CN110812318A - 用于化妆品原料的优化的成纤维细胞提取物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，尤其为一种用于化妆品原料的优化的成纤维细胞提取物的制备方法，包括以下步骤：S1：收集真皮组织来源不同培养代数的成纤维细胞，且成纤维细胞的培养时间为20‑45天；S2：经体外定向诱导扩增为工作细胞株；S3：在体外经植物提取物及人间充质干细胞活性分泌物刺激处理后，强化分泌皮肤损伤修复因子。本发明定向调控后的人成纤维细胞分泌物同时具备人成纤维细胞及间充质干细胞双重活性分泌物；该混合物中富含皮肤组织修复与再生功能等多重细胞因子，并具备胶原蛋白富集、活性氧自由基清除组分强化炎性因子减弱等特征可以作为化妆品原料进行皮肤衰老性修复领域的应用。

Description

用于化妆品原料的优化的成纤维细胞提取物的制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于化妆品原料的优化的成纤维细胞提取物的制备方法。

背景技术

成纤维细胞与创伤修复：成纤维细胞(fibroblast)是疏松结缔组织的主要成分，由胚胎时期的间充质细胞(mesenchymal cell)分化而来，在修复由于细胞变性、坏死导致的组织缺损方面起重要作用。人皮肤成纤维细胞(human skin fibroblast，人成纤维细胞)是皮肤组织重要结构成分，可合成和分泌胶原纤维、弹性纤维、网状纤维、透明质酸等细胞外基质，具有维持皮肤结构稳定、保持强度和弹性、修复损伤等功能。日常物理及化学性创伤造成皮肤组织细胞变性、坏死和组织缺损。在修复过程中，真皮乳头层成纤维细胞在受损部位增殖，合成分泌胶原纤维和基质成分，与新生毛细血管等共同形成肉芽组织，填补伤口组织缺损，有助于表皮细胞的覆盖完成修复。在这一过程中，真皮组织中成熟期静止状态的纤维细胞，以及具有分化潜能的少数间充质细胞在特定因素刺激下，可重新转变为成纤维细胞，共同参与组织损伤后的修复。

成纤维细胞在皮肤组织修复与再生中的双重作用：成纤维在皮肤衰老与再生中起双重作用，适度激活是皮肤细胞再生修复的刺激信号，其中炎性细胞因子TGF-β1、IL-6，TNF-α是其中的关键性物质；当损伤创面较大或存在异常的炎症反应时，成纤维细胞过度活动其不受控制，造成创面过度收缩导致增生性瘢痕，过度表达的炎症性因子是导致成纤维细胞过度活化的重要原因。

间充质干细胞调控成纤维细胞在皮肤组织修复中的相互作用：间充质干细胞(间充质干细胞，mesenchymal stem cells,)是一种体内的种子修复细胞。一方面，间充质干细胞的在体内可增殖分化成为成纤维细胞，直接代替与修复衰老死亡的皮肤细胞；另外一方面，间充质干细胞分泌途径分泌皮肤损伤修复生物活性分子调控成纤维细胞，包括纤连蛋白(Fibronectin)作为促进伤口愈合、血管内皮细胞生长因子(VEGF)促进皮肤再生、纤维芽细胞生长因子(bFGF)促进衰老组织的恢复、上皮细胞生长因子(EGF)促进内皮细胞增殖移动；肝细胞生长因子(HGF)激活细胞，治疗伤口效果；转化生长因子(TGF-β1)复原受损的组织并调节成纤维细胞增殖。在间充质干细胞与人成纤维细胞的相互作用中，间充质干细胞抑制TGF-β1所诱导的成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，从而改善损伤愈合失调导致的疤痕疙瘩及组织纤维化。

