pct00011
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2개 이상의 아미노산 서열을 비교하는 목적을 위해, 제1 아미노산 서열 및 제2 아미노산 서열 사이의 "서열 동일성"의 백분율 (또한 본원에서 "아미노산 동일성"으로 지칭됨)은 [제2 아미노산 서열 중의 상응하는 위치에서의 아미노산 잔기와 동일한 제1 아미노산 서열 중의 아미노산 잔기의 수]를 [제1 아미노산 서열 중의 아미노산 잔기의 총 수]로 나누고, [100]을 곱함으로써 계산될 수 있으며, 여기서 제1 아미노산 서열에 비해 제2 아미노산 서열 중의 아미노산 잔기의 각각의 결실, 삽입, 치환 또는 부가는 단일 아미노산 잔기 (위치)에서의 차이로 간주된다. 대안적으로, 2개의 아미노산 서열 사이의 서열 동일성의 정도는 공지된 컴퓨터 알고리즘 (예를 들어, 문헌 [Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c]의 국소 상동성 알고리즘에 의해, 문헌 [Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. (1970) 48:443]의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, 문헌 [Pearson and Lipman. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998) 85:2444]의 유사성에 대한 검색 방법에 의해, 또는 블라스트(Blast), 클러스탈 오메가(Clustal Omega)로서 이용가능한 알고리즘의 컴퓨터화 실행, 또는 다른 서열 정렬 알고리즘에 의해), 및 예를 들어, 표준 설정을 사용하여 계산될 수 있다. 통상적으로, 상기 개요된 계산 방법에 따른 2개의 아미노산 서열 사이의 "서열 동일성"의 백분율을 결정하는 목적을 위해, 최대 수의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열은 "제1" 아미노산 서열로서 취해질 것이고, 다른 아미노산 서열은 "제2" 아미노산 서열로서 취해질 것이다.
추가적으로, 또는 대안적으로, 2개 이상의 서열은 서열 사이의 동일성에 대해 평가될 수 있다. 2개 이상의 핵산 또는 아미노산 서열의 맥락에서 용어 "동일한" 또는 퍼센트 "동일성"은 동일한 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 2개의 서열은, 2개의 서열이 비교 창, 또는 상기 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하여 측정된 바와 같이 지정된 영역에 비해 또는 수동 정렬 및 육안 검사에 의해 최대 상응성에 대해 비교되고 정렬되는 경우, 특정된 영역에 비해 또는 전체 서열에 비해 동일한 (예를 들어, 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9% 동일한) 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 특정된 백분율을 갖는 경우에 "실질적으로 동일하다". 임의로, 동일성은 적어도 약 25, 50, 75, 또는 100개의 아미노산의 길이인 영역에 걸쳐, 또는 100 내지 150개, 150 내지 200개, 100 내지 200개, 또는 200개 이상의 아미노산의 길이인 영역에 걸쳐 존재한다.
추가적으로, 또는 대안적으로, 2개 이상의 서열은 서열 사이의 정렬에 대해 평가될 수 있다. 2개 이상의 핵산 또는 아미노산 서열의 맥락에서 용어 "정렬" 또는 퍼센트 "정렬"은 동일한 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 2개의 서열은, 2개의 서열이 비교 창, 또는 상기 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하여 측정된 바와 같이 지정된 영역에 비해 또는 수동 정렬 및 육안 검사에 의해 최대 상응성에 대해 비교되고 정렬되는 경우, 특정된 영역에 비해 또는 전체 서열에 비해 동일한 (예를 들어, 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% 또는 99.9% 동일한) 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 특정된 백분율을 갖는 경우에 "실질적으로 정렬된다". 임의로, 정렬은 적어도 약 25, 50, 75, 또는 100개의 아미노산의 길이인 영역에 걸쳐, 또는 100 내지 150개, 150 내지 200개, 100 내지 200개, 또는 200개 이상의 아미노산의 길이인 영역에 걸쳐 존재한다.
단백질 분자 외에도, 핵산 분자는 본 출원에 따른 친화도 시약 (예를 들어, 아미노산 인식 분자)으로서 사용하기 위한 다양한 유리한 특성을 갖는다.
핵산 압타머는 높은 친화도 및 선택성으로 요망되는 표적에 결합하도록 조작된 핵산 분자이다. 따라서, 핵산 압타머는 관련 기술분야에 공지된 선택 및/또는 풍부화 기법을 사용하여 아미노산의 요망되는 유형에 선택적으로 결합하도록 조작될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 친화도 시약은 핵산 압타머 (예를 들어, DNA 압타머, RNA 압타머)를 포함한다. 도 1c에 나타내어진 바와 같이, 일부 실시양태에서, 표지된 친화도 시약은 말단 아미노산의 하나의 유형에 선택적으로 결합하는 표지된 압타머 (104)이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 표지된 압타머 (104)는 본원에 기재된 바와 같이 폴리펩티드의 말단에서 아미노산의 하나의 유형 (예를 들어, 아미노산의 단일 유형 또는 아미노산의 유형의 하위세트)에 선택적으로 결합한다. 나타내어지지는 않았지만, 표지된 압타머 (104)는 본 출원의 방법에 따라 폴리펩티드의 임의의 위치에서 (예를 들어, 폴리펩티드의 말단 위치에서 또는 말단 및 내부 위치에서) 아미노산의 하나의 유형에 선택적으로 결합하도록 조작될 수 있음이 인지되어야 한다.
일부 실시양태에서, 표지된 친화도 시약은 결합-유도된 발광을 갖는 표지를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 표지된 압타머 (106)는 공여자 표지 (112) 및 수용자 표지 (114)를 포함하며, 도 1c의 패널 (I) 및 (II)에 예시된 바와 같이 기능한다. 패널 (I)에 도시된 바와 같이, 유리 분자로서 표지된 압타머 (106)는 공여자 표지 (112) 및 수용자 표지 (114)가 표지 사이에 검출가능한 FRET를 제한하는 거리 (예를 들어, 약 10 nm 이상)에 의해 분리된 형태를 채택한다. 패널 (II)에 도시된 바와 같이, 선택적으로 결합된 분자로서 표지된 압타머 (106)는 공여자 표지 (112) 및 수용자 표지 (114)가 표지 사이에 검출가능한 FRET를 촉진시키는 거리 (예를 들어, 약 10 nm 이하) 내인 형태를 채택한다. 추가의 다른 실시양태에서, 표지된 압타머 (106)는 켄칭 모이어티를 포함하고, 분자 신호등과 유사하게 기능하며, 여기서 표지된 압타머 (106)의 발광은 유리 분자로서 내부적으로 켄칭되고, 선택적으로 결합된 분자로서 복원된다 (예를 들어, 문헌 [Hamaguchi, et al. (2001) Analytical Biochemistry 294, 126-131] 참조). 이론에 구애되기를 원하지는 않지만, 결합-유도된 발광을 위한 메커니즘의 이들 및 다른 유형은 유리하게는 배경 발광을 감소시키거나 제거하여 본원에 기재된 방법의 전체 민감도 및 정확도를 증가시킬 수 있다.
폴리펩티드의 말단 아미노산을 확인하는 방법 외에도, 본 출원은 표지된 친화도 시약을 사용하여 폴리펩티드를 시퀀싱하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 시퀀싱의 방법은 폴리펩티드 말단을 말단 아미노산 검출 및 말단 아미노산 절단의 반복된 사이클로 처리하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 출원은 폴리펩티드를 본원에 기재된 1개 이상의 표지된 친화도 시약과 접촉시키고, 폴리펩티드를 에드만 분해로 처리하는 것을 포함하는, 폴리펩티드의 아미노산 서열을 결정하는 방법을 제공한다.
통상적인 에드만 분해는 폴리펩티드의 말단 아미노산을 변형시키고 절단하는 반복된 사이클을 포함하고, 여기서 각각의 연속적으로 절단된 아미노산을 확인하여 폴리펩티드의 아미노산 서열을 결정한다. 통상적인 에드만 분해의 예시적인 예로서, 폴리펩티드의 N-말단 아미노산은 페닐 이소티오시아네이트 (PITC)를 사용하여 변형되어 PITC-유도체화된 N-말단 아미노산을 형성한다. 그 후, PITC-유도체화된 N-말단 아미노산은 산성 조건, 염기성 조건, 및/또는 승온을 사용하여 절단된다. 또한, PITC-유도체화된 N-말단 아미노산을 절단하는 단계는 중성 또는 중성 부근의 pH에서의 상대적으로 보다 온건한 절단 조건을 포함하는 원충 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi)로부터의 변형된 시스테인 프로테아제를 사용하여 효소적으로 달성될 수 있음이 보여졌다. 유용한 효소의 비-제한적 예는 발명의 명칭이 "반복적인 폴리펩티드 분석 및 프로세싱을 위한 분자 및 방법"인 2016년 9월 2일에 출원된 미국 특허 출원 번호 15/255,433에 기재되어 있다.
본 출원에 따른 표지된 친화도 시약을 사용한 에드만 분해에 의한 시퀀싱의 예는 도 1d에 도시된다. 일부 실시양태에서, 에드만 분해에 의한 시퀀싱은 링커 (124)를 통해 고체 지지체의 표면 (130)에 고정화된 (예를 들어, 샘플 웰의 바닥 또는 측벽 표면에 고정화된) 폴리펩티드 (122)를 제공하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이, 폴리펩티드 (122)는 다른 말단이 말단 아미노산의 검출 및 절단에 자유롭도록 하나의 말단 (예를 들어, 아미노-말단 아미노산 또는 카르복시-말단 아미노산)에서 고정화된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 에드만 분해 방법에 사용되는 시약은 폴리펩티드 (122)의 비-고정화된 (예를 들어, 유리) 말단에서 말단 아미노산과 우선적으로 상호작용한다. 이렇게 하여, 폴리펩티드 (122)는 검출 및 절단의 반복된 사이클에 걸쳐 고정화되어 잔류한다. 이 목적으로, 일부 실시양태에서, 링커 (124)는 예를 들어, 화학적 절단 조건 하에서 표면 (130)으로부터 폴리펩티드 (122)의 탈착을 제한하기 위해, 검출 및 절단에 사용되는 조건의 요망되는 세트에 따라 디자인될 수 있다. 폴리펩티드를 표면에 고정화하기 위한 적합한 링커 조성물 및 기법은 본원의 다른 곳에 상세하게 기재되어 있다.
본 출원에 따르면, 일부 실시양태에서, 에드만 분해에 의한 시퀀싱의 방법은 (1) 폴리펩티드 (122)를 말단 아미노산의 1개 이상의 유형에 선택적으로 결합하는 1개 이상의 표지된 친화도 시약과 접촉시키는 단계를 포함한다. 나타내어진 바와 같이, 일부 실시양태에서, 표지된 친화도 시약 (108)은 말단 아미노산에 선택적으로 결합함으로써 폴리펩티드 (122)와 상호작용한다. 일부 실시양태에서, 단계 (1)은 폴리펩티드 (122)의 말단 아미노산 (예를 들어, 유리 말단 아미노산)에 선택적으로 결합하지 않는 1개 이상의 표지된 친화도 시약 중 임의의 것을 제거하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 표지된 친화도 시약 (108)을 검출함으로써 폴리펩티드 (122)의 말단 아미노산을 확인하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 검출은 표지된 친화도 시약 (108)으로부터 발광을 검출하는 것을 포함한다. 본원에 기재된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 발광은 표지된 친화도 시약 (108)과 고유하게 회합되고, 발광은 그에 의해 표지된 친화도 시약 (108)이 선택적으로 결합하는 아미노산의 유형과 회합된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 아미노산의 유형은 표지된 친화도 시약 (108)의 하나 이상의 발광 특성을 결정함으로써 확인된다.
일부 실시양태에서, 에드만 분해에 의한 시퀀싱의 방법은 폴리펩티드 (122)의 말단 아미노산을 제거하는 단계 (2)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단계 (2)는 폴리펩티드 (122)로부터 표지된 친화도 시약 (108) (예를 들어, 말단 아미노산에 선택적으로 결합하는 1개 이상의 표지된 친화도 시약 중 임의의 것)을 제거하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단계 (2)는 말단 아미노산을 이소티오시아네이트 (예를 들어, PITC)와 접촉시켜 이소티오시아네이트-변형된 말단 아미노산을 형성함으로써 폴리펩티드 (122)의 말단 아미노산 (예를 들어, 유리 말단 아미노산)을 변형시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이소티오시아네이트-변형된 말단 아미노산은 비변형된 말단 아미노산보다 절단 시약 (예를 들어, 화학적 또는 효소적 절단 시약)에 의한 제거에 더 감수성이다.
일부 실시양태에서, 단계 (2)는 폴리펩티드 (122)를 이소티오시아네이트-변형된 말단 아미노산에 특이적으로 결합하고 이를 절단하는 프로테아제 (140)와 접촉시킴으로써 말단 아미노산을 제거하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로테아제 (140)는 변형된 시스테인 프로테아제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로테아제 (140)는 변형된 시스테인 프로테아제, 예컨대 트리파노소마 크루지로부터의 시스테인 프로테아제를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Borgo, et al. (2015) Protein Science 24:571-579] 참조). 추가의 다른 실시양태에서, 단계 (2)는 폴리펩티드 (122)를 이소티오시아네이트-변형된 말단 아미노산을 절단하는데 충분한 화학적 (예를 들어, 산성, 염기성) 조건으로 처리함으로써 말단 아미노산을 제거하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 에드만 분해에 의한 시퀀싱의 방법은 말단 아미노산 절단 후 폴리펩티드 (122)를 세척하는 단계 (3)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세척은 프로테아제 (140)를 제거하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세척은 폴리펩티드 (122)를 중성 pH 조건으로 복원하는 것 (예를 들어, 산성 또는 염기성 조건에 의한 화학적 절단 후)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 에드만 분해에 의한 시퀀싱의 방법은 복수개의 사이클 동안 단계 (1) 내지 (3)을 반복하는 것을 포함한다.
에드만 분해에 의한 시퀀싱의 예시 방법은 도 1e에 나타내어진다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 복합체 혼합물 (예를 들어, 단백질의 혼합물)을 함유하는 샘플은 통상적인 효소를 사용하여 대략 6 내지 40개의 아미노산의 짧은 폴리펩티드 단편으로 분해될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 출원의 방법에 따른 이 폴리펩티드 라이브러리의 시퀀싱은 원래 복합체 혼합물에 존재하는 폴리펩티드의 각각의 동일성 및 풍부도를 밝힐 것이다. 본원에 및 문헌에 기재된 바와 같이, 6 내지 40개의 아미노산의 크기 범위의 대부분의 폴리펩티드는 폴리펩티드 쇄 내의 단지 4개의 아미노산의 수 및 위치를 결정함으로서 고유하게 확인될 수 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, 에드만 분해에 의한 시퀀싱의 방법은 4가지 DNA 압타머 유형을 포함하는 표지된 압타머 (150)의 세트를 사용하여 수행될 수 있으며, 각각의 유형은 상이한 N-말단 아미노산을 인식한다. 각각의 압타머 유형은, 상이한 압타머 유형이 하나 이상의 발광 특성에 기반하여 구별될 수 있도록, 상이한 발광 표지로 표지될 수 있다. 예시적인 목적을 위해, 표지된 압타머 (150)의 예시 세트는 제1 발광 표지 ("염료 1")로 표지된 시스테인-특이적 압타머; 제2 발광 표지 ("염료 2")로 표지된 리신-특이적 압타머; 제3 발광 표지 ("염료 3")로 표지된 트립토판-특이적 압타머; 및 제4 발광 표지 ("염료 4")로 표지된 글루타메이트-특이적 압타머를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 출원에 따른 에드만 분해에 의한 시퀀싱의 방법은 도 1e에 나타내어진 프로세스 (152)에 따라 진행된다. 일부 실시양태에서, 단계 (1) 전에, 폴리펩티드 라이브러리로부터의 단일 폴리펩티드 분자는 고체 지지체의 표면에, 예를 들어, 샘플 웰의 어레이의 샘플 웰의 바닥 또는 측벽 표면에서 고정화된다. 일부 실시양태에서, 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이, 표면 고정화를 가능하게 하거나 (예를 들어, 비오틴), 용해도를 개선시키는 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드) 모이어티는 폴리펩티드의 C-말단에 화학적으로 또는 효소적으로 부착될 수 있다. 각각의 폴리펩티드의 서열을 결정하기 위해, 일부 실시양태에서, 고정화된 폴리펩티드는 프로세스 (152)에 의해 예시된 바와 같이, N-말단 아미노산 검출 및 N-말단 아미노산 절단의 반복된 사이클로 처리된다. 일부 실시양태에서, 프로세스 (152)는 자동화된 유체 시스템을 사용하여 검출 표면 위의 플로우셀 내로의 주사에 의해 수행되는 시약 첨가 및 세척 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단계 (1) 내지 (4)는 표지된 압타머 (150)를 사용한 검출 및 절단의 하나의 사이클을 예시한다.
일부 실시양태에서, 프로세스 (152)에 따른 에드만 분해에 의한 시퀀싱의 방법은 4개의 직교로 표지된 DNA 압타머의 혼합물에서 유동시키고, 압터머가 N-말단에 4개의 정확한 아미노산 중 하나를 함유하는 임의의 고정화된 폴리펩티드 (예를 들어, 어레이의 샘플 웰 내에 고정화된 폴리펩티드)에 결합하는 것을 허용하도록 인큐베이션하는 단계 (1)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 고정화된 폴리펩티드를 세척하여 비결합된 압타머를 제거하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 고정화된 폴리펩티드를 영상화하는 것 ("영상화 단계 1")을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 획득된 영상은 압타머-결합된 폴리펩티드의 위치 (예를 들어, 샘플 웰의 어레이 내의 위치) 및 4개의 압타머 중 어느 것이 각각의 위치에 결합되는지를 결정하는데 충분한 정보를 함유한다. 일부 실시양태에서, 방법은 고정화된 폴리펩티드를 적절한 버퍼를 사용하여 세척하여 고정화된 폴리펩티드로부터 압타머를 제거하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 프로세스 (152)에 따른 시퀀싱의 방법은 N-말단 아민 기를 특이적으로 변형시키는 반응성 분자 (예를 들어, 나타내어진 바와 같은 PITC)를 함유하는 용액에서 유동시키는 단계 (2)를 포함한다. 이소티오시아네이트 분자, 예컨대 PITC는 일부 실시양태에서, N-말단 아미노산을 변형된 프로테아제, 예컨대 트리파노소마 크루지로부터의 시스테인 프로테아제 크루자인에 의해 절단을 위한 기질로 변형시킨다.
일부 실시양태에서, 프로세스 (152)에 따른 시퀀싱의 방법은 고정화된 폴리펩티드를 세척한 후, 고정화된 폴리펩티드로부터 변형된 N-말단 아미노산을 인식하고 절단하는 적합한 변형된 프로테아제에서 유동시키는 단계 (3)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 효소적 절단 후에 고정화된 폴리펩티드를 세척하는 단계 (4)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단계 (1) 내지 (4)는 에드만 분해의 하나의 사이클을 도시한다. 따라서, 나타내어진 바와 같은 단계 (1')는 단계 (1) 내지 (4)에 대해 상기 기재된 바와 같이 수행되는 단계 (1') 내지 (4')로서 진행되는 다음 반응 사이클의 시작이다. 일부 실시양태에서, 단계 (1) 내지 (4)는 대략 20-40 사이클 동안 반복된다.
일부 실시양태에서, 표지된 이소티오시아네이트 (예를 들어, 염료-표지된 PITC)는 샘플 로딩을 모니터링하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 샘플을 프로세스 (152)에 나타내어진 바와 같은 시퀀싱의 방법으로 처리하기 전에, 폴리펩티드 샘플은 염료-표지된 PITC를 사용한 말단 단부의 변형에 의해 말단 단부에서 발광 표지로 사전-접합된다. 이렇게 하여, 샘플 웰의 어레이 내로의 폴리펩티드 샘플의 로딩은 프로세스 (152)을 개시하기 전에 표지로부터 발광을 검출함으로써 모니터링될 수 있다. 일부 실시양태에서, 발광은 어레이 중 샘플 웰의 단일 점유도 (예를 들어, 단일 폴리펩티드 분자을 함유하는 샘플 웰의 분율)를 결정하는데 사용되며, 이는 유리하게는 주어진 샘플에 대해 신뢰성 있게 수득되는 정보의 양을 증가시킬 수 있다. 요망되는 샘플 로딩 상태가 발광에 의해 결정되면, 프로세스 (152)는 단계 (1)로 진행하기 전에, 기재된 바와 같이 화학적 또는 효소적 절단에 의해 개시될 수 있다.
일부 실시양태에서, 표지된 이소티오시아네이트 (예를 들어, 염료-표지된 PITC)는 어레이 중의 폴리펩티드 샘플에 대한 반응 진행을 모니터링하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 단계 (2)는 샘플 중의 폴리펩티드의 N-말단 아민 기를 특이적으로 변형시키고 표지하는 염료-표지된 PITC를 함유하는 용액에서 유동시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표지로부터의 발광을 단계 (2) 동안 또는 후에 검출하여 샘플 중의 폴리펩티드의 N-말단 PITC 변형을 평가할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 발광은 단계 (2)로부터 단계 (3)으로 진행하는지 여부 또는 시기를 결정하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 표지로부터의 발광을 단계 (3) 동안 또는 후에 검출하여 샘플 중의 폴리펩티드의 N-말단 아미노산 절단을 평가할 - 예를 들어, 단계 (3)으로부터 단계 (4)로 진행하는지 여부 또는 시기를 결정할 수 있다.
프로세스 (152)에 따른 시퀀싱의 방법은 폴리펩티드의 말단 아미노산을 검출하고 절단하기 위한 별개의 시약을 이용한다. 그럼에도 불구하고, 일부 측면에서, 본 출원은 펩티다제를 포함하는 단일 시약이 폴리펩티드의 말단 아미노산을 검출하고 절단하는데 사용될 수 있는 시퀀싱의 방법을 제공한다. 도 2는 표지된 엑소펩티다제 (200)의 세트를 사용한 폴리펩티드 시퀀싱의 예를 나타내고, 여기서 각각의 표지된 엑소펩티다제는 말단 아미노산의 상이한 유형에 선택적으로 결합하고 이를 절단한다.
도 2의 예에 일반적으로 예시된 바와 같이, 표지된 엑소펩티다제 (200)는 제1 발광 표지를 포함하는 리신-특이적 엑소펩티다제, 제2 발광 표지를 포함하는 글리신-특이적 엑소펩티다제, 제3 발광 표지를 포함하는 아스파르테이트-특이적 엑소펩티다제, 및 제4 발광 표지를 포함하는 류신-특이적 엑소펩티다제를 포함한다. 본원에 기재된 특정 실시양태에 따르면, 표지된 엑소펩티다제 (200)의 각각은 단지 그 아미노산이 폴리펩티드의 아미노- 또는 카르복시-말단에 있는 경우에만 그의 각각의 아미노산에 선택적으로 결합하고 이를 절단한다. 따라서, 이 접근법에 의한 시퀀싱은 펩티드의 하나의 말단으로부터 다른 것을 향해 진행하기 때문에, 표지된 엑소펩티다제 (200)는 세트의 모든 시약이 아미노펩티다제 또는 카르복시펩티다제 활성 중 어느 하나를 가질 것이도록 조작되거나 선택된다.
도 2에 추가로 나타내어진 바와 같이, 프로세스 (202)는 표지된 엑소펩티다제 (200)를 사용한 실시간 시퀀싱 반응을 개략적으로 예시한다. 패널 (I) 내지 (IX)는 하기 나타내어진, 및 각각의 패널에 도시된 사건에 상응하는 신호 출력에 관한 폴리펩티드의 말단 단부에서의 반복적인 검출 및 절단을 포함하는 사건의 진행을 예시한다. 예시적인 목적을 위해, "KLDG..."의 임의적으로 선택된 아미노산 서열 (하나의 말단으로부터 다른 것을 향해 진행함)을 갖는 폴리펩티드가 나타내어진다.
패널 (I)은 시퀀싱 반응의 시작을 도시하고, 여기서 폴리펩티드는 고체 지지체의 표면, 예컨대 샘플 웰의 바닥 또는 측벽 표면에 고정화된다. 일부 실시양태에서, 본 출원에 따른 시퀀싱 방법은 실시간으로의 단일 분자 시퀀싱을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수개의 단일 분자 시퀀싱 반응은 샘플 웰의 어레이에서 동시에 수행된다. 이러한 실시양태에서, 폴리펩티드 고정화는 단일 분자 분석을 위해 폴리펩티드를 샘플 웰 내에 고정시킴으로써 샘플 웰 외부로의 폴리펩티드의 확산을 방지한다.
패널 (II)는 검출 사건을 도시하고, 여기서 표지된 친화도 시약 (200)의 세트로부터의 리신-특이적 엑소펩티다제는 폴리펩티드의 말단 리신 잔기에 선택적으로 결합한다. 패널 (I) 및 (II) 아래의 신호 트레이스에 나타내어진 바와 같이, 신호 출력은 리신-특이적 엑소펩티다제의 발광 표지를 확인하며, 그에 의해 말단 아미노산을 확인하는데 사용될 수 있는 신호 강도의 증가를 표시함으로써 이 결합 사건에 대해 보고한다. 패널 (III)은 말단 아미노산에 선택적으로 결합한 후, 표지된 펩티다제가 말단 아미노산을 절단하는 것을 예시한다. 그 결과, 이들 성분은 패널 (III) 아래의 트레이스에 나타내어진 바와 같이, 신호 강도의 강하에 의해 신호 출력에서 보고되는 발광 검출에 대한 관찰 영역으로부터 확산되는데 자유롭다. 패널 (IV) 내지 (IX)는 패널 (I) 내지 (III)에 대해 기재된 바와 같은 프로세스와 유사하게 진행된다. 즉, 표지된 엑소펩티다제는 상응하는 말단 아미노산에 결합하고 이를 절단하여 신호 출력에서 각각 상응하는 증가 및 감소를 생성한다.
일부 측면에서, 본 출원은 말단 아미노산과 표지된 아미노산 인식 분자 (예를 들어, 표지된 친화도 시약) 및 표지된 절단 시약 (예를 들어, 표지된 비-특이적 엑소펩티다제)의 결합 상호작용을 평가하는 것에 의한 실시간으로의 폴리펩티드 시퀀싱의 방법을 제공한다. 도 3a는 별개의 결합 사건이 신호 출력 (300)의 신호 펄스를 발생시키는 시퀀싱의 방법의 예를 나타낸다. 도 3a의 삽도 패널은 이 접근법에 의한 실시간 시퀀싱의 일반적 스킴을 예시한다. 나타내어진 바와 같이, 표지된 친화도 시약 (310)은 말단 아미노산을 확인하는데 사용될 수 있는 신호 출력 (300)에서 일련의 펄스를 발생시키는 말단 아미노산 (여기서 리신으로 나타내어짐)과 선택적으로 회합하고 (예를 들어, 그에 결합하고), 그로부터 해리된다. 일부 실시양태에서, 일련의 펄스는 상응하는 말단 아미노산의 동일성의 진단제일 수 있는 펄싱 패턴 (예를 들어, 특징적인 패턴)을 제공한다.
이론에 구애되기를 원하지는 않지만, 표지된 친화도 시약 (310)은 결합의 회합 속도, 또는 "온" 레이트 (kon) 및 결합의 해리 속도, 또는 "오프" 레이트 (koff)에 의해 정의되는 결합 친화도 (KD)에 따라 선택적으로 결합한다. 속도 상수 koff 및 kon은 각각 펄스 지속기간 (예를 들어, 검출가능한 결합 사건에 상응하는 시간) 및 펄스간 지속기간 (예를 들어, 검출가능한 결합 사건 사이의 시간)의 중요한 결정자이다. 일부 실시양태에서, 이들 속도는 가장 양호한 시퀀싱 정확도를 제공하는 펄스 지속기간 및 펄스 속도 (예를 들어, 신호 펄스의 빈도)를 달성하도록 조작될 수 있다.
삽도 패널에 나타내어진 바와 같이, 시퀀싱 반응 혼합물은 표지된 친화도 시약 (310)의 그것과는 상이한 발광 표지를 포함하는 표지된 비-특이적 엑소펩티다제 (320)를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 표지된 비-특이적 엑소펩티다제 (320)는 표지된 친화도 시약 (310)의 그것 미만인 농도로 혼합물에 존재한다. 일부 실시양태에서, 표지된 비-특이적 엑소펩티다제 (320)는 그것이 말단 아미노산의 대부분 또는 모든 유형을 절단하도록 폭넓은 특이성을 나타낸다. 따라서, 동적 시퀀싱 접근법은 엑소펩티다제 절단 활성에 의해 촉매되는 분해 반응의 과정에 걸쳐 폴리펩티드의 말단에서 친화도 시약 결합을 모니터링하는 것을 포함할 수 있다.
신호 출력 (300)의 진행에 의해 예시된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 표지된 비-특이적 엑소펩티다제 (320)에 의한 말단 아미노산 절단은 신호 펄스를 발생시키고, 이들 사건은 표지된 친화도 시약 (310)의 결합 펄스보다 더 낮은 빈도로 일어난다. 이렇게 하여, 폴리펩티드의 아미노산은 실시간 시퀀싱 프로세스에서 카운팅되고/거나 확인될 수 있다. 신호 출력 (300)에서 추가로 예시된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 각각 상응하는 말단 아미노산을 확인하는데 사용될 수 있는 진단 펄싱 패턴 (예를 들어, 특징적인 패턴)을 갖는 복수개의 표지된 친화도 시약이 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 상이한 특징적인 패턴 (신호 출력 (300)에서 리신, 페닐알라닌, 및 글루타민의 각각에 의해 예시된 바와 같이)은 1개 초과의 표지된 친화도 시약과 말단 아미노산의 상이한 유형의 회합에 상응한다. 본원에 기재된 바와 같이, 아미노산의 1개 초과의 유형과 회합하는 단일 친화도 시약이 본 출원에 따라 사용될 수 있음이 인지되어야 한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 상이한 특징적인 패턴은 하나의 표지된 친화도 시약과 말단 아미노산의 상이한 유형의 회합에 상응한다.
본원에 기재된 바와 같이, 신호 펄스 정보는 일련의 신호 펄스에서의 특징적인 패턴에 기반하여 아미노산을 확인하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 특징적인 패턴은 복수개의 신호 펄스를 포함하며, 각각의 신호 펄스는 펄스 지속기간을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수개의 신호 펄스는 특징적인 패턴에서의 펄스 지속기간의 분포의 요약 통계 (예를 들어, 평균, 중위값, 시간 분해 상수)를 특징으로 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 특징적인 패턴의 평균 펄스 지속기간은 약 1 밀리초 내지 약 10 초 (예를 들어, 약 1 ms 내지 약 1 s, 약 1 ms 내지 약 100 ms, 약 1 ms 내지 약 10 ms, 약 10 ms 내지 약 10 s, 약 100 ms 내지 약 10 s, 약 1 s 내지 약 10 s, 약 10 ms 내지 약 100 ms, 또는 약 100 ms 내지 약 500 ms)이다. 일부 실시양태에서, 단일 폴리펩티드 중의 아미노산의 상이한 유형에 상응하는 상이한 특징적인 패턴은 요약 통계에서의 통계적으로 유의한 차이에 기반하여 서로로부터 구별될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 하나의 특징적인 패턴은 적어도 10 밀리초 (예를 들어, 약 10 ms 내지 약 10 s, 약 10 ms 내지 약 1 s, 약 10 ms 내지 약 100 ms, 약 100 ms 내지 약 10 s, 약 1 s 내지 약 10 s, 또는 약 100 ms 내지 약 1 s)의 평균 펄스 지속기간의 차이에 기반하여 또 다른 특징적인 패턴으로부터 구별가능할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상이한 특징적인 패턴 사이의 평균 펄스 지속기간의 보다 작은 차이는 통계적 신뢰도를 갖고 하나를 또 다른 것으로부터 구별하는 각각의 특징적인 패턴 내의 보다 큰 수의 펄스 지속기간을 요구할 수 있음이 인지되어야 한다.
상기 상세화된 바와 같이, 도 3a에 의해 예시된 바와 같은 실시간 시퀀싱 프로세스는 일반적으로 말단 아미노산 인식 및 말단 아미노산 절단의 사이클을 포함할 수 있고, 여기서 인식 및 절단의 상대적 발생은 표지된 친화도 시약 (310) 및 표지된 비-특이적 엑소펩티다제 (320) 사이의 농도 격차에 의해 제어될 수 있다. 일부 실시양태에서, 농도 격차는 개별적인 아미노산의 인식 동안 검출되는 신호 펄스의 수가 확인을 위한 요망되는 신뢰 구간을 제공하도록 최적화될 수 있다. 예를 들어, 초기 시퀀싱 반응이 요망되는 신뢰 구간을 갖는 특징적인 패턴의 결정을 허용하기에는 너무 적은 절단 사건 사이의 신호 펄스를 갖는 신호 데이터를 제공하는 경우, 시퀀싱 반응은 친화도 시약에 비해 비-특이적 엑소펩티다제의 감소된 농도를 사용하여 반복될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 출원에 따른 폴리펩티드 시퀀싱은 폴리펩티드를 1개 이상의 아미노산 인식 분자 (예를 들어, 친화도 시약) 및/또는 1개 이상의 절단 시약 (예를 들어, 엑소펩티다제)를 포함하는 시퀀싱 반응 혼합물과 접촉시킴으로써 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 시퀀싱 반응 혼합물은 약 10 nM 내지 약 10 μM의 농도로 아미노산 인식 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 시퀀싱 반응 혼합물은 약 500 nM 내지 약 500 μM의 농도로 절단 시약을 포함한다.
일부 실시양태에서, 시퀀싱 반응 혼합물은 약 100 nM 내지 약 10 μM, 약 250 nM 내지 약 10 μM, 약 100 nM 내지 약 1 μM, 약 250 nM 내지 약 1 μM, 약 250 nM 내지 약 750 nM, 또는 약 500 nM 내지 약 1 μM의 농도로 아미노산 인식 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 시퀀싱 반응 혼합물은 약 100 nM, 약 250 nM, 약 500 nM, 약 750 nM, 또는 약 1 μM의 농도로 아미노산 인식 분자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 시퀀싱 반응 혼합물은 약 500 nM 내지 약 250 μM, 약 500 nM 내지 약 100 μM, 약 1 μM 내지 약 100 μM, 약 500 nM 내지 약 50 μM, 약 1 μM 내지 약 100 μM, 약 10 μM 내지 약 200 μM, 또는 약 10 μM 내지 약 100 μM의 농도로 절단 시약을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시퀀싱 반응 혼합물은 약 1 μM, 약 5 μM, 약 10 μM, 약 30 μM, 약 50 μM, 약 70 μM, 또는 약 약 100 μM의 농도로 절단 시약을 포함한다.
일부 실시양태에서, 시퀀싱 반응 혼합물은 약 10 nM 내지 약 10 μM의 농도로 아미노산 인식 분자, 및 약 500 nM 내지 약 500 μM의 농도로 절단 시약을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시퀀싱 반응 혼합물은 약 100 nM 내지 약 1 μM의 농도로 아미노산 인식 분자, 및 약 1 μM 내지 약 100 μM의 농도로 절단 시약을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시퀀싱 반응 혼합물은 약 250 nM 내지 약 1 μM의 농도로 아미노산 인식 분자, 및 약 10 μM 내지 약 100 μM의 농도로 절단 시약을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시퀀싱 반응 혼합물은 약 500 nM의 농도로 아미노산 인식 분자, 및 약 25 μM 내지 약 75 μM의 농도로 절단 시약을 포함한다.
일부 실시양태에서, 시퀀싱 반응 혼합물은 약 500:1, 약 400:1, 약 300:1, 약 200:1, 약 100:1, 약 75:1, 약 50:1, 약 25:1, 약 10:1, 약 5:1, 약 2:1, 또는 약 1:1의 비로 아미노산 인식 분자 및 절단 시약을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시퀀싱 반응 혼합물은 약 10:1 내지 약 200:1의 비로 아미노산 인식 분자 및 절단 시약을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시퀀싱 반응 혼합물은 약 50:1 내지 약 150:1의 비로 아미노산 인식 분자 및 절단 시약을 포함한다.
도 3a에 의해 예시된 예는 표지된 절단 시약을 사용한 시퀀싱 프로세스에 관한 것이지만, 시퀀싱 프로세스는 이 점에 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이, 본 발명자들은 비표지된 절단 시약을 사용한 단일-분자 시퀀싱을 입증하였다. 일부 실시양태에서, 절단 시약이 연속적인 말단 아미노산을 제거하는 대략적 빈도는 예를 들어, 사용되는 효소의 공지된 활성 및/또는 농도에 기반하여 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 시약에 의한 말단 아미노산 절단은 예를 들어, 아미노산 인식을 위해 검출되는 신호 또는 검출되는 신호의 결여에 기반하여 추론된다. 본 발명자들은 기재된 바와 같은 농도 격차 접근법과 조합으로, 또는 그에 대해 대안적으로 사용될 수 있는 실시간 시퀀싱 반응을 제어하기 위한 추가의 기법을 인식하였다.
