JP2022507516A - タンパク質シーケンシングのための方法及び組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
A-(Y)n-D
(I)
(式中、Aは、少なくとも1つのアミノ酸認識分子を含むアミノ酸結合成分であり;Yの各々は、共有結合性又は非共有結合性連結基を形成するポリマーであり;nは、1~10(両端の値を含む)の整数であり;且つ、Dは、少なくとも1つの検出可能標識を含む標識成分である)
のアミノ酸認識分子を提供する。いくつかの実施形態では、Dは200Å未満の直径である。いくつかの実施形態では、-(Y)n-は、少なくとも2nmの長さ(たとえば、少なくとも5nm、少なくとも10nm、少なくとも20nm、少なくとも30nm、少なくとも50nm、又はそれ以上の長さ)である。いくつかの実施形態では、-(Y)n-は、約2nm~約200nmの長さ(たとえば、約2nm~約100nm、約5nm~約50nm、又は約10nm~約100nmの長さ)である。いくつかの実施形態では、Yの各々は、独立して、バイオ分子又はデンドリティックポリマー(たとえば、ポリオール、デンドリマー)である。いくつかの実施形態では、本願は、式(I)のアミノ酸認識分子を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、アミノ酸認識分子は組成物に可溶である。
A-Y1-D
(II)
(式中、Aは、少なくとも1つのアミノ酸認識分子を含むアミノ酸結合成分であり;Y1は、核酸又はポリペプチドであり;Dは、少なくとも1つの検出可能標識を含む標識成分である)
のアミノ酸認識分子を提供する。いくつかの実施形態では、Y1が核酸であるとき、核酸は共有結合性又は非共有結合性連結基を形成する。いくつかの実施形態では、ただし、Y1がポリペプチドであるとき、ポリペプチドは、50×10-9M未満の解離定数(KD)により特徴付けられる非共有結合性連結基を形成する。いくつかの実施形態では、KDは、1×10-9M未満、1×10-10M未満、1×10-11M未満、又は1×10-12M未満である。
図面を参照して実施形態を説明するとき、方向参照(「上方(above)」、「下方(below)」、「トップ(top)」、「ボトム(bottom)」、「左」、「右」、「水平」、「垂直」など)が使用されうる。かかる参照は、正規の向きで図面を見る読者の助けとなるように単に意図されているにすぎない。これらの方向参照は、具現化されたデバイスの好ましい又は唯一の向きを記述することが意図されるものではない。デバイスは、他の向きで具現化されうる。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、ポリペプチドと、1タイプの末端アミノ酸に選択的に結合するアミノ酸認識分子(本明細書では標識を含んでいても含んでいなくてもよいアミノ酸認識分子ともいう)と、を接触させることを含む。本明細書で用いられる場合、いくつかの実施形態では、末端アミノ酸とは、ポリペプチドのアミノ末端アミノ酸又はポリペプチドのカルボキシ末端アミノ酸を意味しうる。いくつかの実施形態では、標識アフィニティー試薬は、他のタイプの末端アミノ酸よりも1タイプの末端アミノ酸に選択的に結合する。いくつかの実施形態では、標識アフィニティー試薬は、同一タイプの内部アミノ酸よりも1タイプの末端アミノ酸に選択的に結合する。さらに他の実施形態では、標識アフィニティー試薬は、ポリペプチドのいずれかの位置の1タイプのアミノ酸、たとえば、末端アミノ酸や内部アミノ酸と同一タイプのアミノ酸に選択的に結合する。
核酸アプタマーは、高親和性且つ選択性で所望の標的に結合するように工学操作された核酸分子である。それゆえ、核酸アプタマーは、当技術分野で公知の選択及び/又は富化技術を用いて所望のタイプのアミノ酸に選択的に結合するように工学操作されうる。そのため、いくつかの実施形態では、アフィニティー試薬は、核酸アプタマー(たとえば、DNAアプタマー、RNAアプタマー)を含む。図1Cに示されるように、いくつかの実施形態では、標識アフィニティー試薬は、1タイプの末端アミノ酸に選択的に結合する標識アプタマー104である。たとえば、いくつかの実施形態では、標識アプタマー104は、本明細書に記載されるように、ポリペプチドの末端の1タイプのアミノ酸(たとえば、単一タイプのアミノ酸又はアミノ酸のタイプのサブセット)に選択的に結合する。示されていないが、標識アプタマー104は、本願の方法に従ってポリペプチドのいずれかの位置(たとえば、ポリペプチドの末端位置又は末端位置及び内部位置)の1タイプのアミノ酸に選択的に結合するように工学操作されうることが認識されるべきである。
本明細書に記載の実施形態によれば、単一分子ポリペプチドシーケンシング方法は、励起光で表面固定ポリペプチドに照明することと、アミノ酸認識分子(たとえば標識アフィニティー試薬)に装着された標識により生成される発光を検出することと、により行うことが可能である。いくつかの場合には、標識により生成される放射及び/又は非放射減衰は、ポリペプチドに光損傷をもたらしうる。たとえば、図5Aは、表面に固定されたポリペプチドに認識分子が会合して示されるシーケンシング反応例を例示する。
A-(Y)n-D
(I)
(式中、Aは、少なくとも1つのアミノ酸認識分子を含むアミノ酸結合成分であり、Yの各々は、共有結合性又は非共有結合性連結基を形成するポリマーであり、nは、1~10(両端の値を含む)の整数であり、且つ、Dは、少なくとも1つの検出可能標識を含む標識成分である)
のアミノ酸認識分子を提供する。いくつかの実施形態では、本願は、式(I)の可溶性アミノ酸認識分子を含む組成物を提供する。
A-Y1-(Y)m-D又はA-(Y)m-Y1-D
(式中、Y1は、核酸又はポリペプチドであり、且つmは、0~10(両端の値を含む)の整数である)
の1つである。
A-(Y)m-Y2-D又はA-Y2-(Y)m-D
(式中、Y2は、ポリオール又はデンドリマーであり、且つmは、0~10(両端の値を含む)の整数である)
の1つである。いくつかの実施形態では、ポリオール又はデンドリマーは、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコール、ポリ(アミドアミン)、ポリ(プロピレンイミン)、ポリ(プロピレンアミン)、カルボシラン、ポリ(L-リシン)、又はそれらの1つ以上の組合せを含む。
A-Y1-D
(II)
(式中、Aは、少なくとも1つのアミノ酸認識分子を含むアミノ酸結合成分であり、Y1は、核酸又はポリペプチドであり、Dは、少なくとも1つの検出可能標識を含む標識成分である)
のアミノ酸認識分子を提供する。いくつかの実施形態では、Y1が核酸であるとき、核酸は、共有結合性又は非共有結合性連結基を形成する。いくつかの実施形態では、Y1がポリペプチドであるとき、ポリペプチドは、50×10-9M未満の解離定数(KD)により特徴付けられる非共有結合性連結基を形成する。
A-Y1-(Y)n-D又はA-(Y)n-Y1-D
(式中、Yの各々は、共有結合性又は非共有結合性連結基を形成するポリマーであり、且つnは、1~10(両端の値を含む)の整数である)
の1つである。いくつかの実施形態では、Yの各々は、独立して、バイオ分子、ポリオール、又はデンドリマーである。
いくつかの態様では、本願は、既知のポリペプチド配列に対応するユニーク組合せのアミノ酸を同定することによるポリペプチドのシーケンシング方法を提供する。たとえば、図6は、標識ポリペプチド600の標識アミノ酸を選択的に検出することによるシーケンシング方法を示す。いくつかの実施形態では、標識ポリペプチド600は、異なるアミノ酸タイプが異なる発光標識を含むように選択的に修飾されたアミノ酸を含む。本明細書で用いられる場合、とくに指定がない限り、標識ポリペプチドとは、1つ以上の選択的標識アミノ酸側鎖を含むポリペプチドを意味する。選択的標識化の方法並びに標識ポリペプチドの調製及び解析に関する詳細は、当技術分野で公知である(たとえば、スワミナサン(Swaminathan)ら著、プロス・コンピューテーショナル・バイオロジー(PLoS Comput Biol.)、2015年、第11巻、第2号、p.e1004080を参照されたい)。
ポリペプチドサンプルは、シーケンシング前に修飾可能である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドのN末端アミノ酸又はC末端アミノ酸を修飾可能である。図10Aは、タンパク質サンプルから末端修飾ポリペプチドを調製するための末端修飾の非限定的例を例示する。工程(1)では、タンパク質サンプル1000は、断片化されてポリペプチド断片1002を生成する。ポリペプチドは、対象ポリペプチドを切断(たとえば化学的に)及び/又は消化(たとえば、トリプシンなどのペプチダーゼを用いて酵素的に)することにより断片化可能である。断片化は、標識化の前又は後に実施可能である。いくつかの実施形態では、断片化は、全タンパク質の標識化後に実施される。1つ以上のアミノ酸は、切断の前又は後に標識されて標識ポリペプチドを生成可能である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、化学的又は酵素的断片化の後にサイズ選択される。いくつかの実施形態では、より小さなポリペプチド(たとえば<2kDa)は除去され、より大きなポリペプチドは配列解析のために保持される。サイズ選択は、ゲル濾過、SEC、透析、PAGEゲル抽出、マイクロ流体張力フローなどの技術又はいずれかの他の好適な技術を用いて達成可能である。工程(2)では、ポリペプチド断片1002のN末端又はC末端は、修飾されて末端修飾ポリペプチド1004を生成する。いくつかの実施形態では、修飾は、固定部分を付加することを含む。いくつかの実施形態では、修飾は、カップリング部分を付加することを含む。
本明細書で用いられる場合、発光標識とは、1つ以上の光子を吸収し且つ1つ以上の持続時間後に1つ以上の光子を後続的に放出しうる分子のことである。いくつかの実施形態では、この用語は、状況に依存して「標識」又は「発光分子」と同義的に用いられる。本明細書に記載されるある特定の実施形態に係る発光標識は、標識アフィニティー試薬の発光標識、標識ペプチダーゼ(たとえば、標識エキソペプチダーゼ、標識非特異的エキソペプチダーゼ)の発光標識、標識ペプチドの発光標識、標識補因子の発光標識、又は本明細書に記載の他の標識組成物を意味しうる。いくつかの実施形態では、本願に係る発光標識は、1つ以上の標識アミノ酸を含む標識ポリペプチドの標識アミノ酸を意味する。