植物提取物调控成纤维细胞在皮肤组织修复中的相互作用：植物提取物用于皮肤损伤性修复已经相对成熟。例如杜仲提取物松脂醇二葡萄糖苷(PinoresinolDiglucoside，PDG)能显著刺激人成纤维细胞的增殖，促进胶原蛋白的分泌；芦荟来源的乙酰甘露多糖(Acemannan)促进人成纤维细胞增殖促进TGF-α，TGF-β1，EGF，IL-1β，IL-6，IL-8及TNF的分泌，Acemannan进一步调控I型胶原蛋白与III型胶原蛋白的比例，使得组织修复向更为优化的方向进行；水飞蓟素(Silymarin)对体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖具有明显的抑制作用。

工业化细胞培养提取物及在组织修复间的运用：目前在美容抗衰领域中，使用活化的间充质干细胞或人成纤维细胞进行中胚层导入进行损伤组织。更多关注在GMP环境下的细胞生产制备，将细胞培养的含有的上清物及提取物当作生物垃圾废弃，这极大地浪费了细胞在培养过程中分泌的皮肤损伤修复生物活性物质；另外一方面，在化妆品领域植物提取物多作为活性组分直接进行添加。人成纤维细胞及间充质干细胞具有分布广泛、取材方便、对机体损伤较小、体外培养容易成活等特点。在体外分别分离培养人成纤维细胞及间充质干细胞。在人成纤维细胞的培养过程中添加间充质干细胞分泌物及植物提取物对其分泌因子进行定向调控，有可能获得的分泌物具有特殊分泌谱的活性组分，为此，提出用于化妆品原料的优化的成纤维细胞提取物的制备方法。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的用于化妆品原料的优化的成纤维细胞提取物的制备方法。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：用于化妆品原料的优化的成纤维细胞提取物的制备方法，包括以下步骤：

S1：收集真皮组织来源不同培养代数的成纤维细胞，且成纤维细胞的培养时间为20-45天；

S2：经体外定向诱导扩增为工作细胞株；

S3：在体外经植物提取物及人间充质干细胞活性分泌物刺激处理后，强化分泌皮肤损伤修复因子；

S4：分离提取活性上清组分，形成高浓度无菌级别提取物原料。

优选的，所述成纤维细胞的种子细胞株为1-3代，工作细胞株为4-15代，间充质干细胞为不同组织来源的细胞包括但不限于血液、新生儿伴随组织、成体脂肪和成体皮肤，所述新生儿伴随组织包括脐血、脐带、羊膜和胎盘，经体外诱导扩增为间充质干细胞，收集培养上清以3KD超滤截留相关因子，间充质干细胞为新生儿伴随组织及成体脂肪、成体皮肤来源的诱导一定代数的细胞，且间充质干细胞为4-10代。

优选的，所述间充质干细胞培养体系为生理盐水加10％浓度的人血小板裂解液的无血清添加物，

优选的，收集的培养上清以3KD 3500rpm 15min超滤离心后，收集上层超滤物质洗涤后做为浓缩因子。

优选的，所述S3中，利用人间充质干细胞活性提取物，在工作细胞培养的全过程中调控人皮肤成纤维细胞的增殖，促进皮肤损伤修复因子蛋白的分泌，添加比例为间充质分泌物：成纤维培养基＝2:15。

优选的，利用2x10-3μmol/L浓度的杜仲提取物松脂醇二葡萄糖苷在培养初期刺激人皮肤成纤维细胞的增殖，促进胶原蛋白的分泌。

优选的，利用100μg/ml浓度得芦荟来源的乙酰甘露多糖(Acemannan)在培养中期刺激人皮肤成纤维细胞的增殖，促进胶原蛋白的分泌，并进一步优化调控I型胶原蛋白与III型胶原蛋白的比例。

优选的，其特征在于：利用200μmol/ml浓度的水飞蓟素(Silymarin)在培养中后期抑制期刺激人皮肤成纤维细胞的进一步增殖，避免过度活化。

优选的，其特征在于：成纤维细胞培养上清3KD 3500rpm 15min超滤离心后，收集上层超滤物质洗涤后做为浓缩因子。

优选的，收集超滤后的因子，洗涤次数为两次，提取物终浓度为4mg/ml，0.22μm除菌过滤保存。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1.本发明提供的人成纤维细胞提取物富含多种生长因子、蛋白酶、小分子多肽的浓缩物，与皮肤损伤修复与再生中所必须的因子一致；