온도-의존성 실시간 시퀀싱 프로세스의 예는 도 3b에 나타내어진다. 패널 (I) 내지 (III)은 온도-의존성 말단 아미노산 인식 및 말단 아미노산 절단의 사이클을 포함하는 시퀀싱 반응을 예시한다. 시퀀싱 반응의 각각의 사이클은 2가지 온도 범위에 걸쳐 수행된다: 엑소펩티다제 활성에 비해 친화도 시약 활성에 대해 최적인 (예를 들어, 말단 아미노산 인식을 촉진시키기 위한) 제1 온도 범위 ("T1"), 및 친화도 시약 활성에 비해 엑소펩티다제 활성에 대해 최적인 (예를 들어, 말단 아미노산 절단을 촉진시키기 위한) 제2 온도 범위 ("T2"). 시퀀싱 반응은 제1 온도 범위 T1 (아미노산 인식을 개시하기 위한) 및 제2 온도 범위 T2 (아미노산 절단을 개시하기 위한) 사이에 반응 혼합물 온도를 교대시킴으로써 진행된다. 따라서, 온도-의존성 시퀀싱 프로세스의 진행은 온도에 의해 제어가능하고, 상이한 온도 범위 사이에 (예를 들어, T1 및 T2 사이에) 교대시키는 것은 수동 또는 자동화된 프로세스를 통해 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 온도 범위 T2에 비해 제1 온도 범위 T1 내의 친화도 시약 활성 (예를 들어, 아미노산에 대한 결합 친화도 (KD))은 적어도 10배, 적어도 100배, 적어도 1,000배, 적어도 10,000배, 적어도 100,000배, 또는 그 초과 증가된다. 일부 실시양태에서, 제1 온도 범위 T1에 비해 제2 온도 범위 T2 내의 엑소펩티다제 활성 (예를 들어, 절단 생성물로의 기질 전환의 속도)은 적어도 2배, 10배, 적어도 25배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 1,000배, 또는 그 초과 증가된다.
일부 실시양태에서, 제1 온도 범위 T1은 제2 온도 범위 T2보다 더 낮다. 일부 실시양태에서, 제1 온도 범위 T1은 약 15℃ 내지 약 40℃ (예를 들어, 약 25℃ 내지 약 35℃, 약 15℃ 내지 약 30℃, 약 20℃ 내지 약 30℃)이다. 일부 실시양태에서, 제2 온도 범위 T2는 약 40℃ 내지 약 100℃ (예를 들어, 약 50℃ 내지 약 90℃, 약 60℃ 내지 약 90℃, 약 70℃ 내지 약 90℃)이다. 일부 실시양태에서, 제1 온도 범위 T1은 약 20℃ 내지 약 40℃ (예를 들어, 대략 30℃)이고, 제2 온도 범위 T2는 약 60℃ 내지 약 100℃ (예를 들어, 대략 80℃)이다.
일부 실시양태에서, 제1 온도 범위 T1은 제2 온도 범위 T2보다 더 높다. 일부 실시양태에서, 제1 온도 범위 T1은 약 40℃ 내지 약 100℃ (예를 들어, 약 50℃ 내지 약 90℃, 약 60℃ 내지 약 90℃, 약 70℃ 내지 약 90℃)이다. 일부 실시양태에서, 제2 온도 범위 T2는 약 15℃ 내지 약 40℃ (예를 들어, 약 25℃ 내지 약 35℃, 약 15℃ 내지 약 30℃, 약 20℃ 내지 약 30℃)이다. 일부 실시양태에서, 제1 온도 범위 T1은 약 60℃ 내지 약 100℃ (예를 들어, 대략 80℃)이고, 제2 온도 범위 T2는 약 20℃ 내지 약 40℃ (예를 들어, 대략 30℃)이다.
패널 (I)은 엑소펩티다제 활성에 비해 친화도 시약 활성에 대해 최적인 제1 온도 범위 T1 내인 온도에서의 시퀀싱 반응 혼합물을 도시한다. 예시적인 목적을 위해, 아미노산 서열 "KFVAG..."의 폴리펩티드가 나타내어진다. 반응 혼합물 온도가 제1 온도 범위 T1 내인 경우, 혼합물 중의 표지된 친화도 시약은 폴리펩티드 말단과 회합함으로써 아미노산 인식을 개시하도록 활성화된다 (예를 들어, 재생된다). 또한 제1 온도 범위 T1 내에서, 혼합물 중의 표지된 엑소펩티다제는 인식 동안 아미노산 절단을 방지하도록 불활성화된다 (예를 들어, 변성된다). 패널 (I)에서, 제1 친화도 시약은 폴리펩티드 말단에서 리신과 가역적으로 회합하는 것으로 나타내어진 반면, 표지된 엑소펩티다제 (예를 들어, Pfu 아미노펩티다제 I (Pfu API))는 변성된 것으로 나타내어진다. 일부 실시양태에서, 아미노산 인식은 아미노산의 절단을 개시하기 전의 시간의 미리 결정된 지속기간 동안 일어난다. 일부 실시양태에서, 아미노산 인식은 아미노산의 절단을 개시하기 전에 확인을 위해 요망되는 신뢰 구간에 도달할 것이 요구되는 시간의 지속기간 동안 일어난다. 아미노산 인식 후, 반응은 혼합물의 온도를 제2 온도 범위 T2 내로 변화시킴으로써 진행된다.
패널 (II)는 친화도 시약 활성에 비해 엑소펩티다제 활성에 대해 최적인 제2 온도 범위 T2 내인 온도에서의 시퀀싱 반응 혼합물을 도시한다. 이 예의 예시적인 목적을 위해, 제2 온도 범위 T2는 제1 온도 범위 T1보다 더 높지만, 시약 활성은 임의의 요망되는 온도 범위에 대해 최적일 수 있음이 인지되어야 한다. 따라서, 패널 (I)로부터 패널 (II)로의 진행은 적합한 열의 공급원을 사용하여 반응 혼합물 온도를 상승시킴으로써 수행된다. 반응 혼합물이 제2 온도 범위 T2 내인 온도에 도달할 경우, 혼합물 중의 표지된 엑소펩티다제는 엑소펩티다제 활성에 의해 말단 아미노산 절단을 개시하도록 활성화된다 (예를 들어, 재생된다). 또한 제2 온도 범위 T2 내에서, 혼합물 중의 표지된 친화도 시약은 절단 동안 아미노산 인식을 방지하도록 불활성화된다 (예를 들어, 변성된다). 패널 (II)에서, 표지된 엑소펩티다제는 말단 리신 잔기를 절단하는 것으로 나타내어진 반면, 표지된 친화도 시약은 변성된다. 일부 실시양태에서, 아미노산 절단은 폴리펩티드 말단에서 연속적인 아미노산의 인식을 개시하기 전의 시간의 미리 결정된 지속기간 동안 일어난다. 일부 실시양태에서, 아미노산 절단은 연속적인 아미노산의 인식을 개시하기 전에 절단을 검출하는데 요구되는 시간의 지속기간 동안 일어난다. 아미노산 절단 후, 반응은 혼합물의 온도를 제1 온도 범위 T1 내로 변화시킴으로써 진행된다.
패널 (III)은 시퀀싱 반응에서의 다음 사이클의 시작을 도시하고, 여기서 반응 혼합물 온도는 제1 온도 범위 T1 내로 다시 감소되었다. 따라서, 이 예에서, 패널 (II)로부터 패널 (III)으로의 진행은 열의 공급원으로부터 반응 혼합물을 제거하거나, 다르게는 반응 혼합물을 제1 온도 범위 T1 내로 냉각시킴으로써 (예를 들어, 능동적으로 또는 수동적으로) 수행될 수 있다. 나타내어진 바와 같이, 폴리펩티드 말단에서 페닐알라닌과 가역적으로 회합하는 제2 친화도 시약을 비롯한 표지된 친화도 시약은 재생되는 반면, 표지된 엑소펩티다제는 변성되는 것으로 나타내어진다. 시퀀싱 반응은 이 예에 의해 예시된 바와 같이 아미노산 인식 및 아미노산 절단 사이에 온도-의존성 방식으로 추가로 사이클링함으로써 계속된다.
따라서, 동적 시퀀싱 접근법은 반응 혼합물 내에서 1개 이상의 단백질의 단백질 활성 또는 기능의 수준에서 제어되는 반응 사이클링을 포함할 수 있다. 도 3b에 도시되고 상기 기재된 온도-의존성 폴리펩티드 시퀀싱 프로세스는 조건-의존성 인식 및 절단의 제어가능한 사이클링에 의한 폴리펩티드 시퀀싱에 대한 일반적인 접근법을 예시할 수 있음이 인지되어야 한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 출원은 발광-활성화된 시약을 사용한 발광-의존성 시퀀싱 프로세스를 제공한다. 일부 실시양태에서, 발광-의존성 시퀀싱 프로세스는 발광-의존성 아미노산 인식 및 절단의 사이클을 포함한다. 시퀀싱 반응의 각각의 사이클은 시퀀싱 반응 혼합물을 2가지 상이한 발광 조건에 노출시킴으로써 수행될 수 있다: 엑소펩티다제 활성에 비해 친화도 시약 활성에 대해 최적인 (예를 들어, 아미노산 인식을 촉진시키기 위한) 제1 발광 조건, 및 친화도 시약 활성에 비해 엑소펩티다제 활성에 대해 최적인 (예를 들어, 아미노산 절단을 촉진시키기 위한) 제2 발광 조건. 시퀀싱 반응은 반응 혼합물을 제1 발광 조건에 노출시키는 것 (아미노산 인식을 개시하기 위한) 및 반응 혼합물을 제2 발광 조건에 노출시키는 것 (아미노산 절단을 개시하기 위한) 사이에 교대시킴으로써 진행된다. 제한으로서가 아니라 예로서, 일부 실시양태에서, 2가지 상이한 발광 조건은 제1 파장 및 제2 파장을 포함한다.
일부 측면에서, 본 출원은 1개 이상의 표지된 친화도 시약과 말단 및 내부 아미노산의 결합 상호작용 및 표지된 비-특이적 엑소펩티다제와 말단 아미노산의 결합 상호작용을 평가하는 것에 의한 실시간으로의 폴리펩티드 시퀀싱의 방법을 제공한다. 도 4는 도 3a-3b에서의 접근법에 대해 기재되고 예시된 방법이 말단 및 내부 위치 둘 다에서 아미노산의 하나의 유형 (여기서 리신으로서 나타내어짐)에 선택적으로 결합하고 그로부터 해리되는 표지된 친화도 시약 (410)을 사용함으로써 변형된 시퀀싱의 방법의 예를 나타낸다 (도 4, 삽도 패널). 이전의 접근법에 기재된 바와 같이, 선택적 결합은 신호 출력 (400)에서 일련의 펄스를 발생시킨다. 그러나, 이 접근법에서, 일련의 펄스는 폴리펩티드 전반에 걸쳐 아미노산의 유형의 수에 의해 결정되는 속도에서 발생한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 결합 사건에 상응하는 펄싱의 속도는 폴리펩티드에서 현재 존재하는 동종체 아미노산의 수의 진단제일 것이다.
이전의 접근법에서와 같이, 표지된 비-특이적 펩티다제 (420)는 예를 들어, 절단 사건 사이에 최적 시간 창을 제공하기 위해, 표지된 친화도 시약 (410)보다 상대적으로 더 낮은 농도로 존재할 것이다 (도 4, 삽도 패널). 추가적으로, 특정 실시양태에서, 표지된 비-특이적 펩티다제 (420)의 고유하게 확인가능한 발광 표지는 언제 절단 사건이 발생하였는지를 지시할 것이다. 폴리펩티드가 반복적인 절단을 겪음에 따라, 표지된 친화도 시약 (410)에 의한 결합에 상응하는 펄싱의 속도는 말단 아미노산이 표지된 비-특이적 펩티다제 (420)에 의해 절단될 때마다 단계적 방식으로 강하할 것이다. 이 개념은 플롯 (402)에 의해 예시되며, 이는 일반적으로 시간의 함수로서 펄스 속도를 도시하고, 시간에서의 절단 사건은 화살표로 표시된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 아미노산은 절단 사건 사이에 검출되는 패턴 내에서 발생하는 펄싱 패턴 및/또는 펄싱의 속도에 기반하여 이 접근법에서 확인될- 및 그에 의해 폴리펩티드가 시퀀싱될- 수 있다.
일부 실시양태에서, 말단 폴리펩티드 서열 정보 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 결정됨)는 1개 이상의 다른 공급원으로부터 수득된 폴리펩티드 서열 정보와 조합될 수 있다. 예를 들어, 말단 폴리펩티드 서열 정보는 내부 폴리펩티드 서열 정보와 조합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 내부 폴리펩티드 서열 정보는 본원에 기재된 바와 같이 내부 아미노산과 회합하는 1개 이상의 아미노산 인식 분자를 사용하여 수득될 수 있다. 내부 또는 다른 폴리펩티드 서열 정보는 폴리펩티드 분해 프로세스 전에 또는 동안 수득될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이들 방법으로부터 수득된 서열 정보는 다른 기법을 사용한 폴리펩티드 서열 정보, 예를 들어, 1개 이상의 내부 아미노산 인식 분자를 사용하여 수득된 서열 정보와 조합될 수 있다.
차폐된 인식 분자
본원에 기재된 실시양태에 따르면, 단일-분자 폴리펩티드 시퀀싱 방법은 표면-고정화된 폴리펩티드를 여기 광으로 조광하고, 아미노산 인식 분자에 부착된 표지 (예를 들어, 표지된 친화도 시약)에 의해 생성된 발광을 검출함으로써 수행될 수 있다. 일부의 경우, 표지에 의해 생성된 방사성 및/또는 비-방사성 붕괴는 폴리펩티드에 대한 광손상을 발생시킬 수 있다. 예를 들어, 도 5a는 인식 분자가 표면에 고정화된 폴리펩티드와 회합된 것으로 나타내어진 예시 시퀀싱 반응을 예시한다.
여기 조명의 존재 하에서, 표지는 검출가능한 회합 사건을 발생시키는 방사성 붕괴를 통해 형광을 생성할 수 있다. 그러나, 일부의 경우, 표지는 반응성 산소 종 (500)의 형성을 발생시킬 수 있는 비-방사성 붕괴를 생성한다. 반응성 산소 종 (500)은 반응이 폴리펩티드에 대한 완전한 서열 정보를 수득하기 전에 종료하도록, 결국 고정화된 펩티드를 손상시킬 수 있다. 이 광손상은 예를 들어, 노출된 폴리펩티드 말단 (상부 개방 화살표)에서, 내부 위치 (중간 개방 화살표)에서, 또는 폴리펩티드를 표면에 부착시키는 표면 링커 (하부 개방 화살표)에서 발생할 수 있다.
본 발명자들은 아미노산 인식 분자 내로의 차폐 요소의 혼입에 의해 광손상이 완화될 수 있고, 인식 시간이 연장되었음을 발견하였다. 도 5b는 차폐물 (502)을 포함하는 차폐된 인식 분자를 사용한 예시 시퀀싱 반응을 예시한다. 차폐물 (502)은 반응성 산소 종 (500)으로부터의 손상 효과가 표지-폴리펩티드 분리 거리 초과의 자유 라디칼 붕괴로 인해 감소될 수 있도록, 표지 및 폴리펩티드 사이의 증가된 거리를 제공하는 공유 또는 비-공유 연결기를 형성한다. 차폐물 (502)은 또한 반응성 산소 종 (500) 및 방사성 및/또는 비-방사성 붕괴로부터의 손상을 흡수함으로써 표지로부터 폴리펩티드를 차폐하는 입체적 장벽을 제공할 수 있다.
이론에 구애되기를 원하지는 않지만, 인식 성분 및 표지 성분 사이에 위치된 차폐물은 표지 성분에 의해 방출되는 방사성 및/또는 비-방사성 붕괴를 흡수하거나, 편향시키거나, 따르게는 차단할 수 있다고 생각된다. 일부 실시양태에서, 차폐물은 1개 이상의 표지 (예를 들어, 발광 표지)가 1개 이상의 아미노산 인식 분자와 상호작용하는 정도를 방지하거나 제한한다. 일부 실시양태에서, 차폐물은 1개 이상의 표지가 아미노산 인식 분자와 회합된 1개 이상의 분자 (예를 들어, 인식 분자와 회합된 폴리펩티드)와 상호작용하는 정도를 방지하거나 제한한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 용어 차폐물은 일반적으로 인식 성분 및 표지 성분 사이에 형성된 연결기의 일부 부분에 의해 제공되는 보호 또는 차폐 효과를 지칭할 수 있다.
일부 실시양태에서, 차폐물은 1개 이상의 아미노산 인식 분자 (예를 들어, 인식 성분)에 및 1개 이상의 표지 (예를 들어, 표지 성분)에 부착된다. 일부 실시양태에서, 인식 및 표지 성분은 차폐물 상의 비-인접한 부위에서 부착된다. 예를 들어, 1개 이상의 아미노산 인식 분자는 차폐물의 제1 측면에 부착될 수 있고, 1개 이상의 표지는 차폐물의 제2 측면에 부착될 수 있으며, 여기서 차폐물의 제1 및 제2 측면은 서로로부터 멀다. 일부 실시양태에서, 부착 부위는 차폐물의 대략 반대 측면 상에 있다.
차폐물이 인식 분자에 부착되는 부위 및 차폐물이 표지에 부착되는 부위 사이의 거리는 공간을 통한 선형 측정 또는 차폐물의 표면에 걸친 비-선형 측정일 수 있다. 차폐물 상의 인식 분자 및 표지 부착 부위 사이의 거리는 차폐물의 3차원 구조를 모델링함으로써 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이 거리는 적어도 2 nm, 적어도 4 nm, 적어도 6 nm, 적어도 8 nm, 적어도 10 nm, 적어도 12 nm, 적어도 15 nm, 적어도 20 nm, 적어도 30 nm, 적어도 40 nm, 또는 그 초과일 수 있다. 대안적으로, 차폐물 상의 인식 분자 및 표지의 상대 위치는 차폐물의 구조를 2차 표면 (예를 들어, 타원체, 타원 기둥)으로서 처리함으로써 기재될 수 있다. 일부 실시양태에서, 인식 분자 및 표지 부착 부위는 차폐물을 나타내는 타원체 형상 주위의 거리의 적어도 1/8인 거리에 의해 분리된다. 일부 실시양태에서, 인식 분자 및 표지는 차폐물을 나타내는 타원체 형상 주위의 거리의 적어도 1/4인 거리에 의해 분리된다. 일부 실시양태에서, 인식 분자 및 표지는 차폐물을 나타내는 타원체 형상 주위의 거리의 적어도 1/3인 거리에 의해 분리된다. 일부 실시양태에서, 인식 분자 및 표지는 차폐물을 나타내는 타원체 형상 주위의 거리의 적어도 1/2인 거리에 의해 분리된다.
차폐물의 크기는 아미노산 인식 분자가 폴리펩티드와 회합되는 경우에 표지가 폴리펩티드와 직접적으로 접촉할 수 없거나 그럴 가능성이 적도록 해야 한다. 차폐물의 크기는 또한 아미노산 인식 분자가 폴리펩티드와 회합되는 경우에 부착된 표지가 검출가능하도록 해야 한다. 예를 들어, 크기는 부착된 발광 표지가 여기되는 조명 부피 내이도록 해야 한다.
실시자가 차폐 효과를 평가할 수 있는 다양한 파라미터가 있음이 인지되어야 한다. 일반적으로, 차폐 요소의 효과는 차폐 요소를 갖는 조성물 및 차폐 요소를 결여한 조성물 사이의 비교 평가를 수행함으로써 평가될 수 있다. 예를 들어, 차폐 요소는 아미노산 인식 분자의 인식 시간을 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 인식 시간은 인식 분자 및 폴리펩티드 사이의 회합 사건이 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드 시퀀싱 반응에서 관찰가능한 시간의 길이를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 인식 시간은 아미노산 인식 분자이 차폐 요소를 결여하지만, 그렇지 않다면 유사하거나 동일한 것을 제외하고는 동일한 조건 하에서 수행된 폴리펩티드 시퀀싱 반응에 비해, 약 10-25%, 25-50%, 50-75%, 75-100%, 또는 100% 초과, 예를 들어 약 2배, 3배, 4배, 5배, 또는 그 초과 증가된다. 일부 실시양태에서, 차폐 요소는 시퀀싱 정확도 및/또는 서열 판독 길이를 증가시킬 수 있다 (예를 들어, 상기 기재된 바와 같은 비교 조건 하에서 수행된 시퀀싱 반응에 비해, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 25% 또는 그 초과).
따라서, 일부 측면에서, 본 출원은 적어도 1개의 아미노산 인식 분자, 적어도 1개의 검출가능한 표지, 및 인식 분자 및 표지 사이에 공유 또는 비-공유 연결기를 형성하는 차폐 요소 (예를 들어, "차폐물")를 포함하는 차폐된 인식 분자를 제공한다. 일부 실시양태에서, 차폐 요소는 적어도 2 nm, 적어도 5 nm, 적어도 10 nm, 적어도 12 nm, 적어도 15 nm, 적어도 20 nm, 또는 그 초과의 길이 (예를 들어, 수용액 중에서)이다. 일부 실시양태에서, 차폐 요소는 약 2 nm 내지 약 100 nm의 길이 (예를 들어, 약 2 nm 내지 약 50 nm, 약 10 nm 내지 약 50 nm, 약 20 nm 내지 약 100 nm)이다.
일부 실시양태에서, 차폐물 (예를 들어, 차폐 요소)은 1개 이상의 아미노산 인식 분자 (예를 들어, 인식 성분) 및 1개 이상의 표지 (예를 들어, 표지 성분) 사이에 공유 또는 비-공유 연결기를 형성한다. 본원에 사용된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 공유 및 비-공유 연결 또는 연결기는 차폐물에의 인식 및 표지 성분의 부착의 성질을 지칭한다.
일부 실시양태에서, 공유 연결, 또는 공유 연결기는 공유 결합 또는 일련의 인접 공유 결합을 통해 인식 및 표지 성분의 각각에 부착된 차폐물을 지칭한다. 공유 부착 하나 또는 둘 다의 성분은 관련 기술분야에 공지된 공유 접합 방법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 클릭 화학 기법 (예를 들어, 구리-촉매된, 변형-촉진된, 구리-무함유 클릭 화학 등)은 하나 또는 둘 다의 성분을 차폐물에 부착시키는데 사용될 수 있다. 이러한 방법은 일반적으로 하나의 반응성 모이어티를 또 다른 반응성 모이어티에 접합시켜 반응성 모이어티 사이에 1개 이상의 공유 결합을 형성하는 것을 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 차폐물의 제1 반응성 모이어티는 인식 또는 표지 성분의 제2 반응성 모이어티와 접촉되어 공유 부착을 형성할 수 있다. 반응성 모이어티의 예는 제한 없이, 반응성 아민, 아지드, 알킨, 니트론, 알켄 (예를 들어, 시클로알켄), 테트라진, 테트라졸, 및 클릭 반응 및 유사한 커플링 기법에 적합한 다른 반응성 모이어티를 포함한다.
일부 실시양태에서, 비-공유 연결, 또는 비-공유 연결기는 수용체-리간드 상호작용 및 올리고뉴클레오티드 가닥 혼성화를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 1개 이상의 비-공유 커플링 수단을 통해 인식 및 표지 성분 중 하나 또는 둘 다에 부착된 차폐물을 지칭한다. 수용체-리간드 상호작용의 예는 본원에서 제공되며, 제한 없이, 단백질-단백질 복합체, 단백질-리간드 복합체, 단백질-압타머 복합체, 및 압타머-핵산 복합체를 포함한다. 올리고뉴클레오티드 가닥 혼성화를 위한 다양한 배열 및 전략은 본원에 기재되어 있으며, 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2019/0024168 참조).
일부 실시양태에서, 차폐물 (502)은 중합체, 예컨대 생체분자 또는 수지상 중합체를 포함한다. 도 5c는 중합체 차폐물 및 본 출원의 차폐된 인식 분자의 배열의 예를 도시한다. 제1 차폐된 구축물 (504)은 단백질 차폐물 (530)의 예를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 단백질 차폐물 (530)은 인식 분자 및 표지 사이에 공유 연결기를 형성한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 단백질 차폐물 (530)은 1개 이상의 공유 결합을 통해, 예를 들어, 단백질 차폐물 (530)의 천연 또는 비천연 아미노산의 측쇄를 통한 공유 부착에 의해 인식 분자 및 표지의 각각에 부착된다. 일부 실시양태에서, 단백질 차폐물 (530)은 인식 분자 및 표지 사이에 비-공유 연결기를 형성한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 단백질 차폐물 (530)은 1개 이상의 리간드-결합 부위를 포함하는 단량체성 또는 다량체성 단백질이다. 일부 실시양태에서, 비-공유 연결기는 1개 이상의 리간드-결합 부위에 결합된 1개 이상의 리간드 모이어티를 통해 형성된다. 단백질 차폐물에 의해 형성된 비-공유 연결의 추가적인 예는 본원의 다른 곳에 기재되어 있다.
제2 차폐된 구축물 (506)은 제2 올리고뉴클레오티드 가닥 (534)과 혼성화된 제1 올리고뉴클레오티드 가닥 (532)을 포함하는 이중-가닥 핵산 차폐물의 예를 나타낸다. 나타내어진 바와 같이, 일부 실시양태에서, 이중-가닥 핵산 차폐물은 제1 올리고뉴클레오티드 가닥 (532)에 부착된 인식 분자, 및 제2 올리고뉴클레오티드 가닥 (534)에 부착된 표지를 포함할 수 있다. 이렇게 하여, 이중-가닥 핵산 차폐물은 올리고뉴클레오티드 가닥 혼성화를 통해 인식 분자 및 표지 사이에 비-공유 연결기를 형성한다. 일부 실시양태에서, 인식 분자 및 표지는 올리고뉴클레오티드 가닥에 부착될 수 있으며, 이는 단일-가닥 핵산 차폐물 또는 또 다른 올리고뉴클레오티드 가닥과의 혼성화를 통한 이중-가닥 핵산 차폐물을 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 가닥 혼성화는 연결기 내의 증가된 강성을 제공하여 인식 분자 및 표지 사이의 분리를 추가로 향상시킬 수 있다.
차폐 요소 (502)가 핵산을 포함하는 경우, 표지 및 인식 분자 사이의 분리 거리는 핵산 상의 부착 부위 (예를 들어, 직접적 부착 또는 간접적 부착, 예컨대 1개 이상의 추가적인 차폐물 중합체를 통해) 사이의 거리에 의해 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 상의 부착 부위 사이의 거리는 표지 및 인식 분자 사이에 발생하는 핵산 내의 뉴클레오티드의 수에 의해 측정될 수 있다. 뉴클레오티드의 수는 단일-가닥 핵산에서 뉴클레오티드 염기의 수 또는 이중-가닥 핵산에서 뉴클레오티드 염기 쌍의 수 중 어느 하나를 지칭할 수 있음이 이해되어야 한다.
따라서, 일부 실시양태에서, 인식 분자의 부착 부위 및 표지의 부착 부위는 5 내지 200개의 뉴클레오티드 (예를 들어, 5 내지 150개의 뉴클레오티드, 5 내지 100개의 뉴클레오티드, 5 내지 50개의 뉴클레오티드, 10 내지 100개의 뉴클레오티드)에 의해 분리될 수 있다. 핵산에서의 임의의 위치는 인식 분자, 표지, 또는 1개 이상의 추가적인 중합체 차폐물에 대한 부착 부위로서 기능할 수 있음이 인지되어야 한다. 일부 실시양태에서, 부착 부위는 5' 또는 3' 단부에 또는 대략 그에, 또는 핵산의 가닥을 따라 내부 위치에 있을 수 있다.
제2 차폐된 구축물 (506)의 비-제한적 배열은 가닥 혼성화를 통해 비-공유 연결을 형성하는 차폐물의 예를 예시한다. 비-공유 연결의 추가의 예는 올리고뉴클레오티드 차폐물 (536)을 포함하는 제3 차폐된 구축물 (508)에 의해 예시된다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 차폐물 (536)은 인식 분자에 결합하여 비-공유 연결을 형성하는 핵산 압타머이다. 일부 실시양태에서, 인식 분자는 핵산 압타머이고, 올리고뉴클레오티드 차폐물 (536)은 압타머와 혼성화하여 비-공유 연결을 형성하는 올리고뉴클레오티드 가닥을 포함한다.
제4 차폐된 구축물 (510)은 수지상 중합체 차폐물 (538)의 예를 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 수지상 중합체는 일반적으로 폴리올 또는 덴드리머를 지칭한다. 폴리올 및 덴드리머는 관련 기술분야에 기재되었으며, 특정한 배열에 대해 최적화된 분지된 수지상 구조를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 수지상 중합체 차폐물 (538)은 폴리에틸렌 글리콜, 테트라에틸렌 글리콜, 폴리(아미도아민), 폴리(프로필렌이민), 폴리(프로필렌아민), 카르보실란, 폴리(L-리신), 또는 이들 중 하나 이상의 조합을 포함한다.
덴드리머, 또는 덴드론은 전형적으로 코어 주위에 대칭이며, 구형 3차원 형태를 채택할 수 있는 반복적으로 분지된 분자이다. 예를 들어, 문헌 [Astruc et al. (2010) Chem. Rev. 110:1857]을 참조한다. 본 출원의 차폐물 내로의 이러한 구조의 혼입은 표지 및 그와 회합된 1개 이상의 생체분자 (예를 들어, 인식 분자 및/또는 인식 분자와 회합된 폴리펩티드) 사이의 접촉의 입체적 억제를 통한 보호 효과를 제공할 수 있다. 덴드리머 표면의 잠재적 관능화를 비롯한 분자의 1차 구조에서의 변이를 통한 덴드리머의 화학적 및 물리적 특성의 개량은 차폐 효과가 요망되는 바와 같이 조정되는 것을 허용한다. 덴드리머는 관련 기술분야에 공지된 바와 같이 폭넓은 범위의 물질 및 분지화 반응을 사용한 다양한 기법에 의해 합성될 수 있다. 이러한 합성 변이는 필요에 따라 맞춤제작되는 덴드리머의 특성을 허용한다. 본 출원의 차폐물에 따라 사용될 수 있는 폴리올 및 덴드리머 화합물의 예는 제한 없이, 미국 특허 공개 번호 20180346507에 기재된 화합물을 포함한다.
도 5d는 본 출원의 차폐된 인식 분자의 추가의 예시 배열을 도시한다. 단백질-핵산 구축물 (512)은 단백질 및 이중-가닥 핵산의 형태의 1개 초과의 중합체를 포함하는 차폐물을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 차폐물의 단백질 부분은 공유 연결을 통해 차폐물의 핵산 부분에 부착된다. 일부 실시양태에서, 부착은 비-공유 연결을 통해서이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 차폐물의 단백질 부분은 1가 또는 다가 단백질의 리간드-결합 부위에 부착된 리간드 모이어티를 통해 적어도 1개의 비-공유 연결을 형성하는 1가 또는 다가 단백질이다. 일부 실시양태에서, 차폐물의 단백질 부분은 아비딘 단백질을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 출원의 차폐된 인식 분자는 아비딘-핵산 구축물 (514)이다. 일부 실시양태에서, 아비딘-핵산 구축물 (514)은 아비딘 단백질 (540) 및 이중-가닥 핵산을 포함하는 차폐물을 포함한다. 본원에 기재된 바와 같이, 아비딘 단백질 (540)은 예컨대 본원에 기재된 1개 이상의 추가적인 차폐물 중합체를 통해 직접적으로 또는 간접적으로 1개 이상의 아미노산 인식 분자 및 1개 이상의 표지 사이에 비-공유 연결을 형성하는데 사용될 수 있다.
아비딘 단백질은 일반적으로 아비딘 단백질의 4개의 서브유닛의 각각에 비오틴 결합 부위를 갖는 비오틴-결합 단백질이다. 아비딘 단백질은 예를 들어, 아비딘, 스트렙타비딘, 트랍타비딘, 타마비딘, 브라다비딘, 크세나비딘, 및 그의 동족체 및 변이체를 포함한다. 일부의 경우, 아비딘 단백질의 단량체성, 이량체성, 또는 사량체성 형태가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 아비딘 단백질 복합체의 아비딘 단백질은 사량체성 형태 (예를 들어, 동종사량체)의 스트렙타비딘이다. 일부 실시양태에서, 아비딘 단백질의 비오틴 결합 부위는 본원에 기재된 1개 이상의 아미노산 인식 분자, 1개 이상의 표지, 및/또는 1개 이상의 추가적인 차폐물 중합체에 대한 부착 부위를 제공한다.
아비딘 단백질 복합체의 예시적인 도해는 도 5d의 삽도 패널에 나타내어진다. 삽도 패널에 나타내어진 바와 같이, 아비딘 단백질 (540)은 비오틴 모이어티 (흰색 원으로서 나타내어짐)에 결합될 수 있는 단백질의 4개의 서브유닛의 각각에 결합 부위 (542)를 포함할 수 있다. 아비딘 단백질 (540)의 다가성은 일반적으로 예시적인 목적을 위해 나타내어지는 다양한 연결 배열을 허용할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 비오틴 연결 모이어티 (544)는 아비딘 단백질 (540)에 대한 단일 부착 점을 제공하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 비스-비오틴 연결 모이어티 (546)는 아비딘 단백질 (540)에 대한 2개의 부착 점을 제공하는데 사용될 수 있다. 아비딘-핵산 구축물 (514)에 의해 예시된 바와 같이, 아비딘 단백질 복합체는 2개의 비스-비오틴 연결 모이어티에 의해 형성될 수 있으며, 이는 인식 분자 및 표지 사이에 증가된 분리 거리를 제공하는 트랜스-배열을 형성한다.
아비딘 단백질 차폐물 배열의 다양한 추가의 예가 나타내어진다. 제1 아비딘 구축물 (516)은 비스-비오틴 연결 모이어티를 통해 인식 분자에 및 별개의 비오틴 연결 모이어티를 통해 2개의 표지에 부착된 아비딘 차폐물의 예를 나타낸다. 제2 아비딘 구축물 (518)은 별개의 비오틴 연결 모이어티를 통해 2개의 인식 분자에 및 비스-비오틴 연결 모이어티를 통해 표지에 부착된 아비딘 차폐물의 예를 나타낸다. 제3 아비딘 구축물 (520)은 별개의 비오틴 연결 모이어티를 통해 2개의 인식 분자에 및 핵산의 각각의 가닥의 비오틴 연결 모이어티를 통해 표지된 핵산에 부착된 아비딘 차폐물의 예를 나타낸다. 제4 아비딘 구축물 (522)은 별개의 비스-비오틴 연결 모이어티를 통해 인식 분자에 및 표지된 핵산에 부착된 아비딘 차폐물의 예를 나타낸다. 나타내어진 바와 같이, 표지는 표지 및 핵산 사이의 수지상 중합체에 의해 인식 분자로부터 추가로 차폐된다.
도 5a-5d에 나타내어진 차폐된 인식 분자의 예시 배열은 예시적인 목적을 위해 제공됨이 인지되어야 한다. 본 발명자들은 차폐된 인식 분자의 인식 및 표지 성분 사이에 공유 또는 비-공유 연결을 형성하는 1개 이상의 상이한 중합체를 사용하여 다양한 다른 차폐물 배열을 생각하였다. 예로서, 도 5e는 본 출원에 따른 차폐물 배열의 모듈성을 예시한다.
도 5e의 상부에 나타내어진 바와 같이, 차폐된 인식 분자는 일반적으로 인식 성분 (550), 차폐 요소 (552), 및 표지 성분 (554)을 포함한다. 예시의 용이성을 위해, 인식 성분 (550)은 하나의 아미노산 인식 분자로서 도시되고, 표지 성분 (554)은 하나의 표지로서 도시된다. 본 출원의 차폐된 인식 분자는 1개 이상의 아미노산 인식 분자 및 1개 이상의 표지에 부착된 차폐 요소 (552)를 포함할 수 있음이 인지되어야 한다. 인식 성분 (550)이 1개 초과의 인식 분자를 포함하는 경우, 각각의 인식 분자는 차폐 요소 (552) 상의 1개 이상의 부착 부위에서 차폐 요소 (552)에 부착될 수 있다. 표지 성분 (554)이 1개 초과의 표지를 포함하는 경우, 각각의 표지는 차폐 요소 (552) 상의 1개 이상의 부착 부위에서 차폐 요소 (552)에 부착될 수 있다.
일부 실시양태에서, 차폐 요소 (552)는 단백질 (560)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단백질 (560)은 1가 또는 다가 단백질이다. 일부 실시양태에서, 단백질 (560)은 단량체성 또는 다량체성 단백질, 예컨대 단백질 동종이량체, 단백질 이종이량체, 단백질 올리고머, 또는 다른 단백질성 분자이다. 일부 실시양태에서, 차폐 요소 (552)는 적어도 1개의 다른 분자에 비-공유 결합된 단백질에 의해 형성된 단백질 복합체를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 차폐 요소 (552)는 단백질-단백질 복합체 (562)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단백질-단백질 복합체 (562)는 또 다른 단백질성 분자에 특이적으로 결합된 1개의 단백질성 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단백질-단백질 복합체 (562)는 항원에 결합된 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, scFv)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단백질-단백질 복합체 (562)는 단백질 리간드에 결합된 수용체를 포함한다. 단백질-단백질 복합체의 추가적인 예는 제한 없이, 트립신-아프로티닌, 바르나제-바르스타, 및 콜리신 E9-Im9 면역 단백질을 포함한다.
일부 실시양태에서, 차폐 요소 (552)는 단백질-리간드 복합체 (564)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단백질-리간드 복합체 (564)는 1가 단백질 및 비-단백질성 리간드 모이어티를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 단백질-리간드 복합체 (564)는 소분자 억제제 모이어티에 결합된 효소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단백질-리간드 복합체 (564)는 비-단백질성 리간드 모이어티에 결합된 수용체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 차폐 요소 (552)는 1개 이상의 리간드 모이어티에 비-공유 결합된 다가 단백질에 의해 형성된 다가 단백질 복합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 차폐 요소 (552)는 1개 이상의 비오틴 연결 모이어티에 비-공유 결합된 아비딘 단백질에 의해 형성된 아비딘 단백질 복합체를 포함한다. 구축물 (566, 568, 570, 및 572)은 아비딘 단백질 복합체의 예시적인 예를 제공하며, 이들 중 1개 이상은 차폐 요소 (552) 내로 혼입될 수 있다.