omics)-601XL、ディオミクス(Dyomics)-605、ディオミクス(Dyomics)-610、ディオミクス(Dyomics)-615、ディオミクス(Dyomics)-630、ディオミクス(Dyomics)-631、ディオミクス(Dyomics)-632、ディオミクス(Dyomics)-633、ディオミクス(Dyomics)-634、ディオミクス(Dyomics)-635、ディオミクス(Dyomics)-636、ディオミクス(Dyomics)-647、ディオミクス(Dyomics)-647P1、ディオミクス(Dyomics)-648、ディオミクス(Dyomics)-648P1、ディオミクス(Dyomics)-649、ディオミクス(Dyomics)-649P1、ディオミクス(Dyomics)-650、ディオミクス(Dyomics)-651、ディオミクス(Dyomics)-652、ディオミクス(Dyomics)-654、ディオミクス(Dyomics)-675、ディオミクス(Dyomics)-676、ディオミクス(Dyomics)-677、ディオミクス(Dyomics)-678、ディオミクス(Dyomics)-679P1、ディオミクス(Dyomics)-680、ディオミクス(Dyomics)-681、ディオミクス(Dyomics)-682、ディオミクス(Dyomics)-700、ディオミクス(Dyomics)-701、ディオミクス(Dyomics)-703、ディオミクス(Dyomics)-704、ディオミクス(Dyomics)-730、ディオミクス(Dyomics)-731、ディオミクス(Dyomics)-732、ディオミクス(Dyomics)-734、ディオミクス(Dyomics)-749、ディオミクス(Dyomics)-749P1、ディオミクス(Dyomics)-750、ディオミクス(Dyomics)-751、ディオミクス(Dyomics)-752、ディオミクス(Dyomics)-754、ディオミクス(Dyomics)-776、ディオミクス(Dyomics)-777、ディオミクス(Dyomics)-778、ディオミクス(Dyomics)-780、ディオミクス(Dyomics)-781、ディオミクス(Dyomics)-782、ディオミクス(Dyomics)-800、ディオミクス(Dyomics)-831、eフルオル(eFluor)(登録商標)450、エオシン、FITC、フルオレセイン、ハイライト(HiLyte)(商標)フルオル(Fluor)405、ハイライト(HiLyte)(商標)フルオル(Fluor)488、ハイライト(HiLyte)(商標)フルオル(Fluor)532、ハイライト(HiLyte)(商標)フルオル(Fluor)555、ハイライト(HiLyte)(商標)フルオル(Fluor)594、ハイライト(HiLyte)(商標)フルオル(Fluor)647、ハイライト(HiLyte)(商標)フルオル(Fluor)680、ハイライト(HiLyte)(商標)フルオル(Fluor)750、IRダイ(IRDye)(登録商標)680LT、IRダイ(IRDye)(登録商標)750、IRダイ(IRDye)(登録商標)800CW、JOE、ライトサイクラー(LightCycler)(登録商標)640R、ライトサイクラー(LightCycler)(登録商標)レッド610、ライトサイクラー(LightCycler)(登録商標)レッド640、ライトサイクラー(LightCycler)(登録商標)レッド670、ライトサイクラー(LightCycler)(登録商標)レッド705、リサミンローダミンB、ナフトフルオレセイン、オレゴングリーン(Oregon Green)(登録商標)488、オレゴングリーン(Oregon Green)(登録商標)514、パシフィックブルー(Pacific Blue)(商標)、パシフィックグリーン(Pacific Green)(商標)、パシフィックオレンジ(Pacific Orange)(商標)、PET、PF350、PF405、PF415、PF488、PF505、PF532、PF546、PF555P、PF568、PF594、PF610、PF633P、PF647P、クエーサー(Quasar)(登録商標)570、クエーサー(Quasar)(登録商標)670、クエーサー(Quasar)(登録商標)705、ローダミン123、ローダミン6G、ローダミンB、ローダミングリーン、ローダミングリーン-X、ローダミンレッド、ROX、セタ(Seta)(商標)375、セタ(Seta)(商標)470、セタ(Seta)(商標)555、セタ(Seta)(商標)632、セタ(Seta)(商標)633、セタ(Seta)(商標)650、セタ(Seta)(商標)660、セタ(Seta)(商標)670、セタ(Seta)(商標)680、セタ(Seta)(商標)700、セタ(Seta)(商標)750、セタ(Seta)(商標)780、セタ(Seta)(商標)APC-780、セタ(Seta)(商標)PerCP-680、セタ(Seta)(商標)R-PE-670、セタ(Seta)(商標)646、セタウ(SeTau)380、セタウ(SeTau)425、セタウ(SeTau)647、セタウ(SeTau)405、スクエア(Square)635、スクエア(Square)650、スクエア(Square)660、スクエア(Square)672、スクエア(Square)680、スルホローダミン101、TAMRA、TET、テキサスレッド(Texas Red)(登録商標)、TMR、TRITC、ヤキマイエロー(Yakima Yellow)(商標)、ゼノン(Zenon)(登録商標)、Zy3、Zy5、Zy5.5、及びZy7の1つ以上から選択される色素を含む。
いくつかの態様では、本願は、発光標識の1つ以上の発光性に基づくポリペプチドシーケンシング及び/又は同定に関する。いくつかの実施形態では、発光標識は、発光寿命、発光強度、輝度、吸収スペクトル、発光スペクトル、発光量子収率、又はそれらの2つ以上の組合せに基づいて同定される。いくつかの実施形態では、複数のタイプの発光標識は、異なる発光寿命、発光強度、輝度、吸収スペクトル、発光スペクトル、発光量子収率、又はそれらの2つ以上の組合せに基づいて互いに識別可能である。同定することは、発光標識に会合する1タイプのアミノ酸(たとえば、単一タイプ又はタイプのサブセット)の厳密なアイデンティティー及び/又は量を割り当てることを意味しうるとともに、他のタイプのアミノ酸と比べてポリペプチド中のアミノ酸位置を割り当てることも意味しうる。
本願の態様は、ポリペプチドやタンパク質などの生体ポリマーのシーケンシングに関する。本明細書で用いられる場合、「シーケンシング」、「配列決定」、「配列を決定する」などの用語は、ポリペプチド又はタンパク質に関して、ポリペプチド又はタンパク質の部分配列情報さらには全配列情報の決定を含む。すなわち、この用語は、配列比較、フィンガープリンティング、確率的フィンガープリンティング、及び標的分子に関する同レベルの情報、さらには対象領域内の標的分子の各アミノ酸の明確な同定及び順序付けを含む。いくつかの実施形態では、この用語は、ポリペプチドの単一アミノ酸を同定することを含む。さらに他の実施形態では、ポリペプチドの1アミノ酸超が同定される。本明細書で用いられる場合、いくつかの実施形態では、「同定すること」、「アイデンティティーを決定すること」などの用語は、アミノ酸に関して、アミノ酸の明確なアイデンティティーの決定、さらにはアミノ酸の明確なアイデンティティーの確率の決定を含む。たとえば、いくつかの実施形態では、アミノ酸は、アミノ酸が特定のタイプである確率(たとえば0%~100%)を決定することにより、又は複数の特定のタイプの各々の確率を決定することにより、同定される。それゆえ、いくつかの実施形態では、本明細書で用いられる「アミノ酸配列」、「ポリペプチド配列」、及び「タンパク質配列」という用語は、ポリペプチド又はタンパク質の物質それ自体を意味しうるとともに、特定のポリペプチド又はタンパク質を生化学的に特徴付ける特定の配列情報(たとえば、一方の末端から他方の末端へのアミノ酸の順序を表す一連の文字)に制限されるものではない。
本出願の態様は、本明細書に記載のポリペプチドシーケンシング技術により発生したデータを解析するための計算技術に関する。以上で考察されるように、たとえば、図1A及び1Bとの関連では、これらのシーケンシング技術を用いて発生したデータは、シーケンスされるポリペプチドの末端に露出されるアミノ酸にアミノ酸認識分子が会合するインスタンスの指標となる一連のシグナルパルスを含みうる。一連のシグナルパルスは、分解プロセスが逐次アミノ酸を除去して進行するにつれて経時的にその時点の末端のアミノ酸のタイプに依存して、さまざまな1つ以上のフィーチャー(たとえば、パルス持続時間、パルス間持続時間、大きさの変化)を有しうる。得られるシグナルトレースは、それぞれのアミノ酸に関連付けられるさまざまな1つ以上のフィーチャーから生じる特性パターンを含みうる。本明細書に記載の計算技術は、アミノ酸配列を同定するためにこれらのシーケンシング技術を用いて得られるかかるデータを解析する部分として実現されうる。
水性緩衝液へのオリゴペプチドの溶解性の改善を試みて、ペプチド断片をオリゴヌクレオチドリンカーにコンジュゲートすることにより、水への溶解性を改善しうるとともに単一分子レベルでペプチドを表面固定するための機能部分も提供しうると判断された。さまざまなペプチド-リンカーコンジュゲートが合成され、ペプチド-DNAコンジュゲート及びペプチド-PEGコンジュゲートに関して構造例が図15Aに描かれる。リンカーコンジュゲーションは、評価されたさまざまなペプチド-リンカーコンジュゲートの各々で水性溶液へのペプチドの溶解性を大きく増強することが観測された。
各種アミノペプチダーゼの切断能力を試験した。切断アッセイ実験のセットの条件及び結果は、ペプチド基質の濃度、酵素の濃度、緩衝液条件、温度、及びインキュベーション時間を含めて、表7に示される。高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いて、指示酵素によるペプチド基質の切断をアッセイした。表7の「HPLCアッセイ変換率」値は、切断産物に変換されたペプチド基質のパーセントを表す。「HPLCアッセイ変換率」値を決定するために、同一開始濃度のペプチドを含有する2つ溶液を調製した。一方の溶液は酵素消化に付され、他方の溶液はいずれの酵素も含有していなかったが、酵素を貯蔵するために使用した等価量の緩衝液で希釈された。反応は、指示された時間でクエンチされた。産物に変換された反応体の量は、酵素消化後に残留する出発材料のHPLCにより得られたピーク面積を未消化ペプチドの対照溶液のピーク面積で除算してからこの比に100を乗算することにより決定された。表7中、「NH2」はアミン基を表し、「yPIP」はY.ペスティス(pestis)プロリンイミノペプチダーゼを意味し、「NPEPPS」はピューロマイシン感受性アミノペプチダーゼを意味し、「VPr」はビブリオ・プロテオリティカス(Vibrio proteolyticus)アミノペプチダーゼを意味し、且つ「EDAPN」はL.ニューモフィラ(L.pneumophila)M1アミノペプチダーゼを意味する。