2.本发明利用植物提取物优化调控人成纤维细胞的蛋白分泌谱，富集皮肤损伤修复因子，降低内源性皮肤损伤因子组分；

3.本发明使用3-10代之间的人成纤维细胞培养上清分泌物，最大限度去除了衰老人成纤维细胞代谢产物有可能引发的内源性皮肤损伤因子；

4.本发明利用间充质干细胞修复皮肤损伤，及其成纤维细胞增殖调控双重生物学特性，提取其体外培养、增殖过程中分泌的具备皮肤损伤的复合活性物质；

5.本发明不仅降低干细胞、成纤维细胞临床研究中废弃细胞培养上清液作为生物垃圾对自然环境和人类健康存在潜在危害，还对其中活性成分进行开发利用；让细胞应用的成本大幅度降低；

6.本发明中所获得生物活性物质与主流化妆品的配方体系生物相容度良好，可作为原来美容抗衰化妆品中活性添加成分使用。

本发明定向调控后的人成纤维细胞分泌物同时具备人成纤维细胞及间充质干细胞双重活性分泌物；该混合物中富含皮肤组织修复与再生功能等多重细胞因子，并具备胶原蛋白富集、活性氧自由基清除组分强化炎性因子减弱等特征可以作为化妆品原料进行皮肤衰老性修复领域的应用。

附图说明

图1本发明第一实施例中人成纤维细胞形态图；

图2本发明第一实施例中人成纤维细胞活率图；

图3本发明第二实施例中间充质干细胞形态图；

图4本发明第二实施例中间充质干细胞培养后上清液细胞因子含量图；

图5本发明第二实施例中间充质干细胞上清提取物蛋白总浓度变化图；

图6本发明第四实施例中人成纤维细胞在不同培养物添加及刺激后细胞活率变化图；

图7本发明第四实施例中人成纤维细胞在不同培养物添加及刺激后细胞生长曲线图；

图8本发明第四实施例中人成纤维细胞在不同培养物添加及刺激后胶原蛋白分泌量变化图；

图9本发明第四实施例中人成纤维细胞在不同培养物添加及刺激后透明质酸分泌量变化图；

图10本发明第四实施例中人成纤维细胞在不同培养物添加及刺激后羟脯氨酸分泌量变化图；

图11本发明第四实施例中人成纤维细胞在不同培养物添加及刺激后EGF分泌量变化图；

图12本发明第四实施例中人成纤维细胞在不同培养物添加及刺激后TGF-β1分泌量变化图；

图13本发明第四实施例中人成纤维细胞在不同培养物添加及刺激后炎性因子分泌量变化图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：

