JP2007185150A - 繊維芽様細胞の製造方法および移植材 - Google Patents

Abstract

【課題】低侵襲に繊維芽様細胞を製造できる製造方法を提供する。
【解決手段】臍帯血、胎盤血、末梢血または月経血の何れかの血液中から分離した単核球細胞にカルシウムイオンを導入し、該単核球細胞を所定の培養条件において培養する。培養は、底面に血漿を塗布した培養容器に培養液を貯留し、この培養液内で培養し、培養液内にはサイトカインであるｂＦＧＦを添加する。得られた繊維芽様細胞は、間葉系幹細胞様の性質を有するため、生体に移植されることにより、移植部位を構成する組織を再生することが可能となる。
【選択図】図１

Description

この発明は、繊維芽様細胞の製造方法および移植材に関するものである。

近年、いわゆる再生医療において、術後の生体組織における欠損部の修復速度を高めるために、患者から採取した骨髄液等から間葉系幹細胞を取り出して、βリン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）やハイドロキシアパタイト（ＨＡＰ）等の生体組織補填材とともに培養することにより、培養骨に代表される生体組織補填体を製造することが提案されている。生体組織補填体は、移植時に、すでに生体組織補填材を足場にして増殖した多くの間葉系幹細胞を含んでいるので、手術後に体内で細胞を増殖させる方法と比較すると、自家組織に置換されるまでの日数を大幅に短縮することができる（例えば、非特許文献１参照。）。
植村他２名，「生分解性β−ＴＣＰ多孔材料を用いた骨におけるティッシュエンジニアリング−生体内で強度を増す新しい材料オスフェリオン−」，メディカル朝日，朝日新聞社，２００１年１０月１日，第３０巻，第１０号，ｐ．４６−４９

しかしながら、患者から骨髄液を採取する手術は、腸骨等に穿刺して内部の骨髄液を吸引回収するものであり、侵襲性が高く、患者にかかる負担が大きいという問題がある。
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、低侵襲に繊維芽様細胞を製造でき、患者にかかる負担を低減することができる繊維芽様細胞の製造方法および移植材を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、血液中から分離した単核球細胞にカルシウムイオンを導入した後に、該単核球細胞を所定の培養条件において培養する繊維芽様細胞の製造方法を提供する。
本発明によれば、血液から分離した単核球細胞にカルシウムイオンを導入した後に培養することにより、繊維芽様細胞を製造することができる。繊維芽様細胞は、骨髄由来の間葉系幹細胞と同様に繊維状の形態を有するとともに、培養容器の底面への接着性を有し、間葉系幹細胞と同様の性質を有している。

したがって、この発明によれば、腸骨等から骨髄液を採取するような侵襲性の高い手術を行うことなく、シリンジにより末梢血を採取する作業、あるいは、臍帯血や胎盤血あるいは月経血のように胎児に関係する未分化で免疫拒絶反応の少ない女性系の血液を採取する作業のように高い侵襲を伴うことなく採取した血液に基づいて容易に繊維芽様細胞を製造することができる。その結果、患者にかかる負担を大幅に軽減することができる。

上記発明においては、底面に血漿を塗布した培養容器に培養液を貯留し、該培養液内において培養することが好ましい。
このようにすることで、単核球細胞から製造される繊維芽様細胞の培養容器の底面への接着性が向上し、繊維芽様細胞を効率的に製造することができる。

また、上記発明においては、培養液内にサイトカインを添加することとしてもよい。
このようにすることで、サイトカインの作用により、単核球細胞から製造される繊維芽様細胞の成長が促進され、繊維芽様細胞をさらに効率的に製造することができる。
この場合に、前記サイトカインがｂ−ＦＧＦであることとしてもよい。

また、上記発明においては、前記血液として、臍帯血、胎盤血、末梢血または月経血のいずれかを用いることが好ましい。
これらの血液は採取しやすく、患者にかかる負担を軽減できる。また、末梢血は豊富に存在するので繊維芽様細胞ソースとして適している。また、臍帯血、胎盤血あるいは月経血は免疫拒絶反応が少なく、自家細胞のみならず他家細胞を用いることも可能となる。

また、本発明は、上記いずれかの製造方法により製造された繊維芽様細胞を含有する移植材を提供する。
本発明によれば、上記製造方法により製造された繊維芽様細胞が間葉系幹細胞様の性質を有するため、生体に移植されることにより、移植部位を構成する組織を再生することが可能となる。