固定ペプチドのオンチップアミノ酸切断のアッセイは、標識ペプチドコンジュゲートを用いて開発された。アッセイは、固定ペプチドに対するエキソペプチダーゼの酵素認識及び切断活性を決定する方法を提供するように設計された。これは速度論的結合パラメータ及び一般的結合アフィニティーの測定を可能にしうる。
N末端芳香族残基を検出するために、標識アフィニティー試薬として使用するための潜在的候補として、タンパク質分解経路に関与するアダプタータンパク質を同定した。α-プロテオバクテリア(A.ツメファシエンス(A.tumefaciens))由来のアダプタータンパク質ClpS2を発現し、露出されたシステイン残基に標識した。図19Aは、スティックとして示される露出されたシステイン残基と共にClpS2タンパク質の結晶構造を示す。露出されたシステイン残基は、ローダミン色素(アトー(ATTO)532)で標識された。
進行中の分解反応時のN末端アミノ酸認識によるペプチドシーケンシングを評価するために実験を行った。これらの実験の結果例は、図20A~20Dに示されており、これらは、同一反応混合物で標識ClpS2タンパク質及びアミノペプチダーゼを用いてリアルタイムで行われた2つの独立したポリペプチドシーケンシング反応により得られた単一分子強度トレースを示す。各反応では、配列YAAWAAFADDDWK(配列番号78)のポリペプチドは、チップ上にペプチド組成物(10pM)を20分間ロードすることによりC末端リシン残基を介してチップ表面に固定され、且つ固定されたペプチドは、標識アフィニティー試薬(500nMのアトー(ATTO)542標識A.ツメファシエンス(A.tumefaciens)ClpS2-V1)及びアミノペプチダーゼ切断試薬(8μMのVPr)の存在下でモニターされた。
ペプチドの末端アミノ酸を同定することと、ペプチドから末端アミノ酸を切断することと、の両方が可能な単一試薬の可能性を調べるために、試験を実施した。単一試薬として、エキソペプチダーゼは、末端残基に対する切断活性を保持しつつペプチドに結合可能でなければならない。それゆえ、異なるエキソペプチダーゼの天然の表面露出アミノ酸に的を絞ることにより、伝統的標識化ストラテジーを利用する初期のアプローチを行った。これらの実験では、エキソペプチダーゼ標識化のためのロバストな方法であることがと証明された蛍光色素で、表面露出システイン(-SH)又はリシン(-NH2)残基を標識した。しかしながら、ある特定の場合には、このアプローチは、1つ以上の色素で標識されるタンパク質の不均一集団を生成した。
特異的翻訳後修飾を含有するアミノ酸の認識を評価するために、実験を実施した。リン酸化チロシン残基に対する潜在的認識分子として、FynチロシンキナーゼのSrc相同性2(SH2)ドメインの三重突然変異型変異体(T8V、S10A、K15L)をペプチドシーケンシングで試験した。変異体タンパク質をサンプルウェルのボトムに固定し、N末端ホスホチロシンを含有する蛍光標識ペプチドを添加し、単一分子シグナルトレースを収集した。図22Aの代表的トレースより示されるように、これらの実験時、固定タンパク質によるペプチド結合が検出された。これらの実験時に収集されたパルス持続時間データは、図22Bに示される(トップ、中間、及びボトムのプロットは、それぞれ、図22Aのトップ、中間、及びボトムのトレースに対応する)。パルス持続時間及びパルス間持続時間の統計は、図22Cに示される(それぞれ、トップ及びボトムのパネル)。
A.ツメファシエンス(A.tumefaciens)ClpS2-V1のパルス持続時間に及ぼすペナルティメートアミノ酸の影響を決定するために、実験を実施した。N末端にユニークジペプチド配列を含有する49の異なる蛍光標識ペプチドを調製した。ただし、N末端アミノ酸は、F、W、又はYであり、且つペナルティメート位置は、20種の天然アミノ酸の1つであった。各実験では、ClpS2-V1をサンプルウェルのボトムに固定し、蛍光標識ペプチドの1つを添加して一分子シグナルトレースを10~20分間収集した。各ペプチドに対しては最小でも50のサンプルウェルで、パルス持続時間データを収集した。
1つ超の標識認識分子による固定ペプチドの末端アミノ酸認識を実証するために、単一分子ペプチド認識実験を実施した。N末端フェニルアラニンを含有する単一ペプチド分子(FYPLPWPDDDY(配列番号79))をチップのサンプルウェル内に固定した。各500nMのatClpS1(アグロバクテリウム・ツミファシエンス(Agrobacterium tumifaciens)ClpS1、表1に提供される配列)及びatClpS2-V1(アグロバクテリウム・ツミファシエンス(Agrobacterium tumifaciens)ClpS2変異体1、表1に提供される配列)を含有する緩衝液を添加した。ただし、atClpS1及びatClpS2-V1は、それぞれ、Cy3及びCy3Bで標識された。Cy3Bの強度はCy3よりも高いので、atClpS2-V1結合イベントは、atClpS1結合イベントから容易に区別可であった。
単一分子シーケンシング時の固定ペプチドの光安定性を評価するために、実験を実施した。アトー(ATTO)532からの放出により認識をモニターするために、532nmの励起光の存在下で固定ペプチド基質を含有するサンプルウェルに実施例5に記載の色素標識atClpS2-V1を添加した。代表的トレースは図25Aに示される。トップパネルに示されるように、認識は、実験を始めてからおおよそ600秒間で中止されることが観測された。ボトムパネルは、反応を始めてからおおよそ180~430秒間のシグナルパルスを示す拡大図である。
単一分子ペプチドシーケンシング反応混合物中での差次的切断特異性を有する複数のタイプのエキソペプチダーゼの使用を評価するために、実験を実施した。チップのサンプルウェル内にC末端リシン残基を介して単一ペプチド分子(YAAWAAFADDDWK(配列番号78))を固定した。アミノ酸認識用のatClpS2-V1とアミノ酸切断用のhTETとを含有する緩衝液を添加した。代表的トレースは図28Aに提示され、パルスパターン領域の拡大図が図28Bに示される。
請求項では、「a」、「an」、及び「the」などの冠詞は、相反する指示がない限り又はとくに文脈から自明でない限り、1つ又は2つ以上を意味しうる。グループの1つ以上のメンバー間に「or(又は)」を含む請求項又は説明は、相反する指示がない限り又はとくに文脈から自明でない限り、グループメンバーの1つ、2つ以上、又はすべてが所与のプロダクト又はプロセスに存在するか、利用されるか、又は他の形で関連する場合、満足されるとみなされる。本発明は、グループの厳密に1つのメンバーが所与のプロダクト又はプロセスに存在するか、利用されるか、又は他の形で関連する実施形態を含む。本発明は、グループメンバーの2つ以上又はすべてが所与のプロダクト又はプロセスに存在するか、利用されるか、又は他の形で関連する実施形態を含む。
Claims (283)
- ポリペプチドの分解プロセス時のデータを得ることと、
前記分解プロセス時に前記ポリペプチドの末端に逐次露出されるアミノ酸に対応する前記データの部分を決定するように前記データを解析することと、
前記ポリペプチドに相当するアミノ酸配列を出力することと、
を含む方法。 - 前記データが、前記分解プロセス時の前記ポリペプチドの末端のアミノ酸アイデンティティーの指標である、請求項1に記載の方法。
- 前記データが、前記分解プロセス時に前記末端の異なるタイプの末端アミノ酸に結合する1つ以上のアミノ酸認識分子により生成されるシグナルの指標である、請求項2に記載の方法。
- 前記データが前記分解プロセス時に発生する発光シグナルの指標である、請求項1に記載の方法。
- 前記データが前記分解プロセス時に発生する電気シグナルの指標である、請求項1に記載の方法。
- 前記データを解析することが、一連の切断イベントを検出することと、逐次切断イベント間のデータの部分を決定することと、をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記データを解析することが、前記個別部分の各々に対してアミノ酸のタイプを決定することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記個別部分の各々がパルスパターンを含み、且つ前記データを解析することが、そのそれぞれのパルスパターンに基づいて1つ以上の前記部分に対してアミノ酸のタイプを決定することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記アミノ酸のタイプを決定することが、前記データが閾値超であるときの部分内の時間量を同定することと、前記部分に対して前記時間量と持続時間とを比較することと、をさらに含む、請求項8に記載の方法。
- 前記アミノ酸のタイプを決定することが、前記1つ以上の部分の各々に対して少なくとも1つのパルス持続時間を同定することをさらに含む、請求項8に記載の方法。
- 前記アミノ酸のタイプを決定することが、前記1つ以上の部分の各々に対して少なくとも1つのパルス間持続時間を同定することをさらに含む、請求項8に記載の方法。
- 前記アミノ酸配列が、前記部分に対応する一連のアミノ酸を含む、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも1つのハードウェアプロセッサーと、
前記少なくとも1つのハードウェアプロセッサーによる実行時に前記少なくとも1つのハードウェアプロセッサーに請求項1~12のいずれか一項に記載の方法を実施させるプロセッサー実行可能命令を記憶する少なくとも1つの非一時コンピュータ可読記憶媒体と、
を含むシステム。 - 少なくとも1つのハードウェアプロセッサーによる実行時に前記少なくとも1つのハードウェアプロセッサーに請求項1~12のいずれか一項に記載の方法を実施させるプロセッサー実行可能命令を記憶する少なくとも1つの非一時コンピュータ可読記憶媒体。
- ポリペプチドシーケンシング方法であって、前記方法は、
単一ポリペプチド分子と1つ以上の末端アミノ酸認識分子とを接触させることと、
前記1つ以上の末端アミノ酸認識分子と、前記単一ポリペプチドが分解されている間に前記単一ポリペプチド分子の末端に露出される逐次アミノ酸と、の会合の指標となる一連のシグナルパルスを検出することにより、前記単一ポリペプチド分子をシーケンスすることと、