일부 실시양태에서, 차폐 요소 (552)는 2개의 비스-비오틴 연결 모이어티에 결합된 아비딘 단백질을 포함하는 2-원 아비딘 복합체 (566)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 차폐 요소 (552)는 2개의 비오틴 연결 모이어티 및 비스-비오틴 연결 모이어티에 결합된 아비딘 단백질을 포함하는 3-원 아비딘 복합체 (568)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 차폐 요소 (552)는 4개의 비오틴 연결 모이어티에 결합된 아비딘 단백질을 포함하는 4-원 아비딘 복합체 (570)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 차폐 요소 (552)는 아비딘 단백질 내로 조작된 1 또는 2개의 비-기능적 결합 부위를 포함하는 아비딘 단백질을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 차폐 요소 (552)는 2개의 서브유닛의 각각에서 비오틴 연결 모이어티에 결합된 아비딘 단백질을 포함하는 2가 아비딘 복합체 (572)를 포함하고, 여기서 아비딘 단백질은 2개의 다른 서브유닛의 각각에 비-기능적 리간드-결합 부위 (548)를 포함한다. 나타내어진 바와 같이, 일부 실시양태에서, 2가 아비딘 복합체 (572)는 트랜스-2가 아비딘 단백질을 포함하지만, 시스-2가 아비딘 단백질은 요망되는 실행에 따라 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 아비딘 단백질은 3가 아비딘 단백질이다. 일부 실시양태에서, 3가 아비딘 단백질은 하나의 서브유닛에 비-기능적 리간드-결합 부위 (548)를 포함하고, 3개의 비오틴 연결 모이어티, 또는 다른 서브유닛에서 1개의 비오틴 연결 모이어티 및 1개의 비스-비오틴 연결 모이어티에 결합된다.
일부 실시양태에서, 차폐 요소 (552)는 수지상 중합체 (574)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 수지상 중합체 (574)는 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 폴리올 또는 덴드리머이다. 일부 실시양태에서, 수지상 중합체 (574)는 분지된 폴리올 또는 분지된 덴드리머이다. 일부 실시양태에서, 수지상 중합체 (574)는 모노사카라이드-TEG, 디사카라이드, N-아세틸 모노사카라이드, TEMPO-TEG, 트롤록스-TEG, 또는 글리세롤 덴드리머를 포함한다. 본 출원의 차폐된 인식 분자에 따라 유용한 폴리올의 예는 폴리에테르 폴리올 및 폴리에스테르 폴리올, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 풀리프로필렌 글리콜, 및 관련 기술분야에 널리 공지된 유사한 이러한 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 수지상 중합체 (574)는 하기 화학식의 화합물을 포함한다: -(CH2CH2O)n-, 여기서 n은 1 내지 500 (경계값 포함)의 정수이다. 일부 실시양태에서, 수지상 중합체 (574)는 하기 화학식의 화합물을 포함한다: -(CH2CH2O)n-, 여기서 n은 1 내지 100 (경계값 포함)의 정수이다.
일부 실시양태에서, 차폐 요소 (552)는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 단일-가닥이다. 일부 실시양태에서, 표지 성분 (554)은 단일-가닥 핵산의 하나의 단부 (예를 들어, 5' 단부 또는 3' 단부)에 직접적으로 또는 간접적으로 부착되고, 인식 성분 (550)은 단일-가닥 핵산의 다른 단부 (예를 들어, 3' 단부 또는 5' 단부)에 직접적으로 또는 간접적으로 부착된다. 예를 들어, 단일-가닥 핵산은 핵산의 5' 단부에 부착된 표지 및 핵산의 3' 단부에 부착된 아미노산 인식 분자를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 차폐 요소 (552)는 이중-가닥 핵산 (576)을 포함한다. 나타내어진 바와 같이, 일부 실시양태에서, 이중-가닥 핵산 (576)은 가닥 혼성화를 통해 인식 성분 (550) 및 표지 성분 (554) 사이에 비-공유 연결을 형성할 수 있다. 그러나, 일부 실시양태에서, 이중-가닥 핵산 (576)은 동일한 올리고뉴클레오티드 가닥에의 부착을 통해 인식 성분 (550) 및 표지 성분 (554) 사이에 공유 연결을 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표지 성분 (554)은 이중-가닥 핵산의 하나의 단부에 직접적으로 또는 간접적으로 부착되고, 인식 성분 (550)은 이중-가닥 핵산의 다른 단부에 직접적으로 또는 간접적으로 부착된다. 예를 들어, 이중-가닥 핵산은 하나의 가닥의 5' 단부에 부착된 표지 및 다른 가닥의 5' 단부에 부착된 아미노산 인식 분자를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 차폐 요소 (552)는 차폐물의 입체적 벌크를 증가시키는데 유용할 수 있는 1개 이상의 구조적 모티프를 형성하는 핵산을 포함한다. 핵산 구조적 모티프의 예는 제한 없이, 줄기-루프, 3-원 연접부 (예를 들어, 2개 이상의 줄기-루프 모티프에 의해 형성됨), 4-원 연접부 (예를 들어, 홀리데이(Holliday) 연접부), 및 벌지 루프를 포함한다.
일부 실시양태에서, 차폐 요소 (552)는 줄기-루프 (578)를 형성하는 핵산을 포함한다. 줄기-루프, 또는 헤어핀 루프는 올리고뉴클레오티드 가닥이 폴딩되고, 동일한 가닥의 또 다른 섹션과 염기 쌍을 형성할 때 형성되는 올리고뉴클레오티드 가닥 상의 뉴클레오티드의 쌍형성되지 않은 루프이다. 일부 실시양태에서, 줄기-루프 (578)의 쌍형성되지 않은 루프는 3 내지 10개의 뉴클레오티드를 포함한다. 따라서, 줄기-루프 (578)는 혼성화하여 줄기를 형성하는 반전된 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 가닥의 2개의 영역에 의해 형성될 수 있고, 여기서 2개의 영역은 쌍형성되지 않은 루프를 형성하는 3 내지 10개의 뉴클레오티드에 의해 분리된다. 일부 실시양태에서, 줄기-루프 (578)의 줄기는 A/T 뉴클레오티드에 비해 형성되는 첨가 수소 결합 상호작용에 첨가된 안정성을 제공할 수 있는 1개 이상의 G/C 뉴클레오티드를 갖도록 디자인될 수 있다. 일부 실시양태에서, 줄기-루프 (578)의 줄기는 쌍형성되지 않은 루프 서열에 바로 인접한 G/C 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 줄기-루프 (578)의 줄기는 쌍형성되지 않은 루프 서열에 인접한 최초 2, 3, 4, 또는 5개의 뉴클레오티드 내에 G/C 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 줄기-루프 (578)의 쌍형성되지 않은 루프는 1개 이상의 부착 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 부착 부위는 쌍형성되지 않은 루프 중의 무염기 부위에서 발생한다. 일부 실시양태에서, 부착 부위는 쌍형성되지 않은 루프의 염기에서 발생한다.
일부 실시양태에서, 줄기-루프 (578)는 이중-가닥 핵산에 의해 형성된다. 본원에 기재된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 이중-가닥 핵산은 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드 가닥의 가닥 혼성화를 통해 비-공유 연결기를 형성할 수 있다. 그러나, 일부 실시양태에서, 차폐 요소 (552)는 예를 들어, 공유 연결기를 제공하는 줄기-루프 모티프를 형성하는 단일-가닥 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 차폐 요소 (552)는 2개 이상의 줄기-루프 모티프를 형성하는 핵산을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 핵산은 2개의 줄기-루프 모티프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나의 줄기-루프 모티프의 줄기는, 모티프가 함께 3-원 연접부를 형성하도록, 다른 것의 줄기에 인접한다. 일부 실시양태에서, 차폐 요소 (552)는 4-원 연접부 (578)를 형성하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 4-원 연접부 (578)는 2개 이상의 올리고뉴클레오티드 가닥 (예를 들어, 2, 3, 또는 4개의 올리고뉴클레오티드 가닥)의 혼성화를 통해 형성된다.
일부 실시양태에서, 차폐 요소 (552)는 도 5e의 560, 562, 564, 566, 568, 570, 572, 574, 576, 578, 및 580으로부터 선택되는 1개 이상의 중합체를 포함한다. 560, 562, 564, 566, 568, 570, 572, 574, 576, 578, 및 580의 각각 상에 나타내어진 연결 모이어티 및 부착 부위는 예시적인 목적을 위해 나타내어지며, 바람직한 연결 또는 부착 부위 배열을 도시하는 것으로 의도되지 않음이 인지되어야 한다.
일부 측면에서, 본 출원은 화학식 (I)의 아미노산 인식 분자를 제공한다:
A-(Y)n-D
(I)
여기서: A는 적어도 1개의 아미노산 인식 분자를 포함하는 아미노산 결합 성분이고; Y의 각각의 경우는 공유 또는 비-공유 연결기를 형성하는 중합체이고; n은 1 내지 10 (경계값 포함)의 정수이고; D는 적어도 1개의 검출가능한 표지를 포함하는 표지 성분이다. 일부 실시양태에서, 본 출원은 화학식 (I)의 가용성 아미노산 인식 분자를 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, A는 복수개의 아미노산 인식 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수개 중 각각의 아미노산 인식 분자는 Y 상의 상이한 부착 부위에 부착된다. 일부 실시양태에서, 복수개 중 적어도 2개의 아미노산 인식 분자는 Y 상의 단일 부착 부위에 부착된다. 일부 실시양태에서, 아미노산 인식 분자는 예를 들어, 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 인식 단백질 또는 핵산 압타머이다.
일부 실시양태에서, 검출가능한 표지는 발광 표지 또는 전도율 표지이다. 일부 실시양태에서, 발광 표지는 적어도 1개의 형광단 염료 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, D는 20개 이하의 형광단 염료 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 형광단 염료 분자의 수 대 아미노산 인식 분자의 수의 비는 1:1 내지 20:1이다. 일부 실시양태에서, 발광 표지는 공여자 표지 및 수용자 표지를 포함하는 적어도 1개의 FRET 쌍을 포함한다. 일부 실시양태에서, 공여자 표지 대 수용자 표지의 비는 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 또는 5:1이다. 일부 실시양태에서, 수용자 표지 대 공여자 표지의 비는 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 또는 5:1이다.
일부 실시양태에서, D는 200 Å 미만의 직경이다. 일부 실시양태에서, -(Y)n-은 적어도 2 nm의 길이이다. 일부 실시양태에서, -(Y)n-은 적어도 5 nm의 길이이다. 일부 실시양태에서, -(Y)n-은 적어도 10 nm의 길이이다. 일부 실시양태에서, Y의 각각의 경우는 독립적으로 생체분자, 폴리올, 또는 덴드리머이다. 일부 실시양태에서, 생체분자는 핵산, 폴리펩티드, 또는 폴리사카라이드이다.
일부 실시양태에서, 아미노산 인식 분자는 하기 화학식 중 하나의 것이다:
A-Y1-(Y)m-D 또는 A-(Y)m-Y1-D
여기서: Y1은 핵산 또는 폴리펩티드이고; m은 0 내지 10 (경계값 포함)의 정수이다.
일부 실시양태에서, 핵산은 제1 올리고뉴클레오티드 가닥을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 제1 올리고뉴클레오티드 가닥과 혼성화된 제2 올리고뉴클레오티드 가닥을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 제1 올리고뉴클레오티드 가닥을 통해 공유 연결을 형성한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 혼성화된 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드 가닥을 통해 비-공유 연결을 형성한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 1가 또는 다가 단백질이다. 일부 실시양태에서, 1가 또는 다가 단백질은 1가 또는 다가 단백질의 리간드-결합 부위에 부착된 리간드 모이어티를 통해 적어도 1개의 비-공유 연결을 형성한다. 일부 실시양태에서, A, Y, 또는 D는 리간드 모이어티를 포함한다.
일부 실시양태에서, 아미노산 인식 분자는 하기 화학식 중 하나의 것이다:
A-(Y)m-Y2-D 또는 A-Y2-(Y)m-D
여기서: Y2는 폴리올 또는 덴드리머이고; m은 0 내지 10 (경계값 포함)의 정수이다. 일부 실시양태에서, 폴리올 또는 덴드리머는 폴리에틸렌 글리콜, 테트라에틸렌 글리콜, 폴리(아미도아민), 폴리(프로필렌이민), 폴리(프로필렌아민), 카르보실란, 폴리(L-리신), 또는 이들 중 하나 이상의 조합을 포함한다.
일부 측면에서, 본 출원은 화학식 (II)의 아미노산 인식 분자를 제공한다:
A-Y1-D
(II)
여기서: A는 적어도 1개의 아미노산 인식 분자를 포함하는 아미노산 결합 성분이고; Y1은 핵산 또는 폴리펩티드이고; D는 적어도 1개의 검출가능한 표지를 포함하는 표지 성분이다. 일부 실시양태에서, Y1이 핵산인 경우, 핵산은 공유 또는 비-공유 연결기를 형성한다. 일부 실시양태에서, Y1이 폴리펩티드인 경우, 폴리펩티드는 50 × 10-9 M 미만의 해리 상수 (KD)를 특징을 하는 비-공유 연결기를 형성한다.
일부 실시양태에서, Y1은 제1 올리고뉴클레오티드 가닥을 포함하는 핵산이다. 일부 실시양태에서, 핵산은 제1 올리고뉴클레오티드 가닥과 혼성화된 제2 올리고뉴클레오티드 가닥을 포함한다. 일부 실시양태에서, A는 제1 올리고뉴클레오티드 가닥에 부착되고, 여기서 D는 제2 올리고뉴클레오티드 가닥에 부착된다. 일부 실시양태에서, A는 제1 올리고뉴클레오티드 가닥 상의 제1 부착 부위에 부착되고, 여기서 D는 제1 올리고뉴클레오티드 가닥 상의 제2 부착 부위에 부착된다. 일부 실시양태에서, 핵산의 각각의 올리고뉴클레오티드 가닥은 150개 미만, 100개 미만, 또는 50개 미만의 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, Y1은 1가 또는 다가 단백질이다. 일부 실시양태에서, 1가 또는 다가 단백질은 1가 또는 다가 단백질의 리간드-결합 부위에 부착된 리간드 모이어티를 통해 적어도 1개의 비-공유 연결을 형성한다. 일부 실시양태에서, A 및 D 중 적어도 하나는 리간드 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 아비딘 단백질 (예를 들어, 아비딘, 스트렙타비딘, 트랍타비딘, 타마비딘, 브라다비딘, 크세나비딘, 또는 그의 동족체 또는 변이체)이다. 일부 실시양태에서, 리간드 모이어티는 비오틴 모이어티이다.
일부 실시양태에서, 아미노산 인식 분자는 하기 화학식 중 하나의 것이다:
A-Y1-(Y)n-D 또는 A-(Y)n-Y1-D
여기서: Y의 각각의 경우는 공유 또는 비-공유 연결기를 형성하는 중합체이고; n은 1 내지 10 (경계값 포함)의 정수이다. 일부 실시양태에서, Y의 각각의 경우는 독립적으로 생체분자, 폴리올, 또는 덴드리머이다.
다른 측면에서, 본 출원은 핵산; 핵산 상의 제1 부착 부위에 부착된 적어도 1개의 아미노산 인식 분자; 및 핵산 상의 제2 부착 부위에 부착된 적어도 1개의 검출가능한 표지를 포함하는 아미노산 인식 분자를 제공한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 적어도 1개의 아미노산 인식 분자 및 적어도 1개의 검출가능한 표지 사이에 공유 또는 비-공유 연결기를 형성한다.
일부 실시양태에서, 핵산은 제2 올리고뉴클레오티드 가닥과 혼성화된 제1 올리고뉴클레오티드 가닥을 포함하는 이중-가닥 핵산이다. 일부 실시양태에서, 제1 부착 부위는 제1 올리고뉴클레오티드 가닥 상에 있고, 제2 부착 부위는 제2 올리고뉴클레오티드 가닥 상에 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 1개의 아미노산 인식 분자는 적어도 1개의 아미노산 인식 분자 및 핵산 사이에 공유 또는 비-공유 연결기를 형성하는 단백질을 통해 제1 부착 부위에 부착된다. 일부 실시양태에서, 적어도 1개의 검출가능한 표지는 적어도 1개의 검출가능한 표지 및 핵산 사이에 공유 또는 비-공유 연결기를 형성하는 단백질을 통해 제2 부착 부위에 부착된다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 부착 부위는 핵산 상의 5 내지 100개의 뉴클레오티드 염기 또는 뉴클레오티드 염기 쌍에 의해 분리된다.
추가의 다른 측면에서, 본 출원은 적어도 2개의 리간드-결합 부위를 포함하는 다가 단백질; 단백질 상의 제1 리간드-결합 부위에 결합된 제1 리간드 모이어티를 통해 단백질에 부착된 적어도 1개의 아미노산 인식 분자; 및 단백질 상의 제2 리간드-결합 부위에 결합된 제2 리간드 모이어티를 통해 단백질에 부착된 적어도 1개의 검출가능한 표지를 포함하는 아미노산 인식 분자를 제공한다.
일부 실시양태에서, 다가 단백질은 4개의 리간드-결합 부위를 포함하는 아비딘 단백질이다. 일부 실시양태에서, 리간드-결합 부위는 비오틴 결합 부위이고, 여기서 리간드 모이어티는 비오틴 모이어티이다. 일부 실시양태에서, 비오틴 모이어티 중 적어도 하나는 비스-비오틴 모이어티이고, 여기서 비스-비오틴 모이어티는 아비딘 단백질 상의 2개의 비오틴 결합 부위에 결합된다. 일부 실시양태에서, 적어도 1개의 아미노산 인식 분자는 제1 리간드 모이어티를 포함하는 핵산을 통해 단백질에 부착된다. 일부 실시양태에서, 적어도 1개의 검출가능한 표지는 제2 리간드 모이어티를 포함하는 핵산을 통해 단백질에 부착된다.
본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이, 본 출원의 차폐된 인식 분자는 본 출원에 따른 폴리펩티드 시퀀싱 방법, 또는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 차폐된 인식 분자는 폴리펩티드 시퀀싱 반응에서의 다중 반응 혼합물의 반복적인 사이클링을 포함할 수 있는 본원에서 제공된, 또는 관련 기술분야에 통상적으로 공지된 에드만-유형 분해 반응에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 차폐된 인식 분자는 단일 반응 혼합물에서의 아미노산 인식 및 분해를 포함하는 본 출원의 동적 시퀀싱 반응에 사용될 수 있다.
표지된 폴리펩티드의 분해에 의한 시퀀싱
일부 측면에서, 본 출원은 공지된 폴리펩티드 서열에 상응하는 아미노산의 고유한 조합을 확인함으로써 폴리펩티드를 시퀀싱하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 도 6은 표지된 폴리펩티드 (600)의 선택적으로 표지된 아미노산을 검출하는 것에 의한 시퀀싱의 방법을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 표지된 폴리펩티드 (600)는 상이한 아미노산 유형이 상이한 발광 표지를 포함하도록 선택적으로 변형된 아미노산을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 달리 지시되지 않는 한, 표지된 폴리펩티드는 1개 이상의 선택적으로 표지된 아미노산 측쇄를 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 선택적 표지화의 방법 및 표지된 폴리펩티드의 제조 및 분석에 관한 상세사항은 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Swaminathan, et al. PLoS Comput Biol. 2015, 11(2):e1004080] 참조).
나타내어진 바와 같이, 일부 실시양태에서, 표지된 폴리펩티드 (600)는 고정화되고, 여기 공급원에 노출된다. 표지된 폴리펩티드 (600)로부터의 합계 발광이 검출되고, 일부 실시양태에서, 시간 경과에 따른 발광에의 노출이 발광 표지 분해 (예를 들어, 광퇴색으로 인한 분해)로 인해 검출된 신호의 소실을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 표지된 폴리펩티드 (600)는 초기 검출된 신호를 발생시키는 선택적으로 표지된 아미노산의 고유한 조합을 포함한다. 일반적으로 예시된 바와 같이, 시간 경과에 따른 발광 표지의 분해는 광퇴색된 표지된 폴리펩티드 (602)에 대한 검출된 신호의 상응하는 감소를 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 신호는 하나 이상의 발광 특성의 분석에 의해 디콘볼루션될 수 있다 (예를 들어, 발광 수명 분석에 의한 신호 디콘볼루션). 일부 실시양태에서, 표지된 폴리펩티드 (600)의 선택적으로 표지된 아미노산의 고유한 조합은 컴퓨터로 사전산출되고, 경험적으로 확인되었다- 예를 들어, 프로테옴의 공지된 폴리펩티드 서열에 기반하여. 일부 실시양태에서, 검출된 아미노산 표지의 조합을 유기체의 프로테옴의 공지된 서열의 데이터베이스에 대해 비교하여, 표지된 폴리펩티드 (600)에 상응하는 데이터베이스의 특정한 폴리펩티드를 확인한다.
일부 실시양태에서, 도 6에 예시된 접근법은 거대 병행 분석에서 샘플링을 최소화하는 시퀀싱 반응을 수행하기 위해 최적 샘플 농도를 결정함으로써 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 농도는 어레이의 샘플 웰의 요망되는 분율 (예를 들어, 30%)이 임의의 주어진 시간에 점유되도록 선택된다. 이론에 구애되기를 원하지는 않지만, 폴리펩티드는 시간의 기간에 걸쳐 퇴색되는 반면, 동일한 웰은 추가의 분석을 위해 이용가능하도록 계속되는 것으로 생각된다. 확산을 통해, 어레이의 샘플 웰의 대략 30%는 3분마다 분석에 사용될 수 있다. 예시적인 예로서, 100만개의 샘플 웰 칩에서, 시간당 6,000,000개의 폴리펩티드, 또는 4시간 기간에 걸쳐 24,000,000개가 샘플링될 수 있다.
일부 측면에서, 본 출원은 말단 아미노산 변형 및 절단의 반복된 사이클로 처리된 표지된 폴리펩티드의 발광을 검출함으로써 폴리펩티드를 시퀀싱하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 도 7은 본 출원에 따른 에드만 분해에 의해 표지된 폴리펩티드를 시퀀싱하는 방법을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 방법은 일반적으로 에드만 분해에 의한 시퀀싱의 다른 방법에 대해 본원에 기재된 바와 같이 진행된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 도 7에 나타내어진 단계 (1) 및 (2)는 에드만 분해 반응에서 각각 말단 아미노산 변형 및 말단 아미노산 절단에 대해 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
도 7에 도시된 예에 나타내어진 바와 같이, 일부 실시양태에서, 방법은 (1) 표지된 폴리펩티드의 말단 아미노산을 변형시키는 단계를 포함한다. 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 변형은 말단 아미노산을 이소티오시아네이트 (예를 들어, PITC)와 접촉시켜 이소티오시아네이트-변형된 말단 아미노산을 형성하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이소티오시아네이트 변형 (710)은 말단 아미노산을 절단 시약 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 화학적 또는 효소적 절단 시약)에 의한 제거에 보다 감수성인 형태로 전환시킨다. 따라서, 일부 실시양태에서, 방법은 (2) 변형된 말단 아미노산을 에드만 분해에 대해 본원의 다른 곳에 상세화된 화학적 또는 효소적 수단을 사용하여 제거하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 표지된 폴리펩티드의 발광이 검출되는 동안 단계 (1) 내지 (2)를 복수개의 사이클 동안 반복하는 것을 포함하고, 말단으로부터의 표지된 아미노산의 제거에 상응하는 절단 사건은 검출된 신호의 감소로서 검출될 수 있다. 일부 실시양태에서, 도 7에 나타내어진 바와 같이 단계 (2) 후에 신호의 변화 없음은 미지의 유형의 아미노산을 확인한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 부분적 서열 정보는 검출된 신호의 변화에 기반하여 동일성을 결정함으로써 아미노산 유형을 할당하거나, 검출된 신호의 변화 없음에 기반하여 아미노산 유형을 미지인 것으로서 확인함으로써 각각의 순차적인 라운드 동안 단계 (2) 후에 검출된 신호를 평가함으로써 결정될 수 있다.
일부 측면에서, 본 출원에 따른 폴리펩티드를 시퀀싱하는 방법은 도 8a-8c에 일반적으로 예시된 바와 같이, 표지된 폴리펩티드의 진행적인 효소적 절단에 의한 시퀀싱을 포함한다. 나타내어진 바와 같이, 일부 실시양태에서, 표지된 폴리펩티드는 하나의 말단으로부터 또 다른 말단으로 말단 아미노산을 계속적으로 절단하는 변형된 진행적인 엑소펩티다제를 사용한 분해로 처리된다. 엑소펩티다제는 본원의 다른 곳에 상세하게 기재되어 있다. 도 8a는 표지된 폴리펩티드 (800)가 고정화된 진행적인 엑소펩티다제 (810)에 의한 분해로 처리되는 예를 도시한다. 도 8b는 고정화된 표지된 폴리펩티드 (820)가 진행적인 엑소펩티다제 (830)에 의한 분해로 처리되는 예를 도시한다.
도 8c는 도 8b에 도시된 방법에 따라 수행된 실시간 시퀀싱 프로세스의 예를 개략적으로 예시한다. 나타내어진 바와 같이, 패널 (I) 내지 (IV)는 표지된 폴리펩티드 분해의 진행을 나타내며, 시간 경과에 따른 상응하는 신호 트레이스는 각각의 패널 아래에 나타내어진다. 나타내어진 바와 같이, 표지된 아미노산에 상응하는 각각의 절단 사건은 신호의 수반 강하를 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 진행적인 엑소펩티다제 (830)의 진행도의 속도는 공지되어 있으므로, 신호의 검출된 감소 사이의 타이밍은 각각의 검출 사건 사이의 비표지된 아미노산의 수를 계산하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 40개의 아미노산의 폴리펩티드가 아미노산이 매초 제거되는 방식으로 절단된 경우, 3개의 신호를 갖는 표지된 폴리펩티드는 모든 3개의 초기 신호 (패널 (I)), 그 후 2개 (패널 (II)), 그 후 1개 (패널 (III)), 및 최종적으로 신호 없음을 나타낼 것이다. 이렇게 하여, 표지된 아미노산의 순서가 결정될 수 있다. 따라서, 이들 방법은 예를 들어, 폴리펩티드 단편 시퀀싱에 기반한 프로테옴 분석을 위해 부분적 서열 정보를 결정하는데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 단일 분자 단백질 시퀀싱은 예를 들어 도 9에 예시된 바와 같이, ATP-기반 푀르스터(Foerster) 공명 에너지 전달 (FRET) 스킴을 사용하여 (예를 들어, 1개 이상의 표지된 보조인자로) 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 보조인자-기반 FRET에 의한 시퀀싱은 폴리펩티드 기질의 고정화된 ATP-의존성 프로테아제, 공여자-표지된 ATP, 및 수용자-표지된 아미노산을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산은 수용자로 표지될 수 있고, 1개 이상의 보조인자는 공여자로 표지될 수 있다.
예를 들어, 일부 실시양태에서, 추출된 단백질은 변성되고, 시스테인 및 리신은 형광 염료로 표지된다. 일부 실시양태에서, 단백질 트랜스로카제의 조작된 버전 (예를 들어, 박테리아 ClpX)은 개별적인 기질 단백질에 결합하고, 이들을 언폴딩하고, 이들을 그의 나노-채널을 통해 전위시키는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 트랜스로카제는 공여자 염료로 표지되고, FRET는 기질이 나노-채널을 통해 통과할 때 트랜스로카제 상의 공여자 및 기질 상의 2종 이상의 별개의 수용자 염료 사이에 일어난다. 그 후, 표지된 아미노산의 순서는 FRET 신호로부터 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표 5에 나타내어진 하기 비-제한적 표지된 ATP 유사체 중 1종 이상이 사용될 수 있다.
표 5. 표지된 ATP 유사체의 비-제한적 예.
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
시퀀싱을 위한 샘플의 제조
폴리펩티드 샘플은 시퀀싱 전에 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 N-말단 아미노산 또는 C-말단 아미노산은 변형된다. 도 10a는 단백질 샘플로부터 말단 변형된 폴리펩티드를 제조하기 위한 말단 단부 변형의 비-제한적 예를 예시한다. 단계 (1)에서, 단백질 샘플 (1000)은 단편화되어 폴리펩티드 단편 (1002)을 생성한다. 폴리펩티드는 관심의 폴리펩티드를 절단함 (예를 들어, 화학적으로) 및/또는 소화시킴 (예를 들어, 효소적으로, 예를 들어 펩티다제, 예를 들어 트립신을 사용하여)으로써 단편화될 수 있다. 단편화는 표지화 전에 또는 후에 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단편화는 전체 단백질의 표지화 후에 수행된다. 1개 이상의 아미노산은 절단 전에 또는 후에 표지되어 표지된 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 화학적 또는 효소적 단편화 후에 크기 선택된다. 일부 실시양태에서, 보다 작은 폴리펩티드 (예를 들어, < 2 kDa)는 제거되고, 보다 큰 폴리펩티드는 서열 분석을 위해 보유된다. 크기 선택은 겔 여과, SEC, 투석, PAGE 겔 추출, 미세유체 장력 유동, 또는 임의의 다른 적합한 기법과 같은 기법을 사용하여 달성될 수 있다. 단계 (2)에서, 폴리펩티드 단편 (1002)의 N-말단 또는 C-말단은 변형되어 말단 변형된 폴리펩티드 (1004)를 생성한다. 일부 실시양태에서, 변형은 고정화 모이어티를 첨가하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형은 커플링 모이어티를 첨가하는 것을 포함한다.
따라서, 단백질 및 폴리펩티드의 말단 단부를 표면 (예를 들어, 단백질 분석에 사용되는 칩 상의 샘플 웰의 표면)에의 고정화를 가능하게 하는 모이어티로 변형시키는 방법이 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 이러한 방법은 본 출원에 따라 분석되는 표지된 폴리펩티드의 말단 단부를 변형시키는 것을 포함한다. 추가의 다른 실시양태에서, 이러한 방법은 본 출원에 따라 단백질 또는 폴리펩티드 기질을 분해하거나 전위시키는 단백질 또는 효소의 말단 단부를 변형시키는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단백질 또는 폴리펩티드의 카르복시-말단은 (i) 단백질 또는 폴리펩티드의 유리 카르복실레이트 기를 차단하고; (ii) 단백질 또는 폴리펩티드를 변성시키고 (예를 들어, 열 및/또는 화학적 수단에 의해); (iii) 단백질 또는 폴리펩티드의 유리 티올 기를 차단하고; (iv) 단백질 또는 폴리펩티드를 소화시켜 유리 C-말단 카르복실레이트 기를 포함하는 적어도 1개의 폴리펩티드 단편을 생성하고; (v) 관능성 모이어티를 유리 C-말단 카르복실레이트 기에 접합시키는 (예를 들어, 화학적으로) 것을 포함하는 방법으로 변형된다. 일부 실시양태에서, 방법은 (i) 후에 및 (ii) 전에, 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하는 샘플을 투석하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 단백질 또는 폴리펩티드의 카르복시-말단은 (i) 단백질 또는 폴리펩티드를 변성시키고 (예를 들어, 열 및/또는 화학적 수단에 의해); (ii) 단백질 또는 폴리펩티드의 유리 티올 기를 차단하고; (iii) 단백질 또는 폴리펩티드를 소화시켜 유리 C-말단 카르복실레이트 기를 포함하는 적어도 1개의 폴리펩티드 단편을 생성하고; (iv) 유리 C-말단 카르복실레이트 기를 차단하여 차단된 C-말단 카르복실레이트 기를 포함하는 적어도 1개의 폴리펩티드 단편을 생성하고; (v) 관능성 모이어티를 차단된 C-말단 카르복실레이트 기에 접합시키는 (예를 들어, 효소적으로) 것을 포함하는 방법으로 변형된다. 일부 실시양태에서, 방법은 (iv) 후에 및 (v) 전에, 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하는 샘플을 투석하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 유리 카르복실레이트 기를 차단하는 것은 비변형된 카르복실레이트에 비해 화학적 반응성을 변경시키는 이들 기의 화학적 변형을 지칭한다. 적합한 카르복실레이트 차단 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 관능화되는 폴리펩티드의 카르복시-말단 카르복실레이트 기와는 화학적으로 상이하도록 측쇄 카르복실레이트 기를 변형시켜야 한다. 일부 실시양태에서, 유리 카르복실레이트 기를 차단하는 것은 폴리펩티드의 유리 카르복실레이트 기의 에스테르화 또는 아미드화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 유리 카르복실레이트 기를 차단하는 것은 예를 들어, 폴리펩티드를 메탄올성 HCl과 반응시키는 것에 의한 폴리펩티드의 유리 카르복실레이트 기의 메틸 에스테르화를 포함한다. 유리 카르복실레이트 기를 차단하는데 유용한 시약 및 기법의 추가적인 예는 제한 없이, 4-술포-2,3,5,6-테트라플루오로페놀 (STP) 및/또는 카르보디이미드, 예컨대 N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDAC), 우로늄 시약, 디아조메탄, 피셔 에스테르화를 위한 알콜 및 산, NHS 에스테르를 형성하는 N-히드록실숙신이미드 (NHS) (잠재적으로 후속 에스테르 또는 아민 형성에 대한 중간체로서)의 사용, 또는 카르보닐디이미다졸 (CDI)과의 반응 또는 혼합된 무수물의 형성, 또는 잠재적으로 에스테르 또는 아미드 중 어느 하나의 형성을 통해 카르복실산을 변형시키거나 차단하는 임의의 다른 방법을 포함한다.
일부 실시양태에서, 유리 티올 기를 차단하는 것은 비변형된 티올에 비해 화학적 반응성을 변경시키는 이들 기의 화학적 변형을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 유리 티올 기를 차단하는 것은 단백질 또는 폴리펩티드의 유리 티올 기를 환원시키고 알킬화하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 환원 및 알킬화는 폴리펩티드를 디티오트레이톨 (DTT) 및 아이오도아세트아미드 및 아이오도아세트산 중 하나 또는 둘 다와 접촉시킴으로써 수행된다. 사용될 수 있는 추가적인 및 대안적인 시스테인-환원 시약의 예는 널리 공지되어 있으며, 제한 없이, 2-메르캅토에탄올, 트리스 (2-카르복시에틸) 포스핀 히드로클로라이드 (TCEP), 트리부틸포스핀, 디티오부틸아민 (DTBA), 또는 티올 기를 환원시킬 수 있는 임의의 시약을 포함한다. 사용될 수 있는 추가적인 및 대안적인 시스테인-차단 (예를 들어, 시스테인-알킬화) 시약의 예는 널리 공지되어 있으며, 제한 없이, 아크릴아미드, 4-비닐피리딘, N-에틸말레미드 (NEM), N-ε-말레이미도카프로산 (EMCA), 또는 디술피드 결합 형성을 방지하도록 시스테인을 변형시키는 임의의 시약을 포함한다.
일부 실시양태에서, 소화는 효소적 소화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 소화는 단백질 또는 폴리펩티드를 소화 조건 하에서 엔도펩티다제 (예를 들어, 트립신)와 접촉시킴으로써 수행된다. 일부 실시양태에서, 소화는 화학적 소화를 포함한다. 화학적 및 효소적 소화를 위한 적합한 시약의 예는 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 제한 없이, 트립신, 케모트립신, Lys-C, Arg-C, Asp-N, Lys-N, BNPS-스카톨, CNBr, 카스파제, 포름산, 글루타밀 엔도펩티다제, 히드록실아민, 아이오도소벤조산, 호중구 엘라스타제, 펩신, 프롤린-엔도펩티다제, 프로테이나제 K, 스타필로코쿠스 펩티다제 I, 써모리신, 및 트롬빈을 포함한다.
일부 실시양태에서, 관능성 모이어티는 비오틴 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 관능성 모이어티는 반응성 화학적 모이어티, 예컨대 알키닐을 포함한다. 일부 실시양태에서, 관능성 모이어티를 접합시키는 것은 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 카르복시펩티다제 Y에 의한 카르복시-말단 카르복시-메틸 에스테르 기의 비오티닐화를 포함한다.
일부 실시양태에서, 가용화 모이어티는 폴리펩티드에 첨가된다. 도 10b는 예를 들어 가용화 링커를 폴리펩티드에 접합시키는 프로세스를 사용한 폴리펩티드의 말단 아미노산에 첨가된 가용화 모이어티의 비-제한적 예를 예시한다.
일부 실시양태에서, 링커 접합 모이어티 (1012)를 포함하는 말단 변형된 폴리펩티드 (1010)는 폴리펩티드 접합 모이어티 (1022)를 포함하는 가용화 링커 (1020)에 접합된다. 일부 실시양태에서, 가용화 링커는 가용화 중합체, 예컨대 생체분자 (예를 들어, 반점 형상으로서 나타내어짐)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1012 및 1022 사이에 형성된 연결 (1032)을 포함하는 생성된 링커-접합된 폴리펩티드 (1030)는 표면 접합 모이어티 (1034)를 추가로 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서 본원에서 제공된 방법 및 조성물은 폴리펩티드의 말단 단부를 그들의 용해도를 증가시키는 모이어티로 변형시키는데 유용하다. 일부 실시양태에서, 가용화 모이어티는 단편화 (예를 들어, 효소적 단편화, 예를 들어 트립신을 사용함)로부터 발생되고, 상대적으로 불용성인 작은 폴리펩티드에 대해 유용하다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 풀 중의 짧은 폴리펩티드는 중합체 (예를 들어, 짧은 올리고, 당, 또는 다른 하전된 중합체)를 폴리펩티드에 접합시킴으로써 가용화될 수 있다.
일부 실시양태에서, 샘플 웰의 1개 이상의 표면 (예를 들어, 샘플 웰의 측벽)은 변형될 수 있다. 샘플 웰 측벽의 부동태화 및/또는 오염방지의 비-제한적 예는 바닥 표면에의 단일 분자 고정화를 촉진시키는데 사용될 수 있는 변형된 표면을 갖는 샘플 웰의 예시 개략도가 예시된 도 10c에 나타내어진다. 일부 실시양태에서, 1040은 SiO2이다. 일부 실시양태에서, 1042는 폴리펩티드 접합 모이어티 (예를 들어, TCO, 테트라진, N3, 알킨, 알데히드, NCO, NHS, 티올, 알켄, DBCO, BCN, TPP, 비오틴, 또는 다른 적합한 접합 모이어티)이다. 일부 실시양태에서, 1050은 TiO2 또는 Al2O3이다. 일부 실시양태에서, 1052는 소수성 C4-18 분자, 폴리테트라플루오로에틸렌 화합물 (예를 들어, (CF2)4-12), 폴리올, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (예를 들어, PEG3-100), 풀리프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌 글리콜, 또는 그의 조합 또는 변이, 또는 쯔비터이온, 예컨대 술포베타인이다. 일부 실시양태에서, 1060은 Si이다. 일부 실시양태에서, 1070은 Al이다. 일부 실시양태에서, 1080은 TiN이다.