1、外源性间充质干细胞调控分泌物的制备：

a.间充质干细胞选自体外分离、培养的人脐带、羊膜、胎盘和脂肪的间充质干细胞，可以为单一来源，也可组合来源，间充质干细胞为第3-10代间充干细胞。

b.间充质干细胞活性分泌物的收集：进一步的通过收集、低温离心分离、无菌过滤、超滤和浓缩获得培养上清液中的部分活性浓缩物质。

2、人真皮成纤维细胞的分离培养：

c.人皮肤组织进行清洗后，去除脂肪层及表皮毛发部分，剪碎以贴壁法用无血清培养基培养成纤维细胞最多至第3代，冻存细胞用于后续规模扩增。

3、人成纤维细胞内源性修复因子的强化分泌及收集：

d.取3-10代的工作细胞株于含有5％血小板裂解液的无血清培养基中，37℃、5％CO2环境下培养12hr，添加松脂醇二葡萄糖苷(PDG)及间充质干细胞分泌物；

e.在人成纤维细胞培养48hr后，添加乙酰甘露多糖(Acemannan)刺激不同胶原蛋白的优化分泌；

f.在人成纤维细胞培养96hr后，添加水飞蓟素(Silymarin)乙酰甘露多糖防止人成纤维细胞过度激活；

g.人成纤维细胞细胞活性分泌物的收集：进一步的通过收集、低温离心分离、无菌过滤、超滤和浓缩获得成纤维细胞的培养上清液中的活性浓缩物质。

实施例一：请参阅图1和图2，高生物安全性人源成纤维种子细胞系的制备：

按成纤维细胞的临床试验产品标准，在GMP车间之中进行细胞分离培养，具体包括以下步骤：

1)用生理盐水无菌环境下清洗人皮肤组织样本2次，充分去除皮肤组织内残留血液；

2)剥离去除人皮肤下层脂肪组织，露出真皮层，剪去皮肤外表皮处毛发成分；

3)使用手术刀把人皮肤组织切割为0.3～0.5cm×0.5cm大小的组织块，清洗一次；

4)使用添加5％左右血小板的无血清培养基浸润组织块，把组织块放置于12孔板中，保证真皮层紧贴孔板底部；

5)每孔放置1-2块组织，添加0.5ml左右细胞培养基，隔天换液一次；

6)待细胞迁移出并增殖一定数量下，去除组织，使用枪头吹起细胞重新贴壁；

7)待12孔板中细胞融合度为80％，传至175cm2培养瓶中继续培养；

8)培养至第三代后进行后续刺激优化培养，同时冻存部分用于种子细胞的储备，此时细胞存活率不小于90％；

9)对各次传代细胞取样，显微镜镜检观察细胞形态；并使用台盼蓝染色，进行细胞计数及活率统计。

实施例二：请参阅图3-图5，高生物安全性人源间充质干细胞活性调节性因子的提取：

1)按间充质干细胞的临床试验产品标准，在GMP车间之中进行间充质干细胞的大规模扩增，获取细胞培养上清液，具体包括以下步骤；

2)采集健康人的脐带、羊膜、胎盘、脂肪等组织，磷酸缓冲液(PBS)洗掉血管中残留血液；

3)分离并去除血管组织及血细胞；

4)将剩余组织剪碎至约1～2mm2组织块，移至0.1％胶原酶II中，37℃消化2h，2500r/min离心10分钟；

5)取下层沉淀再用0.25％胰蛋白酶消化20min，2500r/min离心10分钟；

6)弃上清，保留沉淀，用PBS吹打成悬液，100μm滤网过滤，2000r/min离心10分钟，获得单细胞；

7)PBS洗涤2次，以20000/cm2的密度接种于添加5％浓度人血小板裂解物的间充质干细胞无血清培养基中，置37℃，5％CO2饱和湿度环境下培养；

8)2天后除去未贴壁细胞，更换新鲜培养基，每3～4天换新鲜培养基；

9)生长至约80％融合时，按3000/cm2的密度进行传代，，采用代数为3-10代工作细胞株生产间充质干细胞培养上清，收集培养上清并于-20℃保存备用；