を含む方法。 - 前記1つ以上の末端アミノ酸認識分子と前記末端に露出される各タイプのアミノ酸との会合が、前記末端に露出される他のタイプのアミノ酸とは異なる前記一連のシグナルパルスの特性パターンを生成する、請求項15に記載の方法。
- 前記特性パターンが前記一連のシグナルパルスの一部分を含む、請求項16に記載の方法。
- 前記特性パターンのシグナルパルスが、末端アミノ酸認識分子と前記末端に露出されるアミノ酸との間の個別会合イベントに対応する、請求項17に記載の方法。
- 前記特性パターンの前記シグナルパルスが、前記末端アミノ酸認識分子と前記末端に露出される前記アミノ酸との間の結合の解離速度に特有なパルス持続時間を含む、請求項18に記載の方法。
- 前記特性パターンの各シグナルパルスが、末端アミノ酸認識分子結合の会合速度に特有なパルス間持続時間により他のものから分離される、請求項19に記載の方法。
- 前記特性パターンが、前記単一ポリペプチド分子の末端に露出される前記アミノ酸との一連の可逆末端アミノ酸認識分子結合相互作用に対応する、請求項16~20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記一連の可逆末端アミノ酸認識分子結合相互作用が、前記単一ポリペプチド分子の末端での1つの二元複合体種の可逆形成を含む、請求項21に記載の方法。
- 前記一連の可逆末端アミノ酸認識分子結合相互作用が、前記単一ポリペプチド分子の末端での異なる二元複合体種の可逆形成を含む、請求項21に記載の方法。
- 前記特性パターンが、前記単一ポリペプチド分子の末端に露出される前記アミノ酸及び連続位置のアミノ酸の指標となる、請求項16~23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記末端に露出されるアミノ酸及び前記連続位置のアミノ酸が異なるタイプである、請求項24に記載の方法。
- シーケンシングが、前記単一ポリペプチドが分解されている間に前記単一ポリペプチドの末端に露出される各タイプの逐次アミノ酸を同定することを含む、請求項15~25のいずれか一項に記載の方法。
- シーケンシングが、前記単一ポリペプチドが分解されている間に前記単一ポリペプチドの末端に露出されるすべてのタイプの逐次アミノ酸の一部分を同定することを含む、請求項15~25のいずれか一項に記載の方法。
- シーケンシングが、前記単一ポリペプチドが分解されている間に前記単一ポリペプチドの末端に露出される逐次アミノ酸の相対位置を決定することを含む、請求項15~27のいずれか一項に記載の方法。
- シーケンシングが、前記単一ポリペプチド分子の少なくとも2つの連続アミノ酸を同定することを含む、請求項15~28のいずれか一項に記載の方法。
- シーケンシングが、前記単一ポリペプチド分子の少なくとも2つの非連続アミノ酸を同定することを含む、請求項15~29のいずれか一項に記載の方法。
- シーケンシングが、天然に存在するアミノ酸、非天然アミノ酸、又はそれらの修飾変異体として、前記末端に露出されるアミノ酸を同定することを含む、請求項15~30のいずれか一項に記載の方法。
- シーケンシングが、荷電、非荷電、極性、非極性、疎水性、芳香族、又はそれらの組合せの側鎖を有するものとして、前記末端に露出されるアミノ酸を同定することを含む、請求項15~31のいずれか一項に記載の方法。
- 前記側鎖が負荷電又は正荷電である、請求項32に記載の方法。
- シーケンシングが、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セレノシステイン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンから選択される1タイプとして、前記末端に露出されるアミノ酸を同定することを含む、請求項15~33のいずれか一項に記載の方法。
- シーケンシングが、翻訳後修飾を有するものとして、前記末端に露出されるアミノ酸を同定することとを含む、請求項15~34のいずれか一項に記載の方法。
- 前記翻訳後修飾が、アセチル化、ADPリボシル化、カスパーゼ切断、シトルリン化、ホルミル化、N連結グリコシル化、O連結グリコシル化、ヒドロキシル化、メチル化、ミリストイル化、NEDD化、ニトロ化、酸化、パルミトイル化、リン酸化、プレニル化、S-ニトロシル化、硫酸化、SUMO化及びユビキチン化から選択される、請求項35に記載の方法。
- 前記一連のシグナルパルスが、光学シグナルの大きさの一連の変化を経時的に含む、請求項15~36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記一連の各シグナルパルスが複数の光子放出イベントを含む、請求項37に記載の方法。
- シーケンシングが、発光寿命、発光輝度、発光強度、発光波長、発光偏光、及び発光量子収率の1つ以上を決定することをさらに含む、請求項38に記載の方法。
- 前記一連のシグナルパルスが、電気シグナルの大きさの一連の変化を経時的に含む、請求項15~39のいずれか一項に記載の方法。
- 前記一連のシグナルパルスが、可逆単一分子結合相互作用に対応する伝導率遷移を含む、請求項40に記載の方法。
- 前記1つ以上の末端アミノ酸認識分子の各々が認識タンパク質又は認識核酸を含む、請求項15~41のいずれか一項に記載の方法。
- 前記認識タンパク質が、分解経路タンパク質、ペプチダーゼ、抗体、アミノトランスフェラーゼ、tRNAシンテターゼ、若しくはSH2ドメイン含有タンパク質、又はそれらの断片である、請求項42に記載の方法。
- 前記分解経路タンパク質が、N末端則経路タンパク質又はその突然変異体若しくは変異体である、請求項43に記載の方法。
- 前記N末端則経路タンパク質が、Arg/N末端則経路タンパク質、Ac/N末端則経路タンパク質、又はPro/N末端則経路タンパク質である、請求項44に記載の方法。
- 前記N末端則経路タンパク質が、Gidタンパク質、UBRボックスタンパク質若しくはそのUBRボックスドメイン含有断片、p62タンパク質若しくはそのZZドメイン含有断片、又はClpSタンパク質である、請求項45に記載の方法。
- 前記Gidタンパク質が、S.セレビシエ(S.cerevisiae)又はその相同種由来のGid4又はGid10である、請求項46に記載の方法。
- 前記UBRボックスタンパク質が、ヒト、S.セレビシエ(S.cerevisiae)、又はそれらの相同種由来のUBR1又はUBR2である、請求項46に記載の方法。
- 前記p62タンパク質が、ヒト、ラット、又はそれらの相同種由来のp62である、請求項46に記載の方法。
- 前記ClpSタンパク質が、A.ツミファシエンス(A.tumifaciens)、C.クレセンタス(C.crescentus)、E.コリ(E.coli)、S.エロンガタス(elongatus)、P.ファルシパルム(P.falciparum)、T.エロンガタス(elongatus)、又はそれらの相同種由来のClpS1又はClpS2である、請求項46に記載の方法。
- 前記認識タンパク質が合成タンパク質又は組換えタンパク質である、請求項42~50のいずれか一項に記載の方法。
- 前記認識核酸が核酸アプタマーである、請求項42に記載の方法。
- 前記1つ以上の末端アミノ酸認識分子の各々が検出可能標識を含む、請求項15~52のいずれか一項に記載の方法。
- 前記検出可能標識が発光標識又は伝導率標識である、請求項53に記載の方法。
- 前記単一ポリペプチド分子が表面に固定される、請求項15~54のいずれか一項に記載の方法。
- 前記単一ポリペプチド分子が、前記1つ以上の末端アミノ酸認識分子が会合する前記末端の遠位にある末端を介して表面に固定される、請求項55に記載の方法。
- 前記単一ポリペプチド分子がカルボキシ末端を介して固定される、請求項55に記載の方法。
- 前記単一ポリペプチド分子がアミノ末端を介して固定される、請求項55に記載の方法。
- 前記単一ポリペプチド分子がリンカーを介して前記表面に固定される、請求項55~58のいずれか一項に記載の方法。
- 前記リンカーがバイオ分子を含み、任意選択的に前記バイオ分子がオリゴヌクレオチドである、請求項59に記載の方法。
- 前記単一ポリペプチド分子が、前記単一ポリペプチド分子の末端から1つ以上のアミノ酸を除去する切断試薬により分解される、請求項15~60のいずれか一項に記載の方法。
- 前記切断試薬と前記末端との会合の指標となるシグナルを検出することをさらに含む、請求項61に記載の方法。
- 前記切断試薬が検出可能標識を含む、請求項61又は62に記載の方法。
- 前記検出可能標識が発光標識又は伝導率標識である、請求項63に記載の方法。
- 前記一連のシグナルパルスが一連のリアルタイムシグナルパルスである、請求項15~64のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも1つのハードウェアプロセッサーと、
前記少なくとも1つのハードウェアプロセッサーによる実行時に前記少なくとも1つのハードウェアプロセッサーに請求項15~65のいずれか一項に記載の方法を実施させるプロセッサー実行可能命令を記憶する少なくとも1つの非一時コンピュータ可読記憶媒体と、
を含むシステム。 - 少なくとも1つのハードウェアプロセッサーによる実行時に前記少なくとも1つのハードウェアプロセッサーに請求項15~65のいずれか一項に記載の方法を実施させるプロセッサー実行可能命令を記憶する少なくとも1つの非一時コンピュータ可読記憶媒体。
- ポリペプチドのシーケンシング方法であって、前記方法は、
反応混合物中の単一ポリペプチド分子と、1つ以上の末端アミノ酸認識分子と切断試薬とを含む組成物と、を接触させることと、
前記切断試薬の存在下で前記1つ以上の末端アミノ酸認識分子と前記単一ポリペプチド分子の末端との会合の指標となる一連のシグナルパルスを検出することであって、前記一連のシグナルパルスが、前記切断試薬による末端アミノ酸切断の結果として経時的に末端に露出される一連のアミノ酸の指標となる、検出することと、
を含む方法。 - 前記1つ以上の末端アミノ酸認識分子と前記末端に露出される各タイプのアミノ酸との会合が、前記末端に露出される他のタイプのアミノ酸とは異なる前記一連のシグナルパルスの特性パターンを生成する、請求項68に記載の方法。
- 前記特性パターンが前記一連のシグナルパルスの一部分を含む、請求項69に記載の方法。
- 前記特性パターンのシグナルパルスが、末端アミノ酸認識分子と前記末端に露出されるアミノ酸との間の個別会合イベントに対応する、請求項70に記載の方法。