발광 표지
본원에 사용된 바와 같이, 발광 표지는 1개 이상의 광자를 흡수하고, 이어서 하나 이상의 시간 지속기간 후에 1개 이상의 광자를 방출할 수 있는 분자이다. 일부 실시양태에서, 상기 용어는 맥락에 따라 "표지" 또는 "발광 분자"와 상호교환가능하게 사용된다. 본원에 기재된 특정 실시양태에 따른 발광 표지는 표지된 친화도 시약의 발광 표지, 표지된 펩티다제 (예를 들어, 표지된 엑소펩티다제, 표지된 비-특이적 엑소펩티다제)의 발광 표지, 표지된 펩티드의 발광 표지, 표지된 보조인자의 발광 표지, 또는 본원에 기재된 또 다른 표지된 조성물을 지칭할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 출원에 따른 발광 표지는 1개 이상의 표지된 아미노산을 포함하는 표지된 폴리펩티드의 표지된 아미노산을 지칭한다.
일부 실시양태에서, 발광 표지는 제1 및 제2 발색단을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 발색단의 여기된 상태는 제2 발색단에의 에너지 전달을 통한 완화가 가능하다. 일부 실시양태에서, 에너지 전달은 푀르스터 공명 에너지 전달 (FRET)이다. 이러한 FRET 쌍은 표지를 혼합물 중의 복수개의 발광 표지 중에서로부터 구별하는 것을 보다 용이하게 만드는 특성을 갖는 발광 표지를 제공하는데 유용할 수 있다- 예를 들어, 도 1c의 표지된 압타머 (106)에 대해 본원에 예시되고 기재된 바와 같이. 추가의 다른 실시양태에서, FRET 쌍은 제1 발광 표지의 제1 발색단 및 제2 발광 표지의 제2 발색단을 포함한다- 예를 들어, 표지된 보조인자를 사용한 표지된 펩티드의 시퀀싱에 대해 본원에 예시되고 기재된 바와 같이 (예를 들어, 도 9 참조). 특정 실시양태에서, FRET 쌍은 제1 스펙트럼 범위에서 여기 에너지를 흡수하고, 제2 스펙트럼 범위에서 발광을 방출할 수 있다.
일부 실시양태에서, 발광 표지는 형광단 또는 염료를 지칭한다. 전형적으로, 발광 표지는 방향족 또는 헤테로방향족 화합물을 포함하며, 피렌, 안트라센, 나프탈렌, 나프틸아민, 아크리딘, 스틸벤, 인돌, 벤즈인돌, 옥사졸, 카르바졸, 티아졸, 벤조티아졸, 벤즈옥사졸, 페난트리딘, 페녹사진, 포르피린, 퀴놀린, 에티듐, 벤즈아미드, 시아닌, 카르보시아닌, 살리실레이트, 안트라닐레이트, 쿠마린, 플루오로세인, 로다민, 크산텐, 또는 다른 유사 화합물일 수 있다.
일부 실시양태에서, 발광 표지는 하기 중 1종 이상으로부터 선택되는 염료를 포함한다: 5/6-카르복시로다민 6G, 5-카르복시로다민 6G, 6-카르복시로다민 6G, 6-TAMRA, 아베리어(Abberior)® 스타(STAR) 440SXP, 아베리어® 스타 470SXP, 아베리어® 스타 488, 아베리어® 스타 512, 아베리어® 스타 520SXP, 아베리어® 스타 580, 아베리어® 스타 600, 아베리어® 스타 635, 아베리어® 스타 635P, 아베리어® 스타 레드, 알렉사 플루오르(Alexa Fluor)® 350, 알렉사 플루오르® 405, 알렉사 플루오르® 430, 알렉사 플루오르® 480, 알렉사 플루오르® 488, 알렉사 플루오르® 514, 알렉사 플루오르® 532, 알렉사 플루오르® 546, 알렉사 플루오르® 555, 알렉사 플루오르® 568, 알렉사 플루오르® 594, 알렉사 플루오르® 610-X, 알렉사 플루오르® 633, 알렉사 플루오르® 647, 알렉사 플루오르® 660, 알렉사 플루오르® 680, 알렉사 플루오르® 700, 알렉사 플루오르® 750, 알렉사 플루오르® 790, AMCA, ATTO 390, ATTO 425, ATTO 465, ATTO 488, ATTO 495, ATTO 514, ATTO 520, ATTO 532, ATTO 542, ATTO 550, ATTO 565, ATTO 590, ATTO 610, ATTO 620, ATTO 633, ATTO 647, ATTO 647N, ATTO 655, ATTO 665, ATTO 680, ATTO 700, ATTO 725, ATTO 740, ATTO Oxa12, ATTO Rho101, ATTO Rho11, ATTO Rho12, ATTO Rho13, ATTO Rho14, ATTO Rho3B, ATTO Rho6G, ATTO Thio12, BD 호리즌(Horizon)™ V450, 바디피(BODIPY)® 493/501, 바디피® 530/550, 바디피® 558/568, 바디피® 564/570, 바디피® 576/589, 바디피® 581/591, 바디피® 630/650, 바디피® 650/665, 바디피® FL, 바디피® FL-X, 바디피® R6G, 바디피® TMR, 바디피® TR, CAL 플루오르® 골드 540, CAL 플루오르® 그린 510, CAL 플루오르® 오렌지 560, CAL 플루오르® 레드 590, CAL 플루오르® 레드 610, CAL 플루오르® 레드 615, CAL 플루오르® 레드 635, 캐스케이드(Cascade)® 블루, CF™350, CF™405M, CF™405S, CF™488A, CF™514, CF™532, CF™543, CF™546, CF™555, CF™568, CF™594, CF™620R, CF™633, CF™633-V1, CF™640R, CF™640R-V1, CF™640R-V2, CF™660C, CF™660R, CF™680, CF™680R, CF™680R-V1, CF™750, CF™770, CF™790, 크로메오(Chromeo)™ 642, 크로미스(Chromis) 425N, 크로미스 500N, 크로미스 515N, 크로미스 530N, 크로미스 550A, 크로미스 550C, 크로미스 550Z, 크로미스 560N, 크로미스 570N, 크로미스 577N, 크로미스 600N, 크로미스 630N, 크로미스 645A, 크로미스 645C, 크로미스 645Z, 크로미스 678A, 크로미스 678C, 크로미스 678Z, 크로미스 770A, 크로미스 770C, 크로미스 800A, 크로미스 800C, 크로미스 830A, 크로미스 830C, Cy®3, Cy®3.5, Cy®3B, Cy®5, Cy®5.5, Cy®7, 다이라이트(DyLight)® 350, 다이라이트® 405, 다이라이트® 415-Co1, 다이라이트® 425Q, 다이라이트® 485-LS, 다이라이트® 488, 다이라이트® 504Q, 다이라이트® 510-LS, 다이라이트® 515-LS, 다이라이트® 521-LS, 다이라이트® 530-R2, 다이라이트® 543Q, 다이라이트® 550, 다이라이트® 554-R0, 다이라이트® 554-R1, 다이라이트® 590-R2, 다이라이트® 594, 다이라이트® 610-B1, 다이라이트® 615-B2, 다이라이트® 633, 다이라이트® 633-B1, 다이라이트® 633-B2, 다이라이트® 650, 다이라이트® 655-B1, 다이라이트® 655-B2, 다이라이트® 655-B3, 다이라이트® 655-B4, 다이라이트® 662Q, 다이라이트® 675-B1, 다이라이트® 675-B2, 다이라이트® 675-B3, 다이라이트® 675-B4, 다이라이트® 679-C5, 다이라이트® 680, 다이라이트® 683Q, 다이라이트® 690-B1, 다이라이트® 690-B2, 다이라이트® 696Q, 다이라이트® 700-B1, 다이라이트® 700-B1, 다이라이트® 730-B1, 다이라이트® 730-B2, 다이라이트® 730-B3, 다이라이트® 730-B4, 다이라이트® 747, 다이라이트® 747-B1, 다이라이트® 747-B2, 다이라이트® 747-B3, 다이라이트® 747-B4, 다이라이트® 755, 다이라이트® 766Q, 다이라이트® 775-B2, 다이라이트® 775-B3, 다이라이트® 775-B4, 다이라이트® 780-B1, 다이라이트® 780-B2, 다이라이트® 780-B3, 다이라이트® 800, 다이라이트® 830-B2, 다이오믹스(Dyomics)-350, 다이오믹스-350XL, 다이오믹스-360XL, 다이오믹스-370XL, 다이오믹스-375XL, 다이오믹스-380XL, 다이오믹스-390XL, 다이오믹스-405, 다이오믹스-415, 다이오믹스-430, 다이오믹스-431, 다이오믹스-478, 다이오믹스-480XL, 다이오믹스-481XL, 다이오믹스-485XL, 다이오믹스-490, 다이오믹스-495, 다이오믹스-505, 다이오믹스-510XL, 다이오믹스-511XL, 다이오믹스-520XL, 다이오믹스-521XL, 다이오믹스-530, 다이오믹스-547, 다이오믹스-547P1, 다이오믹스-548, 다이오믹스-549, 다이오믹스-549P1, 다이오믹스-550, 다이오믹스-554, 다이오믹스-555, 다이오믹스-556, 다이오믹스-560, 다이오믹스-590, 다이오믹스-591, 다이오믹스-594, 다이오믹스-601XL, 다이오믹스-605, 다이오믹스-610, 다이오믹스-615, 다이오믹스-630, 다이오믹스-631, 다이오믹스-632, 다이오믹스-633, 다이오믹스-634, 다이오믹스-635, 다이오믹스-636, 다이오믹스-647, 다이오믹스-647P1, 다이오믹스-648, 다이오믹스-648P1, 다이오믹스-649, 다이오믹스-649P1, 다이오믹스-650, 다이오믹스-651, 다이오믹스-652, 다이오믹스-654, 다이오믹스-675, 다이오믹스-676, 다이오믹스-677, 다이오믹스-678, 다이오믹스-679P1, 다이오믹스-680, 다이오믹스-681, 다이오믹스-682, 다이오믹스-700, 다이오믹스-701, 다이오믹스-703, 다이오믹스-704, 다이오믹스-730, 다이오믹스-731, 다이오믹스-732, 다이오믹스-734, 다이오믹스-749, 다이오믹스-749P1, 다이오믹스-750, 다이오믹스-751, 다이오믹스-752, 다이오믹스-754, 다이오믹스-776, 다이오믹스-777, 다이오믹스-778, 다이오믹스-780, 다이오믹스-781, 다이오믹스-782, 다이오믹스-800, 다이오믹스-831, e플루오르(eFluor)® 450, 에오신(Eosin), FITC, 플루오레세인(Fluorescein), 하이라이트(HiLyte)™ 플루오르(Fluor) 405, 하이라이트™ 플루오르 488, 하이라이트™ 플루오르 532, 하이라이트™ 플루오르 555, 하이라이트™ 플루오르 594, 하이라이트™ 플루오르 647, 하이라이트™ 플루오르 680, 하이라이트™ 플루오르 750, IRDye® 680LT, IRDye® 750, IRDye® 800CW, JOE, 라이트사이클러(LightCycler)® 640R, 라이트사이클러® 레드 610, 라이트사이클러® 레드 640, 라이트사이클러® 레드 670, 라이트사이클러® 레드 705, 리사민 로다민 B, 나프토플루오레세인, 오레곤 그린(Oregon Green)® 488, 오레곤 그린® 514, 퍼시픽 블루(Pacific Blue)™, 퍼시픽 그린(Pacific Green)™, 퍼시픽 오렌지(Pacific Orange)™, PET, PF350, PF405, PF415, PF488, PF505, PF532, PF546, PF555P, PF568, PF594, PF610, PF633P, PF647P, 콰사르(Quasar)® 570, 콰사르® 670, 콰사르® 705, 로다민 123, 로다민 6G, 로다민 B, 로다민 그린, 로다민 그린-X, 로다민 레드, ROX, 세타(Seta)™ 375, 세타™ 470, 세타™ 555, 세타™ 632, 세타™ 633, 세타™ 650, 세타™ 660, 세타™ 670, 세타™ 680, 세타™ 700, 세타™ 750, 세타™ 780, 세타™ APC-780, 세타™ PerCP-680, 세타™ R-PE-670, 세타™ 646, 세타우(SeTau) 380, 세타우 425, 세타우 647, 세타우 405, 스퀘어(Square) 635, 스퀘어 650, 스퀘어 660, 스퀘어 672, 스퀘어 680, 술포로다민 101, TAMRA, TET, 텍사스 레드(Texas Red)®, TMR, TRITC, 야키마 옐로우(Yakima Yellow)™, 제논(Zenon)®, Zy3, Zy5, Zy5.5, 및 Zy7.
발광
일부 측면에서, 본 출원은 발광 표지의 하나 이상의 발광 특성에 기반한 폴리펩티드 시퀀싱 및/또는 확인에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 발광 표지는 발광 수명, 발광 강도, 휘도, 흡수 스펙트럼, 방출 스펙트럼, 발광 양자 수율, 또는 그의 2개 이상의 조합에 기반하여 확인된다. 일부 실시양태에서, 발광 표지의 복수개의 유형은 상이한 발광 수명, 발광 강도, 휘도, 흡수 스펙트럼, 방출 스펙트럼, 발광 양자 수율, 또는 그의 2개 이상의 조합에 기반하여 서로로부터 구별될 수 있다. 확인은 발광 표지와 회합된 아미노산의 하나의 유형 (예를 들어, 단일 유형 또는 유형의 하위세트)의 정확한 동일성 및/또는 양을 할당하는 것을 의미할 수 있으며, 또한 아미노산의 다른 유형에 비해 폴리펩티드에서 아미노산 위치를 할당하는 것을 의미할 수 있다.
일부 실시양태에서, 발광은 발광 표지를 일련의 별개의 광 펄스에 노출시키고, 표지로부터 방출된 각각의 광자의 타이밍 또는 다른 특성을 평가함으로써 검출된다. 일부 실시양태에서, 표지로부터 순차적으로 방출된 복수개의 광자에 대한 정보를 합계하고 평가하여 표지를 확인하며, 그에 의해 아미노산의 연관된 유형을 확인한다. 일부 실시양태에서, 표지의 발광 수명을 표지로부터 순차적으로 방출된 복수개의 광자로부터 결정하고, 발광 수명을 사용하여 표지를 확인할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표지의 발광 강도를 표지로부터 순차적으로 방출된 복수개의 광자로부터 결정하고, 발광 강도를 사용하여 표지를 확인할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표지의 발광 수명 및 발광 강도를 표지로부터 순차적으로 방출된 복수개의 광자로부터 결정하고, 발광 수명 및 발광 강도를 사용하여 표지를 확인할 수 있다.
본 출원의 일부 측면에서, 단일 폴리펩티드 분자는 복수개의 별개의 광 펄스에 노출되고, 일련의 방출된 광자는 검출되고 분석된다. 일부 실시양태에서, 일련의 방출된 광자는 실험의 시간에 걸쳐 반응 샘플에 존재하고 변화하지 않는 단일 폴리펩티드 분자에 관한 정보를 제공한다. 그러나, 일부 실시양태에서, 일련의 방출된 광자는 상이한 시간에서 반응 샘플에 존재하는 (예를 들어, 반응 또는 프로세스가 진행됨에 따라) 일련의 상이한 분자에 관한 정보를 제공한다. 제한으로서가 아니라 예로서, 이러한 정보는 본 출원에 따라 화학적 또는 효소적 분해로 처리된 폴리펩티드를 시퀀싱하고/거나 확인하는데 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 발광 표지는 시간 지속기간 후에 1개의 광자를 흡수하고, 1개의 광자를 방출한다. 일부 실시양태에서, 표지의 발광 수명은 시간 지속기간을 측정함으로써 결정되거나 추정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표지의 발광 수명은 다중 펄스 사건 및 방출 사건에 대한 복수개의 시간 지속기간을 측정함으로써 결정되거나 추정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표지의 발광 수명은 시간 지속기간을 측정함으로써 표지의 복수개의 유형의 발광 수명 중에서 구별될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표지의 발광 수명은 다중 펄스 사건 및 방출 사건에 대한 복수개의 시간 지속기간을 측정함으로써 표지의 복수개의 유형의 발광 수명 중에서 구별될 수 있다. 특정 실시양태에서, 표지는 표지의 발광 수명을 결정하거나 추정함으로써 표지의 복수개의 유형 중에서 확인되거나 구별된다. 특정 실시양태에서, 표지는 표지의 복수개의 유형의 복수개의 발광 수명 중에서 표지의 발광 수명을 구별함으로써 표지의 복수개의 유형 중에서 확인되거나 구별된다.
발광 표지의 발광 수명의 결정은 임의의 적합한 방법을 사용하여 (예를 들어, 적합한 기법을 사용하여 수명을 측정함으로써 또는 방출의 시간-의존성 특징을 결정함으로써) 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나의 표지의 발광 수명을 결정하는 것은 또 다른 표지에 비해 수명을 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표지의 발광 수명을 결정하는 것은 참조물에 비해 수명을 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표지의 발광 수명을 결정하는 것은 수명 (예를 들어, 형광 수명)을 측정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표지의 발광 수명을 결정하는 것은 수명을 지시하는 하나 이상의 시간적 특징을 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표지의 발광 수명은 여기 펄스에 비해 하나 이상의 시간-게이팅된 창에 걸쳐 발생하는 복수개의 방출 사건 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100개, 또는 그 초과의 방출 사건)의 분포에 기반하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 표지의 발광 수명은 여기 펄스에 관하여 측정된 광자 도착 시간의 분포에 기반하여 상이한 발광 수명을 갖는 복수개의 표지로부터 구별될 수 있다.
발광 표지의 발광 수명은 표지가 여기된 상태에 도달한 후에 방출된 광자의 타이밍을 지시하며, 표지는 광자의 타이밍을 지시하는 정보에 의해 구별될 수 있음이 인지되어야 한다. 일부 실시양태는 표지에 의해 방출된 광자와 연관된 시간을 측정함으로써 표지의 발광 수명에 기반하여 표지를 복수개의 표지로부터 구별하는 것을 포함할 수 있다. 시간의 분포는 분포로부터 결정될 수 있는 발광 수명의 지시를 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표지는 예컨대 시간의 분포를 공지된 표지에 상응하는 참조 분포와 비교함으로써, 시간의 분포에 기반하여 복수개의 표지로부터 구별가능하다. 일부 실시양태에서, 발광 수명에 대한 값은 시간의 분포로부터 결정된다.
본원에 사용된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 발광 강도는 펄싱된 여기 에너지의 전달에 의해 여기되고 있는 발광 표지에 의해 방출된 단위 시간당 방출된 광자의 수를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 발광 강도는 펄싱된 여기 에너지의 전달에 의해 여기되고 있는 표지에 의해 방출된 단위 시간당 방출된 광자의 검출된 수를 지칭하며, 특정한 센서 또는 센서의 세트에 의해 검출된다.
본원에 사용된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 휘도는 발광 표지당 평균 방출 강도에 대해 보고하는 파라미터를 지칭한다. 따라서, 일부 실시양태에서, "방출 강도"는 일반적으로 1개 이상의 표지를 포함하는 조성물의 휘도를 지칭하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표지의 휘도는 그의 양자 수율 및 소광 계수의 결과물과 동등하다.
본원에 사용된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 발광 양자 수율은 방출 사건을 발생시키는 주어진 파장에서 또는 주어진 스펙트럼 범위 내에서 여기 사건의 분율을 지칭하며, 전형적으로 1 미만이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 발광 표지의 발광 양자 수율은 0 내지 약 0.001, 약 0.001 내지 약 0.01, 약 0.01 내지 약 0.1, 약 0.1 내지 약 0.5, 약 0.5 내지 0.9, 또는 약 0.9 내지 1이다. 일부 실시양태에서, 표지는 발광 양자 수율을 결정하거나 추정함으로써 확인된다.
본원에 사용된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 여기 에너지는 광원으로부터의 광의 펄스이다. 일부 실시양태에서, 여기 에너지는 가시 스펙트럼에 있다. 일부 실시양태에서, 여기 에너지는 자외선 스펙트럼에 있다. 일부 실시양태에서, 여기 에너지는 적외선 스펙트럼에 있다. 일부 실시양태에서, 여기 에너지는 복수개의 방출된 광자가 검출되는 발광 표지의 흡수 최대값 또는 그 부근이다. 특정 실시양태에서, 여기 에너지는 약 500 nm 내지 약 700 nm (예를 들어, 약 500 nm 내지 약 600 nm, 약 600 nm 내지 약 700 nm, 약 500 nm 내지 약 550 nm, 약 550 nm 내지 약 600 nm, 약 600 nm 내지 약 650 nm, 또는 약 650 nm 내지 약 700 nm)이다. 특정 실시양태에서, 여기 에너지는 단색성이거나 스펙트럼 범위에 국한될 수 있다. 일부 실시양태에서, 스펙트럼 범위는 약 0.1 nm 내지 약 1 nm, 약 1 nm 내지 약 2 nm, 또는 약 2 nm 내지 약 5 nm의 범위를 갖는다. 일부 실시양태에서, 스펙트럼 범위는 약 5 nm 내지 약 10 nm, 약 10 nm 내지 약 50 nm, 또는 약 50 nm 내지 약 100 nm의 범위를 갖는다.
시퀀싱
본 출원의 측면은 생물학적 중합체, 예컨대 폴리펩티드 및 단백질을 시퀀싱하는 것에 관한 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, 폴리펩티드 또는 단백질에 관하여 "시퀀싱", "서열 결정", "서열을 결정하는 것" 및 유사한 용어는 폴리펩티드 또는 단백질의 부분적 서열 정보 뿐만 아니라 완전한 서열 정보의 결정을 포함한다. 즉, 상기 용어는 서열 비교, 핑거프린팅, 확률론적 핑거프린팅, 및 표적 분자에 관한 유사한 수준의 정보, 뿐만 아니라 관심의 영역 내의 표적 분자의 각각의 아미노산의 발현 확인 및 순서결정을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 용어는 폴리펩티드의 단일 아미노산을 확인하는 것을 포함한다. 추가의 다른 실시양태에서, 폴리펩티드의 1개 초과의 아미노산이 확인된다. 본원에 사용된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 아미노산에 관하여 "확인하는 것", "동일성을 결정하는 것" 및 유사한 용어는 아미노산의 발현 동일성의 결정 뿐만 아니라 아미노산의 발현 동일성의 확률의 결정을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 아미노산은 아미노산이 특이적 유형의 것일 확률 (예를 들어, 0% 내지 100%)을 결정함으로써, 또는 복수개의 특이적 유형의 각각에 대한 확률을 결정함으로써 확인된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "아미노산 서열", "폴리펩티드 서열", 및 "단백질 서열"은 폴리펩티드 또는 단백질 물질 자체를 지칭할 수 있으며, 특이적 폴리펩티드 또는 단백질을 생화학적으로 특징규명하는 특이적 서열 정보 (예를 들어, 하나의 말단으로부터 또 다른 말단으로 아미노산의 순서를 나타내는 문자의 연속)에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드 분자의 시퀀싱은 폴리펩티드 분자에서 적어도 2개 (예를 들어, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 25개, 적어도 30개, 적어도 35개, 적어도 40개, 적어도 45개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 70개, 적어도 80개, 적어도 90개, 적어도 100개, 또는 그 초과)의 아미노산을 확인하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 아미노산은 인접 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 아미노산은 비-인접 아미노산이다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드 분자의 시퀀싱은 폴리펩티드 분자에서 모든 아미노산의 100% 미만 (예를 들어, 99% 미만, 95% 미만, 90% 미만, 85% 미만, 80% 미만, 75% 미만, 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만, 55% 미만, 50% 미만, 45% 미만, 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만 또는 그 미만)의 확인을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 분자의 시퀀싱은 폴리펩티드 분자에서 아미노산의 하나의 유형의 100% 미만의 확인 (예를 들어, 폴리펩티드 분자에서 하나의 유형의 모든 아미노산의 부분의 확인)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 분자의 시퀀싱은 폴리펩티드 분자에서 아미노산의 각각의 유형의 100% 미만의 확인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드 분자의 시퀀싱은 폴리펩티드에서 아미노산의 적어도 1개, 적어도 5개, 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 25개, 적어도 30개, 적어도 35개, 적어도 40개, 적어도 45개, 적어도 50개, 적어도 55개, 적어도 60개, 적어도 65개, 적어도 70개, 적어도 75개, 적어도 80개, 적어도 85개, 적어도 90개, 적어도 95개, 적어도 100개 또는 그 초과의 유형의 확인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 출원은 시간 경과에 따라 폴리펩티드의 말단에 존재하는 일련의 아미노산을 확인함으로써 (예를 들어, 말단에서의 아미노산의 반복적인 검출 및 절단에 의해) 폴리펩티드를 시퀀싱하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 추가의 다른 실시양태에서, 본 출원은 폴리펩티드의 표지된 아미노 함량을 확인하고, 참조 서열 데이터베이스와 비교함으로써 폴리펩티드를 시퀀싱하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 출원은 폴리펩티드의 복수개의 단편을 시퀀싱함으로써 폴리펩티드를 시퀀싱하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드를 시퀀싱하는 것은 복수개의 폴리펩티드 단편에 대한 서열 정보를 조합하여 폴리펩티드에 대한 서열을 확인하고/거나 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열 정보를 조합하는 것은 컴퓨터 하드웨어 및 소프트웨어에 의해 수행될 수 있다. 본원에 기재된 방법은 관련된 폴리펩티드의 세트, 예컨대 유기체의 전체 프로테옴이 시퀀싱되는 것을 허용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 복수개의 단일 분자 시퀀싱 반응은 본 출원의 측면에 따라 병렬적으로 (예를 들어, 단일 칩 상에서) 수행된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 복수개의 단일 분자 시퀀싱 반응은 단일 칩 상의 별개의 샘플 웰에서 각각 수행된다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 방법은 단백질의 복합체 혼합물을 포함하는 샘플에서의 개별적인 단백질의 시퀀싱 및 확인에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 출원은 단백질의 복합체 혼합물에서 개별적인 단백질을 고유하게 확인하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 개별적인 단백질은 단백질의 부분적 아미노산 서열을 결정함으로써 혼합된 샘플에서 검출된다. 일부 실시양태에서, 단백질의 부분적 아미노산 서열은 대략 5 내지 50개의 아미노산의 인접 스트레치 내에 있다.
임의의 툭장한 이론에 구애되기를 원하지는 않지만, 대부분의 인간 단백질은 프로테옴 데이터베이스를 참조로 불완전한 서열 정보를 사용하여 확인될 수 있다고 믿어진다. 예를 들어, 인간 프로테옴의 간단한 모델링은 단백질의 대략 98%가 6 내지 40개의 아미노산의 스트레치 내에서 아미노산의 단지 4개의 유형을 검출함으로써 고유하게 확인될 수 있음을 보였다 (예를 들어, 문헌 [Swaminathan, et al. PLoS Comput Biol. 2015, 11(2):e1004080]; 및 [Yao, et al. Phys. Biol. 2015, 12(5):055003] 참조). 따라서, 단백질의 복합체 혼합물은 대략 6 내지 40개의 아미노산의 짧은 폴리펩티드 단편으로 분해될 (예를 들어, 화학적으로 분해될, 효소적으로 분해될) 수 있으며, 이 폴리펩티드 라이브러리의 시퀀싱은 원래 복합체 혼합물에 존재하는 단백질의 각각의 동일성 및 풍부도를 밝힐 것이다. 부분적 서열 정보를 결정하는 것에 의한 선택적 아미노산 표지화 및 폴리펩티드를 확인하기 위한 조성물 및 방법은 그 전문이 참조로 포함되는 발명의 명칭이 "단일 분자 펩티드 시퀀싱"인 2015년 9월 15일에 출원된 미국 특허 출원 번호 15/510,962에 상세하게 기재되어 있다.
실시양태는 높은 정확도, 예컨대 적어도 약 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%, 99.99%, 99.999%, 또는 99.9999%의 정확도로 단일 폴리펩티드 분자를 시퀀싱할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단일 분자 시퀀싱에 사용되는 표적 분자는 고체 지지체의 표면, 예컨대 샘플 웰의 바닥 표면 또는 측벽 표면에 고정화된 폴리펩티드이다. 샘플 웰은 또한 본 출원에 따른 시퀀싱 반응에 필요한 임의의 다른 시약, 예컨대 1개 이상의 적합한 버퍼, 보조-인자, 표지된 친화도 시약, 및 효소 (예를 들어, 발광 표지되거나 비표지될 수 있는 촉매적 활성 또는 불활성 엑소펩티다제 효소)를 함유할 수 있다.
상기 기재된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 본 출원에 따른 시퀀싱은 아미노산이 특이적 유형의 것일 확률을 결정함으로써 아미노산을 확인하는 것을 포함한다. 통상적인 단백질 확인 시스템은 폴리펩티드를 확인하기 위해 폴리펩티드에서의 각각의 아미노산의 확인을 요구한다. 그러나, 폴리펩티드에서 각각의 아미노산을 정확하게 확인하는 것은 곤란하다. 예를 들어, 제1 인식 분자가 제1 아미노산과 회합하는 상호작용으로부터 수집된 데이터는 2개의 아미노산 사이에 구별하기 위해 제2 인식 분자가 제2 아미노산과 회합하는 상호작용으로부터 수집된 데이터와는 충분히 상이하지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 출원에 따른 시퀀싱은 통상적인 단백질 확인 시스템과는 달리, 단백질에서의 각각의 아미노산의 확인을 요구하지 않는 (그러나 불가능하게 하지는 않는) 단백질 확인 시스템을 사용함으로써 이 문제를 회피한다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본 출원에 따른 시퀀싱은 단백질을 확인하기 위해 기계 학습 기법을 사용하는 단백질 확인 시스템을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 시스템은 (1) 실시간 단백질 시퀀싱 장치를 사용하여 단백질의 폴리펩티드에 관한 데이터를 수집하고; (2) 기계 학습 모델 및 수집된 데이터를 사용하여 특정 아미노산이 각각의 위치에서의 폴리펩티드의 일부일 확률을 확인하고; (3) 확인된 확률을 "확률론적 핑거프린트"로서 사용하여 단백질을 확인함으로써 작동한다. 일부 실시양태에서, 단백질의 폴리펩티드에 관한 데이터는 아미노산에 선택적으로 결합하는 시약을 사용하여 수득될 수 있다. 예로서, 시약 및/또는 아미노산은 여기 에너지의 인가에 반응하여 광을 방출하는 발광 표지로 표지될 수 있다. 이 예에서, 단백질 시퀀싱 장치는 샘플에서의 시약과 아미노산의 결합 상호작용 동안 단백질 (예를 들어, 폴리펩티드)의 샘플에 여기 에너지를 인가할 수 있다. 일부 실시양태에서, 시퀀싱 장치에서 1개 이상의 센서 (예를 들어, 광검출기, 전기 센서, 및/또는 임의의 다른 적합한 유형의 센서)는 결합 상호작용을 검출할 수 있다. 이번에는, 검출된 광 방출로부터 수집되고/거나 유래된 데이터는 기계 학습 모델에 제공될 수 있다. 기계 학습 모델 및 연관된 시스템 및 방법은 그 전문이 참조로 포함되는 발명의 명칭이 "기계 학습 가능화된 단백질 확인"인 2019년 6월 12일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/860,750에 상세하게 기재되어 있다.
본 출원에 따른 시퀀싱은 일부 측면에서, 기질의 (예를 들어, 고체 지지체, 예를 들어 칩, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 통합 장치의) 표면 상에 폴리펩티드를 고정화하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 기질 상의 샘플 웰의 표면 상에 (예를 들어, 샘플 웰의 바닥 표면 상에) 고정화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 N-말단 아미노산은 고정화된다 (예를 들어, 표면에 부착된다). 일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 C-말단 아미노산은 고정화된다 (예를 들어, 표면에 부착된다). 일부 실시양태에서, 1개 이상의 비-말단 아미노산은 고정화된다 (예를 들어, 표면에 부착된다). 고정화된 아미노산(들)은 예를 들어 본 출원에 기재된 바와 같이 임의의 적합한 공유 또는 비-공유 연결을 사용하여 부착될 수 있다. 일부 실시양태에서, 복수개의 폴리펩티드는 예를 들어 기질 상의 샘플 웰의 어레이에서 복수개의 샘플 웰에 부착된다 (예를 들어, 각각의 샘플 웰의 표면, 예를 들어 바닥 표면에 부착된 1개의 폴리펩티드를 가짐).
본 출원에 따른 시퀀싱은 일부 측면에서, 단일 분자 분석을 허용하는 시스템을 사용하여 수행될 수 있다. 시스템은 통합 장치 및 통합 장치와 접속하도록 구성된 기기를 포함할 수 있다. 통합 장치는 화소의 어레이를 포함할 수 있고, 여기서 개별적인 화소는 샘플 웰 및 적어도 1개의 광검출기를 포함한다. 통합 장치의 샘플 웰은 통합 장치의 표면 상에 또는 이를 통해 형성되고, 통합 장치의 표면 상에 정치된 샘플을 수용하도록 구성될 수 있다. 집합적으로, 샘플 웰은 샘플 웰의 어레이로 간주될 수 있다. 복수개의 샘플 웰은 샘플 웰의 적어도 일부분이 단일 샘플 (예를 들어, 단일 분자, 예컨대 폴리펩티드)을 수용하도록 적합한 크기 및 형상을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플 웰 내의 샘플의 수는 일부 샘플 웰이 1개의 샘플을 함유하는 반면, 다른 것은 0개, 2개 이상의 샘플을 함유하도록 통합 장치의 샘플 웰 중에서 분포될 수 있다.
여기 광은 통합 장치에 대해 외부의 1개 이상의 광원으로부터 통합 장치에 제공된다. 통합 장치의 광학 성분은 광원으로부터의 여기 광을 수신하고, 통합 장치의 샘플 웰의 어레이를 향해 광을 방향화하고, 샘플 웰 내의 조명 영역을 조광할 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플 웰은 샘플이 샘플 웰의 표면에 근접하게 보유되는 것을 허용하는 배열을 가질 수 있으며, 이는 샘플로의 여기 광의 전달 및 샘플로부터의 방출 광의 검출을 용이하게 할 수 있다. 조명 영역 내에 위치된 샘플은 여기 광에 의해 조광되는 것에 반응하여 방출 광을 방출할 수 있다. 예를 들어, 샘플은 형광 마커로 표지될 수 있으며, 이는 여기 광의 조명을 통해 여기된 상태를 달성하는 것에 반응하여 광을 방출한다. 샘플에 의해 방출된 방출 광은 그 후 분석되는 샘플을 갖는 샘플 웰에 상응하는 화소 내의 1개 이상의 광검출기에 의해 검출될 수 있다. 일부 실시양태에 따라 대략 10,000개의 화소 내지 1,000,000개의 화소의 수의 범위일 수 있는 샘플 웰의 어레이에 걸쳐 수행되는 경우, 다중 샘플은 병렬적으로 분석될 수 있다.
통합 장치는 샘플 웰 어레이 중에서 여기 광을 수신하고, 여기 광을 방향화하기 위한 광학 시스템을 포함할 수 있다. 광학 시스템은 여기 광을 통합 장치에 커플링시키고, 여기 광을 다른 광학 성분에 방향화하도록 구성된 1개 이상의 그레이팅 커플러를 포함할 수 있다. 광학 시스템은 그레이팅 커플러로부터의 여기 광을 샘플 웰 어레이를 향해 방향화하는 광학 성분을 포함할 수 있다. 이러한 광학 성분은 광학 스플리터, 광학 컴바이너, 및 도파관을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 광학 스플리터는 그레이팅 커플러로부터의 여기 광을 커플링시키고, 여기 광을 도파관 중 적어도 하나에 전달할 수 있다. 일부 실시양태에 따르면, 광학 스플리터는 도파관의 각각이 실질적으로 유사한 양의 여기 광을 수신하도록, 여기 광의 전달이 모든 도파관에 걸쳐 실질적으로 균일한 것을 허용하는 배열을 가질 수 있다. 이러한 실시양태는 통합 장치의 샘플 웰에 의해 수신되는 여기 광의 균일성을 개선시킴으로써 통합 장치의 성능을 개선시킬 수 있다. 통합 장치에 포함되는 예를 들어, 여기 광을 샘플 웰에 커플링시키고, 방출 광을 광검출기에 방향화하기 위한 적합한 성분의 예는 둘 다 그 전문이 참조로 포함되는 발명의 명칭이 "분자를 탐지하고, 검출하고, 분석하기 위한 통합 장치"인 2015년 8월 7일에 출원된 미국 특허 출원 번호 14/821,688, 및 발명의 명칭이 "분자를 탐지하고, 검출하고, 분석하기 위한 외부 광원을 갖는 통합 장치"인 2014년 11월 17일에 출원된 미국 특허 출원 번호 14/543,865에 기재되어 있다. 통합 장치에서 실행될 수 있는 적합한 그레이팅 커플러 및 도파관의 예는 그 전문이 참조로 포함되는 발명의 명칭이 "광학 커플러 및 도파관 시스템"인 2017년 12월 15일에 출원된 미국 특허 출원 번호 15/844,403에 기재되어 있다.