本発明によれば、低侵襲に繊維芽様細胞を製造でき、患者にかかる負担を低減することができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係る繊維芽様細胞の製造方法について、図１を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る繊維芽様細胞の製造方法は、図１に示されるように、ヒトから採取した血液から単核球細胞を分離する分離ステップＳ_１と、分離された単核球細胞にカルシウムイオンを導入するステップＳ_２と、カルシウムイオンが導入された単核球細胞を培養する培養ステップＳ_３とを備えている。

前記分離ステップＳ_１は、例えば、遠心分離法により行われる。ヒトから採取した血液が末梢血である場合には、第１の遠心分離により血漿を分離した後、第２の遠心分離により単核球細胞を単離することができる。第２の遠心分離は、例えば、Ficoll-Paqueを血液上に重層した後、密度勾配遠心分離法により行われる。

前記導入ステップＳ_２においては、単離した単核球細胞を容器に貯留した食塩水に浸漬する。次いで、容器内にカルシウムイオンを投入し、２〜４時間程度浸漬する。
カルシウムイオンとしては、例えば、β−リン酸三カルシウムを食塩水に浸漬することにより、溶液内に電離させたものでよい。あるいは、リン酸カルシウム溶液を食塩水に添加することにしてもよい。
容器内の溶液にはサイトカインを投入してもよい。サイトカインとしてはｂＦＧＦ(Basic Fibroblast Growth Factor)が好ましい。

前記培養ステップＳ_３においては、底面に血漿（例えば、前記第１の遠心分離により分離された血漿）を塗布した培養容器を乾燥させた後、前記導入ステップＳ_２において得られた単核球細胞を容器内から取り出し、培養容器に播種する。培養容器内には、培養液を貯留しておく。この後に培養液を交換しながら所定の培養条件で培養する。培養液にはカルシウムイオンを添加してもよい。

末梢血等の血液内には単核球細胞が少量存在することが知られているが、一般に、この単核球細胞は増殖することが困難であると考えられていた。
本実施形態に係る繊維芽様細胞の製造方法によれば、溶液内に存在するカルシウムイオンの作用により、単核球細胞を繊維芽様細胞に分化させて、増殖させることができた。

また、本実施形態に係る繊維芽様細胞の製造方法によれば、培養容器の底面に血漿を塗布しているので、繊維芽様細胞の接着性が向上し、効率的な増殖を図ることができる。
また、本実施形態に係る繊維芽様細胞の製造方法によれば、溶液内にサイトカインが添加されているので、繊維芽様細胞の増殖が促進され、さらに効率的な増殖を図ることができるという利点がある。

本実施形態に係る製造方法により製造された繊維芽様細胞は、間葉系幹細胞と同様の繊維状の形態を有するとともに、間葉系幹細胞と同様の接着性を有するなど、間葉系幹細胞と同様の性質を有している。
したがって、従来、腸骨に穿刺することにより回収した骨髄液から分離すること等により得られていた間葉系幹細胞と比較すると、末梢血その他の血液から製造することができるため、侵襲性を大幅に低減して、患者にかかる負担を軽減することができるという利点がある。

特に、生体組織の再生に必要な数の間葉系幹細胞を早期に得るためには、多量の骨髄液が必要であったため、１度に大量の骨髄液を採取しなければならないとともに、場合によっては、多数回に分けて採取する必要があり、患者にかかる身体的な負担は大きなものであった。これに対して、本実施形態に係る製造方法によれば、末梢血その他の血液から繊維芽様細胞を製造し増殖させることができる。

したがって、末梢血を始めとする血液は、シリンジ等により簡単に採取することができる。また、骨髄液とは異なり、ヒトの体内に存在する血液量は膨大であるため、複数回に分けて採取することもできる。この場合においても、低侵襲で採取できるので、患者にかかる負担は大幅に軽減されることになる。

［第１の実施例］
以下、本実施形態に係る繊維芽様細胞の製造方法の第１の実施例について説明する。
まず、内部にヘパリンを入れたシリンジで成人健常ドナーから静脈血を採血した。得られた静脈血２０ｍｌを遠心（１２００ｒｐｍ、５分）して血漿を分離した。次いで、遠心分離容器内に残った血液上にFicoll-Paqueを重層して、密度勾配遠心分離（３０Ｇ，１４００ｒｐｍ、３０分）を室温で行い、単核球細胞を単離した。