- 前記特性パターンの前記シグナルパルスが、前記末端アミノ酸認識分子と前記末端に露出される前記アミノ酸との間の結合の解離速度に特有なパルス持続時間を含む、請求項71に記載の方法。
- 前記特性パターンの各シグナルパルスが、末端アミノ酸認識分子結合の会合速度に特有なパルス間持続時間により他のものから分離される、請求項72に記載の方法。
- 前記特性パターンが、前記単一ポリペプチド分子の末端に露出される前記アミノ酸との一連の可逆末端アミノ酸認識分子結合相互作用に対応する、請求項69~73のいずれか一項に記載の方法。
- 前記一連の可逆末端アミノ酸認識分子結合相互作用が、前記単一ポリペプチド分子の末端での1つの二元複合体種の可逆形成を含む、請求項74に記載の方法。
- 前記一連の可逆末端アミノ酸認識分子結合相互作用が、前記単一ポリペプチド分子の末端での異なる二元複合体種の可逆形成を含む、請求項74に記載の方法。
- 前記特性パターンが、前記単一ポリペプチド分子の末端に露出される前記アミノ酸及び連続位置のアミノ酸の指標となる、請求項69~76のいずれか一項に記載の方法。
- 前記末端に露出されるアミノ酸及び前記連続位置のアミノ酸が異なるタイプである、請求項77に記載の方法。
- シーケンシングが、前記単一ポリペプチドが分解されている間に前記単一ポリペプチドの末端に露出される各タイプの逐次アミノ酸を同定することを含む、請求項68~78のいずれか一項に記載の方法。
- シーケンシングが、前記単一ポリペプチドが分解されている間に前記単一ポリペプチドの末端に露出されるすべてのタイプの逐次アミノ酸の一部分を同定することを含む、請求項68~78のいずれか一項に記載の方法。
- シーケンシングが、前記単一ポリペプチドが分解されている間に前記単一ポリペプチドの末端に露出される逐次アミノ酸の相対位置を決定することを含む、請求項68~80のいずれか一項に記載の方法。
- シーケンシングが、前記単一ポリペプチド分子の少なくとも2つの連続アミノ酸を同定することを含む、請求項68~81のいずれか一項に記載の方法。
- シーケンシングが、前記単一ポリペプチド分子の少なくとも2つの非連続アミノ酸を同定することを含む、請求項68~82のいずれか一項に記載の方法。
- シーケンシングが、天然に存在するアミノ酸、非天然アミノ酸、又はそれらの修飾変異体として、前記末端に露出されるアミノ酸を同定することを含む、請求項68~83のいずれか一項に記載の方法。
- シーケンシングが、荷電、非荷電、極性、非極性、疎水性、芳香族、又はそれらの組合せの側鎖を有するものとして、前記末端に露出されるアミノ酸を同定することを含む、請求項68~84のいずれか一項に記載の方法。
- 前記側鎖が負荷電又は正荷電である、請求項85に記載の方法。
- シーケンシングが、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セレノシステイン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンから選択される1タイプとして、前記末端に露出されるアミノ酸を同定することを含む、請求項68~86のいずれか一項に記載の方法。
- シーケンシングが、翻訳後修飾を有するものとして、前記末端に露出されるアミノ酸を同定することとを含む、請求項68~87のいずれか一項に記載の方法。
- 前記翻訳後修飾が、アセチル化、ADPリボシル化、カスパーゼ切断、シトルリン化、ホルミル化、N連結グリコシル化、O連結グリコシル化、ヒドロキシル化、メチル化、ミリストイル化、NEDD化、ニトロ化、酸化、パルミトイル化、リン酸化、プレニル化、S-ニトロシル化、硫酸化、SUMO化及びユビキチン化から選択される、請求項88に記載の方法。
- 前記一連のシグナルパルスが、光学シグナルの大きさの一連の変化を経時的に含む、請求項68~89のいずれか一項に記載の方法。
- 前記一連の各シグナルパルスが複数の光子放出イベントを含む、請求項90に記載の方法。
- シーケンシングが、発光寿命、発光輝度、発光強度、発光波長、発光分極、及び発光量子収率の1つ以上を決定することをさらに含む、請求項91に記載の方法。
- 前記一連のシグナルパルスが、電気シグナルの大きさの一連の変化を経時的に含む、請求項68~92のいずれか一項に記載の方法。
- 前記一連のシグナルパルスが、可逆単一分子結合相互作用に対応する伝導率遷移を含む、請求項93に記載の方法。
- 前記1つ以上の末端アミノ酸認識分子の各々が認識タンパク質又は認識核酸を含む、請求項68~94のいずれか一項に記載の方法。
- 前記認識タンパク質が、分解経路タンパク質、ペプチダーゼ、抗体、アミノトランスフェラーゼ、tRNAシンテターゼ、若しくはSH2ドメイン含有タンパク質、又はそれらの断片である、請求項95に記載の方法。
- 前記分解経路タンパク質が、N末端則経路タンパク質又はその突然変異体若しくは変異体である、請求項96に記載の方法。
- 前記N末端則経路タンパク質が、Arg/N末端則経路タンパク質、Ac/N末端則経路タンパク質、又はPro/N末端則経路タンパク質である、請求項97に記載の方法。
- 前記N末端則経路タンパク質が、Gidタンパク質、UBRボックスタンパク質若しくはそのUBRボックスドメイン含有断片、p62タンパク質若しくはそのZZドメイン含有断片、又はClpSタンパク質である、請求項98に記載の方法。
- 前記Gidタンパク質が、S.セレビシエ(S.cerevisiae)又はその相同種由来のGid4又はGid10である、請求項99に記載の方法。
- 前記UBRボックスタンパク質が、ヒト、S.セレビシエ(S.cerevisiae)、又はそれらの相同種由来のUBR1又はUBR2である、請求項99に記載の方法。
- 前記p62タンパク質が、ヒト、ラット、又はそれらの相同種由来のp62である、請求項99に記載の方法。
- 前記ClpSタンパク質が、A.ツミファシエンス(A.tumifaciens)、C.クレセンタス(C.crescentus)、E.コリ(E.coli)、S.エロンガタス(elongatus)、P.ファルシパルム(P.falciparum)、T.エロンガタス(elongatus)、又はそれらの相同種由来のClpS1又はClpS2である、請求項99に記載の方法。
- 前記認識タンパク質が合成タンパク質又は組換えタンパク質である、請求項95~103のいずれか一項に記載の方法。
- 前記認識核酸が核酸アプタマーである、請求項95に記載の方法。
- 前記1つ以上の末端アミノ酸認識分子の各々が検出可能標識を含む、請求項68~105のいずれか一項に記載の方法。
- 前記検出可能標識が発光標識又は伝導率標識である、請求項106に記載の方法。
- 前記単一ポリペプチド分子が表面に固定される、請求項68~107のいずれか一項に記載の方法。
- 前記単一ポリペプチド分子が、前記1つ以上の末端アミノ酸認識分子が会合する前記末端の遠位にある末端を介して前記表面に固定される、請求項108に記載の方法。
- 前記単一ポリペプチド分子がカルボキシ末端を介して固定される、請求項108に記載の方法。
- 前記単一ポリペプチド分子がアミノ末端を介して固定される、請求項108に記載の方法。
- 前記単一ポリペプチド分子がリンカーを介して前記表面に固定される、請求項108~111のいずれか一項に記載の方法。
- 前記リンカーがバイオ分子を含み、任意選択的に前記バイオ分子がオリゴヌクレオチドである、請求項112に記載の方法。
- 前記切断試薬と前記末端との会合の指標となるシグナルを検出することをさらに含む、請求項68~113のいずれか一項に記載の方法。
- 前記切断試薬が検出可能標識を含む、請求項68~114のいずれか一項に記載の方法。
- 前記検出可能標識が発光標識又は伝導率標識である、請求項115に記載の方法。
- 前記一連のシグナルパルスが一連のリアルタイムシグナルパルスである、請求項68~116のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも1つのハードウェアプロセッサーと、
前記少なくとも1つのハードウェアプロセッサーによる実行時に前記少なくとも1つのハードウェアプロセッサーに請求項68~117のいずれか一項に記載の方法を実施させるプロセッサー実行可能命令を記憶する少なくとも1つの非一時コンピュータ可読記憶媒体と、
を含むシステム。 - 少なくとも1つのハードウェアプロセッサーによる実行時に前記少なくとも1つのハードウェアプロセッサーに請求項68~117のいずれか一項に記載の方法を実施させるプロセッサー実行可能命令を記憶する少なくとも1つの非一時コンピュータ可読記憶媒体。
- ポリペプチドシーケンシング方法であって、
a)単一ポリペプチド分子の末端の第1のアミノ酸を同定することと、
b)前記第1のアミノ酸を除去して前記単一ポリペプチド分子の末端に第2のアミノ酸を露出させることと、
c)前記単一ポリペプチド分子の末端の前記第2のアミノ酸を同定することと、
を含み、
(a)~(c)が単一反応混合物中で実施される、方法。 - (a)~(c)が逐次行われる、請求項120に記載の方法。
- (c)が(a)及び(b)の前に行われる、請求項120に記載の方法。
- 前記単一反応混合物が1つ以上の末端アミノ酸認識分子を含む、請求項120~122のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1及び第2のアミノ酸が、前記1つ以上の末端アミノ酸認識分子と前記単一ポリペプチド分子の末端との会合の指標となる一連のシグナルパルスを検出することにより同定される、請求項123に記載の方法。
- 前記1つ以上の末端アミノ酸認識分子と前記第1のアミノ酸との会合が、前記第2のアミノ酸とは異なる一連のシグナルパルスの特性パターンを生成する、請求項124に記載の方法。
- 前記1つ以上の末端アミノ酸認識分子の各々が認識タンパク質又は認識核酸を含む、請求項120~125のいずれか一項に記載の方法。
- 前記認識タンパク質が、分解経路タンパク質、ペプチダーゼ、抗体、アミノトランスフェラーゼ、tRNAシンテターゼ、若しくはSH2ドメイン含有タンパク質、又はそれらの断片である、請求項126に記載の方法。
- 前記分解経路タンパク質が、N末端則経路タンパク質又はその突然変異体若しくは変異体である、請求項127に記載の方法。
- 前記N末端則経路タンパク質が、Arg/N末端則経路タンパク質、Ac/N末端則経路タンパク質、又はPro/N末端則経路タンパク質である、請求項128に記載の方法。
- 前記N末端則経路タンパク質が、Gidタンパク質、UBRボックスタンパク質若しくはそのUBRボックスドメイン含有断片、p62タンパク質若しくはそのZZドメイン含有断片、又はClpSタンパク質である、請求項129に記載の方法。