추가적인 광자 구조는 샘플 웰 및 광검출기 사이에 위치되고, 여기 광이 광검출기에 도달하는 것을 감소시키거나 방지하도록 구성될 수 있으며, 이는 그렇지 않다면 방출 광을 검출하는데 있어서 신호 잡음에 기여할 수 있다. 일부 실시양태에서, 통합 장치에 대한 회로로서 작용할 수 있는 금속 층은 또한 공간 필터로서 작용할 수 있다. 적합한 광자 구조의 예는 스펙트럼 필터, 편광 필터, 및 공간 필터를 포함할 수 있으며, 그 전문이 참조로 포함되는 발명의 명칭이 "광학 거부 광자 구조"인 2018년 7월 23일에 출원된 미국 특허 출원 번호 16/042,968에 기재되어 있다.
통합 장치의 위치된 성분은 여기 공급원을 통합 장치에 위치시키고 정렬하는데 사용될 수 있다. 이러한 성분은 렌즈, 거울, 프리즘, 윈도우, 애퍼처, 감쇠기, 및/또는 광학 섬유를 비롯한 광학 성분을 포함할 수 있다. 추가적인 기계적 성분은 1개 이상의 정렬 성분의 제어를 허용하기 위해 기기에 포함될 수 있다. 이러한 기계적 성분은 작동기, 스테퍼 모터, 및/또는 놉을 포함할 수 있다. 적합한 여기 공급원 및 정렬 메커니즘의 예는 그 전문이 참조로 포함되는 발명의 명칭이 "펄스화된 레이저 및 시스템"인 2016년 5월 20일에 출원된 미국 특허 출원 번호 15/161,088에 기재되어 있다. 빔-조종 모듈의 또 다른 예는 본원에 참조로 포함되는 발명의 명칭이 "컴팩트 빔 형상화 및 조종 어셈블리"인 2017년 12월 14일에 출원된 미국 특허 출원 번호 15/842,720에 기재되어 있다. 적합한 여기 공급원의 추가적인 예는 그 전문이 참조로 포함되는 발명의 명칭이 "분자를 탐지하고, 검출하고, 분석하기 위한 통합 장치"인 2015년 8월 7일에 출원된 미국 특허 출원 번호 14/821,688에 기재되어 있다.
통합 장치의 개별적인 화소와 함께 위치된 광검출기(들)는 화소의 상응하는 샘플 웰로부터 방출 광을 검출하도록 구성되고 위치될 수 있다. 적합한 광검출기의 예는 그 전문이 참조로 포함되는 발명의 명칭이 "수신된 광자의 시간적 비닝을 위한 통합 장치"인 2015년 8월 7일에 출원된 미국 특허 출원 번호 14/821,656에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 샘플 웰 및 그의 각각의 광검출기(들)는 공통 축을 따라 정렬될 수 있다. 이 방식으로, 광검출기(들)는 화소 내의 샘플 웰과 중첩될 수 있다.
검출된 방출 광의 특징은 방출 광과 회합된 마커를 확인하기 위한 지시를 제공할 수 있다. 이러한 특징은 광검출기에 의해 검출된 광자의 도착 시간, 광검출기에 의해 시간 경과에 따라 축적된 광자의 양, 및/또는 2개 이상의 광검출기에 걸친 광자의 분포를 비롯한 임의의 적합한 유형의 특징을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 광검출기는 샘플의 방출 광과 연관된 하나 이상의 타이밍 특징 (예를 들어, 발광 수명)의 검출을 허용하는 배열을 가질 수 있다. 광검출기는 여기 광의 펄스가 통합 장치를 통해 전파된 후에 광자 도착 시간의 분포를 검출할 수 있으며, 도착 시간의 분포는 샘플의 방출 광의 타이밍 특징 (예를 들어, 발광 수명에 대한 대용물)의 지시를 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 광검출기는 마커에 의해 방출된 방출 광의 확률 (예를 들어, 발광 강도)의 지시를 제공한다. 일부 실시양태에서, 복수개의 광검출기는 방출 광의 공간 분포를 포획하도록 사이징되고 배열될 수 있다. 그 후, 1개 이상의 광검출기로부터의 출력 신호는 복수개의 마커 중에서 마커를 구별하는데 사용될 수 있고, 여기서 복수개의 마커는 샘플 내에서 샘플을 확인하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플은 다중 여기 에너지에 의해 여기될 수 있으며, 방출 광 및/또는 다중 여기 에너지에 반응하여 샘플에 의해 방출된 방출 광의 타이밍 특징은 복수개의 마커로부터 마커를 구별할 수 있다.
작동에서, 샘플 웰 내의 샘플의 병렬 분석은 여기 광을 사용하여 웰 내의 샘플의 일부 또는 전부를 여기시키고, 샘플 방출로부터의 신호를 광검출기로 검출함으로써 수행된다. 샘플로부터의 방출 광은 상응하는 광검출기에 의해 검출되고, 적어도 하나의 전기 신호로 전환될 수 있다. 전기 신호는 통합 장치의 회로에서 전도선을 따라 전송될 수 있으며, 이는 통합 장치와 접속된 기기에 연결될 수 있다. 전기 신호는 이어서 프로세싱되고/거나 분석될 수 있다. 전기 신호의 프로세싱 또는 분석은 기기 상에 또는 외부에 위치한 적합한 컴퓨팅 장치 상에서 일어날 수 있다.
기기는 기기 및/또는 통합 장치의 작동을 제어하기 위한 사용자 인터페이스를 포함할 수 있다. 사용자 인터페이스는 사용자가 기기 내로 정보, 예컨대 기기의 기능화를 제어하는데 사용되는 명령 및/또는 설정을 입력하는 것을 허용하도록 구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 사용자 인터페이스는 버튼, 스위치, 다이알, 및 음성 명령을 위한 마이크를 포함할 수 있다. 사용자 인터페이스는 사용자가 기기 및/또는 통합 장치의 성능에 대한 피드백, 예컨대 통합 장치 상의 광검출기로부터의 판독 신호에 의해 수득된 적절한 정렬 및/또는 정보를 수신하는 것을 허용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 사용자 인터페이스는 스피커를 사용하여 피드백을 제공하여 가청적 피드백을 제공할 수 있다. 일부 실시양태에서, 사용자 인터페이스는 사용자에게 가시적 피드백을 제공하기 위한 인디케이터 라이트 및/또는 디스플레이 스크린을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 기기는 컴퓨팅 장치와 연결하도록 구성된 컴퓨터 인터페이스를 포함할 수 있다. 컴퓨터 인터페이스는 USB 인터페이스, 파이어와이어(FireWire) 인터페이스, 또는 임의의 다른 적합한 컴퓨터 인터페이스일 수 있다. 컴퓨팅 장치는 임의의 일반용 컴퓨터, 예컨대 랩탑 또는 데스크탑 컴퓨터일 수 있다. 일부 실시양태에서, 컴퓨팅 장치는 적합한 컴퓨터 인터페이스를 통해 무선 네트워크 상에 접근가능한 서버 (예를 들어, 클라우드-기반 서버)일 수 있다. 컴퓨터 인터페이스는 기기 및 컴퓨팅 장치 사이의 정보의 통신을 용이하게 할 수 있다. 기기를 제어하고/거나 구성하기 위한 입력 정보는 컴퓨팅 장치에 제공되고, 컴퓨터 인터페이스를 통해 기기에 전송될 수 있다. 기기에 의해 생성된 출력 정보는 컴퓨터 인터페이스를 통해 컴퓨팅 장치에 의해 수신될 수 있다. 출력 정보는 기기의 성능, 통합 장치의 성능, 및/또는 광검출기의 판독 신호로부터 생성된 데이터에 관한 피드백을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 기기는 통합 장치의 1개 이상의 광검출기로부터 수신된 데이터를 분석하고/거나, 제어 신호를 여기 공급원(들)에 전송하도록 구성된 프로세싱 장치를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로세싱 장치는 일반용 프로세서, 특수-개조된 프로세서 (예를 들어, 중앙 처리 장치 (CPU), 예컨대 1개 이상의 마이크로프로세서 또는 마이크로컨트롤러 코어, 필드-프로그램가능 게이트 어레이 (FPGA), 용도-특이적 집적 회로 (ASIC), 맞춤 집적 회로, 디지털 신호 프로세서 (DSP), 또는 그의 조합)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 광검출기로부터의 데이터의 프로세싱은 기기의 프로세싱 장치 및 외부 컴퓨팅 장치 둘 다에 의해 수행될 수 있다. 다른 실시양태에서, 외부 컴퓨팅 장치는 생략될 수 있으며, 1개 이상의 광검출기로부터의 데이터의 프로세싱은 단지 통합 장치의 프로세싱 장치에 의해 수행될 수 있다.
일부 실시양태에 따르면, 발광 방출 특징에 기반하여 샘플을 분석하도록 구성된 기기는 상이한 발광 분자 사이의 발광 수명 및/또는 강도의 차이 및/또는 상이한 환경에서의 동일한 발광 분자의 수명 및/또는 강도 사이의 차이를 검출할 수 있다. 본 발명자들은 발광 방출 수명의 차이가 상이한 발광 분자의 존재 또는 부재 사이에 분별하고/거나, 발광 분자가 처리되는 상이한 환경 또는 조건 사이에 분별하는데 사용될 수 있음을 인식하고 인지하였다. 일부의 경우, 수명 (예를 들어 방출 파장이라기 보다는)에 기반하여 발광 분자를 분별하는 것은 시스템의 측면을 단순화할 수 있다. 예로서, 파장-식별 광학장치 (예컨대 파장 필터, 각각의 파장에 대한 전용 검출기, 상이한 파장에서의 전용 펄스화된 광원, 및/또는 회절 광학장치)는 수명에 기반하여 발광 분자를 분별하는 경우에 수가 감소되거나 제거될 수 있다. 일부의 경우, 단일 특징적인 파장에서 작동하는 단일 펄스화된 광원은 광학 스펙트럼의 동일한 파장 영역 내에서 방출하지만, 측정가능하게 상이한 수명을 갖는 상이한 발광 분자를 여기시키는데 사용될 수 있다. 동일한 파장 영역에서 방출하는 상이한 발광 분자를 여기시키고 분별하기 위해, 상이한 파장에서 작동하는 다중 공급원이라기 보다는, 단일 펄스화된 광원을 사용하는 분석 시스템은 작동 및 유지가 덜 복잡하고, 보다 컴팩트할 수 있으며, 보다 적은 비용으로 제조될 수 있다.
발광 수명 분석에 기반한 분석 시스템은 특정 이익을 가질 수 있지만, 분석 시스템에 의해 수득된 정보의 양 및/또는 검출 정확도는 추가적인 검출 기법을 허용함으로써 증가될 수 있다. 예를 들어, 시스템의 일부 실시양태는 추가적으로 발광 파장 및/또는 발광 강도에 기반하여 샘플의 하나 이상의 특성을 분별하도록 구성될 수 있다. 일부 실행에서, 발광 강도는 추가적으로 또는 대안적으로 상이한 발광 표지 사이에 구별하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 발광 표지는 비록 그들의 붕괴 속도가 유사할 수 있더라도, 유의하게 상이한 강도에서 방출되거나, 그들의 여기의 확률의 유의한 차이 (예를 들어, 적어도 약 35%의 차이)를 가질 수 있다. 비닝된 신호를 측정된 여기 광에 참조함으로써, 강도 수준에 기반하여 상이한 발광 표지를 구별하는 것이 가능할 수 있다.
일부 실시양태에 따르면, 상이한 발광 수명은 발광 표지의 여기 후 발광 방출 사건을 시간-비닝하도록 구성된 광검출기로 구별될 수 있다. 시간 비닝은 광검출기에 대한 단일 전하-축적 사이클 동안 일어날 수 있다. 전하-축적 사이클은 광-생성된 운반체가 시간-비닝 검출기의 빈에 축적되는 판독 사건 사이의 간격이다. 시간-비닝 광검출기의 예는 본원에 참조로 포함되는 발명의 명칭이 "수신된 광자의 시간적 비닝을 위한 통합 장치"인 2015년 8월 7일에 출원된 미국 특허 출원 번호 14/821,656에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 시간-비닝 광검출기는 광자 흡수/운반체 생성 영역에서 전하 운반체를 생성하고, 전하 운반체를 전하 운반체 저장 영역에서 전하 운반체 저장 빈으로 직접적으로 전달할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 시간-비닝 광검출기는 운반체 운행/포획 영역을 포함하지 않을 수 있다. 이러한 시간-비닝 광검출기는 "직접 비닝 화소"로 지칭될 수 있다. 직접 비닝 화소를 비롯한 시간-비닝 광검출기의 예는 본원에 참조로 포함되는 발명의 명칭이 "직접 비닝 화소를 갖는 통합 광검출기"인 2017년 12월 22일에 출원된 미국 특허 출원 번호 15/852,571에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 동일한 유형의 형광단의 상이한 수는, 각각의 시약이 발광 광도에 기반하여 확인될 수 있도록, 샘플 중의 상이한 시약에 연결될 수 있다. 예를 들어, 2개의 형광단은 제1 표지된 친화도 시약에 연결될 수 있고, 4개 이상의 형광단은 제2 표지된 친화도 시약에 연결될 수 있다. 형광단의 상이한 수 때문에, 상이한 친화도 시약과 연관된 상이한 여기 및 형광단 방출 확률이 있을 수 있다. 예를 들어, 빈의 겉보기 강도가 제1 표지된 친화도 시약에 대해서보다 유의하게 더 높도록, 신호 축적 간격 동안 제2 표지된 친화도 시약에 대한 보다 많은 방출 사건이 있을 수 있다.
본 발명자들은 형광단 붕괴 속도 및/또는 형광단 강도에 기반하여 뉴클레오티드 또는 임의의 다른 생물학적 또는 화학적 샘플을 구별하는 것이 광학 여기 및 검출 시스템의 단순화를 가능하게 할 수 있음을 인식하고 인지하였다. 예를 들어, 광학 여기는 단일-파장 공급원 (예를 들어, 다중 공급원이라기 보다는 하나의 특징적인 파장을 생성하는 공급원 또는 다중 상이한 특징적인 파장에서 작동하는 공급원)으로 수행될 수 있다. 추가적으로, 파장 식별 광학장치 및 필터는 검출 시스템에 필요하지 않을 수 있다. 또한, 단일 광검출기는 상이한 형광단으로부터의 방출을 검출하도록 각각의 샘플 웰에 대해 사용될 수 있다. 어구 "특징적인 파장" 또는 "파장"은 방사선의 제한된 밴드폭 내의 중심 또는 우세한 파장 (예를 들어,펄스화된 광원에 의한 20 nm 밴드폭 출력 내의 중심 또는 피크 파장)을 지칭하는데 사용된다. 일부의 경우, "특징적인 파장" 또는 "파장"은 공급원에 의한 방사선 출력의 총 밴드폭 내의 피크 파장을 지칭하는데 사용될 수 있다.
컴퓨터 기법
본 출원의 측면은 본원에 기재된 폴리펩티드 시퀀싱 기법에 의해 생성된 데이터를 분석하기 위한 컴퓨터 기법에 관한 것이다. 상기 논의된 바와 같이, 예를 들어 도 1a 및 1b와 관련하여, 이들 시퀀싱 기법을 사용함으로써 생성된 데이터는 아미노산 인식 분자가 시퀀싱되는 폴리펩티드의 말단에서 노출된 아미노산과 회합되는 경우를 지시하는 일련의 신호 펄스를 포함할 수 있다. 일련의 신호 펄스는 시간 경과에 따라 분해 프로세스가 연속적인 아미노산을 제거하는데 있어서 진행됨에 따라, 현재 말단에서의 아미노산의 유형에 따라, 다양한 하나 이상의 특색 (예를 들어, 펄스 지속기간, 펄스간 지속기간, 규모의 변화)을 가질 수 있다. 생성된 신호 트레이스는 각각의 아미노산과 연관된 다양한 하나 이상의 특색으로부터 발생하는 특징적인 패턴을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 컴퓨터 기법은 아미노산 서열을 확인하기 위해 이들 시퀀싱 기법을 사용하여 수득된 이러한 데이터를 분석하는 것의 일부로서 실행될 수 있다.
일부 실시양태는 폴리펩티드의 분해 프로세스 동안 데이터를 수득하고, 데이터를 분석하여 분해 프로세스 동안 폴리펩티드의 말단에서 순차적으로 노출된 아미노산에 상응하는 데이터의 부분을 결정하고, 폴리펩티드를 대표하는 아미노산 서열을 출력하는 것을 포함할 수 있다. 도 11은 본원에 기재된 폴리펩티드 시퀀싱 기법을 사용하여 수득된 데이터를 분석함으로써 아미노산 서열을 확인하기 위한 예시적인 프로세싱 파이프라인 (1100)의 도해이다. 도 11에 나타내어진 바와 같이, 시퀀싱 데이터 (1102)를 분석하는 것은 회합 사건 확인 기법 (1104) 및 아미노산 확인 기법 (1106)을 사용하여 아미노산 서열(들) (1108)을 출력하는 것을 포함할 수 있다.
본원에서 논의된 바와 같이, 시퀀싱 데이터 (1102)는 폴리펩티드의 분해 프로세스 동안 수득될 수 있다. 일부 실시양태에서, 시퀀싱 데이터 (1102)는 분해 프로세스 동안 폴리펩티드의 말단에서의 아미노산 동일성을 지시한다. 일부 실시양태에서, 시퀀싱 데이터 (1102)는 분해 프로세스 동안 말단에서의 말단 아미노산의 상이한 유형에 결합하는 1개 이상의 아미노산 인식 분자에 의해 생성된 신호를 지시한다. 예시적인 시퀀싱 데이터는 상기 논의된 도 1a 및 1b에 나타내어진다.
신호가 어떻게 분해 프로세스 동안 생성되는지에 따라, 시퀀싱 데이터 (1102)는 신호의 1개 이상의 상이한 유형을 지시할 수 있다. 일부 실시양태에서, 시퀀싱 데이터 (1102)는 분해 프로세스 동안 발생된 발광 신호를 지시한다. 예를 들어, 발광 표지는 아미노산 인식 분자를 표지하는데 사용될 수 있고, 발광 표지에 의해 방출된 발광은 아미노산 인식 분자가 특정한 아미노산과 회합하여, 발광 신호를 발생시킬 때 검출될 수 있다. 일부 실시양태에서, 시퀀싱 데이터 (1102)는 분해 프로세스 동안 생성된 전기 신호를 지시한다. 예를 들어, 시퀀싱되는 폴리펩티드 분자는 나노포어에 고정화될 수 있고, 전기 신호 (예를 들어, 전도도의 변화)는 아미노산 인식 분자가 특정한 아미노산과 회합할 때 검출될 수 있다.
일부 실시양태는 시퀀싱 데이터 (1102)를 분석하여 분해 프로세스 동안 폴리펩티드의 말단에서 순차적으로 노출된 아미노산에 상응하는 시퀀싱 데이터 (1102)의 부분을 결정하는 것을 포함한다. 도 11에 나타내어진 바와 같이, 회합 사건 확인 기법 (1104)은 시퀀싱 데이터 (1102)에 접근하고, 시퀀싱 데이터를 분석하여 회합 사건에 상응하는 시퀀싱 데이터 (1102)의 부분을 확인할 수 있다. 회합 사건은 데이터에서 특징적인 패턴, 예컨대 도 1b에 나타내어진 CP1 및 CP2에 상응할 수 있다. 일부 실시양태에서, 회합 사건 확인 기법 (1104)은 일련의 절단 사건을 검출하고, 연속적인 절단 사건 사이의 시퀀싱 데이터 (1102)의 부분을 결정하는 것을 포함할 수 있다. 예로서, 도 1b에 나타내어진 CP1 및 CP2 사이의 절단 사건은 CP1에 상응하는 데이터의 제1 부분이 제1 회합 사건으로서 확인될 수 있고, CP2에 상응하는 데이터의 제2 부분이 제2 회합 사건으로서 확인될 수 있도록 검출될 수 있다.
일부 실시양태는 시퀀싱 데이터 (1102)의 결정된 부분 중 1개 이상에 대한 아미노산의 유형을 확인하는 것을 포함한다. 도 11에 나타내어진 바와 같이, 아미노산 확인 기법 (1106)은 회합 사건 확인 기법 (1104)에 의해 확인된 회합 사건 중 1개 이상에 대한 아미노산의 유형을 결정하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 회합 사건 확인 기법 (1104)에 의해 확인된 데이터의 개별적인 부분은 펄스 패턴을 포함할 수 있고, 아미노산 확인 기법 (1106)은 그의 각각의 펄스 패턴에 기반하여 부분 중 1개 이상에 대한 아미노산의 유형을 결정할 수 있다. 도 1b에 관하여, 아미노산 확인 기법 (1106)은 CP1에 대한 아미노산의 제1 유형 및 CP2에 대한 아미노산의 제2 유형을 확인할 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산의 유형을 결정하는 것은 데이터가 역치 값을 초과하는 경우에 데이터의 부분, 예컨대 회합 사건 확인 기법 (1104)을 사용하여 확인된 부분 내의 시간의 양을 확인하고, 시간의 양을 데이터의 부분에 대한 지속기간과 비교하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, CP1에 대한 아미노산의 유형을 확인하는 것은 신호가 역치 값, 예컨대 시간 기간, pd 초과인 경우, 신호가 ML 초과인 경우, CP1 내의 시간의 양을 결정하고, 이를 CP1에 대한 시간의 총 지속기간과 비교하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산의 유형을 결정하는 것은 회합 사건 확인 기법 (1102)에 의해 확인된 데이터의 1개 이상의 부분에 대한 하나 이상의 펄스 지속기간을 확인하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, CP1에 대한 아미노산의 유형을 확인하는 것은 CP1에 대한 펄스 지속기간, 예컨대 시간 기간, pd를 결정하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산의 유형을 결정하는 것은 회합 사건 확인 기법 (1104)을 사용하여 확인된 데이터의 1개 이상의 부분에 대한 하나 이상의 펄스간 지속기간을 확인하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, CP1에 대한 아미노산의 유형을 확인하는 것은 펄스간 지속기간, 예컨대 ipd를 확인하는 것을 포함할 수 있다.
시퀀싱 데이터 (1102)의 연속적인 부분에 대한 아미노산의 유형을 확인함으로써, 아미노산 확인 기법 (1106)은 폴리펩티드를 대표하는 아미노산 서열(들) (1108)을 출력할 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 회합 사건 확인 기법 (1104)을 사용하여 확인된 데이터의 부분에 상응하는 일련의 아미노산을 포함한다.
도 12는 본원에 기재된 기술의 일부 실시양태에 따른 폴리펩티드 분자의 아미노산 서열을 결정하기 위한 예시적인 프로세스 (1200)의 흐름도이다. 프로세스 (1200)는 임의의 적합한 컴퓨팅 장치(들) (예를 들어, 단일 컴퓨팅 장치, 단일 물리적 위치에 공동-위치하거나 서로로부터 원격의 다중 물리적 위치에 위치한 다중 컴퓨팅 장치, 클라우드 컴퓨팅 시스템의 1개 이상의 컴퓨터 장치 부분 등) 상에서 수행될 수 있는데, 이는 본원에 기재된 기술의 측면이 이와 관련하여 제한되지 않기 때문이다. 일부 실시양태에서, 회합 사건 확인 기법 (1104) 및 아미노산 확인 기법 (1106)은 프로세스 (1200)의 일부 또는 전부를 수행하여 아미노산 서열(들)을 결정할 수 있다.
프로세스 (1200)는 단일 폴리펩티드 분자를 1개 이상의 말단 아미노산 인식 분자와 접촉시키는 것을 포함하는 작용 (1202)에서 시작한다. 다음으로, 프로세스 (1200)는 1개 이상의 말단 아미노산 인식 분자와 단일 폴리펩티드가 분해되고 있는 동안 단일 폴리펩티드의 말단에서 노출된 연속적인 아미노산의 회합을 지시하는 일련의 신호 펄스를 검출하는 것을 포함하는 작용 (1104)으로 진행한다. 일련의 펄스는 예컨대 회합 사건 확인 기법 (1104) 및 아미노산 확인 기법 (1106)을 사용함으로써 단일 폴리펩티드 분자의 시퀀싱을 허용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 프로세스 (1200)는 예컨대 아미노산 확인 기법 (1106)을 사용함으로써, 일련의 신호 펄스에서의 제1 특징적인 패턴에 기반하여 단일 폴리펩티드 분자에서 아미노산의 제1 유형을 확인하는 것을 포함하는 작용 (1206)을 포함할 수 있다.
도 13은 본원에 기재된 기술의 일부 실시양태에 따른 폴리펩티드를 대표하는 아미노산 서열을 결정하기 위한 예시적인 프로세스 (1300)의 흐름도이다. 프로세스 (1300)는 임의의 적합한 컴퓨팅 장치(들) (예를 들어, 단일 컴퓨팅 장치, 단일 물리적 위치에 공동-위치하거나 서로로부터 원격의 다중 물리적 위치에 위치한 다중 컴퓨팅 장치, 클라우드 컴퓨팅 시스템의 1개 이상의 컴퓨터 장치 부분 등) 상에서 수행될 수 있는데, 이는 본원에 기재된 기술의 측면이 이와 관련하여 제한되지 않기 때문이다. 일부 실시양태에서, 회합 사건 확인 기법 (1104) 및 아미노산 확인 기법 (1106)은 프로세스 (1300)의 일부 또는 전부를 수행하여 아미노산 서열(들)을 결정할 수 있다.
프로세스 (1300)는 폴리펩티드의 분해 프로세스 동안 데이터가 수득되는 작용 (1302)에서 시작한다. 일부 실시양태에서, 데이터는 분해 프로세스 동안 폴리펩티드의 말단에서의 아미노산 동일성을 지시한다. 일부 실시양태에서, 데이터는 분해 프로세스 동안 말단에서의 말단 아미노산의 상이한 유형에 결합하는 1개 이상의 아미노산 인식 분자에 의해 생성된 신호를 지시한다. 일부 실시양태에서, 데이터는 분해 프로세스 동안 생성된 발광 신호를 지시한다. 일부 실시양태에서, 데이터는 분해 프로세스 동안 생성된 전기 신호를 지시한다.
다음으로, 프로세스 (1300)는 예컨대 회합 사건 확인 기법 (1104) 및 아미노산 확인 기법 (1106)을 사용함으로써, 데이터를 분석하여 분해 프로세스 동안 폴리펩티드의 말단에서 순차적으로 노출된 아미노산에 상응하는 데이터의 부분을 결정하는 작용 (1304)으로 진행한다. 일부 실시양태에서, 데이터를 분석하는 것은 일련의 절단 사건을 검출하고, 예컨대 회합 사건 확인 기법 (1104)을 사용함으로써 연속적인 절단 사건 사이의 데이터의 부분을 결정하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 데이터를 분석하는 것은 예컨대 아미노산 확인 기법 (1106)을 사용함으로써, 개별적인 부분의 각각에 대한 아미노산의 유형을 결정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 개별적인 부분의 각각은 펄스 패턴을 포함하고, 데이터를 분석하는 것은 그의 각각의 펄스 패턴에 기반하여 부분 중 1개 이상에 대한 아미노산의 유형을 결정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산의 유형을 결정하는 것은 데이터가 역치 값 초과인 경우에 부분 내의 시간의 양을 확인하고, 시간의 양을 부분에 대한 시간의 지속기간과 비교하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산의 유형을 결정하는 것은 1개 이상의 부분의 각각에 대한 적어도 하나의 펄스 지속기간을 확인하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산의 유형을 결정하는 것은 1개 이상의 부분의 각각에 대한 적어도 하나의 펄스간 지속기간을 확인하는 것을 추가로 포함한다.
다음으로, 프로세스 (1300)는 폴리펩티드를 대표하는 아미노산 서열이 예컨대 사용자 인터페이스를 통해 출력되는 작용 (1306)으로 진행한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 부분에 상응하는 일련의 아미노산을 포함한다.
본원에 기재된 실시양태 중 임의의 것과 관련하여 사용될 수 있는 컴퓨터 시스템 (1400)의 예시적인 실행은 도 14에 나타내어진다. 컴퓨터 시스템 (1400)은 1개 이상의 프로세서 (1410), 및 비-일시적 컴퓨터-판독가능 저장 매체 (예를 들어, 메모리 (1420) 및 1개 이상의 비-휘발성 저장 매체 (1430))를 포함하는 1개 이상의 제조품을 포함한다. 프로세서 (1410)는 메모리 (1420) 및 비-휘발성 저장 장치 (1430)에 대한 기록 데이터 및 그로부터의 판독 데이터를 임의의 적합한 방식으로 제어할 수 있는데, 이는 본원에 기재된 기술의 측면이 이와 관련하여 제한되지 않기 때문이다. 본원에 기재된 기능성 중 임의의 것을 수행하기 위해, 프로세서 (1410)는 프로세서 (1410)에 의한 실행을 위해 프로세서-실행가능 명령을 저장하는 비-일시적 컴퓨터-판독가능 저장 매체로서 기능할 수 있는 1개 이상의 비-일시적 컴퓨터-판독가능 저장 매체 (예를 들어, 메모리 (1420))에 저장된 1개 이상의 프로세서-실행가능 명령을 실행할 수 있다.
컴퓨팅 장치 (1400)는 또한 컴퓨팅 장치가 다른 컴퓨팅 장치와 (예를 들어,네트워크 상에서) 통신할 수 있는 네트워크 입력/출력 (I/O) 인터페이스 (1440)를 포함할 수 있고, 또한 컴퓨팅 장치가 사용자에게 출력을 제공하고, 사용자로부터 입력을 수신할 수 있는 1개 이상의 사용자 I/O 인터페이스 (1450)를 포함할 수 있다. 사용자 I/O 인터페이스는 키보드, 마우스, 마이크, 디스플레이 장치 (예를 들어, 모니터 또는 터치 스크린), 스피커, 카메라, 및/또는 다양한 다른 유형의 I/O 장치와 같은 장치를 포함할 수 있다.
상기-기재된 실시양태는 다수의 방식 중 임의의 것으로 실행될 수 있다. 예를 들어, 실시양태는 하드웨어, 소프트웨어 또는 그의 조합을 사용하여 실행될 수 있다. 소프트웨어에서 실행되는 경우, 소프트웨어 코드는 단일 컴퓨팅 장치에서 제공되든지, 다중 컴퓨팅 장치 중에서 분포되든지, 임의의 적합한 프로세서 (예를 들어, 마이크로프로세서) 또는 프로세서의 집합 상에서 실행될 수 있다. 상기 기재된 기능을 수행하는 임의의 성분 또는 성분의 집합은 상기-논의된 기능을 제어하는 1개 이상의 컨트롤러로서 일반적으로 간주될 수 있음이 인지되어야 한다. 1개 이상의 컨트롤러는 다수의 방식으로, 예컨대 상기 나열된 기능을 수행하도록 마이크로코드 또는 소프트웨어를 사용하여 프로그래밍된 전용 하드웨어로, 또는 일반용 하드웨어 (예를 들어, 1개 이상의 프로세서)로 실행될 수 있다.
이와 관련하여, 본원에 기재된 실시양태의 하나의 실행은 1개 이상의 프로세서 상에서 실행되는 경우, 하나 이상의 실시양태의 상기-논의된 기능을 수행하는, 컴퓨터 프로그램 (즉, 복수개의 실행가능 명령)으로 코딩된 적어도 1개의 컴퓨터-판독가능 저장 매체 (예를 들어, RAM, ROM, EEPROM, 플래쉬 메모리 또는 다른 메모리 기술, CD-ROM, 디지털 다목적 디스크 (DVD) 또는 다른 광학 디스크 저장, 자기 카세트, 자기 테이프, 자기 디스크 저장 또는 다른 자기 저장 장치, 또는 다른 실감형, 비-일시적 컴퓨터-판독가능 저장 매체)를 포함함이 인지되어야 한다. 컴퓨터-판독가능 매체는 그에 저장된 프로그램이 본원에서 논의된 기법의 측면을 실행하기 위해 임의의 컴퓨팅 장치 상으로 로딩될 수 있도록 휴대용일 수 있다. 또한, 실행되는 경우, 상기-논의된 기능 중 임의의 것을 수행하는 컴퓨터 프로그램에 대한 언급은 호스트 컴퓨터 상에서 구동하는 응용 프로그램에 제한되지 않음이 인지되어야 한다. 오히려, 용어 컴퓨터 프로그램 및 소프트웨어는 본원에서 논의된 기법의 측면을 실행하기 위한 1개 이상의 프로세서를 프로그래밍하기 위해 채용될 수 있는 컴퓨터 코드의 임의의 유형 (예를 들어 응용 소프트웨어, 펌웨어, 마이크로코드, 또는 컴퓨터 명령의 임의의 다른 형태)을 언급하기 위해 일반적 의미에서 본원에 사용된다.
실시예
실시예 1. 화학적 절단에 의한 에드만 분해
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대략 3개 내지 대략 30개의 아미노산 (n=3-30)의 표면-부착된 올리고펩티드가 제공되며, 여기서 아미노산 잔기 R1-R3은 통상적인 20가지 아미노산 또는 내인적으로 변형된 아미노산 (예를 들어, 번역후 변형에 의해 변형된) 중 임의의 것일 수 있다. 이소티오시아네이트 N-말단 반응, 단계 1에서, 이소티오시아네이트 X-NCS를 표면-부착된 올리고펩티드를 함유하는 용기에 첨가하며, 여기서 X는 페닐 (Ph), 4-NO2Ph, 4-SO3Ph, 나프틸, 벤질, 알킬, 또는 그의 유도체이다. 단계 1을 하기 조건 하에서 수행하여 X-NCS 유도체화된 N-말단 아미노산을 제공한다: 수성 버퍼 pH 4-10, MeOH 또는 EtOH 또는 IPA 알콜성 공-용매, 유기 용매 (DCM, THF, MeCN, DMF 등) 중 트리알킬아민, 20℃ 내지 50℃. 티오우레아 절단 반응, 단계 2에서, 산 또는 염기를 X-NCS 유도체화된 N-말단 아미노산을 함유하는 용기에 첨가하며, 여기서 산은 순수한 또는 수용액으로서의 아세트산, 포름산, 트리클로로아세트산, 트리플루오로아세트산, 인산, 또는 염산이거나, 염기는 트리알킬아민 또는 완충된 트리알킬아민 (예를 들어, Et3NH+AcO-)이다. 단계 2를 하기 조건 하에서 수행하여 n-1 올리고펩티드 및 티오히단토인 부산물을 제공한다: 순수한 산 또는 임의의 비의 수성/유기 공-용매로, 20℃ 내지 50℃.
실시예 2. 펩티드 표면 고정화를 위한 가용화 링커
수성 버퍼 중의 올리고펩티드 용해도를 개선시키는 것을 추구하여, 펩티드 단편은 올리고뉴클레오티드 링커와 접합되어 수용해도를 개선시키면서 또한 단일 분자 수준에서 펩티드의 표면 고정화를 위한 관능성 모이어티를 제공할 수 있음이 결정되었다. 펩티드-DNA 접합체 및 펩티드-PEG 접합체에 대해 도 15a에 도시된 예시 구조를 갖는 상이한 펩티드-링커 접합체를 합성하였다. 링커 접합은 평가된 상이한 펩티드-링커 접합체의 각각에 대해 수용액 중의 펩티드 용해도를 크게 향상시키는 것으로 관찰되었다.
펩티드-링커 접합체를 N-말단 아미노펩티다제에 의한 펩티드 N-말단에서의 아미노산 절단에 대해 평가하였다 (표 6, 하기).
표 6. 펩티드-링커 접합체의 말단 아미노산 절단.
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표 6에 나타내어진 펩티드-링커 접합체를 프롤린 이미노펩티다제 ("PIP") 또는 래트 아미노펩티다제 N ("래트 APN") 중 어느 하나와 함께 인큐베이션하고, 펩티드 절단을 LCMS에 의해 모니터링하였다. 표 6으로부터의 항목 5의 절단을 입증하는 LCMS의 예는 도 15b에 나타내어진다. 모든 다른 절단 반응을 유사한 방식으로 측정하였다. 표 6에 나타내어진 바와 같이, 양으로 하전된 펩티드-DNA 접합체 ("올리고" 및 "올리고-PEG" 링커)는 시험된 아미노펩티다제에 의해 절단되지 않은 반면, DNA 올리고뉴클레오티드 링커를 갖는 모든 다른 접합체 부류 (음으로 하전된, 방향족, 소수성)는 절단되었다. 그에 비해, 양으로 하전된 펩티드-PEG 접합체는 아미노펩티다제 중 적어도 1종에 의해 절단되는 것으로 나타났다.
표지된 펩티드-링커 접합체를 사용하여, 상이한 조성의 펩티드는 단일 분자 분석을 위해 개별적인 샘플 웰 표면에 고정화될 수 있는 것으로 나타났다. 이들 실험을 위해, DNA 링커를 염료로 표지하고 (예를 들어, 펩티드-DNA 접합에 대해 도 15a에 도시된 바와 같이), 개별적인 샘플 웰 내로의 상이한 펩티드-DNA 접합체의 로딩을 염료 형광에 의해 측정하였다. 예시 로딩 실험은 도 15c에 나타내어진다. 표지된 펩티드-DNA 접합체 (50 pM)의 형광 방출을 측정함으로써, 칩 상의 샘플 웰의 적어도 18%가 표면-고정화된 접합체로 샘플 웰당 단일 점유도로 로딩되었음이 결정되었다. 이들 실험은 펩티드-링커 접합체가 비-접합된 펩티드 대응물에 비해 향상된 수용해도를 나타내고, 접합된 링커가 상이한 아미노펩티다제에 의한 펩티드의 말단 아미노산 절단을 방지하지 않으며, 상이한 조성의 펩티드-링커 접합체가 단일 분자 수준에서 칩 표면에 고정화될 수 있음을 입증하였다.