10)将收集的上清以40ml每管分装于50ml离心管中，4℃下，3500rpm*15min、4000rpm*10min、5000rpm*8min，去除蛋白絮凝；

11)离心上清用0.22μm滤器过滤，过滤后上清按15ml/每管分装于50ml的超滤管中(截留分子量3KD)；

12)于4℃下，3500r/min离心30分钟，超滤浓缩至终体积5-10ml，弃流出物；

13)留样测量蛋白浓度，以PBS调整蛋白浓度5mg/ml，并于-20℃保存备用；

14)对各次传代细胞取样，显微镜镜检观察细胞形态；并使用台盼蓝染色，进行细胞计数及活率统计；

15)对各蛋白浓缩样本取样，使用紫外分光度计测定蛋白吸光度；以人血清白蛋白系列稀释液做标准曲线，计算各样本蛋白浓度。

实施例三：植物提取物的母液制备：

1)称取松酯醇二葡萄糖苷干粉，并将干粉溶解于DMSO中，母液浓度为20μmol/l，0.22μm滤膜除菌过滤；

2)称取添加乙酰甘露多糖(Acemannan)，并将干粉溶解于培养基中，母液浓度为100mg/ml，0.22μm滤膜除菌过滤；

3)称取水飞蓟宾(Silymarin)并将干粉溶解于培养基中，母液浓度为200mmol/L，0.22μm滤膜除菌过滤。

实施例四：请参阅图6-图13，其中图6、图7、图9、图10、图11和图12中1标号均表示未处理细胞，2标号表示药物处理细胞，图8中每组从上至下分别代表0hr、12hr、48hr、96hr和120hr，图13中1-4标号分别为：12hr、48hr、96hr和120hr，优化刺激人成纤维细胞分泌皮肤修复相关因子：

1)取人成纤维细胞种子细胞在添加5％人血小板裂解物的无血清培养基中，于37℃、5％CO2、饱和湿度的环境下诱导培养人成纤维细胞12小时；

2)去除细胞培养上清，并向细胞中加入15ml添加5％人血小板裂解物的无血清培养基；

3)取间充质干细胞活性培养上清，于37℃溶解备用；

4)按2:15的比例，向人成纤维细胞培养基中加入预热的间充质培养上清；

5)按1：1000的比例，向人成纤维细胞培养基中添加松酯醇二葡萄糖苷(PDG)母液，终浓度与为2x10-3μmol/L；

6)于37℃、5％CO2、饱和湿度的环境下诱导培养人成纤维细胞至第48hr；

7)按1：1000的比例，向人成纤维细胞培养基中添加乙酰甘露多糖(Acemannan)母液，终浓度与为100μg/ml；

8)于37℃、5％CO2、饱和湿度的环境下诱导培养人成纤维细胞至第96hr；

9)按1：1000的比例，向人成纤维细胞培养基中添加水飞蓟宾(Silymarin)母液，终浓度与为200μmol/ml；

10)于37℃、5％CO2、饱和湿度的环境下诱导培养人成纤维细胞至第120hr；

11)收集培养上清并于-20℃保存备用，传代细胞，重复上述优化刺激步骤；

12)当人成纤维细胞培养代数超过15代时，废弃细胞；

13)对各次传代细胞取样，显微镜镜检观察细胞形态；并使用台盼蓝染色，进行细胞计数并进行细胞活率计算；

14)对各阶段细胞取样，离心去除培养上清，加入-20℃冷乙醇固定细胞，并在37℃条件下使用0.5mg/ml的碘化丙啶，进行细胞染色，在流式细胞仪上测定细胞周期；

15)对各时间点培养上清样本取样，使用ELISA分别测定目的蛋白含量，包括：皮肤损伤修复效应分子(胶原蛋白I，胶原蛋白III，透明质酸，羟脯氨酸)；皮肤再生通路(EGF，TGF-β1)；炎性调节因子(IL-1β，IL6，IL-8，TNF)。