- 前記Gidタンパク質が、S.セレビシエ(S.cerevisiae)又はその相同種由来のGid4又はGid10である、請求項130に記載の方法。
- 前記UBRボックスタンパク質が、ヒト、S.セレビシエ(S.cerevisiae)、又はそれらの相同種由来のUBR1又はUBR2である、請求項130に記載の方法。
- 前記p62タンパク質が、ヒト、ラット、又はそれらの相同種由来のp62である、請求項130に記載の方法。
- 前記ClpSタンパク質が、A.ツミファシエンス(A.tumifaciens)、C.クレセンタス(C.crescentus)、E.コリ(E.coli)、S.エロンガタス(elongatus)、P.ファルシパルム(P.falciparum)、T.エロンガタス(elongatus)、又はそれらの相同種由来のClpS1又はClpS2である、請求項130に記載の方法。
- 前記認識タンパク質が合成タンパク質又は組換えタンパク質である、請求項126~134のいずれか一項に記載の方法。
- 前記認識核酸が核酸アプタマーである、請求項126に記載の方法。
- 前記1つ以上の末端アミノ酸認識分子の各々が検出可能標識を含む、請求項120~136のいずれか一項に記載の方法。
- 前記検出可能標識が発光標識又は伝導率標識である、請求項137に記載の方法。
- 前記単一反応混合物が、前記単一ポリペプチド分子の末端から1つ以上のアミノ酸を除去する切断試薬を含む、請求項120~138のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のアミノ酸が前記切断試薬により除去される、請求項139に記載の方法。
- 前記切断試薬が検出可能標識を含む、請求項139又は140に記載の方法。
- 前記検出可能標識が発光標識又は伝導率標識である、請求項141に記載の方法。
- 前記単一ポリペプチド分子が表面に固定される、請求項120~142のいずれか一項に記載の方法。
- 前記単一ポリペプチド分子が、前記第1のアミノ酸が除去される末端の遠位にある末端を介して前記表面に固定される、請求項143に記載の方法。
- 前記単一ポリペプチド分子がカルボキシ末端を介して固定される、請求項143に記載の方法。
- 前記単一ポリペプチド分子がアミノ末端を介して固定される、請求項143に記載の方法。
- 前記単一ポリペプチド分子がリンカーを介して前記表面に固定される、請求項143~146のいずれか一項に記載の方法。
- 前記リンカーがバイオ分子を含み、任意選択的に前記バイオ分子がオリゴヌクレオチドである、請求項147に記載の方法。
- 前記一連のシグナルパルスが一連のリアルタイムシグナルパルスである、請求項124~148のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも1つのハードウェアプロセッサーと、
前記少なくとも1つのハードウェアプロセッサーによる実行時に前記少なくとも1つのハードウェアプロセッサーに請求項120~149のいずれか一項に記載の方法を実施させるプロセッサー実行可能命令を記憶する少なくとも1つの非一時コンピュータ可読記憶媒体と、
を含むシステム。 - 少なくとも1つのハードウェアプロセッサーによる実行時に前記少なくとも1つのハードウェアプロセッサーに請求項120~149のいずれか一項に記載の方法を実施させるプロセッサー実行可能命令を記憶する少なくとも1つの非一時コンピュータ可読記憶媒体。
- ポリペプチドのアミノ酸を同定する方法であって、前記方法は、
単一ポリペプチド分子と前記単一ポリペプチド分子に結合する1つ以上のアミノ酸認識分子とを接触させることと、
ポリペプチド分解条件下で前記1つ以上のアミノ酸認識分子と前記単一ポリペプチド分子との会合の指標となる一連のシグナルパルスを検出することと、
前記一連のシグナルパルスの第1の特性パターンに基づいて前記単一ポリペプチド分子の第1のタイプのアミノ酸を同定することと、
を含む方法。 - 前記第1の特性パターンが前記一連のシグナルパルスの少なくとも一部分を含む、請求項152に記載の方法。
- 前記第1の特性パターンのシグナルパルスが、アミノ酸認識分子と前記第1のタイプのアミノ酸との間の個別会合イベントに対応する、請求項153に記載の方法。
- 前記第1の特性パターンの前記シグナルパルスが、前記アミノ酸認識分子と前記第1のタイプのアミノ酸との間の結合の解離速度に特有なパルス持続時間を含む、請求項154に記載の方法。
- 前記第1の特性パターンの各シグナルパルスが、アミノ酸認識分子結合の会合速度に特有なパルス間持続時間により他から分離される、請求項155に記載の方法。
- 前記第1の特性パターンが、前記単一ポリペプチド分子の前記第1のタイプのアミノ酸との一連の可逆アミノ酸認識分子結合相互作用に対応する、請求項152~156のいずれか一項に記載の方法。
- 前記一連の可逆アミノ酸認識分子結合相互作用が、前記単一ポリペプチド分子の末端での1つの二元複合体種の可逆形成を含む、請求項157に記載の方法。
- 前記一連の可逆アミノ酸認識分子結合相互作用が、前記単一ポリペプチド分子の末端での異なる二元複合体種の可逆形成を含む、請求項157に記載の方法。
- 前記単一ポリペプチド分子が前記単一ポリペプチド分子の末端位置に前記第1のタイプのアミノ酸を含む、請求項152~159のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の特性パターンが、前記末端位置の前記第1のタイプのアミノ酸と連続位置のアミノ酸タイプとの指標となっている、請求項160に記載の方法。
- 前記末端位置及び前記連続位置のアミノ酸が異なるタイプである、請求項161に記載の方法。
- 前記単一ポリペプチド分子が、前記単一ポリペプチド分子の内部位置に前記第1のタイプのアミノ酸を含む、請求項152~162のいずれか一項に記載の方法。
- 前記単一ポリペプチド分子が、前記末端位置及び前記単一ポリペプチド分子の非連続内部位置に前記第1のタイプのアミノ酸を含む、請求項160~163のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の特性パターンが、前記末端位置の前記第1のタイプのアミノ酸と非連続内部位置のアミノ酸タイプとの指標となる、請求項164に記載の方法。
- 前記第1の特性パターンが、前記単一ポリペプチド分子の前記第1のタイプのアミノ酸の存在量の指標である、請求項164又は165に記載の方法。
- 同定することが、天然に存在するアミノ酸、非天然アミノ酸、又はそれらの修飾変異体として前記第1のタイプのアミノ酸を同定することを含む、請求項152~166のいずれか一項に記載の方法。
- 同定することが、荷電、非荷電、極性、非極性、疎水性、芳香族、又はそれらの組合せの側鎖を有するとして、前記第1のタイプのアミノ酸を同定することを含む、請求項152~167のいずれか一項に記載の方法。
- 前記側鎖が負荷電又は正荷電である、請求項168に記載の方法。
- 同定することが、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セレノシステイン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンから選択される1タイプとして、前記第1のタイプのアミノ酸を同定することを含む、請求項152~169のいずれか一項に記載の方法。
- 同定することが、翻訳後修飾を有するとして前記第1のタイプのアミノ酸を同定することを含む、請求項152~170のいずれか一項に記載の方法。
- 前記翻訳後修飾が、アセチル化、ADPリボシル化、カスパーゼ切断、シトルリン化、ホルミル化、N連結グリコシル化、O連結グリコシル化、ヒドロキシル化、メチル化、ミリストイル化、NEDD化、ニトロ化、酸化、パルミトイル化、リン酸化、プレニル化、S-ニトロシル化、硫酸化、SUMO化及びユビキチン化から選択される、請求項171に記載の方法。
- 前記一連のシグナルパルスが、光学シグナルの大きさの一連の変化を経時的に含む、請求項152~172のいずれか一項に記載の方法。
- 前記一連の各シグナルパルスが複数の光子放出イベントを含む、請求項173に記載の方法。
- 前記第1のタイプのアミノ酸を同定することが、発光寿命、発光輝度、発光強度、発光波長、発光偏光、及び発光量子収率の1つ以上を決定することをさらに含む、請求項174に記載の方法。
- 前記一連のシグナルパルスが、電気シグナルの大きさの一連の変化を経時的に含む、請求項152~175のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の特性パターンが、可逆単一分子結合相互作用に対応する伝導率遷移を含む、請求項176に記載の方法。
- 前記1つ以上のアミノ酸認識分子の各々が認識タンパク質又は認識核酸を含む、請求項152~177のいずれか一項に記載の方法。
- 前記認識タンパク質が、分解経路タンパク質、ペプチダーゼ、抗体、アミノトランスフェラーゼ、tRNAシンテターゼ、若しくはSH2ドメイン含有タンパク質、又はそれらの断片である、請求項178に記載の方法。
- 前記分解経路タンパク質が、N末端則経路タンパク質又はその突然変異体若しくは変異体である、請求項179に記載の方法。
- 前記N末端則経路タンパク質が、Arg/N末端則経路タンパク質、Ac/N末端則経路タンパク質、又はPro/N末端則経路タンパク質である、請求項180に記載の方法。
- 前記N末端則経路タンパク質が、Gidタンパク質、UBRボックスタンパク質若しくはそのUBRボックスドメイン含有断片、p62タンパク質若しくはそのZZドメイン含有断片、又はClpSタンパク質である、請求項181に記載の方法。
- 前記Gidタンパク質が、S.セレビシエ(S.cerevisiae)又はその相同種由来のGid4又はGid10である、請求項182に記載の方法。
- 前記UBRボックスタンパク質が、ヒト、S.セレビシエ(S.cerevisiae)、又はそれらの相同種由来のUBR1又はUBR2である、請求項182に記載の方法。
- 前記p62タンパク質が、ヒト、ラット、又はそれらの相同種由来のp62である、請求項182に記載の方法。
- 前記ClpSタンパク質が、A.ツミファシエンス(A.tumifaciens)、C.クレセンタス(C.crescentus)、E.コリ(E.coli)、S.エロンガタス(elongatus)、P.ファルシパルム(P.falciparum)、T.エロンガタス(elongatus)、又はそれらの相同種由来のClpS1又はClpS2である、請求項182に記載の方法。