실시예 3. 폴리펩티드 기질의 엑소펩티다제 절단
다양한 아미노펩티다제의 절단 능력을 시험하였다. 펩티드 기질의 농도, 효소의 농도, 버퍼 조건, 온도, 및 인큐베이션 시간을 비롯한 절단 검정 실험의 세트를 위한 조건 및 결과는 표 7에 나타내어진다. 지시된 효소에 의한 펩티드 기질의 절단을 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 사용하여 검정하였다. 표 7에서 "HPLC 검정 전환" 값은 절단 생성물로 전환된 펩티드 기질의 백분율을 지시한다. "HPLC 검정 전환" 값을 결정하기 위해, 동일한 출발 농도의 펩티드를 함유하는 2가지 용액을 제조하였다. 하나의 용액은 효소적 소화로 처리한 반면, 다른 용액은 임의의 효소를 함유하지 않았지만, 효소를 저장하는데 사용된 등가의 양의 버퍼로 희석되었다. 반응을 지시된 시간에서 켄칭하였다. 생성물로 전환된 반응물의 양을 효소적 소화 후에 잔류하는 출발 물질의 HPLC에 의해 수득된 피크의 면적을 비소화된 펩티드의 대조군 용액의 피크 면적으로 나눈 후, 이 비에 100을 곱함으로써 결정하였다. 표 7에서, "NH2"는 아민 기를 지시하고, "yPIP"는 와이. 페스티스 프롤린 이미노펩티다제를 지칭하고, "NPEPPS"는 퓨로마이신-민감성 아미노펩티다제를 지칭하고, "VPr"은 비브리오 프로테올리티쿠스 아미노펩티다제를 지칭하고, "EDAPN"은 엘. 뉴모필라 M1 아미노펩티다제를 지칭한다.
표 7. 아미노펩티다제에 의한 펩티드 기질의 절단.
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표 7의 선택 엑소펩티다제에 대한 아미노산 절단 활성의 요약은 도 16에 나타내어진다. 특이적 절단 활성은 하기 효소에 대해 나타내어진다: "cVPr" (브이. 프로테올리티쿠스 아미노펩티다제), "yPIP" (와이. 페스티스 프롤린 이미노펩티다제), "D/E APN" (엘. 뉴모필라 M1 아미노펩티다제), hTET (피로코쿠스 호리코쉬이 TET 아미노펩티다제), 및 Pfu API (표 7에서 "PfuTET"). 말단 아미노산에 관한 특이적 활성은 나타내어진 바와 같이 분류되며, 아미노산에 대해 단일-문자 약어가 사용된다 ("XP-"는 인접한, 또는 전종단, 프롤린 (P) 잔기를 갖는 임의의 말단 아미노산 (X)을 나타낸다).
실시예 4. 단일 분자 수준에서의 고정화된 펩티드의 말단 아미노산 절단
고정화된 펩티드의 칩상 아미노산 절단을 위한 검정을 표지된 펩티드 접합체를 사용하여 개발하였다. 검정을 동역학 결합 파라미터 및 일반적 결합 친화도의 측정을 허용할 수 있는 고정화된 펩티드에 대한 엑소펩티다제의 효소적 인식 및 절단 활성을 결정하는 방법을 제공하도록 디자인하였다.
펩티드의 N-말단 아미노산 절단을 평가하기 위해, PEG 스페이서에 의해 염료에 부착된 N-말단 아스파르테이트를 함유한 염료 표지된 펩티드를 디자인하고 합성하였다. 이 펩티드는 또한 효소 프롤린 이미노펩티다제 (다른 곳에 공지되어 있고, 본원에서 "yPIP"로 지칭되는 예르시니아 페스티스로부터)에 의해 특이적으로 인식되는 변형된 아스파르테이트에 인접한 프롤린 잔기를 함유하였다. 효소 yPIP는 단지 프롤린 잔기로부터 상류의 N-말단 아미노산을 절단할 것이다.
이 및 다른 표지된 펩티드가 벌크로 yPIP에 의해 효율적으로 절단되었음을 보인 후 (예를 들어, 실시예 2에 기재된 바와 같이), 칩상 염료/펩티드 접합체 검정을 개발하여 N-말단 아미노산 절단을 단일 분자 수준에서 관찰하였다. 도 17a는 염료/펩티드 접합체 검정을 위한 일반적 스킴을 나타낸다 (삽도 패널). 나타내어진 바와 같이, 스페이서를 통해 N-말단 아미노산에 부착된 표지를 갖는 펩티드는 링커에 의해 표면에 고정화된다. 펩티다제에 노출된 후, N-말단 아미노산 절단은 검출가능한 관찰 부피로부터의 표지된 잔기의 제거를 발생시키고, 표지로부터의 신호의 수반 소실에 의해 측정된다. 삽도 패널의 우측으로 효소-펩티드 복합체는 N-말단 절단을 일반적으로 도시한다.
도 17a는 염료/펩티드 접합체 검정에 사용하기 위해 디자인되고 합성된 표지된 펩티드 구축물 (하부에서)을 나타낸다. 이들 실험에서, 로다민 염료 (ATTO Rho6G)는 N-말단에 전종단 프롤린 잔기를 갖는 펩티드의 N-말단 아스파르테이트 잔기에 부착되었다. 나타내어진 바와 같이, 펩티드는 표면 고정화를 위해 비오틴 모이어티를 갖는 가용화 DNA 링커에 추가로 접합되었다.
표지된 펩티드 접합체를 샘플 웰의 어레이를 갖는 유리 칩 상으로 로딩하였다. 칩의 영상을 호딩 전에 및 후에 획득하여 로다민 형광에 의한 단일 점유도에서 샘플 웰의 퍼센트 로딩을 결정하였다. 그 후, 효소 yPIP를 로딩된 칩 상으로 도입하고, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. yPIP의 도입 후 칩의 영상을 취하고, 소실된 녹색 염료의 백분율을 계산하여 N-말단 아미노산 절단을 평가하였다. 도 17b는 로딩 단계에서 6-7% 로딩 및 yPIP와의 인큐베이션 후에 이전에 로딩된 웰에서 신호의 91% 소실을 나타낸 실험으로부터의 영상화 결과를 나타내며, 이는 N-말단 아미노산 절단을 지시하였다. 도 17c는 이들 실험으로부터의 대표적인 신호 트레이스를 나타내며, 이는 표지된 펩티드의 로딩 시 염료 신호의 검출된 증가 및 yPIP에의 노출 후 염료 신호의 검출된 소실을 입증한다.
단일 분자 수준에서의 N-말단 아미노산 절단의 추가의 확인으로서, 칩상 FRET 검정을 개발하여 엑소펩티다제 인식 및 절단 활성을 평가하였다. 도 18a는 FRET 펩티드 접합체 검정 (패널 A) 및 FRET 효소 접합체 검정 (패널 B)을 일반적으로 도시한다. FRET 펩티드 접합체 검정 (패널 A)에서, 고정화된 펩티드 구축물은 링커에 부착된 FRET 공여자 표지 및 N-말단에서 부착된 FRET 수용자 표지를 포함한다. N-말단 아미노산 절단은 펩티다제에 노출되는 경우에 FRET 수용자 표지로부터의 신호의 소실에 의해 검출된다. 추가적으로, 이 디자인은 FRET 공여자 표지로부터의 방출을 따름으로써 실험 전반에 걸쳐 펩티드 접합체의 로딩을 모니터링하는 것을 허용한다.
FRET 효소 접합체 검정 (패널 B)에서, 고정화된 펩티드 구축물은 링커에 부착된 FRET 쌍의 제1 표지를 포함하고, 펩티다제는 FRET 쌍의 제2 표지로 표지된다. N-말단 아미노산 절단은 펩티드에의 펩티다제의 충분한 근접으로 및 N-말단에서의 충분한 체류 시간으로 발생할 FRET 상호작용에 기인하는 형광의 향상에 의해 검출된다. 추가적으로, 이 검정은 진행적인 절단으로 시간 경과에 따른 증가하는 FRET 신호를 검출함으로써 진행적인 엑소펩티다제에 의한 진행적인 아미노산 절단을 평가하는 것을 허용한다.
도 18a는 또한 패널 A의 FRET 펩티드 접합체 검정에 사용하기 위해 디자인되고 합성된 패널 A 하의 FRET 펩티드 구축물을 나타낸다. 나타내어진 바와 같이, FRET 펩티드 구축물은 N-말단에 전종단 프롤린 잔기를 갖는 펩티드의 N-말단 아스파르테이트 잔기에 부착된 로다민 염료 (ATTO 647N)를 포함하였다. 펩티드는 FRET를 위한 시아닌 염료 (Cy3B) 및 표면 고정화를 위한 비오틴 모이어티에 부착된 가용화 DNA 링커에 추가로 접합되었다.
이 실험에서, FRET 펩티드 구축물을 샘플 웰의 어레이를 갖는 유리 칩 상으로 로딩하고, 수집된 광을 먼저 녹색 필터 및 그 후 적색 필터에 의해 필터링하였다. FRET 펩티드 구축물의 로딩을 녹색 및 적색 필터 둘 다를 통해 통과하는 신호를 측정함으로써 검출하였다. 말단 아미노산 절단을 신호가 단지 녹색 필터에서 측정가능할 때 검출하였으며, 이는 FRET 펩티드 구축물로부터의 적색 염료 접합된 N-말단 아미노산이 yPIP에 의해 절단되었음을 지시하였다. 이 검출 패턴은 패널 C에 예시된다. 나타내어진 바와 같이, 둘 다의 염료가 yPIP의 첨가 전에 검출가능하고, 단지 녹색 염료가 yPIP와의 인큐베이션 후에 가시적인 경우, 이 검출 패턴의 변화는 펩티드의 절단에 기인하고, 광퇴색 또는 전체로서 펩티드의 소실에 기인하지 않다고 합리적으로 결론내릴 수 있다. 추가적으로, 단독의 녹색 염료로부터의 형광의 증가가 예상될 것인데, 이는 그의 방출이 적색 염료에 의해 더 이상 흡수되지 않기 때문이다.
포스폰산 및 실란을 사용한 표면 부동태화에 의해 변형된 칩 상으로의 FRET 펩티드 구축물의 로딩 후, yPIP를 도입하고, 영상을 몇몇 시점에서 수득하였다. 전체 절단 경향을 평가하기 위해, (녹색)/(녹색 + 적색)의 비를 각각의 실험에 대해 산출하였다. 이 비는 발생하는 절단의 정도에 따라 증가한다. 도 18b는 yPIP와의 인큐베이션의 상이한 시점에서 모든 애퍼처에 걸친 FRET 방출 비의 플롯이다. 나타내어진 바와 같이, 형광 방출의 비에 대한 녹색 염료 기여는 yPIP와의 인큐베이션 동안 시간 경과에 따라 증가하며, 이는 보다 많은 N-말단 아스파르테이트 잔기가 커팅되어, 단지 녹색 염료로 말단절단된 펩티드를 남겼음을 지시한다.
그 후, 커팅 효율을 어느 시점에서 염료 형광이 관찰되었는지를 결정함으로써 상이한 시점에서 평가하였다. 이는 간단한 역치화로 수행되었다 - 예를 들어, 평균 염료 방출 신호가 여기 동안 > 2.5인 경우, 염료를 존재하는 것으로 결정하였다 (각각의 상응하는 필터가 적용된 경우). 그 후, 커팅을 나타내는 애퍼처는 실험의 로딩 단계 동안 녹색 및 적색 염료 둘 다, 그러나 yPIP로 노출된 시점에서는 단지 녹색 염료를 나타낼 것이다. 도 18c에 나타내어진 바와 같이, 칩이 yPIP와의 더 긴 인큐베이션 시간에 노출됨에 따라, 점진적으로 보다 많은 커팅이 관찰되었다. 3개의 yPIP-처리된 시점의 각각에서 나타난 커팅을 나타내는 예시 신호 트레이스는 도 18d에 나타내어진다.
추가적인 실험을 yPIP 및 다른 펩티다제로 덱스트란을 사용한 표면 부동태화에 의해 변형된 칩을 사용하여 수행하였으며, 이는 칩 상으로의 펩티다제의 도입 후 시간 경과에 따라 말단 아미노산 절단의 증가를 나타내는 유사한 결과를 생성하였다. 도 18e는 yPIP와의 인큐베이션의 상이한 시점에서의 로딩된 애퍼처에 걸친 FRET 방출 비의 플롯이다. 도 18f는 아미노펩티다제와의 인큐베이션의 상이한 시점에서의 로딩된 애퍼처에 걸친 FRET 방출 비의 플롯이다. 전체적으로, 여기에서의 실험은 N-말단 아미노산 절단이 상이한 엑소펩티다제 및 상이한 표지화 전략을 사용하여 단일 분자 수준에서 실시간으로 검출가능함을 입증한다.
실시예 5. 표지된 친화도 시약에 의한 말단 아미노산 식별
단백질분해 경로에 관여하는 어댑터 단백질은 N-말단 방향족 잔기를 검출하기 위한 표지된 친화도 시약으로서 사용하기 위한 잠재적 후보로서 확인되었다. α-프로테오박테리움 (에이. 투메파시엔스)으로부터의 어댑터 단백질, ClpS2를 발현시키고, 노출된 시스테인 잔기에서 표지하였다. 도 19a는 막대기로서 나타내어진 노출된 시스테인 잔기를 갖는 ClpS2 단백질의 결정 구조를 나타낸다. 노출된 시스테인 잔기를 로다민 염료 (ATTO 532)로 표지하였다.
상이한 N-말단 방향족 잔기를 갖는 펩티드를 제조하여 표지된 ClpS2가 단일 분자 수준에서 N-말단 아미노산 식별이 가능한지 여부를 시험하였다. 이들 실험으로부터의 예시 단일 분자 강도 트레이스는 도 19b에 나타내어진다. 나타내어진 바와 같이, 신호 트레이스는 N-말단 페닐알라닌 잔기 (F, 상부 신호 트레이스), N-말단 티로신 잔기 (Y, 중간 신호 트레이스), 또는 N-말단 트립토판 잔기 (W, 하부 신호 트레이스) 중 어느 하나를 갖는 펩티드의 N-말단에 가역적으로 결합하는 표지된 친화도 시약에 상응하는 잔기-특이적 온-오프 결합 패턴을 입증한다.
단일 분자 궤적의 추가의 분석을 수행하고, 결과를 도 19c-19e에 나타내었다. 도 19c는 표지된 ClpS2에 의해 가역적으로 결합된 경우에 3개의 N-말단 잔기 중에서 식별자 펄스 지속기간 (신호 피크의 시간 지속기간)을 나타내는 플롯이다. 도 19d는 3개의 N-말단 잔기 중에서 식별자 펄스간 지속기간 (신호 펄스 사이의 시간 지속기간)을 나타내는 플롯이다. 도 19e는 펩티드 N-말단에서의 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판 중에서 식별자 펄스 지속기간을 추가로 예시하는 플롯을 나타낸다. 상이한 N-말단 잔기에 대한 평균 펄스 지속기간은 히스토그램 (A)-(B) 및 층상화된 히스토그램 (C)에 의해 가시화된다.
써모시노코쿠스 엘론가투스로부터의 또 다른 어댑터 단백질, ClpS (teClpS)를 류신 인식을 위한 표지된 친화도 시약으로서 사용하기 위해 평가하였다. 도 19f-19h에 나타내어진 체류 시간 분석으로부터 수득된 데이터는 표지된 teClpS 단백질이 0.71초의 평균 펄스 지속기간으로 폴리펩티드의 말단 류신 잔기와의 검출가능한 결합 상호작용을 생성함을 입증하였다. 이들 실험에 사용된 teClpS 단백질의 아미노산 서열은 표 1에 나타내어진다.
유사한 실험을 수행하여 류신 인식을 위한 잠재적 시약으로서 에이. 투메파시엔스 ClpS1 및 에스. 엘론가투스 ClpS2, 및 프롤린 인식을 위한 잠재적 시약으로서 GID4를 평가하였다. 도 19i는 에이. 투메파시엔스 ClpS1에 의한 페닐알라닌, 류신, 트립토판, 및 티로신의 구별가능한 인식을 나타낸 체류 시간 분석으로부터의 예시 결과를 나타낸다. 도 19j는 에스. 엘론가투스 ClpS2에 의한 류신 인식을 입증하는 체류 시간 분석으로부터의 예시 결과를 나타낸다. 도 19k-19l은 GID4에 의한 프롤린 인식을 입증하는 체류 시간 분석의 예시 결과를 나타낸다.
실시예 6. 분해 동안 인식에 의한 폴리펩티드 시퀀싱
진행중인 분해 반응 동안 N-말단 아미노산 인식에 의한 펩티드 시퀀싱을 평가하기 위한 실험을 수행하였다. 이들 실험으로부터의 예시 결과는 도 20a-20d에 나타내어지며, 이는 동일한 반응 혼합물 중의 표지된 ClpS2 단백질 및 아미노펩티다제를 사용하여 실시간으로 수행된 2가지 독립적인 폴리펩티드 시퀀싱 반응에 걸쳐 수득된 단일 분자 강도 트레이스를 나타낸다. 각각의 반응에서, 서열 YAAWAAFADDDWK (서열식별번호: 78)의 폴리펩티드를 20분 동안 칩 상으로 펩티드 조성물 (10 pM)을 로딩함으로써 C-말단 리신 잔기를 통해 칩 표면에 고정화하고, 고정화된 펩티드를 표지된 친화도 시약 (500 nM에서의 ATTO 542-표지된 에이. 투메파시엔스 ClpS2-V1) 및 아미노펩티다제 절단 시약 (8 μM에서의 VPr)의 존재 하에서 모니터랑하였다.
도 20a 및 20c는 2개의 상이한 시퀀싱 실행에 대한 신호 트레이스 데이터를 나타내며, 상부 패널 (도 20a에서 패널 1, 20c에서 패널 2)은 완전한 트레이스를 나타내고, 하부 패널 (Y, W, F)은 완전한 트레이스에서 강조된 영역의 각각에 상응하는 확대된 영역을 나타낸다. 도 20b 및 20d는 각각 도 20a 및 20c에서 표지된 바와 같은 상응하는 패널의 트레이스 데이터에 대한 히스토그램에서의 펄스 지속기간 통계를 나타낸다. 각각의 시퀀싱 실행의 완전한 신호 트레이스 (패널 1, 2)에 나타내어진 바와 같이, 신호 펄스의 3개의 별개의 시간 간격이 반응의 과정에 걸쳐 관찰되었다. 확대된 영역 (패널 Y, W, F)에 의해 강조된 바와 같이, 3개의 간격은 신호 펄스의 패턴의 관찰가능한 차이에 기반하여 서로로부터 시각적으로 구별가능하다.
신호 펄스 데이터를 추가로 분석하기 위해, 펄스 지속기간 통계를 각각의 시간 간격에 대해 결정하였다 (도 20b 및 20d). 펄스 지속기간 분포의 차이는 ClpS2로의 정상-상태 칩상 결합 겸정에서 개별적으로 이들 아미노산에 대해 관찰된 것들에 상응하는 것으로 결정되었으며, 신호 펄스 정보는 시퀀싱 실행 및 개별적인 아미노산 결합 검정으로부터의 간격 사이에 표현형적으로 일치하였다.
신호 펄스 정보의 분석에 의해 확인된 바와 같이, 각각의 시퀀싱 실행의 진행에 걸쳐 관찰된 신호 펄스의 3개의 시간 간격은 각각 Y, W, 및 F의 인식 패턴에 상응한다 (패널 1, 2). 신호 펄스 패턴 사이의 개재 시간 기간은 N-말단 알라닌 잔기에 결합하지 않는 ClpS2-V1의 선택성에 기인한다. 완전한 신호 트레이스에 의해 예시된 바와 같이, 제1 간격은 Y 인식에 상응하고, 이는 VPr 펩티다제가 Y 및 2개의 알라닌 잔기를 절단할 때 휴지에 이어지고, 이어서 W 인식에 상응하는 제2 간격이 이어지고, 이는 VPr 펩티다제가 W 및 2개의 알라닌 잔기를 커팅할 때 또 다른 휴지에 이어지고, 마지막으로 VPr 펩티다제가 F를 커팅하고, 나머지 ADDDWK 펩티드에서 정지하기 전에 F 인식에 상응하는 제3 간격이 이어진다. 이들 결과는 진행중인 분해 반응 동안 말단 아미노산 인식에 의해 수득된 펄스 지속기간 정보가 말단 아미노산의 상이한 유형 사이에 식별하는 특징적인 패턴을 결정하는데 사용될 수 있음을 나타낸다.
실시예 7. 표지된 엑소펩티다제에 의한 말단 아미노산 확인 및 절단
펩티드의 말단 아미노산을 확인하고, 펩티드로부터 말단 아미노산을 절단하는 것 둘 다가 가능한 단일 시약에 대한 잠재성을 조사하기 위한 연구를 수행하였다. 단일 시약으로서, 엑소펩티다제는 말단 잔기에 대한 절단 활성을 보유하면서 펩티드에 결합할 수 있어야 한다. 따라서, 전통적인 표지화 전략을 채용하는 초기 접근법을 상이한 엑소펩티다제의 천연 표면-노출된 아미노산을 표적화함으로써 수행하였다. 이들 실험에서, 표면-노출된 시스테인 (-SH) 또는 리신 (-NH2) 잔기를 형광 염료로 표지하였으며, 이는 엑소펩티다제 표지화를 위한 왕성한 방법론인 것으로 입증되었다. 그러나, 특정한 경우, 이 접근법은 1개 이상의 염료로 표지된 단백질의 이질적 집단을 생성하였다.
표지화가 엑소펩티다제 상에서 일어나는 경우를 보다 정확하게 제어하고, 각각의 엑소펩티다제 분자가 단일 형광 염료로 표지됨 (뿐만 아니라 염료의 오프-타겟 반응성을 제거함)을 보장하기 위해, 새로운 표지화 전략을 조사하였다. 이들 실험에서, 표지된 엑소펩티다제를 반응성 관능기를 함유하는 비천연 아미노산이 엑소펩티다제 내로 도입되는 부위-특이적 표지화 전략을 사용하여 제조하였다 (예를 들어, 문헌 [Chin, J.W., et al. J Am Chem Soc. 2002 Aug 7; 124(31):9026-9027] 참조).
예르시니아 페스티스로부터의 프롤린 이미노펩티다제 (yPIP)를 위치 287에서의 리신 잔기의 파라-아지도페닐알라닌 (pAzF) 측쇄를 갖는 잔기로의 돌연변이에 의해 변형시켰다. 도 21a는 yPIP의 결정 구조를 나타내며, 돌연변이는 막대기로서 나타내어진 K287 측쇄로 나타내어진 pAzF의 화학적 구조에 의해 지시된다. 이 돌연변이 부위를 이 위치에서의 알파 나선에 의해 제공된 안정성에 기반하여 및 새로운 아지도 관능기가 용매 노출됨을 보장하기 위해 선택하였다.
pAzF를 아미노산 쇄 내로 도입하는데 필요한 돌연변이체 아미노 tRNA 신테타제 및 돌연변이체 tRNA를 함유하는 pEVOL 플라스미드를 수득하였다. 그 후, pAzF의 특이적 혼입에 필요한 앰버 정지 코돈 (TAG)을 퀵체인지(QuickChange) II 돌연변이유발 키트를 사용하여 cDNA 내로 도입하였다. 그 후, cDNA를 시퀀싱하고, TAG 코돈 위치를 확인하였다. 이에 이어서 yPIP 앰버 돌연변이체를 함유하는 pET21b+ 플라스미드 및 pAzF를 갖는 앰버 코돈에 대해 tRNA를 충전하는 세포 기구를 함유하는 pEVOL 플라스미드 둘 다를 공동-형질감염시켰다. 그 후, 공동-형질감염된 세포를 0.8 ODU로 성장시키고, 2 L의 LB 중 2 mM pAzF의 존재 하에서 0.02% 아라비노스 및 1 mM IPTG로 유도하고, 화학용해를 사용하여 수확하였다. 정제를 5 mL 친화도 크로마토그래피 칼럼을 사용하여 수행하고, 단백질을 100 mM 이미다졸에서 용리하였다. 그 후, 생성된 단백질을 투석하고, 50 mM HEPES pH 8.0 및 0.5 M KCl 내로 농축시키고, 분취하고, 급속 동결시킨 후, -20℃에서 저장하였다.
정제된 단백질 중의 아지도 기의 존재를 확인하기 위해, DBCO-Cy3 (2 mM)을 pAzF-yPIP 변이체 (220 μM)와 반응시켰다 (반응 조건: 50 mM HEPES pH 8.0, 0.5 mM KCl, 20% DMSO; 37℃에서 10시간, 실온에서 48시간). 단백질 반응 생성물을 크기-배제 크로마토그래피에 의해 정제하였고, 생성된 단백질은 아지드-반응성 DBCO-Cy3 시약으로 100% 표지되었음이 결정되었으며 (도 21b), 이는 비천연 아미노산의 왕성한 혼입을 지시한다.
단백질 표지화 및 최종 생성물의 순도를 비표지된 및 표지된 pAzF 변이체의 SDS-PAGE 분석에 의해 확인하였다. 도 21c는 pAzF-yPIP의 Cy3-표지화를 확인시켜 주는 SDS-PAGE 겔의 사진 (래더를 나타내기 위해 도 21d에 나타내어진 겔의 과노출된 영상)을 나타낸다. 도 21e는 염료 및 단백질 둘 다가 공동-이동하고, 순수함을 확인시켜 주는 쿠마시-염색된 겔의 사진을 나타낸다.
염료-표지된 pAzF-yPIP 변이체를 활성 검정에 사용하여 효소가 표지화 및 정제 후에 여전히 활성임을 확인하였다. 도 21f에 나타내어진 바와 같이, Cy3-pAzF-yPIP는 HPLC에 의해 측정된 바와 같이, 1000배 과량의 기질을 사용하여 1시간에서 펩티드 기질의 100%를 가수분해할 수 있었다. 이들 실험은 천연 단백질 구조/기능의 최소 변화로 엑소펩티다제의 부위-특이적 변형 및 표지화를 허용하는 방법론을 입증한다.
실시예 8. 폴리펩티드 시퀀싱에서 변형된 아미노산의 인식
특이적 번역후 변형을 함유하는 아미노산의 인식을 평가하기 위한 실험을 수행하였다. Fyn, 티로신 키나제로부터의 Src 상동성 2 (SH2) 도메인의 삼중-돌연변이체 변이체 (T8V, S10A, K15L)를 펩티드 시퀀싱에서 인산화된 티로신 잔기에 대한 잠재적 인식 분자로서 시험하였다. 변이체 단백질을 샘플 웰의 바닥에 고정화하고, 단일-분자 신호 트레이스를 N-말단 포스포-티로신을 함유하는 형광-표지된 펩티드의 첨가 시 수집하였다. 고정화된 단백질에 의한 펩티드 결합이 도 22a에서의 대표적인 트레이스에 의해 나타내어진 바와 같이 이들 실험 동안 검출되었다. 이들 실험 동안 수집된 펄스 지속기간 데이터는 도 22b에 나타내어진다 (각각 도 22a의 상부, 중간, 및 하부 트레이스에 상응하는 상부, 중간, 및 하부 플롯). 펄스 지속기간 및 펄스간 지속기간 통계는 도 22c에 나타내어진다 (각각 상부 및 하부 패널).
Fyn 단백질이 인산화된 티로신에 대해 특이적임을 확인하기 위한 대조 실험을 수행하였다. 실험을 3가지 상이한 펩티드의 각각에 대해 반복하였다: N-말단 비변형된 티로신을 함유하는 제1 펩티드 (Y; 도 22d), N-말단 및 전종단 비변형된 티로신을 함유하는 제2 펩티드 (YY; 도 22e), 및 N-말단 포스포-세린을 함유하는 제3 펩티드 (도 22f). 나타내어진 바와 같이, 결합은 음성 대조군 실험에 사용된 펩티드 중 임의의 것으로 검출되지 않았다.
실시예 9. 폴리펩티드 시퀀싱에서 전종단 아미노산의 인식
에이. 투메파시엔스 ClpS2-V1에 대한 펄스 지속기간에 대한 전종단 아미노산의 효과를 결정하기 위한 실험을 수행하였다. N-말단에 고유한 디펩티드 서열을 함유하는 49가지 상이한 형광-표지된 펩티드를 제조하였으며, 여기서 N-말단 아미노산는 F, W, 또는 Y이고, 전종단 위치는 20가지 천연 아미노산 중 하나였다. 각각의 실험을 위해, ClpS2-V1을 샘플 웰의 바닥에서 고정화하고, 단일-분자 신호 트레이스를 형광-표지된 펩티드 중 하나의 첨가 시 10-20분 동안 수집하였다. 펄스 지속기간 데이터를 각각의 펩티드에 대해 최소 50개의 샘플 웰에 대해 수집하였다.
도 23은 50가지 펩티드의 각각에 대한 중위 펄스 지속기간을 나타내며, 전종단 아미노산 (x-축) 및 N-말단 아미노산에 의해 그룹화된 데이터 점은 상이한 기호로 나타내어진다.
실시예 10. 다중 인식 분자로의 동시 아미노산 인식
1개 초과의 표지된 인식 분자에 의한 고정화된 펩티드의 말단 아미노산 인식을 입증하기 위한 단일-분자 펩티드 인식 실험을 수행하였다. N-말단 페닐알라닌을 함유하는 단일 펩티드 분자 (FYPLPWPDDDY (서열식별번호: 79))를 칩의 샘플 웰에서 고정화하였다. atClpS1 (아그로박테리움 투미파시엔스 ClpS1; 표 1에 제공된 서열) 및 atClpS2-V1 (아그로박테리움 투미파시엔스 ClpS2 변이체 1; 표 1에 제공된 서열)의 각각 500 nM을 함유하는 버퍼를 첨가하였으며, 여기서 atClpS1 및 atClpS2-V1은 각각 Cy3 및 Cy3B로 표지되었다. Cy3B의 강도는 Cy3보다 더 높기 때문에, atClpS2-V1 결합 사건은 atClpS1 결합 사건으로부터 용이하게 구별가능하였다.
도 24a-24c는 차등적으로 표지된 인식 분자로의 단일-분자 펩티드 인식을 나타내는 실험의 결과를 나타낸다. 대표적인 트레이스는 도 24a에 제시된다. 펄스 지속기간 분포는 각각의 결합제에 대해 별개이며 (도 24b), 단일-결합제 실험에서 관찰된 바와 같은 그들의 동역학 프로파일에 상응하였다. 평균 펄스 지속기간은 atClpS1에 대해 1.3초 및 atClpS2-V1에 대해 1.0초였다 (도 24c). 펄스 속도는 또한 별개였다: atClpS1에 대해 8.1 펄스/min 및 atClp2-V1에 대해 14.1 펄스/min (도 24c). 따라서, 1개 초과의 인식 분자가 고정화된 펩티드의 동적 인식을 위해 포함되는 경우, 각각의 인식 분자의 결합 특징 (펄스 지속기간, 펄스간 지속기간, 및 펄스 속도를 포함함)은 펩티드 서열에 관한 정보를 동시에 제공할 수 있다.
실시예 11. 인식 분자 링커로의 광안정성의 향상
단일-분자 시퀀싱 동안 고정화된 펩티드의 광안정성을 평가하기 위한 실험을 수행하였다. 실시예 5에 기재된 염료-표지된 atClpS2-V1을 532 nm에서의 여기 광의 존재 하에서 고정화된 펩티드 기질을 함유하는 샘플 웰에 첨가하여 ATTO 532로부터의 방출에 의한 인식을 모니터링하였다. 대표적인 트레이스는 도 25a에 나타내어진다. 상부 패널에 나타내어진 바와 같이, 인식은 실험에서 대략 600초에서 중단되는 것으로 관찰되었다. 하부 패널은 반응에서 대략 180-430초에서의 신호 펄스를 나타내는 확대된 모습이다.
도 25b는 이들 실험에 사용된 ClpS2 단백질의 결정 구조의 가시화를 나타낸다. 나타내어진 바와 같이, 염료 접합 부위로서 기능하는 시스테인 잔기는 말단 아미노산 결합 부위로부터 대략 2 nm이다. 펩티드에 대한 광손상은 결합 동안 펩티드의 N-말단에의 염료의 근접에 의해 유발된 것으로 가설화되었다. 염료 근접의 잠재적 광손상 효과를 완화시키기 위해, ClpS2 단백질을 염료 및 펩티드의 N-말단 사이의 거리를 10 nm 초과 증가시킨 링커를 통해 염료-표지하였다. 링커는 스트렙타비딘 및 이중-가닥 핵산을 포함하였으며; 이중-가닥 핵산은 2개의 Cy3B 염료 분자로 표지되었고, 비스-비오틴 모이어티를 통해 스트렙타비딘에 부착되었고, ClpS2 단백질은 비오틴 모이어티를 통해 스트렙타비딘 상의 나머지 2개의 결합 부위의 각각에 부착되었다. 이 염료-차폐된 ClpS2 분자를 사용한 대표적인 트레이스는 도 25c에 나타내어진다. 상부 패널에 나타내어진 바와 같이, 인식 시간은 실험에서 대략 6,000초로 연장되었다. 하부 패널은 반응에서 대략 750-930초에서의 신호 펄스를 나타내는 확대된 모습이다.
2개의 Cy3B 염료 분자로 표지되고, 비스-비오틴 모이어티를 통해 스트렙타비딘에 부착된 이중-가닥 핵산을 함유하는 링커, 및 비스-비오틴 모이어티를 통해 스트렙타비딘 상의 나머지 2개의 결합 부위에 부착된 단일 ClpS2 단백질을 함유하는 링커를 갖는 DNA-스트렙타비딘 인식 분자를 생성하였다. 이 구축물을 단일-분자 펩티드 시퀀싱 반응에 사용하였으며, 이들 실험으로부터의 대표적인 트레이스는 도 26a-26c에 나타내어진다.
실시예 6에 기재된 시퀀싱 실험을 하기와 같이 변화된 반응 조건으로 반복하였다: DNA-스트렙타비딘 ClpS2 인식 분자를 hTET 아미노산 절단 시약과 조합으로 사용하였다. 대표적인 신호 트레이스는 도 27에 나타내어진다.
실시예 12. 다중 엑소펩티다제에 의한 분해 동안 인식에 의한 시퀀싱
단일-분자 펩티드 시퀀싱 반응 혼합물에서의 차등적인 절단 특이성을 갖는 엑소펩티다제의 다중 유형의 사용을 평가하기 위한 실험을 수행하였다. 단일 펩티드 분자 (YAAWAAFADDDWK (서열식별번호: 78))를 칩의 샘플 웰에서 C-말단 리신 잔기를 통해 고정화하였다. 아미노산 인식을 위해 atClpS2-V1 및 아미노산 절단을 위해 hTET를 함유하는 버퍼를 첨가하였다. 대표적인 트레이스는 도 28a에 제시되며, 펄스 패턴 영역의 확대된 모습은 도 28b에 나타내어진다.
차등적인 특이성을 갖는 2가지 유형의 엑소펩티다제의 존재 하에서 시퀀싱 반응을 평가하기 위한 실험을 수행하였다. 단일 펩티드 분자 (FYPLPWPDDDYK (서열식별번호: 80))를 칩의 샘플 웰에서 C-말단 리신 잔기를 통해 고정화하였다. 아미노산 인식을 위해 atClpS2-V1, 및 아미노산 절단을 위해 hTET 및 yPIP 둘 다를 함유하는 버퍼를 첨가하였다. 대표적인 트레이스는 도 28c에 제시되며, 펄스 패턴 영역의 확대된 모습은 도 28d에 나타내어진다. 이들 반응 조건으로부터의 추가적인 대표적인 트레이스는 도 28e에 나타내어진다.
차등적인 특이성을 갖는 2가지 유형의 엑소펩티다제의 존재 하에서 시퀀싱 반응을 평가하기 위한 추가의 실험을 수행하였다. 단일 펩티드 분자 (YPLPWPDDDYK (서열식별번호: 81))를 칩의 샘플 웰에서 C-말단 리신 잔기를 통해 고정화하였다. 한 실험에서, 아미노산 인식을 위해 atClpS2-V1, 및 아미노산 절단을 위해 hTET 및 yPIP 둘 다를 함유하는 버퍼를 첨가하였다. 대표적인 트레이스는 도 28f에 제시되며, 펄스 패턴 영역의 확대된 모습은 도 28g에 나타내어진다. 이들 반응 조건으로부터의 추가적인 대표적인 트레이스는 도 28h에 나타내어진다. 추가의 실험에서, 아미노산 인식을 위해 atClpS2-V1, 및 아미노산 절단을 위해 PfuTET 및 yPIP 둘 다를 함유하는 버퍼 (50 mM MOPS, 60 mM KOAc, 200 μM Co(OAc)2)를 첨가하였다. 대표적인 트레이스는 도 28i에 제시되며, 펄스 패턴 영역의 확대된 모습은 도 28j에 나타내어진다.
등가물 및 범주
청구항에서, 예컨대 단수형은 반대로 지시되거나 다르게는 맥락으로부터 명백하지 않는 한, 하나 또는 하나 초과를 의미할 수 있다. 군의 하나 이상의 구성원 사이에 "또는"을 포함하는 청구범위 또는 설명은 반대로 지시되거나 다르게는 맥락으로부터 명백하지 않는 한, 군 구성원의 하나, 하나 초과, 또는 전부가 주어진 생성물 또는 프로세스에 존재하거나, 그에 채용되거나, 다르게는 그와 관련되는 경우에 충족되는 것으로 간주된다. 본 발명은 군의 정확하게 하나의 구성원이 주어진 생성물 또는 프로세스에 존재하거나, 그에 채용되거나, 다르게는 그와 관련되는 실시양태를 포함한다. 본 발명은 군 구성원의 하나 초과, 또는 전부가 주어진 생성물 또는 프로세스에 존재하거나, 그에 채용되거나, 다르게는 그와 관련되는 실시양태를 포함한다.