単離された単核球細胞に、以下の処理を施した。
単離した単核球細胞を洗浄するために食塩水を添加して、単核球細胞と混合し、よく攪拌した。それを遠心（１２００ｒｐｍ、５分）した後、上澄み液を除去した。食塩水を添加して、２×１０^６／ｍｌの細胞密度に調製し、１０μＭのリン酸カルシウム溶液（１μＭ〜１００μＭが望ましい。）を加え、室温で４時間（２〜４時間が望ましい。）静置した。
この後に顕微鏡観察を行うと、表面に凹凸ができるなど、細胞の形状に変化が認められた。

自家血漿を底面にコーティングし乾燥させた培養容器に、低グルコースＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）培地を貯留した。そして、上述した処理を施した単核球細胞を播種し、通常の培養条件（温度３７℃±０．５℃、ＣＯ_２濃度５％）下で約２〜６時間培養した後、培地を交換した。
培養３日目に浮遊細胞を除去し、その後は３日毎に新鮮培地に交換しながら、１週間まで細胞を培養した。１週間後に細胞の核分裂を確認した（図２中矢印部参照。）。培養７〜１４日目に接着細胞を繊維芽様細胞として回収した。このとき細胞数は約３０倍に増殖していた。

図２に示されるように、繊維芽様細胞は、間葉系幹細胞と同様の繊維状の形態を有しているとともに、培養容器の底面に接着して成長する性質を有しており、間葉系幹細胞のような性質を示すことがわかった。

［第２実施例］
次に、第１の実施例により製造した繊維芽様細胞を人工骨（例えば、β−リン酸三カルシウム多孔体ブロック：β−ＴＣＰ）に播種することにより移植材を製造した。
そして、製造された移植材をヌードマウスの皮下に移植した。４週、６週、８週、１０週、１２週後（全てＮ＝１、１００％）に組織解析を行った結果、骨形成が認められた。

同時に、比較例として、人工骨（β−ＴＣＰ）（Ｎ＝６）、培養骨（Ｎ＝６）、高く旧細胞のみ（Ｎ＝１）、ＰＲＰ（Platelet Rich Plasma）（Ｎ＝１）をそれぞれヌードマウスの皮下に移植した。その結果、いずれも４週では骨形成が認められなかった。培養骨の場合には、８週間（１／６、１６％）と１０週間（３／６、５０％）後に骨形成が認められた。
この結果、第１の実施例により製造した繊維芽様細胞が、間葉系幹細胞と同様の性質を有していることが確認された。また、培養骨におけるよりも早く骨形成が行われることが確認された。

なお、本実施形態においては、単核球細胞の細胞ソースとして、静脈血のような末梢血を使用した場合について例示したが、これに代えて、臍帯血、胎盤血あるいは月経血のような、胎児に関係する未分化で免疫拒絶反応の少ない女性系の血液を使用することとしてもよい。この場合には、自家血液のみならず、他家血液をも利用することが可能となり、さらに容易に、多量の繊維芽様細胞を取得することが可能となる。

また、培地内にリン酸カルシウム溶液を添加することでカルシウムイオンを含む培養液を構成したが、これに代えて、硫酸カルシウムその他の化合物あるいは、培地中においてカルシウムイオンを電離し易いカルシウム含有物質を採用してもよい。
また、サイトカインとしてｂＦＧＦを採用したが、これに代えて、他のサイトカインを採用してもよい。

この発明の一実施形態に係る繊維芽様細胞の製造方法を示すフローチャートである。 図１の繊維芽様細胞の製造方法により製造された繊維芽様細胞を示す顕微鏡写真である。

符号の説明

Ｓ_１ 分離ステップ
Ｓ_２ 導入ステップ
Ｓ_３ 培養ステップ

Claims (6)

1. 血液中から分離した単核球細胞にカルシウムイオンを導入する処理を行った後に、
   該単核球細胞を所定の培養条件において培養する繊維芽様細胞の製造方法。
2. 底面に血漿を塗布した培養容器に培養液を貯留し、該培養液内において培養する請求項１に記載の繊維芽様細胞の製造方法。
3. 培養液内にサイトカインを添加する請求項１または請求項２に記載の繊維芽様細胞の製造方法。
4. 前記サイトカインがｂＦＧＦである請求項３に記載の繊維芽様細胞の製造方法。
5. 前記血液として、臍帯血、胎盤血、末梢血または月経血のいずれかを用いる請求項１から請求項４のいずれかに記載の繊維芽溶細胞の製造方法。
6. 請求項１から請求項５のいずれかの製造方法により製造された繊維芽様細胞を含有する移植材。