- 前記認識タンパク質が合成タンパク質又は組換えタンパク質である、請求項178~186のいずれか一項に記載の方法。
- 前記認識核酸が核酸アプタマーである、請求項178に記載の方法。
- 前記1つ以上のアミノ酸認識分子の各々が検出可能標識を含む、請求項152~188のいずれか一項に記載の方法。
- 前記検出可能標識が発光標識又は伝導率標識である、請求項189に記載の方法。
- 前記単一ポリペプチド分子が表面に固定される、請求項152~190のいずれか一項に記載の方法。
- 前記単一ポリペプチド分子が、一方の末端を介して前記表面に固定され、且つ前記1つ以上のアミノ酸認識分子が、他方の末端を介して前記単一ポリペプチド分子に結合する、請求項191に記載の方法。
- 前記単一ポリペプチド分子が、カルボキシ末端を介して固定され、且つ前記1つ以上のアミノ酸認識分子が、アミノ末端で前記単一ポリペプチド分子に結合する、請求項192に記載の方法。
- 前記単一ポリペプチド分子が、アミノ末端を介して固定され、且つ前記1つ以上のアミノ酸認識分子が、カルボキシ末端で前記単一ポリペプチド分子に結合する、請求項192に記載の方法。
- 前記単一ポリペプチド分子がリンカーを介して前記表面に固定される、請求項191~194のいずれか一項に記載の方法。
- 前記リンカーがバイオ分子を含み、任意選択的に前記バイオ分子がオリゴヌクレオチドである、請求項195に記載の方法。
- 前記単一ポリペプチド分子の分解を観測することをさらに含む、請求項152~196のいずれか一項に記載の方法。
- 前記分解条件が、前記単一ポリペプチド分子の末端から1つ以上の末端アミノ酸を除去可能な切断試薬の存在下で前記一連のシグナルパルスを検出することを含む、請求項152~197のいずれか一項に記載の方法。
- 前記切断試薬と前記単一ポリペプチド分子との会合の指標となるシグナルパルスの検出をさらに含む、請求項198に記載の方法。
- 前記切断試薬が検出可能標識を含む、請求項198又は199に記載の方法。
- 前記検出可能標識が発光標識又は伝導率標識である、請求項200に記載の方法。
- 前記一連のシグナルパルスの第2の特性パターンに基づいて前記単一ポリペプチド分子の第2のタイプのアミノ酸を同定することをさらに含む、請求項197~201のいずれか一項に記載の方法。
- シグナルパルスの前記第2の特性パターンが前記単一ポリペプチド分子からの前記第1のタイプのアミノ酸の除去の指標となる、請求項202に記載の方法。
- 前記一連のシグナルパルスが一連のリアルタイムシグナルパルスである、請求項152~203のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも1つのハードウェアプロセッサーと、
前記少なくとも1つのハードウェアプロセッサーによる実行時に前記少なくとも1つのハードウェアプロセッサーに請求項152~204のいずれか一項に記載の方法を実施させるプロセッサー実行可能命令を記憶する少なくとも1つの非一時コンピュータ可読記憶媒体と、
を含むシステム。 - 少なくとも1つのハードウェアプロセッサーによる実行時に前記少なくとも1つのハードウェアプロセッサーに請求項152~204のいずれか一項に記載の方法を実施させるプロセッサー実行可能命令を記憶する少なくとも1つの非一時コンピュータ可読記憶媒体。
- 式(I):
A-(Y)n-D (I)
(式中、
Aは、少なくとも1つのアミノ酸認識分子を含むアミノ酸結合成分であり、
Yの各々は、共有結合性又は非共有結合性連結基を形成するポリマーであり、
nは、1~10(両端の値を含む)の整数であり、且つ
Dは、少なくとも1つの検出可能標識を含む標識成分であり、Dは、200Å未満の直径である)
の可溶性アミノ酸認識分子を含む組成物。 - -(Y)n-が少なくとも2nmの長さである、請求項207に記載の組成物。
- -(Y)n-が少なくとも5nmの長さである、請求項207に記載の組成物。
- -(Y)n-が少なくとも10nmの長さである、請求項207に記載の組成物。
- Yの各々が、独立して、バイオ分子、ポリオール、又はデンドリマーである、請求項207~210のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記バイオ分子が、核酸、ポリペプチド、又は多糖である、請求項211に記載の組成物。
- 前記可溶性アミノ酸認識分子が、次式:
A-Y1-(Y)m-D又はA-(Y)m-Y1-D
(式中、
Y1は、核酸又はポリペプチドであり、且つ
mは、0~10(両端の値を含む)の整数である)
の1つである、請求項207~212のいずれか一項に記載の組成物。 - 前記核酸が第1のオリゴヌクレオチド鎖を含む、請求項212又は213に記載の組成物。
- 前記核酸が、前記第1のオリゴヌクレオチド鎖にハイブリダイズされた第2のオリゴヌクレオチド鎖を含む、請求項214に記載の組成物。
- 前記核酸が、前記第1のオリゴヌクレオチド鎖を介して共有結合性連結を形成する、請求項214又は215に記載の組成物。
- 前記核酸が、前記ハイブリダイズされた第1及び第2のオリゴヌクレオチド鎖を介して非共有結合性連結を形成する、請求項215に記載の組成物。
- 前記ポリペプチドが1価又は多価タンパク質である、請求項212~217のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記1価又は多価タンパク質が、前記1価又は多価タンパク質のリガンド結合部位に装着されたリガンド部分を介して少なくとも1つの非共有結合性連結を形成する、請求項218に記載の組成物。
- A、Y、又はDがリガンド部分を含む、請求項219に記載の組成物。
- 前記可溶性アミノ酸認識分子が、次式:
A-(Y)m-Y2-D又はA-Y2-(Y)m-D
(式中、
Y2は、ポリオール又はデンドリマーであり、且つ
mは、0~10(両端の値を含む)の整数である)
の1つである、請求項207~212のいずれか一項に記載の組成物。 - 前記ポリオール又はデンドリマーが、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコール、ポリ(アミドアミン)、ポリ(プロピレンイミン)、ポリ(プロピレンアミン)、カルボシラン、ポリ(L-リシン)、又はそれらの1つ以上の組合せを含む、請求項221に記載の組成物。
- Aが複数のアミノ酸認識分子を含む、請求項207~222のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記複数の各アミノ酸認識分子がY上の異なる装着部位に装着される、請求項223に記載の組成物。
- 前記複数のアミノ酸認識分子の少なくとも2つがY上の単一装着部位に装着される、請求項223に記載の組成物。
- 前記アミノ酸認識分子が認識タンパク質又は核酸アプタマーである、請求項207~225のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記認識タンパク質が、分解経路タンパク質、ペプチダーゼ、抗体、アミノトランスフェラーゼ、tRNAシンテターゼ、若しくはSH2ドメイン含有タンパク質、又はそれらの断片である、請求項226に記載の組成物。
- 前記分解経路タンパク質がN末端則経路タンパク質又はその突然変異体若しくは変異体である、請求項227に記載の組成物。
- 前記N末端則経路タンパク質が、Arg/N末端則経路タンパク質、Ac/N末端則経路タンパク質、又はPro/N末端則経路タンパク質である、請求項228に記載の組成物。
- 前記N末端則経路タンパク質が、Gidタンパク質、UBRボックスタンパク質若しくはそのUBRボックスドメイン含有断片、p62タンパク質若しくはそのZZドメイン含有断片、又はClpSタンパク質である、請求項229に記載の組成物。
- 前記Gidタンパク質が、S.セレビシエ(S.cerevisiae)又はその相同種由来のGid4又はGid10である、請求項230に記載の組成物。
- 前記UBRボックスタンパク質が、ヒト、S.セレビシエ(S.cerevisiae)、又はそれらの相同種由来のUBR1又はUBR2である、請求項230に記載の組成物。
- 前記p62タンパク質が、ヒト、ラット、又はそれらの相同種由来のp62である、請求項230に記載の組成物。
- 前記ClpSタンパク質が、A.ツミファシエンス(A.tumifaciens)、C.クレセンタス(C.crescentus)、E.コリ(E.coli)、S.エロンガタス(elongatus)、P.ファルシパルム(P.falciparum)、T.エロンガタス(elongatus)、又はそれらの相同種由来のClpS1又はClpS2である、請求項230に記載の組成物。
- 前記検出可能標識が発光標識又は伝導率標識である、請求項207~234のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記発光標識が少なくとも1つのフルオロフォア色素分子を含む、請求項235に記載の組成物。
- Dが20以下のフルオロフォア色素分子を含む、請求項236に記載の組成物。
- 前記フルオロフォア色素分子の数と前記アミノ酸認識分子の数との比が1:1~20:1である、請求項236又は237に記載の組成物。
- 前記発光標識が、ドナー標識とアクセプター標識とを含む少なくとも1つのFRETペアを含む、請求項235~238のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ドナー標識と前記アクセプター標識との比が1:1、2:1、3:1、4:1、又は5:1である、請求項239に記載の組成物。
- 前記アクセプター標識と前記ドナー標識との比が1:1、2:1、3:1、4:1、又は5:1である、請求項239に記載の組成物。
- 式(II):
A-Y1-D(II)
(式中、
Aは、少なくとも1つのアミノ酸認識分子を含むアミノ酸結合成分であり、
Y1は、核酸又はポリペプチドであり、
Dは、少なくとも1つの検出可能標識を含む標識成分であり、
ただし、Y1が核酸であるとき、前記核酸は共有結合性又は非共有結合性連結基を形成し、且つ
ただし、Y1がポリペプチドであるとき、前記ポリペプチドは、50×10-9M未満の解離定数(KD)により特徴付けられる非共有結合性連結基を形成する)
のアミノ酸認識分子。 - -Y1-が少なくとも2nmの長さである、請求項242に記載のアミノ酸認識分子。
- -Y1-が少なくとも5nmの長さである、請求項242に記載のアミノ酸認識分子。
- -Y1-が少なくとも10nmの長さである、請求項242に記載のアミノ酸認識分子。