더욱이, 본 발명은 열거된 청구항의 하나 이상으로부터의 하나 이상의 제한, 요소, 조항, 및 기재적 용어가 또 다른 청구항 내로 도입되는 모든 변형, 조합, 및 순열을 포괄한다. 예를 들어, 또 다른 청구항에 종속하는 임의의 청구항은 동일한 기본 청구항에 종속하는 임의의 다른 청구항에서 발견되는 하나 이상의 제한을 포함하도록 변형될 수 있다. 요소가 목록으로서, 예를 들어, 마쿠시 군 형식으로 제시되는 경우, 요소의 각각의 하위군은 또한 개시되며, 임의의 요소(들)는 군으로부터 제거될 수 있다. 일반적으로, 본 발명, 또는 본 발명의 측면이 특정한 요소 및/또는 특색을 포함하는 것으로 언급되는 경우, 본 발명의 특정 실시양태 또는 본 발명의 측면은 이러한 요소 및/또는 특색으로 이루어지거나, 이로 본질적으로 이루어짐이 이해되어야 한다. 단순성의 목적을 위해, 그러한 실시양태는 본원에서 문구 그대로 구체적으로 제시되지는 않았다.
명세서에서 및 청구항에서 본원에 사용된 바와 같은 어구 "및/또는"은 그렇게 결합된 요소, 즉, 일부의 경우에 결합적으로 존재하고, 다른 경우에 분리적으로 존재하는 요소 중 "어느 하나 또는 둘 다"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. "및/또는"과 함께 열거된 다중 요소는 동일한 방식으로, 즉, 그렇게 결합된 요소 중 "하나 이상"으로 해석되어야 한다. "및/또는" 조항에 의해 구체적으로 확인된 요소 이외의 다른 요소는 구체적으로 확인된 그러한 요소와 관련되든 비관련되든 임의로 존재할 수 있다. 따라서, 비-제한적 예로서, 개방-단부 언어, 예컨대 "포함하는"과 함께 사용되는 경우, "A 및/또는 B"에 대한 언급은 한 실시양태에서, A 단독 (B 이외의 요소를 임의로 포함함); 또 다른 실시양태에서, B 단독 (A 이외의 요소를 임의로 포함함); 추가의 또 다른 실시양태에서, A 및 B 둘 다 (다른 요소를 임의로 포함함) 등을 지칭할 수 있다.
명세서에서 및 청구항에서 본원에 사용된 바와 같은 "또는"은 상기 정의된 바와 같은 "및/또는"과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 목록에서 항목을 분리하는 경우, "또는" 또는 "및/또는"은 포함적인 것, 즉, 요소의 수 또는 목록 중 적어도 하나의, 그러나 또한 하나 초과를 포함하는, 및 임의로, 추가적인 비열거된 항목의 포함으로서 해석될 것이다. 단지 반대로 명백하게 지시된 용어, 예컨대 "중 단지 하나" 또는 "중 정확하게 하나", 또는 청구항에서 사용되는 경우, "로 이루어진"은 요소의 수 또는 목록 중 정확하게 하나의 요소의 포함을 지칭할 것이다. 일반적으로, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "또는"은 배타성의 용어, 예컨대 "어느 하나", "중 하나", "중 단지 하나", 또는 "중 정확하게 하나"에 의해 선행되는 경우, 단지 배타적인 대안 (즉, 하나 또는 다른 것, 그러나 둘 다는 아님")을 지시하는 것으로서 해석될 것이다. 청구항에서 사용되는 경우에 "로 본질적으로 이루어진"은 특허법의 분야에 사용되는 바와 같은 그의 통상적인 의미를 가질 것이다.
명세서에서 및 청구항에서 본원에 사용된 바와 같이, 하나 이상의 요소의 목록에 관하여 어구 "적어도 하나"는 요소의 목록에서 요소 중 임의의 하나 이상으로부터 선택되는 적어도 하나의 요소를 의미하지만, 요소의 목록 내에 구체적으로 열거된 각각의 및 모든 요소 중 적어도 하나를 반드시 포함하지는 않으며, 요소의 목록에서 요소의 임의의 조합을 배제하지는 않음이 이해되어야 한다. 이 정의는 또한 구체적으로 확인된 그러한 요소와 관련되든지 비관련되든지, 어구 "적어도 하나"가 언급하는 요소의 목록 내에 구체적으로 확인된 요소 이외의 요소가 임의로 존재할 수 있음을 허용한다. 따라서, 비-제한적 예로서, "A 및 B 중 적어도 하나" (또는 등가적으로, "A 또는 B 중 적어도 하나", 또는 등가적으로 "A 및/또는 B 중 적어도 하나")는 한 실시양태에서, 하나 초과의 A를 임의로 포함하고, B가 존재하지 않는 적어도 하나 (및 B 이외의 요소를 임의로 포함함); 또 다른 실시양태에서, 하나 초과의 B를 임의로 포함하고, A가 존재하지 않는 적어도 하나 (및 A 이외의 요소를 임의로 포함함); 추가의 또 다른 실시양태에서, 하나 초과의 A를 임의로 포함하는 적어도 하나, 및 하나 초과의 B를 임의로 포함하는 적어도 하나 (및 다른 요소를 임의로 포함함) 등을 지칭할 수 있다.
또한, 반대로 명백하게 지시되지 않는 한, 하나 초과의 단계 또는 작용을 포함하는 본원에서 청구된 임의의 방법에서, 방법의 단계 또는 작용의 순서는 방법의 단계 또는 작용이 나열된 순서에 반드시 제한되지는 않음이 이해되어야 한다.
청구항에서, 뿐만 아니라 상기 명세서에서, 모든 전이적 어구, 예컨대 "포함하는", "포함한", "보유하는", "갖는", "함유하는", "수반하는", "수용하는", "로 구성된" 등은 포함하지만 이에 제한되지는 않음을 의미하는 개방-단부인 것으로 이해되어야 한다. 단지 전이적 어구 "로 이루어진" 및 "로 본질적으로 이루어진"은 미국 특허청 특허 심사 절차 매뉴얼, 섹션 2111.03에 제시된 바와 같이, 각각 폐쇄된 또는 반-폐쇄된 전이적 어구일 것이다. 개방-단부 전이적 어구 (예를 들어, "포함하는"를 사용하여 이 문서에 기재된 실시양태는 또한 대안적인 실시양태에서 개방-단부 전이적 어구에 의해 기재된 특색"으로 이루어진" 및 "으로 본질적으로 이루어진" 것으로서 고려됨이 인지되어야 한다. 예를 들어, 본 출원이 "A 및 B를 포함하는 조성물"을 기재하는 경우, 본 출원은 또한 대안적인 실시양태 "A 및 B로 이루어진 조성물" 및 "A 및 B로 본질적으로 이루어진 조성물"을 고려한다.
범위가 주어지는 경우, 종점이 포함된다. 더욱이, 달리 지시되거나 다르게는 맥락 및 관련 기술분야의 통상의 기술자의 이해로부터 명백하지 않는 한, 범위로서 표현된 값은 맥락이 명백하게 달리 나타내지 않는 한, 본 발명의 상이한 실시양태에서 안급된 범위 내의 임의의 구체적인 값 또는 하위-범위를 범위의 하한의 단위의 1/10까지 가정할 수 있다.
본 출원은 다양한 허여된 특허, 공개된 특허 출원, 저널 논문, 및 다른 간행물을 언급하며, 이들 모두는 본원에 참조로 포함된다. 포함된 참고문헌 중 임의의 것 및 본 명세서 사이에 충돌이 있는 경우, 본 명세서가 지배할 것이다. 또한, 종래 기술 내에 해당하는 본 발명의 임의의 특정한 실시양태는 청구항 중 임의의 하나 이상으로부터 명백하게 배제될 수 있다. 이러한 실시양태는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 것으로 간주되기 때문에, 이들은 비록 배제가 본원에 명백하게 제시되지 않더라도 배제될 수 있다. 본 발명의 임의의 특정한 실시양태는 종래 기술의 존재에 관련되든 그렇지 않든, 임의의 이유로 임의의 청구항으로부터 배제될 수 있다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 통상적인 실험 이하를 사용하여 본원에 기재된 구체적인 실시양태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 본원에 기재된 본 실시양태의 범주는 상기 설명에 제한되는 것으로 의도되지 않지만, 오히려 첨부된 청구항에 제시된 바와 같다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 설명에 대한 다양한 변화 및 변형이 하기 청구항에서 정의된 바와 같은 본 발명의 취지 또는 범주로부터 벗어나지 않으면서 이루어질 수 있음을 인지할 것이다.
본원의 변수의 임의의 정의에서 화학기의 목록의 나열은 임의의 단일 기 또는 열거된 기의 조합으로서 그 변수의 정의를 포함한다. 본원의 변수에 대한 실시양태의 나열은 임의의 단일 실시양태로서 또는 임의의 다른 실시양태 또는 그의 부분과의 조합으로 그 실시양태를 포함한다. 본원의 실시양태의 나열은 임의의 단일 실시양태로서 또는 임의의 다른 실시양태 또는 그의 부분과의 조합으로 그 실시양태를 포함한다.
SEQUENCE LISTING <110> Quantum-Si Incorporated <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR PROTEIN SEQUENCING <130> R0708.70042WO00 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 62/907,507 <151> 2019-09-27 <150> US 62/768,076 <151> 2018-11-15 <160> 158 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 103 <212> PRT <213> Agrobacterium tumifaciens <400> 1 Met Ser Asp Ser Pro Val Asp Leu Lys Pro Lys Pro Lys Val Lys Pro 1 5 10 15 Lys Leu Glu Arg Pro Lys Leu Tyr Lys Val Met Leu Leu Asn Asp Asp 20 25 30 Tyr Thr Pro Met Ser Phe Val Thr Val Val Leu Lys Ala Val Phe Arg 35 40 45 Met Ser Glu Asp Thr Gly Arg Arg Val Met Met Thr Ala His Arg Phe 50 55 60 Gly Ser Ala Val Val Val Val Cys Glu Arg Asp Ile Ala Glu Thr Lys 65 70 75 80 Ala Lys Glu Ala Thr Asp Leu Gly Lys Glu Ala Gly Phe Pro Leu Met 85 90 95 Phe Thr Thr Glu Pro Glu Glu 100 <210> 2 <211> 103 <212> PRT <213> Agrobacterium tumifaciens <400> 2 Met Ser Asp Ser Pro Val Asp Leu Lys Pro Lys Pro Lys Val Lys Pro 1 5 10 15 Lys Leu Glu Arg Pro Lys Leu Tyr 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Azidolysine <400> 100 Lys Lys Pro Lys Lys Pro Xaa 1 5 <210> 101 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa is Azidolysine <400> 101 Lys Pro Lys Lys Pro Xaa 1 5 <210> 102 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa is Azidolysine <400> 102 Lys Met Lys Lys Met Xaa 1 5 <210> 103 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa is Azidolysine <400> 103 Tyr Tyr Met Tyr Tyr Met Xaa 1 5 <210> 104 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa is Azidolysine <400> 104 Asp Pro Ala Ala Ala Phe Lys Xaa 1 5 <210> 105 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 105 Pro Ala Ala Ala Phe Lys 1 5 <210> 106 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa is Azidolysine <400> 106 Lys Ala Ala Ala Ala Ala Ala Phe Lys Xaa 1 5 10 <210> 107 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa is Azidolysine <400> 107 Phe Tyr Pro Leu Pro Trp Pro Asp Asp Asp Tyr Xaa 1 5 10 <210> 108 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa is Azidolysine <400> 108 Tyr Pro Leu Pro Trp Pro Asp Asp Asp Tyr Xaa 1 5 10 <210> 109 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa is Azidolysine <400> 109 Pro Leu Pro Trp Pro Asp Asp Asp Tyr Xaa 1 5 10 <210> 110 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa is Azidolysine <400> 110 Leu Pro Trp Pro Asp Asp Asp Tyr Xaa 1 5 <210> 111 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 111 Phe Ala Ala Ala Trp Pro Asp Asp Asp Phe 1 5 10 <210> 112 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 112 Trp Pro Asp Asp Phe 1 5 <210> 113 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 113 Trp Ala Ala Ala Phe Pro Asp Asp Asp Phe 1 5 10 <210> 114 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 114 Phe Pro Asp Asp Phe 1 5 <210> 115 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 115 Tyr Pro Asp Asp Phe 1 5 <210> 116 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 116 Arg Arg Pro Phe Gln Gln 1 5 <210> 117 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 117 Arg Pro Phe Gln Gln 1 5 <210> 118 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 118 Ala Ala Pro Phe Gln Gln 1 5 <210> 119 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 119 Ala Pro Phe Gln Gln 1 5 <210> 120 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 120 Lys Lys Pro Phe Gln Gln 1 5 <210> 121 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 121 Lys Pro Phe Gln Gln 1 5 <210> 122 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 122 Tyr Tyr Pro Phe Gln Gln 1 5 <210> 123 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 123 Tyr Pro Phe Gln Gln 1 5 <210> 124 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 124 Phe Phe Pro Phe Gln Gln 1 5 <210> 125 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 125 Phe Pro Phe Gln Gln 1 5 <210> 126 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 126 Asp Asp Pro Phe Gln Gln 1 5 <210> 127 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 127 Asp Pro Phe Gln Gln 1 5 <210> 128 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 128 Glu Glu Pro Phe Gln Gln 1 5 <210> 129 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 129 Glu Pro Phe Gln Gln 1 5 <210> 130 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 130 Asn Asn Pro Phe Gln Gln 1 5 <210> 131 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 131 Asn Pro Phe Gln Gln 1 5 <210> 132 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 132 Gln Gln Pro Phe Gln Gln 1 5 <210> 133 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 133 Gln Pro Phe Gln Gln 1 5 <210> 134 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 134 Val Val Pro Phe Gln Gln 1 5 <210> 135 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 135 Val Pro Phe Gln Gln 1 5 <210> 136 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 136 Ile Ile Pro Phe Gln Gln 1 5 <210> 137 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 137 Ile Pro Phe Gln Gln 1 5 <210> 138 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 138 Leu Leu Pro Phe Gln Gln 1 5 <210> 139 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 139 Leu Pro Phe Gln Gln 1 5 <210> 140 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 140 Ser Ser Pro Phe Gln Gln 1 5 <210> 141 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 141 Ser Pro Phe Gln Gln 1 5 <210> 142 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 142 Thr Thr Pro Phe Gln Gln 1 5 <210> 143 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 143 Thr Pro Phe Gln Gln 1 5 <210> 144 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 144 Cys Cys Pro Phe Gln Gln 1 5 <210> 145 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 145 Cys Pro Phe Gln Gln 1 5 <210> 146 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 146 Trp Trp Pro Phe Gln Gln 1 5 <210> 147 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 147 Trp Pro Phe Gln Gln 1 5 <210> 148 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 148 Met Met Pro Phe Gln Gln 1 5 <210> 149 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 149 Met Pro Phe Gln Gln 1 5 <210> 150 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 150 Pro Pro Pro Phe Gln Gln 1 5 <210> 151 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 151 Pro Pro Phe Gln Gln 1 5 <210> 152 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 152 Gly Gly Pro Phe Gln Gln 1 5 <210> 153 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 153 Gly Pro Phe Gln Gln 1 5 <210> 154 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 154 His His Pro Phe Gln Gln 1 5 <210> 155 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 155 His Pro Phe Gln Gln 1 5 <210> 156 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 156 Tyr Ala Ala Phe Ala Ala Trp Ala Asp Asp Asp Trp 1 5 10 <210> 157 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 157 Ala Asp Asp Asp Trp Lys 1 5 <210> 158 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 158 Trp Ala Asp Asp Asp Trp Lys 1 5

Claims (283)

  1. 폴리펩티드의 분해 프로세스 동안 데이터를 수득하고;
    데이터를 분석하여 분해 프로세스 동안 폴리펩티드의 말단에서 순차적으로 노출된 아미노산에 상응하는 데이터의 부분을 결정하고;
    폴리펩티드를 대표하는 아미노산 서열을 출력하는 것
    을 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 데이터가 분해 프로세스 동안 폴리펩티드의 말단에서의 아미노산 동일성을 지시하는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 데이터가 분해 프로세스 동안 말단에서의 말단 아미노산의 상이한 유형에 결합하는 1개 이상의 아미노산 인식 분자에 의해 생성된 신호를 지시하는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 데이터가 분해 프로세스 동안 생성된 발광 신호를 지시하는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 데이터가 분해 프로세스 동안 생성된 전기 신호를 지시하는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 데이터를 분석하는 것이 일련의 절단 사건을 검출하고, 연속적인 절단 사건 사이의 데이터의 부분을 결정하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 데이터를 분석하는 것이 개별적인 부분의 각각에 대한 아미노산의 유형을 결정하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 개별적인 부분의 각각이 펄스 패턴을 포함하고, 데이터를 분석하는 것이 그의 각각의 펄스 패턴에 기반하여 부분 중 1개 이상에 대한 아미노산의 유형을 결정하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 아미노산의 유형을 결정하는 것이, 데이터가 역치 값 초과인 경우에 부분 내의 시간의 양을 확인하고, 시간의 양을 부분에 대한 시간의 지속기간과 비교하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  10. 제8항에 있어서, 아미노산의 유형을 결정하는 것이 1개 이상의 부분의 각각에 대한 적어도 하나의 펄스 지속기간을 확인하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  11. 제8항에 있어서, 아미노산의 유형을 결정하는 것이 1개 이상의 부분의 각각에 대한 적어도 하나의 펄스간 지속기간을 확인하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 아미노산 서열이 부분에 상응하는 일련의 아미노산을 포함하는 것인 방법.
  13. 하기를 포함하는 시스템:
    적어도 1개의 하드웨어 프로세서; 및
    적어도 1개의 하드웨어 프로세서에 의해 실행되는 경우, 적어도 1개의 하드웨어 프로세서가 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 방법을 수행하도록 하는 프로세서-실행가능 명령을 저장하는 적어도 1개의 비-일시적 컴퓨터-판독가능 저장 매체.
  14. 적어도 1개의 하드웨어 프로세서에 의해 실행되는 경우, 적어도 1개의 하드웨어 프로세서가 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 방법을 수행하도록 하는 프로세서-실행가능 명령을 저장하는 적어도 1개의 비-일시적 컴퓨터-판독가능 저장 매체.
  15. 폴리펩티드 시퀀싱의 방법으로서:
    단일 폴리펩티드 분자를 1개 이상의 말단 아미노산 인식 분자와 접촉시키고;
    1개 이상의 말단 아미노산 인식 분자와, 단일 폴리펩티드가 분해되고 있는 동안 단일 폴리펩티드의 말단에서 노출된 연속적인 아미노산의 회합을 지시하는 일련의 신호 펄스를 검출하며, 그에 의해 단일 폴리펩티드 분자를 시퀀싱하는 것
    을 포함하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 1개 이상의 말단 아미노산 인식 분자와 말단에서 노출된 아미노산의 각각의 유형의 회합이 말단에서 노출된 아미노산의 다른 유형과는 상이한 일련의 신호 펄스에서의 특징적인 패턴을 생성하는 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 특징적인 패턴이 일련의 신호 펄스의 부분을 포함하는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 특징적인 패턴의 신호 펄스가 말단 아미노산 인식 분자 및 말단에서 노출된 아미노산 사이의 개별적인 회합 사건에 상응하는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 특징적인 패턴의 신호 펄스가 말단 아미노산 인식 분자 및 말단에서 노출된 아미노산 사이의 결합의 해리 속도의 특징인 펄스 지속기간을 포함하는 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 특징적인 패턴의 각각의 신호 펄스가 말단 아미노산 인식 분자 결합의 회합 속도의 특징인 펄스간 지속기간에 의해 또 다른 것으로부터 분리되는 것인 방법.
  21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 특징적인 패턴이 단일 폴리펩티드 분자의 말단에서 노출된 아미노산과의 일련의 가역적인 말단 아미노산 인식 분자 결합 상호작용에 상응하는 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 일련의 가역적인 말단 아미노산 인식 분자 결합 상호작용이 단일 폴리펩티드 분자의 말단에서의 1개의 2원 복합체 종의 가역적인 형성을 포함하는 것인 방법.
  23. 제21항에 있어서, 일련의 가역적인 말단 아미노산 인식 분자 결합 상호작용이 단일 폴리펩티드 분자의 말단에서의 상이한 2원 복합체 종의 가역적인 형성을 포함하는 것인 방법.
  24. 제16항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 특징적인 패턴이 단일 폴리펩티드 분자의 말단에서 노출된 아미노산 및 인접 위치에서의 아미노산을 지시하는 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 말단에서 노출된 아미노산 및 인접 위치에서의 아미노산이 상이한 유형의 것인 방법.
  26. 제15항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 시퀀싱이 단일 폴리펩티드가 분해되고 있는 동안 단일 폴리펩티드의 말단에서 노출된 연속적인 아미노산의 각각의 유형을 확인하는 것을 포함하는 것인 방법.
  27. 제15항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 시퀀싱이 단일 폴리펩티드가 분해되고 있는 동안 단일 폴리펩티드의 말단에서 노출된 연속적인 아미노산의 모든 유형의 부분을 확인하는 것을 포함하는 것인 방법.
  28. 제15항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 시퀀싱이 단일 폴리펩티드가 분해되고 있는 동안 단일 폴리펩티드의 말단에서 노출된 연속적인 아미노산의 상대 위치를 결정하는 것을 포함하는 것인 방법.
  29. 제15항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 시퀀싱이 단일 폴리펩티드 분자에서 적어도 2개의 인접 아미노산을 확인하는 것을 포함하는 것인 방법.
  30. 제15항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 시퀀싱이 단일 폴리펩티드 분자에서 적어도 2개의 비-인접 아미노산을 확인하는 것을 포함하는 것인 방법.
  31. 제15항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 시퀀싱이 말단에서 노출된 아미노산을 천연 발생 아미노산, 비천연 아미노산, 또는 그의 변형된 변이체로서 확인하는 것을 포함하는 것인 방법.
  32. 제15항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 시퀀싱이 말단에서 노출된 아미노산을 하전된, 비하전된, 극성, 비-극성, 소수성, 방향족, 또는 그의 조합인 측쇄를 갖는 것으로서 확인하는 것을 포함하는 것인 방법.
  33. 제32항에 있어서, 측쇄가 음으로 하전되거나 또는 양으로 하전된 것인 방법.
  34. 제15항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 시퀀싱이 말단에서 노출된 아미노산을 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 셀레노시스테인, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 및 발린으로부터 선택되는 하나의 유형으로서 확인하는 것을 포함하는 것인 방법.
  35. 제15항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 시퀀싱이 말단에서 노출된 아미노산을 번역후 변형을 갖는 것으로서 확인하는 것을 포함하는 것인 방법.
  36. 제35항에 있어서, 번역후 변형이 아세틸화, ADP-리보실화, 카스파제 절단, 시트룰린화, 포르밀화, N-연결된 글리코실화, O-연결된 글리코실화, 히드록실화, 메틸화, 미리스토일화, 네딜화, 니트로화, 산화, 팔미토일화, 인산화, 프레닐화, S-니트로실화, 황산화, 수모일화, 및 유비퀴틴화로부터 선택되는 것인 방법.
  37. 제15항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 일련의 신호 펄스가 시간 경과에 따른 광학 신호의 규모의 일련의 변화를 포함하는 것인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 일련의 신호 펄스 각각이 복수개의 광자 방출 사건을 포함하는 것인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 시퀀싱이 발광 수명, 발광 휘도, 발광 강도, 발광 파장, 발광 편광, 및 발광 양자 수율 중 하나 이상을 결정하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  40. 제15항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 일련의 신호 펄스가 시간 경과에 따른 전기 신호의 규모의 일련의 변화를 포함하는 것인 방법.
  41. 제40항에 있어서, 일련의 신호 펄스가 가역적인 단일 분자 결합 상호작용에 상응하는 전도율 전이를 포함하는 것인 방법.
  42. 제15항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 말단 아미노산 인식 분자의 각각이 인식 단백질 또는 인식 핵산을 포함하는 것인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 인식 단백질이 분해 경로 단백질, 펩티다제, 항체, 아미노트랜스퍼라제, tRNA 신테타제, 또는 SH2 도메인-함유 단백질 또는 그의 단편인 방법.
  44. 제43항에 있어서, 분해 경로 단백질이 N-단부 규칙 경로 단백질, 또는 그의 돌연변이체 또는 변이체인 방법.
  45. 제44항에 있어서, N-단부 규칙 경로 단백질이 Arg/N-단부 규칙 경로 단백질, Ac/N-단부 규칙 경로 단백질, 또는 Pro/N-단부 규칙 경로 단백질인 방법.
  46. 제45항에 있어서, N-단부 규칙 경로 단백질이 Gid 단백질, UBR 박스 단백질 또는 그의 UBR 박스 도메인-함유 단편, p62 단백질 또는 그의 ZZ 도메인-함유 단편, 또는 ClpS 단백질인 방법.
  47. 제46항에 있어서, Gid 단백질이 에스. 세레비지아에(S. cerevisiae) 또는 그의 상동성 종으로부터의 Gid4 또는 Gid10인 방법.
  48. 제46항에 있어서, UBR 박스 단백질이 인간, 에스. 세레비지아에, 또는 그의 상동성 종으로부터의 UBR1 또는 UBR2인 방법.
  49. 제46항에 있어서, p62 단백질이 인간, 래트, 또는 그의 상동성 종으로부터의 p62인 방법.
  50. 제46항에 있어서, ClpS 단백질이 에이. 투미파시엔스(A. tumifaciens), 씨. 크레센투스(C. crescentus), 이. 콜라이(E. coli), 에스. 엘론가투스(S. elongatus), 피. 팔시파룸(P. falciparum), 티. 엘론가투스(T. elongatus), 또는 그의 상동성 종으로부터의 ClpS1 또는 ClpS2인 방법.
  51. 제42항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 인식 단백질이 합성 단백질 또는 재조합 단백질인 방법.
  52. 제42항에 있어서, 인식 핵산이 핵산 압타머인 방법.
  53. 제15항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 말단 아미노산 인식 분자의 각각이 검출가능한 표지를 포함하는 것인 방법.
  54. 제53항에 있어서, 검출가능한 표지가 발광 표지 또는 전도율 표지인 방법.
  55. 제15항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 폴리펩티드 분자가 표면에 고정화된 것인 방법.
  56. 제55항에 있어서, 단일 폴리펩티드 분자가, 1개 이상의 말단 아미노산 인식 분자가 회합하는 말단에 대해 원위인 말단 단부를 통해 표면에 고정화된 것인 방법.
  57. 제55항에 있어서, 단일 폴리펩티드 분자가 카르복시-말단 단부를 통해 고정화된 것인 방법.
  58. 제55항에 있어서, 단일 폴리펩티드 분자가 아미노-말단 단부를 통해 고정화된 것인 방법.
  59. 제55항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 폴리펩티드 분자가 링커를 통해 표면에 고정화된 것인 방법.
  60. 제59항에 있어서, 링커가 생체분자를 포함하고, 임의로 생체분자가 올리고뉴클레오티드인 방법.
  61. 제15항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 폴리펩티드 분자가 단일 폴리펩티드 분자의 말단으로부터 1개 이상의 아미노산을 제거하는 절단 시약에 의해 분해되는 것인 방법.
  62. 제61항에 있어서, 절단 시약과 말단의 회합을 지시하는 신호를 검출하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  63. 제61항 또는 제62항에 있어서, 절단 시약이 검출가능한 표지를 포함하는 것인 방법.
  64. 제63항에 있어서, 검출가능한 표지가 발광 표지 또는 전도율 표지인 방법.
  65. 제15항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 일련의 신호 펄스가 일련의 실시간 신호 펄스인 방법.
  66. 하기를 포함하는 시스템:
    적어도 1개의 하드웨어 프로세서; 및
    적어도 1개의 하드웨어 프로세서에 의해 실행되는 경우, 적어도 1개의 하드웨어 프로세서가 제15항 내지 제65항 중 어느 한 항의 방법을 수행하도록 하는 프로세서-실행가능 명령을 저장하는 적어도 1개의 비-일시적 컴퓨터-판독가능 저장 매체.
  67. 적어도 1개의 하드웨어 프로세서에 의해 실행되는 경우, 적어도 1개의 하드웨어 프로세서가 제15항 내지 제65항 중 어느 한 항의 방법을 수행하도록 하는 프로세서-실행가능 명령을 저장하는 적어도 1개의 비-일시적 컴퓨터-판독가능 저장 매체.
  68. 폴리펩티드를 시퀀싱하는 방법으로서:
    반응 혼합물 중의 단일 폴리펩티드 분자를 1개 이상의 말단 아미노산 인식 분자 및 절단 시약을 포함하는 조성물과 접촉시키고;
    절단 시약의 존재 하에서 1개 이상의 말단 아미노산 인식 분자와 단일 폴리펩티드 분자의 말단의 회합을 지시하는 일련의 신호 펄스를 검출하는 것을 포함하며, 여기서 일련의 신호 펄스가 절단 시약에 의한 말단 아미노산 절단의 결과로서 시간 경과에 따른 말단에서 노출된 일련의 아미노산을 지시하는 것인
    방법.
  69. 제68항에 있어서, 1개 이상의 말단 아미노산 인식 분자와 말단에서 노출된 아미노산의 각각의 유형의 회합이 말단에서 노출된 아미노산의 다른 유형과는 상이한 일련의 신호 펄스에서의 특징적인 패턴을 생성하는 것인 방법.
  70. 제69항에 있어서, 특징적인 패턴이 일련의 신호 펄스의 부분을 포함하는 것인 방법.
  71. 제70항에 있어서, 특징적인 패턴의 신호 펄스가 말단 아미노산 인식 분자 및 말단에서 노출된 아미노산 사이의 개별적인 회합 사건에 상응하는 것인 방법.
  72. 제71항에 있어서, 특징적인 패턴의 신호 펄스가 말단 아미노산 인식 분자 및 말단에서 노출된 아미노산 사이의 결합의 해리 속도의 특징인 펄스 지속기간을 포함하는 것인 방법.
  73. 제72항에 있어서, 특징적인 패턴의 각각의 신호 펄스가 말단 아미노산 인식 분자 결합의 회합 속도의 특징인 펄스간 지속기간에 의해 또 다른 것으로부터 분리되는 것인 방법.
  74. 제69항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 특징적인 패턴이 단일 폴리펩티드 분자의 말단에서 노출된 아미노산과의 일련의 가역적인 말단 아미노산 인식 분자 결합 상호작용에 상응하는 것인 방법.
  75. 제74항에 있어서, 일련의 가역적인 말단 아미노산 인식 분자 결합 상호작용이 단일 폴리펩티드 분자의 말단에서의 1개의 2원 복합체 종의 가역적인 형성을 포함하는 것인 방법.
  76. 제74항에 있어서, 일련의 가역적인 말단 아미노산 인식 분자 결합 상호작용이 단일 폴리펩티드 분자의 말단에서의 상이한 2원 복합체 종의 가역적인 형성을 포함하는 것인 방법.
  77. 제69항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 특징적인 패턴이 단일 폴리펩티드 분자의 말단에서 노출된 아미노산 및 인접 위치에서의 아미노산을 지시하는 것인 방법.
  78. 제77항에 있어서, 말단에서 노출된 아미노산 및 인접 위치에서의 아미노산이 상이한 유형의 것인 방법.
  79. 제68항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 시퀀싱이 단일 폴리펩티드가 분해되고 있는 동안 단일 폴리펩티드의 말단에서 노출된 연속적인 아미노산의 각각의 유형을 확인하는 것을 포함하는 것인 방법.
  80. 제68항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 시퀀싱이 단일 폴리펩티드가 분해되고 있는 동안 단일 폴리펩티드의 말단에서 노출된 연속적인 아미노산의 모든 유형의 부분을 확인하는 것을 포함하는 것인 방법.
  81. 제68항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 시퀀싱이 단일 폴리펩티드가 분해되고 있는 동안 단일 폴리펩티드의 말단에서 노출된 연속적인 아미노산의 상대 위치를 결정하는 것을 포함하는 것인 방법.
  82. 제68항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 시퀀싱이 단일 폴리펩티드 분자에서 적어도 2개의 인접 아미노산을 확인하는 것을 포함하는 것인 방법.
  83. 제68항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 시퀀싱이 단일 폴리펩티드 분자에서 적어도 2개의 비-인접 아미노산을 확인하는 것을 포함하는 것인 방법.
  84. 제68항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 시퀀싱이 말단에서 노출된 아미노산을 천연 발생 아미노산, 비천연 아미노산, 또는 그의 변형된 변이체로서 확인하는 것을 포함하는 것인 방법.
  85. 제68항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 시퀀싱이 말단에서 노출된 아미노산을 하전된, 비하전된, 극성, 비-극성, 소수성, 방향족, 또는 그의 조합인 측쇄를 갖는 것으로서 확인하는 것을 포함하는 것인 방법.
  86. 제85항에 있어서, 측쇄가 음으로 하전되거나 또는 양으로 하전된 것인 방법.
  87. 제68항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 시퀀싱이 말단에서 노출된 아미노산을 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 셀레노시스테인, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 및 발린으로부터 선택되는 하나의 유형으로서 확인하는 것을 포함하는 것인 방법.
  88. 제68항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 시퀀싱이 말단에서 노출된 아미노산을 번역후 변형을 갖는 것으로서 확인하는 것을 포함하는 것인 방법.
  89. 제88항에 있어서, 번역후 변형이 아세틸화, ADP-리보실화, 카스파제 절단, 시트룰린화, 포르밀화, N-연결된 글리코실화, O-연결된 글리코실화, 히드록실화, 메틸화, 미리스토일화, 네딜화, 니트로화, 산화, 팔미토일화, 인산화, 프레닐화, S-니트로실화, 황산화, 수모일화, 및 유비퀴틴화로부터 선택되는 것인 방법.
  90. 제68항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 일련의 신호 펄스가 시간 경과에 따른 광학 신호의 규모의 일련의 변화를 포함하는 것인 방법.
  91. 제90항에 있어서, 일련의 신호 펄스 각각이 복수개의 광자 방출 사건을 포함하는 것인 방법.
  92. 제91항에 있어서, 시퀀싱이 발광 수명, 발광 휘도, 발광 강도, 발광 파장, 발광 편광, 및 발광 양자 수율 중 하나 이상을 결정하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  93. 제68항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 일련의 신호 펄스가 시간 경과에 따른 전기 신호의 규모의 일련의 변화를 포함하는 것인 방법.
  94. 제93항에 있어서, 일련의 신호 펄스가 가역적인 단일 분자 결합 상호작용에 상응하는 전도율 전이를 포함하는 것인 방법.
  95. 제68항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 말단 아미노산 인식 분자의 각각이 인식 단백질 또는 인식 핵산을 포함하는 것인 방법.
  96. 제95항에 있어서, 인식 단백질이 분해 경로 단백질, 펩티다제, 항체, 아미노트랜스퍼라제, tRNA 신테타제, 또는 SH2 도메인-함유 단백질 또는 그의 단편인 방법.
  97. 제96항에 있어서, 분해 경로 단백질이 N-단부 규칙 경로 단백질, 또는 그의 돌연변이체 또는 변이체인 방법.
  98. 제97항에 있어서, N-단부 규칙 경로 단백질이 Arg/N-단부 규칙 경로 단백질, Ac/N-단부 규칙 경로 단백질, 또는 Pro/N-단부 규칙 경로 단백질인 방법.
  99. 제98항에 있어서, N-단부 규칙 경로 단백질이 Gid 단백질, UBR 박스 단백질 또는 그의 UBR 박스 도메인-함유 단편, p62 단백질 또는 그의 ZZ 도메인-함유 단편, 또는 ClpS 단백질인 방법.
  100. 제99항에 있어서, Gid 단백질이 에스. 세레비지아에 또는 그의 상동성 종으로부터의 Gid4 또는 Gid10인 방법.
  101. 제99항에 있어서, UBR 박스 단백질이 인간, 에스. 세레비지아에, 또는 그의 상동성 종으로부터의 UBR1 또는 UBR2인 방법.
  102. 제99항에 있어서, p62 단백질이 인간, 래트, 또는 그의 상동성 종으로부터의 p62인 방법.
  103. 제99항에 있어서, ClpS 단백질이 에이. 투미파시엔스, 씨. 크레센투스, 이. 콜라이, 에스. 엘론가투스, 피. 팔시파룸, 티. 엘론가투스, 또는 그의 상동성 종으로부터의 ClpS1 또는 ClpS2인 방법.
  104. 제95항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 인식 단백질이 합성 단백질 또는 재조합 단백질인 방법.
  105. 제95항에 있어서, 인식 핵산이 핵산 압타머인 방법.
  106. 제68항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 말단 아미노산 인식 분자의 각각이 검출가능한 표지를 포함하는 것인 방법.
  107. 제106항에 있어서, 검출가능한 표지가 발광 표지 또는 전도율 표지인 방법.
  108. 제68항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 폴리펩티드 분자가 표면에 고정화된 것인 방법.
  109. 제108항에 있어서, 단일 폴리펩티드 분자가, 1개 이상의 말단 아미노산 인식 분자가 회합하는 말단에 대해 원위인 말단 단부를 통해 표면에 고정화된 것인 방법.
  110. 제108항에 있어서, 단일 폴리펩티드 분자가 카르복시-말단 단부를 통해 고정화된 것인 방법.
  111. 제108항에 있어서, 단일 폴리펩티드 분자가 아미노-말단 단부를 통해 고정화된 것인 방법.
  112. 제108항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 폴리펩티드 분자가 링커를 통해 표면에 고정화된 것인 방법.
  113. 제112항에 있어서, 링커가 생체분자를 포함하고, 임의로 생체분자가 올리고뉴클레오티드인 방법.
  114. 제68항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 절단 시약과 말단의 회합을 지시하는 신호를 검출하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  115. 제68항 또는 제114항에 있어서, 절단 시약이 검출가능한 표지를 포함하는 것인 방법.
  116. 제115항에 있어서, 검출가능한 표지가 발광 표지 또는 전도율 표지인 방법.
  117. 제68항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 일련의 신호 펄스가 일련의 실시간 신호 펄스인 방법.
  118. 하기를 포함하는 시스템:
    적어도 1개의 하드웨어 프로세서; 및
    적어도 1개의 하드웨어 프로세서에 의해 실행되는 경우, 적어도 1개의 하드웨어 프로세서가 제68항 내지 제117항 중 어느 한 항의 방법을 수행하도록 하는 프로세서-실행가능 명령을 저장하는 적어도 1개의 비-일시적 컴퓨터-판독가능 저장 매체.