实施例五：人成纤维细胞活性因子的分离过滤：

1)将实施例4中收集的成纤维细胞培养上清融化合并；

2)40ml每管分装于50ml离心管中，于4℃下，3500rpm*15min、4000rpm*10min、5000rpm*8min，去除蛋白絮凝；

3)离心上清用0.22μm滤器过滤；

4)过滤后上清按15ml/每管分装于50ml的超滤管中，截留分子量3KD；

5)于4℃下，3800r/min离心30分钟，浓缩至终体积2ml；

6)加入4℃预冷的静脉注射生理盐水(0.9％NaCl)，补充至终体积15ml；

7)于4℃下，3800r/min离心30分钟，浓缩至终体积1.5-2ml；

8)加入4℃预冷的静脉注射生理盐水(0.9％NaCl)，补充至终体积15ml；

9)4℃下，3800r/min离心30分钟，浓缩至终体积1.5-2ml；

10)合并各管3KD浓缩液。

实施例6：人成纤维细胞提取物终浓度调节以及理化性质鉴定

1)将3KD活性因子浓缩液，按10ml/管分装于离心管中；

2)于4℃下，10000r/min离心20分钟，收集上清液，抛弃蛋白絮凝沉淀；

3)测定所得浓缩物蛋白含量，用预冷注射级生理盐水(0.9％NaCl)稀释浓缩液，调整蛋白总浓度为4mg/ml；

4)0.22μm滤膜除菌过滤，所得溶液为成纤维分泌的活性因子终产品；

5)抽取样品进行生化检测，项目包括细菌、真菌、支原体、衣原体、浓度、内毒素，具体的质量标准细菌：阴性；真菌：阴性；支原体：阴性；衣原体：阴性；内毒素：小于0.25EU/ml；浓度：4mg/ml。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.用于化妆品原料的优化的成纤维细胞提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：收集真皮组织来源不同培养代数的成纤维细胞，且成纤维细胞的培养时间为20-45天；

S2：经体外定向诱导扩增为工作细胞株；

S3：在体外经植物提取物及人间充质干细胞活性分泌物刺激处理后，强化分泌皮肤损伤修复因子；

S4：分离提取活性上清组分，形成高浓度无菌级别提取物原料。

2.根据权利要求1所述的用于化妆品原料的优化的成纤维细胞提取物的制备方法，其特征在于：所述成纤维细胞的种子细胞株为1-3代，工作细胞株为4-15代，间充质干细胞为不同组织来源的细胞包括但不限于血液、新生儿伴随组织、成体脂肪和成体皮肤，所述新生儿伴随组织包括脐血、脐带、羊膜和胎盘，经体外诱导扩增为间充质干细胞，收集培养上清以3KD超滤截留相关因子，间充质干细胞为新生儿伴随组织及成体脂肪、成体皮肤来源的诱导一定代数的细胞，且间充质干细胞为4-10代。

3.根据权利要求2所述的用于化妆品原料的优化的成纤维细胞提取物的制备方法，其特征在于：所述间充质干细胞培养体系为生理盐水加10％浓度的人血小板裂解液的无血清添加物。

4.根据权利要求2所述的用于化妆品原料的优化的成纤维细胞提取物的制备方法，其特征在于：收集的培养上清以3KD 3500rpm 15min超滤离心后，收集上层超滤物质洗涤后做为浓缩因子。

5.根据权利要求1所述的用于化妆品原料的优化的成纤维细胞提取物的制备方法，其特征在于：所述S3中，利用人间充质干细胞活性提取物，在工作细胞培养的全过程中调控人皮肤成纤维细胞的增殖，促进皮肤损伤修复因子蛋白的分泌，添加比例为间充质分泌物：成纤维培养基＝2:15。

6.根据权利要求1所述的用于化妆品原料的优化的成纤维细胞提取物的制备方法，其特征在于：利用2 x 10-3μmol/L浓度的杜仲提取物松脂醇二葡萄糖苷在培养初期刺激人皮肤成纤维细胞的增殖，促进胶原蛋白的分泌。

7.根据权利要求1所述的用于化妆品原料的优化的成纤维细胞提取物的制备方法，其特征在于：利用100μg/ml浓度得芦荟来源的乙酰甘露多糖(Acemannan)在培养中期刺激人皮肤成纤维细胞的增殖，促进胶原蛋白的分泌，并进一步优化调控I型胶原蛋白与III型胶原蛋白的比例。

8.根据权利要求1所述的用于化妆品原料的优化的成纤维细胞提取物的制备方法，其特征在于：利用200μmol/ml浓度的水飞蓟素(Silymarin)在培养中后期抑制期刺激人皮肤成纤维细胞的进一步增殖，避免过度活化。

9.根据权利要求1所述的用于化妆品原料的优化的成纤维细胞提取物的制备方法，其特征在于：成纤维细胞培养上清3KD 3500rpm 15min超滤离心后，收集上层超滤物质洗涤后做为浓缩因子。

10.根据权利要求9所述的用于化妆品原料的优化的成纤维细胞提取物的制备方法，其特征在于：收集超滤后的因子，洗涤次数为两次，提取物终浓度为4mg/ml，0.22μm除菌过滤保存。

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