- 前記核酸が第1のオリゴヌクレオチド鎖を含む、請求項242~245のいずれか一項に記載のアミノ酸認識分子。
- 前記核酸が、前記第1のオリゴヌクレオチド鎖にハイブリダイズされた第2のオリゴヌクレオチド鎖を含む、請求項246に記載のアミノ酸認識分子。
- Aが前記第1のオリゴヌクレオチド鎖に装着され、且つDが前記第2のオリゴヌクレオチド鎖に装着される、請求項247に記載のアミノ酸認識分子。
- Aが前記第1のオリゴヌクレオチド鎖上の第1の装着部位に装着され、且つDが前記第1のオリゴヌクレオチド鎖上の第2の装着部位に装着される、請求項246又は247に記載のアミノ酸認識分子。
- 前記核酸の各オリゴヌクレオチド鎖が、150未満、100未満、又は50未満のヌクレオチドを含む、請求項246~249のいずれか一項に記載のアミノ酸認識分子。
- 前記ポリペプチドが1価又は多価タンパク質である、請求項242~250のいずれか一項に記載のアミノ酸認識分子。
- 前記1価又は多価タンパク質が、前記1価又は多価タンパク質のリガンド結合部位に装着されたリガンド部分を介して少なくとも1つの非共有結合性連結を形成する、請求項251に記載のアミノ酸認識分子。
- A及びDの少なくとも1つがリガンド部分を含む、請求項252に記載のアミノ酸認識分子。
- 前記ポリペプチドはアビジンタンパク質である、請求項242~253のいずれか一項に記載のアミノ酸認識分子。
- 前記アビジンタンパク質が、アビジン、ストレプトアビジン、トラプタビジン、タマビジン、ブラダビジン、キセナビジン(xenavidin)、又はそれらのホモログ若しくは変異体である、請求項254に記載のアミノ酸認識分子。
- 前記リガンド部分がビオチン部分である、請求項252~255のいずれか一項に記載のアミノ酸認識分子。
- 前記KDが、1×10-9M未満、1×10-10M未満、1×10-11M未満、又は1×10-12M未満である、請求項242~256のいずれか一項に記載のアミノ酸認識分子。
- 前記アミノ酸認識分子が、次式:
A-Y1-(Y)n-D又はA-(Y)n-Y1-D
(式中、
Yの各々は、共有結合性又は非共有結合性連結基を形成するポリマーであり、且つ
nは、1~10(両端の値を含む)の整数である)
の1つである、請求項242~257のいずれか一項に記載のアミノ酸認識分子。 - Yの各々が、独立して、バイオ分子、ポリオール、又はデンドリマーである、請求項258に記載のアミノ酸認識分子。
- 核酸と、
前記核酸上の第1の装着部位に装着された少なくとも1つのアミノ酸認識分子と、
前記核酸上の第2の装着部位に装着された少なくとも1つの検出可能標識と、
を含むアミノ酸認識分子であって、
前記核酸が前記少なくとも1つのアミノ酸認識分子と前記少なくとも1つの検出可能標識との間に共有結合性又は非共有結合性連結基を形成する、アミノ酸認識分子。 - 前記核酸が、第2のオリゴヌクレオチド鎖にハイブリダイズされた第1のオリゴヌクレオチド鎖を含む二本鎖核酸である、請求項260に記載のアミノ酸認識分子。
- 前記第1の装着部位が前記第1のオリゴヌクレオチド鎖上にあり、且つ前記第2の装着部位が前記第2のオリゴヌクレオチド鎖上にある、請求項261に記載のアミノ酸認識分子。
- 前記少なくとも1つのアミノ酸認識分子が、前記少なくとも1つのアミノ酸認識分子と前記核酸との間に共有結合性又は非共有結合性連結基を形成するタンパク質を介して前記第1の装着部位に装着される、請求項260~262のいずれか一項に記載のアミノ酸認識分子。
- 前記少なくとも1つの検出可能標識が、前記少なくとも1つの検出可能標識と前記核酸との間に共有結合性又は非共有結合性連結基を形成するタンパク質を介して前記第2の装着部位に装着される、請求項260~263のいずれか一項に記載のアミノ酸認識分子。
- 前記第1及び第2の装着部位が、前記核酸上の5~100のヌクレオチド塩基又はヌクレオチド塩基対により分離される、請求項260~264のいずれか一項に記載のアミノ酸認識分子。
- 少なくとも2つのリガンド結合部位を含む多価タンパク質と、
前記タンパク質上の第1のリガンド結合部位に結合された第1のリガンド部分を介して前記タンパク質に装着された少なくとも1つのアミノ酸認識分子と、
前記タンパク質上の第2のリガンド結合部位に結合された第2のリガンド部分を介して前記タンパク質に装着された少なくとも1つの検出可能標識と、
を含むアミノ酸認識分子。 - 前記多価タンパク質が、4つのリガンド結合部位を含むアビジンタンパク質である、請求項266に記載のアミノ酸認識分子。
- 前記リガンド結合部位がビオチン結合部位であり、且つ前記リガンド部分がビオチン部分である、請求項266又は267に記載のアミノ酸認識分子。
- 前記ビオチン部分の少なくとも1つがビスビオチン部分であり、且つ前記ビスビオチン部分が前記アビジンタンパク質上の2つのビオチン結合部位に結合される、請求項268に記載のアミノ酸認識分子。
- 前記少なくとも1つのアミノ酸認識分子が、前記第1のリガンド部分を含む核酸を介して前記タンパク質に装着される、請求項266~269のいずれか一項に記載のアミノ酸認識分子。
- 前記少なくとも1つの検出可能標識が、前記第2のリガンド部分を含む核酸を介して前記タンパク質に装着される、請求項266~270のいずれか一項に記載のアミノ酸認識分子。
- ポリペプチドの末端アミノ酸を同定する方法であって、前記方法は、
前記ポリペプチドと、前記ポリペプチドの末端の1タイプ以上の末端アミノ酸に選択的に結合する1つ以上の標識アフィニティー試薬と、を接触させることと、
前記ポリペプチドと前記1つ以上の標識アフィニティー試薬との相互作用を検出することにより前記ポリペプチドの末端の末端アミノ酸を同定することと、
を含む方法。 - ポリペプチドのアミノ酸配列を決定する方法であって、前記方法は、
i.前記ポリペプチドと、前記ポリペプチドの末端の1タイプ以上の末端アミノ酸に選択的に結合する1つ以上の標識アフィニティー試薬と、を接触させることと、
ii.前記ポリペプチドと前記1つ以上の標識アフィニティー試薬との相互作用を検出することにより前記ポリペプチドの末端の末端アミノ酸を同定することと、
iii.前記末端アミノ酸を除去することと、
iv.前記ポリペプチドの末端で(i)~(iv)を1回以上繰り返して前記ポリペプチドのアミノ酸配列を決定することと、
を含む方法。 - 前記方法が、
a.(i)の後且つ(ii)の前に、前記末端アミノ酸に選択的に結合しない前記1つ以上の標識アフィニティー試薬をいずれも除去することと、及び/又は
b.(ii)の後且つ(iii)の前に、前記末端アミノ酸に選択的に結合する前記1つ以上の標識アフィニティー試薬をいずれも除去すること、
をさらに含む、請求項273に記載の方法。 - (iii)が、前記末端アミノ酸とイソチオシアネートとを接触させることにより前記末端アミノ酸を修飾することと、
a.前記修飾された末端アミノ酸と、前記修飾された末端アミノ酸に特異的に結合してそれを除去するプロテアーゼと、を接触させることと、
又は
b.前記修飾された末端アミノ酸を除去するのに十分な酸性又は塩基性条件に前記修飾された末端アミノ酸を付すことと、
を含む、請求項273に記載の方法。 - 前記末端アミノ酸を同定することが、
a.前記1つ以上の標識アフィニティー試薬が結合する前記1つ以上のタイプの末端アミノ酸の1つのタイプであるとして前記末端アミノ酸を同定することと、又は
b.前記1つ以上の標識アフィニティー試薬が結合する前記1つ以上のタイプの末端アミノ酸以外のタイプであるとして前記末端アミノ酸を同定することと、
を含む、請求項273に記載の方法。 - 前記1つ以上の標識アフィニティー試薬が、1つ以上の標識アプタマー、1つ以上の標識ペプチダーゼ、1つ以上の標識抗体、又はそれらの組合せを含む、請求項273に記載の方法。
- 前記1つ以上の標識ペプチダーゼが修飾されて切断活性を不活性化するか、又は前記1つ以上の標識ペプチダーゼが(iii)の除去のために切断活性を保持する、請求項277に記載の方法。
- 混合サンプル中の対象タンパク質を同定する方法であって、前記方法は、
混合タンパク質サンプルを切断して複数のポリペプチド断片を生成することと、
請求項273~278のいずれか1項に記載の方法で前記複数のポリペプチド断片の少なくとも1つのアミノ酸配列を決定することと、
前記アミノ酸配列が対象タンパク質にユニークに同定可能である場合に前記混合サンプル中の対象タンパク質を同定することと、
を含む方法。 - 混合サンプル中の対象タンパク質を同定する方法であって、前記方法は、
混合タンパク質サンプルを切断して複数のポリペプチド断片を生成することと、
前記複数のポリペプチド断片中の1つ以上のタイプのアミノ酸を1つ以上の異なる発光標識で標識することと、
前記複数の標識されたポリペプチドの少なくとも1つに対して経時的に発光を測定することと、
検出された発光に基づいて前記少なくとも1つの標識ポリペプチドのアミノ酸配列を決定することと、
前記アミノ酸配列が対象タンパク質にユニークに同定可能である場合に前記混合サンプル中の対象タンパク質を同定することと、
を含む方法。 - ポリペプチド中の2つ以上のアミノ酸の相対位置を同定する方法であって、前記方法は、
ポリペプチドの2つ以上のアミノ酸を1タイプ以上の第1のFRET標識で標識することと、
第2のFRET標識で標識された補因子の存在下で前記標識ポリペプチドのトランスロケーション反応からのFRETシグナルを検出することと、
前記FRETシグナルに基づいて2つ以上のアミノ酸の相対位置を決定することと、
を含む方法。 - 分析のためのタンパク質を調製する方法であって、前記方法は、
i.タンパク質の遊離カルボン酸基をブロックすることと、
ii.タンパク質を変性することと、
iii.タンパク質の遊離チオール基をブロックすることと、
iv.前記タンパク質を消化して遊離C末端カルボン酸基を含む少なくとも1つのポリペプチド断片を生成することと、
v.機能部分を前記遊離C末端カルボン酸基に化学的にコンジュゲートすることと、
を含む方法。 - 分析のためのタンパク質を調製する方法であって、前記方法は、
i.タンパク質を変性することと、
ii.タンパク質の遊離チオール基をブロックすることと、
iii.前記タンパク質を消化して遊離C末端カルボン酸基を含む少なくとも1つのポリペプチド断片を生成することと、
iv.遊離C末端カルボン酸基をブロックしてブロックC末端カルボン酸基を含む少なくとも1つのポリペプチド断片を生成することと、
v.機能部分を前記ブロックC末端カルボン酸基に酵素的にコンジュゲートすることと、
を含む方法。
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