  119. 적어도 1개의 하드웨어 프로세서에 의해 실행되는 경우, 적어도 1개의 하드웨어 프로세서가 제68항 내지 제117항 중 어느 한 항의 방법을 수행하도록 하는 프로세서-실행가능 명령을 저장하는 적어도 1개의 비-일시적 컴퓨터-판독가능 저장 매체.
  120. 폴리펩티드 시퀀싱의 방법으로서:
    a) 단일 폴리펩티드 분자의 말단에서 제1 아미노산을 확인하고;
    b) 제1 아미노산을 제거하여 단일 폴리펩티드 분자의 말단에서 제2 아미노산을 노출시키고;
    c) 단일 폴리펩티드 분자의 말단에서 제2 아미노산을 확인하는 것
    을 포함하며,
    여기서 (a)-(c)가 단일 반응 혼합물에서 수행되는 것인
    방법.
  121. 제120항에 있어서, (a)-(c)가 순차적으로 일어나는 것인 방법.
  122. 제120항에 있어서, (c)가 (a) 및 (b) 전에 일어나는 것인 방법.
  123. 제120항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 반응 혼합물이 1개 이상의 말단 아미노산 인식 분자를 포함하는 것인 방법.
  124. 제123항에 있어서, 제1 및 제2 아미노산이 1개 이상의 말단 아미노산 인식 분자와 단일 폴리펩티드 분자의 말단의 회합을 지시하는 일련의 신호 펄스를 검출함으로써 확인되는 것인 방법.
  125. 제124항에 있어서, 1개 이상의 말단 아미노산 인식 분자와 제1 아미노산의 회합이 제2 아미노산과는 상이한 일련의 신호 펄스에서의 특징적인 패턴을 생성하는 것인 방법.
  126. 제120항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 말단 아미노산 인식 분자의 각각이 인식 단백질 또는 인식 핵산을 포함하는 것인 방법.
  127. 제126항에 있어서, 인식 단백질이 분해 경로 단백질, 펩티다제, 항체, 아미노트랜스퍼라제, tRNA 신테타제, 또는 SH2 도메인-함유 단백질 또는 그의 단편인 방법.
  128. 제127항에 있어서, 분해 경로 단백질이 N-단부 규칙 경로 단백질, 또는 그의 돌연변이체 또는 변이체인 방법.
  129. 제128항에 있어서, N-단부 규칙 경로 단백질이 Arg/N-단부 규칙 경로 단백질, Ac/N-단부 규칙 경로 단백질, 또는 Pro/N-단부 규칙 경로 단백질인 방법.
  130. 제129항에 있어서, N-단부 규칙 경로 단백질이 Gid 단백질, UBR 박스 단백질 또는 그의 UBR 박스 도메인-함유 단편, p62 단백질 또는 그의 ZZ 도메인-함유 단편, 또는 ClpS 단백질인 방법.
  131. 제130항에 있어서, Gid 단백질이 에스. 세레비지아에 또는 그의 상동성 종으로부터의 Gid4 또는 Gid10인 방법.
  132. 제130항에 있어서, UBR 박스 단백질이 인간, 에스. 세레비지아에, 또는 그의 상동성 종으로부터의 UBR1 또는 UBR2인 방법.
  133. 제130항에 있어서, p62 단백질이 인간, 래트, 또는 그의 상동성 종으로부터의 p62인 방법.
  134. 제130항에 있어서, ClpS 단백질이 에이. 투미파시엔스, 씨. 크레센투스, 이. 콜라이, 에스. 엘론가투스, 피. 팔시파룸, 티. 엘론가투스, 또는 그의 상동성 종으로부터의 ClpS1 또는 ClpS2인 방법.
  135. 제126항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, 인식 단백질이 합성 단백질 또는 재조합 단백질인 방법.
  136. 제126항에 있어서, 인식 핵산이 핵산 압타머인 방법.
  137. 제120항 내지 제136항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 말단 아미노산 인식 분자의 각각이 검출가능한 표지를 포함하는 것인 방법.
  138. 제137항에 있어서, 검출가능한 표지가 발광 표지 또는 전도율 표지인 방법.
  139. 제120항 내지 제138항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 반응 혼합물이 단일 폴리펩티드 분자의 말단으로부터 1개 이상의 아미노산을 제거하는 절단 시약을 포함하는 것인 방법.
  140. 제139항에 있어서, 제1 아미노산이 절단 시약에 의해 제거되는 것인 방법.
  141. 제139항 또는 제140항에 있어서, 절단 시약이 검출가능한 표지를 포함하는 것인 방법.
  142. 제141항에 있어서, 검출가능한 표지가 발광 표지 또는 전도율 표지인 방법.
  143. 제120항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 폴리펩티드 분자가 표면에 고정화된 것인 방법.
  144. 제143항에 있어서, 단일 폴리펩티드 분자가 제1 아미노산이 제거되는 말단에 대해 원위인 말단 단부를 통해 표면에 고정화된 것인 방법.
  145. 제143항에 있어서, 단일 폴리펩티드 분자가 카르복시-말단 단부를 통해 고정화된 것인 방법.
  146. 제143항에 있어서, 단일 폴리펩티드 분자가 아미노-말단 단부를 통해 고정화된 것인 방법.
  147. 제143항 내지 제146항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 폴리펩티드 분자가 링커를 통해 표면에 고정화된 것인 방법.
  148. 제147항에 있어서, 링커가 생체분자를 포함하고, 임의로 생체분자가 올리고뉴클레오티드인 방법.
  149. 제124항 내지 제148항 중 어느 한 항에 있어서, 일련의 신호 펄스가 일련의 실시간 신호 펄스인 방법.
  150. 하기를 포함하는 시스템:
    적어도 1개의 하드웨어 프로세서; 및
    적어도 1개의 하드웨어 프로세서에 의해 실행되는 경우, 적어도 1개의 하드웨어 프로세서가 제120항 내지 제149항 중 어느 한 항의 방법을 수행하도록 하는 프로세서-실행가능 명령을 저장하는 적어도 1개의 비-일시적 컴퓨터-판독가능 저장 매체.
  151. 적어도 1개의 하드웨어 프로세서에 의해 실행되는 경우, 적어도 1개의 하드웨어 프로세서가 제120항 내지 제149항 중 어느 한 항의 방법을 수행하도록 하는 프로세서-실행가능 명령을 저장하는 적어도 1개의 비-일시적 컴퓨터-판독가능 저장 매체.
  152. 폴리펩티드의 아미노산을 확인하는 방법으로서:
    단일 폴리펩티드 분자를 단일 폴리펩티드 분자에 결합하는 1개 이상의 아미노산 인식 분자와 접촉시키고;
    폴리펩티드 분해 조건 하에서 1개 이상의 아미노산 인식 분자와 단일 폴리펩티드 분자의 회합을 지시하는 일련의 신호 펄스를 검출하고;
    일련의 신호 펄스에서의 제1 특징적인 패턴에 기반하여 단일 폴리펩티드 분자에서 아미노산의 제1 유형을 확인하는 것
    을 포함하는 방법.
  153. 제152항에 있어서, 제1 특징적인 패턴이 일련의 신호 펄스의 적어도 일부분을 포함하는 것인 방법.
  154. 제153항에 있어서, 제1 특징적인 패턴의 신호 펄스가 아미노산 인식 분자 및 아미노산의 제1 유형 사이의 개별적인 회합 사건에 상응하는 것인 방법.
  155. 제154항에 있어서, 제1 특징적인 패턴의 신호 펄스가 아미노산 인식 분자 및 아미노산의 제1 유형 사이의 결합의 해리 속도의 특징인 펄스 지속기간을 포함하는 것인 방법.
  156. 제155항에 있어서, 제1 특징적인 패턴의 각각의 신호 펄스가 아미노산 인식 분자 결합의 회합 속도의 특징인 펄스간 지속기간에 의해 또 다른 것으로부터 분리되는 것인 방법.
  157. 제152항 내지 제156항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 특징적인 패턴이 단일 폴리펩티드 분자에서의 아미노산의 제1 유형과의 일련의 가역적인 아미노산 인식 분자 결합 상호작용에 상응하는 것인 방법.
  158. 제157항에 있어서, 일련의 가역적인 아미노산 인식 분자 결합 상호작용이 단일 폴리펩티드 분자의 말단에서의 1개의 2원 복합체 종의 가역적인 형성을 포함하는 것인 방법.
  159. 제157항에 있어서, 일련의 가역적인 아미노산 인식 분자 결합 상호작용이 단일 폴리펩티드 분자의 말단에서의 상이한 2원 복합체 종의 가역적인 형성을 포함하는 것인 방법.
  160. 제152항 내지 제159항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 폴리펩티드 분자가 단일 폴리펩티드 분자의 말단 위치에 아미노산의 제1 유형을 포함하는 것인 방법.
  161. 제160항에 있어서, 제1 특징적인 패턴이 말단 위치에서의 아미노산의 제1 유형 및 인접 위치에서의 아미노산 유형을 지시하는 것인 방법.
  162. 제161항에 있어서, 말단 위치 및 인접 위치에서의 아미노산이 상이한 유형의 것인 방법.
  163. 제152항 내지 제162항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 폴리펩티드 분자가 단일 폴리펩티드 분자의 내부 위치에 아미노산의 제1 유형을 포함하는 것인 방법.
  164. 제160항 내지 제163항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 폴리펩티드 분자가 단일 폴리펩티드 분자의 말단 위치에 및 비-인접 내부 위치에 아미노산의 제1 유형을 포함하는 것인 방법.
  165. 제164항에 있어서, 제1 특징적인 패턴이 말단 위치에서의 아미노산의 제1 유형 및 비-인접 내부 위치에서의 아미노산 유형을 지시하는 것인 방법.
  166. 제164항 또는 제165항에 있어서, 제1 특징적인 패턴이 단일 폴리펩티드 분자에서의 아미노산의 제1 유형의 풍부도를 지시하는 것인 방법.
  167. 제152항 내지 제166항 중 어느 한 항에 있어서, 확인이 아미노산의 제1 유형을 천연 발생 아미노산, 비천연 아미노산, 또는 그의 변형된 변이체로서 확인하는 것을 포함하는 것인 방법.
  168. 제152항 내지 제167항 중 어느 한 항에 있어서, 확인이 아미노산의 제1 유형을 하전된, 비하전된, 극성, 비-극성, 소수성, 방향족, 또는 그의 조합인 측쇄를 갖는 것으로서 확인하는 것을 포함하는 것인 방법.
  169. 제168항에 있어서, 측쇄가 음으로 하전되거나 또는 양으로 하전된 것인 방법.
  170. 제152항 내지 제169항 중 어느 한 항에 있어서, 확인이 아미노산의 제1 유형을 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 셀레노시스테인, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 및 발린으로부터 선택되는 하나의 유형으로서 확인하는 것을 포함하는 것인 방법.
  171. 제152항 내지 제170항 중 어느 한 항에 있어서, 확인이 아미노산의 제1 유형을 번역후 변형을 갖는 것으로서 확인하는 것을 포함하는 것인 방법.
  172. 제171항에 있어서, 번역후 변형이 아세틸화, ADP-리보실화, 카스파제 절단, 시트룰린화, 포르밀화, N-연결된 글리코실화, O-연결된 글리코실화, 히드록실화, 메틸화, 미리스토일화, 네딜화, 니트로화, 산화, 팔미토일화, 인산화, 프레닐화, S-니트로실화, 황산화, 수모일화, 및 유비퀴틴화로부터 선택되는 것인 방법.
  173. 제152항 내지 제172항 중 어느 한 항에 있어서, 일련의 신호 펄스가 시간 경과에 따른 광학 신호의 규모의 일련의 변화를 포함하는 것인 방법.
  174. 제173항에 있어서, 일련의 신호 펄스 각각이 복수개의 광자 방출 사건을 포함하는 것인 방법.
  175. 제174항에 있어서, 아미노산의 제1 유형을 확인하는 것이 발광 수명, 발광 휘도, 발광 강도, 발광 파장, 발광 편광, 및 발광 양자 수율 중 하나 이상을 결정하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  176. 제152항 내지 제175항 중 어느 한 항에 있어서, 일련의 신호 펄스가 시간 경과에 따른 전기 신호의 규모의 일련의 변화를 포함하는 것인 방법.
  177. 제176항에 있어서, 제1 특징적인 패턴이 가역적인 단일 분자 결합 상호작용에 상응하는 전도율 전이를 포함하는 것인 방법.
  178. 제152항 내지 제177항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 아미노산 인식 분자의 각각이 인식 단백질 또는 인식 핵산을 포함하는 것인 방법.
  179. 제178항에 있어서, 인식 단백질이 분해 경로 단백질, 펩티다제, 항체, 아미노트랜스퍼라제, tRNA 신테타제, 또는 SH2 도메인-함유 단백질 또는 그의 단편인 방법.
  180. 제179항에 있어서, 분해 경로 단백질이 N-단부 규칙 경로 단백질, 또는 그의 돌연변이체 또는 변이체인 방법.
  181. 제180항에 있어서, N-단부 규칙 경로 단백질이 Arg/N-단부 규칙 경로 단백질, Ac/N-단부 규칙 경로 단백질, 또는 Pro/N-단부 규칙 경로 단백질인 방법.
  182. 제181항에 있어서, N-단부 규칙 경로 단백질이 Gid 단백질, UBR 박스 단백질 또는 그의 UBR 박스 도메인-함유 단편, p62 단백질 또는 그의 ZZ 도메인-함유 단편, 또는 ClpS 단백질인 방법.
  183. 제182항에 있어서, Gid 단백질이 에스. 세레비지아에 또는 그의 상동성 종으로부터의 Gid4 또는 Gid10인 방법.
  184. 제182항에 있어서, UBR 박스 단백질이 인간, 에스. 세레비지아에, 또는 그의 상동성 종으로부터의 UBR1 또는 UBR2인 방법.
  185. 제182항에 있어서, p62 단백질이 인간, 래트, 또는 그의 상동성 종으로부터의 p62인 방법.
  186. 제182항에 있어서, ClpS 단백질이 에이. 투미파시엔스, 씨. 크레센투스, 이. 콜라이, 에스. 엘론가투스, 피. 팔시파룸, 티. 엘론가투스, 또는 그의 상동성 종으로부터의 ClpS1 또는 ClpS2인 방법.
  187. 제178항 내지 제186항 중 어느 한 항에 있어서, 인식 단백질이 합성 단백질 또는 재조합 단백질인 방법.
  188. 제178항에 있어서, 인식 핵산이 핵산 압타머인 방법.
  189. 제152항 내지 제188항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 아미노산 인식 분자의 각각이 검출가능한 표지를 포함하는 것인 방법.
  190. 제189항에 있어서, 검출가능한 표지가 발광 표지 또는 전도율 표지인 방법.
  191. 제152항 내지 제190항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 폴리펩티드 분자가 표면에 고정화된 것인 방법.
  192. 제191항에 있어서, 단일 폴리펩티드 분자가 하나의 말단을 통해 표면에 고정화되고, 1개 이상의 아미노산 인식 분자가 다른 말단에서 단일 폴리펩티드 분자에 결합하는 것인 방법.
  193. 제192항에 있어서, 단일 폴리펩티드 분자가 카르복시-말단을 통해 고정화되고, 1개 이상의 아미노산 인식 분자가 아미노-말단에서 단일 폴리펩티드 분자에 결합하는 것인 방법.
  194. 제192항에 있어서, 단일 폴리펩티드 분자가 아미노-말단을 통해 고정화되고, 1개 이상의 아미노산 인식 분자가 카르복시-말단에서 단일 폴리펩티드 분자에 결합하는 것인 방법.
  195. 제191항 내지 제194항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 폴리펩티드 분자가 링커를 통해 표면에 고정화된 것인 방법.
  196. 제195항에 있어서, 링커가 생체분자를 포함하고, 임의로 생체분자가 올리고뉴클레오티드인 방법.
  197. 제152항 내지 제196항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 폴리펩티드 분자의 분해를 관찰하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  198. 제152항 내지 제197항 중 어느 한 항에 있어서, 분해 조건이 단일 폴리펩티드 분자의 말단으로부터 1개 이상의 말단 아미노산을 제거할 수 있는 절단 시약의 존재 하에서 일련의 신호 펄스를 검출하는 것을 포함하는 것인 방법.
  199. 제198항에 있어서, 절단 시약과 단일 폴리펩티드 분자의 회합을 지시하는 신호 펄스를 검출하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  200. 제198항 또는 제199항에 있어서, 절단 시약이 검출가능한 표지를 포함하는 것인 방법.
  201. 제200항에 있어서, 검출가능한 표지가 발광 표지 또는 전도율 표지인 방법.
  202. 제197항 내지 제201항 중 어느 한 항에 있어서, 일련의 신호 펄스에서의 제2 특징적인 패턴에 기반하여 단일 폴리펩티드 분자에서 아미노산의 제2 유형을 확인하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  203. 제202항에 있어서, 신호 펄스의 제2 특징적인 패턴이 단일 폴리펩티드 분자로부터의 아미노산의 제1 유형의 제거를 지시하는 것인 방법.
  204. 제152항 내지 제203항 중 어느 한 항에 있어서, 일련의 신호 펄스가 일련의 실시간 신호 펄스인 방법.
  205. 하기를 포함하는 시스템:
    적어도 1개의 하드웨어 프로세서; 및
    적어도 1개의 하드웨어 프로세서에 의해 실행되는 경우, 적어도 1개의 하드웨어 프로세서가 제152항 내지 제204항 중 어느 한 항의 방법을 수행하도록 하는 프로세서-실행가능 명령을 저장하는 적어도 1개의 비-일시적 컴퓨터-판독가능 저장 매체.
  206. 적어도 1개의 하드웨어 프로세서에 의해 실행되는 경우, 적어도 1개의 하드웨어 프로세서가 제152항 내지 제204항 중 어느 한 항의 방법을 수행하도록 하는 프로세서-실행가능 명령을 저장하는 적어도 1개의 비-일시적 컴퓨터-판독가능 저장 매체.
  207. 화학식 (I)의 가용성 아미노산 인식 분자를 포함하는 조성물:
    A-(Y)n-D
    (I)
    여기서:
    A는 적어도 1개의 아미노산 인식 분자를 포함하는 아미노산 결합 성분이고;
    Y의 각각의 경우는 공유 또는 비-공유 연결기를 형성하는 중합체이고;
    n은 1 내지 10 (경계값 포함)의 정수이고;
    D는 적어도 1개의 검출가능한 표지를 포함하는 표지 성분이고, D는 200 Å 미만의 직경이다.
  208. 제207항에 있어서, -(Y)n-이 적어도 2 nm의 길이인 조성물.
  209. 제207항에 있어서, -(Y)n-이 적어도 5 nm의 길이인 조성물.
  210. 제207항에 있어서, -(Y)n-이 적어도 10 nm의 길이인 조성물.
  211. 제207항 내지 제210항 중 어느 한 항에 있어서, Y의 각각의 경우가 독립적으로 생체분자, 폴리올, 또는 덴드리머인 조성물.
  212. 제211항에 있어서, 생체분자가 핵산, 폴리펩티드, 또는 폴리사카라이드인 조성물.
  213. 제207항 내지 제212항 중 어느 한 항에 있어서, 가용성 아미노산 인식 분자가 하기 화학식 중 하나의 것인 조성물:
    A-Y1-(Y)m-D 또는 A-(Y)m-Y1-D
    여기서:
    Y1은 핵산 또는 폴리펩티드이고;
    m은 0 내지 10 (경계값 포함)의 정수이다.
  214. 제212항 또는 제213항에 있어서, 핵산이 제1 올리고뉴클레오티드 가닥을 포함하는 것인 조성물.
  215. 제214항에 있어서, 핵산이 제1 올리고뉴클레오티드 가닥과 혼성화된 제2 올리고뉴클레오티드 가닥을 포함하는 것인 조성물.
  216. 제214항 또는 제215항에 있어서, 핵산이 제1 올리고뉴클레오티드 가닥을 통해 공유 연결을 형성하는 것인 조성물.
  217. 제215항에 있어서, 핵산이 혼성화된 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드 가닥을 통해 비-공유 연결을 형성하는 것인 조성물.
  218. 제212항 내지 제217항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 1가 또는 다가 단백질인 조성물.
  219. 제218항에 있어서, 1가 또는 다가 단백질이 1가 또는 다가 단백질의 리간드-결합 부위에 부착된 리간드 모이어티를 통해 적어도 1개의 비-공유 연결을 형성하는 것인 조성물.
  220. 제219항에 있어서, A, Y, 또는 D가 리간드 모이어티를 포함하는 것인 조성물.
  221. 제207항 내지 제212항 중 어느 한 항에 있어서, 가용성 아미노산 인식 분자가 하기 화학식 중 하나의 것인 조성물:
    A-(Y)m-Y2-D 또는 A-Y2-(Y)m-D
    여기서:
    Y2는 폴리올 또는 덴드리머이고;
    m은 0 내지 10 (경계값 포함)의 정수이다.
  222. 제221항에 있어서, 폴리올 또는 덴드리머가 폴리에틸렌 글리콜, 테트라에틸렌 글리콜, 폴리(아미도아민), 폴리(프로필렌이민), 폴리(프로필렌아민), 카르보실란, 폴리(L-리신), 또는 이들 중 하나 이상의 조합을 포함하는 것인 조성물.
  223. 제207항 내지 제222항 중 어느 한 항에 있어서, A가 복수개의 아미노산 인식 분자를 포함하는 것인 조성물.
  224. 제223항에 있어서, 복수개 중 각각의 아미노산 인식 분자가 Y 상의 상이한 부착 부위에 부착되는 것인 조성물.
  225. 제223항에 있어서, 복수개 중 적어도 2개의 아미노산 인식 분자가 Y 상의 단일 부착 부위에 부착되는 것인 조성물.
  226. 제207항 내지 제225항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 인식 분자가 인식 단백질 또는 핵산 압타머인 조성물.
  227. 제226항에 있어서, 인식 단백질이 분해 경로 단백질, 펩티다제, 항체, 아미노트랜스퍼라제, tRNA 신테타제, 또는 SH2 도메인-함유 단백질 또는 그의 단편인 조성물.
  228. 제227항에 있어서, 분해 경로 단백질이 N-단부 규칙 경로 단백질, 또는 그의 돌연변이체 또는 변이체인 조성물.
  229. 제228항에 있어서, N-단부 규칙 경로 단백질이 Arg/N-단부 규칙 경로 단백질, Ac/N-단부 규칙 경로 단백질, 또는 Pro/N-단부 규칙 경로 단백질인 조성물.
  230. 제229항에 있어서, N-단부 규칙 경로 단백질이 Gid 단백질, UBR 박스 단백질 또는 그의 UBR 박스 도메인-함유 단편, p62 단백질 또는 그의 ZZ 도메인-함유 단편, 또는 ClpS 단백질인 조성물.
  231. 제230항에 있어서, Gid 단백질이 에스. 세레비지아에 또는 그의 상동성 종으로부터의 Gid4 또는 Gid10인 조성물.
  232. 제230항에 있어서, UBR 박스 단백질이 인간, 에스. 세레비지아에, 또는 그의 상동성 종으로부터의 UBR1 또는 UBR2인 조성물.
  233. 제230항에 있어서, p62 단백질이 인간, 래트, 또는 그의 상동성 종으로부터의 p62인 조성물.
  234. 제230항에 있어서, ClpS 단백질이 에이. 투미파시엔스, 씨. 크레센투스, 이. 콜라이, 에스. 엘론가투스, 피. 팔시파룸, 티. 엘론가투스, 또는 그의 상동성 종으로부터의 ClpS1 또는 ClpS2인 조성물.
  235. 제207항 내지 제234항 중 어느 한 항에 있어서, 검출가능한 표지가 발광 표지 또는 전도율 표지인 조성물.
  236. 제235항에 있어서, 발광 표지가 적어도 1개의 형광단 염료 분자를 포함하는 것인 조성물.
  237. 제236항에 있어서, D가 20개 이하의 형광단 염료 분자를 포함하는 것인 조성물.
  238. 제236항 또는 제237항에 있어서, 형광단 염료 분자의 수 대 아미노산 인식 분자의 수의 비가 1:1 내지 20:1인 조성물.
  239. 제235항 내지 제238항 중 어느 한 항에 있어서, 발광 표지가 공여자 표지 및 수용자 표지를 포함하는 적어도 1개의 FRET 쌍을 포함하는 것인 조성물.
  240. 제239항에 있어서, 공여자 표지 대 수용자 표지의 비가 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 또는 5:1인 조성물.
  241. 제239항에 있어서, 수용자 표지 대 공여자 표지의 비가 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 또는 5:1인 조성물.
  242. 화학식 (II)의 아미노산 인식 분자:
    A-Y1-D
    (II)
    여기서:
    A는 적어도 1개의 아미노산 인식 분자를 포함하는 아미노산 결합 성분이고;
    Y1은 핵산 또는 폴리펩티드이고;
    D는 적어도 1개의 검출가능한 표지를 포함하는 표지 성분이며;
    단, Y1이 핵산인 경우, 핵산은 공유 또는 비-공유 연결기를 형성하고;
    단, Y1이 폴리펩티드인 경우, 폴리펩티드는 50 × 10-9 M 미만의 해리 상수 (KD)를 특징으로 하는 비-공유 연결기를 형성한다.
  243. 제242항에 있어서, -Y1-이 적어도 2 nm의 길이인 아미노산 인식 분자.
  244. 제242항에 있어서, -Y1-이 적어도 5 nm의 길이인 아미노산 인식 분자.
  245. 제242항에 있어서, -Y1-이 적어도 10 nm의 길이인 아미노산 인식 분자.
  246. 제242항 내지 제245항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 제1 올리고뉴클레오티드 가닥을 포함하는 것인 아미노산 인식 분자.
  247. 제246항에 있어서, 핵산이 제1 올리고뉴클레오티드 가닥과 혼성화된 제2 올리고뉴클레오티드 가닥을 포함하는 것인 아미노산 인식 분자.
  248. 제247항에 있어서, A가 제1 올리고뉴클레오티드 가닥에 부착되고, D가 제2 올리고뉴클레오티드 가닥에 부착되는 것인 아미노산 인식 분자.
  249. 제246항 또는 제247항에 있어서, A가 제1 올리고뉴클레오티드 가닥 상의 제1 부착 부위에 부착되고, D가 제1 올리고뉴클레오티드 가닥 상의 제2 부착 부위에 부착되는 것인 아미노산 인식 분자.
  250. 제246항 내지 제249항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산의 각각의 올리고뉴클레오티드 가닥이 150개 미만, 100개 미만, 또는 50개 미만의 뉴클레오티드를 포함하는 것인 아미노산 인식 분자.
  251. 제242항 내지 제250항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 1가 또는 다가 단백질인 아미노산 인식 분자.
  252. 제251항에 있어서, 1가 또는 다가 단백질이 1가 또는 다가 단백질의 리간드-결합 부위에 부착된 리간드 모이어티를 통해 적어도 1개의 비-공유 연결을 형성하는 것인 아미노산 인식 분자.
  253. 제252항에 있어서, A 및 D 중 적어도 하나가 리간드 모이어티를 포함하는 것인 아미노산 인식 분자.
  254. 제242항 내지 제253항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 아비딘 단백질인 아미노산 인식 분자.
  255. 제254항에 있어서, 아비딘 단백질이 아비딘, 스트렙타비딘, 트랍타비딘, 타마비딘, 브라다비딘, 크세나비딘, 또는 그의 동족체 또는 변이체인 아미노산 인식 분자.
  256. 제252항 내지 제255항 중 어느 한 항에 있어서, 리간드 모이어티가 비오틴 모이어티인 아미노산 인식 분자.
  257. 제242항 내지 제256항 중 어느 한 항에 있어서, KD가 1 × 10-9 M 미만, 1 × 10-10 M 미만, 1 × 10-11 M 미만, 또는 1 × 10-12 M 미만인 아미노산 인식 분자.
  258. 제242항 내지 제257항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 인식 분자가 하기 화학식 중 하나의 것인 아미노산 인식 분자:
    A-Y1-(Y)n-D 또는 A-(Y)n-Y1-D
    여기서:
    Y의 각각의 경우는 공유 또는 비-공유 연결기를 형성하는 중합체이고;
    n은 1 내지 10 (경계값 포함)의 정수이다.
  259. 제258항에 있어서, Y의 각각의 경우가 독립적으로 생체분자, 폴리올, 또는 덴드리머인 아미노산 인식 분자.
  260. 핵산;
    핵산 상의 제1 부착 부위에 부착된 적어도 1개의 아미노산 인식 분자; 및
    핵산 상의 제2 부착 부위에 부착된 적어도 1개의 검출가능한 표지
    를 포함하며,
    여기서 핵산이 적어도 1개의 아미노산 인식 분자 및 적어도 1개의 검출가능한 표지 사이에 공유 또는 비-공유 연결기를 형성하는 것인
    아미노산 인식 분자.
  261. 제260항에 있어서, 핵산이 제2 올리고뉴클레오티드 가닥과 혼성화된 제1 올리고뉴클레오티드 가닥을 포함하는 이중-가닥 핵산인 아미노산 인식 분자.
  262. 제261항에 있어서, 제1 부착 부위가 제1 올리고뉴클레오티드 가닥 상에 있고, 제2 부착 부위가 제2 올리고뉴클레오티드 가닥 상에 있는 것인 아미노산 인식 분자.
  263. 제260항 내지 제262항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1개의 아미노산 인식 분자가 적어도 1개의 아미노산 인식 분자 및 핵산 사이에 공유 또는 비-공유 연결기를 형성하는 단백질을 통해 제1 부착 부위에 부착되는 것인 아미노산 인식 분자.
  264. 제260항 내지 제263항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1개의 검출가능한 표지가 적어도 1개의 검출가능한 표지 및 핵산 사이의 공유 또는 비-공유 연결기를 형성하는 단백질을 통해 제2 부착 부위에 부착되는 것인 아미노산 인식 분자.
  265. 제260항 내지 제264항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 부착 부위가 핵산 상의 5 내지 100개의 뉴클레오티드 염기 또는 뉴클레오티드 염기 쌍에 의해 분리되는 것인 아미노산 인식 분자.
  266. 적어도 2개의 리간드-결합 부위를 포함하는 다가 단백질;
    단백질 상의 제1 리간드-결합 부위에 결합된 제1 리간드 모이어티를 통해 단백질에 부착된 적어도 1개의 아미노산 인식 분자; 및
    단백질 상의 제2 리간드-결합 부위에 결합된 제2 리간드 모이어티를 통해 단백질에 부착된 적어도 1개의 검출가능한 표지
    를 포함하는 아미노산 인식 분자.
  267. 제266항에 있어서, 다가 단백질이 4개의 리간드-결합 부위를 포함하는 아비딘 단백질인 아미노산 인식 분자.
  268. 제266항 또는 제267항에 있어서, 리간드-결합 부위가 비오틴 결합 부위이고, 리간드 모이어티가 비오틴 모이어티인 아미노산 인식 분자.
  269. 제268항에 있어서, 비오틴 모이어티 중 적어도 하나가 비스-비오틴 모이어티이고, 비스-비오틴 모이어티가 아비딘 단백질 상의 2개의 비오틴 결합 부위에 결합되는 것인 아미노산 인식 분자.
  270. 제266항 내지 제269항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1개의 아미노산 인식 분자가 제1 리간드 모이어티를 포함하는 핵산을 통해 단백질에 부착되는 것인 아미노산 인식 분자.
  271. 제266항 내지 제270항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1개의 검출가능한 표지가 제2 리간드 모이어티를 포함하는 핵산을 통해 단백질에 부착되는 것인 아미노산 인식 분자.
  272. 폴리펩티드의 말단 아미노산을 확인하는 방법으로서:
    폴리펩티드를 폴리펩티드의 말단에서 말단 아미노산의 1개 이상의 유형에 선택적으로 결합하는 1개 이상의 표지된 친화도 시약과 접촉시키고;
    폴리펩티드와 1개 이상의 표지된 친화도 시약의 상호작용을 검출함으로써 폴리펩티드의 말단에서 말단 아미노산을 확인하는 것
    을 포함하는 방법.
  273. 폴리펩티드의 아미노산 서열을 결정하는 방법으로서:
    i. 폴리펩티드를 폴리펩티드의 말단에서의 말단 아미노산의 1개 이상의 유형에 선택적으로 결합하는 1개 이상의 표지된 친화도 시약과 접촉시키고;
    ii. 폴리펩티드와 1개 이상의 표지된 친화도 시약의 상호작용을 검출함으로써 폴리펩티드의 말단에서 말단 아미노산을 확인하고;
    iii. 말단 아미노산을 제거하고;
    iv. (i) 내지 (iv)를 폴리펩티드의 말단에서 1회 이상 반복하여 폴리펩티드의 아미노산 서열을 결정하는 것
    을 포함하는 방법.
  274. 제273항에 있어서, 방법이
    a. (i) 후에 및 (ii) 전에, 말단 아미노산에 선택적으로 결합하지 않는 1개 이상의 표지된 친화도 시약 중 임의의 것을 제거하는 것; 및/또는
    b. (ii) 후에 및 (iii) 전에, 말단 아미노산에 선택적으로 결합하는 1개 이상의 표지된 친화도 시약 중 임의의 것을 제거하는 것
    을 추가로 포함하는 것인 방법.
  275. 제273항에 있어서, (iii)이 말단 아미노산을 이소티오시아네이트와 접촉시킴으로써 말단 아미노산을 변형시키고;
    a. 변형된 말단 아미노산을 변형된 말단 아미노산에 특이적으로 결합하고 이를 제거하는 프로테아제와 접촉시키는 것; 또는
    b. 변형된 말단 아미노산을 변형된 말단 아미노산을 제거하는데 충분한 산성 또는 염기성 조건으로 처리하는 것
    을 포함하는 것인 방법.
  276. 제273항에 있어서, 말단 아미노산을 확인하는 것이
    a. 말단 아미노산을 1개 이상의 표지된 친화도 시약이 결합하는 말단 아미노산의 1개 이상의 유형 중 하나의 유형인 것으로서 확인하는 것; 또는
    b. 말단 아미노산을 1개 이상의 표지된 친화도 시약이 결합하는 말단 아미노산의 1개 이상의 유형 이외의 유형인 것으로서 확인하는 것
    을 포함하는 것인 방법.
  277. 제273항에 있어서, 1개 이상의 표지된 친화도 시약이 1개 이상의 표지된 압타머, 1개 이상의 표지된 펩티다제, 1개 이상의 표지된 항체, 또는 그의 조합을 포함하는 것인 방법.
  278. 제277항에 있어서, 1개 이상의 표지된 펩티다제가 절단 활성을 불활성화시키도록 변형되었거나, 또는 1개 이상의 표지된 펩티다제가 (iii)의 제거를 위한 절단 활성을 보유하는 것인 방법.
  279. 혼합된 샘플에서 관심의 단백질을 확인하는 방법으로서:
    혼합된 단백질 샘플을 절단하여 복수개의 폴리펩티드 단편을 생성하고;
    제273항 내지 제278항 중 어느 한 항에 따른 방법에서 복수개 중 적어도 1개의 폴리펩티드 단편의 아미노산 서열을 결정하고;
    아미노산 서열이 관심의 단백질에 대해 고유하게 확인가능한 경우, 혼합된 샘플에서 관심의 단백질을 확인하는 것
    을 포함하는 방법.
  280. 혼합된 샘플에서 관심의 단백질을 확인하는 방법으로서:
    혼합된 단백질 샘플을 절단하여 복수개의 폴리펩티드 단편을 생성하고;
    복수개의 폴리펩티드 단편에서 아미노산의 1개 이상의 유형을 1개 이상의 상이한 발광 표지로 표지하고;
    복수개 중 적어도 1개의 표지된 폴리펩티드에 대해 시간 경과에 따라 발광을 측정하고;
    검출된 발광에 기반하여 적어도 1개의 표지된 폴리펩티드의 아미노산 서열을 결정하고;
    아미노산 서열이 관심의 단백질에 대해 고유하게 확인가능한 경우, 혼합된 샘플에서 관심의 단백질을 확인하는 것
    을 포함하는 방법.
  281. 폴리펩티드에서 2개 이상의 아미노산의 상대 위치를 확인하는 방법으로서:
    폴리펩티드의 2개 이상의 아미노산을 제1 FRET 표지의 1개 이상의 유형으로 표지하고;
    제2 FRET 표지로 표지된 보조인자의 존재 하에서 표지된 폴리펩티드의 전위 반응으로부터의 FRET 신호를 검출하고;
    FRET 신호에 기반하여 2개 이상의 아미노산의 상대 위치를 결정하는 것
    을 포함하는 방법.
  282. 분석용 단백질을 제조하는 방법으로서:
    i. 단백질의 유리 카르복실레이트 기를 차단하고;
    ii. 단백질을 변성시키고;
    iii. 단백질의 유리 티올 기를 차단하고;
    iv. 단백질을 소화시켜 유리 C-말단 카르복실레이트 기를 포함하는 적어도 1개의 폴리펩티드 단편을 생성하고;
    v. 관능성 모이어티를 유리 C-말단 카르복실레이트 기에 화학적으로 접합시키는 것
    을 포함하는 방법.
  283. 분석용 단백질을 제조하는 방법으로서:
    i. 단백질을 변성시키고;
    ii. 단백질의 유리 티올 기를 차단하고;
    iii. 단백질을 소화시켜 유리 C-말단 카르복실레이트 기를 포함하는 적어도 1개의 폴리펩티드 단편을 생성하고;
    iv. 유리 C-말단 카르복실레이트 기를 차단하여 차단된 C-말단 카르복실레이트 기를 포함하는 적어도 1개의 폴리펩티드 단편을 생성하고;
    v. 관능성 모이어티를 차단된 C-말단 카르복실레이트 기에 효소적으로 접합시키는 것
    을 포함하는 방법.
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